特許 6887390 植物の生長を向上させるための方法、コーティングおよび細菌ＳＯＳ３株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6887390

(24)【登録日】2021年5月20日

(45)【発行日】2021年6月16日

(54)【発明の名称】植物の生長を向上させるための方法、コーティングおよび細菌ＳＯＳ３株

(51)【国際特許分類】

   A01G 7/00 20060101AFI20210603BHJP

   C05F 11/08 20060101ALI20210603BHJP

   C05F 9/04 20060101ALI20210603BHJP

   A01G 24/20 20180101ALI20210603BHJP

   A01C 1/06 20060101ALI20210603BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20210603BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20210603BHJP

   A01H 5/10 20180101ALN20210603BHJP

【ＦＩ】

   A01G7/00 602Z

   A01G7/00 605Z

   C05F11/08ZNA

   C05F9/04

   A01G24/20

   A01C1/06 Z

   C12N1/20 E

   !C12N15/11 Z

   !A01H5/10

【請求項の数】18

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2017-563236(P2017-563236)

(86)(22)【出願日】2016年6月3日

(65)【公表番号】特表2018-524975(P2018-524975A)

(43)【公表日】2018年9月6日

(86)【国際出願番号】AU2016050453

(87)【国際公開番号】WO2016191828

(87)【国際公開日】20161208

【審査請求日】2019年5月31日

(31)【優先権主張番号】2015902251

(32)【優先日】2015年6月5日

(33)【優先権主張国】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】517419397

【氏名又は名称】サステナブル オーガニック ソリューションズ ピーティーワイ リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＳＴＡＩＮＡＢＬＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ ＰＴＹ ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウエスト ステファン

(72)【発明者】

【氏名】サグレンコ エフゲニー

(72)【発明者】

【氏名】キナエフ ニコライ

【審査官】 大谷 純

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１５−５０２７５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１１０５２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５１１７０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２９５３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PAUNGFOO-LONHIENNE,CHANYARAT，A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth，Microbial Biotechnology，２０１４年，p.142-154

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｇ ２／００− ２／３８、

５／００− ７／０６、

９／２８、

１７／００−１７／０２、

１７／１８、

２０／００−２２／６７、

２４／００−２４／６０

Ａ０１Ｃ １／００− １／０８

Ａ０１Ｈ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １／２０、１５／１１

Ｃ０５Ｆ ９／０４、１１／０８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）双子葉植物、あるいは（ｉｉ）コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質を向上させる方法であって、前記植物に、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む処理剤を適用するステップを含み、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９９％であり、前記細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号３に示されるものであり、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、前記植物の根にバイオフィルムを形成するように構成されており、且つ前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種はバークホルデリア株Ｑ２０８ではない、方法。

【請求項2】

植物の生長を促進する方法であって、
（ｉ）双子葉植物、あるいは（ｉｉ）コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の種子または実生を、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む有効量の処理剤で処理するステップであって、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９９％であり、前記細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号３に示されるものであり、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、前記実生または前記種子から発生した実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されており、且つ前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種はバークホルデリア株Ｑ２０８ではなく、
前記種子または実生を、無土壌生長培地において初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、
前記小植物体を圃場または温室条件に移植するステップと
を含む方法。

【請求項3】

前記無土壌生長培地の少なくとも一部が、前記処理剤を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記小植物体を移植した際には、追加量の前記処理剤で処理された肥料または堆肥を含む土壌において栽培される、請求項２または請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記種子または実生を処理する前記ステップが、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いる併用処理を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種が、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が１００％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記処理剤は、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む肥料組成物である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記肥料組成物は、少なくとも１種の植物栄養素をさらに含む、請求項８または請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも１種の植物栄養素が、堆肥またはコンポストを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１種の植物栄養素が、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群から選ばれる１種または複数種を含む、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

（ｉ）双子葉植物、あるいは（ｉｉ）コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の実生を育成するための方法であって、無土壌生長培地で実生を育成するステップを含み、前記無土壌生長培地は少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種からなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含み、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９９％であり、前記細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号３に示されるものであり、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、前記無土壌生長培地で育成させた実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されており、且つ前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種はバークホルデリア株Ｑ２０８ではない、方法。

【請求項14】

前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種が、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記無土壌生長培地は、少なくとも１種の植物栄養素をさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも１種の植物栄養素が、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群から選ばれる１種または複数種を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

（ｉ）双子葉植物、あるいは（ｉｉ）コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の植物種子を被覆するためのコーティングであって、前記コーティングは、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種からなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含み、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種が、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９９％であり、前記細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号３に示されるものであり、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、前記コーティングで被覆された植物種子から育成された実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されており、且つ前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種はバークホルデリア株Ｑ２０８ではない、コーティング。

【請求項18】

前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）の株である、請求項１７に記載のコーティング。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全般的に、本明細書に記載されている微生物を含む、微生物接種材料、肥料組成物および生長培地に関する。本開示は、また、植物の生長および種子の発芽を促進する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

植物および作物の生産を増強し、貧弱な土壌品質を克服するために肥料を使用することは、広く普及し知れ渡っている。市販の肥料は典型的に、無機化学肥料を含む。このような肥料は、使用に有害となる可能性があり、多くの場合、流出液および地下水における硝酸塩汚染等、環境に損害を与える結果を伴う。したがって、化学肥料の長期使用は、環境持続可能性にマイナスの影響を与え、少なくとも、化学肥料の使用を限定する必要があり、好ましくは、これを避ける必要がある。

【0003】

食糧農業機関（Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ＦＡＯ）の統計（参考文献１）によると、ナス科（例えば、トマト、ジャガイモ）、イネ科（例えば、イネ、コムギおよびトウモロコシ）の作物によって２０１２年に世界中で生じた対価は、米ドルで２０００億を超えると推定された。この産業の否定的側面は、生産の高収量を維持するために、生産者が、過剰量の無機肥料を投入することであり、この行為は、コストがかかり、土壌および収量減退ならびに現場外での（ｏｆｆｓｉｔｅ）汚染をもたらす。次世代農業は、生態学的原理に基づいて、低い経済的および環境的費用で高収量を生じるべきである。これを可能せしめる技術および生み出すための方法論は、未だ開発されていない。

【0004】

窒素およびリンは、植物の生長に必要とされる最も重要な元素に含まれるものであり、現代農業におけるこれらの大量使用は、経済的にも環境的にも高くつく。マメ科植物の場合のように、空気からの窒素の獲得は、農業における多大な利点を有する。植物は、大量の窒素を要求するが、これを空気から直接的に固定化することはできない。植物の生長を促進するために、農産業は、毎年数百万トンの無機窒素肥料を施用して、作物による有機窒素分解の低速を補う。しかし、化学窒素肥料の乱用の経済的および環境的な代償は、環境に強い負の影響を与えるため、世界的な懸念である（参照文献５）。

【0005】

リンも、その可溶性無機形態は大部分が天然では根による取り込みによって利用することができないため、植物生長の主要な限定要因である。自然環境において、リン総量の０．１％のみが、植物の取り込みに利用できる可溶性形態で存在すると推定されている（参照文献６）。この理由から、農業では、作物収量を増加させるために、リン酸塩肥料が広く使用されている。しかし、高品質リン鉱石の世界中で分かっている埋蔵量が、２０５０年までに枯渇し得ることが推定されているため、リン酸塩は、農業使用には非常に高価なものになるであろう（参照文献７）。さらに、その過剰施用は、陸生、淡水および海洋資源における有害な環境的影響をもたらす。施用された肥料の利用効率は、３０％をめったに超えず、リン酸塩肥料の反復した無分別な施用は、土壌肥沃度の損失をもたらす（参照文献８）。これらの要因の全てによって、環境適合性であり、かつ経済的に実行可能な代替戦略の探索を促進することとなった。

【0006】

植物を養うための代替アプローチは、有機肥料（例えば、家畜堆肥およびコンポスト）の施用である。有機肥料は、植物への栄養素の環境に優しい送達手段である。堆肥は、生き物の老廃物である。無機肥料と比較して、有機肥料は、地下水の汚染および土壌栄養素の剥奪を引き起こさず、また、通常、植物の根に肥料やけを起こさない。有機肥料は、土壌構造を健全化し、活力を増強する。多くの有機材料を有する土壌は、より多くの水分および栄養素を保持し、土壌生物の成長および植物の根の発達を促進する。有機肥料の施用に伴う問題は、肥料からの栄養素の放出が遅いことであり、その一方で、無機質の肥料は、通常水溶性であることから、植物が直ちに利用することができる。

【0007】

微生物を含む肥料組成物および植物生長培地（本技術分野では、「バイオ肥料」としても公知）は、従来の化学肥料の代替物としてますます考慮されつつあるものである。将来の農業実践における有望な手段は、植物の生長および活力を増強するための、植物生長促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）に基づくバイオ肥料の施用である（参照文献２および３）。世界的に農産業は、ＳｙｎｇｅｎｔａおよびＭｏｎｓａｎｔｏを含む多数の会社による相当な額の投資により、ＰＧＰＲ技術を活用し始めている（参照文献４）。しかし、ＰＧＰＲの有効性には大きな隔たりがあり、全く利益をもたらさないものから、多大な利益を生じるものまで報告されている。その理由としては、環境要因および作物特異性が、相互作用の成功に重要な役割を果たしていることが挙げられる。しかし、今日まで、バイオ肥料は典型的に、限られた成功をもたらし、多くの場合、現実の農事条件下で効果的であることが立証されてはいない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、少なくとも、依然として、植物生長のための栄養素の提供に有効であり、且つ環境に安全であるおよび／または有害でない、改善された組成物（肥料を含む）および方法に対する需要がある。経済的負荷と共に、環境汚染を低下させるための肥料組成物および／または植物生長培地を提供することは、有益となるであろう。

【0009】

先行技術の刊行物が本明細書において参照されている場合、当該参照は、当該刊行物が、オーストラリア国または他のいずれかの国における本技術分野の一般常識の一部を構成することの承認とはならないことを明確に理解されたい。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の第１の態様では、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽または土壌品質を向上させる方法であって、植物に、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む処理剤を適用するステップを含む方法が提供される。

【0011】

本発明の別の態様では、双子葉植物または単子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質を向上させる方法であって、植物に、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む処理剤を適用するステップを含む方法が提供される。

【0012】

一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に寄託）またはバークホルデリア属のＱ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９６％である。別の実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３またはバークホルデリア属のＱ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％、９８％または９９％である。さらなる実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３またはバークホルデリア属のＱ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が１００％である。細菌ＳＯＳ３は、バークホルデリア属のＱ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が１００％である。細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、配列番号３に示されている。配列番号３に示した配列は、バークホルデリア属のＱ２０８株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列でもある。

【0013】

別の実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属の種、少なくとも１種の植物有益環境（ＰＢＥ）バークホルデリア属の種、またはバークホルデリア属のＰＢＥクレードに属する少なくとも１つの種である（図１を参照）。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、非病原性、特に、非病原性バークホルデリア属の種でもよい。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌である。

【0014】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、（ｉ）大気中窒素に対する固定能、および／または（ｉｉ）植物の根におけるバイオフィルム形成能を有してもよい（またはこれに適合されていてもよい）。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、リン源、特に、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の可溶化のための能力を有してもよい（またはこれに適合されていてもよい）。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、（ｉ）シデロホアの分泌能、および／または（ｉｉ）エチレン産生に対する誘導能を有してもよい（またはこれに適合されていてもよい）。

【0015】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０８０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ２（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０９として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、Burkholderia mimosarum、Burkholderia endofungorum、Burkholderia rhizoxinica、Burkholderia soli、Burkholderia caryophliiおよびBurkholderia caledonicaからなる群から選択される少なくとも１種の細菌でもよい。

【0016】

バークホルデリア属のＱ２０８株（Burkholderia australis、Burkholderia australis Q208、またはバークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８としても公知）は、Ｐａｕｎｇｆｏｏ−Ｌｏｎｈｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（参考文献１０）に記載されている。Ｐａｕｎｇｆｏｏ−Ｌｏｎｈｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．は、サトウキビの変種であるＱ２０８^Ａの根からバークホルデリア属Ｑ２０８株を単離し、バークホルデリア属のＱ２０８株の分離株が、サトウキビ小植物体の生長を促進することを例証した。Ｐａｕｎｇｆｏｏ−Ｌｏｎｈｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．は、バークホルデリア属のＱ２０８株以外の細菌の株についての検討は行っておらず、サトウキビ以外の植物における生長増強機構や、サトウキビまたは他の植物における種子発芽の向上についても検討していない。

【0017】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３およびバークホルデリア属Ｑ２０８株からなる群から選択される少なくとも１種の細菌でもよい。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３からなる群から選択される少なくとも１種の細菌である。別の実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株である。さらなる実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株ではない。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属に属する微生物から単離されたもの、またはこれに由来するものでもよい。

【0018】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、任意の適した供給源から単離されたものでもよい。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、単子葉植物、特に、コムギ、イネまたはトウモロコシから選択される単子葉植物から単離されたもの、またはこれに近接するものでもよい。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、双子葉植物、特に、トマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴまたはジャガイモを含む（またはこれから選択される）双子葉植物から単離されたもの、またはこれに近接するものでもよい。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、植物の根圏、特に、上述の単子葉植物または双子葉植物の根圏から単離されたものでもよい。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、ナス目、特に、ナス科（トマト等）の植物の根圏から単離される。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、トマトの根圏から単離される。

【0019】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種または複数種でもよい。

【0020】

処理剤は、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種との相乗作用をもたらす１種または複数種の追加的な微生物をさらに含んでもよい。１種または複数種の追加的な微生物は、リンを可溶化するものでもよい。例示的な、リンを可溶化する微生物には、Bacillus cereus、Aerobacter、Azotobacter、Aspergilus awamori、Penecillium sp.、Rhizoctonia、Rhizopus、Torula thermophila、SehwannioおよびMyces occidentalisのうちの１種または複数種が含まれる。このような微生物は、追加的なリンを植物に与えるための補助となる。

【0021】

処理剤は、処理組成物でもよい。処理剤（または処理組成物）は、任意の適した形態で存在してもよい。例示的な実施形態では、処理剤（または処理組成物）は、液体、ゲルまたは固体、特に、散布可能な液体、顆粒またはペレットの形態で存在してもよい。

【0022】

処理剤は、少なくとも１種の植物栄養素をさらに含んでもよい。少なくとも１種の植物栄養素は、リン源を含んでもよい。処理剤（または処理組成物）は、リン源を含んでもよい。リン源は、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群のうちの少なくとも１種でもよい。少なくとも１種の植物栄養素は、有機植物栄養素、特に、堆肥またはコンポストを含んでもよい。

【0023】

一実施形態では、処理剤（または処理組成物）は、微生物接種材料（例えば、後述するもの）である。別の実施形態では、処理剤（または処理組成物）は、肥料組成物（例えば、後述するもの）である。さらに別の実施形態では、処理剤（または処理組成物）は、無土壌生長培地（例えば、後述するもの）である。さらなる実施形態では、処理剤（または処理組成物）は、植物種子への適用に適したコーティング（例えば、後述するもの）である。

【0024】

双子葉植物は、任意の適当な双子葉植物であればよい。一実施形態では、双子葉植物は、トマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴおよびジャガイモからなる群のうちの少なくとも１種から選択される。

【0025】

植物に処理剤を適用するステップは、植物の種子または実生に薬剤を適用するステップを含んでもよい。処理剤は、任意の適した仕方で植物に適用してもよい。一実施形態では、処理剤は、種子または実生の根に散布または被覆してもよい。別の実施形態では、処理剤は、植物（特に、種子または実生）に近接する土壌に投与してもよい。さらなる実施形態では、処理剤は、植物（特に、種子または実生）が植えられる生長培地（土壌等）に適用することができる。

【0026】

一実施形態において、種子または実生を処理するステップは、リン源、特に、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群のうちの少なくとも１種による同時処理を含む。

【0027】

本方法は、特に、無土壌生長培地において、処理された種子または実生を育成するステップをさらに含んでもよい。このステップにおいて、処理された種子または実生を、小植物体まで育成してもよい。このステップにおいて、処理された種子または実生は、初期期間育成してもよい。初期期間は、１週間〜６週間である。初期期間は、２週間〜６週間でもよい。一実施形態では、無土壌生長培地の少なくとも一部は、処理剤（または処理組成物）を含む。

【0028】

本方法は、小植物体を圃場または温室条件に移すステップをさらに含んでもよい。一実施形態では、移された小植物体は、肥料または堆肥を含む土壌で栽培される。本方法は、土壌または堆肥を追加量の処理剤（または処理組成物）で処理するステップをさらに含んでもよい。

【0029】

別の態様では、植物生長を促進する方法であって、
双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の種子または実生を、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む有効量の処理組成物（または処理剤）で処理するステップと、
無土壌生長培地において処理された種子または実生を初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、
小植物体を圃場または温室条件に移すステップと
を含む方法が提供される。

【0030】

本発明の本態様の要件は、上述の通りとすることができる。本方法の一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株ではない。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９６％である。

【0031】

別の態様では、植物生長を促進する方法であって、
双子葉植物または単子葉植物の種子または実生を、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む有効量の処理組成物（または処理剤）で処理するステップと、
無土壌生長培地において処理された種子または実生を初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、
小植物体を圃場または温室条件に移すステップと
を含む方法が提供される。

【0032】

本発明の本態様の要件は、上述の通りとすることができる。

【0033】

一実施形態では、無土壌生長培地の少なくとも一部は、処理組成物を含む。

【0034】

別の態様では、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質を向上させるための微生物接種材料であって、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む接種材料が提供される。本発明の本態様の要件は、上述の通りとすることができる。本方法の一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株ではない。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９６％である。

【0035】

しかし、好ましい実施形態では、本発明は、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽または土壌品質を向上させるための微生物接種材料であって、細菌ＳＯＳ１（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０８として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ２（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０９として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、Burkholderia mimosarum、Burkholderia endofungorum、Burkholderia rhizoxinica、Burkholderia soli、Burkholderia caryophliiおよびBurkholderia caledonicaからなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含む接種材料を提供する。

【0036】

少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３およびバークホルデリア属のＱ２０８株からなる群から選択される少なくとも１種の細菌でもよい。一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３からなる群から選択される少なくとも１種の細菌である。別の実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株である。さらなる実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株ではない。接種材料は、バークホルデリア属のＱ２０８株をさらに含んでもよい。

【0037】

微生物接種材料は、コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物、および／または双子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質を向上させるように使用する（または適合されている）ものでもよい。双子葉植物は、上述通りのものでもよい。

【0038】

さらなる態様では、本発明は、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む肥料組成物を提供する。本発明の本態様の要件は、上述の通りとすることができる。

【0039】

一実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３からなる群から選択される少なくとも１種の細菌である。さらなる実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３からなる群から選択される少なくとも１種の細菌である。少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株でもよい。さらなる実施形態では、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、バークホルデリア属のＱ２０８株ではない。

【0040】

肥料組成物は、少なくとも１種の植物栄養素をさらに含んでもよい。少なくとも１種の植物栄養素は、リン源（上述通り）でもよい。少なくとも１種の植物栄養素は、堆肥またはコンポストでもよい。

【0041】

肥料組成物は、任意の適した形態で存在することができる。例示的な実施形態では、肥料組成物は、液体または固体、特に、散布可能な液体、顆粒またはペレットの形態で存在してもよい。肥料組成物は、堆肥またはコンポストを含んでもよく、ペレットの形態で存在してもよい。

【0042】

肥料組成物は、コムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物、および／または双子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質の向上のために使用する（またはこれに適合されている）ものでもよい。双子葉植物は、上述通りのものでもよい。

【0043】

別の態様では、本発明は、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む、実生を育成するための無土壌生長培地に関する。本発明の本態様の要件は、上述の通りとすることができる。

【0044】

無土壌生長培地は、少なくとも１種の植物栄養素をさらに含んでもよい。少なくとも１種の植物栄養素は、リン源を含んでもよい。リン源は、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩からなる群のうちの１種または複数でもよい。

【0045】

無土壌生長培地は、固体、液体またはゲルの形態で存在することができる。

【0046】

本発明のさらなる態様において、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含むコーティングで被覆された被覆植物種子が提供される。

【0047】

植物種子は、単子葉植物、特に、コムギ、イネおよびトウモロコシを含む（またはこれから選択される）単子葉植物のものでもよい。植物種子は、双子葉植物のものでもよい。双子葉植物は、上述通りのものでもよい。

【0048】

コーティングは、植物種子から生じる植物の生長や植物の生産性、もしくは種子の発芽を向上させるためのもの（またはこれに適合されているもの）でもよい。あるいは、植物種子が植えられることになる土壌の土壌品質を改善するためのもの（またはこれに適合されているもの）でもよい。

【0049】

コーティングは、任意の適した形で適用することができる。一実施形態では、コーティングは、少なくとも１種の細菌を含む処理剤（細菌懸濁液等）を種子に散布することにより適用される。別の実施形態では、コーティングは、少なくとも１種の細菌を含む処理剤（細菌懸濁液等）中に種子を浸漬することにより適用される。

【0050】

さらなる実施形態では、コーティングは、ゲル化剤を含む。ゲル化剤は、多糖（アルギン酸塩等）またはガム状の化合物（カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等）を含んでもよい。

【0051】

さらなる態様では、本発明は、植物の生長または土壌の品質を向上させる方法であって、植物に、上述の通り微生物接種材料または肥料組成物を適用するステップを含む方法を提供する。

【0052】

別の態様では、本発明は、コムギ、イネ、トウモロコシから選択される単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数を含む双子葉植物について、植物の生長もしくは種子の発芽もしくは植物の生産性の向上または土壌品質の向上における使用のための微生物接種材料であって、バークホルデリア属に属する微生物から単離されたか、これに由来する、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３またはバークホルデリア属のＱ２０８株を含む接種材料を提供する。本発明のさらなる態様では、コムギ、イネ、トウモロコシのうちの１種もしくは複数を含む単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数を含む双子葉植物について、植物の生長もしくは種子の発芽率もしくは植物の生産性の向上または土壌品質の向上における使用のための微生物接種材料であって、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３の微生物、またはバークホルデリア属に属し、
（ｉ）大気中窒素に対する固定能、および
（ｉｉ）植物の根におけるバイオフィルム形成能
を有する微生物を含む微生物接種材料が提供される。

【0053】

好ましくは、微生物は、リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩に対する可溶化能を有するものである。

【0054】

好ましくは、微生物は、
（ｉｉｉ）シデロホアの分泌能、および／または
（ｉｖ）エチレン産生に対する誘導能
を有するものである。

【0055】

一部の実施形態では、微生物は、バークホルデリア属のＱ２０８株でもよい。

【0056】

一部のさらなる実施形態では、接種材料は、次の細菌種の１種または数種に由来する株、またはいずれかを含む混合物を含んでもよい：細菌ＳＯＳ１（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０８０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ２（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９０９として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、およびBurkholderia caledonica。一実施形態では、当該混合物は、この細菌種との相乗効果をもたらす１種または複数種の追加的な微生物をさらに含んでもよい。１種または複数種の追加的な微生物は、リンを可溶化することができるものである。例示的な、リンを可溶化する微生物には、Bacillus cereus、Aerobacter、Azotobacter、Aspergilus awamori、Penecillium sp.、Rhizoctonia、Rhizopus、Torula thermophila、SehwannioおよびMyces occidentalisのうちの１種または複数種が含まれる。このような微生物は、追加的なリンを植物に与えるための補助となる。

【0057】

本発明のさらなる態様では、バークホルデリア属に属する微生物から単離されたまたはこれに由来する、バークホルデリア・オーストラリスＱ２０８株、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３のうちの１種または複数種を含む微生物接種材料を含む肥料組成物が提供される。

【0058】

本発明の別の態様では、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３の微生物、またはバークホルデリア属に属し、
（ｉ）大気中窒素に対する固定能、および
（ｉｉ）植物の根におけるバイオフィルム形成能
を有する微生物を含む肥料組成物が提供される。

【0059】

好ましくは、微生物は、リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩に対する可溶化能を有している。

【0060】

好ましくは、微生物は、
（ｉｉｉ）シデロホアの分泌能、および／または
（ｉｖ）エチレン産生に対する誘導能
を有している。

【0061】

一部の実施形態では、肥料組成物は、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩のうちの１種または複数種をさらに含んでもよい。

【0062】

一部のさらなる実施形態では、肥料は、堆肥またはコンポストを含む有機肥料をさらに含んでもよい。

【0063】

一部の実施形態では、微生物は、Burkholderia australis Q208、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３のうちの１種または複数種を含んでもよい。

【0064】

一部のさらなる実施形態では、肥料は、次の細菌種のうちの１種または複数種に由来する株、またはいずれかを含む混合物を含んでもよい：細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、およびBurkholderia caledonica。一実施形態では、当該混合物は、この細菌種との相乗効果をもたらす１種または複数種の追加的な微生物をさらに含む。１種または複数種の追加的な微生物は、リンを可溶化することができるものでもよい。例示的な、リンを可溶化する微生物には、Bacillus cereus、Aerobacter、Azotobacter、Aspergilus awamori、Penecillium sp.、Rhizoctonia、Rhizopus、Torula thermophila、SehwannioおよびMyces occidentalisのうちの１種または複数種が含まれる。このような微生物は、追加的なリンを植物に与えるための補助となる。

【0065】

ある実施形態では、肥料は、コムギ、イネ、トウモロコシのうちの１種もしくは複数を含む単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数種を含む双子葉植物における、植物の生長もしくは植物の生産性の向上、または土壌品質の向上のための使用に適合されている。

【0066】

本発明の別の態様では、バークホルデリア属に属する微生物から単離されたまたはこれに由来する、Burkholderia australis Q208株、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３のうちの１種または複数種を含む、実生を育成するための無土壌生長培地が提供される。

【0067】

さらなる態様では、実生を育成および／または発芽させるための無土壌生長培地であって、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３の微生物、またはバークホルデリア属に属し、
（ｉ）大気中窒素に対する固定能、および
（ｉｉ）植物の根におけるバイオフィルム形成能
を有する微生物を含む、無土壌生長培地が提供される。

【0068】

好ましくは、微生物は、リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩に対する可溶化能を有するものである。

【0069】

一部の実施形態では、微生物は、
（ｉｉｉ）シデロホアの分泌能、および／または
（ｉｖ）エチレン産生に対する誘導能
を有してもよい。

【0070】

一部の実施形態では、無土壌生長培地は、リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩のうちの１種または複数種をさらに含んでもよい。

【0071】

一部の実施形態では、生長培地は、次の細菌種のうちの１種または複数種に由来する株、またはいずれかを含む混合物を含んでもよい：細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、およびBurkholderia caledonica。一実施形態では、当該混合物は、この細菌種との相乗効果をもたらす１種または複数種の追加的な微生物をさらに含んでもよい。１種または複数種の追加的な微生物は、リンを可溶化することができる。例示的な、リンを可溶化する微生物は、バチルス・セレウス、アエロバクター属、アゾトバクター属、アスペルギルス・アワモリ、アオカビ属ｓｐ．、リゾクトニア属、クモノスカビ属、トルラ・サーモフィラ、シュワンニオマイセス・オクシデンタリスのうちの１種または複数種を含む。このような微生物は、追加的なリンを植物に与えるための補助となる。

【0072】

一部の実施形態では、生長培地は、Burkholderia australis Q208、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３のうちの１種または複数種を含んでもよい。

【0073】

一部の実施形態では、無土壌生長培地は、イネ、コムギ、トウモロコシのうちの１種もしくは複数を含む単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数種を含む双子葉植物の実生の育成に適合されていてもよい。

【0074】

本発明のさらなる態様では、植物生長を促進する方法であって、
種子または実生を、バークホルデリア属に属する微生物から単離されたまたはこれに由来する、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３およびバークホルデリア属のＱ２０８株のうちの１種または複数種を含む有効量の処理組成物で処理するステップと、
無土壌生長培地において処理された種子または実生を初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、
小植物体を圃場または温室条件に移すステップと
を含む方法が提供される。

【0075】

本発明のさらなる態様では、植物生長を促進する方法であって、
種子または実生を、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３の微生物、またはバークホルデリア属に属し、
ａ．大気中窒素に対する固定能、および
ｂ．植物の根におけるバイオフィルム形成能、
ｃ．処理された種子または実生に対する育成能
を有する微生物を含む有効量の処理組成物で処理するステップを含む方法が提供される。

【0076】

好ましくは、微生物は、リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩に対する可溶化能も有する。

【0077】

一部の実施形態では、微生物は、
（ｉ）シデロホアの分泌能、および／または
（ｉｉ）エチレン産生に対する誘導能
を有してもよい。

【0078】

一部の実施形態では、処理された種子または実生を育成するステップは、
無土壌生長培地において前記種子または実生を初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、小植物体を圃場または温室条件に移すステップと
を含む。

【0079】

一部の実施形態では、無土壌生長培地の少なくとも一部は、処理組成物を含む。

【0080】

一部の実施形態では、初期期間は、１週間〜６週間、より好ましくは、２週間〜６週間に及ぶ。

【0081】

一部の実施形態では、移された小植物体は、有機肥料または堆肥またはコンポストを含む土壌において栽培される。

【0082】

一部の実施形態では、土壌または堆肥を追加量の処理組成物で処理するステップが含まれる。好ましくは、処理組成物で処理するステップは、リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩による同時処理をさらに含む。

【0083】

本方法の一部の実施形態では、処理組成物は、次の細菌種のうちの１種または複数種に由来する株、またはこれらの混合物を含む：細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３、バークホルデリア属のＱ２０８株、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、およびBurkholderia caledonica。一実施形態では、前記混合物は、この細菌種の株との相乗効果をもたらす１種または複数種の追加的な微生物をさらに含む。１種または複数種の追加的な微生物は、リンを可溶化することができる。例示的な、リンを可溶化する微生物は、Bacillus cereus、Aerobacter、Azotobacter、Aspergilus awamori、Penecillium sp.、Rhizoctonia、Rhizopus、Torula thermophila、SehwannioおよびMyces occidentalisのうちの１種または複数種を含む。このような微生物は、追加的なリンを植物に与えるための補助となる。

【0084】

本方法の一部の実施形態では、処理組成物は、Burkholderia australis Q208、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３のうちの１種または複数種を含んでもよい。

【0085】

一部の実施形態では、本方法は、コムギ、イネ、コムギ、トウモロコシのうちの１種もしくは複数を含む単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数を含む双子葉植物のための、植物生長の促進に適合されていてもよい。

【0086】

一部の実施形態では、本方法は、コムギ、イネ、トウモロコシのうちの１種もしくは複数を含む単子葉植物および／またはトマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ、ジャガイモのうちの１種もしくは複数を含む双子葉植物について、種子の発芽を促進するように適合されていてもよい。

【0087】

本願において請求する特定の実施形態の定義を次に示す。

【0088】

本発明の第１の実施形態によると、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽、あるいは土壌品質を向上させる方法であって、前記植物に、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む処理剤を適用するステップを含み、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％であり、前記植物の根にバイオフィルムを形成するように構成されている、方法が提供される。

【0089】

本発明の第２の実施形態によると、以下のステップを含む、植物の生長を促進する方法が提供される。
双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の種子または実生を、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種を含む有効量の処理剤で処理するステップであって、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％であり、且つ前記実生または前記種子から発生した実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されており、
前記種子または実生を、無土壌生長培地において初期期間育成して、小植物体まで育成するステップと、
前記小植物体を圃場または温室条件に移植するステップ。

【0090】

本発明の第３の実施形態によると、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物について、植物の生長、植物の生産性、種子の発芽率または土壌品質を向上させるために使用する微生物接種材料であって、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia heleia、およびBurkholderia bannensisからなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含み、前記少なくとも１種の細菌は、前記微生物接種材料によって処理された種子または土壌を用いて発芽または生長させた植物の根に、バイオフィルムを形成するように構成されている、微生物接種材料が提供される。

【0091】

本発明の第４の実施形態によると、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物に対して使用する、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種からなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含む肥料組成物であって、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％であり、且つ前記肥料組成物によって処理された植物の根にバイオフィルムを形成するように構成されている、肥料組成物が提供される。

【0092】

本発明の第５の実施形態によると、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の実生を育成するために使用する無土壌生長培地であって、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種からなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含み、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種は、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％であり、且つ前記無土壌生長培地で育成させた実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されている、無土壌生長培地が提供される。

【0093】

本発明の第６の実施形態によると、双子葉植物、あるいはコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される単子葉植物の被覆植物種子であって、少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種からなる群から選択される少なくとも１種の細菌を含むコーティングで被覆されており、前記少なくとも１種の植物有益性のバークホルデリア属様の種が、細菌ＳＯＳ３（２０１６年６月２日に受託番号Ｖ１６／０１３９１０として、３２０７ オーストラリア国、ビクトリア州、ポートメルボルン、バーティー・ストリート １／１５３のオーストラリア国立標準研究所に寄託）に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９７％であり、且つ前記被覆植物種子から育成された実生の根にバイオフィルムを形成するように構成されている、被覆植物種子が提供される。

【0094】

本発明の第７の実施形態によると、植物の生長もしくは植物の生産性の向上、または土壌品質の向上のための方法であって、植物に、第３の実施形態に係る微生物接種材料を適用するステップを含む方法が提供される。

【0095】

本明細書に記載されている要件のいずれかを、本発明の範囲内において、任意の組合せで、本明細書に記載されている他の要件のうちいずれか１種または複数種と組み合わせることができる。

【0096】

本発明の様々な実施形態について、次に挙げる図面を参照しつつ説明する。

【図面の簡単な説明】

【0097】

【図1】バークホルデリア属のＰＢＥクレード内における細菌ＳＯＳ１株、細菌ＳＯＳ２株および細菌ＳＯＳ３株の位置を示す、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の系統樹の図である。

【図2】トマト根圏から単離され、１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーであるＯＴＵ１１ｂｕｒｋｈｏｌｄ＿Ｒ：ＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣおよび９２６Ｆ：ＡＡＡＣＴＹＡＡＡＫＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧの使用によってバークホルデリア属として同定された１０の細菌クローンによる系統樹の図である。

【図3】植物の生長および種子の発芽における、植物生長促進細菌の効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0098】

本発明の好ましい要件、実施形態および変種は、本発明の実施に十分な情報を当業者に提供する、次の「実施形態の説明」および「実施例」から認識することができる。次の「実施形態の説明」および「実施例」は、先行する「発明の概要」の範囲を、いかなる範囲においても、限定するものと捉えてはいけない。

【0099】

本発明の少なくとも一部の実施形態は、植物の根圏から細菌B. australis、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２または細菌ＳＯＳ３等の微生物を単離することに関し、本開示は、以前に記述された微生物を単離するための方法を包含する。植物有益性のバークホルデリア属様の種は、（ｉ）大気中窒素の固定、（ｉｉ）植物の根におけるバイオフィルムの形成、（ｉｉｉ）リン脂質および／またはリンタンパク質および／またはリン酸エステルおよび／または糖リン酸および／またはフィチン酸塩の可溶化、（ｉｖ）シデロホアの分泌、および／または（ｖ）エチレン産生の誘導を含む、有益な生理学的特徴およびそのための能力を有してもよい。一部の実験では、植物有益性のバークホルデリア属様の種（B. australis Q208、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３（B. australisおよびその近縁種（Ｂ． ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｑ２０８ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）、即ちＢＡＲＳと表記）と同様の生理学的特徴を示す細菌を含むことができ、ここに含まれうるバークホルデリア属のＰＢＥクレードに属する他の細菌（バークホルデリア属近縁種、即ちＢＲＳとまとめて称する）について、さらに詳細に検討した。ＢＲＳの生理学的特徴は、ＢＡＲＳのものと同様であることが予想される。ＢＡＲＳおよびＢＲＳは、Ｐａｕｎｇｆｏｏ−Ｌｏｎｈｉｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ（参考文献０）に記載されている次のプライマーの使用により同定することができる：ＯＴＵ１１ｂｕｒｋｈｏｌｄ＿Ｒ：（ＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣ）および９２６Ｆ：（ＡＡＡＣＴＹＡＡＡＫＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧ（ＹはＣまたはＴに対応、ＫはＧまたはＴに対応））。

【0100】

本発明者らによって行われた予備実験は、ＢＡＲＳおよびＢＲＳが、ナス科（例えば、トマト、ジャガイモ）、イネ科（例えば、イネ、コムギおよびトウモロコシ）を含む多種多様な植物について、種子の発芽および植物の生長を向上させることを示す。理論に制約されることなく、ＢＲＳおよびＢＡＲＳが、ｉ）分解性の極めて低い、多数の無機および有機化合物由来のリンに対する同化能、ｉｉ）植物におけるエチレン産生誘発能、ならびにｉｉｉ）シデロホア分泌能を有するという理論が立てられる。

【0101】

本出願人らは、ＢＡＲＳおよびＢＲＳが、空気から窒素を固定する能力を有するという理論も立てる。ＢＡＲＳおよびＢＲＳは、根圏に局在し、新たな、まだ明らかになっていない分子経路を経て、大気中の窒素を固定する。

【0102】

本出願人らは、ＢＡＲＳおよびＢＲＳが、有機肥料またはリン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩（ここではＰＲＣと一般的に称される）からリンを抽出する能力を有するという理論も立てる。植物組織および有機肥料（すなわち、堆肥およびコンポスト）は、大量の、分解性が極めて低くい、高リン濃縮化合物を含有する。ＰＲＣは、堆肥およびコンポスト中に非常に豊富に存在するため、これらの化合物を利用するＢＡＲＳおよびＢＲＳの能力は、大量の鉱物リンの需要を低下させて、世界中の農業支出を有意に低下させる大きな可能性を示す。ＢＡＲＳは、植物にはほとんど利用できないが、土壌中に高濃度で存在するいくつかの無機形態のリン（すなわち、リン酸カルシウム）を可溶化することもできる（参照文献９）。

【0103】

本出願人らは、ＢＡＲＳおよびＢＲＳが、植物の根の周りにバイオフィルムを形成して、病原性微生物に対する保護効果を発揮するという理論も立てる。この事象は、病原性微生物による根におけるコロニー形成の可能性を縮小させる。

【0104】

本出願人らは、ＢＡＲＳまたはＢＲＳと植物との共生が、植物におけるエチレンの産生を誘発するという理論も立てる。エチレンは、線虫に対抗する効率的な薬剤である。線虫は、作物のおびただしい損失の原因となる。例えば、イネの根の線虫（ＲＲＮ）であるHirschmanniella oryzaeは、イネの主要有害生物の１つであり、水稲に見られる最も一般的な植物寄生性線虫である。したがって、ＢＡＲＳまたはＢＲＳによる植物の処理は、植物におけるエチレン産生を誘導することにより、植物の線虫に対する抵抗性を高める。

【0105】

植物との共生により、ＢＡＲＳおよびＢＲＳが、シデロホアを分泌することが考えられる。シデロホアは、鉱物から鉄を回収し、この元素の可溶性形態を生成する。多くの植物は、このような微生物シデロホアにより鉄を同化することができる（参考文献１）。よって、これは、容易に利用できる鉄が不十分な土壌において有益となり得る、ＢＡＲＳおよびＢＲＳの別の重要な特徴である。

【0106】

細菌ＳＯＳ１は、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が約９８％である。細菌ＳＯＳ２は、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が約９９％である。細菌ＳＯＳ３は、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８株に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が約１００％である。先行技術で行われた配列解析は、これらの細菌が、Ｔ３ＳＳ３およびＴ４ＳＳをコードする遺伝子の特異的クラスター等の、病原性決定因子を保有しないことを示した。

【0107】

ＢＲＳは、植物根圏もしくは土壌または他の培地中の細菌を、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡプライマーを使用してスクリーニングすることにより、単離することができる。

【0108】

植物を土壌または他の生長培地に移す前の短期間、種子または実生をＢＡＲＳおよびＢＲＳに曝露することができる。一実施形態では、種子または実生は、ＢＲＳまたはＢＡＲＳを含有する懸濁液に浸される。初期期間において細菌懸濁液に種子または実生を短時間浸せば、生長改善および疾患抑制性特徴の惹起に十分である。ＢＲＳまたはＢＡＲＳで処理された種子は、上述したような土壌または無土壌生長培地で発芽させることができる。

【0109】

一部の実施形態では、上述した植物生長を促進する方法は、病原体からの植物の根の保護に頼るものである。本実施形態は、植物の根にバイオフィルムを形成し、植物におけるエチレンの産生を誘導するという、ＢＡＲＳおよびＢＲＳの予想される能力に基づく。バイオフィルムの形成は、細菌および真菌等の他の微生物が、根にコロニー形成するのを妨害する。本方法は、線虫からの植物の保護に役立つエチレンの産生を促進することもできる。

【0110】

本開示は、ＢＲＳおよびＢＡＲＳによる種子、実生、小植物体および植物の処理のための多数の方法、ならびに土壌および水耕栽培用培地へのＢＲＳおよびＢＡＲＳの送達のための組成物を提供する。ある実施形態では、実生は、ＢＲＳまたはＢＡＲＳを含有する、土壌を含まない培地において２〜６週間の期間育成し、続いて圃場または温室条件に移植することができる。本方法は、植物の特定の要求に応じて選択される、最適化された生長培地で実生が生長することを可能にし得る。ＰＲＣは、植物−バークホルデリア属（またはより具体的には、植物−ＢＲＳ）の共生の効率を大きく増加させる添加物でもよい。本方法は、対照植物と比べて、優れた身体的特徴（例えば、より大きな丈および重量）、増加した根系、および優れた健康状態を有する幼若植物を提供することができる。その成果として、植物はより早く成熟期に達し、より優れた収量をもたらすこととなり得る。

【0111】

種子を生長培地に移す前に、種子を散布または浸漬によりＢＲＳまたはＢＡＲＳで処理する、例えば、種子への細菌懸濁液の散布または浸漬等によって処理することができる。本方法は、初期実生期における生長を誘導することができ、これにより、実生の活力が増加され、最終的に、より高い収量をもたらす。

【0112】

あるいは、種子は、アルギン酸塩（２％ｗ／ｖ）またはＣＭＣ（４％ｗ／ｖ）の溶液で被覆することができる。室温で粉末を蒸留水に溶解し、溶液を撹拌し、１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより、溶液を調製することができる。続いて、ＢＲＳを含有する溶液中で種子を被覆し、続いて風乾することができる。

【0113】

処理され得る種子および実生は、イネ、ワタ、コムギ、トウモロコシ、トマト、キュウリ、マメ類、エンドウマメ、ブロッコリー、キャベツ、大豆、カリフラワー、レタス、ダイコン、イチゴ等から選択される、あらゆる種類の単子葉植物種および双子葉植物種の両方を含む。一般に、本発明の活性成分（ＢＲＳまたはＢＡＲＳ）に応答するいかなる種子または実生を本発明に従って処理することができる。

【0114】

本開示は、別の実施形態では、土壌および水耕栽培の、ＢＲＳまたはＢＡＲＳと堆肥またはコンポストとによる併用処理の方法を提案する。農地への動物堆肥またはコンポストの適用は、環境上健全な土壌管理を構成する。細菌は、自身の代謝のために窒素、リンおよび他の化学元素を必要とする。これらの元素を高濃度で含有する有機分子を代謝する能力を有するＢＲＳおよびＢＡＲＳは、自身の発達のためにこの産物を使用するのみならず、有機化学元素を植物が利用できるようにもする。本出願人は、ＢＡＲＳまたはＢＲＳを含有する生長培地への堆肥の添加が、堆肥のみの存在下で育成した植物と比べて、植物の生長および適応度を大幅に向上させることを見出した。

【0115】

ＢＲＳまたはＢＡＲＳは、乾燥ペレットの形態で、公知の農作業に従って堆肥およびコンポストと混合することができる。本方法は、土壌をＢＲＳまたはＢＡＲＳで永続的に強化し、植物の生長および適応度をその全生活環を通じて誘導することができる。

【0116】

ＢＡＲＳまたはＢＲＳとの同時処理に使用することができる別の化合物は、ＰＲＣ（リン脂質、リンタンパク質、リン酸エステル、糖リン酸およびフィチン酸塩）である。ＰＲＣ化合物はいずれも、それぞれ個別に、または種々の組合せで使用することができる。ＢＡＲＳまたはＢＲＳを含有する生長培地へのＰＲＣの添加は、植物生長の初期段階における植物生長および適応度を向上させることができる。ＰＲＣのリストから選ばれた１種または数種の化合物とＢＲＳまたはＢＡＲＳとの組合せは、水耕栽培による育成のための供給培地に含まれてもよい。本開示は、大きな経済的効果をもたらすことが想定される。ＰＲＣ化合物は、相対的に安価な成分であり、リンの再生可能な原料である。植物組織中に大量に存在し、リンの貯蔵源として機能するＰＲＣは、動物堆肥のコンポスト中に高度に存在する。その使用は、リン酸塩鉱石に損害を与えることなく行われる、環境に優しいプロセスである。

【0117】

バークホルデリア属の多様な群を再分類することで、ＰＢＥバークホルデリア属クレードに現在属する微生物を含む別の属が細菌の分類体系に生じる場合がある。バークホルデリア属のＰＢＥ群は、病原性群から分離されており（図１を参照）、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８株および細菌ＳＯＳ３に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９６％である細菌は、ＰＢＥクレードに属する。植物有益性のバークホルデリア属様の種は、このような細菌を含む。現在、この環境クレードには、以下のような代表的な細菌が含まれる：細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２、細菌ＳＯＳ３、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８、Burkholderia sp. Q208、Burkholderia oxyphila、Burkholderia sacchari、Burkholderia ferrariae、Burkholderia silvatlantica、Burkholderia heleia、Burkholderia nodosa、Burkholderia bannensis、Burkholderia tropica、Burkholderia unamae、Burkholderia kururiensis、Burkholderia diazotrophica、Burkholderia tuberum、Burkholderia acidipaludis、Burkholderia caribensis、Burkholderia hospita、Burkholderia terrae、Burkholderia phymatum、Burkholderia sabiae、Burkholderia sartisoli、Burkholderia phenazinium、Burkholderia sediminicola、Burkholderia phytofirmans、Burkholderia ginsengisoli、Burkholderia fungorum、Burkholderia megapolitana、Burkholderia bryophila、Burkholderia terricola、Burkholderia graminis、Burkholderia phenoliruptrix、Burkholderia xenovorans、およびBurkholderia caledonica。図１は、バークホルデリア属のＰＢＥクレード内における、細菌株ＳＯＳ１、ＳＯＳ２およびＳＯＳ３の位置を示す、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の系統樹を提示する。最大複合尤度に基づくノンパラメトリックブートストラップによる近隣結合法（反復抽出１０００回、ＭＥＧＡ ｖ５．０５）を使用して、コンセンサス樹形を推測した。ブートストラップ支持値≧５０％が、教育内部ノード（teach internal node）に示される。太い枝は、ベイジアン事後確率≧０．９０を示す。枝の長さの単位は、部位当たりの置換数で示す。ボックスで囲まれた区域は、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の比較において配列同一性が１００％であるBurkholderia australis Q208の近縁株を示し、この群には、細菌ＳＯＳ３を含む。Burkholderia australis Q208に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が少なくとも９６％である他のあらゆるＰＢＥ細菌が、ＢＲＳ（バークホルデリア属近縁株）として文中に示されており、細菌ＳＯＳ１および細菌ＳＯＳ２はこの群に属する。

【0118】

本明細書および（存在する場合には）特許請求の範囲において、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」を含むその派生語は、記述されている整数のそれぞれを含むが、１個または複数のさらに別の整数が内包されることを除外するものではない。

【0119】

本明細書を通して、「一実施形態」または「ある実施形態」の参照は、当該実施形態に関連して記載されている特定の要件、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。よって、本明細書を通した様々な箇所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照するわけではない。さらに、特定の要件、構造または特徴は、いずれか適した様式で、１種または複数種の組合せにおいて組み合わせることができる。

【0120】

法令を順守しつつ、程度の差はあるが、構造的または方法的な要件に特有の言語で本発明を記載してきた。本明細書に記載されている手段は、本発明を実施するための好ましい形態を含むものであることから、本発明は、ここに示したか記述した特定の要件に限定されないことを理解されたい。したがって、本発明は、当業者によって適切に解釈される（存在する場合には）添付の特許請求の範囲の適正な範囲内において、そのいかなる形態または修飾形についても請求するものである。

【0121】

実施例
以下の実施例は、本発明の１種または複数種の例示的な実施形態を示すことを目的としており、本明細書全体を通した記載に開示した、一般的本質を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例1】

【0122】

微生物株および培養物の維持
微生物株。種子、実生および植物の処理、ならびにバイオ肥料の産生において、次の微生物株を使用した：Burkholderia australis Q208、細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３（ＢＡＲＳ）。細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３は、サトウキビ根圏およびイネ根圏（Burkholderia australis Q208の場合）ならびにトマト根圏（細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３の場合）から単離した。部分的な１６Ｓ ｒＲＮＡのシーケンシングは、これらの株が、植物有益環境（ＰＢＥ）バークホルデリア属クレードに属することを示した。ＤＮＡの完全なシーケンシングにおいて、これらの細菌が、病原性に必要な遺伝子、例えば、Ｔ３ＳＳおよびＴ４ＳＳ系の成分をコードする遺伝子、を欠くことから、非病原性微生物であることが確認された。フィチン酸塩を添加したＲ２Ａ培地において２日間、２８℃で好気的に培養すると、ＢＡＲＳは、非ムコイド状の小型のコロニーおよびムコイド状の大型のコロニーを産生する。細胞は、グラム陰性、非胞子形成性の、卵形から短い桿体（幅が０．４〜０．５μｍおよび長さが１．０±１．３μｍ）であり、単体でまたは対で発生する。生理学的には、この細菌は、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼおよびオキシダーゼ陽性であり、インドールを産生せず、ゼラチンを加水分解せず、グルコースを発酵しない。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は、およそ６３．３ｍｏｌ％である。細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３は、桿状細胞型であり、Ｒ２Ａ培地において白色コロニーを形成し、全縁であり、グラム陰性である。細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３の検査した形態学的および生理学的特徴は、バークホルデリア属の他の代表例と同様のものである、即ち、細胞は、運動性、非発酵性および非蛍光性であり、アンピシリンに対し抵抗性であるが、カナマイシンに対する抵抗性はない。細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３は、アルギニンジヒドロラーゼ試験において陰性である。細菌ＳＯＳ１の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列を配列番号１に示し、細菌ＳＯＳ２の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列を配列番号２に示し、細菌ＳＯＳ３の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ配列を配列番号３に示した。

【0123】

配列番号１ − 細菌ＳＯＳ１
ＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＡＴＡＣＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＣＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＧＴＣＧＧＧＴＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＧＡＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＧＴＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＴＣＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＣＮＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＧ

【0124】

配列番号２ − 細菌ＳＯＳ２
ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＣＴＣＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＴＡＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＴＣＣＣＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＡＣＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＣＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＴＧＣＡＣＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＡＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴ

【0125】

配列番号３ − 細菌ＳＯＳ３
ＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＧＧＡＴＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＣＧＴＣＣＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＡＣＧＴＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＣＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＡＣＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＴＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡ

【0126】

培養物の維持。これらの株を３０％グリセロールストックとして−８０℃で貯蔵する。短期貯蔵には、Ｒ２Ａ−寒天プレートで株を維持する。培養物は、慣例として２８℃で２日間育成し、プレート上に新たに育成されたコロニーは４℃で維持し、４週間毎に継代培養する。

【実施例2】

【0127】

植物有益性の、バークホルデリア属様の種の単離
Burkholderia australis Q208の近縁株（ＢＡＲＳ）を次の方法で単離した。サトウキビまたはイネの根を集めたもの１０ｇ（Burkholderia australis Q208用）、あるいはトマトの根を集めたもの１０ｇ（細菌ＳＯＳ１、細菌ＳＯＳ２および細菌ＳＯＳ３用）を、１０ｍｌの無菌リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．２と共にジューサー（Ｂｒｅｖｉｌｌｅ社製）で１分間高速にてホモジナイズした。ホモジナイズした試料を、Ｗｈａｔｍａｎ紙ナンバー１を通して濾過し、濾液で段階希釈系列（１０^−９まで）を作製した。１００μｌの各希釈液を、Ｒ２Ａ最少培地、およびＢＲＳの場合は濃度４ｇ／Ｌのフィチン酸塩を含有する寒天プレート上に広げた。プレートを２８℃で５日間インキュベートした。分離した個々の細菌コロニーを含有するプレートをＰＣＲスクリーニングに使用した。ＢＲＳの同定のために、バークホルデリア属の１６Ｓ ｒＲＮＡ特異的プライマーであるＯＴＵ１１ｂｕｒｋｈｏｌｄ＿Ｒ：ＧＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣおよび９２６Ｆ：ＡＡＡＣＴＹＡＡＡＫＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧを適用した。この方法を使用して、バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８に対する１６Ｓ ｒＲＮＡの配列同一性が９６％〜１００％である１０個の独立したコロニーを単離した（図２）。実験室での実験および植物生長実験の後に、次の３つの種が、最良の植物生長促進結果を示した：細菌ＳＯＳ１（バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８に対する配列同一性が９６％）、細菌ＳＯＳ２（バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８に対する配列同一性が９８％）および細菌ＳＯＳ３（バークホルデリア属ｓｐ．Ｑ２０８に対する配列同一性が１００％）（図２）。全３種の細菌（細菌ＳＯＳ１〜ＳＯＳ３）は、窒素を固定し、フィチン酸塩を可溶化し、植物の根にバイオフィルムを形成することができる。

【実施例3】

【0128】

植物有益性のバークホルデリア属様の種による種子および小植物体の処理
トマト、イネまたはレタスの種子を、１ｍｌ当たりの細胞濃度が１×１０^９個のＢＡＲＳを含有する溶液に１５分間浸した。対照種子は、播種前に純水に１５分間浸した。対照を含む各処理群を３組使用した。水耕栽培、温室栽培または圃場試験に使用される確立された方法に従って、種子または実生を植えた。

【実施例4】

【0129】

水耕栽培用および温室栽培用肥料の組成
有機フィチン酸塩バイオ肥料（「フィトライザー（ｐｈｙｔｏｌｉｓｅｒ）」）の組成。水耕栽培用および温室栽培用のバイオ肥料（「フィトライザー」）は、２成分系である。これは、液状の溶液として、最終濃度が１ｍｌ当たり１×１０^９細胞となる量のＢＡＲＳと、後述する有機物とで構成されている。細菌株を、実施例１に記載されている通りに育成および維持し、凍結乾燥粉末として試験の場へ送達した。試験場においては、細菌を１００ｍｌの純水に移し（濃度１×１０^６にし）、細菌を元に戻すために１時間放置した。必要な化学元素を含有する有機物（フィチン酸塩）は、植物から、またはブタもしくはニワトリの堆肥から製造されたものである。フィトライザーの主成分は、フィチン酸塩であり、これは、植物によって貯蔵され、様々な種類の堆肥、植物および種子に豊富に存在する有機リンを代表するものである。フィトライザーは、植物生長に必要な、有機分子の形態の多数の他の化学元素も含有する。よって、処方中の全無機栄養素は、有機栄養素で置き換えられ、その場合、必要な化学元素は、有機分子の一部である。バイオ肥料中の化学元素の濃度は、表１に示す通り、現行方式の水耕栽培法で使用される平均濃度に対応する。

【0130】

【表1】

【0131】

部分的有機フィチン酸塩肥料の組成。個別の試験において、高精製フィチン酸塩（純度９８％）を、植物生長に必要な他の１０種の化学元素（表１を参照）と混合した（Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＢおよびＭｏ）。イネ小植物体の根を、ＢＡＲＳを含有する溶液に浸し、続いて粗フィチン酸塩溶液を含有する培地における育成を続けた。標準水耕栽培培地で培養した対照植物よりも、当該小植物体は速く育ち、その根は、より太く見えた（図３）。図３において、バーは、非接種植物と比較した増加の％を示す。エラーバーは、同じ処理につき１０回繰り返した結果の標準誤差である。１−根の長さ、２−根の乾燥質量、３−新芽の長さ、４−新芽の乾燥質量、５−種子発芽率。土壌栽培または水耕栽培のいずれかの条件で試験を行った。この肥料は、植物生長を向上させる機会をもたらすが、これらの条件は、完全なる「有機」とは見なされない可能性がある。この処方は、鉱物リン酸塩および窒素を主体とする肥料の使用を避けることも可能にし、これにより、最終産物中の硝酸塩の濃度を最小化する。

【実施例5】

【0132】

圃場適用のためのバイオ肥料の組成およびその調製
バイオ肥料の調製。ＢＡＲＳをアルギン酸塩−フミン酸混合物と均一に混合する。この懸濁液をＣａＣｌ_２の溶液の存在下でカプセル化し、水溶性アルギン酸ナトリウムを不水溶性アルギン酸カルシウムビーズに変換した。次に、ビーズをフィチン酸塩および堆肥の混合物で被覆し、風乾する。このようなバイオ肥料ペレットは、室温で数カ月間貯蔵することができる。ペレットが湿った土壌に適用されると、細菌は、復活および増殖を始める。続いて、根との直接接触することにより、細菌は、根にバイオフィルムを形成し、植物に栄養素を与える。

【0133】

バイオ肥料を産生するためのさらに例示的な方法を次に示す。Ｙｏｕｎｇら（Young CC, Rekha PD, Lai WA, Arun AB. Encapsulation of plant growth-promoting bacteria in alginate beads enriched with humic acid. Biotechnol Bioeng. 2006 Sep 5; 95(1):76-83）に概要が記載されている方法に従って、アルギン酸塩ビーズを調製した。２．５ｍｌの１０％フミン酸および７５０ｍｌの３０％グリセロールの混合物を、２％アルギン酸ナトリウム溶液に添加して、最終容量を２５ｍｌとした。細菌培養物（２５０ｍｌ）を遠心分離し、細胞ペレットを生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ、ｗ／ｖ）で洗浄し、２５ｍｌのアルギン酸塩−フミン酸混合物に懸濁し、均一になるまで混合した。この懸濁液を、２６ゲージの針を通して押し出し、穏やかな撹拌下の予冷した無菌の１．５％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ_２水溶液に滴下した。水溶性アルギン酸ナトリウムを、不水溶性アルギン酸カルシウムビーズへと変換した。このように即時形成されたビーズを室温で３〜６時間硬化させた。ビーズを篩にかけて収集し、滅菌水で数回洗浄した。

【実施例6】

【0134】

トマト、イネおよびレタスの試験
水耕栽培および温室栽培試験。フィトライザー組成物は、実施例４に記載されている通りのものである。トマト、イネおよびレタスの実生または小植物体を、植え付ける前に、実施例３に記載されている通りにＢＡＲＳで処理した。無処理植物を対照として使用した。他の対照には、次のものが含まれた：水耕栽培試験については、水のみ、および市販の無機肥料、温室栽培試験については、水のみ、および市販の肥料ＦｌｏｗＰｈｏｓ（Ｙａｒａ Ｎｉｐｒｏ社製）。全ての試験において、実験植物は、対照植物よりも速く育ち（図３）、ＢＲＳを添加して育成された植物の乾燥質量は、対照植物よりも有意に高かった（最大３０％）。

【0135】

圃場試験。トマト種子および小植物体を圃場試験に使用した。これらは、実施例３の通りに処理したもの、または未処理のもののいずれかであった。次の通りに圃場を準備した。フィチン酸塩を含む有機栄養素の適正濃度を達成するために、ウシ、ニワトリもしくはブタの堆肥、またはこれらの堆肥の種々の組合せを、０．１〜１％ｗ／ｗの範囲内の異なる濃度で土壌と混合する（上部２０〜５０ｃｍ層）。次に、バイオ肥料ペレット（実施例５）を、０．０１〜０．１％ｗ／ｗの範囲内の異なる濃度で土壌に適用する（上部２０〜５０ｃｍ層）。ペレットは、土壌における長期間の細菌保持を可能にし、他の微生物と比較して、その濃度を相対的に高く維持する。この土壌は、細菌処理済みおよび未処理の種子または小植物体の植え付けに使用される（実施例３）。これらの試験のための対照は、市販の無機肥料を従来慣行で使用した未処理の種子および小植物体、ならびに純粋有機肥料を用いた未処理の種子および小植物体であった。圃場試験の結果（図３）は、ガラス温室条件において得られた結果と同様であり、平均乾燥質量は、１０〜３０％増加した。

【実施例7】

【0136】

種子発芽率の向上
トマトおよびトウモロコシの種子を、ＣＭＣ（４％ｗ／ｖ）溶液中の細菌ＳＯＳ１または細菌ＳＯＳ３で被覆した。対照種子は、ＣＭＣ（４％ｗ／ｖ）のみで処理した。土壌栽培条件下に種子を置いた後に、出現した植物の数を計数したところ、発芽率の有意な改善を検出した（図３）。

【0137】

水耕栽培試験：湿った紙が内側に引かれた、プラスチックで覆われたトレー内で、レタスまたはイネの種子の予備発芽を４〜５日間行った。根が、１〜２ｃｍの長さに達したら、１０^７細胞／ｍｌの濃度の細菌を含有する溶液中に実生を浸漬し、バーミキュライトが入った小型のポット内に再配置した。生長溶液を毛細管作用により下方から供給した。移植４週間後に、植物の根および新芽を測定した。水耕栽培用培地は、０．１％フィチン酸塩溶液（５０％フィチン酸塩純度、Ｌｖｙｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｌｔｄ製またはＨｅｎａｎ Ｋｉｎｇｗａｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．製）を含有した。

【0138】

参考文献
参考文献１： http://www.fao.org/statistics/en/
参考文献２： Bhattacharyya PN、Jha DK. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 2012 Apr; 28(4):1327-50. doi: 10.1007/s11274-011-0979-9. Epub 2011 Dec 24. Review. PubMed PMID: 22805914.
参考文献３： Miransari M. Soil microbes and plant fertilization. Appl Microbiol Biotechnol.2011 Dec; 92(5):875-85. doi: 10.1007/s00253-011-3521-y. Epub 2011 Oct 12. Review. PubMed PMID: 21989562.
参考文献４： http://news.monsanto.com/press-release/corporate/monsanto-and-novozymes-team-provide-sustainable-bioagricultural-solutions
参考文献５： Mulvaney RL、Khan SA、Ellsworth TR. Synthetic nitrogen fertilizers deplete soil nitrogen: a global dilemma for sustainable cereal production. J Environ Qual. 2009 Oct 29; 38(6):2295-314. doi: 10.2134/jeq2008.0527. Print 2009 Nov-Dec. Review. PubMed PMID: 19875786.
参考文献６： Sharma SB、Sayyed RZ、Trivedi MH、Gobi TA. Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils. Springerplus. 2013 Oct 31; 2:587. doi: 10.1186/2193-1801-2-587. eCollection 2013. Review. PubMed PMID: 25674415; PubMed Central PMCID: PMC4320215.
参考文献７： Carroll P. Vance、Claudia Uhde-Stone、Deborah L. Allan. Phosphorus acquisition and use: critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource. New Phytologist. (2003) DOI: 10.1046/j.1469-8137.2003.00695.x
参考文献８： Choudhury AT、Kennedy IR、Ahmed MF、Kecskes ML. Phosphorus fertilization for rice and control of environmental pollution problems. Pak J Biol Sci. 2007 Jul 1; 10(13):2098-105. Review. PubMed PMID: 19070168.
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参考文献１０： Paunngfoo-Lonhienne C、Lonhienne TGA、Yeoh YK、Webb RI、Laksmanan P、Chan CX、Lim P-E、Ragan MA、Schmidt S and Hugenholtz P. A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth. Microbial Biotechnology 2014 7(2):142.

【配列表フリーテキスト】

【0139】

配列番号１： 細菌ＳＯＳ１
配列番号２： 細菌ＳＯＳ２
配列番号３： 細菌ＳＯＳ３

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]