特許 6887008 脊髄疾患の遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6887008

(24)【登録日】2021年5月19日

(45)【発行日】2021年6月16日

(54)【発明の名称】脊髄疾患の遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20210603BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210603BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210603BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20210603BHJP

【ＦＩ】

   A61K48/00ZNA

   A61K35/76

   A61P25/00

   A61P21/00

【請求項の数】6

【外国語出願】

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2019-203155(P2019-203155)

(22)【出願日】2019年11月8日

(62)【分割の表示】特願2017-32174(P2017-32174)の分割

【原出願日】2006年5月2日

(65)【公開番号】特開2020-50660(P2020-50660A)

(43)【公開日】2020年4月2日

【審査請求日】2019年12月9日

(31)【優先権主張番号】60/677,213

(32)【優先日】2005年5月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/790,217

(32)【優先日】2006年4月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(72)【発明者】

【氏名】ジェイムズ・ダッジ

(72)【発明者】

【氏名】ラムヤ・シハブッディン

(72)【発明者】

【氏名】マルコ・パッシーニ

(72)【発明者】

【氏名】セン・チェン

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン・アール・オリオルダン

【審査官】 古閑 一実

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２５８６６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／１１８５５２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／７６６１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Boillee,S. et al，Trends in neurosciences，２００４年，Vol.27, No.5，p.235-8

【文献】 MANDEL,R.J. et al，Neuromethods，２０００年，Vol.36，p.103-130

【文献】 BARTLETT,J.S. et al，Human Gene Therapy，１９９８年，Vol.9, No.8，p.1181-1186

【文献】 CHAMBERLIN,N.L. et al，Brain Research，１９９８年，Vol.793, No.1,2，p.169-175

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ｃ０７Ｋ １４／６５

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の筋萎縮性側索硬化症の処置において使用するための、治療用トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを含む医薬組成物であって、脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へ投与されるものであり、トランスジーン産物が脊髄の少なくとも１つの小区分および／または脳幹の少なくとも１つの区分へ治療上有効量で送達されるものであり、組換え神経向性ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）であり、治療用トランスジーンがインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）であり、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１またはＡＡＶ８からなる群より選択されるものである、医薬組成物。

【請求項2】

脳の深部小脳核領域の領域が、内側領域、中間領域および外側領域からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

送達が両側性である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

脊髄小区分が頸部小区分、胸部小区分、腰部小区分および尾部小区分からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

トランスジーンが脊髄の全小区分へ送達される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

対象がヒト患者である、請求項１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２００５年５月２日出願の米国仮出願番号第６０／６７７，２１３号および２００６年４月８日出願の米国仮出願番号第６０／７９０，２１７号に基づく優先権を主張する。該出願の開示内容は出典明示により本明細書の一部となる。

【0002】

技術分野
本発明は、対象の運動機能、特に、脳および／または脊髄に対する疾患または損傷に侵された運動機能に影響を及ぼす障害を処置するための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
遺伝子療法は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼす障害のための新たな治療法である。ＣＮＳ遺伝子療法は、有糸分裂後ニューロンへの効率的な感染能を有するウイルスベクターの開発により促進された。中枢神経系は脊髄および脳から構成される。脊髄は末梢神経系から脳へ知覚情報を伝え、さらに、脳から様々なエフェクターへ運動情報を伝える。中枢神経系への遺伝子送達用ウイルスベクターの総説については、Ｄａｖｉｄｓｏｎら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．４：３５３−３６４を参照のこと。

【0004】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、好都合な毒性および免疫原性特性を有し、神経細胞に形質導入することができ、ＣＮＳにおいて長期にわたる発現を媒介することができるので、ＣＮＳ遺伝子療法に有用であると考えられている（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４；Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１１８１−１１８６；およびＰａｓｓｉｎｉら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６４３７−６４４６）。

【0005】

ＡＡＶベクターの１つの有用な特性は、幾つかのＡＡＶベクターの神経細胞において逆行性および／または順行性輸送される能力にある。ある脳領域のニューロンは、軸索により遠位脳領域に相互連結されており、それ故に、ベクター送達のための輸送系を提供する。例えば、ＡＡＶベクターは、ニューロンの軸索末端またはその付近に投与されてもよい。ニューロンはＡＡＶベクターを取り込み、軸索に沿って細胞体まで逆行性様式で該ベクターを輸送する。アデノウイルス、ＨＳＶおよび偽性狂犬病ウイルスの、脳内の遠位構造へ遺伝子を送達する同様の特性が示されている（Ｓｏｕｄａｓら（２００１）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５：２２８３−２２８５；Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄら（１９９１）Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：２０３−２１８；およびｄｅＦａｌｃｏら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：２６０８−２６１３）。

【0006】

幾つかのグループは、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）による脳の形質導入が頭蓋内注入部位に限定されていることを報告した（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４；Ｐａｓｓｉｎｉら（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６４３７−６４４６；およびＣｈａｍｂｅｒｌｉｎら（１９９８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７９３：１６９−１７５）。最近の報告では、神経向性ウイルスベクターの逆行性軸索輸送が正常ラット脳の選択回路においても生じ得ることが示唆されている（Ｋａｓｐａｒら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：５０−５６（ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ）；Ｋａｓｐｅｒら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：８３９−８４２（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）およびＡｚｚｏｕｚら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４２９：４１３−４１７（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ））。Ｒｏａｕｌら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２３−４２８およびＲａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２９−４３３は、サイレンシングヒトＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）干渉ＲＮＡを発現するレンチウイルスの筋内注入が、ＡＬＳの治療関連齧歯類モデルにおいて筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の発病開始を遅延することを報告している。

【0007】

ＡＡＶベクターにより形質導入された細胞は、治療用トランスジーン産物、例えば、酵素または神経栄養因子を発現し、有益な効果を細胞内で媒介してもよい。これらの細胞は治療用トランスジーン産物を分泌してもよく、その後、該産物は遠位の細胞により取り込まれてもよく、そこで、その有益な効果を媒介してもよい。この過程は相互−補正（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）として記載されている（Ｎｅｕｆｅｌｄら（１９７０）Ｓｃｉｅｎｃｅ １６９：１４１−１４６）。

【0008】

しかし、ヒト患者において運動機能の喪失をもたらす脊髄の機能障害を処置するための組成物および方法がなお必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点もさらに提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の概要
本発明は、トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを対象の脳の深部小脳核（ＤＣＮ）領域の少なくとも１つの領域へ投与することによる、対象の脊髄および／または脳幹領域へトランスジーンを送達するための方法および組成物を提供する。ウイルス送達は、脊髄および／または脳幹領域でのトランスジーンの発現を助ける条件下でのものである。

【0010】

別の態様において、本発明は、トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを対象の脳の運動皮質領域へ投与することによる、対象の脊髄へトランスジーンを送達するための方法および組成物を提供する。ウイルスベクターの送達は、脊髄でのトランスジーンの発現を助ける条件下で実施される。運動皮質領域へ投与されたウイルスベクターは、運動ニューロンによりそれらの細胞体領域を介して取り込まれて、トランスジーンが発現される。次いで、発現されたトランスジーンは、脊髄に存在する運動ニューロンの軸索終末部へ順行性輸送される。運動皮質の性質に起因して、脳のこの領域へ投与されたウイルスベクターも、運動ニューロンの軸索末端により取り込まれてもよい。ウイルスベクターもまた、運動ニューロンの軸索に沿って逆行性輸送されて、運動ニューロンの細胞体にて発現されてもよい。

【0011】

さらに、対象の脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へトランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを投与することによる、対象の運動ニューロンへトランスジーンを送達するための組成物および方法が提供される。ベクターの送達は、投与部位に対して遠位の運動ニューロンにおけるトランスジーンの発現を助ける条件下で実施される。

【0012】

投与部位に対して遠位の運動ニューロンにおけるトランスジーンの発現を助ける条件下で、対象の脳の運動皮質領域へトランスジーンを含む神経向性ウイルスベクターを投与することによる、対象の運動ニューロンへトランスジーンを送達するための方法および組成物も提供される。

【0013】

別の一の態様において、本発明は、対象の脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へ治療用トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを投与することによる、対象における運動ニューロン障害を処置するための組成物および方法を提供する。該投与は、脊髄および／または脳幹領域の少なくとも１つの小区分における治療上有効量のトランスジーンの発現を助ける条件下で実施される。

【0014】

さらなる一層の一の態様において、本発明は、脊髄および／または脳幹領域の少なくとも１つの小区分における治療上有効量のトランスジーンの発現を助ける条件下で、対象の脳の運動皮質領域へ治療用トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを投与することによる、対象における運動ニューロン障害の徴候を改善するための組成物および方法を提供する。

【0015】

上記の一般的説明および下記の詳細な説明は単なる例示および説明であって、特許請求の範囲に定めた本発明を何ら制限するものではないことが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、脊髄へ治療用ウイルスを輸送するのにＤＣＮがどのように利用され得るかを示す図である。ＤＣＮのアウトラインを示すブラックボックスの内側から始まる線は、脊髄内に局在する細胞体（矢じり）に由来する軸索末端を示す。

【0017】

【図2】図２は、橋−延髄接合部および小脳を通る組織学的横断面の複写であり、ＤＣＮの３つの領域を示す。

【0018】

【図3】図３は、小脳虫部に沿って切断し（矢状断面）、次いで、平板化した小脳、ならびに脊髄を通る水平断面および骨格筋系の概略図である。該図は主要な求心性（入力）経路を示す。

【0019】

【図4】図４は、ＤＣＮの主要な遠心性（出力）経路を示すダイアグラムである。

【0020】

【図5】図５は、入力と出力を連結する大脳皮質における神経回路を図式的に示す。登上繊維は下オリーブに由来し、それ自身が大脳皮質、脊髄および特殊感覚（視覚および聴覚）からの入力を受け取る。苔状繊維入力は、全ての他の求心性神経、例えば、前庭求心性神経、脊髄求心性神経、筋紡錘、ゴルジ腱紡錘、関節受容器、皮膚受容器および大脳皮質に由来する。内在系には、バスケット細胞、ゴルジ細胞および星状細胞を含む３つの種類の抑制性介在ニューロンも存在する。これらは、側方抑制および運動ニューロン機能の微調整に関与する。

【0021】

図２〜５は、ウェブサイト上：ｗｗｗ．ｖｈ．ｏｒｇ／ａｄｕｌｔ／ｐｒｏｖｉｄｅｒ／ａｎａｔｏｍｙ／ＢｒａｉｎＡｎａｔｏｍｙ／Ｃｈ３Ｔｅｘｔ／Ｓｅｃｔｉｏｎ０７．ｈｔｍｌで入手可能なＷｉｌｌｉａｍｓら（２００５）Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ：Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｔｈｅ Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍからの複写である。

【0022】

【図6】図６Ａ〜６Ｅは、ヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型ベクター［（Ａ）２／１、（Ｂ）２／２、（Ｃ）２／５、（Ｄ）２／７および（Ｅ）２／８］をＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へ注入した後の、小脳の矢状断面におけるヒト酸性スフィンゴミエリン（「ｈＡＳＭ」）免疫陽性染色を示す。

【0023】

【図7】図７Ａ〜７Ｅは、深部小脳核から脊髄へのヒト酸性スフィンゴミエリン（「ｈＡＳＭ」）蛋白質輸送を示す。この効果は、ＡＡＶ２／２−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／５−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭで処置したマウスにおいて観察された；（Ａ）ｈＡＳＭ 倍率１０；（Ｂ）ｈＡＳＭ 倍率４０；（Ｃ）共焦点ｈＡＳＭ；（Ｄ）共焦点ＣｈＡＴ；ならびに（Ｅ）共焦点ｈＡＳＭおよびＣｈＡＴ。

【0024】

【図8】図８は、ヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型ベクター（２／１、２／２、２／５、２／７および２／８）を深部小脳核（ｎ＝５／群）へ注入した後の、小脳組織ホモジナートレベルをグラフで示す。同じ文字で関連付けられていない群は、有意に（ｐ＜．０００１）異なる。

【0025】

【図9】図９Ａ〜９Ｇは、ヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型ベクター［（Ａ）２／１、（Ｂ）２／２、（Ｃ）２／５、（Ｄ）２／７および（Ｅ）２／８］をＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へ注入した後の、小脳の矢状断面におけるカルビンジン免疫陽性染色を示す。

【0026】

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、（ＡＡＶ−βｇａｌを注入した）ＡＳＭＫＯ、ＷＴおよびＡＡＶ−ＡＳＭ処置ＡＳＭＫＯマウス（ｎ＝８／群）（１４週齢）における、加速および等速ロータロッドパフォーマンスを示す。同じ文字で関連付けられていない群は有意に異なる。加速ロータロッド試験において、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭを注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したＡＳＭＫＯマウスよりも有意に（ｐ＜．０００９）より長い落下までの滞在時間を示した。等速ロータロッド試験において、ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したマウスよりも有意に（ｐ＜．０００１）より長い落下までの滞在時間を示した。

【0027】

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＡＳＭＫＯ（ｎ＝８）、ＷＴ（ｎ＝８）および両側性ＡＡＶ−ＡＳＭ（ｎ＝５／群）処置マウス（２０週齢）におけるロータロッドパフォーマンスを示す。加速および等速試験の両方において、ＡＡＶ−ＡＳＭ処置マウスは、ＡＳＭＫＯ ＡＡＶ２／１−βｇａｌ処置マウスよりも有意に（ｐ＜．００１）より良好なパフォーマンスを示した。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭを注入したマウスのパフォーマンスは、加速および等速試験の両方において野生型マウスと区別がつかなかった。

【0028】

【図12A】図１２Ａは、深部小脳核領域（内側、中間および外側）と脊髄領域（頸部、胸部、腰部および尾部）との間の関連性を示す。図１２Ｂは、深部小脳核領域（内側、中間および外側）と脳幹領域（中脳、脳橋および髄質）との間の関連性を示す。関連性は矢印で示され、該矢印は、ニューロンの細胞体領域を起点とし、ニューロンの軸索末端領域を終点とする。例えば、ＤＣＮの３つの領域の各々は、脊髄の頸部領域を終点とする軸索を送る細胞体を伴うニューロンを有し、一方で、脊髄の頸部領域はＤＣＮの内側または中間領域のいずれかを終点とする軸索を送る細胞体を有する。

【図12B】図１２Ａは、深部小脳核領域（内側、中間および外側）と脊髄領域（頸部、胸部、腰部および尾部）との間の関連性を示す。図１２Ｂは、深部小脳核領域（内側、中間および外側）と脳幹領域（中脳、脳橋および髄質）との間の関連性を示す。関連性は矢印で示され、該矢印は、ニューロンの細胞体領域を起点とし、ニューロンの軸索末端領域を終点とする。例えば、ＤＣＮの３つの領域の各々は、脊髄の頸部領域を終点とする軸索を送る細胞体を伴うニューロンを有し、一方で、脊髄の頸部領域はＤＣＮの内側または中間領域のいずれかを終点とする軸索を送る細胞体を有する。

【0029】

【図13】図１３は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、脳幹または上部運動ニューロンにおける緑色蛍光蛋白質分布を示す。

【0030】

【図14】図１４は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、脊髄領域における緑色蛍光蛋白質分布を示す。

【0031】

【図15】図１５は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、脳幹におけるグリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）染色における減少を示す。

【0032】

【図16】図１６は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、口部運動核（ｏｒｏｍｏｔｅｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）（三叉神経核、舌下神経核および顔面神経核）内のグリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）染色における減少を示す。

【0033】

【図17】図１７は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、脊髄全体にわたる、グリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）染色における減少を示す。

【0034】

【図18】図１８は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達の後の、中枢神経系（ＣＮＳ）内のＩＧＦ−１ｍＲＮＡの分布を示す。ベータ−アクチンは全ｍＲＮＡレベルと比較するための正対照として用いる。

【0035】

【図19】図１９は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１のＤＣＮ送達が運動ニューロンの生存を促進したことを示す。アスタリスクで示すように、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達に対する、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶで処置したマウスの差異は、統計的に有意（ｐ−値＝０．０１）である。

【0036】

【図20】図２０は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達で処置したマウスにおけるロータロッドパフォーマンス、後肢握力および前肢握力における機能上の改善を示す。

【0037】

【図21】図２１は、ＧＦＰをコードするＡＡＶのＤＣＮ送達と比較した、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶのＤＣＮ送達に媒介される生存の増大を示す。

【0038】

【図22】図２２は、深部小脳核（ＤＣＮ）へＧＦＰ発現ＡＡＶ１ベクターを両側性送達した後の、マウス脳内のＧＦＰ分布を示す。ＤＣＮに加えて、ＧＦＰ陽性染色は嗅球、大脳皮質、視床、脳幹、小脳皮質および脊髄においても観察された。これらの領域の全ては、ＤＣＮからの投射を受けるか、および／またはＤＣＮへ投射を送るかのいずれかである。

【発明を実施するための形態】

【0039】

発明の詳細な説明
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は発明の詳細な説明を通して示される。

【0040】

別記しない限り、本発明の実施には、当業者の範囲内である、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの慣用的技法が利用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＡＮＤ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照のこと。

【0041】

文脈上他のものが明記されない限り、本願明細書および請求の範囲で用いられる単数形は複数への言及を含む。例えば、「細胞」なる用語はその混合物を含む複数の細胞を包含する。

【0042】

本明細書で用いる「含む」なる用語は、組成物および方法が列挙した要素を含むが他のものを排除しないことを意味することが意図される。組成物および方法の定義に用いる「本質的に〜からなる」は、組み合わせに本質的に重要な任意の他の要素を排除することを意味するものとする。故に、本明細書中定義した要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法由来の微量混入物質および医薬上許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、防腐剤等を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程以外のものを排除することを意味するものとする。これらの移行語の各々により定義される実施態様は本発明の範囲内である。

【0043】

範囲を含む全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は近似値であり、０．１の量で（＋）または（−）に変化する。常に明示される訳ではないが、全ての数字表示は、「約」なる用語が先行しているものとして理解されるべきである。また、常に明示される訳ではないが、本明細書中で記載した試薬は単なる例示であり、その等価物は当該分野において知られていることが理解されるべきである。

【0044】

「トランスジーン」なる用語は、細胞に導入され、ＲＮＡに転写され得、所望により、適切な条件下で翻訳および／または発現されるポリヌクレオチドを言う。一の態様において、それは導入された細胞へ所望の特性を付与するか、或いは、所望の治療もしくは診断結果をもたらす。別の態様において、それは、ｓｉＲＮＡのごときＲＮＡ干渉を媒介する分子へ転写されてもよい。

【0045】

ウイルス価に関連して用いられる「ゲノム粒子（ｇｐ）」または「ゲノム等価物」なる用語は、感染性または機能性に関わらず、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含むビリオンの数を言う。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例または例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１−１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２−２７８において記載されているような手段により測定され得る。

【0046】

ウイルス価に関連して用いられる「感染単位（ｉｕ）」「感染性粒子」または「複製単位」なる用語は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３−１９７３において記載されている複製中心アッセイとしても知られている感染中心アッセイにより測定されるような、感染性および複製コンピテント組換えＡＡＶベクター粒子の数を言う。

【0047】

ウイルス価に関連して用いられる「形質導入単位（ｔｕ）」なる用語は、本明細書の実施例または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３−１２４；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（ＬＦＵ ａｓｓａｙ）において記載されているような機能アッセイで測定されるような、機能性トランスジーン産物の産生をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を言う。

【0048】

「治療上の」「治療上有効量」なる用語およびそれらの同族語は、対象における徴候の予防もしくは開始の遅延もしくは改善、或いは神経病理、例えば、ＡＬＳのごとき運動ニューロン疾患に付随する細胞病理の補正のごとき所望の生物学的結果の獲得をもたらすＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡおよび／またはＲＮＡの発現産物の量を言う。「治療的補正」なる用語は、対象における徴候の予防もしくは開始の遅延もしくは改善をもたらす補正の程度を言う。有効量は既知の実験方法により測定され得る。

【0049】

「組成物」は、活性物質および他の担体の組み合わせ、例えば、化合物または組成物、不活性（例えば、検出可能な物質もしくは標識）または活性物質、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、バッファー、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバント等を含むことも意図される。担体は、医薬賦形剤および添加剤、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質および糖質（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖およびオリゴ糖を含む糖；誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖等；および多糖または糖ポリマー）も含み、これらは、１〜９９．９９重量もしくは容積での単独もしくは組み合わせを含む、単独あるいは組み合わせとして提供され得る。例示的な蛋白質賦形剤は、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼイン等を含む。緩衝能において機能し得る代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等を含む。糖質賦形剤も本発明の範囲内に含まれ、例えば、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等；二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；およびアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールを含むが、これらに限定されない。

【0050】

担体なる用語は、バッファーまたはｐＨ調整剤をさらに含む。典型的には、バッファーは有機酸または塩基から調製された塩である。代表的なバッファーは、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸もしくはフタル酸の塩；トリス、トロメタミン塩酸塩またはリン酸バッファーを含む。さらなる担体は、ポリマー賦形剤／添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば、シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−クアドラチュア（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）−シクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香料、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、静電気防止剤、界面活性剤（例えば、ポリソルベート、例えば、「ＴＷＥＥＮ２０」および「ＴＷＥＥＮ８０」）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む。

【0051】

本明細書で用いる「医薬上許容される担体」なる用語は、任意の標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水およびエマルジョン、例えば、油／水もしくは水／油エマルジョンおよび様々な種類の湿潤剤を包含する。組成物は、安定化剤および防腐剤および任意の上記した担体を含むが、ただし、それらはさらにインビボでの使用に許容され得るものである。担体、安定化剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ．ＳＣＩ．，１５ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５）およびＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５）および“ＰＨＹＳＩＣＩＡＮ’Ｓ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ”，５２^ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（１９９８）を参照のこと。

【0052】

本明細書中、「対象」、「個人」または「患者」は同義的に用いられ、脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトを言う。哺乳類は、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、競技用動物およびペットを含むが、これらに限定されない。

【0053】

「対照」は、比較目的のために実験において用いられる補助的な対象または試料である。対照は「正」または「負」であり得る。例えば、実験の目的が特定の型の病変（例えば、上記のＡＬＳを参照のこと）と改変された遺伝子発現レベルとの相関を測定することである場合、一般的に、陽性対照（かかる改変を有し、その疾患に特徴的な症状を呈している対象または該対象に由来する試料）および負対照（改変された発現およびその疾患の臨床症状を欠失している対象または該対象に由来する試料）を用いることが好ましい。

【0054】

遺伝子に適用される「示差的に発現される」は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡまたは遺伝子によりコードされる蛋白質産物の示差的な産生を言う。示差的に発現された遺伝子は、正常または対照細胞の発現レベルと比較して、過剰発現または過小発現されていてもよい。一の態様において、それは、対照試料において検出される発現レベルよりも少なくとも１．５倍、または少なくとも２．５倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高いまたは低い示差を言う。「示差的に発現される」なる用語は、対照細胞においてサイレントである場合に発現されているか、または対照細胞において発現されている場合には発現されていない、細胞または組織のヌクレオチド配列も言う。

【0055】

本明細書で用いる「調節する」なる用語は、効果または結果の量または強さを変化する、例えば、高める、増強する、弱める、または軽減することを意味する。

【0056】

本明細書で用いる「改善する」なる用語は、「緩和する」と同義であり、低下すること、または軽減することを意味する。例えば、疾患または障害の徴候をより耐えられるものにすることにより改善してもよい。

【0057】

遺伝子導入がＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）により媒介される態様において、ベクターコンストラクトは、ウイルスゲノムまたはその部分およびトランスジーンを含むポリヌクレオチドを言う。アデノウイルス（Ａｄｓ）は、５０を超える血清型を含む、比較的よく特徴付けられたウイルスの同種群である。例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２７０７１を参照のこと。Ａｄｓは成長しやすく、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に、野生型ウイルスの組み換えおよび産生の可能性を軽減するものも構築されている。国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／００６５５およびＷＯ９５／１１９８４を参照のこと。野生型ＡＡＶは宿主細胞のゲノムへの組み込みに高い感染性および特異性を有する。Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６を参照のこと。

【0058】

本発明は、トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へ投与することによる、トランスジーンを対象の脊髄および／または脳幹へ送達する方法を提供し、該送達は、投与部位に対して遠位の部位におけるトランスジーンの発現を助ける条件下で実施される。該送達は、投与部位においてトランスジーンの発現をもたらしてもよい。

【0059】

特に反対の指示がない限り、トランスジーンの発現は、ポリペプチドまたは蛋白質の翻訳に限定されず、トランスジーンポリヌクレオチドの複製および／または転写も含む。

【0060】

別の態様において、本発明は、運動ニューロン障害、例えば、ＡＬＳまたは外傷性脊髄損傷に苦しむ哺乳類における、ＣＮＳの標的細胞、すなわち、ニューロンまたはグリア細胞へ治療用トランスジーン産物を送達する方法を提供する。トランスジーンはＩＧＦ−１をコードしていてもよい。

【0061】

別の態様において、本発明は、トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを脳の運動皮質領域へ投与することによる、対象においてトランスジーンを脊髄へ送達する方法であり、該送達は、投与部位に対して遠位の部位での該トランスジーンの発現を助ける条件下で実施される。

【0062】

さらなる一層の一の態様において、本発明のウイルスベクターは、脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へ投与され、ここで、トランスジーン産物は発現され、対象の脊髄および／または脳幹領域に送達される。

【0063】

別の実施態様において、ウイルスベクターは、脳幹および脊髄運動ニューロンに相互連結した脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域に投与される。これらの標的領域は、運動ニューロンの細胞環境を構成する細胞（例えば、介在ニューロンおよび星状膠細胞）と直接連結する。該投与により、トランスジーン産物は運動ニューロンの細胞環境へ送達され、ここで、該産物が、細胞環境を構成する細胞に対して有益な効果を媒介する。

【0064】

一の実施態様において、本発明は、トランスジーンを含む神経向性ウイルスベクターを対象の脳の運動皮質領域へ投与することによる、対象の運動ニューロンへのトランスジーンの送達または該運動ニューロンにおけるその発現の調節方法であり、該トランスジーンは投与部位に対して遠位の運動ニューロンの領域で発現される。

【0065】

別の一の実施態様において、本発明は、治療用トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを対象の脳の深部小脳核領域の少なくとも１つの領域へ投与することによる、対象における運動ニューロン障害の処置方法であり、該トランスジーンは対象の脊髄の少なくとも１つの小区分で、治療上有効量で、発現される。これらの小区分は、頸部、胸部、腰部または尾部の１または複数を含む（図１、図１２Ａを参照のこと）。トランスジーンは、脳幹、例えば、中脳、脳橋または髄質の少なくとも１つの領域で、治療上有効量で、発現されてもよい（図１２Ｂを参照のこと）。トランスジーンは、対象の脳幹の少なくとも１つの領域および脊髄の少なくとも１つの小区分の両方で、治療上有効量で、発現されてもよい。

【0066】

本発明はまた、治療用トランスジーンを含む組換え神経向性ウイルスベクターを脳の運動皮質領域へ投与することによる、対象における運動ニューロン障害の徴候の改善方法であり、該トランスジーンは、対象の脊髄の少なくとも１つの小区分で、治療上有効量で発現される。これらの小区分は、頸部、胸部、腰部または尾部の１または複数を含む（図１、図１２Ａを参照のこと）。

【0067】

本発明の実施に適する神経向性ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，６７２，３４４号）およびレンチウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。

【0068】

本発明の方法において、任意の血清型のＡＡＶが用いられ得る。特定の実施態様において、ベクターが疾患−易感染性の脳において逆行性軸索輸送され得るか、または易感染性でない脳において軸索輸送され得る限り、任意の血清型のＡＡＶが用いられ得る。本発明の特定の実施態様において用いられるウイルスベクターの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８（例えば、Ｇａｏら（２００２）ＰＮＡＳ，９９：１１８５４−１１８５９；およびＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照のこと）からなる群より選択される。本明細書にて記載したものに加えて、他の血清型が用いられ得る。さらに、偽型ＡＡＶベクターが本明細書に記載の方法において用いられてもよい。偽型ＡＡＶベクターは、第２のＡＡＶ血清型のカプシド中に１つのＡＡＶ血清型のゲノムを含むもの；例えば、ＡＡＶ２カプシドおよびＡＡＶ１ゲノムを含むＡＡＶベクター、またはＡＡＶ５カプシドおよびＡＡＶ２ゲノムを含むＡＡＶベクターである（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら，（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０（２６）：３０７５−８１）。

【0069】

ＡＡＶベクターは、哺乳類に対して非病原性である１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡパルボウイルスに由来する（Ｍｕｚｙｓｃｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９で概説されている）。簡単に言うと、ＡＡＶに基づくベクターは、ウイルスゲノムの９６％を占めるｒｅｐおよびｃａｐウイルス遺伝子を除去し、ウイルスＤＮＡの複製、パッケージングおよび組み込みを開始するために用いられる２つの隣接した１４５塩基対（ｂｐ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を残したものである。ヘルパーウイルスの不在下で、野生型ＡＡＶは、ヒト宿主細胞ゲノムの染色体１９ｑ １３．３に優先的な部位特異性で組み込まれるか、またはそれはエピソームとして発現されたままでもよい。単一のＡＡＶ粒子は、最高５ｋｂまでのｓｓＤＮＡを収容可能であり、故に、トランスジーンおよび調節要素のために約４．５ｋｂを残しており、これは典型的には十分である。しかし、例えば、米国特許第６，５４４，７８５号において記載されているようなトランススプライシング系では、この制限をほぼ２倍にしてよい。

【0070】

一の例示的実施態様において、ＡＡＶはＡＡＶ２またはＡＡＶ１である。多くの血清型のアデノ随伴ウイルス、特に、ＡＡＶ２が広く研究されており、遺伝子療法用ベクターとして特徴付けられている。当業者は、機能性ＡＡＶに基づく遺伝子療法用ベクターの調製に精通しているであろう。ヒト対象へ投与するためのＡＡＶの産生、精製および調製の様々な方法に関する多数の参考文献が多種多様な刊行物で見出され得る（例えば、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照のこと）。さらに、ＣＮＳの細胞を標的するＡＡＶに基づく遺伝子療法は米国特許第６，１８０，６１３号および第６，５０３，８８８号に記載されている。さらなる例示的なＡＡＶベクターは、ヒト蛋白質をコードする組換えＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８血清型ベクターである。

【0071】

本発明の特定の方法において、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたトランスジーンを含む。トランスジーンは、生物活性のある分子をコードし、ＣＮＳにおけるその発現は、神経病変の少なくとも部分的な補正をもたらす。ヒトＡＳＭのゲノムおよび機能性ｃＤＮＡ配列は公開されている（例えば、米国特許第５，７７３，２７８号および第６，５４１，２１８号を参照のこと）。インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）遺伝子は複雑な構造を有し、当該分野においてよく知られている。それは、遺伝子転写物から生じる少なくとも２つの選択的スプライシングによるｍＲＮＡ産物を有する。ＩＧＦ−１ＡまたはＩＧＦ−１Ｅａを含む幾つかの名称で知られている１５３個のアミノ酸ペプチド、およびＩＧＦ−１ＢまたはＩＧＦ−１Ｅｂを含む幾つかの名称で知られている１９５個のアミノ酸ペプチドが存在する。ＩＧＦ−１の成熟形態は７０個のアミノ酸ポリペプチドである。ＩＧＦ−１ＥａおよびＩＧＦ−１Ｅｂの両方が７０個のアミノ酸成熟型ペプチドを含むが、それらのカルボキシ末端伸長の配列および長さは異なる。ＩＧＦ−１ＥａおよびＩＧＦ−１Ｅｂのペプチド配列をそれぞれ配列番号：１および２で示す。ヒトＩＧＦ−１のゲノムおよび機能性ｃＤＮＡならびにＩＧＦ−１遺伝子およびその産物に関するさらなる情報はＵｎｉｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６１８で入手可能である。

【0072】

真核細胞におけるトランスジーン発現のレベルは、概して、トランスジーン発現カセット内の転写プロモーターにより決定される。長期間の活性を示し、組織−およびさらには細胞−特異的なプロモーターが幾つかの実施態様において使用される。プロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８−１５４）、ＣＭＶ／ヒトβ３−グロビンプロモーター（Ｍａｎｄｅｌら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４２７１−４２８４）、ＧＦＡＰプロモーター（Ｘｕら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３−１３３２）、１．８−ｋｂのニューロン−特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ｋｌｅｉｎら（１９９８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５０：１８３−１９４）、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター（Ｍｉｙａｚａｋｉ（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：２６９−２７７）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター（Ｓｈｉｐｌｅｙら（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１００９−１０１８）およびユビキチンプロモーター、例えば、米国特許第６，６６７，１７４号に記載されたようなヒトユビキチンＡ、ヒトユビキチンＢおよびヒトユビキチンＣから単離されたものを含むが、これらに限定されない。発現を長引かせるために、他の調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）（Ｄｏｎｅｌｌｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５０８５−５０９２）またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位がさらにトランスジーンに作動可能に連結されてもよい。

【0073】

幾つかのＣＮＳ遺伝子療法に適用する場合、転写活性を制御する必要があるかもしれない。この目的のために、ウイルスベクターを用いる遺伝子発現の薬理学的調節は、例えば、Ｈａｂｅｒｍａｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１６０４−１６０１１；およびＹｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：８８−９１に記載されているような様々な調節要素および薬剤応答性プロモーターを含めることにより、獲得され得る。

【0074】

本発明の方法において、ウイルスベクターは、ニューロンの末端にある軸索末端とトランスジーンを有するウイルスベクターを含有する組成物とを接触させ、ウイルス粒子を取り込ませ、軸索に沿ってニューロンの細胞体まで細胞内を（逆行性）輸送させ；治療用トランスジーン産物を発現させることにより投与され得、それにより、治療用トランスジーン産物は対象における病変を改善する。運動ニューロン、運動ニューロン環境を構成する細胞（例えば、介在ニューロンおよび星状膠細胞）、またはその両方に対して作用してもよい。特定の実施態様において、組成物中のベクターの濃度は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^９ｔｕ／ｍｌ）；或いは（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１０ｉｕ／ｍｌ）である。

【0075】

本発明のさらなる方法において、ウイルスベクターは、ニューロンの細胞体とトランスジーンを有するウイルスベクターを含有する組成物とを接触させ、ウイルス粒子を取り込ませ、治療用トランスジーン産物を発現させ、軸索に沿ってニューロンの軸索末端まで細胞内を順行性輸送させることにより投与され、それにより、治療用トランスジーン産物は対象における病変を改善する。運動ニューロン、運動ニューロン環境を構成する細胞（例えば、介在ニューロンおよび星状膠細胞）、またはその両方に対して作用してもよい。特定の実施態様において、組成物中のベクターの濃度は、少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^９ｔｕ／ｍｌ）；或いは（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１０ｉｕ／ｍｌ）である。

【0076】

一の態様において、トランスジーンは生物活性のある分子をコードし、ＣＮＳにおけるその発現は神経病変の少なくとも部分的な補正をもたらす。幾つかの実施態様において、治療用トランスジーン産物は、対象におけるＳＯＤの発現を阻害し、それによりＡＬＳの徴候を改善または予防するＲＮＡ分子である。Ｒｏａｕｌら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２３−４２８およびＲａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２９−４３３を参照のこと。

【0077】

これらの方法を実施する一の態様において、トランスジーンは、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、カルビンジンＤ２８、パルブアルブミン、ＨＩＦ１−アルファ、ＳＩＲＴ−２、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＣＢＰ（ｃＡＭＰ応答要素結合蛋白質［ＣＲＥＢ］結合蛋白質）、ＳＭＮ−１、ＳＭＮ−２およびＣＮＴＦ（繊毛様神経栄養因子）からなる群より選択される蛋白質を治療用量で発現する。

【0078】

或いは、トランスジーンは、突然変異型の蛋白質、例えば、ＡＬＳをもたらす突然変異ＳＯＤの発現を阻害する。上記のＲｏａｕｌら（２００５）およびＲａｌｐｈら（２００５）。

【0079】

ヒト脳内の構造の同定については、例えば、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ：Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｔｈｒｅｅ−Ｄｅｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｔｏｍｙ Ｗｉｔｈ ＭＲＩ，ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｐｐｌｙ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｄｅｕｔｅｒｏｎら，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｌａ，１９９９；Ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ，ｅｄｓ．Ｍａｉら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９７；およびＣｏ−Ｐｌａｎａｒ Ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ Ａｔｌａｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ：３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｔａｍａｒａｃｋら，Ｔｈｙｍｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂ．，１９８８を参照のこと。マウス脳内の構造の同定については、例えば、Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照のこと。図１は、脊髄ならびにその４つの小区分：頸部、胸部、腰部および尾部を図式的に示す。

【0080】

本発明は、運動ニューロン損傷に苦しむ対象における運動機能の調節、補正または増強方法を提供する。単なる例示ではあるが、対象は、筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ）、球脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）または外傷性脊髄損傷の１つまたは複数を患っていてもよい。

【0081】

理論に限定されないが、運動ニューロン損傷に付随する病変は、運動ニューロン変性、グリオーシス、ニューロフィラメント異常、皮質脊髄路および前根における有髄繊維の欠損を含む。例えば、２つの発症型：上部運動ニューロン（皮質および脳幹運動ニューロン）に影響を及ぼし、顔面筋、スピーチおよび嚥下に影響を及ぼす延髄での発症；および下部運動ニューロン（脊髄運動ニューロン）に影響を及ぼし、痙攣、全身衰弱、筋萎縮症、麻痺および呼吸不全に反映される肢での発症が認識されている。ＡＬＳでは、対象は延髄および肢での発症の両方を有する。ＰＬＳでは、対象は延髄での発症を有する。

【0082】

理論に限定されないが、本発明の一の実施態様は、治療用分子（例えば、蛋白質またはペプチド）を脊髄の各区分へ提供できることにある。これは、ＡＡＶベクターをＤＣＮへ注入することにより成し遂げられてもよい。さらに、各脊髄区分内の個々の薄膜を標的することが重要であってもよい。薄膜は脳および脊髄の領域内の特異的な小領域である。特定の実施態様では、特定の脊髄区分内の特定の薄膜を標的することが所望されてもよい。運動ニューロン損傷は上部運動ニューロン内にも生じてもよいので、治療用分子（例えば、蛋白質またはペプチド）を脳幹の区分へ提供することが所望されてもよい。一の実施態様において、幾つかのまたは全ての小区分を含む脊髄、ならびに幾つかのまたは全ての小区分を含む脳幹の両方に治療用分子を提供することが所望されてもよい。本発明は、ＡＡＶベクターのＤＣＮへの導入を用いて、上記した治療用分子の脊髄領域（複数も可）および／または脳幹への送達を成し遂げる。図１２Ａは深部小脳核領域と脊髄の間の関連性を示し、一方で、図１２Ｂは深部小脳核領域と脳幹との間の関連性を示す。

【0083】

複雑な運動行為を編成し、実行する能力は、大脳皮質の運動野、すなわち、運動皮質からのシグナルに依存する。運動皮質の指令は２つの経路で伝わる。皮質延髄繊維は、顔面筋を動かす脳幹の運動核を制御し、皮質脊髄繊維は、体幹および肢の筋肉を刺激する脊髄運動ニューロンを制御する。大脳皮質はまた、下行性脳幹経路に作用することにより、脊髄運動活動に間接的に影響を及ぼす。

【0084】

一次運動皮質は、ブロードマン領野の中心前回に沿って局在する（４）。脊髄に投射する皮質ニューロンの軸索は、約１００万個の軸索を含む大きな繊維束である皮質延髄路内を共に走行する。これらの約３分の１は前頭葉の中心前回に由来する。別の３分の１は領域６に由来する。残りは体性感覚皮質内の領域３、２および１に由来し、後角を介する求心性入力の伝達を調節する。

【0085】

皮質脊髄繊維は、皮質延髄繊維と共に走行し、内包後脚を経て、中脳の腹側部に到達する。それらは脳橋において小さな繊維束に分かれ、橋核の間を走行する。それらは髄質において再編成され、延髄錐体を形成する。皮質脊髄繊維の約４分の３が、髄質および脊髄の接合部にある錐体交叉の正中線で交差する。交差した繊維は、外側皮質脊髄路を形成する脊髄の側柱の背側部（背外側柱）に下行する。交差しなかった繊維は、腹側皮質脊髄路として前柱を下行する。

【0086】

皮質脊髄路の背側および腹側区分は、脳幹の外側および内側系として脊髄灰白質のほぼ同じ領域で終結する。背側皮質脊髄路は主に、前角の外側部分の運動核および中間帯の介在ニューロンに投射する。腹側皮質脊髄路は、腹側正中細胞柱および体軸筋を刺激する運動ニューロンを含む中間帯の隣接部分の両側に投射する。図３は主要な求心性（入力）経路を図式的に示す。

【0087】

小脳内の深部は、内側（室頂）核、中間（中位）核および外側（歯状）核と称される、深部小脳核と称される灰白質である。本明細書で用いる「深部小脳核」なる用語はこれらの３領域を集合的に言う。図２は、ＤＣＮの３つの領域を図式的に示す。図４は、ＤＣＮからの主要な遠心性（出力）経路を図式的に示す。図５は、大脳皮質における神経回路を図式的に示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ＤＣＮと脊髄または脳幹との間の各関連性を図式的に示す。

【0088】

所望により、ヒト脳構造は、別の哺乳類の脳の類似構造に関連付けられ得る。例えば、ヒトおよび齧歯類を含む大部分の哺乳類は、内嗅−海馬投射の同様の組織分布の編成を示し、外側および内側内嗅皮質の両方の外側部分にあるニューロンは海馬の背側部または中隔柱に投射し、一方で、腹側海馬への投射は、内嗅皮質の内側部分にあるニューロンから主に生じる（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ ｅｄ．，ｅｄｓ Ｋａｎｄｅｌら，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９１；Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄ．Ｐａｘｉｎｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。さらに、内嗅皮質のＩＩ層細胞は歯状回に投射し、それらは歯状回の分子層の外側３分の２で終結する。ＩＩＩ層細胞からの軸索は海馬のアンモン角領域ＣＡ１およびＣＡ３の両側に投射し、網状層分子層で終結する。

【0089】

一の態様において、開示した方法は、罹患した対象のＣＮＳへ治療用産物をコードするトランスジーンを有する神経向性ウイルスベクターを投与し、投与部位から遠位のＣＮＳ内で治療レベルのトランスジーンを発現させることを含む。加えて、ベクターは、ＣＮＳ障害の処置に有効な生物活性のある分子をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。かかる生物活性のある分子は、天然または突然変異型の全長蛋白質、天然または突然変異型の蛋白質フラグメント、合成ポリペプチド、抗体および抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ’分子を含むがこれらに限定されないペプチドを含んでもよい。生物活性のある分子は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドおよび１本鎖または２本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを含むヌクレオチドを含んでもよい。本明細書で開示した方法の実施において用いてもよい例示的なヌクレオチド技法の総説としては、Ｋｕｒｒｅｃｋ，（２００３）Ｊ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，１６２８−１６４４［ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］；Ｙｕら，（２００２）ＰＮＡＳ ９９（９），６０４７−６０５２［ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］；およびＥｌｂａｓｈｉｒら，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５（２）：１８８−２００［ｓｉＲＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］を参照のこと。

【0090】

一の例示的実施態様において、投与は、高力価ベクター溶液を対象または患者のＤＣＮへ直接注入することにより成し遂げられる。例えば、投与は、内側（室頂）領域、中間（中位）領域および外側（歯状）領域からなる群より選択される脳の１または複数の深部小脳核領域へ直接注入することによる。ＤＣＮは、脳幹および脊髄との広範な遠心性および求心性の関連性を有するために、魅力的な注入部位である。これらの細胞は、ウイルスベクターおよび発現されたトランスジーンを脊髄領域および脳幹領域へ送達するための効果的かつ低侵襲的な手段を提供する。理論に限定されないが、ウイルスベクターは、軸索末端により取り込まれて、脊髄領域および／または脳幹全体にわたって投射しているこれらのニューロンの細胞体まで軸索に沿って逆行性輸送されてもよい。ニューロンの細胞体は、例えば、脊髄の頸部領域で終結する軸索末端終結部を有するＤＣＮにも存在する。これらの細胞体により取り込まれたウイルスベクター、またはウイルスベクターに由来する発現されたトランスジーン、またはその両方は、脊髄頸部領域内の軸索末端終結部に順行性輸送されてもよい。故に、注入部位としてＤＣＮを用いることにより、少量のウイルスベクターのみが注入されるが、これが、脊髄および／または脳幹の１または複数の領域にわたって有意なトランスジーン発現を媒介する。

【0091】

幾つかの実施態様において、方法は、治療レベルのトランスジーン産物が第１の部位に対して遠位のＣＮＳの第２の部位で発現されるように、治療用トランスジーンを有する高力価神経向性ベクターの投与を含む。幾つかの実施態様において、組成物のウイルス価は少なくとも：（ａ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１２ｇｐ／ｍｌ）；（ｂ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^９ｔｕ／ｍｌ）；或いは（ｃ）５、６、７、８、８．４、９、９．３、１０、１５、２０、２５または５０（×１０^１０ｉｕ／ｍｌ）である。さらなる実施態様において、投与は、高力価神経向性ベクター溶液を罹患した脳へ直接実質内注入することにより成し遂げられ、その後、治療レベルのトランスジーンを投与部位から少なくとも２、３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｍで、投与部位に対して遠位、対側性または同側性で発現させる。

【0092】

第１と第２の部位の間の距離は、当該分野において知られているか実施例に記載されている手段、例えば、インサイツハイブリダイゼーションを用いて測定されるような、投与部位（第１の部位）と、検出可能な形質導入の境界である遠位部位（第２の部位）との間の最小距離領域として定義される。大型哺乳類のＣＮＳ内の幾つかのニューロンは、それらの軸索投射のために、遠距離に及んでもよい。例えば、ヒトでは、幾つかの軸索は１０００ｍｍ以上の距離に及んでもよい。故に、本発明の様々な方法において、ベクターは、かかる距離の軸索の全長に沿って軸索を輸送され、親細胞体に到達して、形質導入し得る。

【0093】

ＣＮＳ内のベクター投与部位は、投与部位および標的領域が軸索との連結を有する限り、神経病変の所望の標的領域および関与する脳回路のトポロジーに基づいて選択される。標的領域は、例えば、３−Ｄ定位固定座標を用いて定義され得る。幾つかの実施態様において、投与部位は、注入されるベクターの総量の少なくとも０．１、０．５、１、５または１０％が、少なくとも１、２００、５００または１０００ｍｍ^３の標的領域に遠位で送達されるように選択される。投与部位は、脳の遠位領域に連結する投射ニューロンにより刺激された領域に局在してもよい。例えば、実質黒質および腹側分節領域は、尾状核および被殻（合わせて線条体としても知られている）に高密度の投射を送る。実質黒質および腹側被蓋内のニューロンは、線条体への注入後の、ＡＡＶの逆行性輸送による形質導入のために標的され得る。別の例として、海馬は、脳の他の領域から、十分に定義された予測可能な軸索投射を受ける。他の投与部位は、例えば、脊髄、脳幹（髄質、中脳および脳橋）、中脳、小脳（深部小脳核を含む）、間脳（視床、視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質、または皮質、後頭葉、側頭葉、頭頂葉もしくは前頭葉内）またはそれらの組み合わせ中に局在してもよい。

【0094】

第２の（標的）部位は、第１の（投与）部位に投射するニューロンを含む、脳および脊髄を含むＣＮＳの任意の領域に局在し得る。幾つかの実施態様において、第２の部位は、黒質、延髄、脳幹または脊髄から選択されるＣＮＳの領域内にある。

【0095】

ベクターを特に中枢神経系の特定の領域に、特に、脳の特定の領域に送達するために、定位固定微量注入により投与されてもよい。例えば、手術日に、患者の適当な位置に定位固定フレームベースを固定する（頭蓋内にねじ込む）。定位固定フレームベース（基準点マークと適合するＭＲＩ）を固定された脳は、高分解能ＭＲＩを用いて画像化できる。次いで、ＭＲＩ画像を、定位固定ソフトウェアを実行するコンピューターに転送する。一連の冠状方向、矢状方向および軸方向の画像を用いて、ベクター注入の標的部位および軌道を決定できる。ソフトウェアは、その軌道を定位固定フレームに適する３次元座標に直接翻訳する。侵入部位および所定の深さで埋め込んだニードルの付いた定位固定装置の上にドリルで穴（Ｂｕｒｒ ｈｏｌｅ）を開ける。次いで、医薬上許容される担体中のベクターが注入され得る。次いで、ベクターは、主要な標的部位に直接注入することにより投与され、軸索を介して遠位の標的部位に逆行性輸送される。さらなる投与経路、例えば、直接可視化の下での表面皮質への適用または他の非−定位固定の適用を用いてもよい。

【0096】

加えて、ＤＣＮの各領域はＣＮＳの特定領域を標的するので（図１および図１２Ａおよび１２Ｂを参照のこと）、投与のためのＤＣＮの領域を予め選択することにより、トランスジーンが送達されるＣＮＳの領域を特に標的化できる。当業者には明かであろうが、トランスジーン投与の位置、順序および回数を変化させることにより、多数の投与および標的化送達が成し遂げられ得る。投与されるべき材料の全量および投与されるべきベクター粒子の総数は、遺伝子療法の既知の態様に基づいて、当業者により決定されるだろう。治療有効性および安全性は適切な動物モデルで試験され得る。例えば、様々な十分に特徴付けられた動物モデルがＬＳＤ用に存在し、例えば、本明細書またはＷａｔｓｏｎら（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７６：３８３−４０３；またはＪｅｙａｋｕｍａｒら（２００２）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２８：３４３−３５７ ａｎｄ ＡＬＳ（ｓｅｅ Ｔｕら（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９３：３１５５−３１６０；Ｒｏａｕｌら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２３−４２８およびＲａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２９−４３３）に記載されている。

【0097】

実験用マウスでは、注入されたＡＡＶ溶液の全量は、例えば、１〜５μｌである。ヒト脳を含む他の哺乳類では、量および送達速度は適宜調整される。例えば、霊長類の脳では１５０μｌの量が安全に注入され得ることが示されている（Ｊａｎｓｏｎら（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１３９１−１４１２）。処置は、標的部位あたり一回の注入で構成されてもよく、または、必要な場合には、注入路に沿って繰り返されてもよい。複数の注入部位が用いられ得る。例えば、幾つかの実施態様において、第１の投与部位に加えて、トランスジーンを有するウイルスベクターを含有する組成物が、第１の投与部位に対して対側または同側であり得る別の部位へ投与される。注入は一回または複数回、片側性または両側性であってもよい。

【0098】

高力価ＡＡＶ調製物は、当該分野において知られている技法、例えば、米国特許第５，６５８，７７６号およびＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３に記載されている技法を用いて調製され得る。

【0099】

以下の実施例は本発明の実施態様の説明を提供する。当業者であれば、本発明の精神または範囲を変更することなく、様々な修飾および改変がなされてもよいことを理解するであろう。かかる修飾および改変は本発明の範囲内に包含される。実施例は本発明を限定するものでは決してない。

【実施例】

【0100】

組換えベクターの力価測定
ＡＡＶベクター力価を、ゲノムコピー数（１ミリリットルあたりのゲノム粒子）により測定した。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されたように（Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１−１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２−２７８）、ベクターＤＮＡのＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲに基づいた。簡単に言うと、精製ＡＡＶ−ＡＳＭを、カプシド消化バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１．０ｍＭのＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）で５０℃、１時間処理し、ベクターＤＮＡを放出させた。ＤＮＡ試料を、プロモーター領域、トランスジーンまたはポリＡ配列のごときベクターＤＮＡ中の特異的配列にアニールするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供した。次いで、ＰＣＲ結果を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍにより提供されるようなＲｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ソフトウェアにより定量した。

【0101】

感染性アッセイを用いて、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）のごときアッセイ可能なマーカー遺伝子を有するベクターの力価を測定することができる。ＡＡＶを用いて感受性細胞（例えば、ＨｅＬａまたはＣＯＳ細胞）に形質導入し、β−ガラクトシダーゼベクターで形質導入した細胞のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）での染色またはＧＦＰ形質導入細胞の蛍光顕微鏡検査法のごときアッセイを実施して、遺伝子発現を測定する。例えば、アッセイを以下のように行う：４×１０^４個のＨｅＬａ細胞を、通常の成長培地を用いる２４穴培養プレートの各ウェルに蒔く。接着後、すなわち、約２４時間後、細胞を感染多重度（ＭＯＩ）１０でＡｄ型５に感染させ、段階希釈したパッケージ化ベクターで形質導入し、３７℃でインキュベートする。１〜３日後、広範な細胞変性効果が観察される前に、適切なアッセイ（例えば、Ｘ−ｇａｌ染色または蛍光顕微鏡検査法）を細胞上で行う。β−ガラクトシダーゼのごときレポーター遺伝子を用いる場合、細胞を２％パラホルムアルデヒド、０．５％グルタルアルデヒド中で固定し、Ｘ−ｇａｌを用いてβ−ガラクトシダーゼ活性について染色する。十分に分離した細胞を生じるベクター希釈液をカウントする。各陽性細胞はベクターの形質導入単位（ｔｕ）が１であることを表す。

【0102】

機能性蛋白質の発現は治療関連マウスモデルにおける運動不全を抑止する
ＡＳＭＫＯマウスは、ニーマン・ピック病ＡおよびＢ型の一般に認められたモデルである（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２８８−２９３；Ｊｉｎら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１１８３−１１９１；およびＯｔｔｅｒｂａｃｈ（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：１０５３−１０６１）。ニーマン・ピック病（ＮＰＤ）はリソソーム蓄積症として分類され、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ；スフィンゴミエリンコリンホスホヒドロラーゼ，ＥＣ３．１．３．１２）の遺伝的欠損により特徴付けられる遺伝性神経代謝障害である。機能性ＡＳＭ蛋白質の欠如は、脳全体にわたるニューロンおよびグリアのリソソーム内にスフィンゴミエリン基質の蓄積をもたらす。これにより、周核体において多数の膨張したリソソームが形成され、これは、ＮＰＤ Ａ型の顕著な特徴であり、主要な細胞表現型である。膨張したリソソームの存在は、正常な細胞機能の喪失および罹患した個人に幼児期での死をもたらす進行性の神経変性過程に相関する（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｒｉｖｅｒら，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１，ｐｐ．３５８９−３６１０）。第２の細胞表現型（例えば、さらなる代謝異常）も、リソソームコンパートメント内の高レベルのコレステロール蓄積が顕著である、この疾患に関連する。スフィンゴミエリンはコレステロールに対して強い親和性を有し、ＡＳＭＫＯマウスおよびヒト患者のリソソーム内に多量のコレステロールの隔離をもたらす（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４９７６−４４９８３；Ｓｌｏｔｔｅ（１９９７）Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７７−２９３；およびＶｉａｎａ ｅｔ ｌａ．（１９９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４９９−５０４）。

【0103】

以下の実験により、深部小脳核内への片側性注入後のＡＳＭＫＯマウスにおいて、ヒトＡＳＭ（ｈＡＳＭ）をコードする組換えＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８血清型ベクターのｈＡＳＭ蛋白質を発現し、コレステロール貯蔵病変を補正し、輸送を受け、プルキンエ細胞をレスキューし、および機能的回復を開始する相対能力を評価した。さらなる群のＡＳＭＫＯマウスのＤＣＮへ両側性注入を行い、増大したトランスジーン蛋白質の広がり／発現が行動上の機能回復を改善し得るかを評価した。

【0104】

６６匹の雄ホモ接合性（−／−）酸性スフィンゴミエリナーゼノックアウト（ＡＳＭＫＯ）マウスおよび１６匹の雄野生型同腹子対照を異種交配（＋／−）により繁殖させた。Ｇａｌら（１９７５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ：２９３：６３２−６３６に記載の手段に従うＰＣＲにより、マウスの遺伝子型を同定した。元々の群体からのマウスをＣ５７／Ｂｌ６系統と戻し交配した。動物を１２：１２時間の明：暗サイクルの下で飼育し、自由に食飼および水を摂取させた。全手段は、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコルに基づいて行った。

【0105】

イソフルランで麻酔した後、以下のＡＡＶ血清型ベクター（ｎ＝８／ベクター）：ＡＡＶ１−ＣＭＶ−βｇａｌ、ＡＡＶ１−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ５−ＣＭＶ−ＡＳＭ、ＡＡＶ７−ＣＭＶ−ＡＳＭおよびＡＡＶ８−ＣＭＶ−ＡＳＭの１つをマウス（約７週齢）の深部小脳核（Ａ−Ｐ：ブレグマから−５．７５、Ｍ−Ｌ：ブレグマから−１．８、Ｄ−Ｖ：硬膜から−２．６、切歯棒（ｉｎｃｉｓｏｒ ｂａｒ）：０．０）へ片側性注入した。シリンジポンプに取り付けた１０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、１つの脳あたり全部で１．８６×１０^１０個のゲノム粒子について０．５μｌ／分の速度で、ベクターを送達した。各ベクターの最終注入量は４μｌだった。手術の１時前および２４時間後、鎮痛のために、マウスにケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ；ＳＣ）を投与した。

【0106】

マウスを注入から７週間後に屠殺した（１４週齢）。屠殺時、マウスにユサゾール（ｅｕｔｈａｓｏｌ）（１５０ｍｇ／ｋｇ；ＩＰ）を過剰投与し、直ちに断頭するか（ｎ＝５／群）、または経心的に灌流した（ｎ＝３／群）。断頭したマウスから直ちに脳を取り出し、液体窒素で急速凍結（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）し、３切片（右大脳半球、左大脳半球および小脳）に解体し、ホモジナイズし、ＥＬＩＳＡによりｈＡＳＭについて分析した。灌流マウスからの脳および脊髄を、ヒトＡＳＭ蛋白質発現、フィリピン染色により検出されるコレステロール蓄積、および５０μｍビブラトーム切片のカルビンジン染色を用いるプルキンエ細胞生存のために処理した。ＡＡＶ２／１−βｇａｌ（ｎ＝８）、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭ（ｎ＝５）およびＡＡＶ２／２−ＡＳＭ（ｎ＝５）の両側性注入を受けたＡＳＭＫＯマウス（約７週齢）を、ロータロッド試験の後、２０週齢で屠殺した。当該分野において知られている方法を用いて、Ｓｍａｒｔｒｏｄ（ＡｃｃｕＳｃａｎ）上の運動機能用の加速および等速ロータロッドにより、マウスを試験した。例示的な方法はＳｌｅａｔら（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：９１１７−９１２６に記載されている。図１０および１１は、運動機能回復の測定としてのロータロッド試験の結果を図式的に示す。

【0107】

ＳＶ４０ポリアデニル化配列およびハイブリッドイントロンを有する、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある全長ヒトＡＳＭ ｃＤＮＡを、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２ ＩＴＲ）に由来するＩＴＲを含むプラスミドへクローニングした（Ｊｉｎら（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１１８３−１１９１）。ＡＡＶ型２複製遺伝子に加えて血清型特異的カプシドコーディングドメインを含む一連のヘルパープラスミドを用いて、三重トランスフェクションにより、ハイブリッドベクターを作製した。この戦略により、各血清型−特異的ビリオンへのＡＡＶ２ ＩＴＲベクターのパッケージ化が可能となる（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１−８０１）。このアプローチと共に、ｈＡＳＭ組換えゲノムを用いて、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７およびＡＡＶ２／８を含む様々な血清型の一連のｒＡＡＶ−ｈＡＳＭベクターを作製した。組換えＡＡＶベクターを、イオン交換クロマトグラフィー（血清型２／１、２／２および２／５）（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら（２０００）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２：４４４−５４）、またはＣｓＣｌ遠心分離（血清型２／８および２／７）（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら（２００２）Ｊ．Ｕｒｒｏｌ．７６：７９１−８０１）により精製した。ＣＭＶ配列のＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより、ＡＡＶ−ＡＳＭビリオン粒子（ＤＮＡｓｅ−耐性粒子）の最終力価を測定した（Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１０３１−１０３９）。

【0108】

ヒトＡＳＭ抗体はヒト特異的であり、マウスＡＳＭと交差反応しない。５０ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中で希釈したモノクローナル組換えヒトＡＳＭ（ｒｈＡＳＭ）抗体（２μｇ／ｍｌ）でコーティングしたＣｏｓｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）９０１８プレート（１００μｌ／ウェル）を２〜８℃で一晩インキュベートした。過剰なコーティング抗体を除去し、ブロッキング希釈液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）を３７℃で１時間加えておいた。マイクロプレートウォッシャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を２サイクルで用いてプレートを洗浄した。標準的な希釈バッファー（ＰＢＳ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ，１％ ＨＰ−ＢＳＡ）中に希釈した標準、対照および試料をデュプリケートでピペッティングし、３７℃で１時間インキュベートさせておいた。プレートを上記のように洗浄した。１００マイクロリットルのビオチン化組換えヒトＡＳＭ（ｒｈＡＳＭ）抗体（標準的な希釈バッファー中、１：２０Ｋで希釈）を各ウェルへ加え、３７℃で１時間インキュベートさせておき、次いで、マイクロプレートウォッシャーで洗浄した。次いで、１：１０Ｋで希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＩＬ）を加え（１００μｌ／ウェル）、室温で３０分間インキュベートさせておいた。プレートを上記のように洗浄し、次いで、ＳｕｒｅＢｌｕｅ ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）と共に１５分間３６〜３８℃でインキュベートした。停止液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）で反応を停止させ、次いで、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ３４０ プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ４．３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を用いてデータ分析を完了した。

【0109】

標準としてウシ血清アルブミンを用いるＢＣＡ蛋白質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＩＬ）を用いて、各試料の蛋白質濃度を測定した。

【0110】

０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー中に２％パラホルムアルデヒド、０．０３％グルタルアルデヒド、０．００２％ＣａＣｌ_２を含有するｐＨ６．５の固定剤を用いてマウスを経心的に灌流し、次いで、ｐＨ８．５の同じ固定剤を用いて灌流した。マウスの脳および脊髄を切断し、その後、グルタルアルデヒド不含のｐＨ８．５の固定剤中、４℃で一晩固定した。組織をｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸カリウムバッファー中で洗浄し、３．５％寒天中に包埋し、ビブラトームを用いて５０μｍの矢状断面に切り分けた。

【0111】

脳および脊髄は５０μｍの間隔で矢状方向にビブラトームにより切断した。切片は、ヒトＡＳＭに対する一次抗体（１：２００）を用いて免疫蛍光用に処理した。切片を、ＰＢＳ中の１０％ロバ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中の２％ロバ血清、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中でビオチン化マウス抗−ヒトＡＳＭと共に７２時間インキュベートした。洗浄した後、Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を用いてシグナルを増幅した。Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いてヒトＡＳＭ蛋白質を可視化し、ＳＰＯＴカメラおよびＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて画像を獲得した。

【0112】

初めに、フィリピン複合体（Ｆｉｌｉｐｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００％メタノール中で希釈し、１ｍｇ／ｍｌのストック濃度とした。ストック溶液は−２０℃で４週間安定である。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、用事調製した１０μｇ／ｍｌフィリピンのＰＢＳ中溶液中、暗所で３時間インキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡上、紫外フィルター下でコレステロール蓄積を可視化した。

【0113】

カルシウム結合蛋白質、カルビンジンに対する一次抗体を用いて免疫蛍光用に脳を処理した。切片をリン酸カリウムバッファー（ＫＰＢ）で洗浄し、次いで、リン酸カリウム緩衝生理食塩水（ＫＰＢＳ）でリンスした。次いで、切片をＫＰＢＳ中の５％ロバ血清、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で最高３時間までブロックし、次いで、ＫＰＢＳ中の５％ロバ血清、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびマウス抗−カルビンジン（１：２５００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートした。４℃で７２時間後、切片をＫＰＢＳおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回リンスした。２次抗体、ロバ−抗マウスＣＹ３（１：３３３，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をＫＰＢＳ＋０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に室温で９０分間加えておいた。切片をＫＰＢで洗浄し、次いで、ゲルコーティングしたスライドにマウントした。カルビンジン−陽性細胞を落射蛍光下で可視化した。小脳のプルキンエ細胞を定量化するために、４つの全断面の（ｆｕｌｌ−ｆａｃｅｄ）内側小脳切片を各動物から選択した。カルビンジン−免疫陽性プルキンエ細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、細胞体を２０×の倍率でカウントした。各葉を別々にカウントした。葉ごとに、２つの別個の焦点面をカウントした。細胞が２回カウントされないように、焦点の合った細胞のみをカウントした。

【0114】

初めに、上記したように、ヒトＡＳＭに対する抗体を用いて、免疫蛍光用に５０μｍのビブラトーム切片を処理した。次いで、カルビンジンについて上記したプロトコルを用いて、切片をＰＢＳ中で洗浄し、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；ウサギポリクローナル，１：５００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）で染色した。しかし、ＣＹ３ ２次抗体ではなく、ロバ−抗−ウサギＦＩＴＣ（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いた。初めに、染色を落射蛍光下で可視化し、その後、共焦点顕微鏡を用いて画像を獲得した。

【0115】

フィリピン染色を以下のように定量化した。ＳＰＯＴデジタルカメラ装着のＮｉｋｏｎ Ｅ６００広視野正立型落射蛍光顕微鏡を用いて露光補正した画像を獲得した。初めに、ＡＡＶ２／１−β−ｇａｌ群の画像を獲得し、その露光を用いて全てのさらなる画像を獲得した。分析した各画像は、各半分の脳の長さまでの正中矢状面を示す。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形態学的分析を行った。ＡＡＶ２／１−β−ｇａｌ画像を閾値設定し；確立したら、同じ閾値を全ての画像に用いた。以下の領域：小脳、脳橋、髄質、中脳、大脳皮質、海馬、視床、視床下部および線条体を使用者が手動で選択し、別々に分析した。積分強度を各領域で測定し、特定群の動物の全ての測定値（ｎ＝３／群）を用いて平均値を得た。次いで、処置動物におけるコレステロールの減少を、ノックアウトβ−ｇａｌ注入マウスと比較した積分強度の減少パーセントとして算出した。深部小脳核内へのＡＡＶ−ＡＳＭの片側性注入の後に、小脳（表１）、脳橋、髄質および脊髄の全体にわたって、陽性ｈＡＳＭ免疫染色が観察された。

【0116】

表１
ＡＡＶ血清型の関数としての陽性ｈＡＳＭ染色された領域。＊は、陽性ｈＡＳＭが検出限界より低いにも関わらず、コレステロール病変の補正が生じたことを示す。

【表1】

【0117】

小脳において、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭで処置したマウスは最も広範な（すなわち、同じ矢状断面内の小葉間に広がる）レベルのｈＡＳＭ発現を有し、一方で、ＡＡＶ２／２−ＡＳＭで処置したマウスは最も限局的なレベルのヒトＡＳＭ蛋白質発現を有した。ＡＡＶ２／５−ＡＳＭ、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭで処置したマウスにおけるヒトＡＳＭ蛋白質発現はこれらの２群の中間であった。矢状断面間の内側−外側の広がりは、血清型１および８で処置したマウスで最大であり、血清型２を注入したマウスで最小であった。血清型５および７は、血清型１および２の中間の内側−外側の広がりを示した。小脳の各層（すなわち、分子、プルキンエおよび顆粒）は各ＡＡＶ血清型により形質導入された。しかし、分子層に対する親和性の増大は全血清型について明かであった。プルキンエ細胞形質導入は、血清型１および５で処置したマウスで最大であった。血清型７を注入したマウスは、形質導入されたプルキンエ細胞の数が最も少なかった。血清型８で処置したマウスも形質導入されたプルキンエ細胞の数が少なかったが、血清型１、２、５および７と比較すると、顆粒層内のＡＳＭ発現がより少なかった。ＡＳＭで形質導入されたプルキンエ細胞は、正常な細胞構造を有しているようだった。小脳組織ホモジナート中のＥＬＩＳＡによるＡＡＶ媒介ｈＡＳＭ蛋白質発現の定量分析はこれらの免疫組織学的知見を支持する。血清型１および８を注入されたマウスは、他の全てのマウスと比較した場合に、有意（ｐ＜．０００１）に高い小脳ｈＡＳＭ蛋白質レベルを示した。血清型２、５および７を注入したマウスに由来する小脳ｈＡＳＭレベルはＷＴレベル（すなわちバックグラウンド）を超えなかった。予想通り、ヒトＡＳＭは野生型マウスにおいて検出されず−ＥＬＩＳＡで使用したｈＡＳＭ抗体はヒト特異的である。

【0118】

機能性ＡＳＭ蛋白質の不在は、スフィンゴミエリンのリソソーム蓄積、その後の２次代謝欠陥、例えば、異常なコレステロール輸送をもたらす（Ｓａｒｎａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１８７３−１８８０およびＬｅｖｅｎｔｈａｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４４９７６−４４９８）。ストレプトミセス・フィリピネンシス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ）から単離した自家蛍光分子であるフィリピンを用いて、ＡＳＭＫＯマウス脳における遊離コレステロールの蓄積を可視化する。野生型マウス脳はフィリピンで陽性染色されない。全てのＡＡＶ処置マウス（ＡＡＶ２／１−βｇａｌを除く）において、フィリピン染色のクリアランス（表２）はｈＡＳＭ免疫染色陽性の領域と重複し、これは、各血清型ベクターが機能性トランスジーン産物の産生能を有することを示す。

【0119】

表２
ヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型（ｎ＝３／血清型；２／１、２／２、２／５、２／７および２／８）をＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へ小脳内注入した後の選択した脳領域における、ＡＡＶ−βｇａｌで処置したＡＳＭＫＯマウスと比較した、フィリピン（すなわち、コレステロール）クリアランスにおける減少パーセント。

【表2】

【0120】

（Ｐａｓｓｉｎｉら（２００３），“Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ”Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ）により既に報告されているように、フィリピンクリアランスは、注入部位に解剖学的に連結した領域においても生じるが、該領域はｈＡＳＭについて陽性染色されない。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析は、フィリピン染色における減少が、吻側−尾側の軸全体にわたって生じたことを示した。小脳および脳幹において、フィリピンは、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭで処置したマウスにおいて最大限に減少し、一方で、間脳および大脳皮質では、ＡＡＶ２／８−ＡＳＭを注入したマウスは、最大合計レベルのフィリピンクリアランスを有した（表２）。それにも関わらず、これらの結果は、ＡＳＭＫＯマウスＣＮＳにおけるコレステロール貯蔵病変の補正に必要とされるｈＡＳＭのレベルが最小である（すなわち、ｈＡＳＭ免疫蛍光の検出限界未満である）ことを示す。

【0121】

組織学的研究は、ＡＳＭＫＯマウス小脳が急激に劣化することを示す。より具体的には、プルキンエ細胞は８〜２０週齢で徐々に死滅する（Ｓａｒｎａら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１８１３−１８８０およびＳｔｅｗａｒｔら（２００２）“Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ” Ｏｒｌａｎｄ，ＦＬ）。カルビンジンは広く認められているプルキンエ細胞マーカーである。ＡＡＶ−ＡＳＭ処置マウスにおける陽性カルビンジン染色は、ｈＡＳＭのＡＡＶ媒介発現が治療的であることを示唆し得る。本発明者らの全結果は、小脳におけるＡＡＶ媒介ｈＡＳＭ発現がＡＳＭＫＯマウスにおけるプルキンエ細胞死を抑制することを示す（表３）。予想通り、プルキンエ細胞生存は小葉Ｉ−ＩＩＩにおいて存在しなかった；マウスは７週齢で注入され、８週までに、これらの細胞の大部分は既に死滅した。小葉ＩＶ／Ｖにおけるプルキンエ細胞生存は血清型１で処置したマウスで最大であった。小葉ＶＩにおいて、有意なプルキンエ細胞生存はＡＡＶ処置マウスにおいて観察されなかった。小葉ＶＩＩにおいて、血清型５で処置したマウスのみが有意なプルキンエ細胞生存を示した。小葉ＶＩＩＩでは、血清型５および血清型２で処置したマウスがまた有意なプルキンエ細胞生存を示した。小葉ＩＸおよびＸでは、プルキンエ細胞数においてＷＴとＫＯマウス（またはＡＡＶ処置マウス）との間に有意な差異はなかった。これは予期されたものであり、というのも、１４週齢（すなわち、屠殺時）のこれらの小葉内のプルキンエ細胞はＡＳＭＫＯマウスにおいてなお生存しているからである。全小葉にわたって、プルキンエ細胞生存は血清型１、２および５で処置したマウスにおいて最大であり、血清型７および８で処置したマウスにおいて最小だった。

【0122】

表３
ヒトＡＳＭをコードする種々のＡＡＶ血清型（ｎ＝３／血清型；２／１、２／２、２／５、２／７および２／８）をＡＳＭＫＯマウスの深部小脳核へ小脳内注入した後の、ＷＴおよびＡＳＭＫＯマウスの小脳葉Ｉ−Ｘにおけるプルキンエ細胞数。太字のイタリックで示す数字は、ＫＯマウス（すなわち、ＡＡＶ２／１−βｇａｌで処置したマウス）と有意に異なる。ｐ≦．０１．

【表3】

【0123】

加速ロータロッド試験において、ＡＡＶ２／１−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／８−ＡＳＭを片側注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したＡＳＭＫＯマウスよりも、有意に（ｐ＜．０００９）より長い落下までの滞在時間を示した。血清型ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスは野生型マウスと有意に異ならなかった。ＡＡＶ２／２−ＡＳＭおよびＡＡＶ２／５−ＡＳＭを注入したマウスは、ＡＡＶ２／１−βｇａｌを注入したＡＳＭＫＯマウスよりも、より長い落下までの滞在時間を示す傾向があり；一方で、ＡＡＶ２／７−ＡＳＭを注入したマウスはその傾向がなかった。等速ロータロッド試験では、ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスのみが、ＡＡ２／１−βｇａｌを注入したマウスより、有意に（ｐ＜．０００１）より長い落下までの滞在時間を示した。この場合、野生型マウスは、ＡＡ２／１−ＡＳＭを注入したマウスよりも有意に良好なパフォーマンスを示した。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭまたはＡＡＶ２／２−ＡＳＭのいずれかを両側性注入されたＡＳＭＫＯマウスは、加速および等速の両試験について、ＡＳＭＫＯ ＡＡＶ２／１−βｇａｌ処置マウスよりも有意に（ｐ＜．００１）良好なパフォーマンスを示した。ＡＡＶ２／１−ＡＳＭ両側注入マウスは両試験において野生型マウスと同等のパフォーマンスを示した。

【0124】

ＡＡＶ産生ｈＡＳＭがＡＳＭＫＯ ＣＮＳ内で機能的に有効であるか否かを決定するための１つの方法は、コレステロール貯蔵病変−ＮＰＡ疾患の２次代謝欠陥に対するその影響を評価することである。全ＡＡＶ処置マウス（ＡＡＶ２／１−βｇａｌを除く）において、コレステロール貯蔵病変の補正はｈＡＳＭ免疫染色陽性の領域と重複し、これは、各血清型ベクターが機能性トランスジーン産物の産生能を有することを示す。既に示されているように、異常なコレステロール代謝の補正は、注入部位に解剖学的に連結する領域においても生じるが、ｈＡＳＭについて陽性染色されなかった領域においても生じ、これは、コレステロール貯蔵病変の補正に必要とされるｈＡＳＭレベルが最小限であることを示す。これらのｈＡＳＭ組織学的および生化学的結果と一致して、血清型１および８で処置したマウスは、コレステロール貯蔵病変において顕著な減少を示した。血清型２、５および７で処置したマウスも、コレステロール貯蔵病変において減少を示したが、血清型１および８で処置したマウスと同程度ではなかった。

【0125】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療関連モデル
筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ）は、皮質、脳幹および脊髄にある運動ニューロンの選択的損失により特徴付けられる致命的な神経変性疾患である。疾患の進行は、四肢筋、体軸筋および呼吸筋の萎縮に至り得る。運動ニューロン細胞死は、反応性神経膠症、ニューロフィラメント異常、ならびに皮質脊髄路および前根における大きな有髄繊維の有意な欠損に付随する^１−６。ＡＬＳの病因は不明なところが多いが、蓄積の証拠は、特発性（ＳＡＬＳ）および家族性（ＦＡＬＳ）ＡＬＳが多くの類似する病理学的特徴を共有することを示し、故に、いずれかの形態の研究が共通の処置をもたらし得ることが期待される^７。ＦＡＬＳは、診断症状の約１０％を占め、その２０％はＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）における優性遺伝性突然変異に関連する^８。突然変異ヒトＳＯＤ１蛋白質を発現するトランスジェニックマウス（例えば、ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａマウス）は、ＡＬＳの多くの病理学的特徴を再現し、ＡＬＳを研究するために利用可能な動物モデルである^９。ＳＡＬＳでは、興奮性毒、毒物暴露、プロテアソーム機能障害、ミトコンドリア損傷、ニューロフィラメント崩壊および神経栄養支持の欠損を含む無数の病理学的機序が根底にある原因に関係があるとされる^{１０、１１}。

【0126】

現在のところ、ＡＬＳの効果的な治療法は存在していない。インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）のごとき神経栄養因子は、ＡＬＳの処置における潜在的有用性について広く研究されてきた。脳幹および脊髄運動ニューロンに相互連結するＣＮＳの領域へ（軸索輸送可能な）ウイルスベクターを頭蓋内送達させることにより、ＩＧＦ−１のごとき潜在的治療剤を先行技術の手段では標的化が困難であった領域へ投与する手段が提供される。

【0127】

理論に限定されないが、これらの標的領域は必ずしも運動ニューロンと直接的なつながりを有さなくてもよい。すなわち、これらの標的領域が運動ニューロンの細胞環境を単に構成する細胞（例えば、介在ニューロンおよび星状膠細胞）と直接的なつながりを有すれば十分であり得る。この想定は、正常およびＳＯＤ１突然変異−発現細胞の混合体であるキメラマウスでの研究により支持される。これらの実験は、突然変異ＳＯＤ１を発現しない非−神経細胞が変性を遅延し、突然変異を発現する運動ニューロンの生存を有意に長引かせることを示した^１３。さらに、さらなる実験は、運動ニューロンの細胞環境を構成する細胞（例えば、星状膠細胞およびミクログリア）は神経栄養因子の重要な源であることを示し、これらの細胞の損傷（ＡＬＳにおいて病理学上生じるような）が運動ニューロン変性の一因となる根本的な因子の１つであることが示唆される^１１。

【0128】

治療用ウイルスベクターおよび／または発現蛋白質の運動ニューロンの細胞環境への輸送を支持する可能性のあるＣＮＳの領域は、小脳の深部小脳核（ＤＣＮ）である。ＤＣＮは脳幹および脊髄の両方と広範な求心性および遠心性のつながりを有する（図１を参照のこと）^{１４−１９}。軸索輸送能を有するウイルスベクターを用いて神経代謝疾患のマウスモデルにおいてＤＣＮを標的化することにより、脳幹および脊髄の両方においてトランスジーン蛋白質の検出がもたらされる^２０。興味深いことに、トランスジーン蛋白質は、運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）について陽性および陰性の両細胞において検出された。

【0129】

マウスおよびラットにおけるスーパーオキシドジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）遺伝子突然変異の過剰発現は、ヒトにおけるＡＬＳの臨床的および病理学的特徴を再現する。このモデルにおいて徴候の遅延に有効な化合物は、ＡＬＳを患う患者における臨床効果を予測するものであることが示され、故に、この疾患の治療関連モデルとなる。かかるマウスモデルは、Ｔｕら（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９３：３１５５−３１６０；Ｋａｓｐａｒら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：８３９−８４２；Ｒｏａｕｌら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２３−４２８およびＲａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２９−４３３に既に記載されている。

【0130】

故に、現在の実験により、症状のある（すなわち、９０日齢）ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａマウスにおける疾患の進行に対するＡＡＶ−ＩＧＦ−１の両側性ＤＣＮ送達の影響を調べることに努めた。特に、第一の目標は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１の送達が（１）脳幹および脊髄へのベクターおよび／または蛋白質の送達；（２）脳幹および脊髄における神経病変の減少；（３）運動行動機能における改善；ならびに（４）寿命の有意な延長をもたらしたか否かを決定することであった。結果は、脳幹および脊髄に相互連結したＣＮＳの領域へのウイルスベクターの注入が、脳幹および脊髄へ可能性のある治療用トランスジーンを送達するための実行可能なアプローチであることを示す。さらに、本発明者らの結果は、その細胞環境の修正を介して運動ニューロン変性を処置するよう設計される治療薬の開発を支持する。

【0131】

２つの研究をＧ９３Ａ ＳＯＤ１（本明細書中、ＳＯＤ１マウスにおいて言及される、ＳＯＤ１^Ｇ９３Ａ突然変異マウス）において行った。このモデルはヒトＡＬＳを綿密に模倣する。後肢運動障害を伴う進行性運動ニューロン変性が存在し、約９０日齢のマウスで出現する。約１２０〜１２２日で死亡する。各研究は、４つの処置群：１）ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶ血清型１を投与されたマウス（ＡＡＶ１−ＩＧＦ−１）；２）緑色蛍光蛋白質をコードするＡＡＶ血清型１を投与されたマウス（ＡＡＶ１−ＧＦＰ）；３）ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶ血清型２を投与されたマウス（ＡＡＶ２−ＩＧＦ−１）；ならびに４）緑色蛍光蛋白質をコードするＡＡＶ血清型２を投与されたマウス（ＡＡＶ２−ＧＦＰ）を有した。

【0132】

理論に限定されないが、ＩＧＦ−１は、種々のレベルの中枢神経軸におけるその多数の作用に起因して、ＡＬＳを処置するための治療用蛋白質である（Ｄｏｒｅら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９７，２０：３２６−３３１を参照のこと）。脳では：それは、ニューロンおよびグリアのアポトーシスの両方を軽減し、鉄、コルヒチン、カルシウム不安定性、過酸化物およびサイトカインにより誘導される毒性に対してニューロンを保護すると考えられる。それは、神経伝達物質アセチルコリンおよびグルタミン酸の放出も調節すると考えられる。それは、また、ニューロフィラメント、チューブリンおよびミエリン塩基性蛋白質の発現も誘導すると考えられる。脊髄では：ＩＧＦ−１は、ＣｈＡＴ活性を調節し、コリン作用性表現型の喪失を軽減し、運動ニューロンの発芽を強化し、髄鞘形成を増大し、脱髄を阻害し、運動ニューロンの増殖および前駆細胞からの分化を刺激し、シュワン細胞分化、成熟および成長を促進すると考えられる。筋肉では：ＩＧＦ−１は、神経筋接合部におけるアセチルコリン受容体クラスター形成を誘導し、神経筋機能および筋力を増大すると考えられる。この実験では、該蛋白質のＩＧＦ−１Ｅａ形態を利用した。

【0133】

緑色蛍光蛋白質は対照蛋白質として利用され、ＡＡＶベクターの注入を媒介する発現の可視化も可能である。

【0134】

生後９０日で、ＳＯＤ１マウスに、ＡＡＶ組換えベクターを用いて両側性注入した。１つの研究において、注入した用量は１部位あたり約２．０ ｅ１０ ｇｃ／ｍｌだった。特定のマウスを生後約１１０日で屠殺し、その脳および脊髄を、ＧＦＰ染色、免疫組織化学によるＩＧＦ−１発現、ＥＬＩＳＡによるＩＧＦ−１発現、ＲＴ−ＰＣＲによるＩＧＦ−１発現、免疫組織化学によるＣｈＡＴ局所性、グリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）発現、運動ニューロン数、上記したロータロッドでの機能性試験（等速および加速）、握力メーターを用いる前肢および後肢の握力、ならびに生存について分析した。

【0135】

「死亡事象」は、仰向けに置かれた状態から３０秒以内に動物が自力で「元に戻る」ことができない場合か、または動物飼育の専門家により死亡したと判断された場合を言う。「死亡事象」の分類は、評価時に、動物群ごとに（ＧＦＰ対ＩＧＦ−１、盲式）２人で実施された。

【0136】

ＧＦＰは、深部小脳核（ＤＣＮ）へのＧＦＰ発現ＡＡＶベクターの両側性送達の後に、脳幹および脊髄の各区分にわたって検出された（図１３および１４を参照のこと）。図２２は、マウス脳内のＧＦＰ分布を示す。ＤＣＮに加えて、ＧＦＰ陽性染色は、嗅球、大脳皮質、視床、脳幹、小脳皮質および脊髄においても観察された。これらの領域の全ては、ＤＣＮからの投射を受けるか、および／またはＤＣＮへ投射を送るかのいずれかである。加えて、ＧＦＰ陽性繊維および／または細胞は、ＣｈＡＴ陽性細胞に対して近位で観察された。

【0137】

ＩＧＦ−１ｍＲＮＡは、ＡＡＶ１−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ２−ＩＧＦ−１で処置したマウスの脳幹および脊髄の各区分において検出され、これは、ベクターが逆行性輸送されたことを示す（図１８を参照のこと）。ＩＧＦ−１蛋白質は、ＡＡＶ１−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ２−ＩＧＦ−１で処置したマウスの脳幹および脊髄で検出された。口部運動核（ｏｒｏｍｏｔｏｒ ｎｕｃｌｅｉ）（例えば、三叉神経運動核、顔面神経核および舌下神経核）および脊髄の各区分におけるＧＦＡＰ染色の減少は、ＡＡＶ１−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ２−ＩＧＦ−１で処置したマウスにおいて観察された（図１５−１７を参照のこと）。ＧＦＡＰは、ＡＬＳの病理学的特徴であるグリオーシスのマーカーである。ＡＡＶ１−ＩＧＦ−１またはＡＡＶ２−ＩＧＦ１の送達は、ロータロッドおよび握力タスクにおいて有意な機能上の改善をもたらした（図２０を参照のこと）。ＡＡＶ−ＩＧＦ−１、ＡＡＶ２−ＩＧＦ１の送達はまた、ＳＯＤ１マウスの寿命を有意に延長した（図２１を参照のこと。該図では、ＡＡＶ−ＧＦＰ処置マウスでの１２１または１２０日に対して、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処置マウスでは１３３．５または１３４日に生存の中央値が増大している）。図１９は、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１のＤＣＮ送達が運動ニューロンの生存を促進したことを示す。アスタリスクで示すように、ＧＦＰをコードするＡＡＶをＤＣＮ送達したマウスに対する、ＩＧＦ−１をコードするＡＡＶで処置したマウスの差異は、統計的に有意（ｐ−値＝０．０１）である。

【0138】

血清型に関わらず、ＡＡＶ−ＩＧＦ−１処置は運動ニューロン生存を有意に高め、ロータロッドおよび握力試験の両方において運動能力を改善し、寿命を有意に延長した。ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡを用いて、ＩＧＦ−１発現を脳幹および脊髄にわたって検出した。

【0139】

本明細書は、本明細書中で引用した参考文献の教示を照らすことで、十分に理解される。本明細書中の実施態様は本発明の実施態様の説明を提供しており、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。当業者であれば、他の多くの実施態様が本発明に包含されることが容易に理解できよう。本明細書中に引用した全ての文献、特許および生物学的配列は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。出典明示により本明細書に組み込まれた材料が本明細書に矛盾するか、または一致しない範囲内においては、本明細書が任意のかかる材料に優先し得る。本明細書中、任意の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものではない。

【0140】

別記しない限り、特許請求の範囲を含む本明細書中で用いた成分量、細胞培養、処置条件等を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」なる用語で修飾されているものとして理解されるべきである。従って、反対の指示がない限り、数字パラメーターは近似値であり、本発明により獲得が探求されている所望の特性に非常に依存するものであってもよい。別記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる用語は、列挙した各要素に対して言うことが理解されるべきである。当業者は、単なる慣用的実験を用いることで、本明細書中に記載した本発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識または解明することができよう。かかる均等物は添付の特許請求の範囲により包含されるべきことが意図される。

【0141】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]