特許 6886571 ４−エチルフェノールの生成方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6886571

(24)【登録日】2021年5月19日

(45)【発行日】2021年6月16日

(54)【発明の名称】４−エチルフェノールの生成方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/22 20060101AFI20210603BHJP

   A23F 3/40 20060101ALI20210603BHJP

   A23L 27/10 20160101ALI20210603BHJP

   A23L 2/00 20060101ALI20210603BHJP

   A23F 3/16 20060101ALI20210603BHJP

   C12P 7/56 20060101ALI20210603BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/22

   A23F3/40

   A23L27/10 C

   A23L2/00 B

   A23F3/16

   C12P7/56

【請求項の数】7

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2016-184439(P2016-184439)

(22)【出願日】2016年9月21日

(65)【公開番号】特開2018-46772(P2018-46772A)

(43)【公開日】2018年3月29日

【審査請求日】2019年8月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000210067

【氏名又は名称】池田食研株式会社

(72)【発明者】

【氏名】中村 直樹

(72)【発明者】

【氏名】玉井 秀樹

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０３９７６０５２（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００３−３３３９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／１４３７４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０９０７２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１６９６７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−２５０７３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１２６００３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭６３−０８７９６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 LOPEZ, A.M., et al.，"Survival and metabolic activity of probiotic bacteria in green tea."，LWT - FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY，２０１４年 １月，Vol.55, No.1，pp.314-322，doi: 10.1016/j.lwt.2013.08.021

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ａ２３Ｆ ３／００− ５／５０

Ａ２３Ｌ ２／００−３５／００

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ ９／００− ９／９９

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

茶抽出物をラクトバチルス・プランタラム及び／又はラクトバチルス・ペントサスにより発酵させる工程及びβ‐グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む、４−エチルフェノールの生成方法。

【請求項2】

β‐グルコシダーゼ活性を有する酵素がアスペルギルス属に属する菌由来である、請求項１記載の４−エチルフェノールの生成方法。

【請求項3】

茶抽出物をラクトバチルス・プランタラム及び／又はラクトバチルス・ペントサスにより発酵させる工程及びβ−グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む、茶発酵物の製造方法。

【請求項4】

β−グルコシダーゼ活性を有する酵素がアスペルギルス属に属する菌由来である、請求項３記載の茶発酵物の製造方法。

【請求項5】

４−エチルフェノール含有茶発酵物が得られる、請求項３又は４記載の茶発酵物の製造方法。

【請求項6】

請求項３〜５の何れか１項に記載の製造方法により得られる茶発酵物であって、４−エチルフェノールを含有し、乳酸を０．２重量％以上含む、茶発酵物。

【請求項7】

請求項６記載の茶発酵物を含む飲食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、４−エチルフェノールの生成方法及び茶発酵物等に関する。

【背景技術】

【0002】

特定の香気成分として３−メチルフェノール及び４−エチルフェノールを用いて、これらを特定の重量比で混合することや他の化合物を添加することによって、高温加熱により発現する風味付与及び塩味やスパイス感増強効果が得られ、さらに不快臭を軽減できることが知られている（引用文献１）。なお、引用文献１には４−エチルフェノールの生成方法については記載されていない

【0003】

引用文献２には、茶抽出液中で乳酸菌を培養することにより、「甘い香り」が強調されること、並びにγ−アミノ酪酸の含有量が増大することが記載されている。

【0004】

また、引用文献３には、蒸葉、粗揉葉、揉捻葉からなる群より選ばれる少なくとも１種の茶葉から得られた抽出液にβ−グリコシダーゼ活性を有する酵素を作用させて、従来の緑茶エキスとは異なる特定の香気成分組成にコントロールすることで、緑茶のフレッシュな香りを保持しながらも従来の緑茶エキスには無いフルーティーな特有の香りを持つ茶エキスが得られることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１４−１５５４８１号公報

【特許文献2】特開２００３−３３３９９０号公報

【特許文献3】特開２０１１−２５０７３６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、茶抽出物を乳酸菌で発酵させる工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む４−エチルフェノールの生成方法、茶発酵物及びその製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明者らは、茶抽出物を乳酸菌により発酵させる工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含むことで、４−エチルフェノールが生成されることを見出し、さらに茶特有の香り、フローラルな香り及び適度な酸味を有する風味力価の高い茶発酵物を製造できることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［９］の態様に関する。
［１］茶抽出物を乳酸菌により発酵させる工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む、４−エチルフェノールの生成方法。
［２］乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム及び／又はラクトバチルス・ペントサスである、［１］記載の４−エチルフェノールの生成方法。
［３］β-グルコシダーゼ活性を有する酵素がアスペルギルス属に属する菌由来である、［１］又は［２］記載の４−エチルフェノールの生成方法。
［４］茶抽出物を乳酸菌により発酵させる工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む、茶発酵物の製造方法。
［５］乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム及び／又はラクトバチルス・ペントサスである、［４］記載の茶発酵物の製造方法。
［６］β-グルコシダーゼ活性を有する酵素がアスペルギルス属に属する菌由来である、［４］又は［５］記載の茶発酵物の製造方法。
［７］［４］〜［６］の何れか１項に記載の４−エチルフェノール含有茶発酵物の製造方法。
［８］［４］〜［７］の何れか１項に記載の製造方法により得られる茶発酵物であって、４−エチルフェノールを含有し、乳酸を０．２重量％以上含む、茶発酵物。
［９］［８］記載の茶発酵物を含む飲食品。

【発明の効果】

【0009】

本発明によって、茶抽出物から簡便に４−エチルフェノールが生成できることが分かり、天然由来の４−エチルフェノールを生成することができるようになった。４−エチルフェノールを含有することで、フローラルな香りを有する茶発酵物を提供できる。さらに４−エチルフェノールと乳酸を含有し、茶特有の香り及びフローラルな香りと共に、適度な酸味があり、風味力価の高い茶発酵物を提供できる。また、簡便に該茶発酵物を製造できる製造方法を提供できる。さらに、該茶発酵物は希釈して使用でき、各種飲食品に少量添加するだけで、良好な風味を付与でき、風味良好な飲食品を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施品１、並びに比較品１、３及び４のＧＣ（ガスクロマトグラフ）による香気成分分析結果（チャート）。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、茶抽出物を、乳酸菌で発酵させる工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する工程を含む。例えば、茶原料に加水し加熱する工程、乳酸菌を接種する工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素を添加する工程を含む方法を例示できる。

【0012】

本発明に記載の茶抽出物は、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の葉、茎等から製造された茶原料から抽出されたものであればよく、茶原料は不発酵茶、半発酵茶、発酵茶、後発酵茶等の何れでもよく、緑茶、烏龍茶、紅茶等が例示できる。二種類以上の茶原料を組み合わせて用いてもよい。なお、茶葉等から抽出して液体形態となっている茶と区別するため、本願では、抽出に供する茶葉等を“茶原料”とする。茶原料は乾燥品であり、一般的な乾燥品であれば水分含量は特に限定されないが、８重量％以下が好ましく、７重量％以下がより好ましく、緑茶であれば荒茶を使用すればよい。また、切断、破砕、細砕、粉砕等の処理を行った茶原料を用いてもよい

【0013】

前記茶原料に水性溶媒を添加し、加熱することで、茶由来成分を含む茶抽出物が得られる。抽出方法は、一般的な方法で行えばよく、水性溶媒を用いて、茶原料から茶由来成分を抽出できれば特に限定されない。水性溶媒は水が好ましく、無機塩、エタノール等を含有する水溶液でもよい。水性溶媒と原料との混合物が流動性を有していれば、水性溶媒と原料との比率は特に限定されないが、水性溶媒を８０重量％以上含むのが好ましく、８５重量％以上含むのがより好ましく、９０重量％以上含むのがさらに好ましい。抽出温度は茶由来成分が抽出できる温度であれば特に限定されないが、１５〜１１０℃が好ましく、３０〜１０５℃がより好ましく、５０〜１００℃がさらに好ましく、６０〜９０℃が最も好ましい。抽出時間は、１分間〜１２時間が好ましく、２分間〜６時間がより好ましく、５分間〜３時間がさらに好ましい。抽出は、常圧条件下、加圧条件下の何れでもよい。抽出後に固液分離してもよく、不織布によるろ過、遠心分離等により茶原料を含む混合物から液体を回収できる。市販の茶抽出物を使用してもよく、抽出後に濃縮したエキスを使用してもよい。

【0014】

本発明は、茶抽出物を乳酸菌により発酵させる工程を含む。乳酸菌は、β-グルコシダーゼ活性を有する酵素との併用で本発明品が得られれば特に限定されないが、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）のうち、少なくとも１種を用いるのが好ましい。発酵条件は、本発明の茶発酵物が得られれば特に限定されず、静置で行うことができる。また、発酵温度は２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がより好ましく、発酵時間は１０〜４８時間が好ましく、１２〜３６時間がより好ましい。

【0015】

本発明は、茶抽出物をβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素で処理する酵素処理工程を含む。β-グルコシダーゼ活性を有する酵素は、乳酸菌による発酵との併用で本発明品が得られれば特に限定されないが、単糖配糖体を加水分解する酵素を例示でき、例えば、β−グルコシダーゼ製剤として、スミチームＢＧＡ（新日本化学工業株式会社製）等が使用でき、アスペルギルス属に属する菌由来の酵素が好ましく、アスペルギルス・ニガー由来の酵素がより好ましい。さらに、プロテアーゼ等の他の酵素を併用してもよい。

【0016】

酵素処理条件は、乳酸菌による発酵との併用で本発明品が得られる条件であれば特に限定されないが、例えば酵素添加量は、酵素製剤として、茶原料を１００重量％とした場合に、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．０５〜３重量％である。また、処理条件は酵素の最適ｐＨ及び温度、並びにｐＨ及び温度安定性を考慮して適宜設定できるが、例えば、ｐＨ２〜８、１０〜７０℃での処理が例示でき、ｐＨ３〜７、２０〜６０℃が好ましい。処理時間は処理条件に応じて適宜調整できるが、例えば、５分間〜３０時間が例示でき、１０分間〜２４時間が好ましい。さらに、７０〜１２０℃、１分間〜６時間又は８０〜１００℃、３分間〜３時間の加熱工程を追加で行うのが好ましく、酵素を失活させることができる。

【0017】

上記に記載した茶原料からの抽出工程、乳酸菌による発酵工程及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理工程は、本発明の茶発酵物を製造できれば、並行して行ってもよい。

【0018】

上記に記載の方法により４−エチルフェノールを生成することができ、本発明の茶発酵物を製造することができる。本発明の茶発酵物は、茶発酵物全体を１００重量％とした場合に、４−エチルフェノールを含むものが好ましく、２ｐｐｍ以上含むものがより好ましく、３ｐｐｍ以上含むものがさらに好ましく、４ｐｐｍ以上含むものが特に好ましい。かつ、乳酸を含むものが好ましく、０．２重量％以上含むものがより好ましく、０．３重量％以上含むものがさらに好ましく、０．４重量％以上含むものが特に好ましい。茶発酵物は、さらに、ドラムドライ、エアードライ、スプレードライ、真空乾燥及び／又は凍結乾燥等を行い、乾燥品として利用しても良い。

【0019】

本発明の茶発酵物は、希釈して喫することができ、各飲食品に添加して使用することができる。各飲食品に添加することにより、茶特有の香り、フローラルな香り及び酸味が付与された各飲食品を製造できる。各飲食品への添加量は良好な官能が得られれば特に限定されないが、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．５〜１５％、さらに好ましくは１．０〜１０％である。添加する飲食品は特に限定されないが、清涼飲料、ジュース、アルコール飲料等の飲料、洋菓子、和菓子、アイスクリーム等が例示できる。

【実施例】

【0020】

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。尚、本発明において、％は別記がない限り全て重量％である。

【0021】

［実施例１］
（煎茶発酵物１）
煎茶原料１０ｇと水道水９０ｇを混合し、８０℃で１０分間処理した後、３５℃まで冷却した。次いで、乳酸菌としてラクトバチルス・プランタラム菌体粉末（ＴＨＴ０３０７０１株、１×１０^１０ｃｆｕ／ｇ、セティ株式会社製）を５×１０^６ｃｆｕ／ｇ程度となるよう０．０５ｇ接種し、β−グルコシダーゼ製剤としてスミチームＢＧＡ（アスペルギルス属由来、新日本化学工業株式会社製）０．１ｇを添加し、３５℃で２０時間発酵処理及び酵素処理することで、煎茶発酵物である実施品１を９５ｇ得た。

【0022】

［実施例２］
（煎茶発酵物２）
実施例１のβ−グルコシダーゼ製剤に加え、プロテアーゼ製剤であるスミチームＦＰ（新日本化学工業株式会社製）０．１ｇを添加し、それ以外は実施例１と同様に処理して、煎茶発酵物である実施品２を９５ｇ得た。

【0023】

［実施例３］
（煎茶発酵物３）
実施例１のβ−グルコシダーゼ製剤に加え、プロテアーゼ製剤であるスミチームＡＣＰ（新日本化学工業株式会社製）０．１ｇを添加し、それ以外は実施例１と同様に処理して、煎茶発酵物である実施品３を９５ｇ得た。

【0024】

［比較例１］
実施例１記載の方法からβ−グルコシダーゼ製剤を除き、それ以外は実施例１と同様に処理して、比較品１を９５ｇ得た。

【0025】

［比較例２］
実施例１記載の方法から乳酸菌を除き、それ以外は実施例１と同様に処理して、比較品２を９５ｇ得た。

【0026】

［比較例３］
実施例１のβ−グルコシダーゼ製剤の代わりにプロテアーゼ製剤であるスミチームＦＰを添加し、それ以外は実施例１と同様に処理して、比較品３を９５ｇ得た。

【0027】

［比較例４］
実施例１のβ−グルコシダーゼ製剤の代わりにキシラナーゼ製剤であるスミチームＸ（新日本化学工業株式会社製）を添加し、それ以外は実施例１と同様に処理して、比較品４を９５ｇ得た。

【0028】

［評価試験１］
（官能評価）
実施品１〜３及び比較品１〜４について、官能評価を実施した。なお、官能評価は、各実施品又は比較品５ｇにミネラルウォーター９５ｇを加えて２０倍に希釈したものを検体として香気及び味を評価し、表１に示した。香気の評価は、「煎茶特有の爽やかな香り」が「有る」：○、「無い」：×、又は「フローラルな香り」が「有る」：○、「無い」：×とした。味の評価は、「酸味」が「適切」：○、「弱い」：△、「無い」：×、又は「風味」が「良好」：○、「不良」：×とした。

【0029】

実施品１〜３の煎茶発酵物は、何れも煎茶特有の爽やかな香りに加えフローラルな香りが有った。また、適度な酸味があり風味良好だった。一方、比較品１〜４は、何れも煎茶特有の爽やかな香りは有ったが、フローラルな香りは無く、味が薄く、好ましい風味のものではなかった。

【0030】

さらに、実施品における有効成分を解明するため、乳酸濃度及び香気成分についてさらに分析することとした。

【0031】

［評価試験２］
（乳酸濃度の測定）
乳酸濃度は、実施品１〜３及び比較品１〜４について、ＨＰＬＣを用いて下記測定条件１で測定し、結果を表１に示した。
＜ＨＰＬＣ測定条件１＞
検出器：ＶＩＳ検出器（４３０ｎｍ）
カラム１：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｐｈｅｎｙｌ
（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
カラム２：Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−Ｘ３００
（内径４．１ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ製）
移動相：２ｍＭ 過塩素酸水溶液
移動相流速：０．６５ｍｌ／分
ポストカラム反応液：ＳＴ３−Ｒ（昭和電工株式会社製）
ポストカラム反応液流速：０．３５ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
標品：乳酸（食品添加物、和光純薬工業株式会社製）を蒸留水で適宜希釈し、検量線を作成した。
検体：各試料を蒸留水で、適宜希釈したもの。

【0032】

［評価試験３］
（香気成分の特定）
香気成分は、実施品１、並びに比較品１、３及び４について、ＧＣ（ガスクロマトグラフ）を用いて下記分析条件で分析し、結果を図１に示した。
＜ＧＣ分析条件＞
検出器：Ｆｌａｍｅ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＦＩＤ）
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（内径：０．２５ｍｍ、長さ：３０ｍ、膜厚：０．２５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆Ｗ製）
カラム温度：４０℃（５分間保持）→１０℃／分で昇温→２５０℃（３分間保持）
キャリアガス：ヘリウム（１００ｋＰａ、流量：１．３ｍｌ／分）
インジェクション量：１μｌ（スプリット比１：１５）
インジェクタ温度：２５０℃
検体：各煎茶発酵物に同重量のジエチルエーテルを加えて抽出（分液）した後、ジエチルエーテル層を回収して検体とした。

【0033】

実施品と比較品のチャートを比較したところ、実施品のみに見られるピーク（リテンションタイム１８．８３５）が確認でき、該物質が香気及び味に影響していると考えられた。該リテンションタイムから、該物質は４−エチルフェノールと推測されたため、４−エチルフェノール（一級、和光純薬工業株式会社製）を標品として用いてＧＣ分析したところ、実施品のみに見られるピークと同じリテンションタイムにピークが見られた。

【0034】

さらに、４−エチルフェノールを標品として、ＨＰＬＣを用いて下記測定条件２で測定した結果、実施品のみに見られるピークと標品とで、同じリテンションタイムにピークが見られ、本願発明を特徴付ける重要な香気成分が４−エチルフェノールであることが明らかになった。

【0035】

＜ＨＰＬＣ測定条件２＞
検出器：ＵＶ検出器（２７７ｎｍ）
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８
（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ジーエルサイエンス株式会社製）
移動相Ａ：１６容量％アセトニトリル水溶液（０．１容量％リン酸含有）
移動相Ｂ：８０容量％アセトニトリル水溶液（０．１容量％リン酸含有）
グラジエント：移動相Ａから移動相Ｂへのグラジエント（３０分間）
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
標品：４−エチルフェノールを５０容量％エタノールで適宜希釈し、検量線を作成した。
検体：各試料を５０容量％エタノールで、適宜希釈したもの。

【0036】

［評価試験４］
（４−エチルフェノール（４−ＥＰ）濃度の測定）
実施品１〜３及び比較品１〜４について、ＨＰＬＣを用いて上記ＨＰＬＣ測定条件２で４−ＥＰ濃度を測定し、結果を表１に示した。

【0037】

【表1】

【0038】

評価試験２及び４の結果、乳酸菌による発酵に加え、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理を行って得られた実施品１〜３の煎茶発酵物は、香気成分である４−ＥＰが検出され、その濃度は何れも９ｐｐｍ以上であり、さらに乳酸濃度が何れも０．４％以上だった。一方、比較品１〜４は、乳酸が検出されたものもあったが、４−ＥＰは何れも検出されなかった。

【0039】

評価試験１、２及び４より、実施品１〜３は、何れも乳酸菌による発酵に加え、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理を併用して得られた煎茶発酵物であるのに対し、比較品１又は２は、乳酸菌による発酵のみ又はβ−グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理のみで、比較品３又は４は、乳酸菌による発酵は行っているが、β−グルコシダーゼ活性のない酵素による酵素処理を行って得られた煎茶発酵物であることから、本発明は、乳酸菌による発酵に加え、β−グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理を併用することが重要であることが分かった。

【0040】

［実施例４］
（烏龍茶発酵物）
実施例３の煎茶原料の代わりに烏龍茶原料を用い、それ以外は実施例１と同様に処理した後、８０℃で１０分間加熱殺菌処理し、不織布を用いて固液分離して液部を回収することで、烏龍茶発酵物である実施品４を７０ｇ得た。

【0041】

［実施例５］
（紅茶発酵物）
実施例４の烏龍茶原料の代わりに紅茶原料を用い、それ以外は実施例４と同様に処理して、紅茶発酵物である実施品５を６５ｇ得た。

【0042】

［評価試験５］
前記評価試験１、２及び４に従って、官能評価、乳酸濃度及び４−ＥＰ濃度を測定し、結果を表２に示した。なお、香気評価については、「烏龍茶特有の芳ばしい香り」が「有る」：○、「無い」：×、又は「紅茶特有の甘い香り」が「有る」：○、「無い」：×とした。

【0043】

【表2】

【0044】

実施品４及び５の発酵物は、何れも各茶特有の香りと共にフローラルな香りが有った。また、適度な酸味があり風味良好だった。さらに、香気成分である４−ＥＰが検出され、その濃度は７〜１１ｐｐｍであり、乳酸濃度は何れも０．４％以上だった。

【0045】

よって、烏龍茶及び紅茶でも、煎茶と同様に、乳酸菌による発酵及びβ−グルコシダーゼ活性を有する酵素による酵素処理を行うことで、本発明の茶発酵物が得られることが分かった。

【0046】

［実施例６］
煎茶１０ｇと水道水９０ｇを混合し、８０℃で１０分間加熱殺菌処理した後、３５℃まで冷却した。次いで、乳酸菌としてラクトバチルス・プランタラムＮＢＲＣ１５８９１（実施例６−１）、ラクトバチルス・ペントサスＮＢＲＣ１２０１１（実施例６−２）又はラクトバチルス・ペントサスＮＢＲＣ１０６４６７（実施例６−３）を１×１０^６ｃｆｕ／ｇ程度となるよう接種し、β−グルコシダーゼ製剤としてスミチームＢＧＡ０．１ｇ及びプロテアーゼ製剤としてスミチームＡＣＰ０．１ｇを添加し、３５℃で２０時間酵素処理及び発酵処理することで、煎茶発酵物である実施品６−１〜６−３を各９５ｇ得た。

【0047】

［比較例５］
実施例６の乳酸菌の代わりに、乳酸菌としてラクトバチルス・カルバタスＮＢＲＣ１５８８４（比較例５−１）、ラクトバチルス・アシドフィラスＮＢＲＣ１３９５１（比較例５−２）、ラクトバチルス・カゼイＮＢＲＣ１５８８３（比較例５−３）、ラクトバチルス・パラカゼイＮＢＲＣ３５３３（比較例５−４）、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＢＲＣ１５８８５（比較例５−５）、ラクトバチルス・ブレビスＮＢＲＣ１３１１０（比較例５−６）、ラクトバチルス・サケイＮＢＲＣ３５４１（比較例５−７）、ラクトバチルス・サケイＮＢＲＣ１０７１３０（比較例５−８）、ラクトバチルス・パラプランタラムＮＢＲＣ１０７１５１（比較例５−９）、ラクトバチルス・パラリメンタリウスＮＢＲＣ１０７１５２（比較例５−１０）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＢＲＣ１３９５７（比較例５−１１）、ロイコノストック・ラクティスＮＢＲＣ１０７８６６（比較例５−１２）又はロイコノストック・メセンテロイデスＮＢＲＣ１００４９６（比較例５−１３）を接種し、それ以外は実施例６と同様に処理して、比較品５−１〜５−１３を各９５ｇ得た。

【0048】

［評価試験６］
前記評価試験２及び４に従って、乳酸濃度及び４−ＥＰ濃度を測定し、結果を表３に示した。

【0049】

【表3】

【0050】

実施品６の発酵物は、何れも香気成分である４−ＥＰが検出され、その濃度は４〜３９ｐｐｍであり、乳酸濃度が０．４％以上だった。一方、比較品５−１〜５−１３は、乳酸が検出されたものもあったが、４−ＥＰは何れも検出されなかった。

【0051】

よって、乳酸菌による発酵は、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトバチルス・ペントサスのような、β−グルコシダーゼとの併用で４−ＥＰを生成できる乳酸菌を用いることが重要であることが分かった。

【図1】