知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6887467
(24)【登録日】2021年5月20日
(45)【発行日】2021年6月16日
(54)【発明の名称】ボツリヌス毒素の製造のための培地組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20210603BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20210603BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12P21/02 A
【請求項の数】11
【外国語出願】
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2019-118235(P2019-118235)
(22)【出願日】2019年6月26日
(62)【分割の表示】特願2017-524477(P2017-524477)の分割
【原出願日】2016年4月28日
(65)【公開番号】特開2020-72649(P2020-72649A)
(43)【公開日】2020年5月14日
【審査請求日】2019年7月25日
(31)【優先権主張番号】10-2015-0059655
(32)【優先日】2015年4月28日
(33)【優先権主張国】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517154177
【氏名又は名称】テウン カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＤＡＥＷＯＯＮＧ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100185915
【弁理士】
【氏名又は名称】長山 弘典
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】キム ギョンユン
(72)【発明者】
【氏名】ソル ヘヨン
(72)【発明者】
【氏名】ミン ギョンミン
【審査官】
松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００７−５０６４２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００９−２９７０２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
米国特許出願公開第２０１２／０２３７４９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
特開２０１４−０８３０５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
PNAS，２００９年，Vol. 106, No. 32，pp. 13225-13229
【文献】
和光純薬時報，２００９年，Vol. 77, No. 3，pp. 25
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １／２０
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
莢豌豆加水分解物、綿実加水分解物および小麦グルテン加水分解物を、重量を基準に１：０．２４〜４３．６２：０．０１〜５０．５７で含む植物性ペプトンとカゼイン加水分解物とを含むクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項2】
前記植物性ペプトンの含有量は、０．１〜１０ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項１に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項3】
前記カゼイン加水分解物の含有量は、０．２２〜１５．５ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項１又は２に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項4】
前記カゼイン加水分解物は、５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有する加水分解物および／または５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有する加水分解物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項5】
前記カゼイン加水分解物が５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有する加水分解物および５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有する加水分解物を全て含む場合、５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有する加水分解物および５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有する加水分解物の含有量比は、重量を基準に０．０１〜４０：０．０１〜２２であることを特徴とする請求項４に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項6】
前記植物性ペプトンまたはカゼイン加水分解物は、酵素処理されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項7】
前記クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物は、炭素源とＫ２ＨＰＯ４（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＫＨ２ＰＯ４（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で構成された群から選択される一つ以上のミネラルとをさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項8】
前記ミネラルの含有量は、０．０５〜３．５ｗ／ｖ％であることを特徴とする請求項７に記載のクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物。
【請求項9】
下記段階を含むボツリヌス毒素の製造方法：
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の培地組成物を利用してクロストリジウム・ボツリヌスを培養してボツリヌス毒素を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたボツリヌス毒素を回収する段階。
（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の培地組成物を利用してクロストリジウム・ボツリヌスを培養してボツリヌス毒素を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成されたボツリヌス毒素を回収する段階。
【請求項10】
前記培養は、嫌気条件で行うことを特徴とする請求項９に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【請求項11】
前記毒素は、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧで構成された群から選択されることを特徴とする請求項９又は１０に記載のボツリヌス毒素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ボツリヌス毒素の製造のための培地組成物に関し、より詳細にはボツリヌス毒素を産生することができるクロストリジウム属菌株の培養用培地組成物に関する。本発明の培地組成物は、莢豌豆加水分解物（Ｇａｒｄｅｎ Ｐｅａ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、綿実加水分解物（Ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）および小麦グルテン加水分解物（Ｗｈｅａｔ Ｇｌｕｔｅｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）で構成された群から選択される一つ以上の植物性ペプトンとカゼイン加水分解物（ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）を含むことを特徴とする。
【背景技術】
【0002】
神経毒性を持つ毒素を分泌する種々のクロストリジウム属菌株が１８９０年代から今まで発見されて、過去７０年間これらの菌株が分泌する毒素に対する特性解明がなされてきた（Ｓｃｈａｎｔ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：８０，１９９２）。
【0003】
前記クロストリジウム属菌株から由来した神経毒性を持つ毒素、すなわちボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）は、その血清学的特徴によりＡ〜Ｇ型の七つの型に区分される。各毒素は、約１５０ＫＤａ程度の毒素タンパク質を有しているが、自然的には種々の非毒性タンパク質と結合されている複合体からなっている。中間（Ｍｅｄｉｕｍ）複合体（３００ｋＤａ）は、毒素タンパク質と非毒性−非ヘマグルチニンタンパク質からなり、大きい（Ｌａｒｇｅ；４５０ｋＤａ）複合体および巨大（Ｌａｒｇｅ−Ｌａｒｇｅ；９００ｋＤａ）複合体は、中間複合体がヘマグルチニンと結合されている形態を有している（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，４４：４１９，１９８０）。このような非毒性非ヘマグルチニンタンパク質は腸内で低いｐＨと各種タンパク質加水分解酵素から毒素を保護する機能をすると知られている。
【0004】
前記毒素は、細胞内で分子量が約１５０ｋＤａである一つのポリペプチドで合成された後、細胞内タンパク質分解酵素の作用やトリプシンのような人為的な酵素処理によってＮ末端から１／３になる位置で切断されて、二つ単位体である軽鎖（Ｌ：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）（分子量；５０ｋＤａ）および重鎖（Ｈ：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）（分子量；１００ｋＤａ）に分けられる。このように分けられた毒素は、単一ポリペプチドである時に比べてその毒性が大きく増加する。二つの単位体は、二硫化結合によって連結されていて、それぞれは異なる機能を有する。重鎖は目標物（ｔａｒｇｅｔ）になる細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合して（Ｐａｒｋ．Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７２：２４３，１９９０）、低いｐＨ（ｐＨ４）で生体膜と反応してチャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）を形成する機能を有して（Ｍａｎｔｅｃｕｃｃｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ．，１８：３２４，１９９３）、軽鎖は薬理活性を持っていて洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を使って細胞に透過性を与えたり、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）等で細胞内投入された時神経伝達物質の分泌を妨げる（Ｐｏｕｌａｉｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：４０９０，１９８８）。
【0005】
前記毒素は、神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のコリン性前シナプス（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｅｓｙｎａｐｓｅ）でアセチルコリンのエキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）を阻害して無力症を引き起こす。極微量の毒素を処理しても毒性が現れることからこの毒素は何らかの酵素活性を持つと考えられてきた（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｅｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２６：４２７，１９８６）。
【0006】
最近明らかになったところによると、毒素はメタロペプチダーゼ活性（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持っていて、その基質は、エキソサイトーシス装置複合体（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｍａｃｈｉｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）をなす単位タンパク質であるシナプトブレビン（Ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ）、シンタキシン（Ｓｙｎｔａｘｉｎ）、２５ＫＤａのシナプトソーム関連タンパク質（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ２５ＫＤａ）（ＳＮＡＰ２５）等である。各型の毒素は、この三つのタンパク質中一つを基質としているが、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトブレビンを、ＡとＥ型はＳＮＡＰ２５を、Ｃ型はシンタキシンを特定部位で切断すると知られている（Ｂｉｎｚ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：９１５３，１９９４）。
【0007】
特に、ボツリヌス毒素Ａ型は、ｐＨ４．０〜６．８の薄い水溶液に溶解性であると知られている。約７以上のｐＨで安定化非−毒素タンパク質が神経毒素から分離されて、その結果毒性が徐々に失われるが、特にｐＨおよび温度が上昇するにつれ毒性が減少すると知られている。
【0008】
前記ボツリヌス毒素は、少量で体に致命的で大量生産が容易であるため、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、天然痘（ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）と共に４大生物テロ武器で使われることができる毒素である。しかし、前記ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）中Ａ型毒素の場合には、全身的には体に影響を及ぼさない容量以下で注射すると、前記注射部位の局所筋肉を麻痺させることができると明らかになり、このような特性を利用してシワ除去剤、強直性片麻痺および脳性麻痺の治療剤などで広範囲に使用することができるので、需要が急増していて需要に合わせてボツリヌス毒素の生産方法に対する研究が盛んに行われている。
【0009】
現在代表的に商用化されている製品は、米国アラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社のＢＯＴＯＸ（登録商標）（ボツリヌス毒素Ａ型精製された神経毒素複合体）で、それぞれのＢＯＴＯＸ（登録商標）の１００ユニットバイアルは、約５ｎｇの精製されたボツリヌス毒素Ａ型複合体、０．５ｍｇヒト血清アルブミン、および０．９ｍｇ塩化ナトリウムで構成されて、真空−乾燥形態で提供されて、保存剤なしに（０．９％塩化ナトリウム注入）滅菌生理食塩水を利用して復元させる。他の商用化された製品は、英国Ｉｐｓｅｎ社のＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）（ボツリヌス毒素薬剤学的組成物中ラクトースおよびヒト血清アルブミンを有するクロストリジウム・ボツリヌスＡ型毒素ヘマグルチニン複合体、使用前に０．９％塩化ナトリウムを利用して復元される）およびＳｏｌｓｔｉｃｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭｙｏＢｌｏｃＴＭ（ボツリヌス毒素Ｂ型、ヒト血清アルブミン、コハク酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを含む薬ｐＨ５．６注射溶液）等がある。
【0010】
大韓民国登録特許第１０−１３３９３４９号に開示されているボツリヌス毒素の製造方法と一般に使用されるクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地は、動物性成分が含まれている。したがって、伝染性海綿状脳症誘発因子として知られている動物由来の異常プリオン（ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｉｏｎ）が汚染によって前記動物性成分に含まれていると、ボツリヌス毒素製造過程において問題となる。
【0011】
伝染性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）は、致命的な神経の退行性疾患を引き起こす一種の退行性神経疾患で、ＢＳＥ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、牛海綿状脳症（狂牛病））、スクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｃｏｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クールー病（Ｋｕｒｕ）、伝染性ミンク脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｍｉｎｋ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、シカの慢性消耗病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｗａｓｔｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ネコ海綿状脳症（Ｆｅｌｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）等のヒトおよび動物で発病して、牛海綿状脳症の場合、種間障壁（ｓｐｅｃｉｅｓ ｂａｒｒｉｅｒ）を越えてヒトにも発病すると報告されている。
【0012】
伝染性海綿状脳症の原因体は、免疫原性がなく、長い潜伏期を有する特徴がある。牛海綿状脳症、すなわち狂牛病に感染した牛の脳の事後分析から、神経細胞の破壊と異常タンパク質繊維の沈積によって脳にスポンジ（海綿状）形態の特異なパターンの空胞が形成されたことを確認することができる。
【0013】
伝染性海綿状脳症の原因と考えられる病原体は、異常プリオン（ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｒｉｏｎ）と呼ばれる感染タンパク質である。核酸を必要とする一般ウイルスの場合とは異なり、異常プリオンは、核酸を含まずタンパク質のみからなる感染粒子である。伝染性海綿状脳症は、正常プリオン（ＰｒＰｃ）に感染性因子である異常プリオン（ＰｒＰｓｃ）が結合するようになると病原性プリオンに転換されて、このような病原性プリオンが脳に蓄積されると知られている（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ ＳＢ，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓ Ａｓｓｏｃ Ｄｉｓｏｒｄ．，３：５２−７８，１９８９）。
【0014】
クロイツフェルト・ヤコブ病は、ヒト伝染性海綿状脳症（伝染性海面両脳症、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）の珍しい神経退行性疾患で、伝染性物質は、プリオンタンパク質の異常な変異体であることは明らかである。クロイツフェルト・ヤコブ病がある個体は、明らかに完全な健康状態から６ヶ月以内に無動無言症（ａｋｉｎｅｔｉｃ ｍｕｔｉｓｍ）に悪化され得る。したがって、動物由来産物を使用して得られるボツリヌス毒素のような生物製剤を含む薬剤学的組成物を投与する場合、クロイツフェルト・ヤコブ病のような、プリオン媒介疾患を得るようになる危険性が存在する。したがって、動物由来成分を使用して産生した原液を利用して医薬品を製造する場合、患者が様々な病原体または感染性物質を受け入れるようになる危険性が存在する。
【0015】
このような技術的背景下、本発明者等は、前記のようなプリオン媒介疾患を得るようになる危険を予防するために、クロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養時、伝染性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）感染の恐れがない植物由来ペプトンを含み、ミネラル成分およびＴＳＥ感染の恐れがないカゼイン加水分解物（例えば、ＴＳＥ−Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｄ ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）が添加された培地を利用する場合、既存培地で発生し得るプリオン媒介疾患を得るようになる危険性を排除させて、既存培地と植物性ペプトンが含まれた培地よりクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長率を向上させる可能性があることを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
本発明の目的は、伝染性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＳＥ）感染の恐れがない植物性ペプトンとＴＳＥ感染の恐れがないカゼイン加水分解物が含まれた培地組成物及び前記培地組成物でクロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養してボツリヌス毒素の産生量を改善させる製造方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【0017】
前記目的を達成するために、本発明は、莢豌豆加水分解物、綿実加水分解物および小麦グルテン加水分解物で構成された群から選択される一つ以上の植物性ペプトンとカゼイン加水分解物を含むクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物を提供する。
【0018】
本発明はまた、（ａ）前記培地組成物を利用してクロストリジウム・ボツリヌスを培養してボツリヌス毒素を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたボツリヌス毒素を回収する段階を含むボツリヌス毒素の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】植物性ペプトンが含まれた培地（ＡＰＦ培地）におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長の可否を示したものである。
【図2】植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンが含まれた培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長の可否を示したものである。
【図3】植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンを含む培地を滅菌処理した場合、沈殿物の形成の可否を示したものである。
【図4】植物性ペプトンとミネラルを含む培地を滅菌処理した場合、沈殿物の形成の可否を示したものである。
【図5】植物性ペプトンとミネラルが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地にビタミン、アミノ酸およびブドウ糖とＬ−グルタミンが排除された培地性分が追加で添加された培地で培養された菌株の成長の可否を示したものである。
【図6】植物性ペプトンの種類に応じたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地における菌株の成長の可否を示したものである。
【図7】ミネラルスクリーニング（ｍｉｎｅｒａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に対するＦＦＤのｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓとｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したもので、（Ａ）ｈｉｇｈ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ、（Ｂ）ｍｉｄｄｌｅ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ、（Ｃ）ｌｏｗ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔおよび（Ｄ）ｍａｘｉｍｕｍ ＯＤに対するｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したものである。
【図8】ミネラルスクリーニング（ｍｉｎｅｒａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に対するＦＦＤのｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓとｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したもので、（Ａ）ｈｉｇｈ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ、（Ｂ）ｍｉｄｄｌｅ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ、（Ｃ）ｌｏｗ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔおよび（Ｄ）ｍａｘｉｍｕｍ ＯＤに対するｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したものである。
【図9】植物性ペプトンスクリーニング（Ｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ｓｃｒｅｅｉｎｇ）に対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓとｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したもので、（Ａ）ｍｉｄｄｌｅ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ、（Ｂ）ｌｏｗ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔおよび（Ｃ）ｍａｘｉｍｕｍ ＯＤに対するｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したものである。
【図10】最終選別されたＡＰＦ培地で育ったクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）および毒素（ｔｏｘｉｎ）濃度変化を示したものである。
【図11】植物性ペプトンを含む培地にカゼイン加水分解物を添加した後、クロストリジウム・ボツリヌス菌株接種後２４時間が経過した培養物に対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓを示したもので、（Ａ）ｌｏｗｅｒ ｂｏｕｎｄ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔと（Ｂ）ｍｉｄｄｌｅ ｓｅｔｔｉｎｇに対するｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔを示す。
【図12】植物性ペプトンを含む培地にカゼイン加水分解物を添加した後、クロストリジウム・ボツリヌス菌株接種後２４時間が経過した培養物に対するｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを示したものである。
【図13】ＣＣＦ（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆａｃｅｄ）デザインのｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓで、（Ａ）統計プログラムのｐｌｏｔ及び（Ｂ）統計プログラムのｐｌｏｔを示す。
【図14】ＣＣＦ（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆａｃｅｄ）デザインの（Ａ）ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓと（Ｂ）ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｌｏｔを示す。
【図15】既存培地、植物性ペプトンが添加された培地、または植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された最終培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を時間別ＯＤ値で比較したものをグラフで示した。
【発明を実施するための形態】
【0020】
ＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）組成でも、既存培地対比向上されたクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長率（生長率）を示したが、菌株の成長率をさらに向上させながらもＴＳＥなどの感染の恐れがない培地成分の添加を考慮した。したがって、ＴＳＥ感染事例が報告されたことがないカゼイン加水分解物（例えば、ＴＳＥ−Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｄ ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）をＡＰＦ培地に添加して菌株の成長を調べた結果、既存培地と植物由来ペプトンだけ含まれた培地より高い菌株の成長率を示し、前記培地を利用するとＴＳＥ−フリー（ＴＳＥ−ｆｒｅｅ）な条件で安全に菌株を培養して高濃度のボツリヌス毒素を製造することができるであろう。
【0021】
本発明で既存培地とは、動物由来成分であるカゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）およびチオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）が含まれた培地を意味する。また、ＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）とは、動物由来タンパク質を含まない培地を意味して、「植物性ペプトン、ミネラルおよびブドウ糖などを含む培地」を意味する。
【0022】
本発明の一実施例では、ＴＳＥ−フリー（ＴＳＥ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）−ｆｒｅｅ）な条件でクロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養してボツリヌス毒素を製造するために、ＴＳＥ−フリーな植物性ペプトンが含まれたＡＰＦ培地を製造して、これを既存培地（動物性成分含み）と比較した。その結果、クロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養するための最適な培地組成は、植物性ペプトンとＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４で構成された群から選択された一つ以上のミネラルを含ませて、これに炭素源（例：ブドウ糖）を添加した場合であり、この場合最適な菌株成長を確認することができた。結果的に、表１３に示された通り、最終選別されたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物に含まれた植物性ペプトンの最適含有量は、Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４ ５ｇ／Ｌ、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ １０ｇ／ＬおよびＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ ５ｇ／Ｌであり、ミネラルの最適含有量は、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｇ／Ｌであると確定した。
【0023】
本発明の他の実施例では、最終選別された植物性ペプトンとミネラルが含まれたＡＰＦ培地で育ったクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長パターン（ｇｒｏｗｔｈ ｐａｔｔｅｒｎ）および毒素（ｔｏｘｉｎ）濃度測定を行った。その結果、表１２および図１０に示された通り、クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養１２時間後からＯＤ値が増加し始めて培養２４時間が経過した時点でＯＤ５４０ｎｍが３．５４６５、ＯＤ６００ｎｍが３．０６９５を示した。また、その後ＯＤ値がますます減少して４８時間が経過した時点ではＯＤ５４０ｎｍが０．７９２、ＯＤ６００ｎｍが０．７２２４を示した。クロストリジウム・ボツリヌス毒素の上澄み液中の毒素濃度は、培養５時間後から増加して最終３１．４１μｇ／ｍｌの値を示して、菌株を破砕して測定した場合、培養５時間後から毒素が生成され始めて継続して毒素量が増加して２８時間以後からは似たような量の毒素濃度が測定されて最終３８．３９μｇ／ｍｌの値を示した。
【0024】
本発明のさらに他の実施例では、植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長パターンを確認しようした。その結果、表１７及び図１５に示された通り、既存培地は、クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養２４時間後から成長速度が増加して、培養３９時間経過時に最大値であるＯＤ５４０ｎｍ ３．３８４を示して、植物性ペプトンを含む培地（ＡＰＦ培地）は、培養１８時間後から成長率が増加して培養２８時間経過時に最大値ＯＤ５４０ｎｍ ３．５２６を示した。
【0025】
また、植物性ペプトンが含まれた培地にカゼイン加水分解物を添加した場合、培養１８時間から成長速度が増加して、培養２６時間に最大値であるＯＤ５４０ｎｍ ５．６２８を示した。したがって、２４時間経過した時点で、ＯＤ５４０ｎｍ値を比較した時、既存培地で培養した場合、１．２３８２を示し、植物性ペプトンが含まれている培地の場合は２．８５９５、植物性ペプトンが含まれた培地にカゼイン加水分解物を添加した場合は５．２４４を示した。したがって、植物性ペプトンとカゼイン加水分解物が含まれた培地のＯＤ値が既存培地より２４時間基準で約４．２３倍、植物性ペプトンが含まれた培地より約１．８３倍高いことが示された。また、最大ＯＤ値で比較すると、植物性ペプトンとカゼイン加水分解物が含まれた培地は、植物性ペプトンが含まれた培地より約１．６倍高いことが確認された。
【0026】
結果的に、表１８に示された通り、最終選別されたＴＳＥ−フリー（ＴＳＥ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）−ｆｒｅｅ）なカゼイン加水分解物が含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物に含まれた植物性ペプトンの最適含有量は、Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４ ５ｇ／Ｌ、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ １０ｇ／ＬおよびＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ ５ｇ／Ｌであり、カゼイン加水分解物の含量は、２０ｇ／Ｌ Ｎ−Ｚ−Ａｍｉｎｅ Ａ、１１ｇ／Ｌ Ｎ−Ｚ−Ｃａｓｅ ＴＴであると確定した。
【0027】
したがって、一観点において、本発明は、莢豌豆加水分解物、綿実加水分解物および小麦グルテン加水分解物で構成された群から選択される一つ以上の植物性ペプトンとカゼイン加水分解物を含むクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物に関する。
【0028】
ここで、植物性ペプトンは、莢豌豆（Ｇａｒｄｅｎ Ｐｅａ）、綿実（Ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）または小麦グルテン（Ｗｈｅａｔ Ｇｌｕｔｅｎ）から抽出されたペプトンを意味し、好ましくは商業的に購入可能なＨｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ、ＨｙＰｅｐＴＭ ７５０４、ＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎであってもよいが、これに限定されない。また、カゼイン加水分解物は、牛乳から抽出された成分を意味し、好ましくは５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有するカゼイン加水分解物または５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有するカゼイン加水分解物であってもよく、より好ましくは商業的に購入可能なＮＺ−Ａｍｉｎｅ ＡまたはＮＺ−Ｃａｓｅ ＴＴであってもよいが、これに限定されない。
【0029】
本明細書で用語「植物性ペプトン」または「植物性加水分解物」とは、植物から得たタンパク質の分解産物を意味する。例えば、莢豌豆ペプトン（莢豌豆加水分解物）は、莢豌豆（Ｇａｒｄｅｎ Ｐｅａ）から収得した総タンパク質を分解して得た産物を意味する。また、「カゼイン加水分解物」とは、カゼインタンパク質の分解産物を意味する。
【0030】
前記植物性タンパク質またはカゼインタンパク質の分解は、好ましくは部分的分解（ｐａｒｔｉａｌ ｄｉｇｅｓｔ）により行われる。前記タンパク質の分解は、好ましくは酸処理、塩基処理、酵素処理、高圧処理、熱処理または物理的処理による分解を介して行われ、より好ましくは植物性ペプトンまたはカゼイン加水分解物は酵素処理されたことを特徴とする。前記物理的処理は、例えばクラインディング（ｇｒｉｎｄｉｎｇ）である。
【0031】
本発明における植物性ペプトンまたはカゼイン加水分解物は、植物性タンパク質の部分的分解産物として、単分子であるアミノ酸だけでなく、数個〜数十個のアミノ酸からなるペプチドと完全なタンパク質分子がいずれも含まれている混合物形態である。
【0032】
本発明において、前記植物性ペプトンの含有量は、０．１〜１０ｗ／ｖ％（１〜１００ｇ／Ｌ）であることを特徴とし、好ましくは０．２〜５ｗ／ｖ％（２〜５０ｇ／Ｌ）であってもよく、より好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％（５〜２０ｇ／Ｌ）であってもよい。
【0033】
本発明において、前記莢豌豆加水分解物、綿実加水分解物および小麦グルテン加水分解物を全て含む場合、莢豌豆加水分解物、綿実加水分解物および小麦グルテン加水分解物の含有量比は、重量を基準に１：０．２４〜４３．６２：０．０１〜５０．５７であることを特徴とし、好ましくは１：０．６８〜１４．４６：０．０９〜９．８７であってもよく、より好ましくは１：１．６〜２．４：０．６〜１．４であってもよい。
【0034】
本発明において、前記カゼイン加水分解物の含有量は、０．２２〜１５．５ｗ／ｖ％（２．２〜１５５ｇ／Ｌ）であることを特徴とし、好ましくは０．４４〜７．７５ｗ／ｖ％（４．４〜７７．５ｇ／Ｌ）であってもよく、より好ましくは１．１〜３．１ｗ／ｖ％（１１〜３１ｇ／Ｌ）であってもよい。
【0035】
本発明において、前記カゼイン加水分解物は、牛乳から抽出された成分を意味し、好ましくは５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有するカゼイン加水分解物および／または５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有するカゼイン加水分解物であることを特徴とする。
【0036】
本発明において、前記カゼイン加水分解物が５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有する加水分解物および５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有する加水分解物を全て含む場合、５００Ｄａ以下のペプチドを約８５．５〜９４．５重量％含有する加水分解物および５００Ｄａ以下のペプチドを約６３．５６〜７０．２５重量％含有する加水分解物の含有量比は、重量を基準に０．０１〜４０：０．０１〜２２であることを特徴とし、好ましくは１０〜３０：５．５〜１６．５であってもよく、より好ましくは１６〜２４：８．８〜１３．２であってもよい。
【0037】
本発明において、前記クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地組成物は、炭素源とＫ２ＨＰＯ４（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＫＨ２ＰＯ４（Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で構成された群から選択される一つ以上のミネラルをさらに含んでもよい。
【0038】
ここで、前記炭素源は、単糖類（例えば、グルコース、フルクトーススなど）、二糖類（例えば、マルトース、スクロースなど）、オリゴ糖、多糖類（例えば、デキストリン、シクロデキストリン、澱粉など）または糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）であってもよいが、これに限定されない。
【0039】
本発明において、前記ミネラルの含有量は、０．０５〜３．５ｗ／ｖ％（０．５〜３５ｇ／Ｌ）であることを特徴とし、好ましくは０．１〜１．７５ｗ／ｖ％（１〜１７．５ｇ／Ｌ）であってもよく、より好ましくは０．２５〜０．７ｗ／ｖ％（２．５〜７ｇ／Ｌ）であってもよい。
【0040】
他の観点において、本発明は、（ａ）前記培地組成物を利用してクロストリジウム・ボツリヌスを培養してボツリヌス毒素を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成されたボツリヌス毒素を回収する段階を含むボツリヌス毒素の製造方法に関する。
【0041】
本発明において、前記培養は嫌気条件で行うことを特徴とし、前記毒素はボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧで構成された群から選択されることを特徴とする。
【実施例】
【0042】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【0043】
実施例１：植物性ペプトン培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養１−１：培養に使用した既存培地の組成
本発明で使用された試薬および培地成分は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ、米国）、ケリー社（Ｋｅｒｒｙ Ｉｎｃ、米国）、ＢＤ社（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）、Ｇｉｂｃｏ社（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）およびクエスト社（Ｑｕｅｓｔ、米国）から購入して使用した。
【0044】
ボツリヌス毒素の産生のためのクロストリジウム・ボツリヌス菌株の種培養および本培養に利用された培地は２％カゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）［２０ｇ／Ｌ］、１％酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）［１０ｇ／Ｌ］、１％グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）［１０ｇ／Ｌ］および０．５％チオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）［５ｇ／Ｌ］の組成を有する既存培地を使用した。前記既存培地１Ｌ中チオグリコール酸塩培地５ｇは、２．５２ｇカゼイン消化酵素分解物（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ ｃａｓｅｉｎ）、０．８４ｇ酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、０．９２５ｇデキストロース（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、０．０８５ｇチオグリコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）、０．４２ｇ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０８５ｇ Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ）、０．０００１４ｇレサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）および０．１２５ｇ細菌性寒天（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇａｒ）で構成されたものである。
【0045】
１−２：培養に使用したＡＰＦ培地の組成クロストリジウム・ボツリヌス培養用既存培地（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｅｄｉａ）でカゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ）およびチオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）が除去された培地（陰性対照群、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）、前記陰性対照群組成に植物性ペプトン候補群４種（Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ、ＨｙＰｅｐＴＭ ７５０４、ＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ）が添加されたＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）を製造した（表１）。
【0046】
下記の表１は、既存培地対比植物性ペプトンが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用ＡＰＦ培地の成分を示したものである。
【0047】
【表1】
【0048】
１−３：クロストリジウム・ボツリヌス菌株の種培養（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）実施例１−１および１−２の培地組成を有する１０ｍＬの滅菌された培地が入っている培養チューブ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｕｂｅ）に２０μＬのクロストリジウム・ボツリヌス（疾病管理本部管理番号：４−０２９−ＣＢＢ−ＩＳ−００１）を接種して３５℃で嫌気的条件で２２〜３０時間１次種培養（静置培養）をした。１次種培養で菌株の成長が確認されると、同じ培地組成を有する８００ｍＬの滅菌された培地が入っている１Ｌ培養ボトル（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅ）に８ｍＬの１次種培養液を接種して３５℃で嫌気的条件で８〜１５時間２次種培養（静置培養）をした。
【0049】
１−４：クロストリジウム・ボツリヌス菌株の本培養クロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養してボツリヌス毒素を産生するために本培養を実施して、実施例１−１および１−２の組成で培地９．３Ｌを調製して、１０Ｌ培養器に入れた後、培地滅菌を行った。嫌気的条件は、窒素を供給して作って、温度は３５℃、撹はん速度は５０ｒｐｍに設定して成長環境を維持させた。
【0050】
実施例１−３で２次種培養を完了した１Ｌ培養ボトル（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅ）を１０Ｌ培養器の接種ポートと連結された接種線を介して１０Ｌ培養器に接種した。１０Ｌ培養器におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株は、３５℃、５０ｒｐｍ条件で培養して、培養が進行される間培養設定条件に維持されるかを確認して記録した。１００時間以上培養された時、本培養を終了した。
【0051】
クロストリジウム・ボツリヌス培養用既存培地（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｅｄｉａ）からカゼイン加水分解物（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）およびチオグリコール酸塩培地（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）が除去された培地（陰性対照群、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）対比植物性ペプトン候補群４種（Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ、ＨｙＰｅｐＴＭ ７５０４、ＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ）が添加されたＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長の可否を比較した（表１）。
【0052】
その結果、表１および図１に示された通り、陰性対照群培地でクロストリジウム・ボツリヌス菌株は育たなく、既存培地はクロストリジウム・ボツリヌス菌株接種後２４時間後に育ち、植物性ペプトンを添加した培地は、菌株接種後３０時間が過ぎた後育ち始めたことが確認された。
【0053】
実施例２：植物性ペプトン、ミネラル、アミノ酸およびビタミンが添加された培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養実施例１で４種の植物性ペプトンを添加した培地で育ったクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長が、既存培地で培養する時より遅かったため、これの解決策を下記のように講じた。
１）嫌気性状態を作る役割をするチオグリコール酸塩（Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）による影響を確認しようと既存培地にチオグリコール酸塩を除去して成長速度差を確認した。
２）窒素源（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ）不足による成長速度低下である可能性があってペプトン濃度を２倍に増加させて培養した。
３）既存植物性ペプトンを含む培地にミネラル成分、アミノ酸、ビタミンを添加した培地とアラガン（Ａｌｌｅｒｇａｎ）社の特許（ＵＳ８，０１２，７１６）に出ているＡＰＦ培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長の可否を比較した（表２）。
【0054】
下記の表２は、植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地の成分を示したものである。
【0055】
【表2】
【0056】
その結果、表２および図２に示された通り、既存培地でチオグリコール酸塩を除去して菌株を培養した場合、既存培地より育つ速度が遅く、これはチオグリコール酸塩成分が成長速度に影響を及ぼすことが確認された。ペプトンの濃度を２倍増加した場合は育たなく、ペプトンを含む培地にミネラル成分、アミノ酸およびビタミンを添加した場合は既存培地と似た速度で育つが培地滅菌後沈殿物ができることを確認して、アラガン社のＡＰＦ培地は既存培地と似た速度で成長することを確認した。
【0057】
実施例３：植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンが含まれた培地の滅菌処理による沈殿物生成実施例２でＡＰＦ培地候補群（表２：２〜４ ＡＰＦ培地）中植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンを含む培地で既存培地と似た成長速度でクロストリジウム・ボツリヌス菌株が育つことを確認したが、培地の滅菌処理後沈殿物ができる現象が現れてそれに対する原因を把握しようとした（表３）。
【0058】
下記の表３は、滅菌処理に利用された植物性ペプトンとミネラル、アミノ酸およびビタミンが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地の成分を示したものである。
【0059】
【表3】
【0060】
その結果、表３および図３に示された通り、植物性ペプトンが含まれた培地にミネラルを添加した場合でだけ滅菌処理後沈殿物が形成されたので、沈殿物形成の主な原因はミネラルであることを確認した。これは、培地滅菌時高温・高圧の条件でミネラル成分間の相互作用から由来したと見た。
【0061】
実施例４：植物性ペプトンとミネラルが含まれた培地の滅菌処理による沈殿物生成実施例３で確認された培地の滅菌処理による沈殿物形成に関与するミネラル成分を確認しようと様々な組み合わせでそれぞれ異なるミネラル成分を培地に添加した後、滅菌処理をした（表４）。
【0062】
下記の表４は、植物性ペプトンとミネラルが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地の成分および前記培地の滅菌処理による結果を示したものである。
【0063】
【表4】
【0064】
その結果、表４および図４に示された通り、植物性ペプトンとミネラルを含む培地中ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯとＫ２ＨＰＯ４を共に滅菌した場合と、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯとＮａ２ＨＰＯ４を共に滅菌した場合、沈殿物ができることを確認した。
【0065】
実施例５：ＡＰＦ培地の沈殿物ができない条件でクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養実施例４の植物性ペプトンとミネラルが含まれたＡＰＦ培地にビタミンとアミノ酸を追加で添加する場合、クロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養が可能であるか否かを確認しようした。また、これとは別に植物性ペプトンとミネラルを排除してビタミン、アミノ酸および／または「ＢＤ ＲｅｃｈａｒｇｅＴＭ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ」（Ｃａｔ Ｎｏ．６７０００２，ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（酵母抽出物をベースに製作されたブドウ糖とＬ−グルタミンが排除された培地性分）を含む場合、菌株の培養が可能であるか否かも確認した（表５）。
【0066】
下記の表５は、植物性ペプトンとミネラルが含まれたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地にビタミン、アミノ酸および酵母抽出物をベースに製作されたブドウ糖とＬ−グルタミンが排除された培地性分が追加で添加された培地の成分および前記培地で培養された菌株の成長速度を示したものである。
【0067】
【表5】
【0068】
その結果、表５および図５に示された通り、植物性ペプトンとＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４で構成されたミネラルの組み合わせを一つ以上含ませて、これにビタミンとアミノ酸を培地に添加した場合だけが、クロストリジウム・ボツリヌス菌株接種後２４時間後に菌株が成長することを確認することができた。また、植物性ペプトンとミネラルを排除してビタミン、アミノ酸および酵母抽出物をベースに製作されたブドウ糖とＬ−グルタミンが排除された培地性分を含む場合、菌株接種後４８時間後に菌株が成長することを確認した。結果的に、クロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養するための最も適する培地組成は、植物性ペプトンとＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、アミノ酸およびビタミンを添加したものである。
【0069】
実施例６：培地に含まれた植物性ペプトン種類に応じたクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養実施例５のＡＰＦ培地に植物性ペプトンの種類を互いに異なる組み合わせで添加する場合、クロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養が可能であるか否かを確認しようとした。
【0070】
下記の表６は、植物性ペプトンの種類に応じたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地の成分および前記培地における菌株の成長の可否を示したものである。
【0071】
【表6】
【0072】
その結果、表６および図６に示された通り、４種の植物性ペプトン中１種または２種だけを培地に添加するだけでもクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養が可能であることが確認された。
【0073】
したがって、実施例５および６の結果をまとめると、培地に植物性ペプトンは１種以上含ませるべきで、植物性ペプトンを「ＢＤ ＲｅｃｈａｒｇｅＴＭ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ」（Ｃａｔ Ｎｏ．６７０００２，ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（酵母抽出物をベースに製作されたブドウ糖とＬ−グルタミンが排除された培地性分）で置き換えることができないことが分かった。
【0074】
実施例７：培地に含まれたミネラル３種中２種選別実験実施例１〜７でクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用として利用されたＡＰＦ培地組成は、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、植物性ペプトン４種、ミネラル成分３種、アミノ酸、ビタミンに確定して、これらの中成長に大きい影響を及ぼさない培地成分は除去して培地の種類を減少させようとした。したがって、アミノ酸とビタミンは、クロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長に大きい影響を及ぼさないとの判断下で培地成分から除去した。また、ミネラル３種中２種を選別するために、表７のような培地組成で菌株を培養して菌株接種後２４時間および４８時間が過ぎた時点で、ＯＤ（５４０ｎｍ、６００ｎｍ）を測定してその値を比較した。
【0075】
下記の表７は、１次ミネラル選別による培地の組成および前記培地を利用したクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を示したものである。
【0076】
【表7】
【0077】
その結果、表７に示された通り、菌株接種後２４時間基準では、既存培地はＯＤ（５４０ｎｍ）が０．９４２を示し、ＡＰＦ培地中Ｋ２ＨＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４を含む場合ＯＤ（５４０ｎｍ）が４．９６４と最も高い値を示した。また、菌株接種後４８時間基準では、ＫＨ２ＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４を添加した場合、最も高いＯＤ値を示して菌株成長が旺盛であることが確認された。
【0078】
一方、図７に示された通り、主効果が大きいＫ２ＨＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４に対してｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔを作成した。その結果、Ｋ２ＨＰＯ４とＮａ２ＨＰＯ４が共に増加するほどＯＤ値が増加する傾向を示した。また、クロストリジウム・ボツリヌス菌株が最大成長を示す条件は、ＫＨ２ＰＯ４＝０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４＝５．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４＝５ｇ／Ｌとミネラルが培地に添加される時であることが分かった。
【0079】
一方、より正確なミネラル添加による菌株培養の結果確認のために、反応表面法で２次実験を進めた。培地組成が負の値を有することができなのでＣＣＦ（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆａｃｅｄ）デザインで設計して実験を表８のような培地組成で菌株を培養して実験を行った後、先に行ったＦＦＤ結果と合わせて統計分析を行った。
【0080】
下記の表８は、２次ミネラル選別による培地の組成および前記培地を利用したクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を示したものである。
【0081】
【表8】
【0082】
Ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓを描いて比較した結果、図８に示された通り、ＫＨ２ＰＯ４が少ないほどＯＤ値が増加して、最適条件を比較すると曲律効果によってＦＦＤの結果と差を見せて、Ｋ２ＨＰＯ４の値は同じであるが、Ｎａ２ＨＰＯ４の値が５ｇ／Ｌから３．１３１３ｇ／Ｌに変わった。したがって、統計分析よる培地の最適なミネラル条件は、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｇ／Ｌと確定した。
【0083】
実施例８：培地に含まれた植物性ペプトン選別実験表９および表１０に示された通り、混合物設計に従って植物性ペプトンを組み合わせてクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を確認した。
【0084】
下記の表９は、１次植物性ペプトン選別による培地の組成および前記培地を利用したクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を示したものである。
【0085】
【表9】
【0086】
下記の表１０は、２次植物性ペプトン選別による培地の組成および前記培地を利用したクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を示したものである。
【0087】
【表10】
【0088】
その結果、図９に示された通り、Ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓを描いて分析した結果、成分Ｃに該当するＨｙＰｅｐＴＭ ７５０４がクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長に最も影響を及ぼすことができないと判断されて培地成分から除外させた。結果的に、培地に含まれる最終選別された植物性ペプトンの組成は、Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４ ５ｇ／Ｌ、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ １０ｇ／ＬおよびＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ ５ｇ／Ｌと決めた。
【0089】
実施例９：培地にＮａＣｌ添加有無によるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養実施例１〜８で使用された培地組成中ＮａＣｌの濃度は０．５ｇ／Ｌで少量添加された。ＮａＣｌの濃度によるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を調べようと培地のＮａＣｌ添加量を０〜１ｇ／Ｌに調節した後、前記菌株を培養した。
【0090】
下記の表１１は、ＮａＣｌが添加されたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地の成分および前記培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を示したものである。
【0091】
【表11】
【0092】
その結果、表１１に示された通り、ＮａＣｌ添加有無による成長の差がなかった。したがって、ＮａＣｌを最終ＡＰＦ培地成分から除去した。
【0093】
実施例１０：最終選別されたＡＰＦ培地で育ったクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長パターンおよび毒素濃度測定実施例１〜９に基づいて組成された最終選別されたクロストリジウム・ボツリヌス菌株培養用培地（ブドウ糖１０ｇ／Ｌ、Ｈｙ−ＰｅａＴＭ ７４０４ ５ｇ／Ｌ、ＵｌｔｒａＰｅｐＴＭ Ｃｏｔｔｏｎ １０ｇ／Ｌ、ＨｙＰｅｐＴＭ ４６０１Ｎ ５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｇ／Ｌ）にクロストリジウム・ボツリヌス菌株を接種した後、菌株の成長パターンと毒素濃度を測定した。
【0094】
下記の表１２は、最終選別されたＡＰＦ培地で育ったクロストリジウム・ボツリヌス菌株の時間別ＯＤ値および毒素（ｔｏｘｉｎ）濃度を示したものである。
【0095】
【表12】
【0096】
その結果、表１２および図１０に示された通り、クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養１２時間後からＯＤ値が増加し始めて培養２４時間が経過した時点でＯＤ５４０ｎｍが３．５４６５、ＯＤ６００ｎｍが３．０６９５を示した。また、その後ＯＤ値が徐々に減少して４８時間が経過した時点ではＯＤ５４０ｎｍが０．７９２、ＯＤ６００ｎｍが０．７２２４を示した。クロストリジウム・ボツリヌス毒素の上澄み液中の毒素濃度は培養５時間後から増加して最終３１．４１μｇ／ｍｌの値を示して、菌株を破砕して測定した場合、培養５時間後から毒素が生成され始めて継続して毒素量が増加して２８時間後からは似た量の毒素濃度が測定されて最終３８．３９μｇ／ｍｌの値を示した。
【0097】
結果的に、実施例１〜１０の結果で最終選別されたＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）組成は下記の表１３に示された通りである。
【0098】
【表13】
【0099】
実施例１１：植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された培地組成選別実施例１〜１０を介して確立されたＡＰＦ培地組成でも、既存培地比向上された菌株の成長率を示したが、菌株の成長率をさらに向上させながらもＴＳＥなどの感染の恐れがない培地成分の添加を考慮し、その結果、ＴＳＥ−フリー（ＴＳＥ−ｆｒｅｅ）なカゼイン加水分解物（例えば、ＴＳＥ−Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅｄ ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）をＡＰＦ培地に添加して菌株の成長を調べることにした。
【0100】
実施例１〜１０で確立されたＡＰＦ培地に２種のＴＳＥ感染の恐れがないカゼイン加水分解物を１種または２種添加した。つまり、植物性ペプトンを含有する培地組成物にカゼイン加水分解物であるＮＺ−Ａｍｉｎｅ Ａを含むＡ培地、またはＮＺ−Ｃａｓｅ ＴＴを含むＢ培地、またはカサミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を含むＣ培地、またはトリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）を含むＤ培地を利用して、クロストリジウム・ボツリヌス菌株を２４時間、４８時間培養する中でＯＤ（５４０ｎｍ、６００ｎｍ）値を測定し、菌株の成長を調べてみた（表１４）。また、前記結果は、統計プログラムを利用して統計分析を行って、菌株培養２４時間経過時の最大の成長を示す培地組成選別した。
【0101】
下記の表１４は、カゼイン加水分解物が添加された植物性ペプトンを含有する培地組成物におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の経時的な成長を確認したものである。
【0102】
【表14】
【0103】
一方、図１１に示された通り、菌株培養２４時間経過時の最大成長を示す条件を調べるためにＬｏｗｅｒ ｂｏｕｎｄ ｓｅｔｔｉｎｇとｍｉｄｄｌｅ ｓｅｔｔｉｎｇ条件に対してｍｉｘｔｕｒｅ ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔｓをそれぞれ描いてみた結果、Ａ培地とＢ培地が存在してＣ培地とＤ培地が０の値を示す領域でボツリヌス菌株が最大成長を示すことが分かった。また、図１２に示された通り、菌株の最大成長を示す条件を調べたところ、Ａ＝０．８７２５、Ｂ＝１．１２７５、Ｃ＝０、Ｄ＝０である条件で、最大の菌株の成長を示すことが確認された。結果的に、前記の結果を基に、４種の培地成分の中でＡ培地（Ｎ−Ｚ−Ａｍｉｎｅ Ａ）とＢ培地（Ｎ−Ｚ−Ｃａｓｅ Ｔ）を最終選別した。
【0104】
実施例１２：植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された培地の濃度の最終選別実施例１１で選別された２種のカゼイン加水分解物培地成分について最適培地条件を調べるために、ＣＣＦ（Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆａｃｅｄ）デザインで反応表面法実験を行った。
【0105】
下記の表１５は、ＣＣＦ反応表面法を利用して、カゼイン加水分解物が添加された植物性ペプトンを含有する培地組成物におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の経時的な成長を確認したものである。
【0106】
【表15】
【0107】
その結果、表１５に示された通り、クロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長の結果を確認した。
【0108】
一方、統計プログラムを利用して樹立したモデルのｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔを描いてみた結果、図１３（Ａ）に示された通り、Ａ培地成分が実験の範囲外に増加して、最適条件があることを確認した。また、これを確認するために、統計プログラムを利用して、Ａ培地成分（ＮＺ−Ａｍｉｎｅ Ａ）の範囲を実験の範囲外にまで拡張してｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔを描いてみた結果、図１３（Ｂ）に示された通り、Ａ培地成分が増加するほど菌株の成長が増加することを確認した。但し、カゼイン加水分解物の含量が増加すると溶解度（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）に問題が発生し得るため、実験条件の中で最適の条件を探そうとした。
【0109】
その結果、菌株が２４時間で最大成長が出る条件は、Ａ＝２．０、Ｂ＝１．１４０２で出てきて、この結果を基に、ＡＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）にカゼイン加水分解物が添加されたクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を最大にする培地組成を表１６の通り確定した。
【0110】
【表16】
【0111】
実施例１３：植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された培地におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長パターン実施例１〜１０に係る方法で植物性ペプトン及び／またはカゼイン加水分解物が添加された培地組成物を利用して、クロストリジウム・ボツリヌス菌株を培養して菌株の成長パターンを調べた。
【0112】
下記の表１７は、既存培地、植物性ペプトンが添加された培地（ＡＰＦ培地）、または植物性ペプトン及びカゼイン加水分解物が添加された最終培地（ＡＰＦ培地＋カゼイン）におけるクロストリジウム・ボツリヌス菌株の成長を時間別ＯＤ値で比較したものである。
【0113】
【表17】
【0114】
その結果、表１７及び図１５に示された通り、既存培地は、クロストリジウム・ボツリヌス菌株培養２４時間後から成長速度が増加して、培養３９時間経過時に最大値であるＯＤ５４０ｎｍ ３．３８４を示して、植物性ペプトンを含む培地（ＡＰＦ培地）は、培養１８時間後から成長率が増加して培養２８時間経過時に最大値ＯＤ５４０ｎｍ ３．５２６を示した。
【0115】
また、植物性ペプトンが含まれた培地にカゼイン加水分解物を添加した場合、培養１８時間から成長速度が増加して、培養２６時間に最大値であるＯＤ５４０ｎｍ ５．６２８を示した。したがって、２４時間経過した時点で、ＯＤ５４０ｎｍ値を比較した時、既存培地で培養した場合、１．２３８２を示し、植物性ペプトンが含まれている培地の場合は２．８５９５、植物性ペプトンが含まれた培地にカゼイン加水分解物を添加した場合は５．２４４を示した。したがって、植物性ペプトンとカゼイン加水分解物が含まれた培地のＯＤ値が既存培地より２４時間基準で約４．２３倍、植物性ペプトンが含まれた培地より約１．８３倍高いことが示された。また、最大ＯＤ値で比較すると、植物性ペプトンとカゼイン加水分解物が含まれた培地は、植物性ペプトンが含まれた培地より約１．６倍高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0116】
本発明に係る植物由来のペプトン、カゼイン加水分解物及びミネラル成分が含まれた培地をクロストリジウム・ボツリヌス菌株の培養に利用する場合、既存培地と植物由来のペプトンだけ含まれた培地より高い菌株の成長率を示し、前記培地を利用すると、安全に菌株を培養して、高濃度のボツリヌス毒素を製造することができる。
【0117】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。