特許 6884860 操作されたイムノグロブリンラムダ軽鎖座位を有する非ヒト動物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6884860

(24)【登録日】2021年5月14日

(45)【発行日】2021年6月9日

(54)【発明の名称】操作されたイムノグロブリンラムダ軽鎖座位を有する非ヒト動物

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/027 20060101AFI20210531BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210531BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20210531BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20210531BHJP

【ＦＩ】

   A01K67/027ZNA

   !C12P21/08

   !C12N5/10

   !C12N15/13

【請求項の数】21

【全頁数】117

(21)【出願番号】特願2019-522647(P2019-522647)

(86)(22)【出願日】2017年11月3日

(65)【公表番号】特表2020-501516(P2020-501516A)

(43)【公表日】2020年1月23日

(86)【国際出願番号】US2017060006

(87)【国際公開番号】WO2018128691

(87)【国際公開日】20180712

【審査請求日】2020年10月30日

(31)【優先権主張番号】62/567,932

(32)【優先日】2017年10月4日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/417,845

(32)【優先日】2016年11月4日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】グオ， チャングァン

(72)【発明者】

【氏名】ハリス， フェイス

(72)【発明者】

【氏名】ボロニナ， ベラ

(72)【発明者】

【氏名】マクウィルター， ジョン

(72)【発明者】

【氏名】レベンコバ， ナターシャ

(72)【発明者】

【氏名】マクドナルド， リン

(72)【発明者】

【氏名】トゥ， ナシン

(72)【発明者】

【氏名】マーフィー， アンドリュー ジェイ．

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２８３１５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１６３３１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０９６１４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１４４５６６（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

その生殖細胞ゲノムが、
（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含むマウスであって、
（ａ）および（ｂ）が、（ｃ）およびマウスＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、および
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上のマウスイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域および一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域をさらに含み、前記マウスが、ヒトラムダ可変領域と、ヒトラムダ定常ドメインまたはマウスラムダ定常ドメインのいずれかとを含むイムノグロブリンλ軽鎖を発現し、前記一つ以上のヒトＥλ領域が三つのヒトＩｇλエンハンサー配列要素を含む、マウス。

【請求項2】

前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が二つのマウスＥλ領域を含む、請求項１に記載のマウス。

【請求項3】

前記二つのマウスＥλ領域が、マウスＥλおよびマウスＥλ３−１である、請求項２に記載のマウス。

【請求項4】

前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が三つのヒトＥλ領域を含む、請求項１に記載のマウス。

【請求項5】

前記生殖細胞ゲノムが、
（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、マウスイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリン重鎖座位、または
（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、マウスイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリン重鎖座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、前記ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、マウスイムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、をさらに含む、請求項１に記載のマウス。

【請求項6】

一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの前記挿入は、マウスＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える、請求項５に記載のマウス。

【請求項7】

前記挿入は、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、請求項６に記載のマウス。

【請求項8】

一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントの前記挿入が、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置き換える、請求項５に記載のマウス。

【請求項9】

前記挿入は、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、請求項８に記載のマウス。

【請求項10】

前記マウスイムノグロブリン重鎖定常領域が、内因性マウスイムノグロブリン重鎖定常領域である、請求項５に記載のマウス。

【請求項11】

前記マウスＣκ領域が、内因性マウスＣκ領域である、請求項５に記載のマウス。

【請求項12】

前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む、請求項１に記載のマウス。

【請求項13】

前記マウスＣλ遺伝子セグメントが、マウスＣλ遺伝子セグメントである、請求項１に記載のマウス。

【請求項14】

前記イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトイムノグロブリンκ軽鎖座位の近位Ｖκ重複のすべてまたは一部の挿入を含む、請求項５に記載のマウス。

【請求項15】

前記イムノグロブリン重鎖座位が、内因性マウスＡｄａｍ６遺伝子を欠く、請求項５に記載のマウス。

【請求項16】

前記イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上のマウスＡｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む、請求項１５に記載のマウス。

【請求項17】

前記マウスが、前記内因性イムノグロブリン重鎖座位に対しホモ接合性である、請求項５のいずれか一項に記載のマウス。

【請求項18】

前記マウスが、前記内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位に対しホモ接合性である、請求項５に記載のマウス。

【請求項19】

前記マウスが、前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位に対しホモ接合性である、請求項１に記載のマウス。

【請求項20】

その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含むマウスを作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）マウス胚性幹細胞内にＤＮＡ断片を導入することであって、前記ＤＮＡ断片は、
（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含むヌクレオチド配列を含み、
ここで（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、マウスＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、および
前記ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域をさらに含み、前記一つ以上のヒトＥλ領域が三つのヒトＩｇλエンハンサー配列要素を含むこと、
（ｂ）（ａ）で作製された前記マウス胚性幹細胞を取得すること、ならびに
（ｃ）（ｂ）の前記マウス胚性幹細胞を使用してマウスを作製すること、を含む、方法。

【請求項21】

その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含み、前記操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントが、マウスまたはヒトのＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上のマウスイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域をさらに含み、前記一つ以上のヒトＥλ領域が三つのヒトＩｇλエンハンサー配列要素を含む、マウスを作製する方法であって、前記方法が、
マウスの前記生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含むよう操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含むよう、マウスの前記生殖細胞ゲノムを改変することであって、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントが、マウスまたはヒトのＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上のマウスイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）領域をさらに含み、前記一つ以上のヒトＥλ領域が三つのヒトＩｇλエンハンサー配列要素を含み、それにより前記マウスを作製すること、を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１６年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４１７，８４５号明細書、および２０１７年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，９３２号明細書の優先権の利益を主張するものであり、それら各出願は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ヒト抗体は、最も急成長を遂げている治療薬である。現在その作製に使用されている技術のなかでも、ヒト抗体のすべてまたは一部をコードする遺伝物質を用いて操作されたトランスジェニック動物（例えば齧歯類）の開発は、様々な疾患治療に対するヒト治療用モノクローナル抗体の分野に革命をもたらした。さらには、ヒトモノクローナル抗体の作製を目的とした、宿主トランスジェニック動物中のヒト抗体レパートリーが最大化された改善インビボシステムの開発も必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

ある態様において、ヒトに影響を与える様々な疾患の治療に使用することができる新たな抗体および抗体系治療剤の特定ならびに開発のための改善されたインビボシステムが本明細書に提供される。本明細書に開示されるように、ある実施形態において、操作されたイムノグロブリン座位、特に操作されたイムノグロブリン（Ｉｇ）λ軽鎖座位を有する、および／または別手段によりヒトＶλ領域を有する軽鎖を特徴とする抗体レパートリーを発現する、産生する、もしくは含有する、本明細書において提供される非ヒト動物（例えば齧歯類）は、例えば新規抗体系治療剤の特定および開発において、ヒトλ配列の多様性の活用に有用である。一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトへの投与を目的とした抗体および／または抗体系治療剤の開発のための改善されたインビボシステムを提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトＶλ領域配列を含有する既存のインビボシステムから取得された抗体および／または抗体系治療剤と比較して性能が改善されていることを特徴とする、ヒトＶλドメインを含有する抗体および／または抗体系治療剤の開発のための改善されたインビボシステムを提供する。

【0004】

ある態様において、操作されたイムノグロブリン可変領域と定常領域を含有する、一部のある実施形態においては、操作された制御領域（または配列）もさらに含むＩｇλ軽鎖座位を有する非ヒト動物が本明細書において提供される。本明細書に記載されるように、ある実施形態において、提供される非ヒト動物は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＣλ領域遺伝子、および齧歯類Ｃλ領域遺伝子の存在を特徴とする操作されたＩｇλ軽鎖可変領域を含むＩｇλ軽鎖座位を、その生殖細胞ゲノム中に含有し、当該ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントは、互いに操作可能に連結され、および前記齧歯類Ｃλ領域遺伝子に操作可能に連結される。

【0005】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、または少なくとも２５個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。

【0006】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、または５〜６個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、１０〜７０、１０〜６９、１０〜６８、１０〜６７、１０〜６６、１０〜６５、１０〜６４、１０〜６３、１０〜６２、１０〜６１、１０〜６０、１０〜５９、１０〜５８、１０〜５７、１０〜５６、１０〜５５、１０〜５４、１０〜５３、１０〜５２、１０〜５１、１０〜５０、１０〜４９、１０〜４８、１０〜４７、１０〜４６、１０〜４５、１０〜４４、１０〜４３、１０〜４２、１０〜４１、１０〜４０、１０〜３９、１０〜３８、１０〜３７、１０〜３６、１０〜３５、１０〜３４、１０〜３３、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、または１０〜１１個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。

【0007】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、６〜２５、７〜２５、８〜２５、９〜２５、１０〜２５、１１〜２５、１２〜２５、１３〜２５、１４〜２５、１５〜２５、１６〜２５、１７〜２５、１８〜２５、１９〜２５、２０〜２５、２１〜２５、２２〜２５、２３〜２５、または２４〜２５個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、１１〜７０、１２〜７０、１３〜７０、１４〜７０、１５〜７０、１６〜７０、１７〜７０、１８〜７０、１９〜７０、２０〜７０、２１〜７０、２２〜７０、２３〜７０、２４〜７０、２５〜７０、２６〜７０、２７〜７０、２８〜７０、２９〜７０、３０〜７０、３１〜７０、３２〜７０、３３〜７０、３４〜７０、３５〜７０、３６〜７０、３７〜７０、３８〜７０、３９〜７０、４０〜７０、４１〜７０、４２〜７０、４３〜７０、４４〜７０、４５〜７０、４６〜７０、４７〜７０、４８〜７０、４９〜７０、５０〜７０、５１〜７０、５２〜７０、５３〜７０、５４〜７０、５５〜７０、５６〜７０、５７〜７０、５８〜７０、５９〜７０、６０〜７０、６１〜７０、６２〜７０、６３〜７０、６４〜７０、６５〜７０、６６〜７０、６７〜７０、６８〜７０、または６９〜７０個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。

【0008】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、６〜２４、７〜２３、８〜２２、９〜２１、１０〜２０、１１〜１９、１２〜１８、１３〜１７、１４〜１６、または１５〜１６個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、１１〜６９、１２〜６８、１３〜６７、１４〜６６、１５〜６５、１６〜６４、１７〜６３、１８〜６２、１９〜６１、２０〜６０、２１〜５９、２２〜５８、２３〜５７、２４〜５６、２５〜５５、２６〜５４、２７〜５３、２８〜５２、２９〜５１、３０〜５０、３１〜４９、３２〜４８、３３〜４７、３４〜４８、３５〜４７、３６〜４６、３７〜４５、３８〜４４、３９〜４３、４０〜４２、または４１〜４２個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。

【0009】

ある実施形態において、提供される非ヒト動物は、５個、１６個、または２５個の機能的なヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。ある実施形態において、提供される非ヒト動物は、１０個、２７個、または４０個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含むＩｇλ軽鎖座位を含む。ある実施形態において、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、前記ヒトＶλ遺伝子セグメントがヒト細胞のヒトＩｇλ軽鎖座位において存在するように、連続的なヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。

【0010】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、Ｉｇλ軽鎖座位を含み、当該座位は、少なくとも５個のヒトＪλ遺伝子セグメント（例えば限定されないが、５個のヒトＪλ遺伝子セグメント、６個のヒトＪλ遺伝子セグメント、７個のヒトＪλ遺伝子セグメント、８個のヒトＪλ遺伝子セグメントなど）を含む。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、Ｉｇλ軽鎖座位を含み、当該座位は、少なくとも４個のヒトＣλ領域遺伝子（例えば限定されないが、４個のヒトＣλ領域遺伝子、５個のヒトＣλ領域遺伝子、６個のヒトＣλ領域遺伝子、７個のヒトＣλ領域遺伝子、８個のヒトＣλ領域遺伝子など）を含む。ある実施形態において、提供される非ヒト動物は、Ｉｇλ軽鎖座位を含み、当該座位は、少なくとも２５個のヒトＶλ遺伝子セグメント、少なくとも５個のＪλ遺伝子セグメント、および少なくとも４個のヒトＣλ領域遺伝子を、内因性Ｉｇλ軽鎖アレルで含む。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位で、ただ一つのネズミ科動物（例えばマウスまたはラット）のＣλ領域遺伝子（例えばマウスＣλ１領域遺伝子またはマウスＣλ１遺伝子セグメント）を含む。一部の実施形態において、前記Ｉｇλ軽鎖座位は、三個の配列要素を特徴とするヒトＥλ領域（または配列）をさらに含む。

【0011】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、天然の、または生殖細胞の配置で、内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位にヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、ヒト細胞の生殖細胞ゲノムのヒトイムノグロブリンλ軽鎖座位に天然には存在しない配置で、内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位にヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含有する。

【0012】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位に、非コードヒトイムノグロブリンλ軽鎖配列が散在する（または並置する、関連するなど）複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλコード配列を含む、ＤＮＡ配列を含有する。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位に、非コード非ヒト（例えばネズミ科動物）イムノグロブリンλ軽鎖配列が散在する複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλコード配列を含む、ＤＮＡ配列を含有する。

【0013】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、前記非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中の内因性非ヒトＩｇλ軽鎖座位からの抗体発現を特徴とするものであり、当該抗体は、ヒトＶλドメインとヒトまたは非ヒトＣλドメインを含有する。一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位からのヒトＶλ領域の使用（例えば、６０：４０ κ：λの比率）が、一つ以上の参照操作非ヒト動物または野生型非ヒト動物（例えば限定されないが、９５：５ κ：λの比率）と比較して増加していることを特徴とする。

【0014】

一部の実施形態において、そのゲノムが、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織が提供され、当該ヒトＶλ、Ｊλ、およびＣλ遺伝子セグメントは、非ヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の非ヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0015】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、以下を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織が提供される：（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントであって、ここで（ａ）と（ｂ）は、（ｃ）と非ヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の非ヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0016】

一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、三つのヒトＥλをさらに含む。一部の実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、三つの配列要素の存在を特徴とする一つのヒトＥλをさらに含む。一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、モジュール方式で作用する（または機能する）三つの配列要素の存在を特徴とする一つのヒトＥλをさらに含む。

【0017】

一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つの非ヒトＥλを含む。一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つの齧歯類Ｅλを含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つのマウスＥλを含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、マウスＥλとマウスＥλ３−１を含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、マウスＥλ２−４を含有しない（または欠く）。一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つのラットＥλを含む。

【0018】

一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、非ヒトＥλ２−４の欠失を含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２、Ｖλ３、Ｊλ２、Ｃλ２、Ｊλ４Ｐ、Ｃλ４Ｐ、Ｅλ２−４、Ｖλ１、Ｊλ３、Ｊλ３Ｐ、Ｃλ３およびＪλ１の欠失を含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、存在する唯一の非ヒト遺伝子セグメントまたは配列要素としてＣλ１、ＥλおよびＥλ３−１を含む。

【0019】

一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ４−６９〜Ｖλ３−１、少なくともヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７と齧歯類Ｃλ１遺伝子セグメントの挿入を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ３−１、少なくともヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７と齧歯類Ｃλ１遺伝子セグメントの挿入を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、少なくともヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、ならびに齧歯類Ｃλ１遺伝子セグメントの挿入を含む。一部のある実施形態において、挿入には、ヒトＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0020】

一部の実施形態において、非ヒトＣλ遺伝子セグメントは、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントであるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、ネズミ科動物（例えばマウスまたはラット）のＣλ遺伝子セグメントであるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、ラットＣλ遺伝子セグメントであるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ遺伝子セグメントであるか、またはこれを含む。一部のある実施形態において、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ１遺伝子セグメントである。

【0021】

一部の実施形態において、マウスＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、マウスＣλ１、マウスＣλ２およびマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるか、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態において、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２およびマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態では、マウスＣλ１遺伝子は、配列番号１であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、マウスＣλ２遺伝子は、配列番号３であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、マウスＣλ３遺伝子は、配列番号５であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子と同一である配列を含む。

【0022】

一部のある実施形態において、マウスＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、マウスＣλ１、マウスＣλ２、およびマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子に対し、５０％〜１００％、５５％〜１００％、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％、または９８％〜１００％同一である配列を含む。

【0023】

一部のある実施形態において、マウスＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、マウスＣλ１、マウスＣλ２、およびマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子に対し、５０％〜９８％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜７０％、５０％〜６５％、５０％〜６０％、または５０％〜５５％同一である配列を含む。

【0024】

一部のある実施形態において、マウスＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、マウスＣλ１、マウスＣλ２、およびマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子に対し、５５％〜９８％、６０％〜９５％、６５％〜９０％、７０％〜８５％、または７５％〜８０％同一である配列を含む。

【0025】

一部の実施形態において、ラットＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３、およびラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるか、または１００％同一である配列を含む。一部の実施形態において、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３、およびラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態では、ラットＣλ１遺伝子は、配列番号７であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、ラットＣλ２遺伝子は、配列番号９であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、ラットＣλ３遺伝子は、配列番号１１であるか、またはこれを含む。一部のある実施形態では、ラットＣλ４遺伝子は、配列番号１３であるか、またはこれを含む。

【0026】

一部の実施形態において、ラットＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３、およびラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子に対し、５０％〜１００％、５５％〜１００％、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％、または９８％〜１００％同一である配列を含む。

【0027】

一部の実施形態において、ラットＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３、およびラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子に対し、５０％〜９８％、５０％〜９５％、５０％〜９０％、５０％〜８５％、５０％〜８０％、５０％〜７５％、５０％〜７０％、５０％〜６５％、５０％〜６０％、または５０％〜５５％同一である配列を含む。

【0028】

一部の実施形態において、ラットＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３、およびラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子に対し、５５％〜９８％、６０％〜９５％、６５％〜９０％、７０％〜８５％、または７５％〜８０％同一である配列を含む。

【0029】

提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態において、前記非ヒト動物、非ヒト細胞、又は非ヒト組織の生殖細胞ゲノムまたはゲノムは、（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む。

【0030】

一部の実施形態において、挿入される一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える。ある実施形態において、当該挿入には、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。一部の実施形態において、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域は、内因性非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域である。一部の実施形態において、イムノグロブリン重鎖座位は、Ｖ_Ｈ３−７４からＶ_Ｈ６−１のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、Ｄ_Ｈ１−１からＤ_Ｈ７−２７のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１−Ｊ_Ｈ６の挿入を含む。ある実施形態において、当該挿入には、ヒトＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１の間に天然に存在する（発生する）ヒト非コードＤＮＡ、ヒトＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７の間に天然に存在する（発生する）ヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪ_Ｈ１−Ｊ_Ｈ６の間に天然に存在する（発生する）ヒト非コードＤＮＡが含まれる。一部の実施形態において、イムノグロブリン重鎖座位は、全て機能性のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、全て機能性のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および全て機能性のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む。

【0031】

一部の実施形態において、イムノグロブリン重鎖座位は、内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子を欠く。一部の実施形態において、イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の非ヒトＡｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む。一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列は、第一および第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。一部の実施形態において、第一のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２であり、第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ６−１である。一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントとヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入される。

【0032】

一部の実施形態において、挿入される一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置換する。一部のある実施形態において、当該挿入には、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。一部の実施形態において、非ヒトイムノグロブリンＣκ領域は、内因性非ヒトＣκ領域である。一部の実施形態において、イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトイムノグロブリンκ軽鎖座位の近位Ｖκ重複のすべてまたは一部の挿入を含む。一部の実施形態において、イムノグロブリンκ軽鎖座位は、Ｖκ２−４０からＶκ４−１のヒトＶκ遺伝子セグメント、およびＪκ１−Ｊκ５のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む。一部のある実施形態において、当該挿入には、ヒトＶκ２−４０〜Ｖκ４−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪκ１−Ｊκ５の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0033】

本明細書に提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態において、当該非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、本明細書に記載されるイムノグロブリン重鎖座位（例えば本明細書に記載される内因性イムノグロブリン重鎖座位）に対しヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0034】

本明細書に提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態において、当該非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、本明細書に記載されるイムノグロブリンκ軽鎖座位（例えば本明細書に記載される内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位）に対しヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0035】

本明細書に提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態において、当該非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、本明細書に記載されるイムノグロブリンλ軽鎖座位（例えば本明細書に記載される内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位）に対しヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0036】

本明細書に提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の一部の実施形態において、前記非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織の生殖細胞ゲノムは、一つ以上の非ヒトＡｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含み、および当該動物は、前記挿入に対しヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0037】

一部の実施形態では、非ヒト細胞は、非ヒトリンパ球である。一部の実施形態では、非ヒト細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。

【0038】

一部の実施形態では、非ヒト細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、齧歯類ＥＳ細胞である。ある実施形態では、齧歯類ＥＳ細胞は、（例えば、１２９系、Ｃ５７ＢＬ系、ＢＡＬＢ／ｃ系、またはそれらの混合系由来の）マウスＥＳ細胞である。一部のある実施形態では、齧歯類胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系およびＣ５７ＢＬ系の混合物である。一部のある実施形態では、齧歯類胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７ＢＬ系、およびＢＡＬＢ／ｃ系の混合物である。

【0039】

一部の実施形態では、非ヒト動物を作製するための、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞の使用が提供される。ある実施形態では、非ヒトＥＳ細胞はマウスＥＳ細胞であり、および本明細書に記載される操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含むマウスを作製するために使用される。ある実施形態では、非ヒトＥＳ細胞はラットＥＳ細胞であり、および本明細書に記載される操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含むラットを作製するために使用される。

【0040】

一部の実施形態では、非ヒト組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。

【0041】

一部の実施形態では、本明細書に記載される単離された非ヒトの細胞または組織から作製される、生成される、産生される、または取得される不死化細胞が提供される。

【0042】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞から作製される、生成される、産生される、または取得される非ヒト胚が提供される。一部のある実施形態では、非ヒト胚は齧歯類胚であり、一部の実施形態ではマウス胚、一部の実施形態ではラット胎芽である。

【0043】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞、非ヒト組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚を備えたキットが提供される。

【0044】

一部の実施形態では、治療または診断のための薬剤（例えば、抗体またはその断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。

【0045】

一部の実施形態では、疾患、障害もしくは状態の治療、予防、または改善のための薬剤（例えば、抗体またはその断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。

【0046】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物の作製方法が提供され、当該方法は、（ａ）ＤＮＡ断片を非ヒト胚性幹細胞内に導入することであって、前記ＤＮＡ断片は、（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含むヌクレオチド配列を含み、ここで（ｉ）〜（ｉｉｉ）は非ヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびここで当該ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含むこと、（ｂ）（ａ）において作製された非ヒト胚性幹細胞を取得すること、および（ｃ）（ｂ）の非ヒト胚性幹細胞を使用して非ヒト動物を生成すること、を含む。

【0047】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物の作製方法が提供され、当該操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、非ヒトおよび／またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の非ヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、当該方法は、非ヒト動物の生殖細胞ゲノムを改変し、それにより当該ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませること、ここで当該操作された座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、非ヒトおよび／またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含むこと、それにより前記非ヒト動物を作製すること、を含む。

【0048】

本明細書に記載される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４−６９〜Ｖλ３−１、Ｖλ５−５２〜Ｖλ３−１またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む。非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む。非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントは、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含む。非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、当該ヒトＪλおよびＣλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、および当該ヒトＪλ７遺伝子セグメントは、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0049】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の挿入は、ヒトＶλ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６の挿入は、当該ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、そして当該ヒトＪλ７遺伝子セグメントの挿入は、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0050】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、非ヒトＣλ遺伝子セグメントは、齧歯類のＣλ遺伝子セグメントであり、一部の実施形態においては、マウスのＣλ１遺伝子セグメントである。

【0051】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、ＤＮＡ断片は一つ以上の選択マーカーをさらに含む。非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、ＤＮＡ断片は一つ以上の部位特異的組み換え部位をさらに含む。本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、ＤＮＡ断片は、同じリコンビナーゼと再結合する部位特異的組み換え部位のセットを一つ以上さらに含む。非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、ＤＮＡ断片は、異なるリコンビナーゼと再結合する部位特異的組み換え部位のセットを一つ以上さらに含む。

【0052】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、ＤＮＡ断片は、その生殖細胞ゲノムが、（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、を含む非ヒト胚性幹細胞へと導入される。

【0053】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、ＤＮＡ断片は、その生殖細胞ゲノムが、（ｉ）野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または（ｉｉ）野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む非ヒト胚性幹細胞へと導入され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から作製された、生成された、産生された、または取得されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む。

【0054】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、非ヒト動物の生殖細胞ゲノムを改変し、当該ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることが、その生殖細胞ゲノムが、（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、非ヒトイムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む非ヒト胚性幹細胞において実施される。

【0055】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入は、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部のある実施形態において、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入は、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0056】

本明細書に提供される非ヒト動物の作製方法の一部の実施形態において、非ヒト動物の生殖細胞ゲノムを改変し、その生殖細胞ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることが、その生殖細胞ゲノムが、（ｉ）野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または（ｉｉ）野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む非ヒト胚性幹細胞において実施され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から作製された、生成された、産生された、または取得されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む。

【0057】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるマウスは、野生型のＩｇＨおよびＩｇκ座位、ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位であって、当該ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位は挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列を含有する座位、または（Ａｄａｍ６コード配列の挿入を伴う、または伴わない）ホモ接合性もしくはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位とホモ接合性もしくはヘテロ接合性の不活化Ｉｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有する。

【0058】

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法から作製される、生成される、産生される、取得される、または取得可能である非ヒト動物が提供される。

【0059】

一部の実施形態において、抗体を非ヒト動物で産生させる方法が提供され、当該方法は、（ａ）対象抗原を用いて本明細書に記載される非ヒト動物を免疫化する工程、（ｂ）齧歯類が対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で当該非ヒト動物を維持する工程、および（ｃ）当該非ヒト動物、または非ヒト細胞から対象抗原に結合する抗体を回収する工程を含む。一部の実施形態において、抗体は、ヒトラムダ軽鎖可変ドメインを含む。

【0060】

一部の実施形態において、非ヒト動物においてヒトラムダ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を産生させる方法が提供され、当該方法は、（ａ）対象抗原を用いて本明細書に記載される非ヒト動物を免疫化する工程、（ｂ）齧歯類が対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で当該非ヒト動物を維持する工程、および（ｃ）当該非ヒト動物、または非ヒト細胞からヒトラムダ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を回収する工程を含む。一部の実施形態において、方法は、当該非ヒト動物または非ヒト細胞からヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸を回収する工程をさらに含む。

【0061】

非ヒト動物において抗体または核酸を産生させる方法の一部の実施形態において、非ヒト細胞は、Ｂ細胞である。非ヒト動物において抗体または核酸を産生させる方法の一部の実施形態において、非ヒト細胞は、ハイブリドーマである。

【0062】

非ヒト動物において抗体を産生させる方法の一部の実施形態において、齧歯類または齧歯類細胞から回収される、対象抗原に結合する抗体はヒト重鎖可変ドメインとヒトラムダ軽鎖可変ドメインを含む。

【0063】

非ヒト動物において抗体または核酸を産生させる方法の一部の実施形態において、ヒト重鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−２およびＶ_Ｈ６−１からなる群から選択される。

【0064】

非ヒト動物において抗体または核酸を産生させる方法の一部の実施形態において、ヒトラムダ軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶλ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖλ４−６９、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６０、Ｖλ６−５７、Ｖλ１０−５４、Ｖλ５−５２、Ｖλ１−５１、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−４７、Ｖλ７−４６、Ｖλ５−４５、Ｖλ１−４４、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４０、Ｖλ５−３９、Ｖλ５−３７、Ｖλ１−３６、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−２５、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２２、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−１９、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１０、Ｖλ３−９、Ｖλ２−８、Ｖλ４−３およびＶλ３−１からなる群から選択される。

【0065】

一部の実施形態において、非ヒト動物において抗原特異的免疫反応を誘導させる方法が提供され、当該方法は、（ａ）対象抗原を用いて本明細書に記載される非ヒト動物を免疫化する工程、（ｂ）齧歯類が対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で当該非ヒト動物を維持する工程を含む。

【0066】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムがホモ接合性の内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物が提供され、当該軽鎖座位は、（ｉ）ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ４−６９〜Ｖλ３−１、Ｖλ５−５２〜Ｖλ３−１、Ｖλ３−２７〜Ｖλ３−１、またはＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、（ｉｉ）ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６、（ｉｉｉ）ヒトＪλ遺伝子セグメント、のＪλ７、ならびに（ｉｖ）三つのヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（または三つの配列要素を有するヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー）の挿入を含み、この場合において（ｉ）〜（ｉｖ）は、互いに操作可能に連結され、当該挿入は、非ヒトＣλ遺伝子セグメントの上流であり、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性非ヒトイムノグロブリンＥλ２−４を欠く。

【0067】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが以下を含むホモ接合性の内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む非ヒト動物が提供される：（ｉ）ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、（ｉｉ）ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６、（ｉｉｉ）ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、および（ｉｖ）三つのヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（または三つの配列要素を有するヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー）であって、（ｉ）〜（ｉｖ）は互いに操作可能に連結され、そして（ｉ）〜（ｉｉｉ）は非ヒトＣλ遺伝子セグメントの上流（または５’）であり、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性非ヒトイムノグロブリンＥλ２−４を欠き、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１はヒトＶλ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６は、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、そしてヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７は、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0068】

提供される非ヒト動物の一部の実施形態において、非ヒトＣλ遺伝子（または遺伝子セグメント）は、マウスＣλ１遺伝子（または遺伝子セグメント）である。提供される非ヒト動物の一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性非ヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサーのＥλとＥλ３−１をさらに含む。提供される非ヒト動物の一部のある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性非ヒトＶλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。

【0069】

一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、治療または診断のための薬剤（例えば、抗体またはその断片）の製造および／または開発における使用のために提供される。

【0070】

一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、疾患、障害または状態の治療、予防または改善のための医薬の製造における使用のために提供される。

【0071】

一部の実施形態において、例えば医薬としての使用など、医療における使用のための薬剤またはワクチンの製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の使用が提供される。

【0072】

一部の実施形態において、抗体またはその断片の製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞の使用が提供される。

【0073】

様々な実施形態において、本明細書に記載される、提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、齧歯類、齧歯類細胞または齧歯類組織であり、一部の実施形態において、マウス、マウス細胞またはマウス組織であり、一部の実施形態において、ラット、ラット細胞またはラット組織である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるマウス、マウス細胞またはマウス組織は、１２９系、ＢＡＬＢ／ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系の混合系、またはその組み合わせを含む遺伝的背景を含む。

【0074】

本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意義として使用される。約またはおよその有無に関わらず、本明細書で使用される任意の数字は、関連分野の当業者により認識される任意の通常の変動を網羅することが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
その生殖細胞ゲノムが、
（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類であって、
（ａ）および（ｂ）が、（ｃ）および齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、および
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）および一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む、齧歯類。
（項目２）
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が二つの齧歯類Ｅλを含む、項目１に記載の齧歯類。
（項目３）
前記二つの齧歯類Ｅλが、マウスＥλおよびマウスＥλ３−１である、項目２に記載の齧歯類。
（項目４）
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が三つのヒトＥλを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目５）
前記生殖細胞ゲノムが、
（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリン重鎖座位、または
（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントが、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリン重鎖座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、前記ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結されている内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、をさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目６）
一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの前記挿入は、齧歯類Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える、項目５に記載の齧歯類。
（項目７）
前記挿入は、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、項目６に記載の齧歯類。
（項目８）
一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントの前記挿入が、齧歯類ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置き換える、項目５または６に記載の齧歯類。
（項目９）
前記挿入は、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、項目８に記載の齧歯類。
（項目１０）
前記齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域が、内因性齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域である、項目５〜８のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１１）
前記齧歯類Ｃκ領域が、内因性齧歯類Ｃκ領域である、項目５〜１０のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１２）
前記内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位は、内因性ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１３）
前記齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントが、マウスＣλ□遺伝子セグメントである、項目１〜１２のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１４）
前記イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトイムノグロブリンκ軽鎖座位の近位Ｖκ重複のすべてまたは一部の挿入を含む、項目５〜１３のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１５）
前記イムノグロブリン重鎖座位が、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、項目５〜１４のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１６）
前記イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む、項目１５に記載の齧歯類。
（項目１７）
前記齧歯類が、前記内因性イムノグロブリン重鎖座位に対しホモ接合性である、項目５〜１６のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目１８）
前記齧歯類が、前記内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位に対しホモ接合性である、項目５〜１７に記載の齧歯類。
（項目１９）
前記齧歯類が、前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位に対しホモ接合性である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２０）
前記齧歯類がラットまたはマウスである、項目１〜１９のいずれか一項に記載の齧歯類。
（項目２１）
その生殖細胞ゲノムが、
（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む単離齧歯類細胞であって、
（ａ）および（ｂ）が、（ｃ）および齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、および
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）および一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む、単離齧歯類細胞。
（項目２２）
前記齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹細胞である、項目２１に記載の単離齧歯類細胞。
（項目２３）
その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）齧歯類胚性幹細胞内にＤＮＡ断片を導入することであって、前記ＤＮＡ断片は、
（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含むヌクレオチド配列を含み、
ここで（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、および
前記ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含むこと、
（ｂ）（ａ）で作製された前記齧歯類胚性幹細胞を取得すること、ならびに
（ｃ）（ｂ）の前記齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作製すること、を含む、方法。
（項目２４）
その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含み、前記操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントが、齧歯類またはヒトのＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む、齧歯類を作製する方法であって、前記方法が、
齧歯類の前記生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含むよう操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含むよう、齧歯類の前記生殖細胞ゲノムを改変することであって、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントが、齧歯類またはヒトのＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、それにより前記齧歯類を作製すること、を含む方法。
（項目２５）
前記一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントが、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントが、ヒトＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび前記一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントが、前記ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、および前記ヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、項目２６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、前記ヒトＪλおよびＣλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、および前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、ヒトＪλの上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントが、マウスＣλ遺伝子セグメントである、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、三つのヒトＥλを含む、項目２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、二つの齧歯類Ｅλを含む、項目２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記二つの齧歯類Ｅλが、マウスＥλおよびマウスＥλ３−１である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
齧歯類において抗体を産生する方法であって、
（ａ）対象抗原で齧歯類を免疫化する工程であって、前記齧歯類は、
（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、
（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および
（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、
を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む生殖細胞ゲノムを有し、
ここで（ｉ）および（ｉｉ）は、（ｉｉｉ）および齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして
前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）および一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む工程、
（ｂ）前記齧歯類が、前記対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で、前記齧歯類を維持する工程、ならびに
（ｃ）前記齧歯類または齧歯類細胞から、前記対象抗原に結合する抗体を回収する工程、を含む方法。
（項目３４）
前記齧歯類がラットまたはマウスである、項目２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
その生殖細胞ゲノムが、
（ｉ）ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、
（ｉｉ）ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６、
（ｉｉｉ）ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、および
（ｉｖ）三つのヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー、
を含むホモ接合性内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類であって、
ここで（ｉ）〜（ｉｖ）は、互いに操作可能に連結され、そして（ｉ）〜（ｉｉｉ）は齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントの上流にあり、ここで前記内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類イムノグロブリンＥλ２−４を欠き、
前記ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１が、前記ヒトＶλ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、
前記ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、前記ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、および
前記ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７は、ヒトＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、齧歯類。
（項目３６）
前記齧歯類がラットまたはマウスである、項目３５に記載の齧歯類。

【図面の簡単な説明】

【0075】

以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、例示目的のみであり限定を目的としない。

【0076】

【図1】図１は、操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を齧歯類において構築するための戦略の例に関する正確な縮尺ではない略図を示すものであり、当該座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλコード配列の存在が特徴であり、それらコード配列は互いに操作可能に連結され、齧歯類Ｃλ領域（または齧歯類Ｃλ遺伝子）に操作可能に連結される。図示されるように、五つの別個の標的化ベクター（６２８６、６５７１、６５９６、６５９７および６６８０）が示されており、それらはヒトＩｇλ軽鎖座位由来の様々な量の遺伝物質を有し、内因性齧歯類（例えばマウス）Ｉｇλ軽鎖座位内に連続して挿入される（上に示す）。第一の標的化ベクター（６２８６）は、齧歯類Ｃλ１領域の下流に挿入され、三つの配列要素により特徴付けられるモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー（Ｅλ）領域（または配列）を含有するよう構築された。第二の標的化ベクター（６５７１）は、齧歯類Ｃλ１領域の上流に挿入され、五つの機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、四つの機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、およびヒトＪλ７遺伝子セグメント（ヒトＪλ１−Ｃλ１−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ４−Ｃλ４−Ｊλ５−Ｃλ５−Ｊλ６−Ｃλ６−Ｊλ７）を含有するよう操作された。第三（６５９６）および第四（６５９７）の標的化ベクターは、追加のヒトＶλ遺伝子セグメント（それぞれ１１個および９個）のセットをさらに含み、それらは第一の標的化ベクターの標的化が成功した後に、内因性マウスＩｇλ軽鎖座位の総ヒトＶλ遺伝子セグメント内容に連続的に追加される。両方の標的化ベクターともに、３’末端に重複領域（縞模様の黒四角）を含み、それにより内因性マウスＩｇλ軽鎖座位に統合されたときに、先行する標的化ベクターの５’末端との相同組換えが促進される。代替的な第五の標的化ベクター（６６８０）も示されており、この代替的標的化ベクターは、齧歯類Ｖλ２遺伝子セグメントの５’（または上流）配列と同一である配列を有する５’相同アームを含んだという点を除き、６５９７標的化ベクターと同じ遺伝物質を有しており、これにより、標的化ベクターとの相同組換えが行われたときに、内因性Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ−Ｅλ２−４−Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの除去が促進される。別段の示唆が無い限り、黒い記号は齧歯類の遺伝子セグメントおよび／または配列を示し、一方で白い記号はヒトの遺伝子セグメントおよび／または配列を示す。部位特異的組み換え認識部位（例えばｌｏｘＰ、Ｆｒｔ）も示されており、これは選択カセット（ＨＹＧ：ユビキチンプロモーターの転写制御下にあるハイグロマイシン抵抗性遺伝子［ＨＹＧ^Ｒ］、ユビキチンプロモーターの転写制御下にあるＮＥＯネオマイシン抵抗性遺伝子［ＮＥＯ^Ｒ］）に隣接する。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、それぞれ配列番号で示されている。

【0077】

【図2】図２は、実施例１に記載される標的化ベクターの連続挿入後の、齧歯類Ｉｇλ軽鎖アレルの例の、正確な縮尺ではない略図を示す。６５９７アレル：Ｉｇλ軽鎖アレルであり、２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、四個の機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは齧歯類Ｃλ領域（例えばマウスＣλ１領域）に操作可能に連結されている。当該Ｉｇλ軽鎖座位は、内因性Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子セグメント、三つ（すなわち、Ｅ２．４、ＥおよびＥ３．１）の内因性Ｉｇλエンハンサー領域（または配列）、および三つの配列要素により特徴付けられるモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列）をさらに含む。６６８０アレル：Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子セグメントとＩｇλエンハンサーＥλ２−４の部位特異的切除が行われた後のＩｇλ軽鎖アレルであり、当該Ｉｇλ軽鎖アレルは、２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、四個の機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは齧歯類Ｃλ領域（例えばマウスＣλ１領域）に操作可能に連結されている。当該Ｉｇλ軽鎖座位は、二つ（すなわち、ＥおよびＥ３．１）内因性Ｉｇλエンハンサー領域（または配列）およびモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列、上記を参照）をさらに含む。別段の示唆が無い限り、黒い記号は齧歯類の遺伝子セグメントおよび／または配列を示し、一方で白い記号はヒトの遺伝子セグメントおよび／または配列を示す。部位特異的組み換え認識部位（例えばＦｒｔ）も示されており、これは選択カセット（ＨＹＧ：ユビキチンプロモーターの転写制御下にあるハイグロマイシン抵抗性遺伝子［ＨＹＧ^Ｒ］）に隣接する。破線は、二つの図示されるＩｇλアレルの間の削除された領域を示す。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、それぞれ配列番号で示されている。

【0078】

【図3】図３は、操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を齧歯類において構築するための戦略のもう一つの例に関する正確な縮尺ではない略図を示すものであり、当該座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλコード配列の存在が特徴であり、それらコード配列は互いに操作可能に連結され、齧歯類Ｃλ領域に操作可能に連結される。図示されるように、ヒトＩｇλ軽鎖座位由来の様々な量の遺伝物質を有する、二つの異なる標的化ベクターが示されており、それらは操作された齧歯類（例えばマウス）Ｉｇλ軽鎖座位内（上に示される）に同時に挿入され、当該座位は、五つのヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＪλ−Ｃλクラスター、およびマウスＣλ１遺伝子を含有する。６５９６標的化ベクターは、ネオマイシン選択カセットを除去して、５’末端と３’末端に重複配列（縞模様の黒四角）を組み込み、相同領域を提供して、対応するヒト配列との組み換えが促進されるように改変される。第二の標的化ベクターは、当該構築物の３’末端に重複領域（縞模様の黒四角）を含有するよう設計され、当該領域は、改変された６５９６標的化ベクター（トリミングされた６５９６標的化ベクター）と相同な配列を共有しており、これによりトリミングされた６５９６標的化ベクターの５’末端との相同組換えが促進される。これら二つの標的化ベクターは、追加のヒトＶλ遺伝子セグメント（それぞれ１１個および９個）のセットをさらに含み、それらは第一の標的化ベクターの標的化が成功した後に、内因性マウスＩｇλ軽鎖座位の総ヒトＶλ遺伝子セグメント内容に連続的に追加される。第二の標的化ベクターは、齧歯類Ｖλ２遺伝子セグメントの５’（または上流）配列と同一である配列を有する５’相同アームを含み、これにより、標的化ベクターとの相同組換えが行われたときに、内因性Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ−Ｅλ２−４−Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの除去が促進される。この二つの標的化ベクターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに共エレクトロポレーションされ、それにより操作されたＩｇλ軽鎖座位の統合が促進される。これは核配列位置の近くで矢印により示され、各々配列番号により示されている。別段の示唆が無い限り、黒い記号は齧歯類の遺伝子セグメントおよび／または配列を示し、一方で白い記号はヒトの遺伝子セグメントおよび／または配列を示す。部位特異的組み換え認識部位（例えばｌｏｘＰ、Ｆｒｔ）も示されており、これは選択カセット（ＨＹＧ：ユビキチンプロモーターの転写制御下にあるハイグロマイシン抵抗性遺伝子［ＨＹＧ^Ｒ］、ユビキチンプロモーターの転写制御下にあるＮＥＯネオマイシン抵抗性遺伝子［ＮＥＯ^Ｒ］）に隣接する。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、それぞれ配列番号で示されている。

【0079】

【図4】図４は、実施例３に記載される実験で採用された齧歯類の野生型、および操作された齧歯類Ｉｇλ軽鎖アレルの例の、正確な縮尺ではない略図を示す。野生型アレル：野生型マウスＩｇλ軽鎖座位（例えば米国特許第９，００６，５１１号の図２も参照のこと）。６５７１アレル：Ｉｇλ軽鎖アレルであり、当該アレルは、５つの機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントと四つの機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対とヒトＪλ７遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは齧歯類Ｃλ領域（例えばマウスＣλ１領域）に操作可能に連結されている。そして当該Ｉｇλ軽鎖座位は、内因性Ｖλ−Ｊλ−Ｃλ遺伝子セグメント、三つの内因性Ｉｇλエンハンサー領域（または配列）、およびモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列、上記を参照）をさらに含む。６５９７アレル：上記を参照。６６８０アレル：上記を参照。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、それぞれ配列番号で示されている。

【0080】

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ＣＤ１９（ｙ軸）およびＣＤ３（ｘ軸）の発現を示す単一細胞でゲーティングされた脾臓細胞（Ａ）、および脾臓当たりの細胞絶対数（Ｂ）を示す、代表的な等高線図を示す。

【0081】

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ＩｇＤ（ｙ軸）およびＩｇＭ（ｘ軸）の発現を示すＣＤ１９^＋上でゲーティングされた脾臓細胞中の成熟Ｂ細胞および移行期Ｂ細胞（Ａ）、ならびに脾臓当たりの細胞絶対数（Ｂ）を示す、代表的な等高線図を示す。脾臓Ｂ細胞亜群は、各ドットプロット上に記載される（例えば成熟、移行期など）。

【0082】

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ＣＤ１９^＋でゲーティングされた脾臓細胞におけるマウスＩｇλ（ｍＩｇλ、ｙ軸）、マウスＩｇκ（ｍＩｇκ、ｘ軸）またはヒトＩｇλ（ｈＩｇλ、ｙ軸）の発現を示す代表的な等高線図を示す。

【0083】

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ＣＤ１９（ｙ軸）およびＣＤ３（ｘ軸）の発現を示す単一細胞でゲーティングされた骨髄（Ａ）、および大腿骨当たりの細胞絶対数（Ｂ）を示す、代表的な等高線図を示す。

【0084】

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ｃ−ｋｉｔ（ｙ軸）およびＣＤ４３（ｘ軸）の発現を示すＣＤ１９^＋ＩｇＭ^ｌｏｗＢ２２０^ｉｎｔでゲーティングされた骨髄（Ａ）、および大腿骨当たりの細胞絶対数（Ｂ）を示す、代表的な等高線図を示す。脾臓Ｂ細胞亜群は、各ドットプロット上に記載される（例えばプロＢ、プレＢなど）。

【0085】

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から採取された、ＩｇＭ（ｙ軸）およびＢ２２０（ｘ軸）の発現を示すＣＤ１９^＋でゲーティングされた骨髄（Ａ）、および大腿骨当たりの細胞絶対数（Ｂ）を示す、代表的な等高線図を示す。具体的なＢ細胞亜群は各ドットプロット上に記載される（例えば未成熟、成熟、プレおよびプロＢ細胞）。

【0086】

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）からの、マウスＩｇλ（ｍＩｇλ、ｙ軸）、マウスＩｇκ（ｍＩｇκ、ｘ軸）またはヒトＩｇλ（ｈＩｇλ、ｙ軸）の発現を示す未成熟骨髄（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋Ｂ２２０^ｉｎｔでゲーティングされた）を示す代表的な等高線図を示す。

【0087】

【図12】図１２Ａおよび１２Ｂは、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）からの、マウスＩｇλ（ｍＩｇλ、ｙ軸）、マウスＩｇκ（ｍＩｇκ、ｘ軸）またはヒトＩｇλ（ｈＩｇλ、ｙ軸）の発現を示す成熟骨髄（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋Ｂ２２０^＋でゲーティングされた）を示す代表的な等高線図を示す。

【0088】

【図13】図１３は、本明細書に記載される、選択された操作マウス系統由来の脾臓、未成熟骨髄（未成熟ＢＭ）、および成熟骨髄（成熟ＢＭ）における、Ｉｇκ発現（％κＣ）およびヒトＩｇλ発現（％ヒトλＣ）Ｂ細胞の代表的な割合平均を示す。データは平均値として表され、標準偏差も示されている。６６８０ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：ホモ接合性の操作Ｉｇλ軽鎖座位を含有する操作マウス系統であり、当該座位は、２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、四個の機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含有するよう設計され、それらセグメントは齧歯類Ｃλ領域（例えばマウスＣλ１領域）に操作可能に連結されている。当該Ｉｇλ軽鎖座位は、二個の内因性Ｉｇλエンハンサー領域（または配列）およびモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列、上記を参照のこと）をさらに含む。そして当該マウス系統は、ホモ接合性のヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含み、当該ホモ接合性ヒト化ＩｇＨ座位は、挿入齧歯類Ａｄａｍ６コード配列（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照のこと。当該内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）を含有した。６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：ホモ接合性の操作Ｉｇλ軽鎖座位を含有する操作マウス系統であり、当該座位は、２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、四個の機能性ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは齧歯類Ｃλ領域（例えばマウスＣλ１領域）に操作可能に連結され、当該Ｉｇλ軽鎖座位は、二個の内因性Ｉｇλエンハンサー領域（または配列）およびモジュール式ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列、上記を参照）をさらに含む。そして当該マウス系統は、ホモ接合性のヒト化ＩｇＨとＩｇκ座位を含み、当該ホモ接合性ヒト化ＩｇＨ座位は、挿入齧歯類Ａｄａｍ６コード配列（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照のこと。当該内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）を含有した。各遺伝子型コホートのマウスの数は、一群当たり、少なくとも三匹から最大で八匹が含まれた。

【0089】

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、マウス（Ｂ、右の画像）またはヒト（Ａ、左の画像）のλ軽鎖の発現を示す、６６８０標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性の操作マウス（６６８０ＨＯ）および野生型の同腹仔（ＷＴ）から単離された血清を使用した、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの代表的なイムノブロット（ウェスタンブロット）を示す。各サンプルは１．５μｌ量の血清でレーン内に流された。ＰＨＳ：０．２５μｌ量でプールされたヒト血清（Ｌａｂｑｕｉｐ Ｌｔｄ カタログ番号＃９１０１Ａ）。分子量Ｋｄは、各ゲル画像の右側に示される。

【0090】

【図15A】図１５Ａは、６８８９ＨＥＴマウス（ｎ＝５）から採取された脾臓細胞から単離されたＲＮＡから増幅された、ヒトＣλプライミング配列における、代表的なヒトＶλ（上）およびヒトＪλ（下）遺伝子セグメントの使用を示す。

【0091】

【図15B】図１５Ｂは、６８８９ＨＥＴマウス（ｎ＝５）から採取された脾臓細胞から単離されたＲＮＡから増幅された、マウスＣλプライミング配列における、代表的なヒトＶλ遺伝子セグメントの使用を示す。

【0092】

【図15C】図１５Ｃは、６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯマウス（ｎ＝６）から採取された脾臓細胞から単離されたＲＮＡから増幅された、ヒトＣλプライミング配列における、代表的なヒトＶλ（上）およびヒトＪλ（下）遺伝子セグメントの使用を示す。

【0093】

【図15D】図１５Ｄは、６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯマウス（ｎ＝６）から採取された脾臓細胞から単離されたＲＮＡから増幅された、マウスＣλプライミング配列における、代表的なヒトＶλ遺伝子セグメントの使用を示す。

【0094】

【図16】図１６Ａおよび１６Ｂは、６５９７（６５９７ＨＥＴ、ｎ＝６）標的化ベクターまたは６６８０（６６８０ＨＥＴ、ｎ＝６）標的化ベクターの挿入に対してヘテロ接合性の免疫化マウス、および免疫化野生型対照（ＷＴ、ｎ＝６）から採取された、０日目および２２日目の血清中の代表的な総ＩｇＧ力価（Ａ）および抗原特異的ＩｇＧ力価（Ｂ）を示す。

【0095】

【図17A】図１７Ａ〜Ｃは、６５９７（６５９７ＨＥＴ、ｎ＝６）標的化ベクターまたは６６８０（６６８０ＨＥＴ、ｎ＝６）標的化ベクターの挿入に対してヘテロ接合性の免疫化マウス、および免疫化野生型対照（ＷＴ、ｎ＝６）から採取された、０日目および２２日目の血清中の抗原特異的ＩｇＧにおける代表的なヒトλ軽鎖（ｈＩｇλ、左）、マウスλ軽鎖（ｍＩｇλ、真ん中）、およびマウスκ軽鎖（ｍＩｇκ、右）の力価を示す。

【図17B】同上。

【図17C】同上。

【0096】

【図18】図１８Ａおよび１８Ｂは、６８８９標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６８８９ＨＯ ＶＩ ＨＯ Ａｄａｍ６ ＨＯ）および参照操作マウス（ＶＩ）から採取された、ＣＤ１９（ｙ軸）およびＣＤ３（ｘ軸）の発現を示す単一細胞でゲーティングされた脾臓細胞（左）、および脾臓当たりの総Ｂ細胞（右）を示す、代表的な等高線図を示す。６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：上記を参照のこと。ＶＩ：ホモ接合性のヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含有する操作マウス系統であり、当該ホモ接合性ヒト化ＩｇＨ座位は、挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列を含有した（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照のこと。それら特許はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。生単一細胞の脾臓細胞は、活性染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）により決定した。

【0097】

【図19】図１９は、６８８９標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６８８９ＨＯ ＶＩ ＨＯ Ａｄａｍ６ ＨＯ）および参照操作マウス（ＶＩ）から採取された、ＣＤ１９^＋でゲーティングされた脾臓細胞中のヒトＩｇλ（ｈＩｇλ、ｙ軸）およびマウスＩｇκ（ｍＩｇκ、ｘ軸）の発現を示す代表的な等高線図を示す。６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：上記を参照。ＶＩ：上記を参照。

【0098】

【図20】図２０は、６８８９標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６８８９ＨＯ ＶＩ ＨＯ Ａｄａｍ６ ＨＯ）および参照操作マウス（ＶＩ）の大腿骨から採取された、ＩｇＭ（ｙ軸）およびＢ２２０（ｘ軸）の発現を示す骨髄由来の単一細胞でゲーティングされたリンパ球を示す、代表的な等高線図を示す。６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：上記を参照。ＶＩ：上記を参照。未成熟および成熟Ｂ細胞亜群は各等高線図上に記載されている。

【0099】

【図21】図２１は、６８８９標的化ベクターの挿入に対しホモ接合性のマウス（６８８９ＨＯ ＶＩ ＨＯ Ａｄａｍ６ ＨＯ）および参照操作マウス（ＶＩ）からの、ヒトＩｇλ（ｈＩｇλ、ｙ軸）およびマウスＩｇκ（ｍＩｇκ、ｘ軸）の発現を示す未成熟骨髄（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋Ｂ２２０^ｉｎｔでゲーティング、左のカラム）および成熟骨髄（ＣＤ１９^＋ＩｇＭ^＋Ｂ２２０^＋でゲーティング、右のカラム）を示す代表的な等高線図を示す。６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ：上記を参照。ＶＩ：上記を参照。

【発明を実施するための形態】

【0100】

配列表中の選択配列の簡単な説明
マウスＣλ１ ＤＮＡ（配列番号１）：
GCCAGCCCAAGTCTTCGCCATCAGTCACCCTGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGACTAACAAGGCCACACTGGTGTGTACGATCACTGATTTCTACCCAGGTGTGGTGACAGTGGACTGGAAGGTAGATGGTACCCCTGTCACTCAGGGTATGGAGACAACCCAGCCTTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACATGGCTAGCAGCTACCTGACCCTGACAGCAAGAGCATGGGAAAGGCATAGCAGTTACAGCTGCCAGGTCACTCATGAAGGTCACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGACTGTTCC

【0101】

マウスＣλ１ アミノ酸（配列番号２）：
GQPKSSPSVTLFPPSSEELETNKATLVCTITDFYPGVVTVDWKVDGTPVTQGMETTQPSKQSNNKYMASSYLTLTARAWERHSSYSCQVTHEGHTVEKSLSRADCS

【0102】

マウスＣλ２ ＤＮＡ（配列番号３）：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACTCTCACCGTGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGGAAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCCAACTTTTCCCCGAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGGCAACAAGTTCATGGCCAGCAGCTTCCTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGTCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC

【0103】

マウスＣλ２ アミノ酸（配列番号４）：
GQPKSTPTLTVFPPSSEELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEGNKFMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL

【0104】

マウスＣλ３ ＤＮＡ（配列番号５）：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACCATGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGGAAAACAAAGCCACACTCGTGTGTCTGATTTCCAATTTTTCCCCAAGTGGTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTACACCTATCACCCAGGGTGTGGACACTTCAAATCCCACCAAAGAGGACAACAAGTACATGGCCAGCAGCTTCTTACATTTGACATCGGACCAGTGGAGATCTCACAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGGACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTCTC

【0105】

マウスＣλ３ アミノ酸（配列番号６）：
GQPKSTPTLTMFPPSPEELQENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTSNPTKEDNKYMASSFLHLTSDQWRSHNSFTCQVTHEGDTVEKSLSPAECL

【0106】

ラットＣλ１ ＤＮＡ（配列番号７）：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAGAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAATGTGTC

【0107】

ラットＣλ１ アミノ酸（配列番号８）：
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV

【0108】

ラットＣλ２ ＤＮＡ（配列番号９）：
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC

【0109】

ラットＣλ２ アミノ酸（配列番号１０）：
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS

【0110】

ラットＣλ３ ＤＮＡ（配列番号１１）：
GTCAGCCCAAGTCCACTCCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTACCTGCCAAGTTACACATGAAGGGAACACTGTGGAAAAGAGTCTGTCTCCTGCAGAGTGTGTC

【0111】

ラットＣλ３ アミノ酸（配列番号１２）：
GQPKSTPTLTVFPPSTEELQGNKATLVCLISDFYPSDVEVAWKANGAPISQGVDTANPTKQGNKYIASSFLRLTAEQWRSRNSFTCQVTHEGNTVEKSLSPAECV

【0112】

ラットＣλ４ ＤＮＡ（配列番号１３）：
ACCAACCCAAGGCTACGCCCTCAGTCACCCTGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGACTGACAAGGCTACACTGGTGTGTATGGTGACAGATTTCTACCCTGGTGTTATGACAGTGGTCTGGAAGGCAGATGGTACCCCTATCACTCAGGGTGTGGAGACTACCCAGCCTTTCAAACAGAACAACAAGTACATGGCTACCAGCTACCTGCTTTTGACAGCAAAAGCATGGGAGACTCATAGCAATTACAGCTGCCAGGTCACTCACGAAGAGAACACTGTGGAGAAGAGTTTGTCCCGTGCTGAGTGTTCC

【0113】

ラットＣλ４ アミノ酸（配列番号１４）：
DQPKATPSVTLFPPSSEELKTDKATLVCMVTDFYPGVMTVVWKADGTPITQGVETTQPFKQNNKYMATSYLLLTAKAWETHSNYSCQVTHEENTVEKSLSRAECS
定義

【0114】

本発明の範囲は、本明細書に添付される請求の範囲により規定されるものであり、本明細書に記載されるいくらかの実施形態により限定されない。当分野の当業者は、本明細書を読むことで、かかる記載される実施形態に対し均等であり得る様々な改変、または別の手段で請求の範囲内にあり得る様々な改変を認識するであろう。

【0115】

概して、本明細書で使用される用語は、明白な別段の示唆が無い限り、当分野で理解される意味に従う。ある用語の明白な定義を以下に提供する本明細書全体を通じ、特定の例におけるこれらの用語および他の用語の意味は、文脈から、当分野の当業者には明らかであろう。以下の用語および他の用語に関する追加的な定義は、本明細書全体を通じて説明される。本明細書内またはその関連部分内に引用されている特許および非特許参考文献は、参照によりその全体で本明細書に援用される。

【0116】

投与：本明細書において使用される場合、対象またはシステム（たとえば、細胞、臓器、組織、生物、または関連構成要素もしくはその構成要素のセット）に対する組成物の投与を含む。当業者であれば、投与経路は、例えば、その組成物が投与される対象またはシステム、組成物の性質、投与目的などに応じて異なり得ることを認識するであろう。例えば、特定の実施形態では、動物対象（例えば、ヒトまたは齧歯類）への投与は、気管支投与（気管支注入を含む）、口腔投与、腸内投与、皮間投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内投与、筋肉内投与、鼻内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、静脈内投与、心室内投与、粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管投与（気管内注入を含む）、経皮投与、膣投与、および／または硝子体投与であってもよい。一部の実施形態では、投与は、間欠投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を含み得る。

【0117】

改善：本明細書において使用される場合、状態の防止、減少、もしくは緩和、または対象の状態の改善を含む。改善は、疾患、障害、または症状の完全な回復または完全な防止を含むが、必須ではない。

【0118】

およそ：一つ以上の対象の値に適用される場合、指定された参照値に類似した値を含む。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段定めがない限り、または文脈からそうでないことが明らかな場合（このような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）を除いて、指定された参照値のいずれかの方向に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満以内の範囲の値を指す。

【0119】

生物学的に活性：本明細書で使用される場合、生物系、インビトロまたはインビボ（例えば、生物中）で活性を持つ任意の薬剤の特徴を示す。例えば、薬剤が生物内に存在する場合、その生物内で生物学的効果を持つ薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性な場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、「生物学的に活性」な部分と一般的に呼ばれる。

【0120】

同等：本明細書において使用される場合、お互いに同一ではなくてもよいが、それらの間の比較を許容できるほど十分に類似しており、従って観察された差異または類似性に基づいて合理的に結論を導き得る、二つ以上の剤、実体、状況、状態のセットなどを指す。当分野の通常の技能を有する者であれば、文脈内において、任意の所与の環境下でかかる剤、実体、状況、条件群などの二つ以上が同等とみなされるためにはどの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。

【0121】

保存的：本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換を記載する例を指し、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。一般的に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能特性、例えば、リガンドに結合する受容体の能力などを実質的に変化させない。類似の化学特性を伴う側鎖を有するアミノ酸群の例には以下が挙げられる：例えばグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）などの脂肪族側鎖；例えばセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）及びスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）などの脂肪族−ヒドロキシル側鎖；例えばアスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）などのアミド含有側鎖；例えばフェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）などの芳香族側鎖；例えばリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）などの塩基性側鎖；例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの酸性側鎖；ならびに例えばシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）及びメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）などの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン（Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｖ／Ｌ／Ｉ）、フェニルアラニン／チロシン（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｆ／Ｙ）、リシン／アルギニン（Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｋ／Ｒ）、アラニン／バリン（Ａｌａ／Ｖａｌ、Ａ／Ｖ）、グルタミン酸／アスパラギン酸（Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｅ／Ｄ）、及びアスパラギン／グルタミン（Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｎ／Ｑ）が含まれる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘導などで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性がある。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、この場合において該置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで負ではない値を有する。

【0122】

対照：本明細書において使用される場合、結果が比較される基準である「対照」という当技術分野の意味を指す。一般的に、対照は、変数についての結論を出すために、このような変数を分離することによって実験の完全性を増加させるのに使用される。一部の実施形態では、対照は、コンパレーターを提供するために、試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」とは、「対照動物」も含む。「対照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。ある実験では、「試験」（すなわち、試験されている変数）が適用される。その「対照」である第二の実験では、その試験されている変数が適用されない。一部の実施形態では、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイの、または以前に知られた量または結果）である。一部の実施形態では、対照は印刷されたかまたはそれ以外の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。対照は、陽性対照または陰性対照である場合がある。

【0123】

【0124】

〜から誘導された：再構成されていない可変領域および／または再構成されていない可変領域遺伝子セグメント「から誘導された」再構成された可変領域遺伝子または可変ドメインに関して使用される場合、当該再構成された可変領域遺伝子または可変ドメインの配列を、再構成されていない可変領域遺伝子セグメント群まで遡り突き止める能力を指し、当該遺伝子セグメントは再構成されて、可変ドメインを発現する再構成済み可変領域遺伝子を形成した（適切な場合には、スプライス差異、および体細胞変異の原因となる）。例えば、体細胞変異を経た再構成済み可変領域遺伝子は、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントから誘導されたという事実は変わらない。

【0125】

破壊：本明細書において使用される場合、（例えば、遺伝子または座位などの内因性相同配列を有する）ＤＮＡ分子との相同組み換え事象の結果を指す。一部の実施形態では、破壊は、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体または例えばエクソンなどの遺伝子の断片の挿入を含む場合があり、これは内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であってもよい。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたポリペプチドの）発現および／または活性を増加させる場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたポリペプチド）の配列を変える場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたポリペプチド）を切断または断片化する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物を伸長させる場合がある。一部のかかる実施形態では、破損は融合ポリペプチドの組立を遂行する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響するが、その活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するが、そのレベルには影響しない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。

【0126】

決定すること、測定すること、査定すること、評価すること、検査すること、および分析すること：本明細書において相互交換可能に使用され、任意の形態の測定結果を指し、要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。アッセイは相対的または絶対的である場合がある。「の存在をアッセイする」ことは、存在する何かの量を決定するおよび／またはそれが存在するか不在かを決定することである可能性がある。

【0127】

内因性座位または内因性遺伝子：本明細書において使用される場合、本明細書に記述される破損、欠失、置換、変化、または改変の導入前に、親または参照生物において存在する遺伝子座位を指す。一部の実施形態では、内因性座位は自然界に存在する配列を有する。一部の実施形態では、内因性座位は野生型座位である。一部の実施形態では、内因性座位は操作された座位である。一部の実施形態では、参照生物は野生型生物である。一部の実施形態では、参照生物は遺伝子操作された生物である。一部の実施形態では、参照生物は実験室で繁殖された生物（野生型または遺伝子操作型）である。

【0128】

内因性プロモーター：本明細書で使用される場合、例えば、野生型生物で、内因性遺伝子と自然に関連するプロモーターを指す。

【0129】

操作された（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）：本明細書において使用される場合、概して、ヒトの手により操作された態様を指す。例えば一部の実施形態では、自然界での順序では一緒に連結されていない二つ以上の配列がヒトの手により操作され、操作ポリヌクレオチド中で互いに直接連結された場合に、「操作された」とみなされ得る。一部の特定のかかる実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、自然界で第一のコード配列と作動的に関連しているが、第二のコード配列とは作動的に関連せずに存在し、ヒトの手により連結されて第二のコード配列と作動的に関連した制御配列を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、各々、自然界では互いに連結されていないポリペプチド要素またはドメインをコードしている第一及び第二の核酸配列が、一つの操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに連結されていてもよい。同様に、一部の実施形態では、細胞または生物体が操作され、それによりその遺伝情報が改変された（例えば、従前には存在していなかった新たな遺伝物質が導入されたり、または従前には存在していた遺伝物質が変更もしくは除去された）場合に、「操作された」とみなされ得る。一般的なことであり、当技術分野の当業者に理解されているとおり、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫物も通常、実際の操作は過去の実体に対して行われていたのだとしても、「操作された」とみなされる。さらに、当技術分野の当業者により認識されているように、様々な技法が利用可能であり、それらを介して、本明細書に記載される「操作」を行うことができる。例えば、一部の実施形態では、「操作」には、分析または比較を行うようプログラムされた、または推奨された配列および／もしくは選択された配列を別手段により分析するようプログラムされた、コンピューターシステムの使用を介して（例えば核酸配列、ポリペプチド配列、細胞、組織および／または生物体の）選択または設計を行うことを含んでもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では「操作」には、インビトロ化学合成技術の使用、及び／または組み換え核酸技術、例えば（例えばポリメラーゼ鎖反応などを介した）核酸増幅、ハイブリダイゼーション、突然変異誘導、形質転換、トランスフェクションなどの使用を含んでもよく、及び／または様々な任意の制御交配法の使用を含んでもよい。当技術分野の当業者に認識されているように、確立されている様々なこうした技術（例えば組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法など））が当技術分野に周知であり、様々な概説および詳説の参照文献中に記載されており、それらは本明細書全体を通じて引用および／または考察されている。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，５ｔｈ Ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｙ Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，１９９４を参照のこと。

【0130】

機能性：本明細書において使用される場合、特定の特性を示す（例えばコード配列の一部を形成する）および／または活性を示す実体（例えば遺伝子または遺伝子セグメント）の形態または断片を指す。例えばイムノグロブリンとの関連において、可変ドメインは固有の遺伝子セグメント（すなわちＶ、Ｄおよび／またはＪ）によりコードされ、アセンブリされて（または組み替えられて）機能性コード配列を形成する。ゲノム中に存在する場合、遺伝子セグメントはクラスター中に構造化されるが、多様性は発生する。「機能性」遺伝子セグメントは、発現配列（すなわち可変ドメイン）中に現れた遺伝子セグメントであり、それに対応するゲノムＤＮＡは単離され（すなわちクローニングされ）、配列により特定されている。一部のイムノグロブリン遺伝子セグメント配列はオープンリーディングフレームを含有しており、機能性であるとみなされるが、発現レパートリー中には現れない。一方で他のイムノグロブリン遺伝子セグメント配列は終止コドンおよび／または短縮配列を生じさせる変異（すなわち点変異、挿入、欠失など）を含有し、それによりその後、かかる遺伝子セグメント配列は、非変異配列と関連した特性および／または活性を実施できなくなる。かかる配列は発現配列中に現れず、ゆえに偽遺伝子とカテゴライズされる。

【0131】

遺伝子：本明細書において使用される場合、産物（例えばＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする、染色体中のＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の特定の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えばエクソン配列）と非コード配列（例えばイントロン配列）の両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、一つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでもよく、および／または例えば遺伝子発現（例えば、細胞型特異的発現、誘導発現など）の一つ以上の態様を制御することができる、もしくは影響を与えることができるイントロン配列を含んでもよい。明確化のために記載すると、本開示において使用される場合、用語「遺伝子」は、概してポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の一部を意味し；当該用語は任意選択的に制御配列を包含する場合があり、これは当技術分野の当業者には文脈から明らかであるはずである。この定義は、「遺伝子」という用語を非タンパク質をコードする発現単位に適用することを除外する意図はなく、本明細書に使用される当該用語は、多くの場合においてはポリペプチドをコードする核酸を指すことを明らかにすることを意図している。

【0132】

異種：本明細書において用いられる場合、異なる起源からの主体または実体を指す。例えば、特定の細胞もしくは生物に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関連して使用される場合、該用語は、関連ポリペプチド、遺伝子または遺伝子産物が、１）ヒトの手により操作されていること、２）ヒトの手を介して細胞または生物（またはその前駆体）に導入されていること、および／または３）当該関連細胞もしくは生物（例えば関連細胞型または生物型）中に自然状態では産生されない、または存在しないこと、を明らかにする。「異種」は、たとえば天然では関連していない、および一部の実施形態では非内因性の制御因子（たとえばプロモーター）の制御下にある、特定の天然の細胞または生物中に通常存在するが、突然変異または置換により変化する、または改変されるポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物も含む。

【0133】

宿主細胞：本明細書において使用される場合、その中に核酸またはタンパク質が導入された細胞を指す。当業者が本開示を読めば、このような用語が特定の主題細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう。突然変異または環境の影響によって特定の改変は後続世代にも起こる可能性があるため、このような子孫は、実際は、親細胞と同一でない場合があるが、それでも「宿主細胞」という文言の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であるかそれを含む。一般的に、宿主細胞は、細胞が指定される種に関わらず、異種核酸またはタンパク質の受け入れおよび／または生産に適した任意の細胞である。細胞の例としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は単離細胞であるかそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。

【0134】

同一性：配列の比較と関連して本明細書において用いられる場合、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために使用できる当技術分野において公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を指す。一部の実施形態では、本明細書に記述された同一性は、１０．０のギャップ開始ペナルティ、０．１のギャップ延長ペナルティを用い、Ｇｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用して決定される。

【0135】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ）：本明細書で使用する場合、多細胞生物体内ではなく、例えば試験管または反応容器などの人工的環境、細胞培養などにおいて発生する事象を指す。

【0136】

ｉｎ ｖｉｖｏ（インビボ）：本明細書で使用される場合、例えばヒトおよび／または非ヒト動物などの多細胞生物内で発生する事象を指す。細胞ベース系の文脈において、当該用語を使用して、（例えばインビトロシステムとは対照的に）生細胞内で発生する事象を意味する場合もある。

【0137】

単離された：本明細書において使用される場合、（１）（天然環境及び／もしくは実験環境のいずれかで）最初に産生された時にそれが関連していた成分の少なくとも一部から分離された物質ならびに／または実体、ならびに／あるいは（２）ヒトの手によって設計、産生、調製、及び／もしくは製造された物質ならびに／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連していたその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離される場合がある。一部の実施形態において、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％〜１００％、１５％〜１００％、２０％〜１００％、２５％〜１００％、３０％〜１００％、３５％〜１００％、４０％〜１００％、４５％〜１００％、５０％〜１００％、５５％〜１００％、６０％〜１００％、６５％〜１００％、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％、９６％〜１００％、９７％〜１００％、９８％〜１００％、または９９％〜１００％から分離される。一部の実施形態において、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％〜１００％、１０％〜９９％、１０％〜９８％、１０％〜９７％、１０％〜９６％、１０％〜９５％、１０％〜９０％、１０％〜８５％、１０％〜８０％、１０％〜７５％、１０％〜７０％、１０％〜６５％、１０％〜６０％、１０％〜５５％、１０％〜５０％、１０％〜４５％、１０％〜４０％、１０％〜３５％、１０％〜３０％、１０％〜２５％、１０％〜２０％、または１０％〜１５％から分離される。一部の実施形態において、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１１％〜９９％、１２％〜９８％、１３％〜９７％、１４％〜９６％、１５％〜９５％、２０％〜９０％、２５％〜８５％、３０％〜８０％、３５％〜７５％、４０％〜７０％、４５％〜６５％、５０％〜６０％、または５５％〜６０％から分離される。一部の実施形態において、単離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。一部の実施形態において、単離された物質は、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、９５％〜９９％、９６％〜９９％、９７％〜９９％、または９８％〜９９％純粋である。一部の実施形態において、単離された物質は８０％〜９９％、８０％〜９８％、８０％〜９７％、８０％〜９６％、８０％〜９５％、８０％〜９０％、または８０％〜８５％純粋である。一部の実施形態において、単離された物質は８５％〜９８％、９０％〜９７％、または９５％〜９６％純粋である。一部の実施形態では、物質は、その他の成分が実質的に含まれない場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解するように、例えば、一つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの特定のその他の成分と組み合わされた後でも、物質はまだ「単離された」または「純粋」とさえもみなされる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントはこのような担体または賦形剤を含めることなく計算される。一例を挙げると、一部の実施形態では、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、ａ）導出の起源またはソースが、自然界の天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべてと関連していない時、ｂ）それが、自然界でそれを生産する種と同じ種のその他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない時、またはｃ）自然界でそれを生産する種ではない細胞またはその他の発現系によって発現されるか、またはそうでなければそれからの成分と関連している時、「単離された」とみなされる。従って、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成された、または自然界でそれを生産するものとは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。あるいはまたは追加的に、一部の実施形態では、一つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが、ａ）それが自然界で関連している、および／またはｂ）最初に生産された時にそれが関連していたその他の成分から分離されている限りは「単離された」ポリペプチドとみなされることができる。

【0138】

座位：本明細書において使用される場合、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または生物ゲノムの染色体上の位置の特定の場所を指す。 例えば、「イムノグロブリン座位」とは、イムノグロブリン遺伝子セグメント（例えばＶ、Ｄ、ＪまたはＣ）の特定の位置、イムノグロブリン遺伝子セグメントＤＮＡ配列、イムノグロブリン遺伝子セグメントをコードする配列、またはかかる配列が存在する場所として特定された生物体ゲノムの染色体上のイムノグロブリン遺伝子セグメントの位置を指す場合がある。「イムノグロブリン座位」は、限定されないが、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’の制御配列または領域、またはそれらの組み合わせをはじめとする、イムノグロブリン遺伝子セグメントの制御因子を含有する場合がある。「イムノグロブリン座位」は、通常、野生型座位の遺伝子セグメント間に存在するＤＮＡを含有する場合があるが、そのＤＮＡ自身はイムノグロブリン遺伝子セグメントを欠いている（例えば、自然界ではＶ遺伝子セグメント群とＪ遺伝子セグメント群の間に存在するイムノグロブリンＤＮＡ配列、自然界ではＪ遺伝子セグメント群と定常領域遺伝子の間に存在するイムノグロブリンＤＮＡ配列、または自然界では定常領域遺伝子の３’側に存在するイムノグロブリンＤＮＡ配列など）。当技術分野の当業者には、一部の実施形態において、染色体が、数百、さらには数千の遺伝子を含有し得ること、及び異なる種の間で比較した場合に、類似した座位の物理的な共局在を示し得ることが理解されるであろう。かかる遺伝子座位は、シンテニー（ｓｙｎｔｅｎｙ）を共有したと記載され得る。

【0139】

非ヒト動物：本明細書で使用される場合、ヒトではない任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。

【0140】

核酸：本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチド鎖であるか、もしくはオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれることができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、「核酸」とはオリゴヌクレオチド鎖であるか、またはホスホジエステル結合でオリゴヌクレオチド鎖組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかであるように一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基を備えるオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはそれを含み、一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の天然核酸残基を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の核酸類似体を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で「核酸」とは異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野で公知であり、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を持つ、一つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、一つ以上のホスホロチオエートおよび／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は一つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、または一つ以上の天然ヌクレオシドから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５ プロピニル−シチジン、Ｃ−５ プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、およびそれらの組み合わせ）であるか、またはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、天然核酸のものと比べて、一つ以上の改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のエクソンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、天然起源物からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または系での複製、および化学合成の一つ以上によって調製される。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも限定されないが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれを超える残基の長さである。一部の実施形態では、「核酸」は一本鎖であり、一部の実施形態では、「核酸」は二重鎖である。一部の実施形態では、「核酸」はポリペプチドをコードするか、またはポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも一つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、「核酸」は酵素活性を持つ。

【0141】

操作可能に連結された：本明細書において使用される場合、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を指す。例えば、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントが再構成されて、再構成済み可変領域遺伝子を形成することができ、そして当該再構成済み可変領域が、定常領域遺伝子と連結されて抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として発現される場合は、当該再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、連続的な定常領域遺伝子に「操作可能に連結されている」。コード配列に「操作可能に連結した」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合されている。「操作可能に連結した」配列には、対象の遺伝子と連続する発現制御配列と、トランスで、または離れて作用して対象の遺伝子（または対象の配列）を制御する発現制御配列の両方を含む。「発現制御配列」という用語は、ポリヌクレオチド配列を含み、それらが結合されるコード配列の発現およびプロセッシングに作用するために必要である。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、ポリペプチド安定性を強化する配列、および望ましい場合には、ポリペプチド分泌を強化する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、かかる制御配列としては、概して、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる一方、真核生物では、かかる制御配列としては、概して、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられる。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。

【0142】

生理学的条件：本明細書において使用される場合、細胞および生物が生存し、および／または繁殖する条件に言及する当分野に理解される意味を指す。一部の実施形態では、当該用語には、生物または細胞系に対し自然界で発生し得る外的環境または内的環境の条件が含まれる。一部の実施形態では、生理学的条件は、ヒトまたは非ヒト動物の身体内にある条件であり、特に手術部位の、および／または手術部位内の条件である。生理学的条件は、典型的には、たとえば２０〜４０℃の範囲の温度、１気圧、ｐＨ６〜８、１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大気中の酸素濃度、および地球上で遭う重力などを含む。一部の実施形態では、実験室での条件は、生理学的条件に操作され、および／または維持される。一部の実施形態では、生理学的条件は、生物内で遭う条件である。

【0143】

ポリペプチド：本明細書において使用される場合、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、お互いに別々に自然界に存在する部分を含むアミノ酸配列を持つ（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分など、二つ以上の異なる生物からのもの）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用を通して、設計および／または生産されるという点で、遺伝子操作されたアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界には存在しない配列にコードされるアミノ酸配列を有する（例えば、それがヒトの手の作用を介して、前記ポリペプチドをコードするように設計および／または生産されるという点で操作された配列を有する）。

【0144】

組み換え：本明細書で使用される場合、組み換え手段によって設計、操作、調製、発現、生成または単離されたポリペプチドを指すことが意図されており、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，１９９７，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ，Ｈ．ａｎｄ Ｗ．Ｅ．Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，２００２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８−４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．，ａｎｄ Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１−８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対しトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ−Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−７；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−７０；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１−９０；Ｌｅｅ，Ｅ−Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（４）：３５６−６３；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１４７−５２；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３−８を参照）または選択された配列要素の相互スプライスを伴うその他の任意の手段によって調製、発現、生成または単離されたポリペプチドを指す。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上は自然界に存在する。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上はインシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のこのような選択配列要素は、例えば、天然または合成起源の既知の配列要素の変異誘導（例えば、インビボまたはインビトロ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、対象のソース生物（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムに見られる配列から成る。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、変異誘導（例えば、非ヒト動物での、インビトロまたはインビボ）から生じるアミノ酸配列を持ち、従って、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列から由来するが、インビボで非ヒト動物のゲノム内に自然には存在しない場合がある。

【0145】

参照：本明細書で使用される場合、対象の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値が比較される、標準または対照の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を指す。一部の実施形態では、参照の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列もしくは値の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。一部の実施形態では、参照の作用剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、任意選択的に有形媒体で具現化された公知の参照である。一部の実施形態では、参照は対照を指す場合がある。「参照」は、「参照動物」も含む。「参照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。典型的には、当業者には理解されるように、参照の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、集団、サンプル、配列もしくは値を決定または特徴付けるために利用される条件と同等の条件下で決定または特徴付けられる。

【0146】

置換：本明細書に記載される場合、それを通して（例えば、ゲノムの）宿主座位に見られる「置換された」核酸配列（例えば、遺伝子）がその座位から取り除かれ、異なる「置換」用核酸がその場所に配置されるプロセスを指す。一部の実施形態では、置換された核酸配列及び置換用核酸配列は、例えば、それらがお互いに相同である、及び／または対応する要素（例えば、タンパク質コード要素、調節エレメントなど）を含有するという点でお互いに同等である。一部の実施形態では、置換された核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライス供与部位、スプライスアクセプター部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうち一つ以上を含み、一部の実施形態では、置換用核酸配列は、一つ以上のコード配列を含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列は、置換された核酸配列のホモログまたはバリアント（たとえば変異体）である。一部の実施形態では、置換用核酸配列は、置換された配列のオルソログまたはホモログである。一部の実施形態では、置換用核酸配列はヒト核酸配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを含む場合を含め、置換された核酸配列は齧歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはそれを含む場合を含め、置換された核酸配列はヒト配列であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、置換用核酸配列は、置換された配列のバリアントまたは変異体（すなわち、置換された配列と比較して、たとえば置換などの一個以上の配列の違いを含有する配列）である。そのように配置された核酸配列は、そのように配置された配列を得るために使用されるソース核酸配列の一部である一つ以上の調節配列を含む場合がある（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’−または３’−非翻訳領域など）。例えば、様々な実施形態で、置換は、そのように配置された核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の産生を生じる異種配列を伴う内因性配列の代替であるが、内因性配列の発現の代替ではない。置換は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を持つ内因性ゲノム配列のものである（例えば内因性ゲノム配列は非ヒト可変ドメインポリペプチドのすべてまたは一部をコードし、ＤＮＡ断片は一つ以上のヒト可変ドメインポリペプチドのすべてまたは一部をコードする）。様々な実施形態において、内因性非ヒトイムノグロブリン遺伝子セグメントまたはその断片は、ヒトイムノグロブリン遺伝子セグメントまたはその断片で置換される。

【0147】

実質的に：本明細書で使用される場合、対象の特徴または特性のすべてのまたはほぼすべての範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象はあったとしても、完了まで進む、および／または完全な状態まで進行する、または絶対的な結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性をとらえるために使用される。

【0148】

実質的な相同性：本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある。あるいは、相同残基は、適度に類似した構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は「疎水性」または「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を持つものとして一般的に分類される。一つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸での置換は、「相同」置換とみなされる場合がよくある。一般的なアミノ酸分類を以下の表に要約する。

【表A】

【表B】

【0149】

当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（ｅｄｓ．） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８に解説されている。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を一般的に提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも例えば限定されないが、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の残基である。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿って不連続な残基を含み、例えばポリペプチドまたはその一部のフォールディングされた構造により引き合わされた非隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも例えば限定されないが、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。

【0150】

実質的な同一性：本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、「実質的に同一」であると一般的にみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８に解説されている。同一配列の特定に加え、上述のプログラムは多くの場合、同一性の程度の指標も提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する残基区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する残基区間は例えば限定されないが少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。

【0151】

標的化構築物または標的化ベクター：本明細書で使用される場合、標的化領域を備えるポリヌクレオチド分子を指す。標的化領域は、標的細胞、組織または動物の配列と同一または実質的に同一の配列を含み、相同組み換えにより、標的化構築物を、細胞、組織または動物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用して標的にする標的化領域も含まれ、本明細書に記載される。一部の実施形態では、本明細書に記載の標的化構築物は、特に対象となる核酸配列または遺伝子と、選択可能マーカーと、制御配列および／または調製配列と、こうした配列が関与する組み換えを補助または促進するタンパク質を外部から付加することにより媒介する組み換えを可能にする、その他の核酸配列とをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象の遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の該遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする異種遺伝子である。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象のヒト化遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の該ヒト化遺伝子は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする。一部の実施形態では、標的化構築物（または標的化ベクター）は、人の手によって操作された核酸配列を含み得る。例えば一部の実施形態では、標的化構築物（または標的ベクター）は、自然界での状態では互いに連結されていないが、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドにおいて互いに直接連結されるように人の手により操作されている二つ以上の配列を含む、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドを含むように構築され得る。

【0152】

導入遺伝子または導入遺伝子構築物：本明細書に記載される場合、例えば本明細書に記載される方法などにより、ヒトの手により細胞内に導入された核酸配列（例えば対象ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸配列）を指す。導入遺伝子は、部分的または全体的に異種、すなわち、導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して外来性であってもよい。導入遺伝子は、例えばイントロンまたはプロモーターなどの一つ以上の転写制御配列と、任意の他の核酸とを含む場合があり、それらは選択された核酸配列の発現に必要になり得る。

【0153】

トランスジェニック動物、トランスジェニック非ヒト動物、またはＴｇ^＋：本明細書において相互交換可能に使用することができ、任意の非天然非ヒト動物を意味し、非ヒト動物の細胞の一つ以上が、対象のポリペプチドの全部または一部をコードする、異種核酸および／または遺伝子を含有している。例えば一部の実施形態において、「トランスジェニック動物」または「トランスジェニック非ヒト動物」とは、本明細書に記載される導入遺伝子または導入遺伝子構築物を含有する動物または非ヒト動物を指す。一部の実施形態では、異種核酸および／または遺伝子は、例えばマイクロインジェクションを用いるか、または組み換えウイルスによる感染を用いるなどの計画的な遺伝子操作を介した前駆細胞への導入によって、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は、伝統的な交配技術を含めずに、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入を対象にするものである。この分子は、染色体内に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。用語「Ｔｇ^＋」には、異種核酸および／もしくは遺伝子に対してヘテロ接合性もしくはホモ接合性である動物、ならびに／または異種核酸および／または遺伝子の単一コピーもしくは多コピーを有する動物が含まれる。

【0154】

バリアント：本明細書で使用される場合、参照実体とかなりの構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、一つ以上の化学的部分の存在またはレベルにおいて、参照実体とは構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態では、「バリアント」は、その参照実体とは機能的にも異なる。一般的に、特定の実体が、参照実体の「バリアント」と正しくみなされるかどうかは、参照実体とのその構造同一性の程度に基づく。当業者であれば理解するように、すべての生物学的または化学的参照実体は特定の特徴的構造要素を持つ。「バリアント」は、定義によると、一つ以上のこのような特徴的構造要素を共有する別個の化学的実体である。数例ではあるが、ポリペプチドは特徴的な配列要素を有する場合があり、当該配列要素は、直線または三次元空間中に互いに対して相対的な指定位置を有し、および／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される。またはポリペプチドは、直線または三次元空間中で互いに対し相対的な指定位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列要素を有する場合がある。別の例では、「バリアントポリペプチド」は、アミノ酸配列の一つ以上の差異および／またはポリペプチド骨格に共有結合した化学的部分（例えば、炭化水素、脂質など）の一つ以上の差異の結果として、参照ポリペプチドとは異なる場合がある。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、少なくとも一つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは一つ以上の生物活性を持つ。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を共有する。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を欠く。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドと比べて一つ以上の生物活性のレベル減少を示す。多くの実施形態で、特定位置での少数の配列変更がなければ対象のポリペプチドが親のものと同一のアミノ酸配列を持つ場合、対象のポリペプチドは親または参照ポリペプチドの「バリアント」であるとみなされる。一般的に、親と比べて、バリアントの残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％未満が置換される。一部の実施形態では、「バリアント」は、親と比べて、例えば限定されないが１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個の置換残基を有する。しばしば、「バリアント」は、非常に少数の（例えば、５、４、３、２、または１未満）の置換された機能残基（すなわち、特定の生物活性に参加する残基）を持つ。さらに、「バリアント」は一般的には例えば限定されないが５、４、３、２、または１以下の付加または欠失を持ち、親と比べて付加または欠失を持たないことがよくある。さらに、任意の付加または欠失は一般的には、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満であり、通常は約５、約４、約３、または約２残基である。一部の実施形態では、親または参照ポリペプチドは自然界に存在するものである。当分野の当業者であれば理解するように、特に対象のポリペプチドが感染因子ペプチドである時、対象の特定ポリペプチドの複数のバリアントは、通常は自然界に見られる場合がある。

【0155】

ベクター：本明細書で使用される場合、それが関連している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製および／または、真核および／または原核細胞などの宿主細胞中でそれらが連結している核酸の発現能力がある。操作可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。

【0156】

野生型：本明細書で使用される場合、（変異型、病的、変更などとは対照をなす）「正常」な状態または状況で自然界に存在する構造および／または活性を有する実体を指す。当業者であれば、野生型の遺伝子およびポリペプチドは複数の異なる形態（例えば、アレル）で存在することが多いことを理解するであろう。
特定の実施形態の詳細な説明

【0157】

ある態様において、本明細書において特にヒト可変ドメインをコードする、一部の実施形態においてはヒト定常ドメインをコードする異種遺伝物質を有する操作された非ヒト動物が提供され、当該異種遺伝物質は、ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子配列（すなわち遺伝子セグメント）ならびに適切な再構成、およびヒト部分と非ヒト部分を有する抗体または実質的にヒトもしくは実質的にほぼヒトである配列を有する抗体の発現をもたらす他のヒト配列を含む。様々な実施形態において、提供される操作された非ヒト動物は異種遺伝物質を含有し、当該異種遺伝物質は、ヒトＶλドメインとヒトまたは非ヒトＣλドメインを有する軽鎖を含有する抗体が非ヒト動物の抗体レパートリー中で発現されるような方法で挿入される。さらに、提供される操作された非ヒト動物は異種遺伝物質を含有し、当該異種遺伝物質は、ヒトＶλドメインとヒトまたは非ヒトＣλドメインを有する軽鎖を含有する抗体が操作されたＩｇλ軽鎖座位から発現されるような方法で挿入され、当該軽鎖座位は非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中にヒトおよび非ヒトＩｇλエンハンサー領域（または配列）を含む。

【0158】

任意の特定の説に拘束されることは望まないが、本明細書に記載される非ヒト動物の実施形態は、治療用抗体の産生を目的とした、ヒトＶλドメインを含有する抗体発現を活用する改善インビボシステムを提供することが予期される。また、本明細書に記載される非ヒト動物の実施形態は、一部の実施形態において、偏った抗体反応（例えばκまたはλ軽鎖のいずれかが圧倒的な比率であることを特徴とする抗体反応）と関連した疾患標的に対するヒト抗体系治療剤（例えばヒトモノクローナル抗体、多特異性結合剤、ｓｃＦｖ、融合ポリペプチドなど）の開発を目的とした、異種遺伝物質を含有するＩｇλ軽鎖座位の別の操作型を提供することも予期される。ゆえに本明細書に記載される非ヒト動物の実施形態は、非対称な抗体レパートリーおよび／または抗体反応を部分的には原因とする、貧弱な免疫原性と関連した標的（例えばウイルス）に対するヒト抗体の開発に特に有用である。

【0159】

特にある態様において本開示は操作されたＩｇλ軽鎖座位を含有する生殖細胞ゲノムを有する非ヒト動物（例えばラットまたはマウスなどの齧歯類）の産生を記載するものであり、一部の実施形態において当該軽鎖座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子配列が非ヒトＣλ領域に操作可能に連結されて導入されることが特徴であり、それによりヒトＶλドメインとヒトまたは非ヒトＣλドメインを含む軽鎖を含有する抗体の発現が生じる。本明細書に記載されるように、そのような操作Ｉｇλ軽鎖座位が作製されることで、ヒトＶλドメインとヒトまたは非ヒトＣλドメインを含む軽鎖を含有する抗体の発現が、非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中の前記操作Ｉｇλ軽鎖座位から生じる。提供される非ヒト動物の生殖細胞ゲノムは一部の実施形態において（１）ヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位または（２）ヒト化ＩｇＨ座位および機能的にサイレンシングされた、または別手段で非機能的となったＩｇκ軽鎖座位をさらに含む。本明細書に記載されるように、提供される非ヒト動物はＩｇλ軽鎖を含有する抗体レパートリーを発現し、当該軽鎖はヒトＶλドメインを含んでいる。

【0160】

一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物は単一Ｉｇλ軽鎖座位内にヒトと非ヒトのＩｇλ軽鎖配列を含有する。一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物はＩｇλ軽鎖座位内にヒトＩｇλ軽鎖配列とネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｉｇλ軽鎖配列を含有する。本明細書に記載される非ヒト動物の多くの実施形態において、非ヒトＩｇλ軽鎖配列はネズミ科（例えばマウスまたはラット）の配列であるか、またはこれを含有する。

【0161】

一部の実施形態において、Ｉｇλ軽鎖配列は、ヒトおよび／またはネズミ科（例えばマウスまたはラット）起源のものである遺伝子間ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、Ｉｇλ軽鎖配列は合成であり、およびヒトまたはネズミ科（例えばマウスまたはラット）起源の配列に基づいた遺伝子間ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、前記遺伝子間ＤＮＡは、同じイムノグロブリン座位のものであり、その座位中で当該遺伝子間ＤＮＡはそのように配置され、挿入され、位置付けられ、または操作される（例えばＩｇλ軽鎖座位中のＩｇλ遺伝子間ＤＮＡ）。一部のある実施形態において本明細書に記載される非ヒト動物は操作されたＩｇλ軽鎖座位を含有し、当該軽鎖座位は非ヒト起源のＩｇλ軽鎖配列（例えばマウスまたはラットのＩｇλ軽鎖配列）を含む遺伝子間ＤＮＡを含有する。

【0162】

様々な実施形態において、ヒト化ＩｇＨ座位は複数のヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは非ヒトＩｇＨ定常領域（例えばＩｇＭ、ＩｇＧなどの一つ以上のＩｇＨ定常領域遺伝子を含む内因性非ヒトＩｇＨ定常領域）に操作可能に連結される。様々な実施形態において、ヒト化Ｉｇκ軽鎖座位は複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有し、それらセグメントは非ヒトＩｇκ定常領域に操作可能に連結される。一部のある実施形態において提供される非ヒト動物は、本明細書に提供される図面（例えば図１、２、３および／または４を参照）に図示されるイムノグロブリン座位（またはアレル）を含む生殖細胞ゲノムを有する。そのような操作された非ヒト動物は、ヒト抗体およびヒト抗体断片、ならびに／または当該ヒト抗体およびヒト抗体断片をコードする核酸の供給源を提供し、ならびにヒト治療用抗体の産生を目的としたヒトＶλ配列の活用に適した改善インビボシステムを提供する。

【0163】

本明細書に記載されるように、ある実施形態において、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位で非ヒトイムノグロブリンλ軽鎖遺伝子セグメントの代わりに複数のヒトλ軽鎖遺伝子セグメント（例えばＶλ、ＪλおよびＣλ）を含有するゲノムを有する非ヒト動物が提供され、当該非ヒト動物は、ヒト可変領域遺伝子セグメントの間にヒト非コード遺伝子間ＤＮＡを含む。一部のある実施形態において、本明細書に提供される非ヒト動物は、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわちＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ）とκ軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えばＶκおよびＪκ）を、非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち Ｖ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ）とκ軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えばＶκおよびＪκ）の代わりにそれぞれ内因性イムノグロブリン重鎖座位とκ軽鎖座位にさらに含むゲノムを有する。多くの実施形態において、ヒトイムノグロブリン遺伝子セグメント（重鎖および／または軽鎖）は、ヒト遺伝子間ＤＮＡ（すなわちヒト非コードイムノグロブリン遺伝子間ＤＮＡ）で操作される。当該ヒト遺伝子間ＤＮＡは前記遺伝子セグメントと天然に関連する（すなわち非コードゲノムＤＮＡは、ヒト細胞のヒトイムノグロブリン座位に天然に存在する前記遺伝子セグメントと関連する）。かかる遺伝子間ＤＮＡとしては例えばプロモーター、リーダー配列および組み換えシグナル配列が挙げられ、それらにより抗体可変ドメインとの関連でヒト遺伝子セグメントの適切な組み換えと発現が可能となる。当業者であれば、非ヒトイムノグロブリン座位はそのような非コード遺伝子間ＤＮＡも含有すること、および本開示を読むことで他のヒトまたは非ヒト遺伝子間ＤＮＡをかかる操作イムノグロブリン座位の構築に利用し、非ヒト動物の抗体関連においてヒト可変ドメインを同じように発現させ得ることを理解する。かかる類似操作イムノグロブリン座位は、ヒト可変ドメインを含有する抗体発現を達成するために、所望される遺伝子セグメントのヒトコード配列（すなわちエクソン）、またはヒト遺伝子セグメントの組み合わせを含有することのみを必要とする。

【0164】

ある実施形態の様々な態様を以下の項において詳細に記載する。それら各々は、本明細書に記載される任意の態様または実施形態に適用することができる。項の使用は限定を目的としたものではなく、「または」の使用は、別段の記載がない限り「および／または」を意味する。
非ヒト動物における抗体レパートリー

【0165】

イムノグロブリン（抗体とも呼ばれる）は大きな（約１５０ｋＤ）、Ｙ字型の糖たんぱく質であり、宿主免疫系のＢ細胞により産生され、外来性抗原（例えばウイルス、細菌など）を中和する。各イムノグロブリン（Ｉｇ）は、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖から構成され、それら各々が可変ドメインと定常ドメインの二つの構造的構成要素を有する。異なるＢ細胞により産生された抗体において重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインは異なっているが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンから産生された抗体はすべて同一である。各抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインはともに抗原結合領域（または抗原結合部位）を含む。イムノグロブリンは様々な型で存在し得、含有する重鎖定常領域（またはドメイン）に基づきアイソタイプまたはクラスと呼称される。同じアイソタイプの抗体のすべてにおいて重鎖定常ドメインは同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なっている。以下の表に、マウスおよび人類（ヒト）の九種の抗体アイソタイプを要約する。

【表C】

【0166】

他の種でも追加のアイソタイプが特定されている。アイソタイプは、別のアイソタイプで異なる構造的特徴を有することで、抗体に特殊化した生物特性を与え、動物の身体内の異なる場所（細胞、組織など）に存在している。初期にはＢ細胞はＩｇＭとＩｇＤを産生し、それらは同一の抗原結合領域を有する。活性化されるとＢ細胞はクラススイッチと呼称されるプロセスにより別のアイソタイプへと切り替える。クラススイッチにはＢ細胞により産生される抗体の定常ドメインの変化が含まれるが、可変ドメインは変わらず、それにより元々の抗体（Ｂ細胞）の抗原特異性は保存される。

【0167】

二つの別個の座位（ＩｇκとＩｇλ）は、抗体軽鎖をコードする遺伝子セグメント含有し、アレル排除とアイソタイプ排除の両方を示す。κ^＋とλ^＋Ｂ細胞の発現比率は種により異なっている。例えばヒトは約６０：４０（κ：λ）の比率を示す。マウスとラットでは９５：５（κ：λ）の比率が観察されている。興味深いことには、ネコにおいてκ：λの比率（５：９５）が観察されており、マウスおよびラットとは対極的である。いくつかの研究により、これらの観察された比率の背景にある可能性の高い理由が説明されており、論理的根拠として座位の複雑性（すなわち遺伝子セグメントの数、特にＶ遺伝子セグメントの数）と遺伝子セグメントの再構成の効率の両方が提唱されている。ヒトイムノグロブリンλ軽鎖座位は１，０００ｋｂを越えて広がっており、およそ７０個のＶλ遺伝子セグメント（２９〜３３個が機能性）と七個のＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対（４〜５個が機能性）を含有し、それらは三つのクラスターへと組織化されている（例えば米国特許第９，００６，５１１号の図１を参照）。発現抗体レパートリーで観察されたＶλ領域の大部分は、最も近位のクラスター（すなわちクラスターＡ）内に含有される遺伝子セグメントによりコードされている。マウスイムノグロブリンλ軽鎖座位はヒトの座位とは大きく異なっており、系統に応じて数個のＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含有するのみであり、それらは二つの別個の遺伝子クラスターに組織化されている（例えば米国特許第９，００６，５１１号の図２を参照）。

【0168】

様々なヒト疾患の治療を目的とした治療用抗体の開発は、遺伝子操作された非ヒト動物系統の創生に大きく重きを置かれており、特にヒトイムノグロブリン遺伝子に相当する遺伝物質をゲノム中に様々な量で担持している遺伝子操作齧歯類系統に注力されている（例えばＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．６３：１０１−８に概説されている）。そのようなトランスジェニック齧歯類系統の作製において、初期の試みにはヒトイムノグロブリン座位部分の統合に焦点が当てられていた。これにより自身での遺伝子セグメントの組み換えと、全体的にヒトである重鎖および／または軽鎖の産生が行われ、一方で内因性のイムノグロブリン座位は不活化される（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６７−０９−１３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−６；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：９１１−４；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−９；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５７９−９１；Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２６７２−８１；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１；Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５：４０５−１４；Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５；Ｘｉａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ ２：３３３−４３；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４−７０；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−７を参照）。特にいくつかの試みにはヒトＩｇλ軽鎖配列の統合が含まれていた（例えば米国特許出願公開の２００２／００８８０１６ Ａ１、２００３／０２１７３７３ Ａ１、および２０１１／０２３６３７８ Ａ１；米国特許第６，９９８，５１４号および第７，４３５，８７１号；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６８９８−９０６；Ｐｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１６１１−１９を参照）。そのような試みは、ヒトＶλ、Ｊλ、およびＣλ配列を含有する酵母人工染色体の無作為統合に焦点が当てられ、これにより完全ヒトλ軽鎖（すなわちヒト可変およびヒト定常）を発現するマウス系統が作られた。最近ではヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列も含有する構築物を使用した類似の試みも行われている（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１−９０；Ｌｅｅ，Ｅ−Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（４）：３５６−６３）。

【0169】

さらに他の試みとしては、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位（κおよびλ）内に特異的に挿入し、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを内因性Ｉｇ軽鎖定常領域に操作可能に連結させる試みが挙げられる（例えば米国特許第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号、および第９，１６３，０９２号を参照のこと。それらすべて参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。かかる動物において、クラスターＡとＢのヒトＶλ遺伝子セグメントのすべて、およびヒトＪλ遺伝子セグメントのいずれか一〜四個が、内因性ＩｇκおよびＩｇλ軽鎖座位内に挿入された。結果としていくつかの異なるヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、遺伝子操作された齧歯類Ｉｇ軽鎖座位の両方で適切に再構成されて機能性ヒトＶλドメインを形成し、それらは齧歯類抗体レパートリーの軽鎖中のＣκおよびＣλ領域の両方の状況下で発現されたことを示した（例えば米国特許第９，００６，５１１号の表７と図１１〜１３を参照）。特にヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを担持する操作Ｉｇκ軽鎖座位を有するマウスは、脾臓部分において約１：１のκ：λの比率を示した（例えば米国特許第９，００６，５１１号の表４を参照）。実際に両方とも操作されたマウス系統（すなわち操作Ｉｇκまたは操作Ｉｇλ軽鎖座位）は、ヒトＶλドメインが、通常は軽鎖発現において大きな偏りを示す齧歯類中の内因性Ｉｇ軽鎖座位から発現され得たことを示した（上記を参照）。本発明は、他の操作Ｉｇ軽鎖座位構造は、非ヒト動物において治療標的に対する抗体レパートリー中のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの利用を、特に通常ヒトＩｇλ軽鎖座位と関連する（すなわちヒト細胞において存在する）複雑性と安定した品質を欠くＩｇλ軽鎖座位を含有する非ヒト動物（例えばマウスおよびラット）と比較して、最大化するよう作製され得るという認識に基づいている。そのように選択的に操作されたＩｇ軽鎖座位構造は、その設計から生じる固有の抗体レパートリー能力を提供する。

【0170】

本開示は特に、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含有する非ヒト動物の作製に成功したことを記載するものであり、当該軽鎖座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域に操作可能に連結されている。特に本開示は、ヒト可変ドメインと非ヒト定常ドメインを有する抗体を発現する操作非ヒト動物の作製に成功したことを具体的に記載するものであり、それら抗体はヒトＶλドメインを含有する軽鎖を含んでいる。本明細書に記載されるように、そのような軽鎖の発現は、前記複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを内因性Ｉｇλ軽鎖座位（またはアレル）に挿入することで達成される。また本明細書に記載されるように、提供される非ヒト動物は一部の実施形態において、内因性Ｖλドメインを含有する軽鎖の発現が（例えば遺伝子欠失により）不活化されるように操作される。ゆえに本開示は少なくとも一部の実施形態において、選択的に操作されたＩｇλ軽鎖座位を含有する操作された非ヒト動物を提供することによりヒト抗体産生のための改善されたインビボシステムの開発を包含するものであり、当該軽鎖座位はヒトＶλドメインを含有する発現抗体レパートリーを生じさせる。
ＤＮＡ挿入

【0171】

典型的にはヒトＩｇλ軽鎖配列（例えばＶλ、Ｊλ、ＣλおよびＩｇλエンハンサー）またはその一部を含有するポリヌクレオチド分子は、宿主細胞中で当該ポリヌクレオチド分子を複製させるためのベクター、好ましくはＤＮＡベクター内に挿入される。

【0172】

ヒトＩｇλ軽鎖配列は、公知の配列または供給源（例えばライブラリー）から直接クローニングすることができ、またはＧｅｎｅＢａｎｋまたは他の公的に利用可能なデータベース（例えばＩＭＧＴ）から入手可能な公開配列に基づいてインシリコ設計された生殖細胞配列から合成することもできる。あるいは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーも対象のイムノグロブリンＤＮＡ配列（例えばヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、ヒトＥλ領域または配列、およびそれらの組み合わせ）を提供することができる。ＢＡＣライブラリーは、１００〜１５０ｋｂの挿入サイズを含み得、３００ｋｂもの大きさの挿入を保有し得る（Ｓｈｉｚｕｙａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８９：８７９４−８７９７；Ｓｗｉａｔｅｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７：２０７１−２０８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３４ ２１３−２１８、これらの文献は参照によりその全体で本明細書に援用される）。例えば１６４〜１９６ｋｂの平均挿入サイズを保有するヒトＢＡＣライブラリーが報告されている（Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（３）：４８３−９６；Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２：１−８，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．ＧＥ９８５４２３）。ヒトおよびマウスのゲノムＢＡＣライブラリーが構築されており、市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）。ゲノムＢＡＣライブラリーは、イムノグロブリンＤＮＡ配列ならびに転写制御領域の供給源として利用することもできる。

【0173】

あるいは、イムノグロブリンＤＮＡ配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転させてもよい。例えばヒトＩｇλ軽鎖座位のヌクレオチド配列が決定されている（例えばＤｕｎｈａｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４８９−９５を参照）。さらに過去にＹＡＣを利用してヒトＩｇλ軽鎖座位導入遺伝子がアセンブリされている（例えばＰｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７７：１９５−２０１；Ｐｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１６１１−１９を参照）。全Ｉｇλ軽鎖座位（ヒトまたは齧歯類）をクローニングして、いくつかのＹＡＣ内に含有させることができる。複数のＹＡＣが使用され、それらが重複相同性の領域を含有する場合、それらを酵母宿主株内で再結合させて、完全な座位または所望される座位部分（例えば標的化ベクターで標的化される領域）を提示する単一構築物を生成することができる。哺乳類選択カセットを用いた改良によりＹＡＣのアームをさらに改変し、当技術分野に公知の方法および／または本明細書に記載される方法により、構築物を胚性幹細胞または胚に導入することを補助してもよい。

【0174】

本明細書に記載される操作Ｉｇλ軽鎖座位の構築における使用のためのヒトＩｇλ軽鎖遺伝子セグメントのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、公開データベース（例えばＧｅｎｅＢａｎｋ、ＩＭＧＴなど）および／または公開されている抗体配列から取得してもよい。ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ挿入は一部の実施形態において一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列（または領域）を含む。ＤＮＡ挿入は一部の実施形態において一つ以上、例えば一つ、二つ、三つなどの配列因子を含むヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列（または領域）を含む。一部のある実施形態においてＤＮＡ挿入はヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列（または領域）を含み、この配列は三つの異なる配列因子を有するヒトＥλとも呼称される。ゆえに一部の実施形態において本明細書に記載されるヒトＥλはモジュール式であり、一つ以上の配列因子がエンハンサー配列（または領域）として共に機能する。一部のある実施形態においてヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含有するＤＮＡ挿入はヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含み、当該エンハンサー配列は非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域配列）に操作可能に連結されている。一部のある実施形態においてヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含有するＤＮＡ挿入はヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含み、当該エンハンサー配列は非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域配列）に操作可能に連結され、そして一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対、および／または一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントに操作可能に連結されている。一部のある実施形態においてヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含有するＤＮＡ挿入はヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含み、当該エンハンサー配列は非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域配列）、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結されている。

【0175】

ＤＮＡ挿入は、当技術分野に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、ＤＮＡ挿入は、大きなプラスミドの一部として調製することができる。そのような調製により、当技術分野で公知のように、効率的な方法で正しい構築物のクローニングと選択が可能となる。本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列のすべてまたは一部を含有するＤＮＡ挿入は、プラスミド上の便利な制限酵素部位の間に位置づけることができ、それによって、所望される非ヒト動物内への組み込みのために、残りのプラスミド配列からそれらを簡便に単離することができる。

【0176】

プラスミドの調製と宿主生物体の形質転換とに使用される様々な方法が当技術分野に公知である。原核細胞及び真核細胞の両方に適した他の発現システム、ならびに一般的な組み換え法に関しては、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，５ｔｈ Ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｙ Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，１９９４およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９を参照のこと。
標的化ベクター

【0177】

標的化ベクターを利用してＤＮＡ挿入をゲノム標的座位に導入し、ＤＮＡ挿入と、前記ＤＮＡ挿入に隣接する相同アームを含ませることができる。標的化ベクターは直線型であっても環状型であってもよく、そして一本鎖または二本鎖であってもよい。標的化ベクターはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であってもよい。言及を容易にするために、本明細書において相同アームを５’および３’（すなわち上流および下流）相同アームと呼称する。この専門用語は、標的化ベクター内のＤＮＡ挿入に対する相同アームの相対位置に関連する。５’および３’相同アームは、標的化座位内の領域、または別の標的化ベクター内の領域に対応し、それらは本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼称される。一部の実施形態において相同アームは５’標的配列または３’標的配列としても機能し得る。

【0178】

一部の実施形態において本明細書に記載される方法は互いに組み替えることができる標的化ベクターを二つ、三つまたはそれ以上利用する。様々な実施形態において、標的化ベクターは、本明細書の別の部分で記載される大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。そのような実施形態において、第一、第二、および第三の標的化ベクター各々が５’および３’相同アームを含む。第一の標的化ベクターの３’相同アームは、第二の標的化ベクターの５’相同アームと重複する配列（すなわち重複配列）を含み、これが第一と第二のＬＴＶＥＣの間の相同組換えを可能とする。

【0179】

二重標的化方法の場合、第一の標的化ベクターの５’相同アームと第二の標的化ベクターの３’相同アームは、標的ゲノム座位内の対応するセグメント（すなわち標的配列）に対し相同であり、このことが第一および第二の標的化ベクターと、対応するゲノムセグメントの相同組換えを促進し、標的ゲノム座位を改変する。

【0180】

三重標的化方法の場合、第二の標的化ベクターの３’相同アームは、第三の標的化ベクターの５’相同アームと重複する配列（すなわち重複配列）を含み、これが第二と第三のＬＴＶＥＣの間の相同組換えを可能とする。第一の標的化ベクターの５’相同アームと第三の標的化ベクターの３’相同アームは、標的ゲノム座位内の対応するセグメント（すなわち標的配列）に対し相同であり、このことが第一および第三の標的化ベクターと、対応するゲノムセグメントの相同組換えを促進し、標的ゲノム座位を改変する。

【0181】

相同アームと標的配列または二つの相同アームは、その二つの領域が充分なレベルの配列相同性を互いに共有し、相同組換え反応の基質として作用する場合に、互いに「対応する」または「対応している」。「相同」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と、標的化ベクター中に存在する対応する相同アーム（すなわち重複配列）、または二つの相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが発生し得る任意の程度の配列同一性であってもよい。一例であるが、標的化ベクターの相同アーム（またはその断片）と別の標的化ベクターの標的配列または標的ゲノム座位の標的配列（またはその断片）により共有される配列同一性の量は、例えば限定されないが少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってもよく、それにより当該配列は相同組換えを受ける。

【0182】

さらに相同アームと対応する標的配列の間の対応する相同領域は、標的ゲノム座位で相同組換えを促進するために充分である任意の長さの領域であってもよい。例えば所与の相同アームおよび／または対応する標的配列は、例えば限定されないが少なくとも約５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、または２００〜３００ｋｂの長さかそれ以上（例えば本明細書の別の箇所で記載される）である対応する相同領域を含んでもよく、それにより相同アームは、細胞の標的ゲノム座位内または別の標的化ベクター内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに充分な相同性を有する。一部の実施形態において所与の相同アームおよび／または対応する標的配列は、例えば限定されないが少なくとも約１０〜１００ｋｂ、１５〜１００ｋｂ、２０〜１００ｋｂ、２５〜１００ｋｂ、３０〜１００ｋｂ、３５〜１００ｋｂ、４０〜１００ｋｂ、４５〜１００ｋｂ、５０〜１００ｋｂ、５５〜１００ｋｂ、６０〜１００ｋｂ、６５〜１００ｋｂ、７０〜１００ｋｂ、７５〜１００ｋｂ、８０〜１００ｋｂ、８５〜１００ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、または９５〜１００ｋｂの長さかそれ以上（例えば本明細書の別の箇所で記載される）である対応する相同領域を含み、それにより相同アームは、細胞の標的ゲノム座位内または別の標的化ベクター内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに充分な相同性を有する。

【0183】

第一の標的化ベクターの３’相同アームおよび第二の標的化ベクターの５’相同アームの重複配列、または第二の標的化ベクターの３’相同アームおよび第三の標的化ベクターの５’相同アームの重複配列は、前記標的化ベクター間での相同組換えが促進されるのに充分である任意の長さであってもよい。例えば相同アームの所与の重複配列は、少なくとも約１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、５〜２０ｋｂ、５〜２５ｋｂ、５〜３０ｋｂ、５〜３５ｋｂ、５〜４０ｋｂ、５〜４５ｋｂ、５〜５０ｋｂ、５〜５５ｋｂ、５〜６０ｋｂ、５〜６５ｋｂ、５〜７０ｋｂ、５〜７５ｋｂ、５〜８０ｋｂ、５〜８５ｋｂ、５〜９０ｋｂ、５〜９５ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１００〜２００ｋｂ、または２００〜３００ｋｂの長さかそれ以上である対応する重複領域を含んでもよく、それにより相同アームの重複領域は、別の標的化ベクター内の対応する重複配列との相同組換えを受けるのに充分な相同性を有する。一部の実施形態において、相同アームの所与の重複配列は、少なくとも約１〜１００ｋｂ、５〜１００ｋｂ、１０〜１００ｋｂ、１５〜１００ｋｂ、２０〜１００ｋｂ、２５〜１００ｋｂ、３０〜１００ｋｂ、３５〜１００ｋｂ、４０〜１００ｋｂ、４５〜１００ｋｂ、５０〜１００ｋｂ、５５〜１００ｋｂ、６０〜１００ｋｂ、６５〜１００ｋｂ、７０〜１００ｋｂ、７５〜１００ｋｂ、８０〜１００ｋｂ、８５〜１００ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、または９５〜１００ｋｂの長さかそれ以上である重複領域を含み、それにより相同アームの重複領域は、別の標的化ベクター内の対応する重複配列との相同組換えを受けるのに充分な相同性を有する。一部の実施形態において、重複配列は、１ｋｂ以上〜５ｋｂ以下である。一部の実施形態において、重複配列は、約１ｋｂ以上〜約７０ｋｂ以下である。一部の実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ以上〜約７０ｋｂ以下である。一部の実施形態において、重複配列は、約１０ｋｂ以上〜約５０ｋｂ以下である。一部の実施形態において、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。一部の実施形態において、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。例えば重複配列は、約１ｋｂ以上〜約５ｋｂ以下、約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約１５ｋｂ以下、約１５ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約２５ｋｂ以下、約２５ｋｂ以上〜約３０ｋｂ以下、約３０ｋｂ以上〜約３５ｋｂ以下、約３５ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約４５ｋｂ以下、約４５ｋｂ以上〜約５０ｋｂ以下、約５０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約７０ｋｂ以下、約７０ｋｂ以上〜約８０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約９０ｋｂ以下、約９０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ以上〜約１２０ｋｂ以下、約１２０ｋｂ以上〜約１４０ｋｂ以下、約１４０ｋｂ以上〜約１６０ｋｂ以下、約１６０ｋｂ以上〜約１８０ｋｂ以下、約１８０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約２００ｋｂ以上〜約２２０ｋｂ以下、約２２０ｋｂ以上〜約２４０ｋｂ以下、約２４０ｋｂ以上〜約２６０ｋｂ以下、約２６０ｋｂ以上〜約２８０ｋｂ以下、または約２８０ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下であってもよい。一例であるが、重複配列は、約２０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下であってもよい。あるいは重複配列は、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２０ｋｂ、少なくとも２４０ｋｂ、少なくとも２６０ｋｂ、少なくとも２８０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂであってもよい。

【0184】

相同アームは一部の実施形態においては、細胞由来である座位（例えば標的とされる座位）に対応してもよく、あるいは相同アームは細胞ゲノム内に統合された例えば導入遺伝子、発現カセット、または異種もしくは外因性ＤＮＡ領域などの異種または外来性ＤＮＡセグメントの領域に対応してもよい。あるいは相同アームは一部の実施形態においては細胞中の標的化ベクター上の領域に対応してもよい。一部の実施形態において、標的化ベクターの相同アームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）の領域、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の領域、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞中に含有される任意の他の操作された領域に対応してもよい。またさらに、標的化ベクターの相同アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、もしくはＰ１ファージライブラリーの領域に対応するか、またはそれらから誘導されてもよい。一部のある実施形態において標的化ベクターの相同アームは、原核細胞、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳類、齧歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜、農業用哺乳類、または任意の他の対象生物に由来する、それらに対して異種である、またはそれらに対して外因性である座位に対応する。一部の実施形態において、相同アームは、従来的な方法では標的とすることができない細胞の座位、または不正確になら標的とされることができるか、もしくはヌクレアーゼ物質（例えばＣａｓタンパク質）により誘導されるニックまたは二本鎖切断が無い状況下で著しく低い効率でのみ、標的とされることができる細胞の座位に対応する。一部の実施形態において、相同アームは合成ＤＮＡから誘導される。

【0185】

一部の実施形態において、標的化ベクターの５’または３’の相同アームの内の一つは、標的とされるゲノム座位に対応し、当該５’または３’の相同アームのうちの他方は、別の標的化ベクター上の領域に対応する。

【0186】

一部の実施形態において、標的化ベクターの５’および３’の相同アームは、標的とされるゲノムに対応する。あるいは相同アームは関連ゲノムに由来してもよい。例えば標的とされるゲノムは第一のマウス系統のゲノムであり、標的化アームは第二のマウス系統のゲノム由来であり、この場合において当該第一系統と第二系統は異なっている。ある実施形態において、相同アームは同じ動物のゲノム由来であるか、または同じ系統のゲノム由来である。例えば標的とされるゲノムは第一のマウス系統のゲノムであり、標的化アームは同じマウスまたは同じマウス系統のマウスゲノム由来である。

【0187】

標的化ベクターの相同アームは、対応する標的配列との相同組み換え事象を促進するために充分である任意の長さであってもよく、例えば少なくとも１ｋｂ以上〜５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜１０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜１５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜２０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜２５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜３０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜３５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜４０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜４５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜５０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜５５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜６０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜６５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜７０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜７５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜８０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜８５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜９０ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜９５ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、１００ｋｂ以上〜２００ｋｂ以下、または２００ｋｂ以上〜３００ｋｂ以下の長さ、またはそれ以上を含む任意の長さであってもよい。一部の実施形態において、標的化ベクターの相同アームは、少なくとも１ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、１０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、１５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、２０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、２５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、３０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、３５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、４０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、４５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、５０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、５５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、６０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、６５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、７０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、７５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、８０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、８５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、９０ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下、または９５ｋｂ以上〜１００ｋｂ以下の長さ、またはそれ以上である対応する標的配列との相同組み換え事象を促進するために充分である長さを有する。本明細書において記載されるように、大型標的化ベクターは、より長い標的化アームを採用することができる。

【0188】

ヌクレアーゼ物質（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を標的化ベクターと組み合わせて採用し、標的座位（例えばＩｇλ軽鎖座位）の改変を促進することができる。そのようなヌクレアーゼ物質は、標的化ベクターと標的座位の間の相同組換えを促進し得る。ヌクレアーゼ物質を標的化ベクターと組み合わせて採用した場合、その標的化ベクターは、ヌクレアーゼ切断部位に充分に近接して配置された５’および３’の標的配列に対応する５’および３’の相同アームを含み、それにより当該ヌクレアーゼ切断部位でのニックまたは二本鎖切断時に、標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生を促進させることができる。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ニックまたは二本鎖切断がヌクレアーゼ物質により生じるＤＮＡ配列を含む（例えばＣａｓ９切断部位）。標的化ベクターの５’および３’の相同アームに対応する標的座位内の標的配列は、その距離が、認識部位でのニックまたは二本鎖切断時に５’および３’の標的配列と相同アームの間の相同組換え事象の発生を促進するものであれば、ヌクレアーゼ切断部位に対し「充分に近接して配置」されている。ゆえにある実施形態において、標的化ベクターの５’および／または３’の相同アームに対応する標的配列は、所与の認識部位から１ヌクレオチド以内であるか、所与の認識から少なくとも１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂ以内である。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の内の少なくとも一つ、または両方に対し、すぐに隣接している。

【0189】

標的化ベクターの相同アームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位の空間的関連性は変化し得る。例えば標的配列はヌクレアーゼ切断部位に対し５’側に配置されてもよく、標的配列は認識部位に対し３’側に配置されてもよく、または標的配列はヌクレアーゼ切断部位に隣接してもよい。

【0190】

標的化ベクター（例えば大型標的化ベクターを含む）をヌクレアーゼ物質と組み合わせて使用することで、標的化ベクター単独で使用したときと比較して標的化効率を上昇させることができる。例えば標的化ベクターをヌクレアーゼ物質と組み合わせて使用する場合、標的化ベクターの標的化効率は、標的化ベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはこれら整数値から成り立つ範囲以内、例えば２〜１０倍まで上昇させることができる。

【0191】

一部の標的化ベクターは、「大型標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり、それらは細胞中で相同組換えを行うことを目的とした他の方法で一般的に使用される核酸配列よりも大きい核酸配列に対応する、または当該核酸配列に由来する相同アームを含有する標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣは、例えば少なくとも１０ｋｂの長さであってもよく、または５’相同アームと３’相同アームの総計が例えば少なくとも１０ｋｂであってもよい。ＬＴＶＥＣは、細胞中で相同組換えを行うことを目的とした他の方法で一般的に使用されるものよりも大きいＤＮＡ挿入含む標的化ベクターも含む。例えばＬＴＶＥＣは、従来のプラスミド系標的化ベクターではサイズ制限の問題で適合させることができない大きな座位の改変を可能にする。例えば標的とされる座位は、従来的な方法では標的とすることができない細胞の座位、または不正確になら標的とされることができるか、もしくはヌクレアーゼ物質（例えばＣａｓタンパク質）により誘導されるニックまたは二本鎖切断が無い状況下で著しく低い効率でのみ、標的とされることができる細胞の座位であってもよい（すなわち５’および３’の相同アームは、それら座位に対応することができる）。

【0192】

一部の実施形態において本明細書に記載される方法は、互いにおよび標的ゲノム座位と組み替えることができる二つまたは三つのＬＴＶＥＣを、三方または四方の組み換え事象で採用する。かかる方法により、単一のＬＴＶＥＣを使用しては達成することができない大きな座位の改変が可能となる。

【0193】

ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）から誘導されたベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣおよびその作製方法の例は、例えば米国特許第６，５８６，２５１号、第６，５９６，５４１号および第７，１０５，３４８号、ならびに国際特許出願公開２００２／０３６７８９に記載されており、それら各々は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。ＬＴＶＥＣは、直線型であってもよく、または環状型であってもよい。

【0194】

ＬＴＶＥＣは、例えば約２０ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約５０ｋｂ以下、約５０ｋｂ以上〜約７５ｋｂ以下、約７５ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ以下、約１２５ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約１７５ｋｂ以下、約１７５ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約２００ｋｂ以上〜約２２５ｋｂ以下、約２２５ｋｂ以上〜約２５０ｋｂ以下、約２５０ｋｂ以上〜約２７５ｋｂ以下、または約２７５ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下を含む任意の長さのものであってもよい。あるいはＬＴＶＥＣは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂまたはそれ以上であってもよい。ＬＴＶＥＣの大きさは一部の実施形態において大きすぎるために従来的なアッセイ法、例えばサザンブロッティングやロングレンジ（例えば１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲなどでは標的化事象のスクリーニングを行うことができない。

【0195】

一部の実施形態においてＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約３０ｋｂ以下、約３０ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約５０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約７０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約９０ｋｂ以下、約９０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ以上〜約１１０ｋｂ以下、約１２０ｋｂ以上〜約１３０ｋｂ以下、約１３０ｋｂ以上〜約１４０ｋｂ以下、約１４０ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約１６０ｋｂ以下、約１６０ｋｂ以上〜約１７０ｋｂ以下、約１７０ｋｂ以上〜約１８０ｋｂ以下、約１８０ｋｂ以上〜約１９０ｋｂ以下、または約１９０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下の範囲のＤＮＡ挿入を含む。一部の実施形態においてＤＮＡ挿入は、例えば約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約８０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約２００ｋｂ以上〜約２５０ｋｂ以下、約２５０ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下、約３００ｋｂ以上〜約３５０ｋｂ以下、または約３５０ｋｂ以上〜約４００ｋｂ以下の範囲であってもよい。一部の実施形態においてＬＴＶＥＣは、例えば約４００ｋｂ以上〜約４５０ｋｂ以下、約４５０ｋｂ以上〜約５００ｋｂ以下、約５００ｋｂ以上〜約５５０ｋｂ以下、約５５０ｋｂ以上〜約６００ｋｂ以下、約６００ｋｂ以上〜約６５０ｋｂ以下、約６５０ｋｂ以上〜約７００ｋｂ以下、約７００ｋｂ以上〜約７５０ｋｂ以下、または約７５０ｋｂ以上〜約８００ｋｂの範囲のＤＮＡ挿入を含む。

【0196】

一部の実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’相同アームと３’相同アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一部の実施形態において、ＬＴＶＥＣの５’相同アームは、約１ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下の範囲であり、および／またはＬＴＶＥＣの３’相同アームは、約１ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下の範囲である。５’および３’の相同アームの総計は、例えば約１ｋｂ以上〜約５ｋｂ以下、約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約３０ｋｂ以下、約３０ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約５０ｋｂ以下、約５０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約７０ｋｂ以下、約７０ｋｂ以上〜約８０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約９０ｋｂ以下、約９０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ以上〜約１１０ｋｂ以下、約１１０ｋｂ以上〜約１２０ｋｂ以下、約１２０ｋｂ以上〜約１３０ｋｂ以下、約１３０ｋｂ以上〜約１４０ｋｂ以下、約１４０ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約１６０ｋｂ以下、約１６０ｋｂ以上〜約１７０ｋｂ以下、約１７０ｋｂ以上〜約１８０ｋｂ以下、約１８０ｋｂ以上〜約１９０ｋｂ以下、または約１９０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下であってもよい。あるいは各相同アームは一部の実施形態において、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂであってもよい。同様に５’および３’の相同アームの総計は一部の実施形態において、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１７０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも１９０ｋｂ、または少なくとも２００ｋｂであってもよい。

【0197】

一部の実施形態においてＬＴＶＥＣとＤＮＡ挿入は標的座位で約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約８０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、または約１００ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約２００ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下、約３００ｋｂ以上〜約４００ｋｂ以下、約４００ｋｂ以上〜約５００ｋｂ以下、約５００ｋｂ以上〜約６００ｋｂ以下、約６００ｋｂ以上〜約７００ｋｂ以下、約７００ｋｂ以上〜約８００ｋｂ以下、または約５００ｋｂ以上〜約１Ｍｂ以下、約１Ｍｂ以上〜約１．５Ｍｂ以下、約１．５Ｍｂ以上〜約２Ｍｂ以下、約２Ｍｂ以上〜約２．５Ｍｂ以下、または約２．５Ｍｂ以上〜約３Ｍｂ以下の内因性配列の欠失が可能となるよう設計される。あるいは欠失は約３Ｍｂ以上〜約４Ｍｂ以下、約４Ｍｂ以上〜約５Ｍｂ以下、約５Ｍｂ以上〜約１０Ｍｂ以下、約１０Ｍｂ以上〜約２０Ｍｂ以下、約２０Ｍｂ以上〜約３０Ｍｂ以下、約３０Ｍｂ以上〜約４０Ｍｂ以下、約４０Ｍｂ以上〜約５０Ｍｂ以下、約５０Ｍｂ以上〜約６０Ｍｂ以下、約６０Ｍｂ以上〜約７０Ｍｂ以下、約７０Ｍｂ以上〜約８０Ｍｂ以下、約８０Ｍｂ以上〜約９０Ｍｂ以下、または約９０Ｍｂ以上〜約１００Ｍｂ以下であってもよい。あるいは欠失は、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂまたはそれ以上であってもよい。

【0198】

一部の実施形態においてＬＴＶＥＣとＤＮＡ挿入は、例えば約５ｋｂ以上〜約１０ｋｂ以下、約１０ｋｂ以上〜約２０ｋｂ以下、約２０ｋｂ以上〜約４０ｋｂ以下、約４０ｋｂ以上〜約６０ｋｂ以下、約６０ｋｂ以上〜約８０ｋｂ以下、約８０ｋｂ以上〜約１００ｋｂ以下、約１００ｋｂ以上〜約１５０ｋｂ以下、約１５０ｋｂ以上〜約２００ｋｂ以下、約２００ｋｂ以上〜約２５０ｋｂ以下、約２５０ｋｂ以上〜約３００ｋｂ以下、約３００ｋｂ以上〜約３５０ｋｂ以下、または約３５０ｋｂ以上〜約４００ｋｂ以下の範囲の外因性核酸配列の標的座位内への挿入が可能となるように設計される。あるいは挿入は一部の実施形態において、約４００ｋｂ以上〜約４５０ｋｂ以下、約４５０ｋｂ以上〜約５００ｋｂ以下、約５００ｋｂ以上〜約５５０ｋｂ以下、約５５０ｋｂ以上〜約６００ｋｂ以下、約６００ｋｂ以上〜約６５０ｋｂ以下、約６５０ｋｂ以上〜約７００ｋｂ以下、約７００ｋｂ以上〜約７５０ｋｂ以下、または約７５０ｋｂ以上〜約８００ｋｂの範囲であってもよい。あるいは挿入は一部の実施形態において、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ ｋｂ、または少なくとも５００ｋｂまたはそれ以上であってもよい。

【0199】

さらに別の例において、ＤＮＡ挿入および／または変えられる、欠失される、標的とされる、改変される、操作されるなどの内因性座位の領域は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂもしくはそれ以上である。一部の実施形態において、ＤＮＡ挿入および／または変えられる、欠失される、標的とされる、改変される、操作されるなどの内因性座位の領域は、ヌクレオチド〜２０ｋｂ、２００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、３００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、４００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、５００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、６００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、７００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、８００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、９００ヌクレオチド〜２０ｋｂ、１ｋｂ〜２０ｋｂ、２ｋｂ〜２０ｋｂ、３ｋｂ〜２０ｋｂ、４ｋｂ〜２０ｋｂ、５ｋｂ〜２０ｋｂ、６ｋｂ〜２０ｋｂ、７ｋｂ〜２０ｋｂ、８ｋｂ〜２０ｋｂ、９ｋｂ〜２０ｋｂ、１０ｋｂ〜２０ｋｂ、１１ｋｂ〜２０ｋｂ、１２ｋｂ〜２０ｋｂ、１３ｋｂ〜２０ｋｂ、１４ｋｂ〜２０ｋｂ、１５ｋｂ〜２０ｋｂ、１６ｋｂ〜２０ｋｂ、１７ｋｂ〜２０ｋｂ、１８ｋｂ〜２０ｋｂ、または１９ｋｂ〜２０ｋｂである。一部の実施形態において、ＤＮＡ挿入および／または変えられる、欠失される、標的とされる、改変される、操作されるなどの内因性座位の領域は、１００ヌクレオチド〜１９ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１８ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１７ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１６ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１５ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１４ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１３ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１２ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１１ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１０ｋｂ、１００ヌクレオチド〜９ｋｂ、１００ヌクレオチド〜８ｋｂ、１００ヌクレオチド〜７ｋｂ、１００ヌクレオチド〜６ｋｂ、１００ヌクレオチド〜５ｋｂ、１００ヌクレオチド〜４ｋｂ、１００ヌクレオチド〜３ｋｂ、１００ヌクレオチド〜２ｋｂ、１００ヌクレオチド〜１ｋｂ、１００ヌクレオチド〜９００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜８００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜７００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜６００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜５００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチド、または１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＤＮＡ挿入、および／または変えられる、欠失される、標的とされる、改変される、操作されるなどの内因性座位の領域は、２００ヌクレオチド〜１９ｋｂ、３００ヌクレオチド〜１８ｋｂ、４００ヌクレオチド〜１７ｋｂ、５００ヌクレオチド〜１６ｋｂ、６００ヌクレオチド〜１５ｋｂ、７００ヌクレオチド〜１４ｋｂ、８００ヌクレオチド〜１３ｋｂ、９００ヌクレオチド〜１２ｋｂ、１ｋｂ〜１１ｋｂ、２ｋｂ〜１０ｋｂ、３ｋｂ〜９ｋｂ、４ｋｂ〜８ｋｂ、５ｋｂ〜７ｋｂ、または５ｋｂ〜６ｋｂである。
提供される非ヒト動物

【0200】

ある態様において、ヒトＩｇλ軽鎖配列のすべてまたは一部を含む軽鎖を含有する抗体を発現する非ヒト動物が提供され、当該軽鎖はヒトＩｇλ軽鎖座位の少なくとも一部に相当する遺伝物質の統合から生じたものであり、当該軽鎖座位は少なくともヒトＶλドメイン（すなわち再構成されたヒトＶλ−Ｊλ配列）を、非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中の対応する非ヒトＩｇλ軽鎖配列の代わりにコードしている。本明細書に記述される適切な例としては、限定されないが齧歯類、特にラットまたはマウスが挙げられる。

【0201】

ヒトＩｇλ軽鎖配列は一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖座位由来の遺伝物質を含み、この場合において当該ヒトＩｇλ軽鎖配列は、ヒトＩｇλ軽鎖座位由来の遺伝物質のコード部分を含むイムノグロブリン軽鎖をコードする。一部の実施形態において本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列は、少なくとも一つのヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも一つのヒトＪλ遺伝子セグメント、ならびに前記少なくとも一つのヒトＶλ遺伝子セグメントと前記少なくとも一つのヒトＪλ遺伝子セグメントの再構成を促進し、ヒトＶλドメインをコードする機能的な再構成ヒトＶλ−Ｊλ配列を形成させるために必要な配列（例えば組み換えシグナル配列）を一つ以上含む。多くの実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントと、前記ヒトＶλ遺伝子セグメントと少なくとも一つのヒトＪλ遺伝子セグメントの再構成を促進するために必要な配列を一つ以上含む。多くの実施形態において、本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列は、（例えば細菌人工染色体から単離された、および／またはクローニングされた）ヒトＩｇλ軽鎖座位のゲノム配列であり、複数のヒトＶλ遺伝子セグメントを生殖細胞構造中に含有する。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、生殖細胞構造中にヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列を含む（すなわち前記ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列は、ヒト細胞のＩｇλ軽鎖座位中に存在する）。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、図面（例えば図１〜４を参照）中にあるヒト配列であるか、またはこれを含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、Ｉｇλ軽鎖ポリペプチドのすべてまたは一部をコードし、当該Ｉｇλ軽鎖ポリペプチドは、イムノグロブリン、特にヒトＢ細胞より発現されるイムノグロブリン中に存在する。前記ヒトＩｇλ軽鎖配列を、対応する非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば内因性齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位）の代わりに含有する非ヒト動物、非ヒト胚、および細胞を作製するための非ヒト動物、胚、細胞、および標的化構築物も提供される。

【0202】

一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞ゲノム内に、対応する非ヒトＩｇλ軽鎖配列の代わりに挿入される。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域配列）の上流に挿入される。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖配列の真ん中に挿入され、それにより前記ヒトＩｇλ軽鎖配列は、非ヒトＩｇλ軽鎖配列と並列する（例えば図１、２、３および／または４を参照）。

【0203】

一部の実施形態において、非ヒトＩｇλ軽鎖座位の一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖配列（またはその一部）は欠失されない。一部の実施形態において、非ヒトＩｇλ軽鎖座位の一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば、Ｖλ、Ｊλ、および／またはＣλ）が、特に本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせ）を用いて変えられ、移動され、破壊され、欠失され、または置き換えられ、それらヒト軽鎖配列は、非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域、ならびに非ヒトＩｇλ軽鎖座位の一つ以上のエンハンサーおよび／または制御因子に操作可能に連結される。一部の実施形態において、非ヒトＩｇλ軽鎖座位のすべて、または実質的にすべてが、一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖配列（本明細書に記載される）と置き換えられ、当該一つ以上のヒト軽鎖配列は、非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域ならびに非ヒトＩｇλ軽鎖座位の一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサーおよび／または制御因子に操作可能に連結されている。一部のある実施形態において、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域遺伝子は、本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列を含む非ヒト動物において欠失されず、または置換されない。非限定的な一例であるが、ヒトＩｇλ軽鎖配列の挿入が非ヒトＩｇλ軽鎖座位内に挿入される例において、前記挿入は、挿入点近くの非ヒトＩｇλ軽鎖配列（例えば非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域および／または非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域もしくは配列）の完全性が維持されるように行われる。ゆえにそのような非ヒト動物は野生型のＩｇλ軽鎖定常領域を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載される一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖配列を用いて変えられる、移動される、破壊される、欠失される、置き換えられる、または操作される非ヒトＩｇλ軽鎖座位は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）のＩｇλ軽鎖座位である。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖配列は、前記非ヒトＩｇλ軽鎖座位の２コピーの非ヒトＩｇλ軽鎖座位のうちの１コピー（すなわちアレル）内に挿入され、それによりヒトＩｇλ軽鎖配列に関しヘテロ接合性の非ヒト動物が誕生する。一部の実施形態において、Ｉｇλ軽鎖座位に関しホモ接合性の非ヒト動物が提供され、当該軽鎖座位は本明細書に記載されるヒトＩｇλ軽鎖配列を含む。

【0204】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作された非ヒトＩｇλ軽鎖座位は、ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域ならびに一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサーおよび／または制御因子に操作可能に連結される。一部の実施形態において、本明細書に記載される操作された非ヒトＩｇλ軽鎖座位は、ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサーおよび／または制御因子、ならびに一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサーおよび／または制御因子に操作可能に連結される。

【0205】

一部の実施形態において、非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含有し、当該軽鎖座位はそのゲノム内に無作為に統合されている（例えば無作為に統合されたヒトＩｇλ軽鎖配列の一部として）。ゆえにそのような非ヒト動物は、複数のヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλ遺伝子セグメントを含有するヒトＩｇλ軽鎖導入遺伝子を有するとして記載されることができ、それらセグメントは、前記ヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλ遺伝子セグメントが再構成することができ、そして非ヒト動物の発現レパートリーにおいて抗体のＩｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードすることができるように構成される。本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位または導入遺伝子は、例えば、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、サザンブロット、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、またはアレルの獲得もしくは欠失アッセイを含む、様々な方法を使用して検出されることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位に関してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位に関してヘミ接合性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位または導入遺伝子の一つ以上のコピーを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、図面（例えば図１、２、３および／または４を参照）に図示されるＩｇλ軽鎖座位を含む。

【0206】

一部の実施形態では、その生殖細胞ゲノムが操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物の作製のための組成物および方法が提供され、当該軽鎖座位は、一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖配列（例えばヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλ遺伝子セグメント）を、非ヒトＩｇλ軽鎖配列の代わりに含み、当該ヒト軽鎖配列は、特定の多型のヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλセグメントを含む配列をコードするヒトＩｇλ軽鎖を含み、非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域に操作可能に連結されたヒトＶλ、ＪλおよびＣλセグメントを含有するＩｇλ軽鎖座位からアセンブリされる、ヒト可変ドメインとヒトまたは非ヒト定常ドメインを含有するＩｇλ軽鎖を含む抗体を発現する非ヒト動物の作製のための組成物および方法を含む。一部の実施形態では、かかる抗体を内因性エンハンサーおよび／または内因性制御配列の制御下で発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供されている。一部の実施形態では、かかる抗体を異種エンハンサーおよび／または異種制御配列の制御下で発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供されている。

【0207】

ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、ヒトＩｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードする配列を、非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域（例えばネズミ科Ｃλ領域）の上流に挿入し、それにより抗体が発現されることを含み、当該抗体は、少なくともヒトＶλドメインを含有する軽鎖、一部の実施形態ではヒトＶλおよびＣλドメインを含有する軽鎖の存在が特徴であり、そして非ヒト動物のＢ細胞表面上と血清中の両方で発現される。

【0208】

一部の実施形態では、方法は、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質の連続挿入を含む。一部の実施形態では、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質は、合成またはゲノムであってもよい（例えば、細菌人工染色体からクローニングされたもの）。一部の実施形態では、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質は、公開されたソースから、および／または細菌人工染色体から設計されてもよく、それにより前記遺伝物質がヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλセグメントを含有し、それらセグメントは、ヒトＩｇλ軽鎖座位において存在する方向とは異なるが、しかし前記物質が未だ前記ヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλセグメントが再構成され、機能性Ｉｇλ軽鎖が変わらずコードされるような方向にある。一例であるが、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質は、ヒトＩｇλ軽鎖配列を構築するための本明細書に提供されるガイダンスを使用して設計されてもよく、当該ヒト軽鎖配列はヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλセグメントを含有し、それらセグメントは、ヒト細胞のヒトＩｇλ軽鎖座位において存在するものとは異なる順序および／または構成にある。そのような例において、ヒトＶλ、Ｊλおよび／またはＣλセグメントの内容は、ヒト細胞中の対応するセグメントと等しいであろう。しかしその順序と構成は異なっているであろう。本明細書に記載される非ヒト動物の作製を目的としてヒトＩｇλ軽鎖座位を構築するとき、必須の組み換えシグナル配列を設定し、それにより当該ヒト配列が正しく再構成され、機能性Ｉｇλ軽鎖が形成され得る。適切な組み換えに必要なヒトＩｇλ軽鎖セグメントおよび配列の生殖細胞配置に関するガイダンスは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００４，Ｅｄ．Ｈｏｎｊｏ，Ｔ．，Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４（ｐｐ．３７−５９）および５（６１−８２）に見出すことができ、それらはその全体で参照により本明細書に組み込まれる。

【0209】

一部の実施形態では、連続挿入は、単一ＥＳ細胞クローンにおける異種遺伝物質部分の複数回挿入を含む。一部の実施形態では、連続挿入は、継代ＥＳ細胞クローンにおける異種遺伝物質部分の順次挿入を含む。

【0210】

一部の実施形態では、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域下流の約１１，８２２ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）を含んでいる。一部のある実施形態において、方法は、三つのヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）を含む約１１，８２２ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、前記三つのヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）は、前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ領域の下流に挿入される。

【0211】

一部の実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の上流の約１２５，４７３ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−１０、Ｖλ３−９、Ｖλ２−８、Ｖλ４−３、Ｖλ３−１、ヒトＪλ−Ｃλセグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、およびヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７を含む。一部のある実施形態において、方法は、一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）を含む約１１，８２２ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、前記一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）は、前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の下流に挿入される。

【0212】

一部の実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の上流の約１７１，４５８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、およびＶλ３−２７を含む。一部のある実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結されたヒトＶλ３−１０遺伝子セグメントの上流の約１７１，４５８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ２−１１、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１６、Ｖλ３−１９、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−２２、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２５、およびＶλ３−２７を含む。

【0213】

一部の実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の上流の約１２１，１８８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１およびＶλ５−５２を含む。一部のある実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結されたヒトＶλ３−２７遺伝子セグメントの上流の約１２１，１８８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、およびＶλ５−５２を含む。

【0214】

一部の実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の上流の約１２１，１８８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１およびＶλ５−５２を含み、そして当該ＤＮＡは、マウスＶλ２遺伝子セグメントの５’側の配列を含む相同アームを含む。一部のある実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結されたヒトＶλ３−２７遺伝子セグメントの上流の約１２１，１８８ｂｐのＤＮＡの挿入を含み、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ３−２７、Ｖλ１−３６、Ｖλ５−３７、Ｖλ５−３９、Ｖλ１−４０、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４４、Ｖλ５−４５、Ｖλ７−４６、Ｖλ１−４７、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−５１、およびＶλ５−５２を含み、そして当該ＤＮＡは、マウスＶλ２遺伝子セグメントの５’側の配列を含む相同アームを含み、それにより前記ＤＮＡ断片との相同組換えが行われたときに、マウスＩｇλゲノム配列（例えばＩｇλ軽鎖座位）の欠失が誘導される。

【0215】

追加のヒトＶλ、Ｊλ，および／またはＣλ遺伝子セグメントの挿入は、本明細書に記載される方法を使用して実施することができ、それにより操作Ｉｇλ軽鎖座位の多様性のさらなる追補が行われる。例えば一部の実施形態において、方法は、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域の上流の約３００ｋｂのＤＮＡの挿入を含み、それにより前記ＤＮＡは前記ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ１０−５４、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、およびＶλ４−６９を含む。そのような実施形態において、前記ＤＮＡは、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｃλ１領域に操作可能に連結されたヒトＶλ５−５２遺伝子セグメントの上流に挿入され、当該ＤＮＡは、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ１０−５４、Ｖλ６−５７、Ｖλ４−６０、Ｖλ８−６１、およびＶλ４−６９を含む。一部のある実施形態において、前記ＤＮＡは、ヒトＶｐｒｅＢ遺伝子を含む。上述の追加ヒトＶλセグメントは、市販のＢＡＣクローンから直接クローニングされ、本明細書に記載される、または当分野において他に公知の組み換え技術を使用して、より小さなＤＮＡ断片中に配置されてもよい。あるいは上述の追加ヒトＶλ遺伝子セグメントは、ＤＮＡ断片内に合成され、上述の操作Ｉｇλ軽鎖座位に付加されることもできる。同様に追加ヒトＪλおよび／またはＣλ遺伝子セグメントは、市販のＢＡＣクローンから取得され、または公開配列から直接合成されてもよい。さらに本明細書に記載されるように、内因性Ｉｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）が、操作Ｉｇλ軽鎖座位から削除されてもよい。本明細書に記載される非ヒト動物の操作Ｉｇλ軽鎖座位を示す例図を、図１、２、３、および４のいずれか一つに記載する。

【0216】

適切である場合には、Ｉｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードするヒトＩｇλ軽鎖配列（すなわちヒトＶλ、Ｊλ、および／またはＣλ遺伝子セグメントを含む配列）は、非ヒト動物における発現に最適化されたコドンを含むよう別個に改変されてもよい（例えば米国特許第５，６７０，３５６号および第５，８７４，３０４号を参照）。コドン最適化配列は合成配列であり、非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一ポリペプチド（または全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する全長ポリペプチドの生物活性断片）をコードすることが好ましい。一部の実施形態では、Ｉｇλ軽鎖の全部または一部をコードするヒトＩｇλ軽鎖配列は、特定の細胞型（例えば齧歯類細胞）に対してコドン使用頻度を最適化するために変更された配列を別個に含んでもよい。例えば、非ヒト動物（たとえば齧歯類）のゲノム内に挿入される各ヌクレオチド配列のコドンは、その非ヒト動物の細胞中での発現に対し最適化されていてもよい。このような配列はコドン最適化配列として記述される場合がある。

【0217】

一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列の挿入は、本明細書に記載される非ヒト動物の生殖細胞ゲノムの最小限の改変を利用し、それによりすべてまたは一部がヒトである軽鎖を含む抗体の発現が生じる。ノックアウトおよびノックインを含む遺伝子操作された非ヒト動物を生成する方法は、当技術分野に公知である（例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２０００を参照のこと）。例えば、トランスジェニック齧歯類の生成には、任意選択的に、一つ以上の内因性齧歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）の遺伝子座位の破壊と、一部の実施形態では内因性齧歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）と同じ位置での、その齧歯類ゲノムへの一つ以上の異種遺伝子（または遺伝子セグメントもしくはヌクレオチド配列）の導入とが含まれていてもよい。一部の実施形態において、ヒトＩｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列は、齧歯類の生殖細胞ゲノムにおいて無作為に挿入されたＩｇλ軽鎖導入遺伝子のネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｉｇλ軽鎖定常領域遺伝子の上流に導入される。一部の実施形態において、人Ｉｇλ軽鎖のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列は、齧歯類の生殖細胞ゲノムの内因性Ｉｇλ軽鎖座位のネズミ科（例えばマウスまたはラット）Ｉｇλ軽鎖座位定常領域遺伝子の上流に導入される。一部のある実施形態において、内因性Ｉｇλ軽鎖座位は、ヒトＩｇλ遺伝子セグメント（例えばＶλ、Ｊλおよび／またはＣλ）を含有するよう変えられ、改変され、または操作され、当該セグメントは齧歯類Ｃλ１領域に操作可能に連結される。

【0218】

操作されたＩｇλ軽鎖座位例の略図（正確な縮尺ではない）を図１〜４に提供する。特に図１および図３は、操作されたＩｇλ軽鎖座位を構築するための戦略の例を明記しており、当該軽鎖座位は複数のヒトＶλ、Ｊλ、および／またはＣλセグメントを含有するヌクレオチド配列の挿入を特徴とする。図１に図示されるように、ヒトＥλ配列（または領域）を含有するＤＮＡ断片は、相同組換えを介して齧歯類Ｃλ領域の下流に挿入される。このＤＮＡ断片は、ヒトＥλ配列の３’側に配置されたネオマイシン選択カセット（例えばｌｏｘＰ組み換え認識部位に隣接されるネオマイシン抵抗性遺伝子［ＮＥＯ^Ｒ］）を含有し、この断片は、齧歯類Ｃλ１領域の下流（または３’側）に操作された三つのヒトＥλ因子を含有する。また図１には、ヒトＶλセグメント、ヒトＪλ−Ｃλセグメント対のセット（例えばヒトＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃｌ３、Ｊλ６−Ｃλ６）、およびヒトＪλ７セグメントの第一の部分を含有するＤＮＡ断片が、相同組換えを介して齧歯類Ｃλ１領域の上流に挿入されていることが図示される。図示されるように、ハイグロマイシン選択カセット（例えばＦｒｔ組み換え認識部位に隣接されるハイグロマイシン抵抗性遺伝子［ＨＹＧ^Ｒ］が、標的化ベクターの５’末端上、およびその標的化ベクターに含有されるヒトＩｇλ軽鎖配列の上流に配置されている。ハイグロマイシン選択カセットは、以下の実施例の項に記載される次の標的化ベクターを用いた相同組換えを介して除去される。次いで標的化ベクターは、齧歯類の胚性幹（ＥＳ）細胞内にエレクトロポレーションされ、その生殖細胞ゲノムが、操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む齧歯類が産生される。陽性齧歯類ＥＳ細胞クローンが確認されたら、その他の図示される標的化ベクターを連続的にエレクトロポレーションして、各工程で操作Ｉｇλ軽鎖座位の構築が完了したことを確認する（図２を参照）。最後の標的化ベクターは、相同組換えを介した内因性Ｉｇλ軽鎖セグメントの削除を誘導する相同アームを伴って（６６８０標的化ベクター）、または伴わずに（６５９７標的化ベクター）設計されており、それにより二つの操作Ｉｇλ軽鎖アレルが生じる可能性がある（図２）。さらに望ましい場合にはリコンビナーゼ介在性削除を介して任意の残りの選択カセットを削除してもよい。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して追加のヒトＶλ遺伝子セグメントを操作Ｉｇλ軽鎖座位に挿入するための別の戦略を図３に明記する。

【0219】

ヒトＩｇλ軽鎖配列がＢＡＣクローンの非ヒトＩｇλ軽鎖定常領域の上流に挿入されると、Ｉｇλ軽鎖座位内への統合用の標的化ベクターが生成される。標的化ベクター生成用の、ヒトＩｇλ軽鎖配列を有する標的ＢＡＣクローンは、ネズミ科（例えばマウスまたはラット）起源の５’および／または３’隣接ゲノムＤＮＡを含有してもよい。あるいは、またはさらに、標的化ベクター生成用の、ヒトＩｇλ軽鎖配列を有する標的ＢＡＣクローンは、ヒト起源の５’および／または３’隣接ゲノムＤＮＡを含有してもよく、それによりヒトＩｇλ軽鎖配列との重複領域が生成される。この方法では、複数の操作ＢＡＣクローンの連続標的化が可能である（例えば図１を参照）。最後の標的化ベクターは、非ヒト細胞（例えば齧歯類胚性幹細胞）のゲノム中のＩｇλ軽鎖座位内に組み込まれる。一部の実施形態において、本明細書に記載される標的化ベクターは、非ヒト細胞の生殖細胞ゲノムのＩｇλ軽鎖座位内に組み込まれ、当該細胞は一つ以上のＩｇＨ定常領域遺伝子と操作可能に連結されたヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_ＨゲノムＤＮＡ（例えば複数のＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含有する）、ならびに／またはＩｇκ定常領域遺伝子に操作可能に連結されたヒトＶκおよびＪκゲノムＤＮＡ（例えば複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する）をさらに含有する（例えば米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および第８，７９１，３２３号を参照のこと。それらは参照により本明細書にその全体で組み込まれる）。

【0220】

標的化ベクターは、エレクトロポレーションにより齧歯類（例えばマウス）胚性幹細胞内に導入され、それにより当該標的化ベクター中に含有される配列は、当該齧歯類胚性幹細胞のゲノム内に挿入され、非ヒト細胞または非ヒト動物（例えばマウス）が、ヒトＩｇλ軽鎖のすべてまたは一部を有する抗体を発現する能力を生じさせる。本明細書に記載されるように、操作されたＩｇλ軽鎖座位（例えば、本明細書に記載される内因性齧歯類Ｃλ領域に操作可能に連結されたヒトＩｇλ軽鎖配列を含有する内因性Ｉｇλ軽鎖座位）が齧歯類ゲノムの生殖細胞中に生成されたトランスジェニック齧歯類が作製される。齧歯類Ｂ細胞の表面上、および前記齧歯類の血清中に抗体が発現され、当該抗体は、ヒトＶλドメインを、一部の実施形態においてはヒトＶλおよびＣλドメインを有する軽鎖により特徴付けられる。齧歯類ゲノムの生殖細胞中の内因性Ｉｇλ軽鎖座位が標的化ベクターの標的とされない場合、操作されるＩｇλ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位以外の位置に挿入されることが好ましい（例えば無作為挿入される導入遺伝子など）。

【0221】

上述の非ヒト動物において操作されたＩｇλ軽鎖座位を生成することにより、ヒトＶλドメイン、及び一部の実施形態においてはヒトＶλおよびＣλドメインを有する当該操作されたＩｇλ軽鎖座位から発現されたＩｇλ軽鎖を含む抗体を産生する操作齧歯類系統が提供される。ＩｇＨ定常領域遺伝子に操作可能に連結された複数のヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、操作されたＩｇＨ座位の存在を活用することで、ヒト抗体系治療剤の開発用の抗体および抗体構成要素を産生する操作された齧歯類系統が生成される。ゆえに単一操作された齧歯類系統は、ヒト疾患を治療するための新たな抗体系医薬の開発用にヒトＶλドメインを活用する代替的インビボシステムを提供する能力を有することが理解される。

【0222】

一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物ゲノムは、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および第８，７９１，３２３号に記載されるような一つ以上のヒトイムノグロブリン重鎖および／または軽鎖可変領域を（例えば交配または複数遺伝子標的化戦略を介して）さらに含有する。それら特許はすべてその全体で参照により本明細書に組み込まれる。あるいは本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位は、ヒト化ＩｇＨおよび／またはＩｇκ座位を含む胚性幹細胞内に操作されてることができ、または本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物は、ヒト化ＩｇＨおよび／またはＩｇκ座位を含む別の非ヒト動物と交配されてもよい。かかるヒト化ＩｇＨおよび／またはＩｇκ座位を含む様々な動物が公知であり、例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）系統（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号および／または第８，６４２，８３５号を参照。これらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ系統（例えば、Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５（２）：１４６−５６ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５２５−３５を参照）がある。本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位のホモ接合性は、その後に交配を行うことにより実現することができる。あるいは無作為挿入された操作Ｉｇλ軽鎖導入遺伝子（上述）の場合には、特に導入遺伝子からのヒトＶλドメインの発現に基づいて齧歯類系統を選択することができる。

【0223】

あるいは、および／またはさらに一部の実施形態において、本明細書に記載される非ヒト動物の生殖細胞ゲノムは、削除された、不活化された、機能的にサイレンシングされた、または別手段により非機能性の内因性Ｉｇκ軽鎖座位をさらに含む。遺伝子もしくは遺伝子座位を削除する、または非機能性にさせる遺伝子改変は、本明細書に記載される方法を使用して、および／または当分野に公知の方法を使用して実施してもよい。

【0224】

トランスジェニック創始非ヒト動物は、その生殖細胞ゲノム中の操作されたＩｇλ軽鎖座位の存在に基づいて、および／または非ヒト動物の組織もしくは細胞におけるヒトＩｇλ軽鎖配列のすべてまたは一部を有する抗体の発現に基づいて、特定されることができる。次いでトランスジェニック創始非ヒト動物を使用して、操作されたＩｇλ軽鎖座位を担持する別の非ヒト動物と交配させ、それによって各々が１コピー以上の操作されたＩｇλ軽鎖座位を担持する非ヒト動物群を作製することができる。また、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を担持するトランスジェニック非ヒト動物を、所望される他の導入遺伝子（例えばヒトイムノグロブリン遺伝子）を担持する他のトランスジェニック非ヒト動物とさらに交配させることもできる。

【0225】

一部の実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、導入遺伝子または統合された配列の制御発現、有向性発現、誘導性発現および／または細胞型特異的発現を可能とする選択システムを含有するように作製されてもよい。例えば本明細書に記載される非ヒト動物を操作して、条件付きで発現される抗体のヒトＩｇλ軽鎖をすべてまたは一部コードする配列を含有させてもよい（例えば、Ｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（３）：６００−３に概説される）。システムの例としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６２３２−６を参照のこと）及び出芽酵母のＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−５）が挙げられる。こうした動物は、例えば、一方は選択された改変（例えば、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位）を含む導入遺伝子を含有し、他方はリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）をコードする導入遺伝子を含有する、二種のトランスジェニック動物を交配させることによって、「二重」のトランスジェニック動物を構築することにより提供され得る。

【0226】

本明細書に記載の非ヒト動物は、多くの場合、当該非ヒト動物の使用目的に応じて、追加のヒト遺伝子、ヒト化遺伝子または別手段で操作された遺伝子を含むように、上述のように調製されるかまたは当技術分野に公知の方法用いて調製されてもよい。かかるヒト遺伝子、ヒト化遺伝子、または別手段で操作された遺伝子の遺伝物質は、上述の遺伝的改変または変化を有する細胞（例えば胚性幹細胞）のゲノムのさらなる改変を介して、または所望される他の遺伝子改変系統もしくは遺伝子操作系統を用いた当技術分野に公知の交配技術を介して、導入されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、トランスジェニックヒトＩｇＨおよび／もしくはＩｇκ軽鎖遺伝子または遺伝子セグメントをさらに含有するように調製される（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３−５１５８；米国特許第８，５０２，０１８号、米国特許第８，６４２，８３５号、米国特許第８，６９７，９４０号、米国特許第８，７９１，３２３号、および米国特許出願公開２０１３／００９６２８７Ａ１を参照。それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。

【0227】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記述される標的化ベクターを、改変された系統由来の細胞内へと導入することにより作製されてもよい。一例を挙げると、上述の標的化ベクターは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに導入されてもよい。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、完全ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインを有する抗体を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトイムノグロブリン遺伝子（可変領域遺伝子および／または定常領域遺伝子）をさらに備えるように作製される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位と、異種（例えばヒト）由来の遺伝物質を含み、この場合において当該遺伝物質は、一つ以上のヒト重鎖および／またはＩｇκ軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部をコードする。

【0228】

例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物は、以下の文献に記載される一つ以上の改変を（例えば、交配または複数遺伝子標的化戦略を介して）さらに含んでもよい：Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３−８；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１４７−５２、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号および第８，７９１，３２３号。これらすべてはその全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む齧歯類は、ヒト化ＩｇＨおよび／またはＩｇκ軽鎖の可変領域座位を含む齧歯類と交配される（例えば米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および／または第８，７９１，３２３号を参照。それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む齧歯類は、ヒト化ＩｇＨ可変領域座位（例えば米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および／または第８，７９１，３２３号を参照。それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）、および不活化内因性Ｉｇκ軽鎖座位（例えば米国特許第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号、および第９，１６３，０９２号を参照。それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）を含む齧歯類と交配される。

【0229】

マウスでの操作Ｉｇλ軽鎖座位の構築を記載する実施形態（すなわち、マウスＣλ領域と操作可能に連結された複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられる操作Ｉｇλ軽鎖座位を有し、それによりヒトＩｇλ軽鎖を含有する抗体が発現されるマウス）が本明細書において詳細に検討されているが、操作Ｉｇλ軽鎖座位を含む他の非ヒト動物も提供される。そのような非ヒト動物としては、本明細書に記載される抗体を発現するよう遺伝子改変され得る非ヒト動物のいずれか、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの哺乳類が挙げられる。例えば、好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作るために他の方法が採用される。このような方法には、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を利用して好適な細胞、例えば除核卵母細胞、に遺伝子改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。

【0230】

非ヒト動物の生殖細胞ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯類、ニワトリなどのゲノム）を改変する方法としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）、またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を利用して本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位を含ませる方法が挙げられる。非ヒト動物の生殖細胞ゲノムの改変方法に関するガイダンスは、例えば米国特許出願１４／７４７，４６１（２０１５年６月２３日出願）、１４／９４８，２２１（２０１５年１１月２０日出願）、および１４／９７４，６２３（２０１５年１２月１８日出願）に見出すことができ、これら３出願はすべて参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。

【0231】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝的に改変された動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はマウス、ラット、ハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、及び高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。一部のある実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一部のある実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものである。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、齧歯類である。一部のある実施形態では、本明細書に記載される齧歯類は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、マウスである。

【0232】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯類である。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系から成る群から選択される１２９系である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照）。一部のある実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ／６系との混合である。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、前述の１２９系の混合、または前述のＢＬ／６系の混合である。一部の実施形態では、本明細書に記述された混合の１２９系は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、例えばＢＡＬＢ／ｃ系などのＢＡＬＢ系である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統及び前述の別系統の混合である。

【0233】

一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ラットである。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記述されたラット系は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから成る群から選択された二つ以上の系の混合である。

【0234】

ラット多能性細胞および／または分化全能性細胞は、たとえばＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはたとえばＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統をはじめとする任意のラット系統由来であってもよい。ラット多能性細胞及び／または分化全能性細胞は、上記の二つ以上の系統の混合から誘導された系統から取得されたものであってもよい。例えば、ラット多能性細胞及び／または分化全能性細胞は、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統由来のものであってもよい。ＡＣＩラット系統は、黒アグーチを有し、腹部と足は白色で、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプであることが特徴である。当該系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓをはじめとする様々な供給源から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチの毛色を有し、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプであることが特徴である。当該ラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓをはじめとする様々な供給源から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株と、ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。一部の実施形態において、ラット多能性細胞および／または分化全能性細胞は、近交系ラット系統由来である（例えば２０１４年８月２１日に公開された米国特許出願公開２０１４−０２３５９３３Ａ１を参照。当該出願は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。
具体的な例示的実施形態−操作されたＩｇＨ座位

【0235】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含み、そして複数のヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられる操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）をさらに含み、それらセグメントは、生殖細胞構造中に配置され、非ヒトＩｇＨ定常領域、エンハンサーおよび制御領域に操作可能に連結される。一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇＨ定常領域に操作可能に連結される。

【0236】

一部の実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０個またはそれ以上（例えば、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２個など）のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇＨ座位の、両端を含むヒトＶ_Ｈ３−７４とヒトＶ_Ｈ６−１遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、少なくともヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのＶ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−２、およびＶ_Ｈ６−１を含む。

【0237】

一部の実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、５、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上（例えば、２６、２７個など）のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇＨ座位の、両端を含むヒトＤ_Ｈ１−１とＤ_Ｈ７−２７遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、少なくともヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのＤ_Ｈ１−１、Ｄ_Ｈ２−２、Ｄ_Ｈ３−３、Ｄ_Ｈ４−４、Ｄ_Ｈ５−５、Ｄ_Ｈ６−６、Ｄ_Ｈ１−７、Ｄ_Ｈ２−８、Ｄ_Ｈ３−９、Ｄ_Ｈ３−１０、Ｄ_Ｈ５−１２、Ｄ_Ｈ６−１３、Ｄ_Ｈ２−１５、Ｄ_Ｈ３−１６、Ｄ_Ｈ４−１７、Ｄ_Ｈ６−１９、Ｄ_Ｈ１−２０、Ｄ_Ｈ２−２１、Ｄ_Ｈ３−２２、Ｄ_Ｈ６−２５、Ｄ_Ｈ１−２６、およびＤ_Ｈ７−２７を含む。

【0238】

一部の実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の機能性ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇＨ座位の、両端を含むヒトＪ_Ｈ１とヒトＪ_Ｈ６遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）は、少なくともヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１、Ｊ_Ｈ２、Ｊ_Ｈ３、Ｊ_Ｈ４、Ｊ_Ｈ５、およびＪ_Ｈ６を含む。

【0239】

一部のある実施形態において、非ヒトＩｇＨ定常領域は、例えばイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、イムノグロブリンＤ（ＩｇＤ）、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）およびイムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）などの一つ以上の非ヒトＩｇＨ定常領域遺伝子を含む。一部のある実施形態において、非ヒトＩｇＨ定常領域は、齧歯類ＩｇＭ、齧歯類ＩｇＤ、齧歯類ＩｇＧ３、齧歯類ＩｇＧ１、齧歯類ＩｇＧ２ｂ、齧歯類ＩｇＧ２ａ、齧歯類ＩｇＥ、および齧歯類ＩｇＡの定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態において、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇＨエンハンサー（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇＨ制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇＨエンハンサー（またはエンハンサー配列）と一つ以上の非ヒトＩｇＨ制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。

【0240】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇＨ座位は、内因性Ａｄａｍ６遺伝子を含有しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇＨ座位は、同種の野生型非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中に存在する位置と同じ生殖細胞ゲノム位置に内因性Ａｄａｍ６遺伝子（またはＡｄａｍ６コード配列）を含有しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇＨ座位は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を含有しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇＨ座位は、一つ以上の非ヒト（例えば齧歯類）Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列の挿入を含む。前記挿入は、本明細書に記載される操作されたイムノグロブリン重鎖座位の外側（例えば最も５’側のＶ_Ｈ遺伝子セグメントの上流）、操作されたＩｇＨ座位の内、または非ヒト動物、細胞もしくは組織の生殖細胞ゲノム中の別の場所（例えば無作為に導入された非ヒトＡｄａｍ６をコードする配列）であってもよい。

【0241】

様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶ_Ｈ領域のすべてまたは一部を検出可能な程度に発現しない。様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶ_Ｈ領域（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈおよび／またはＪ_Ｈ）のすべてまたは一部をコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、またはそれの欠失を含有する）。様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、内因性非ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む生殖細胞ゲノムを有する。様々な実施形態において、提供される非ヒト動物は、繁殖可能である。

【0242】

かかる操作されたＩｇＨ座位（またはアレル）を担持する標的化ベクター、非ヒト細胞および動物の作製に関するガイダンスは、例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に見出すことができ、それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。当分野の当業者であれば、非ヒト（例えば哺乳類）のそのような遺伝子操作および／または処置を実現するための、または非ヒト動物の生殖細胞ゲノム内への導入用にそのような配列を別手段で調製、提供または製造するための当分野に公知の様々な技術を認識する。
具体的な例示的実施形態−操作されたＩｇκ軽鎖座位

【0243】

一部の実施形態において、提供された非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含み、そして複数のヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられる操作されたＩｇκ座位（またはアレル）をさらに含み、それらセグメントは、生殖細胞構造中に配置され、非ヒトＩｇκ軽鎖定常領域、Ｉｇκエンハンサーおよび制御領域に操作可能に連結される。一部の実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇκ定常領域（Ｃκ）に操作可能に連結される。

【0244】

一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇκ軽鎖座位の遠位の可変クラスター（または遠位アーム、または遠位重複）中に存在する少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇκ軽鎖座位の近位の可変クラスター（または近位アーム、または近位重複）中に存在する少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇκ軽鎖座位の遠位および近位の可変クラスター中に存在するヒトＶκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇκ座位の、両端を含むヒトＶκ２−４０（またはＶκ３Ｄ−７）とヒトＶκ４−１遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＶκ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。

【0245】

一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５個またはそれ以上（例えば、３６、３７、３８、３９、４０個など）のヒトκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、ヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ３Ｄ−７、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３９、Ｖκ２Ｄ−４０、Ｖκ２−４０、Ｖκ１−３９、Ｖκ１−３３、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−２８、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２４、Ｖκ６−２１、Ｖκ３−２０、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−１６、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１２、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−９、Ｖκ１−８、Ｖκ１−６、Ｖκ１−５、Ｖκ５−２、およびＶκ４−１を含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ３Ｄ−７、Ｖκ１Ｄ−８、Ｖκ１Ｄ−４３、Ｖκ３Ｄ−１１、Ｖκ１Ｄ−１２、Ｖκ１Ｄ−１３、Ｖκ３Ｄ−１５、Ｖκ１Ｄ−１６、Ｖκ１Ｄ−１７、Ｖκ３Ｄ−２０、Ｖκ６Ｄ−２１、Ｖκ２Ｄ−２６、Ｖκ２Ｄ−２８、Ｖκ２Ｄ−２９、Ｖκ２Ｄ−３０、Ｖκ１Ｄ−３３、Ｖκ１Ｄ−３９、およびＶκ２Ｄ−４０を含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくともヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ２−４０、Ｖκ１−３９、Ｖκ１−３３、Ｖκ２−３０、Ｖκ２−２８、Ｖκ１−２７、Ｖκ２−２４、Ｖκ６−２１、Ｖκ３−２０、Ｖκ１−１７、Ｖκ１−１６、Ｖκ３−１５、Ｖκ１−１２、Ｖκ３−１１、Ｖκ１−９、Ｖκ１−８、Ｖκ１−６、Ｖκ１−５、Ｖκ５−２、およびＶκ４−１を含む。

【0246】

一部の実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、１、２、３、４、５個またはそれ以上の機能性ヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇκ軽鎖座位の、両端を含むヒトＪκ１とヒトＪκ５遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＪκ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくともヒトＪκ遺伝子セグメントのＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４およびＪκ５を含む。

【0247】

一部の実施形態において、前記ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇκエンハンサー（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇκ軽鎖制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇκ軽鎖エンハンサー（またはエンハンサー配列もしくはエンハンサー領域）と一つ以上の非ヒトＩｇκ軽鎖制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。

【0248】

一部の実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣκ領域は、齧歯類Ｃκ領域、例えばマウスＣκ領域またはラットＣκ領域を含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣκ領域は、１２９系、ＢＡＬＢ／ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系の混合系、またはその組み合わせを含む遺伝的背景に由来するマウスＣκ領域であるか、またはそれを含む。

【0249】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を含み、不活化されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）をさらに含む。

【0250】

様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶκ領域のすべてまたは一部を検出可能な程度に発現しない。様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、抗体分子中に内因性非ヒトＶκ領域のすべてまたは一部をコードする一つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、またはそれの欠失を含有する）。様々な実施形態において、本明細書に記載される提供される非ヒト動物、非ヒト細胞、または非ヒト組織は、内因性非ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む生殖細胞ゲノムを有する。

【0251】

かかる操作されたＩｇκ軽鎖座位（またはアレル）を担持する標的化ベクター、非ヒト細胞および動物の作製に関するガイダンスは、例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に見出すことができ、それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。当分野の当業者であれば、非ヒト（例えば哺乳類）のそのような遺伝子操作および／または処置を実現するための、または非ヒト動物の生殖細胞ゲノム内への導入用にそのような配列を別手段で調製、提供または製造するための当分野に公知の様々な技術を認識する。
具体的な例示的実施形態−操作されたＩｇλ軽鎖座位

【0252】

一部の実施形態において、提供される非ヒト動物は、操作されたＩｇλ軽鎖座位を含み、当該軽鎖座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントの存在により特徴付けられ、それらセグメントは、生殖細胞構造中に配置され、そして非ヒトＣλ遺伝子セグメント（またはＣλ領域遺伝子）の上流に挿入され、および操作可能に連結される。本明細書に記載されるように、かかる操作されたＩｇλ軽鎖座位は、一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）をさらに含む。一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、それらセグメントは非ヒトＩｇλ軽鎖定常（Ｃλ）領域に操作可能に連結される。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、ヒトＩｇλ軽鎖座位の少なくともクラスターＡに存在する、一部の実施形態においては、ヒトＩｇλ軽鎖座位のクラスターＡとクラスターＢに存在する、一部のある実施形態においては、ヒトＩｇλ軽鎖座位のクラスターＡ、クラスターＢおよびクラスターＣに存在する、ヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。

【0253】

一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、５、１０、１５、２０、２５、３０個またはそれ以上（例えば、３１、３２、３３、３４、３５個など）のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇλ座位の、両端を含むヒトＶλ４−６９とヒトＶλ３−１遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇλ座位の、両端を含むヒトＶλ５−５２とヒトＶλ３−１遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇλ座位の、両端を含むヒトＶλ３−２７とヒトＶλ３−１遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ４−６９、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６０、Ｖλ６−５７、Ｖλ１０−５４、Ｖλ５−５２、Ｖλ１−５１、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−４７、Ｖλ７−４６、Ｖλ５−４５、Ｖλ１−４４、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４０、Ｖλ５−３９、Ｖλ５−３７、Ｖλ１−３６、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−２５、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２２、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−１９、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１０、Ｖλ３−９、Ｖλ２−８、Ｖλ４−３およびＶλ３−１を含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくとも機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０と、Ｖλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む。

【0254】

一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上の機能性ヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇλ軽鎖座位の、両端を含むヒトＪλ１とヒトＪλ７遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＪλ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくともヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６およびＪλ７を含む。

【0255】

一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、１、２、３、４、５、６、７個またはそれ以上の機能性ヒトＣλ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、自然界で存在するヒトＩｇλ軽鎖座位の、両端を含むヒトＣλ１とヒトＣλ７遺伝子セグメントの間に存在する機能性ヒトＣλ遺伝子セグメントのすべて、または実質的にすべてを含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくともヒトＣλ遺伝子セグメントのＣλ１、Ｃλ２、Ｃλ３、およびＣλ６を含む。

【0256】

一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、野生型Ｉｇλ軽鎖座位（またはアレル）に存在するものと同じ非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を含有しない。一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、少なくとも一つの非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）のすべてまたは一部（例えばＩｇλエンハンサー２−４またはＥλ２−４）を欠く。

【0257】

一部の実施形態において、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）と一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖制御領域（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。一部の実施形態において、前記ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー（またはエンハンサー配列もしくはエンハンサー領域）、一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー（すなわちエンハンサー配列またはエンハンサー領域）、および一つ以上の非ヒトＩｇλ軽鎖制御領域（または制御配列）に操作可能に連結される。

【0258】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、ヒトＶｐｒｅＢ遺伝子（またはヒトＶｐｒｅＢ遺伝子コード配列）を含有しない。

【0259】

一部の実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、齧歯類Ｃλ領域、例えばマウスＣλ領域またはラットＣλ領域を含む。一部のある実施形態において、操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、１２９系、ＢＡＬＢ／ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系の混合系、またはその組み合わせを含む遺伝的背景に由来するマウスＣλ領域であるか、またはそれを含む。

【0260】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、配列番号１（マウスＣλ１）、配列番号３（マウスＣλ２）または配列番号５（マウスＣλ３）に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、配列番号１（マウスＣλ１）、配列番号３（マウスＣλ２）または配列番号５（マウスＣλ３）に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、マウスＣλ１領域の配列であるか、またはそれを含む。

【0261】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、配列番号２（マウスＣλ１）、配列番号４（マウスＣλ２）または配列番号６（マウスＣλ３）に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、配列番号２（マウスＣλ１）、配列番号４（マウスＣλ２）または配列番号６（マウスＣλ３）に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、マウスＣλ１領域のポリペプチドであるか、またはそれを含む。

【0262】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、配列番号７（ラットＣλ１）、配列番号９（ラットＣλ２）、配列番号１１（ラットＣλ３）または配列番号１３（ラットＣλ４）に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、配列番号７（ラットＣλ１）、配列番号９（ラットＣλ２）、配列番号１１（ラットＣλ３）または配列番号１３（ラットＣλ４）に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）の非ヒトＣλ領域は、ラットＣλ１領域の配列であるか、またはそれを含む。

【0263】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、配列番号８（ラットＣλ１）、配列番号１０（ラットＣλ２）、配列番号１２（ラットＣλ３）または配列番号１４（ラットＣλ４）に対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、配列番号８（ラットＣλ１）、配列番号１０（ラットＣλ２）、配列番号１２（ラットＣλ３）または配列番号１４（ラットＣλ４）に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。一部のある実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に位置付けられた配列によりコードされる非ヒトＣλ領域は、ラットＣλ１領域のポリペプチドであるか、またはそれを含む。

【0264】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、ヒトＩｇλ軽鎖配列（ゲノムまたは合成）に対応するヒト遺伝物質を、非ヒトＩｇλ軽鎖配列の代わりに内因性座位で挿入することから生じる一つ以上の固有のヌクレオチド配列接合部の存在により特徴付けられる。ヌクレオチド配列接合部の例を、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、および配列番号１２９に明記する。

【0265】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、および配列番号１２９のうちの一つ以上を含む。

【0266】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、および配列番号１２３を含む。

【0267】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、および配列番号１２３を含む。

【0268】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２８、および配列番号１２９を含む。

【0269】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２６、および配列番号１２７を含む。

【0270】

一部の実施形態において、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）は、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、および配列番号１２５を含む。

【0271】

ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントに関するガイダンスは、例えばＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，２０００，Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，４０：Ａ．１ｐ．１−Ａ．１ｐ．３７に見いだされる。特に本開示は、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントがＩｇλ軽鎖座位（またはアレル）に存在することで、提供される非ヒト動物の軽鎖レパートリーの多様性が、かかる操作されたＩｇλ軽鎖アレルを含まない非ヒト動物の発現抗体レパートリー中の軽鎖の多様性と比較して増加していることを示す。
方法

【0272】

ある態様において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト抗体の作製、および／またはヒト抗体をコードする核酸配列の作製に利用することができ、当該ヒト抗体は、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞の遺伝物質によってコードされる核酸配列由来の可変ドメインを含む。例えば、本明細書に記載の非ヒト動物は、当該非ヒト動物が対象抗原に対し免疫反応を生じさせる条件下、および充分な時間、前記対象抗原で免疫化される。抗体は、そのように免疫化された非ヒト動物（または一つ以上の細胞、例えば、一つ以上のＢ細胞）から単離され、例えば、親和性、特異性、エピトープマッピング、リガンド−受容体相互作用の阻害能力、受容体活性の阻害能力などを測定する、種々のアッセイを用いて特徴付けられる。種々の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物によって産生される抗体は、非ヒト動物から単離された一つ以上のヒト可変領域ヌクレオチド配列由来である一つ以上のヒト可変ドメインを含む。一部の実施形態では、抗薬剤抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）が、本明細書に記載の非ヒト動物に生じ得る。

【0273】

一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、様々なアッセイに有用なヒト抗体を産生するための、改良されたインビボシステムと生物学的物質（例えば、細胞）の供給源とを提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、対象ポリペプチド（例えば膜貫通ポリペプチドまたは分泌ポリペプチド）を標的とする治療剤、および／または前記対象ポリペプチドと関連する一つ以上の活性を調節する治療剤、および／または前記対象ポリペプチドと他の結合パートナー（例えばリガンドまたは受容体ポリペプチド）の相互作用を調節する治療剤が開発される。例えば様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上の受容体ポリペプチドを標的とする治療剤、受容体ポリペプチドを調節する治療剤、および／または受容体ポリペプチドと他の結合パートナーとの相互作用を調節する治療剤が開発される。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上の対象ポリペプチドに結合する治療剤候補物質（例えば抗体、ｓｉＲＮＡなど）が特定、スクリーニング、および／または開発される。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上の対象ポリペプチド活性を阻害する、または一つ以上の対象受容体ポリペプチドの活性を阻害する、治療剤候補物質（例えば抗体、ｓｉＲＮＡなど）がスクリーニングされ、および開発される。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上の対象ポリペプチドのアンタゴニストおよび／またはアゴニストの結合プロファイルが決定される。一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上の対象ポリペプチドに結合する一つ以上の治療用抗体候補のエピトープが決定される。

【0274】

様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一つ以上のヒト抗体候補の薬物動態プロファイルが決定される。様々な実施形態において、本明細書に記載の一つ以上の非ヒト動物及び一つ以上の対照または参照の非ヒト動物がそれぞれ、一つ以上のヒト抗体候補に様々な投与量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治療薬抗体は、経口および非経口投与経路を含む、任意の望ましい投与経路で投薬される場合がある。非経口経路は、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。非注射経路は、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。非ヒト動物（ヒト化および対照）から血液が様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大３０日またはそれ以上の日数）で単離される。様々なアッセイは、総ＩｇＧ、抗治療抗体反応、凝集などを含むがこれらに限定されない、本明細書に記述された非ヒト動物から取得されたサンプルを使用して、投与された候補治療抗体の薬物動態プロファイルを決定するために実施される場合がある。

【0275】

様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、対象ポリペプチドの活性を阻害または調節する治療効果、および細胞変化の結果としての遺伝子発現または受容体ポリペプチドとの関連では当該非ヒト動物の細胞表面上の受容体ポリペプチドの密度に対する効果が測定される。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物またはそれらから単離された細胞が治療剤候補物質に暴露され、当該候補物質は、対象ポリペプチドに結合し、その一定期間後、前記対象ポリペプチドと関連した特定の細胞プロセス、例えばリガンド−受容体相互作用またはシグナル伝達に対する効果が分析される。

【0276】

ある態様において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト抗体可変ドメインを発現する。従って、細胞、細胞株および細胞培養物は、例えばアンタゴニストもしくはアゴニストの結合または機能に関するアッセイを行うなどの結合アッセイおよび機能性アッセイにおける使用のためのヒト抗体可変ドメインの供給源として利用されるよう作製されることができ、この場合において当該アンタゴニストまたはアゴニストは、対象のヒト抗原に特異的であり、またはリガンド−受容体相互作用（結合）で機能するエピトープに特異的である。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された細胞を使用して、治療用候補物質の抗体またはｓｉＲＮＡによって結合されたエピトープを決定することができる。

【0277】

提供される非ヒト動物由来の細胞は、その場限りで単離して使用するか、または多世代にわたって培養物中で維持することができる。様々な実施形態において、提供される非ヒト動物からの細胞は（例えば、ウイルスの使用によって）不死化され、培養物中（例えば、連続培養物中）で無期限に維持される。

【0278】

一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、対象ポリペプチドに結合するヒト抗体可変ドメインのバリアント（例えばヒトＶλドメインバリアント）作製のためのインビボシステムを提供する。こうしたバリアントには、望ましい機能性、特に対象ポリペプチドの二種以上のバリアントに共有される共通エピトープに対する交差反応性が低いなどの機能性を有するヒト抗体可変ドメインを含む。一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を利用して、望ましい、または改善された機能性に関してスクリーニングされる、一連のバリアント可変ドメインを含有するヒト抗体可変ドメインパネルが作製される。

【0279】

ある態様において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト抗体可変領域ライブラリー（例えばヒトＶλドメインライブラリー）を作製するためのインビボシステムを提供する。そのようなライブラリーは、望まれるエフェクター機能に基づいて、異なるＦｃ領域上に移植され得る重鎖および／または軽鎖可変領域配列の供給源を提供するものであり、当分野に公知の技術（例えば部位特異的突然変異誘導、エラープローンＰＣＲなど）を使用した可変領域配列のアフィニティ成熟のための供給源として使用され、および／または例えばキメラ抗原受容体（すなわち抗体構成要素を使用して操作された分子、例えばｓｃＦｖ）、多特異性結合物質（例えば二特異性結合物質）および融合タンパク質（例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖなど）といった抗体系治療用分子の作製のための抗体構成要素の供給源として使用される。

【0280】

一部の態様において、本明細書に記載の非ヒト動物は、薬剤またはワクチンの分析および検査のためのインビボシステムを提供する。様々な実施形態において、候補薬剤またはワクチンが本明細書に記載の一つ以上の非ヒト動物に送達され、その後、当該非ヒト動物をモニターして、薬剤もしくはワクチンに対する免疫反応、薬剤もしくはワクチンの安全性プロファイル、または疾患もしくは症状に対する効果および／もしくは疾患もしくは症状の一つ以上の兆候に対する効果のうちの一つ以上を算出してもよい。安全性プロファイルを算出するために使用される例示的方法には、毒性、至適用量濃度、抗体（すなわち抗薬剤）反応、薬剤またはワクチンの有効性、および潜在的リスク因子の測定が含まれる。このような薬剤またはワクチンはこのような非ヒト動物で改善および／または開発される場合がある。

【0281】

ワクチンの有効性は、数多くの方法で算出され得る。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物は当技術分野で公知の方法を使用して免疫化され、その後ワクチンに曝露されるか、またはすでに感染した非ヒト動物にワクチンが投与される。ワクチンに対する非ヒト動物の応答を、その非ヒト動物（またはそれらから単離された細胞）のモニタリングを行うことにより、および／またはそれらに対して一つ以上のアッセイを行うことにより測定して、ワクチンの有効性を決定することができる。ワクチンに対する非ヒト動物の応答は、続いて、当技術分野に公知の、および／または本明細書に記載の一つ以上の手段を使用して、対照動物と比較される。

【0282】

ワクチンの有効性は、ウイルス中和アッセイによりさらに算出されてもよい。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物を免疫化し、免疫後の様々な日数で血清を採取する。血清の連続希釈物をウイルスとプレインキュベートし、その間に、そのウイルスに特異的な血清中の抗体が、ウイルスに結合することになる。続いて、ウイルス／血清の混合物を許容細胞に添加して、プラークアッセイまたはマイクロ中和アッセイにより感染性を算出する。血清中の抗体がウイルスを中和する場合、対照群と比較して、プラーク数が少ないか、または相対ルシフェラーゼ単位が低くなる。

【0283】

一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト抗体可変ドメインを産生する。したがって診断応用（例えば免疫学的、血清学的、微生物学的、細胞病態学的応用など）における使用のためのヒト抗体の産生用のインビボシステムを提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、例えば病理学的変化の指標となる特定の細胞表面マーカーの発現などの細胞変化の特定のための関連抗原性部位に結合するヒト抗体可変ドメインを産生させてもよい。そのような抗体は、様々な化学実体（例えば放射性トレーサー）と複合体化することができ、そして望ましい場合には様々なインビボおよび／またはインビトロのシステムで利用することができる。

【0284】

一部の実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物は、腫瘍および／または感染性疾患における使用のためのヒト抗体の開発および選別のための改善インビボシステムを提供する。様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物および対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載の遺伝子改変とは異なる遺伝子改変を有するもの、または遺伝子改変を有さないもの（すなわち野生型）など）に腫瘍（または腫瘍細胞）を移植し、またはウイルス（例えばインフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶなど）に感染させてもよい。移殖または感染させた後、非ヒト動物に候補治療物質を投与してもよい。腫瘍またはウイルスは、非ヒト動物内の一つ以上の場所に定着するのに十分な時間が与えられた後に、候補治療物質を投与されてもよい。あるいは、および／またはさらに、免疫反応をそのような非ヒト動物においてモニタリングしてもよく、それにより治療剤として開発され得る可能性のあるヒト抗体を特徴解析し、選択してもよい。
キット

【0285】

一部の態様において本発明はさらに、本明細書に記載される、少なくとも一つの非ヒト動物、非ヒト細胞、ＤＮＡ断片、標的化ベクター、またはそれらの任意の組み合わせで満たされた容器を一つ以上備えたパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば調査方法）において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、（ａ）ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用に関する説明書、および／または（ｃ）二つ以上の実体およびそれらの組み合わせの間の物質ならびに／または生物製品（例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）の移送を支配する契約書、を反映している。

【0286】

ある実施形態の他の特徴は以下の例示的な実施形態の記述の過程で明らかになるはずであり、該例示的な実施形態は、例示のために与えられ、その限定を意図するものではない。
追加の例示的実施形態

【0287】

例示的実施形態１において、その生殖細胞ゲノムが内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類が本明細書において提供され、当該軽鎖座位は、（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において（ａ）と（ｂ）は（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含む。

【0288】

例示的実施形態２において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が二つの齧歯類Ｅλを含む、実施形態１に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0289】

例示的実施形態３において、当該二つの齧歯類Ｅλが、マウスＥλおよびマウスＥλ３−１である、実施形態２に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0290】

例示的実施形態４において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が三つのヒトＥλを含む、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0291】

例示的実施形態５において、その生殖細胞ゲノムが、（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0292】

例示的実施形態６において、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入は、齧歯類のＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントを置換する、実施形態５に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0293】

例示的実施形態７において、当該挿入は、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0294】

例示的実施形態８において、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入は、齧歯類のＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置換する、実施形態５または６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0295】

例示的実施形態９において、当該挿入は、ヒトＶκ、およびＪκ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態８に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0296】

例示的実施形態１０において、当該齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域が、内因性齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域である、実施形態５〜８のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0297】

例示的実施形態１１において、当該齧歯類Ｃκ領域が内因性齧歯類Ｃκ領域である、実施形態５〜１０のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0298】

例示的実施形態１２において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0299】

例示的実施形態１３において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２遺伝子セグメントとＶλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む、実施形態１２に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0300】

例示的実施形態１４において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントとＶλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む、実施形態１２に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0301】

例示的実施形態１５において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントがマウスＣλ１遺伝子セグメントである、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0302】

例示的実施形態１６において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が齧歯類Ｅλ２−４の欠失を含む、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0303】

例示的実施形態１７において、当該齧歯類が、内因性イムノグロブリンλ軽鎖を検出可能な程度に発現しない、実施形態１〜１６のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0304】

例示的実施形態１８において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の挿入を含む、実施形態５〜１７のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0305】

例示的実施形態１９において、当該挿入は、ヒトＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態１８に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0306】

例示的実施形態２０において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトイムノグロブリンκ軽鎖座位の近位Ｖκ重複のすべてまたは一部の挿入を含む、実施形態５〜１９のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0307】

例示的実施形態２１において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ２−４０〜Ｖκ４−１、およびヒトＪκ遺伝子セグメントのＪκ１−Ｊκ５の挿入を含む、実施形態２０に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0308】

例示的実施形態２２において、当該挿入が、ヒトＶκ２−４０〜Ｖκ４−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪκ１−Ｊκ５の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態２１に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0309】

例示的実施形態２３において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、少なくともヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、ならびに齧歯類Ｃλ１遺伝子セグメントの挿入を含む、実施形態１〜２２のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0310】

例示的実施形態２４において、当該挿入は、ヒトＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態２３に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0311】

例示的実施形態２５において、当該イムノグロブリン重鎖座位が、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、実施形態５〜２４のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0312】

例示的実施形態２６において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む、実施形態５〜２５のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0313】

例示的実施形態２７において、当該一つ以上のヌクレオチド配列が、第一および第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される、実施形態２６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0314】

例示的実施形態２８において、当該一つ以上のヌクレオチド配列が、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入される、実施形態２６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0315】

例示的実施形態２９において、当該第一のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２であり、第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ６−１である、実施形態２７に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0316】

例示的実施形態３０において、当該一つ以上のヌクレオチド配列が、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントとヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される、実施形態２６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0317】

例示的実施形態３１において、当該齧歯類が、内因性イムノグロブリン重鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である、実施形態５〜３０のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0318】

例示的実施形態３２において、当該齧歯類が、内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である、実施形態５〜３１のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0319】

例示的実施形態３３において、当該齧歯類が、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である、実施形態１〜３２のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0320】

例示的実施形態３４において、当該齧歯類がラットまたはマウスである、実施形態１〜３３のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0321】

例示的実施形態３５において、その生殖細胞ゲノムが、以下を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む、単離齧歯類細胞が本明細書において提供される：（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントであって、（ｉ）ここで（ａ）と（ｂ）は、（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして（ｉｉ）当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0322】

例示的実施形態３６において、実施形態３５に記載の齧歯類細胞から作製された不死化細胞が本明細書において提供される。

【0323】

例示的実施形態３７において、当該齧歯類細胞が、齧歯類胚性幹細胞である、実施形態３５に記載の単離齧歯類細胞が本明細書において提供される。

【0324】

例示的実施形態３８において、実施形態３５の齧歯類胚性幹細胞から作製された齧歯類胚が本明細書において提供される。

【0325】

例示的実施形態３９において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類の作製方法が本明細書において提供され、当該方法は、（ａ）ＤＮＡ断片を齧歯類胚性幹細胞内に導入することであって、前記ＤＮＡ断片は、（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含むヌクレオチド配列を含み、ここで（ｉ）〜（ｉｉｉ）は齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびここで当該ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含むこと、（ｂ）（ａ）において作製された齧歯類胚性幹細胞を取得すること、および（ｃ）（ｂ）の齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作製すること、を含む。

【0326】

例示的実施形態４０において、当該ヌクレオチド配列が、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む、実施形態３９に記載の方法が本明細書において提供される。

【0327】

例示的実施形態４１において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類の作製方法が本明細書において提供され、当該操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、齧歯類またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、当該方法は、齧歯類の生殖細胞ゲノムを改変し、それにより当該ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませること、ここで当該操作された座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、齧歯類またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、それにより前記齧歯類を作製すること、を含む。

【0328】

例示的実施形態４２において、当該一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントが、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む、実施形態３９または４１に記載の方法が本明細書において提供される。

【0329】

例示的実施形態４３において、当該一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントが、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態４２に記載の方法が本明細書において提供される。

【0330】

例示的実施形態４４において、当該一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントと当該一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントは、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含む、実施形態３９〜４３のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0331】

例示的実施形態４５において、当該ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、当該ヒトＪλおよびＣλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、および当該ヒトＪλ７遺伝子セグメントは、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態４４に記載の方法が本明細書において提供される。

【0332】

例示的実施形態４６において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントがマウスＣλ１遺伝子セグメントである、実施形態３９〜４５いずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0333】

例示的実施形態４７において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が三つのヒトＥλを含む、実施形態３９〜４６のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0334】

例示的実施形態４８において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が二つの齧歯類Ｅλを含む、実施形態３９〜４６のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0335】

例示的実施形態４９において、当該二つの齧歯類Ｅλが、マウスＥλおよびマウスＥλ３−１である、実施形態４８に記載の方法が本明細書において提供される。

【0336】

例示的実施形態５０において、当該ＤＮＡ断片が、一つ以上の選択マーカーをさらに含む、実施形態３８および４２〜４９のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0337】

例示的実施形態５１において、当該ＤＮＡ断片が、一つ以上の部位特異的組み換え部位をさらに含む、実施形態３９および４２〜５０のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0338】

例示的実施形態５２において、（ａ）の当該ＤＮＡ断片が、その生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、を含む齧歯類胚性幹細胞へと導入される、実施形態３９および４２〜５１のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0339】

例示的実施形態５３において、当該（ａ）のＤＮＡ断片は、その生殖細胞ゲノムが、野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む齧歯類胚性幹細胞へと導入され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から産生されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む、実施形態３９および４２〜５１のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される

【0340】

例示的実施形態５４において、齧歯類の生殖細胞ゲノムを改変して、その生殖細胞ゲノムに操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることが、その生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む齧歯類胚性幹細胞において実施される、実施形態４７〜４９のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0341】

例示的実施形態５５において、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの当該挿入は、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態５２または５４に記載の方法が本明細書において提供される。

【0342】

例示的実施形態５６において、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの当該挿入は、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態５２または５４に記載の方法が本明細書において提供される。

【0343】

例示的実施形態５７において、非ヒト動物の生殖細胞ゲノムを改変し、その生殖細胞ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることが、その生殖細胞ゲノムが、野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む非ヒト胚性幹細胞において実施され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から産生されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む、実施形態４１〜４９のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0344】

例示的実施形態５８において、当該第二のマウスが、野生型ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有する、実施形態５３または５７のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0345】

例示的実施形態５９において、当該第二のマウスが、ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有し、当該ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位が、挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列を含有する、実施形態５３または５７のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0346】

例示的実施形態６０において、当該第二のマウスが、ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位と、ホモ接合性またはヘテロ接合性の不活化Ｉｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有する、実施形態５３または５７のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0347】

例示的実施形態６１において、齧歯類において抗体を産生させる方法が本明細書において提供され、当該方法は、（１）対象抗原で齧歯類を免疫化する工程であって、当該齧歯類は、（ａｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む生殖細胞ゲノムを有し、この場合において（ａ）と（ｂ）は（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含む工程、（２）当該齧歯類が当該対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で当該齧歯類を維持する工程、および（３）当該齧歯類または齧歯類細胞から、当該対象抗原に結合する抗体を回収する工程を含む。

【0348】

例示的実施形態６２において、当該齧歯類が、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む生殖細胞ゲノムを有する、実施形態６１に記載の方法が本明細書において提供される。

【0349】

例示的実施形態６３において、当該齧歯類細胞が、Ｂ細胞である、実施形態６１または６２のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0350】

例示的実施形態６４において、当該齧歯類細胞が、ハイブリドーマである、実施形態６１または６２のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0351】

例示的実施形態６５において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の挿入を含む、実施形態６１〜６４のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0352】

例示的実施形態６６において、当該挿入は、ヒトＶλのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態６５に記載の方法が本明細書において提供される。

【0353】

例示的実施形態６７において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントがマウスＣλ１遺伝子セグメントである、実施形態６１〜６６いずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0354】

例示的実施形態６８において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の挿入を含み、そして当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、内因性齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される、実施形態６２〜６７のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0355】

例示的実施形態６９において、当該挿入は、ヒトＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態６８に記載の方法が本明細書において提供される。

【0356】

例示的実施形態７０において、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える、実施形態６８に記載の方法が本明細書において提供される。

【0357】

例示的実施形態７１において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ２−４０〜Ｖκ４−１、およびヒトＪκ遺伝子セグメントのＪκ１−Ｊκ５の挿入を含み、そして当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、内因性齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される、実施形態６２〜７０のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0358】

例示的実施形態７２において、当該挿入が、ヒトＶκ２−４０〜Ｖκ４−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪκ１−Ｊκ５の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む、実施形態７１に記載の方法が本明細書において提供される。

【0359】

例示的実施形態７３において、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置き換える、実施形態７１に記載の方法が本明細書において提供される。

【0360】

例示的実施形態７４において、当該齧歯類の生殖細胞ゲノムは、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む、実施形態６１〜７３のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0361】

例示的実施形態７５において、当該イムノグロブリン重鎖座位が、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、実施形態６２〜７４のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0362】

例示的実施形態７６において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む、実施形態７５に記載の方法が本明細書において提供される。

【0363】

例示的実施形態７７において、当該一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列が、第一および第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される、実施形態７６に記載の方法が本明細書において提供される。

【0364】

例示的実施形態７８において、当該第一のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２であり、第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ６−１である、実施形態７７に記載の方法が本明細書において提供される。

【0365】

例示的実施形態７９において、当該一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列が、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりにに挿入される、実施形態７６に記載の方法が本明細書において提供される。

【0366】

例示的実施形態８０において、当該一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列が、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントとヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される、実施形態７６に記載の方法が本明細書において提供される。

【0367】

例示的実施形態８１において、齧歯類または齧歯類細胞から回収された対象抗原に結合する抗体が、ヒト重鎖可変ドメインとヒトラムダ軽鎖可変ドメインを含む、実施形態６１〜８０のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0368】

例示的実施形態８２において、当該ヒト重鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−２およびＶ_Ｈ６−１からなる群から選択される、実施形態８１に記載の方法が本明細書において提供される。

【0369】

例示的実施形態８３において、当該ヒトラムダ軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶλ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖλ４−６９、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６０、Ｖλ６−５７、Ｖλ１０−５４、Ｖλ５−５２、Ｖλ１−５１、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−４７、Ｖλ７−４６、Ｖλ５−４５、Ｖλ１−４４、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４０、Ｖλ５−３９、Ｖλ５−３７、Ｖλ１−３６、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−２５、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２２、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−１９、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１０、Ｖλ３−９、Ｖλ２−８、Ｖλ４−３およびＶλ３−１からなる群から選択される、実施形態８１または８２に記載の方法が本明細書において提供される。

【0370】

例示的実施形態８４において、当該齧歯類がラットまたはマウスである、実施形態３９〜８３のいずれか一つに記載の方法が本明細書において提供される。

【0371】

例示的実施形態８５において、その生殖細胞ゲノムが、以下を含むホモ接合性内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類が本明細書において提供される：（ｉ）ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、（ｉｉ）ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６、（ｉｉｉ）ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、および（ｉｖ）三つのヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサーであって、（ｉ）〜（ｉｖ）は互いに操作可能に連結され、そして（ｉ）〜（ｉｉｉ）は齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントの上流であり、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類イムノグロブリンＥλ２−４を欠き、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１はヒトＶλ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、そしてヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７は、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0372】

例示的実施形態８６において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントがマウスＣλ１遺伝子セグメントである、実施形態８５に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0373】

例示的実施形態８７において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位が、内因性齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサーＥλとＥλ３−１をさらに含む、実施形態８５または８６に記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0374】

例示的実施形態８８において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類のＶλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントとＶλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む、実施形態８５〜８７のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0375】

例示的実施形態８９において、当該齧歯類がラットまたはマウスである、実施形態８５〜８８のいずれか一つに記載の齧歯類が本明細書において提供される。

【0376】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類が本明細書において提供され、当該軽鎖座位は、（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において（ａ）と（ｂ）は（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含む。

【0377】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つの齧歯類Ｅλを含む。

【0378】

一部の実施形態において、当該二つの齧歯類Ｅλは、マウスＥλとマウスＥλ３−１である。

【0379】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、三つのヒトＥλを含む。

【0380】

一部の実施形態において、当該生殖細胞ゲノムは、（ｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または（ｉｉ）一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む。

【0381】

一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入は、齧歯類Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える。

【0382】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0383】

一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入は、齧歯類ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置き換える。

【0384】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメント、ならびにその組み合わせの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0385】

一部の実施形態において、当該齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域は、内因性齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域である。

【0386】

一部の実施形態において、当該齧歯類Ｃκ領域は、内因性齧歯類Ｃκ領域である。

【0387】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントのすべてまたは一部の欠失を含む。

【0388】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。

【0389】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、Ｖλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。

【0390】

一部の実施形態において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ１遺伝子セグメントである。

【0391】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、齧歯類Ｅλ２−４の欠失を含む。

【0392】

一部の実施形態において、当該齧歯類は、内因性イムノグロブリンλ軽鎖を検出可能な程度に発現しない。

【0393】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのＶ_Ｈ３−７４からＶ_Ｈ６−１、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのＤ_Ｈ１−１からＤ_Ｈ７−２７、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１−Ｊ_Ｈ６の挿入を含む。

【0394】

一部の実施形態において、当該挿入は、ヒトＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0395】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトイムノグロブリン軽鎖κ座位の近位Ｖκ重複のすべてまたは一部の挿入を含む。

【0396】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ２−４０からＶκ４−１、およびヒトＪκ遺伝子セグメントのＪκ１−Ｊκ５の挿入を含む。

【0397】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶκ２−４０〜Ｖκ４−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪκ１−Ｊκ５の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0398】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、少なくともヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、ならびに齧歯類Ｃλ１遺伝子セグメントの挿入を含む。

【0399】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0400】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く。

【0401】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む。

【0402】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヌクレオチド配列は、第一および第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。

【0403】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入される。

【0404】

一部の実施形態において、当該第一のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２であり、当該第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ６−１である。

【0405】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントとヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。

【0406】

一部の実施形態において、当該齧歯類は、内因性イムノグロブリン重鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0407】

一部の実施形態において、当該齧歯類は、内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0408】

一部の実施形態において、当該齧歯類は、内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である。

【0409】

一部の実施形態では、当該齧歯類はラットまたはマウスである。

【0410】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、以下を含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む、単離齧歯類細胞が本明細書において提供される：（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントであって、（ｉ）ここで（ａ）と（ｂ）は、（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして（ｉｉ）当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0411】

一部の実施形態において、本明細書において提供される齧歯類細胞から作製された不死化細胞が本明細書において提供される。

【0412】

一部の実施形態において、当該齧歯類細胞は、齧歯類胚性幹細胞である。

【0413】

一部の実施形態において、本明細書において提供される齧歯類胚性幹細胞から作製された齧歯類胚が本明細書において提供される。

【0414】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類の作製方法が本明細書において提供され、当該方法は、（ａ）ＤＮＡ断片を齧歯類胚性幹細胞内に導入することであって、前記ＤＮＡ断片は、（ｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｉｉ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｉｉｉ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含むヌクレオチド配列を含み、ここで（ｉ）〜（ｉｉｉ）は齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびここで当該ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含むこと、（ｂ）（ａ）において作製された齧歯類胚性幹細胞を取得すること、および（ｃ）（ｂ）の齧歯類胚性幹細胞を使用して齧歯類を作製すること、を含む。

【0415】

一部の実施形態において、当該ヌクレオチド配列は、一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0416】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類の作製方法が本明細書において提供され、当該操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、齧歯類またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、当該方法は、齧歯類の生殖細胞ゲノムを改変し、それにより当該ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませること、ここで当該操作された座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、齧歯類またはヒトＣλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含み、それにより前記齧歯類を作製すること、を含む。

【0417】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１を含む。

【0418】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５−５２〜Ｖλ１−４０および／またはＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0419】

一部の実施形態において、当該一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントと当該一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントは、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントを含む。

【0420】

一部の実施形態において、当該ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、当該ヒトＪλおよびＣλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、および当該ヒトＪλ７遺伝子セグメントは、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0421】

一部の実施形態において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ１遺伝子セグメントである。

【0422】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、三つのヒトＥλを含む。

【0423】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、二つの齧歯類Ｅλを含む。

【0424】

一部の実施形態において、当該二つの齧歯類Ｅλは、マウスＥλとマウスＥλ３−１である。

【0425】

一部の実施形態において、当該ＤＮＡ断片は、一つ以上の選択マーカーをさらに含む。

【0426】

一部の実施形態において、当該ＤＮＡ断片は、一つ以上の部位特異的組み換え部位をさらに含む。

【0427】

一部の実施形態において、（ａ）の当該ＤＮＡ断片は、その生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、を含む齧歯類胚性幹細胞へと導入される。

【0428】

一部の実施形態において、当該（ａ）のＤＮＡ断片は、その生殖細胞ゲノムが、野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む齧歯類胚性幹細胞へと導入され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から産生されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む。

【0429】

一部の実施形態において、齧歯類の生殖細胞ゲノムを改変して、その生殖細胞ゲノムに操作された内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることは、その生殖細胞ゲノムが、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む齧歯類胚性幹細胞において実施される。

【0430】

一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの当該挿入は、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0431】

一部の実施形態において、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントおよび一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの当該挿入は、一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、および一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0432】

一部の実施形態において、非ヒト動物の生殖細胞ゲノムを改変し、その生殖細胞ゲノムに操作されたイムノグロブリンλ軽鎖座位を含ませることは、その生殖細胞ゲノムが、野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位、または野生型内因性イムノグロブリン重鎖座位と野生型内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位、を含む非ヒト胚性幹細胞において実施され、そしてこの場合において当該方法は、前記非ヒト胚性幹細胞から産生されたマウスと、第二のマウスを交配させる工程をさらに含む。

【0433】

一部の実施形態において、当該第二のマウスは、野生型ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有する。

【0434】

一部の実施形態において、当該第二のマウスは、ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有し、当該ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位は、挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列を含有する。

【0435】

一部の実施形態において、当該第二のマウスは、ホモ接合性またはヘテロ接合性のヒト化ＩｇＨ座位と、ホモ接合性またはヘテロ接合性の不活化Ｉｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有する。

【0436】

一部の実施形態において、齧歯類において抗体を産生させる方法が本明細書において提供され、当該方法は、（１）対象抗原で齧歯類を免疫化する工程であって、当該齧歯類は、（ａｉ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含む内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む生殖細胞ゲノムを有し、この場合において（ａ）と（ｂ）は（ｃ）と齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントに操作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つ以上の齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含む工程、（２）当該齧歯類が当該対象抗原に対する免疫反応を生じさせるのに十分な条件下で当該齧歯類を維持する工程、および（３）当該齧歯類または齧歯類細胞から、当該対象抗原に結合する抗体を回収する工程を含む。

【0437】

一部の実施形態において、当該齧歯類は、一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、または一つ以上のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリン重鎖座位であって、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される座位、ならびに一つ以上のヒトＶκ遺伝子セグメントと一つ以上のヒトＪκ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性イムノグロブリンκ軽鎖座位であって、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される座位、をさらに含む生殖細胞ゲノムを有する。

【0438】

一部の実施形態において、当該齧歯類細胞は、Ｂ細胞である。

【0439】

一部の実施形態において、当該齧歯類細胞は、ハイブリドーマである。

【0440】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、Ｊλ６−Ｃλ６、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の挿入を含む。

【0441】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶλＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ならびにヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７の上流（または５’側）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0442】

一部の実施形態において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ１遺伝子セグメントである。

【0443】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントのＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１、ヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントのＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７、およびヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントのＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の挿入を含み、そして当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、内因性齧歯類イムノグロブリン重鎖定常領域に操作可能に連結される。

【0444】

一部の実施形態において、当該挿入は、ヒトＶ_Ｈ３−７４〜Ｖ_Ｈ６−１の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、ヒトＤ_Ｈ１−１〜Ｄ_Ｈ７−２７の間に自然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪ_Ｈ１〜Ｊ_Ｈ６の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0445】

一部の実施形態において、当該ヒトＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントは、齧歯類Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈ遺伝子セグメントを置き換える。

【0446】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリンκ軽鎖座位は、ヒトＶκ遺伝子セグメントのＶκ２−４０〜Ｖκ４−１、およびヒトＪκ遺伝子セグメントのＪκ１−Ｊκ５の挿入を含み、そして当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、内因性齧歯類イムノグロブリンＣκ領域に操作可能に連結される。

【0447】

一部の実施形態において、当該挿入には、ヒトＶκ２−４０〜Ｖκ４−１の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡ、およびヒトＪκ１−Ｊκ５の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡが含まれる。

【0448】

一部の実施形態において、当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、齧歯類ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを置き換える。

【0449】

一部の実施形態において、当該齧歯類の生殖細胞ゲノムは、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む。

【0450】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、内因性齧歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く。

【0451】

一部の実施形態において、当該イムノグロブリン重鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする一つ以上のヌクレオチド配列の挿入をさらに含む。

【0452】

一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする当該一つ以上のヌクレオチド配列は、第一および第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。

【0453】

一部の実施形態において、当該第一のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ１−２であり、当該第二のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、ヒトＶ_Ｈ６−１である。

【0454】

一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする当該一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入される。

【0455】

一部の実施形態において、一つ以上の齧歯類Ａｄａｍ６ポリペプチドをコードする当該一つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントとヒトＤ_Ｈ遺伝子セグメントの間に挿入される。

【0456】

一部の実施形態において、当該齧歯類または齧歯類細胞から回収された対象抗原に結合する抗体は、ヒト重鎖可変ドメインとヒトラムダ軽鎖可変ドメインを含む。

【0457】

一部の実施形態において、当該ヒト重鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖ_Ｈ３−７４、Ｖ_Ｈ３−７３、Ｖ_Ｈ３−７２、Ｖ_Ｈ２−７０、Ｖ_Ｈ１−６９、Ｖ_Ｈ３−６６、Ｖ_Ｈ３−６４、Ｖ_Ｈ４−６１、Ｖ_Ｈ４−５９、Ｖ_Ｈ１−５８、Ｖ_Ｈ３−５３、Ｖ_Ｈ５−５１、Ｖ_Ｈ３−４９、Ｖ_Ｈ３−４８、Ｖ_Ｈ１−４６、Ｖ_Ｈ１−４５、Ｖ_Ｈ３−４３、Ｖ_Ｈ４−３９、Ｖ_Ｈ４−３４、Ｖ_Ｈ３−３３、Ｖ_Ｈ４−３１、Ｖ_Ｈ３−３０、Ｖ_Ｈ４−２８、Ｖ_Ｈ２−２６、Ｖ_Ｈ１−２４、Ｖ_Ｈ３−２３、Ｖ_Ｈ３−２１、Ｖ_Ｈ３−２０、Ｖ_Ｈ１−１８、Ｖ_Ｈ３−１５、Ｖ_Ｈ３−１３、Ｖ_Ｈ３−１１、Ｖ_Ｈ３−９、Ｖ_Ｈ１−８、Ｖ_Ｈ３−７、Ｖ_Ｈ２−５、Ｖ_Ｈ７−４−１、Ｖ_Ｈ４−４、Ｖ_Ｈ１−３、Ｖ_Ｈ１−２およびＶ_Ｈ６−１からなる群から選択される。

【0458】

一部の実施形態において、当該ヒトラムダ軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶλ遺伝子セグメントを含み、当該セグメントは、Ｖλ４−６９、Ｖλ８−６１、Ｖλ４−６０、Ｖλ６−５７、Ｖλ１０−５４、Ｖλ５−５２、Ｖλ１−５１、Ｖλ９−４９、Ｖλ１−４７、Ｖλ７−４６、Ｖλ５−４５、Ｖλ１−４４、Ｖλ７−４３、Ｖλ１−４０、Ｖλ５−３９、Ｖλ５−３７、Ｖλ１−３６、Ｖλ３−２７、Ｖλ３−２５、Ｖλ２−２３、Ｖλ３−２２、Ｖλ３−２１、Ｖλ３−１９、Ｖλ２−１８、Ｖλ３−１６、Ｖλ２−１４、Ｖλ３−１２、Ｖλ２−１１、Ｖλ３−１０、Ｖλ３−９、Ｖλ２−８、Ｖλ４−３およびＶλ３−１からなる群から選択される。

【0459】

一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。

【0460】

一部の実施形態において、その生殖細胞ゲノムが、以下を含むホモ接合性内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位を含む齧歯類が本明細書において提供される：（ｉ）ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１、（ｉｉ）ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３およびＪλ６−Ｃλ６、（ｉｉｉ）ヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７、および（ｉｖ）三つのヒトイムノグロブリンλ軽鎖エンハンサーであって、（ｉ）〜（ｉｖ）は互いに操作可能に連結され、そして（ｉ）〜（ｉｉｉ）は齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントの上流であり、そして当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類イムノグロブリンＥλ２−４を欠き、ヒトＶλ遺伝子セグメントのＶλ５−５２〜Ｖλ１−４０およびＶλ３−２７〜Ｖλ３−１はヒトＶλ遺伝子セグメントの間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対のＪλ１−Ｃλ１、Ｊλ２−Ｃλ２、Ｊλ３−Ｃλ３、およびＪλ６−Ｃλ６は、ヒトＪλ−Ｃλ遺伝子セグメント対の間に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含み、そしてヒトＪλ遺伝子セグメントのＪλ７は、ヒトＪλ７の上流（または５’）に天然に存在するヒト非コードＤＮＡを含む。

【0461】

一部の実施形態において、当該齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ１遺伝子セグメントである。

【0462】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類イムノグロブリンλ軽鎖エンハンサーＥλとＥλ３−１をさらに含む。

【0463】

一部の実施形態において、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、内因性齧歯類のＶλ２−Ｖλ３−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ４Ｐ−Ｃλ４Ｐ遺伝子セグメントと、Ｖλ１−Ｊλ３−Ｊλ３Ｐ−Ｃλ３−Ｊλ１遺伝子セグメントの欠失を含む。

【0464】

一部の実施形態では、当該齧歯類はラットまたはマウスである。

【実施例】

【0465】

以下の実施例は、本明細書に記載される方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者に説明するために提供されており、本開示の発明者が自身の発明としてみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。別段の示唆が無い限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。
実施例１．齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位を操作するための標的化ベクターの構築

【0466】

本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト動物のゲノム内への挿入用に標的化ベクターを構築する方法の例を示したものである。本実施例に記載される方法は、その生殖細胞ゲノムが操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物の作製を示す。特に本実施例は、非ヒト動物において内因性Ｉｇλ軽鎖座位を操作するための一連の標的化ベクターの構築を示すものであり、これにより当該非ヒト動物は、ヒト可変ドメイン、および非ヒト、一部の実施形態ではヒトの定常ドメインを有するＩｇλ軽鎖を含む抗体を、当該非ヒト動物の生殖細胞ゲノム中の前記内因性Ｉｇλ軽鎖座位から発現させ、および／または産生する。以下に記載されるように、一連の標的化ベクターは、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質（すなわちヒトＶλ、Ｊλ、ＣλおよびＩｇλエンハンサー配列）を様々な量で含有し、内因性齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位に挿入される。特に前記遺伝物質は、齧歯類Ｃλ遺伝子（または遺伝子セグメント）の上流に挿入され、それによりヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントは、前記齧歯類Ｃλ遺伝子に操作可能に連結される。本実施例に記載される方法は、内因性齧歯類Ｉｇλ遺伝子セグメント（または配列）の保持および／または欠失をもたらす。操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を構築するための一連の標的化ベクターの例示的略図を図１〜４に明記する。

【0467】

様々な量のヒトＶλ、Ｊλ、ＣλおよびＩｇλエンハンサー配列（または領域）を、齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位への挿入のために含有する一連の標的化ベクターを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−９を参照のこと。これらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）と、当分野に公知の分子生物学技術を使用して作製した。本実施例に記述される方法を採用して、任意のヒトＶλ、Ｊλ、ＣλおよびＩｇλエンハンサー配列、または望ましい場合には配列の組み合わせ（または配列断片）を活用することができる。表１は、図１に図示される各標的化ベクターの簡潔な説明を記載する。

【0468】

簡潔に述べると、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンのＣＴＤ−２５０２ｍ１６からの約１２ｋｂ（１１，８２２ｂｐ）のヒトＩｇλゲノム配列を、マウスＢＡＣクローンのＲＰ２３−６０ｅ１４にライゲートした。このマウスＢＡＣクローンを操作して、当該ＢＡＣクローンを約９０ｋｂまで短縮させ、マウスＣλ１遺伝子の下流に固有ＡｓｉＳＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を挿入し、元々のクロラムフェニコール抵抗性（ＣＭ^Ｒ）遺伝子を、スペクチノマイシン抵抗性（Ｓｐｅｃ^Ｒ）遺伝子と固有Ｉ−ＣｅｕＩ制限酵素部位とに、二回の連続的細菌相同組換え（ＢＨＲ）工程により置き換え、その後、ヒトＩｇλゲノム配列とのライゲーションを行った。ヒトＢＡＣクローンのＣＴＤ−２５０２ｍ１６も、二回の連続的ＢＨＲ工程により改変し、ネオマイシン選択カセットと固有ＰＩ−ＳｃｅＩ制限酵素部位を用いて３’末端から約５３ｋｂのヒト配列を切り取り、そしてハイグロマイシンカセットと固有ＡｓｉＳＩ制限酵素部位を用いて５’末端からＣＭ^Ｒ遺伝子と約１０１．５ｋｂのヒト配列を切り取った。それによりＡｓｉＳＩ部位とネオマイシン選択カセットがそれぞれモジュール式ヒトエンハンサー領域の２８８５ｂｐ上流、および約１４１８ｂｐ下流に配置された（例えばＡｓｅｎｂａｕｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｋｌｏｂｅｃｋ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１４２−５０を参照。本文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。ヒトＩｇλゲノム配列は、モジュール式で、三つの配列要素を含有するヒトＩｇλエンハンサー（Ｅλ）領域（または配列）に対応する約７．５ｋｂ（図１；Ａｓｅｎｂａｕｅｒ，Ｈ．ａｎｄ Ｈ．Ｇ．Ｋｌｏｂｅｃｋ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１４２−５０）、そして２．９ｋｂと１．４ｋｂのそれぞれ５’隣接配列と３’隣接配列、ならびにネオマイシン選択カセット（すなわちユビキチンプロモーターの転写制御下にあり、ｌｏｘＰ部位に隣接するネオマイシン抵抗性遺伝子［ＮＥＯ^Ｒ］）を含有した。改変されたヒトおよびマウスのＢＡＣクローンを、ＡｓｉＳＩとＰＩ−ＳｃｅＩ部位で消化し、一緒にライゲーションを行った。操作されたマウスＢＡＣクローンへライゲーションした後、得られた標的化ベクターは、５’相同アームとして約３９，１６６ｂｐのマウス配列を含有し、そしてマウスＩｇλ遺伝子セグメントのＶλ１、Ｊλ３、Ｊλ３Ｐ、Ｃλ３、Ｊλ１およびＣλ１を含有した（６２８６標的化ベクター、図１）。３’相同アーム（約３０，３９５ｂｐ）は、マウスＩｇλエンハンサー（ｍＥλ）を含有した。単純化のために、図１の６２８６標的化ベクターの図において、マウス相同アームは示されていない。この標的化ベクターとの相同組換えにより、マウス配列が削除されることなく、三つのヒトＩｇλエンハンサー配列ならびに５’および３’の隣接配列の挿入が生じた。ネオマイシン選択カセットのリコンビナーゼ介在性削除は、ＥＳ細胞において、Ｃｒｅリコンビナーゼを一過性発現させることにより行われた（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６；Ｏｒｂａｎ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６８６１−５；Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７３（６）：１１５５−６４；Ａｒａｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１６０−４；Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１２）：６１９１−６を参照。これらすべて参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）。

【0469】

第二の構築物（６５７１標的化ベクター）を操作して、五つの機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント群と、約１２５，４７３ｂｐにわたるＪλ−Ｃλクラスター（すなわちヒトＪλ１−Ｃλ１−Ｊλ２−Ｃλ２−Ｊλ３−Ｃλ３−Ｊλ４−Ｃλ４−Ｊλ５−Ｃλ５−Ｊλ６−Ｃλ６−ｈＪλ７）の実質的にすべてを含ませた。それらはヒトＢＡＣクローンのＣＴＤ−２０７９ｉ４から取得された。標的化ベクターを構築するために、ヒトＢＡＣクローンのＣＴＤ−２０７９ｉ４中のヒトＣλ７遺伝子を、ＢＨＲによりマウスＣλ１遺伝子および約１５８８ｂｐの隣接配列と最初に置換した。それらはマウスＢＡＣクローンのＲＰ２３−６０ｅ１４を鋳型として使用してＰＣＲにより増幅させた。次いで、マウスＢＡＣクローンのＲＰ２３−６０ｅ１４中のマウスＣλ１遺伝子の５’側の配列に対応する約３７，１６１ｂｐのマウス配列を含有する５’相同アームを、マウスおよびヒトのＢＡＣクローンの両方にＢＨＲにより別々に導入された固有Ｉ−ＣｅｕＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩ制限酵素認識部位を使用して、合成マウスＣλ１遺伝子を含有する改変ヒトＢＡＣクローンのＣＴＤ−２０７９ｉ４にライゲーションさせた。この５’相同アームは、マウスＶλ１、Ｊλ３、Ｊλ３Ｐ、Ｃλ３、およびＪλ１遺伝子セグメントを含有した（図１）。３’相同アームは、６２８６標的化ベクターからのヒトＥλの内の二つに対応する約９，１８９ｂｐのヒト配列を含有した（図１）。

【0470】

第三の構築物（６５９６標的化ベクター）を操作して、追加の１１個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントを含有させた。この標的化ベクターは、ＢＡＣクローンのＲＰ１１−７６１Ｌ１３からの約１７１，４５８ｂｐのヒト配列を含有した。設計により、この三つのヒトＶλ遺伝子セグメントは、６５７１標的化ベクターとの３’重複相同性（約３３，４６９ｂｐ）を提供するように含有された。上述のように、約３７，１６１ｂｐのマウス配列を含有する５’相同アームを、マウスおよびヒトのＢＡＣクローンの両方にＢＨＲにより別々に導入された固有Ｉ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素認識部位を使用して、ヒトＶλ遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ断片の５’末端にライゲーションさせた。

【0471】

第四の構築物（６５９７標的化ベクター）を操作して、追加の九個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントを含有させた。この標的化ベクターは、二つのＢＡＣクローンのＲＰ１１−２２Ｌ１８とＲＰ１１−７６１Ｌ１３からの約１２１，１８８ｂｐのヒト配列を含有した。上述のように、このヒト配列の３’末端は追加のヒトＶλ遺伝子セグメントを含有し、この遺伝子セグメントは、６５９６標的化ベクターとの３’重複相同性を提供した（約２７，４６８ｂｐ）。６５７１および６５９６標的化ベクターに関し上に記載されるように、ＢＡＣクローンＲＰ２３−６０ｅ１４からのマウス配列を含有する約３７，１６１ｂｐの５’相同アームを、マウスおよびヒトのＢＡＣクローンの両方にＢＨＲにより別々に導入された固有Ｉ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素認識部位を使用して、ヒト配列の５’末端にライゲーションさせた。

【0472】

同様に、第五の構築物（６６８０標的化ベクター）を操作して、６５９７標的化ベクターと同じ追加の九個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントを含有させたが、５’相同アームは、相同組換えを介したマウスＩｇλ軽鎖座位の削除が可能となるように変化させた。この５’相同アームはＢＡＣクローンのＲＰ２３−１５ｍ１６からの約２２，２９８ｂｐを含有し、マウスおよびヒトのＢＡＣクローンの両方にＢＨＲにより別々に導入された固有Ｉ−ＣｅｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素認識部位を使用して、ヒト配列（約１２１，１８８ｂｐの断片、上記）の５’末端にライゲーションされた。この５’相同アームは、マウスＶλ２遺伝子セグメントの５’側のマウス配列を含有し、相同組換えが行われることで、マウスＩｇλ軽鎖座位を効率的に削除する。この標的化ベクターは、６５９７標的化ベクター（上述）と同じ３’重複相同性を含有した。図２は、６５９７または６６８０標的化ベクターの挿入から生じた異なるアレルを図示する。

【0473】

同様に、追加の操作マウス系統を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して補助することで、二つの異なる標的化ベクターをＥＳ細胞内に共エレクトロポレーションを行うことで作製した（図３）。例えば、米国特許第９，２２８，２０８号（２０１６年１月５日登録）および米国特許出願公開２０１５−０１５９１７４Ａ１（２０１４年１０月１５日出願）、２０１５−０３７６６５０Ａ１（２０１５年６月５日出願）、２０１５−０３７６６２８Ａ１（２０１５年６月２３日出願）、２０１６−００６０６５７Ａ１（２０１５年１０月３０日出願）、２０１６−０１４５６４６Ａ１（２０１５年１１月２０日出願）、および２０１６−０１７７３３９Ａ１（２０１５年１２月１８日出願）を参照のこと。このＥＳ細胞は、６５７１標的化ベクター構築物の挿入に対しヘテロ接合性のゲノムを有した。

【0474】

簡潔に述べると、図３に示されるように、短縮化された６５９６標的化ベクター（すなわち上述のように５’相同アームとカセットが無い）は、約３３ｋｂ ３’相同アームを含有するよう設計され、当該相同アームは、６５７１標的化ベクター中の三つのヒトＶλ遺伝子セグメントに対応する重複配列、１１個の追加ヒトＶλ遺伝子セグメントを含む約１１１ｋｂの配列、そして単一のヒトＶλ遺伝子セグメントを含有する約２７ｋｂの配列を含み、第二の標的化ベクターとの重複領域としての役割を果たす。第二の標的化ベクター（６６８０標的化ベクター）は、当該標的化ベクターの３’末端上に位置する同じ約２７ｋｂの重複領域配列、追加の九個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む約９４ｋｂの配列、ネオマイシン選択カセット（例えばＦｒｔ組み換え認識部位に隣接されるユビキチンプロモーターの転写制御下にあるネオマイシン抵抗性遺伝子［ＮＥＯ^Ｒ］）、そして２２ｋｂの５’マウスλ相同アームを含む。これら二つの標的化ベクターのエレクトロポレーションに採用されたＥＳ細胞は、６５７１標的化ベクターの挿入に対しヘテロ接合性のゲノムを有した（図３）。これらＥＳ細胞は、一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および二つのｇＲＮＡとともに上述の二つの標的化ベクターで共エレクトロポレーションされた。当該一つのガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧ ＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧ（配列番号１３０）での６５７１標的化ベクターからのハイグロマイシン抵抗性遺伝子を標的としており、当該二つのｇＲＮＡは、マウスＶλ２遺伝子セグメントの上流領域（すなわちマイナス鎖上のマウスＶλ２遺伝子セグメントの３’側；ｇＲＮＡ１：ＧＴＡＣＡＴＣＴＴＧ ＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴ、配列番号１３９、マウスＶλ２遺伝子の上流の約１０００ｂｐ；ｇＲＮＡ２：ＧＴＣＣＡＴＡＡＴＴ ＡＡＴＧＴＡＧＴＴＡ Ｃ、配列番号１４０、マウスＶλ２の上流の約３８０ｂｐ）を標的とし、これらの配列での二本鎖切断を促進する。この二つの共エレクトロポレーションされる標的化ベクターは、相同組換えによってＥＳ細胞のゲノム内にハイグロマイシン配列で挿入され、ハイグロマイシン選択カセットを含有する領域と周辺領域を置換した。得られたＥＳ細胞は、操作された内因性Ｉｇλ座位を含有した。当該座位は、ヒトＪλ−Ｃλクラスターに操作可能に連結された２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、ヒトＪλ７遺伝子セグメントを含み、マウスＣλ１遺伝子に操作可能に連結されたヒトイムノグロブリン可変領域を含む（図３）。

【0475】

上述の標的化ベクターは、マウス胚性幹細胞（ＥＳ）内に導入され、操作されたＩｇλ軽鎖座位を確立させた。ＥＳ細胞ゲノム内に各標的化ベクターが挿入された後に陽性ＥＳ細胞クローンが確認され（以下を参照）、その後に次の標的化ベクターが挿入された。一部の例では、表現型解析のために中間系統が作製された。

【表1】

【0476】

上述の標的化ベクターの挿入後の、選択接合点にわたるヌクレオチド配列は、配列解析により確認された。図1〜4に示される選択接合点を、以下に提示する。

【表D-1】

【表D-2】

【0477】

操作座位の構築、特に操作イムノグロブリン座位の構築において、本発明者らは、いくつかのヒトＶλ遺伝子セグメントがあるハプロタイプから失われる場合があること、ゆえにヒトＩｇλ軽鎖座位にわたる選択ＢＡＣクローンに提示されない場合があると認識した。一例ではあるが、ごく最近になって、これまでに報告されていたアレルと比較して、ヒトＩｇλ軽鎖座位のクラスターＢには一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントの挿入／欠失が含有されるという証拠が報告された（例えば、ヒトＶλ１−５０、Ｖλ５−４８、Ｖλ５−４５およびＶλ５−３９：Ｍｏｒａｅｓ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｇ．Ａ．Ｐａｓｓｏｓ，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５５（１）：１０−５を参照）。ゆえに本発明者らは、標的化ベクター設計と構築に使用されている特定ＢＡＣクローンにおいて失われているヒトＶλ遺伝子セグメントを含ませる戦略を設計した。

【0478】

簡潔に述べると、ヒトＢＡＣクローンを、エンドシークエンスによりヒトＩｇλ軽鎖座位に対しマッピングした。特にＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｆｅｂ．２００９）を使用して、ヒトＢＡＣクローンのＲＰ１１−３４６Ｉ４、ＣＴＤ−２５２３Ｆ２１およびＣＴＤ−２５２３Ｅ２２が、ヒトＶλ７−４６〜Ｖλ１−３６を含むヒトＩｇλ軽鎖座位のクラスターＢ領域にわたることを特定した。例えば一つ以上の失われたヒトＶλ遺伝子セグメント（例えばＶλ５−３９、Ｖλ５−３７、および／またはＶλ１−３６）を、これら特定されたＢＡＣクローンのいずれか一つを使用して上述の標的化ベクター（６６８０または６８８９）に挿入し、挿入が望ましい一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントを含有させた。例えばＢＡＣクローンのＣＴＤ−２５２３Ｆ２１を、リコンビナーゼ認識部位（例えばｌｏｘ２３７２）と、６５９７標的化ベクターとの重複配列を有する約２７ｋｂの３’相同アームに隣接する選択カセット（例えばユビキチンプロモーターの転写制御下にあるハイグロマイシン抵抗性遺伝子［ＨＹＧ^Ｒ］）と、３’を置換することにより改変する（上記を参照）。ヒトＢＡＣクローンの５’末端は、６６８０または６８８９標的化ベクターとの重複配列を有する５’相同アームとしての役割を果たし、それにより相同組換えが促進され、任意の失われたヒトＶλ遺伝子セグメントと選択カセットの挿入が促進される。リコンビナーゼ（例えばＣｒｅ）の一過性発現を行う任意の最終工程を利用して、選択カセットを除去してもよい。
実施例２．操作されたＩｇλ軽鎖座位を有する齧歯類の作製

【0479】

本実施例は、その生殖細胞ゲノムが、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列の挿入を含む内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物（例えば齧歯類）の作製を示すものであり、当該ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列は、齧歯類Ｃλ遺伝子（または遺伝子セグメント）に操作可能に連結され、当該内因性Ｉｇλ軽鎖座位は一つ以上のヒトＩｇλエンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。一部の実施形態において、前記内因性Ｉｇλ軽鎖座位は、一つ以上の内因性Ｉｇλ軽鎖エンハンサー領域（または配列）の欠失を含む。かかる非ヒト動物は、一部の実施形態において、完全にヒトであるＩｇλ軽鎖（すなわちヒト可変ドメインと定常ドメイン）の発現を特徴とする。

【0480】

実施例１に記載される標的化ベクターの標的挿入は、ポリメラーゼ連鎖反応により確認された。標的ＢＡＣ ＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応により確認し、続いて、Ｆ１ハイブリッド（１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ／Ｃ５７ＢＬ６ＮＴａｃ）マウス胚性幹（ＥＳ細胞）にエレクトロポレーションを介して導入した後に、選択培地で培養した。一部の実施形態において、一連の標的化ベクターのエレクトロポレーションに使用されるＥＳ細胞は、野生型ＩｇＨとＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有してもよく、ホモ接合性のヒト化ＩｇＨ座位とＩｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有してもよく、ここで当該ホモ接合性ヒト化ＩｇＨ座位は挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列を含有しており（例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照。それらは参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）、またはホモ接合性のヒト化ＩｇＨ（例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照。上記）とホモ接合性の不活化Ｉｇκ座位を含む生殖細胞ゲノムを有してもよい。他の実施形態において、本明細書に記載される標的のＥＳ細胞を使用してマウス（以下を参照）を作製した後、本明細書に記載される操作されたヒトＩｇλ座位を含む得られたマウスを使用して、ヒト化ＩｇＨとＩｇκ座位を含むマウスと交配させ、ここで当該ヒト化ＩｇＨは挿入された齧歯類Ａｄａｍ６コード配列（例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照、上記）を含み、またはヒト化ＩｇＨ座位（例えば米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号を参照。上記）と不活化Ｉｇκ座位を含むマウスと交配させる。エレクトロポレーションを行った１０日後に、薬剤抵抗性コロニーを摘まみ上げ、従前に記載されるように正しく標的化されたものをＴＡＱＭＡＮ^ＴＭと染色体分析によりスクリーニングした（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７）。表２には、陽性ＥＳ細胞クローンのスクリーニングに使用されるプライマー／プローブの例が記載される。

【0481】

ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２８５−２９４；ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３０：３１１−３２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９）を使用した。この方法において、標的のＥＳ細胞を非小型化８細胞期Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に注入して、操作されたＩｇλ軽鎖座位アレルに対しヘテロ接合性の、健常な完全ＥＳ細胞由来Ｆ０世代マウスを作製した。Ｆ０世代のヘテロ接合性のマウスを、Ｃ５７Ｂｌ６／ＮＴａｃのマウスと交配させてＦ１ヘテロ接合体を作製し、このＦ１ヘテロ接合体同士を交雑させて、表現型解析用のＦ２世代動物を作製した。

【0482】

まとめると、本実施例は、その生殖細胞ゲノムが、操作されたＩｇλ軽鎖座位を含む齧歯類（例えばマウス）の作製を示すものであり、当該軽鎖座位は、複数のヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列の存在が特徴であり、それら配列は、齧歯類Ｃλ遺伝子に操作可能に連結されており、当該齧歯類の操作されたＩｇλ軽鎖座位は、内因性齧歯類軽鎖エンハンサー配列（または領域）とヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー配列を含む。ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ配列を内因性齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位に挿入する本明細書に記載の戦略によって、ヒトまたは齧歯類Ｃλドメインのいずれかに融合されたヒトＶλドメインを含有する抗体を発現する齧歯類の構築が可能となる。本明細書に記載されるように、かかるヒトＶλドメインは、齧歯類生殖細胞ゲノム中の内因性Ｉｇλ軽鎖座位から発現される。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

実施例３．操作されたＩｇλ軽鎖座位を有する齧歯類の表現型評価

【0483】

本実施例は、上述の内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含有するよう操作された齧歯類（例えばマウス）中の様々な免疫細胞群の特徴解析を示す。特に本実施例は、本明細書に記載される操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を有する齧歯類は、野生型同腹仔と類似したＢ細胞の発生を呈することを具体的に示すものである。特にヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質を様々な量で担持する、いくつかの操作齧歯類はそれぞれ、齧歯類Ｂ細胞表面上にヒト可変ドメインと、ヒトまたは齧歯類の定常ドメインを有するＩｇλ軽鎖を検出可能な程度に発現する。

【0484】

簡潔に述べると、図４に提示されるＩｇλ軽鎖アレルに対しホモ接合性またはヘテロ接合性の選択操作マウスと、野生型同腹仔から脾臓と大腿骨を採取した。２．０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を用いてフラッシュすることにより大腿骨から骨髄を採取した。脾臓および骨髄の調製物由来の赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社）で溶解させ、続いて２．０％のＦＢＳを含む１×ＰＢＳで洗浄した。単離された細胞（１×１０^６個）を、選択された抗体カクテルと共に４℃で３０分間インキュベートした（表３を参照）。

【表3】

【0485】

染色後に細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒド中で固定した。データ取得は、ＢＤ ＦＯＲＴＥＳＳＡ^ＴＭフローサイトメーター上で行われ、ＦＬＯＷＪＯ^ＴＭソフトウェアを用いて分析された。代表的な結果を図５〜１３及び１８〜２１に記載する。図４に提示される他の系統でも類似したデータが取得されたが、選択された指定系統のみを示している。

【0486】

結果から、ヒトＩｇλ軽鎖座位に対応する遺伝物質を異なる量で担持する各系統が、脾臓および骨髄分画において類似した免疫細胞群プロファイルを示したことが示される。特に図５〜７に示されるデータから明らかであるように、操作マウスは、野生型同腹仔対照と類似した数のＣＤ１９^＋脾臓Ｂ細胞、類似した脾臓の成熟または移行期Ｂ細胞群、類似した脾臓におけるκ利用、そして類似した辺縁体Ｂ細胞群および濾胞Ｂ細胞群を示した。さらに本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位を、追加のヒト化ＩｇＨおよびヒト化Ｉｇκ座位の存在下で含有するマウスは、ヒト化ＩｇＨおよびヒト化Ｉｇκ座位のみを含有するマウスと比較してＢ細胞の発生に大きな違いは示さなかった（例えば図１８Ａおよび１８Ｂを参照）。また図８〜１２に提示されるマウスにおいて示されるように、操作されたマウスは、野生型同腹仔対照と比較して類似したＣＤ１９^＋、プロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞の数を有し、および骨髄において類似したκ利用を有していた。選択された操作系統（ホモ接合性−ＨＯ、ヘテロ接合性−ＨＥＴ）における軽鎖発現の、その野生型同腹仔対照との比較の要約を図１３に提示する。本明細書に記載される操作されたヒト化Ｉｇλ座位に対しホモ接合性であり、ヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ座位に対してもホモ接合性であり、齧歯類Ａｄａｍ６コード配列に対してもホモ接合性であるマウスは、野生型マウスで知られている典型的なラムダの末梢利用（例えば脾臓で５％）と比較して、高いラムダ座位の利用（約４０％）を示した（６６８０ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯおよび６６８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯのカラムを参照。図１３）。また少数群のマウスＩｇλ陽性Ｂ細胞がこれらマウスにおいて検出され（約３〜５％）、このことから、操作されたλ軽鎖座位内のマウスＣλ遺伝子も、これらマウスの機能性λ軽鎖の状況下で発現されていることが確認される。
実施例４．操作されたＩｇλ軽鎖座位を有する齧歯類の抗体発現

【0487】

本実施例は、非ヒト動物からの抗体発現を示すものであり、当該抗体は、ヒトＶλ領域と、ヒトまたは齧歯類のＣλ領域の存在が特徴である軽鎖を含有し、当該軽鎖は、操作された内因性齧歯類Ｉｇλ軽鎖座位から発現される。特に本実施例は、その生殖細胞ゲノムが内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含む非ヒト動物（例えば齧歯類）の血清中の抗体発現を示すものであり、当該軽鎖座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントの挿入を含み、当該ヒトＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントは、齧歯類Ｃλ遺伝子に操作可能に連結され、当該内因性イムノグロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類Ｉｇλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）と一つ以上のヒトＩｇλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）をさらに含む。

【0488】

簡潔に述べると、選択された操作マウス系統と野生型同腹仔から血液を採取した（実施例３を参照）。エッペンドルフチューブを使用して五分間、４℃、９０００ｒｃｆで遠心した血液から血清を分離させた。集めた血清をイムノブロッティングに使用して、抗体のＩｇ軽鎖発現を特定した。マウス血清はＰＢＳ（Ｃａ２^＋とＭｇ２^＋を含まない）中、１．５：１０に希釈され、還元条件下、および非還元条件下で４〜２０％のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上で泳動された。メーカーの説明書に従い、ゲルをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へと移した。ブロットは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ社）中、５％無脂肪乳で一晩ブロッキングした。ＰＶＤＦ膜を、０．１％無脂肪乳のＴＢＳＴ溶液中、１：１０００で希釈された異なる一次抗体（ＨＲＰ結合マウス抗ｈＩｇλ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）；ＨＲＰ結合ヤギ抗ｍＩｇλ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に１時間、室温で暴露した。ブロットは、一洗浄当たり十分間で四回洗浄し、メーカーの説明書に従いＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて一分間発色させた。次いで、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ−４０００ Ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤ Ｃａｍｅｒａ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してブロットを画像撮影した。２０枚の画像が取得されるまで、または画像が完全に感光されるまで、どちらか最初の状態になるまで１５秒間隔で画像を取得した。代表的な結果を図１４Ａおよび１４Ｂに記載する。この結果から、全ての操作された系統が、検出可能なレベルのヒトＩｇλ軽鎖を含有する抗体を血清中に発現したことが示された（図１４およびデータは示さず）。
実施例５．操作されたＩｇλ軽鎖座位を有する齧歯類におけるヒト遺伝子セグメントの利用

【0489】

本実施例は、本明細書に記載される内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含有するよう操作された齧歯類（例えばマウス）で発現された抗体軽鎖におけるヒト遺伝子の利用を示す。上述の選択された操作齧歯類系統におけるヒトＩｇλ遺伝子セグメントの利用は、次世代シークエンサー抗体レパートリー分析により決定された。

【0490】

簡潔に述べると、マウスＣλ１遺伝子の上流の２５個の機能性ヒトＶλ遺伝子セグメント、４個の機能性ヒトＪλ−Ｃλクラスター、およびヒトＪλ７遺伝子セグメントの挿入、およびマウスＣλ１遺伝子と内因性マウスＩｇλエンハンサー３．１の間に挿入されたヒトＩｇλエンハンサーに対してヘテロ接合性のマウスから脾臓細胞が採取された（６８８９ヘテロ接合性マウス、図４）。Ｂ細胞は、抗マウスＣＤ１９磁気ビーズとＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）により総脾臓細胞から陽性に富化された。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して脾臓Ｂ細胞から単離された。

【0491】

オリゴ−ｄＴプライマーを用いた逆転写の後、遺伝子特異的ＰＣＲが行われ、ヒトＩｇλ定常領域配列（Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３およびＣλ６）を含有するｃＤＮＡ、ならびにマウスＣλ１配列を含有するｃＤＮＡが、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して作製された。逆転写が行われている間に、特異的ＤＮＡ配列（ＰＩＩＡ：５’−ＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴ ＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴ ＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’、配列番号１３３）を新たに合成されたｃＤＮＡの３’末端に付加させた。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によりｃＤＮＡを精製して、その後、ヒトＣλ特異的プライマー（５’−ＣＡＣＹＡＧＴＧＴＧ ＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧ ＣＴＴＧ−３’、配列番号１３１）、およびマウスＣλ１特異的プライマー（５’−ＣＡＣＣＡＧＴＧＴＧ ＧＣＣＴＴＧＴＴＡＧ ＴＣＴＣ−３’、配列番号１３２）と対形成された、ＰＩＩＡに対し逆相補的なプライマー（５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴ ＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧ ＡＧＴＡＣＡＴ−３’）を使用してさらに増幅された。

【0492】

次いで精製された増幅物を、ＰＩＩＡ特異的プライマー（５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧ ＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧ ＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧ ＡＴＣＴＡＡＧＣＡＧ ＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣ ＧＣＡＧＡＧＴ−３’、配列番号１３４）、およびネステッドヒトＣλ特異的プライマー（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣ ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣ ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡ ＧＧＧＣＧＧＧＡＡＣ ＡＧＡＧＴＧ−３’、配列番号１３５）またはネステッドマウスＣλ１特異的プライマー（５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣ ＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣ ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧ ＡＡＡＣＡＧＧＧＴＧ ＡＣＴＧＡＴＧ−３’、配列番号１３６）を使用したＰＣＲにより増幅させた。４５０〜６９０ｂｐの間のＰＣＲ産物をＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐ（ＳＡＧＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）により単離し、回収した。これらの断片を、以下のプライマーを使用したＰＣＲによりさらに増幅させた：５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧ ＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ ＧＡＴＣＴＡＣＡＣＸ ＸＸＸＸＸＡＣＡＣＴ ＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣ ＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ ＴＣＣＧＡＴＣ−３’、配列番号１３７、および５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧ ＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ ＡＧＡＴＸＸＸＸＸＧ ＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴ ＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴ ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡ ＴＣＴ−３’、配列番号１３８（“ＸＸＸＸＸＸ”は、６ｂｐのインデックス配列であり、配列解析を行うためのサンプルの多重化を可能にする）。約４９０ｂｐ〜７１０ｂｐのＰＣＲ産物をＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐにより単離、回収して、次いでＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用したｑＰＣＲにより定量した。その後、配列解析のためにＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）にローディングした（ｖ３、６００サイクル）。

【0493】

バイオインフォマティクス分析を行うために、得られたＩｌｌｕｍｉｎａ配列を逆多重化し、品質向上のためにトリミングした。その後、ｉｇｂｌａｓｔのローカルインストールを使用して、重複ペアエンドリードをアセンブリし、アノテーションを行った（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）。リードを、ヒトおよびマウス両方の生殖細胞ＶλセグメントならびにＪλセグメントのデータベースにアラインメントし、ベストヒットに対しソーティングを行った。同一スコアの複数のベストヒットが検出された場合には配列は不明瞭として示され、分析から取り除かれた。パール（ｐｅｒｌ）スクリプトのセットを開発して、ｍｙｓｑｌデータベースの結果とスコアを分析した。代表的な結果を図１５Ａ（ヒトＣλ−プライム）および１５Ｂ（マウスＣλ−プライム）に記載する。

【0494】

別の実験において、６８８９標的化ベクター（６８８９ＨＯ／ＶＩ ＨＯ／Ａｄａｍ６ ＨＯ、上述）の挿入に対してホモ接合性のマウス（ｎ＝３）から回収された脾臓Ｂ細胞を、次世代シーケンス抗体のレパートリー分析（上述）によりヒトＩｇλ遺伝子セグメントの利用に対し分析した。脾臓Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡは、マウスｍＣλ（ｎ＝３）およびヒトｈＣλ（ｎ＝３）の定常領域に対するプライマーを使用した５’ＲＡＣＥにより増幅され、ＭｉＳｅｑを使用して配列解析された。代表的な結果を図１５Ｃ（ヒトＣλ−プライム）および１５Ｄ（マウスＣλ−プライム）に記載する。

【0495】

６８８９標的化ベクター（すなわち二つの標的化ベクターとｇＲＮＡの共エレクトロポレーション）を使用して作製されたマウスは、２５個すべての機能性ヒトＶλ遺伝子セグメントの発現を示した。さらにこれらマウスのＢ細胞からのヒトＶλ遺伝子セグメントの発現は、単離Ｂ細胞において、ヒト臍帯血で観察されるヒトＶλ遺伝子セグメントと比較して類似した頻度を示した。まとめると、本実施例は、本明細書に記載される操作されたＩｇλ軽鎖座位をその生殖細胞ゲノム中に含有する齧歯類は、Ｂ細胞において、ヒトＩｇλ配列を含有するＩｇλ軽鎖を発現することを示す。さらに、そのようなヒトＩｇλ配列は、マウスまたはヒトのＣλドメインを含有する軽鎖において容易に識別され得る。
実施例６．操作された齧歯類における抗体の産生

【0496】

本実施例は、上述の操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含む齧歯類における抗体の産生を、対象抗原（例えば単回膜貫通タンパク質または複数回膜貫通タンパク質など）を使用して示すものである。本実施例に記載される方法、または当技術分野で公知の免疫化の方法を使用して、本明細書に記載の操作された内因性Ｉｇλ軽鎖座位を含有する齧歯類を、ポリペプチドまたはその断片（例えば、所望のエピトープ由来のペプチド）で、または望ましい場合にはポリペプチドまたはその断片の組み合わせで、免疫化することができる。

【0497】

本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位とヒト化ＩｇＨ座位（上述）を有するマウスのコホート、または本明細書に記載の操作されたＩｇλ軽鎖座位とヒト化ＩｇＨおよびＩｇκ軽鎖座位（上述）を有するマウスのコホートに、当分野に公知の免疫化方法を使用して対象抗原をチャレンジした。抗体免疫反応を、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ（すなわち血清力価）でモニターする。望ましい免疫反応が得られた場合、脾臓細胞（および／または他のリンパ組織）を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させ、それらの活性を保持させ、不死化ハイブリドーマ細胞株を形成させる。ハイブリドーマ細胞株を（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより）スクリーニングし、選択して、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。ハイブリドーマは、所望される相対結合親和性とアイソタイプに関してさらに特徴付けされてもよい。この技術と上記の免疫原を使用して、数種の抗原特異的キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインと齧歯類定常ドメインを保有する抗体）が取得される。

【0498】

完全ヒト抗体の調製を目的として、重鎖と軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを単離して、当該重鎖と軽鎖の望ましいアイソタイプ（定常ドメイン）に連結してもよい。かかる抗体タンパク質を、ＣＨＯ細胞などの細胞中で産生することができる。続いて、完全ヒト抗体を、相対結合親和性および／または対象の抗原の中和活性に関して特徴付ける。

【0499】

抗原特異的キメラ抗体、または軽鎖と重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。最初に、ヒト可変ドメインと齧歯類定常ドメインを有する高親和性のキメラ抗体を単離し、親和性、選択性、エピトープなどの望ましい特性に関して特徴解析し、選択する。齧歯類定常ドメインを所望のヒト定常ドメインで置換し、完全ヒト抗体を作製する。特定の用途に従い選択される定常ドメインは変化し得るが、可変ドメイン中には高親和性の抗原結合性と標的特異性の特徴が存在する。また、例えばその全体で参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるように、ミエローマ細胞との融合を行うことなく、抗原陽性Ｂ細胞（免疫化マウス由来）からも抗原特異的抗体は直接単離される。この方法を使用して、数種の完全ヒト抗原特異的抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとヒト定常ドメインとを保有する抗体）を作製する。

【0500】

一つの実験において、６５９７ｈｅｔ（ｎ＝６）および６６８０ｈｅｔ（ｎ＝６）のマウスが、受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いた足蹠投与を介して免疫化され、操作マウスにおける免疫反応が決定された。

【0501】

簡潔に述べると、マウスは２．３５μｇの抗原（受容体ポリペプチドのＥＣＤ）と１０μｇのＣｐＧアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ＯＤＮ１８２６）で抗原刺激された。マウスは２．３５μｇの抗原（受容体ポリペプチドのＥＣＤ）、１０μｇのＣｐＧアジュバント、および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ社）で七回追加刺激された。最後の注射から二日後、選択された操作マウス系統と対照から血液を採取した。Ｍｉｃｔｒｏｔａｉｎｅｒキャピラリー血液採取管（ＢＤ社、カタログ番号３６５９６７）を使用して五分間、４℃、９０００ｒｃｆで遠心を行い、血液から血清を分離させた。血清ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、総ＩｇＧ（図１６Ａ）、抗原特異的ＩｇＧ（図１６Ｂ）、ｍＩｇκ（図１７Ｃ）、ｍＩｇλ（図１７Ｂ）およびｈＩｇλ（図１７Ａ）の力価を決定した。

【0502】

総ＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイに関しては、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社）を、１ウェル当たり、１μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ社）のＤＰＢＳ溶液（ＣａとＭｇを含む）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＣａまたはＭｇを含まず、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中で四回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで一時間、室温でブロッキングした。０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で血清を十倍に希釈し（１：１００で開始し、１：１０^９で終了）、マウスＩｇＧ標準物（Ｓｉｇｍａ社）は０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で三倍に希釈された（１μｇ／ｍＬで開始し、０．０５ｎｇ／ｍＬで終了）。それぞれ標準物とサンプル希釈物の１００μｌをプレートに添加し、室温で一時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔ中で四回点状した。１：２５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧヒトａｄｓ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）の１００μｌを各ウェルに加え、プレートを一時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ中で四回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を各ウェルに十分間添加した。１ウェル当たり１００μｌの１Ｎ 硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍで吸着を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、四パラメータ曲線に適合させた。

【0503】

抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイに関しては、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社）を、１ウェル当たり、１μｇ／ｍＬの抗原のＤＰＢＳ溶液（ＣａとＭｇを含む）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ−Ｔ中で四回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中、１：２に希釈されたＳｅａ Ｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）にて室温で一時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔ中、１：５に希釈されたＳｅａ Ｂｌｏｃｋにて血清を希釈した（上述）。各サンプル希釈物を各プレートに加え、一時間、室温でインキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ−Ｔ中、四回洗浄した。１：２５００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧヒトａｄｓ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、１：４０００に希釈されたヤギ抗ｍＩｇκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、１：４０００に希釈されたヤギ抗ｍＩｇλ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、または１：４０００に希釈されたヤギ抗ｈＩｇλマウスａｄｓ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）のいずれか１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを一時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔ中四回洗浄し、上述のように発色させた。代表的な結果を図１６と図１７に記載する。

【0504】

まとめると、本実施例は、本明細書に記載されるＩｇλ軽鎖座位を含有するように操作された齧歯類は、対象抗原を用いた免疫化に対し、強い抗体反応を生じさせることを示す。さらにかかる操作された齧歯類は、野生型対照と同等の総ＩｇＧ値および抗原特異的ＩｇＧ値を示した。このことから、これら操作された動物における安定した免疫反応能力が確認される。実際に、免疫時のｈＩｇλ力価は、ｍＩｇλ力価よりも高かった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。ゆえに本明細書に記載の操作された齧歯類は、ヒト抗体系治療剤、特にヒトＩｇλ軽鎖配列を利用するヒト抗体系治療剤の開発用の抗体作製に対し、改善されたインビボシステムを提供する。
均等

【0505】

当分野の当業者には、本開示の様々な変更、改変および改善が、当分野の当業者には容易に気が付くと認識されるはずである。そのような変更、改変および改善は、本開示の一部であることが意図され、そして本発明の主旨および範囲の内にあることが意図される。従って、前述の説明および図面は例示のみを目的としており、本開示に記載される任意の発明は、以下の請求項によりさらに詳細に記載される。

【0506】

請求項で請求項を変更するための「第一の」、「第二の」、「第三の」などの順序の用語の使用は、それ自体は一つの請求項要素の別の要素に対する優位性、先行、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、特定の名称を持つ一つの請求項要素を（順序の用語の使用以外は）同じ名称を持つ別の要素から区別して請求項要素を区別するための標識としてのみ使用される。

【0507】

本明細書および本特許請求の範囲において、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、そうではないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の一つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記述は、そうではないことが示されるかまたはそうでなければ文脈から明らかでない限り、一つ、二つ以上、または群のすべての要素が、所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する場合に満足される。本発明は、群の正確に一つの要素が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、二つ以上、または群の要素全体が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別途指定されない限り、または矛盾または不一致が起こることが当業者には明らかでない限り、変形、組み合わせ、および記載された請求項の一つ以上からの一つ以上の限定、要素、句、記述用語などが、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または関連する任意のその他の請求項）に導入される並べ替えすべてを網羅することを理解すべきである。記載されたような要素が存在する場合（例えば、マーカッシュ群または類似の形式で）、要素の各サブグループも開示され、任意の要素を群から除去することができる。当然のことながら、一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などから成る、または実質的にそれらから成る。簡潔にするために、これらの実施形態はすべての場合において、多くの言葉では本明細書に特に記述されていない。これも当然のことながら、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、請求項から明示的に除外される可能性がある。

【0508】

当業者であれば、本明細書に記載されるアッセイまたは他のプロセスで得られた値に起因する一般的な標準偏差または誤差を理解するであろう。本発明の背景を説明し、その実践に関して追加的詳細を提供するために本明細書において言及される出版物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]