特許 6887628 被移植体における移植不全を防ぐ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6887628

(24)【登録日】2021年5月21日

(45)【発行日】2021年6月16日

(54)【発明の名称】被移植体における移植不全を防ぐ方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/727 20060101AFI20210603BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20210603BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/727

   A61P37/06

【請求項の数】4

【全頁数】7

(21)【出願番号】特願2017-564639(P2017-564639)

(86)(22)【出願日】2016年6月10日

(65)【公表番号】特表2018-517724(P2018-517724A)

(43)【公表日】2018年7月5日

(86)【国際出願番号】EP2016063264

(87)【国際公開番号】WO2016198578

(87)【国際公開日】20161215

【審査請求日】2019年5月29日

(31)【優先権主張番号】15171710.5

(32)【優先日】2015年6月11日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515288959

【氏名又は名称】ユニフェルシテイト マーストリヒト

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ

(73)【特許権者】

【識別番号】517079054

【氏名又は名称】アカデミシュ ジーケンハウス マーストリヒト

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＳＣＨ ＺＩＥＫＥＮＨＵＩＳ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100075557

【弁理士】

【氏名又は名称】西教 圭一郎

(72)【発明者】

【氏名】ハーン，ファン，ロデヴァイク ウィレム アーネスト

(72)【発明者】

【氏名】ニコラース，ヘラルデュス アンナ フランシスクス

(72)【発明者】

【氏名】ロイテリングスペルガー，クリスティアーン ペーテル マリーア

(72)【発明者】

【氏名】スマーレン，ファン，ティム クリスティアン

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 欧州特許出願公開第０２５４５９２４（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特開昭６３−０８８１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 BLOOD，２０１４年，Vol.123, No.7，p.1098-1101

【文献】 LIDER O，SUPPRESSION OF EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE DISEASES AND PROLONGATION OF ALLGRAFT SURVIVAL 以下備考，JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION，米国，AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION，１９８９年 ３月，VOL:83, NR:3，PAGE(S):752 - 756，BY TREATMENT OF ANIMALS WITH LOW DOSES OF HEPARINS，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1172/JCI113953

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７２７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペンタサッカライドの含有量が未分画ヘパリンに比べて少なくとも５０％減少したヘパリンであるペンタサッカライド減損ヘパリンを含み、
前記ペンタサッカライド減損ヘパリンは、アフィニティクロマトグラフィーによって高抗凝固活性ヘパリンを選択的に除去することによって得られる、レシピエントにおける移植後の生着不全の、予防、改善、または低減に使用するための組成物。

【請求項2】

移植片が、臓器または組織であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記臓器は、皮膚、心臓、肝臓、肺、膵臓、腸、または腎臓であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記アフィニティクロマトグラフィーは、固定化された抗トロンビンを用いて実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医療の分野に属する。特に、本発明は、レシピエントにおける移植後の生着不全を、予防、改善、または低減するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

移植は、ドナーから臓器が十分に機能しないレシピエントへ臓器の移植を可能にし、レシピエントのクオリティオブライフを向上させ、平均余命を延ばし、命を救う複合的な医療である。

【0003】

移植不全は、移植の最も困難な課題の１つである。臓器移植後、被移植体および移植片において不可避の反応が生じる。この反応は、臓器獲得、潅流、維持、および手術に付随する外傷の結果として生じ得る。この反応は、ドナーとレシピエントとの間における抗原性の免疫応答システムの相違による特異的認識にも関し得る（１）。また、これらのメカニズムは、急性に、または数週間後、数月後、もしくは数年後でさえ生じる可能性があり、最後には移植片の損失をもたらす有害な反応をもたらす。この過程は、多くの場合、移植拒絶と称される。

【0004】

移植片機能損失は、多様な反応の結果であり、細胞死プロセスを開始し、止めなければ、増加し、移植片を失わせる。細胞死をもたらし、臓器獲得、維持、および虚血／再潅流障害によって生じる外傷は、完全に防ぐことはできない。したがって、負の影響を減らす適切な治療戦略が極めて重要である。残念ながら、それほど多くの利用可能な選択肢はない。

【0005】

拒絶は、外来物質または外来抗原に対する免疫システムの天然応答の結果である。この複雑な過程は、主にＴリンパ球調節性であるが、外来抗原、抗体、Ｔリンパ球、マクロファージ、サイトカイン（リンホカインまたはインターロイキンとしても知られている）、接着分子（すなわち、共刺激分子）、ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球の結合を促進する膜タンパク質に関する。

【0006】

免疫抑制療法は、多くの場合、移植拒絶を防止および治療するため、ならびに移植片および患者の生存を延長するために実施される。しかし、免疫抑制剤の効力と、薬物動態学における異種間および同種間の個体差とが原因で、有害反応を最小化し、適切な免疫抑制を維持するために、投与量の個別化が必要とされる。不十分な水溶解性および生体適合性は、シクロスポリンおよびシロリムスなどの免疫抑制剤投与の複雑性に寄与する。移植拒絶は、予め作製された抗体によってもたらされる超急性（移植後１時間もしくは数日間以内）であってもよく、Ｔリンパ球によってもたらされる急性（数日もしくは数月間）、または主に抗体によってもたらされる慢性（数月もしくは数年後でさえ）であってもよい。

【0007】

ドナー臓器の不足が続いている。これは、主な健康問題をもたらす。なぜなら、臓器移植の順番待ち名簿における患者は、臓器移植がなければ死亡する可能性が高いからである。彼らは、彼らの処置の高額な費用が原因で、健康管理システムに対して重い金銭的負担である（２〜１０）。

【0008】

移植の成功率を上昇させるための方法が、したがって、早急に必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

我々は、低下した抗凝固活性を有するヘパリン、具体的にはペンタサッカライド減損ヘパリンが、レシピエントにおける外来臓器の移植不全を、低減、改善、または予防するために使用可能であることを見出した。ペンタサッカライド減損ヘパリンは、抗凝固活性を顕著に減少させた。さらに、それは、ヒストン媒介性細胞毒性を中和する顕著な能力を示した。このヒストン媒介性細胞毒性は、移植における生着不全の原因である。したがって、本発明は、人体、または動物体における移植不全の治療または予防におけるペンタサッカライド減損ヘパリンに関する。

【発明を実施するための形態】

【0010】

ヘパリンは、多糖類鎖の混合物である（Casu, B. (1989) 「Structure of heparin and heparin fragments.」 Ann N Y Acad Sci 556: 1-17）。多糖類鎖の成分と、それらの長さは、変化する。いわゆるペンタサッカライドドメインを有する鎖は、主な循環抗凝固タンパク質の１つである抗トロンビン（ＡＴ）に強く結合する（Casu, B. et al. Biochem J 197(3) (1981) 599-609）。

【0011】

低下した抗凝固活性を有するヘパリンは、当該分野において公知であり、その製造のための公知のいくつかの方法が存在する。第１に、ヘパリンは、アフィニティクロマトグラフィーによってそのペンタサッカライドを減らされ、それによって非抗凝固ヘパリン、または低下した抗凝固活性を有するヘパリンを得てもよい。また、ヘパリンは、低下した抗凝固活性を有するヘパリンを得るために化学的に処理されてもよい。

【0012】

ペンタサッカライド減損ヘパリンは、当該技術分野における公知の方法によって未分画ヘパリン（ＵＦＨ）から得られてもよい。好ましい方法において、ペンタサッカライド減損ヘパリンは、アフィニティクロマトグラフィーによって得られる。それに関して、ＵＦＨは、固定化されたＡＴを含むカラムを通過する。ペンタサッカライド配列を含む分子は、カラムに結合するが、他の物質は通過する。非結合物質は、低アフィニティ物質（ＬＡＭ）と称され、結合する物質は、高アフィニティ物質（ＨＡＭ）と称される。ＬＡＭは、ペンタサッカライドが実質的に減少しており、その結果その抗凝固活性が低下しているが、ＨＡＭは、完全な抗凝固活性を有する。

【0013】

また、ＬＡＭは、天然ヘパリンのペンタサッカライド減損画分として記載されてもよい。

【0014】

本明細書において、ペンタサッカライド減損ヘパリンとの用語は、ペンタサッカライドの含有量が、市販のヘパリンに比べて実質的に減少したヘパリン画分を表すために使用される。

【0015】

本明細書において使用されたような、実質的に減少または低下したとの用語は、２０％もしくは３０％のような少なくとも１０％、より好ましくは４０もしくは５０％、さらに好ましくは、９０％のような、６０％もしくは７０％もしくは８０％以上、または９９％以上もしくは１００％などの９８％以上減少したことを意味する。後掲のHemkerら（２００３）によって記載されたようなトロンビン生成について試験をしたときに、ペンタサッカライド減損画分が検出可能なペンタサッカライドを全く含んでいないときが最も好ましい。一方では、低下した抗凝固活性を有するヘパリンは、２０％もしくは３０％などの少なくとも１０％、より好ましくは４０もしくは５０％、さらに好ましくは、９０％などの、６０％もしくは７０％もしくは８０％以上、または９９％もしくは１００％などの９８％以上低下した抗凝固活性を有するヘパリンを意味する。後掲のHemkerら（２００３）によって記載されたようなトロンビン生成について試験したとき、低下した抗凝固活性を有するヘパリンは、検出可能な抗凝固活性を有しないときが最も好ましい。

【0016】

実験のセクションにおいて、どのようにペンタサッカライド減損ヘパリンを得ることができるか詳細に記載される。それは、そこで低アフィニティ物質の略語、ＬＡＭと称される。

【0017】

我々は、したがって、抗凝固ヘパリン画分をＵＦＨから除くことによって、ヒストン媒介細胞毒性を中和するペンタサッカライド減損ヘパリンをもたらし、心臓、肺、肝臓、角膜、皮膚、子宮、腎臓、膵臓、および腸などの、ドナーの臓器および組織の移植不全を防ぐために有利に使用することができることを見出した。

【0018】

本明細書において使用されるような、移植不全または生着不全は、その通常の機能を発揮するために移植された臓器の機能不全を意味する。このことは、移植された臓器が、完全に、または部分的にのみその機能を発揮することができないことを意味してもよい。また、移植不全は、機能が実質的に減少または低下した移植された臓器の状態を表してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＬＡＭおよびＨＡＭへのＵＦＨの分離。２ｍｇのＵＦＨが加えられた。図は、２５４ｎｍにおける光学密度を示しており、第１ピークは集められたＬＡＭを表し、第２ピークは集められたＨＡＭを含む。第２のグラフは、溶出した物質の導電度を表す。ＬＡＭは１ｍｌ／分で溶出され、ＨＡＭは４ｍｌ／分で溶出された。

【図2】様々なヘパリン調製物の抗凝固活性。図は、脱硫酸化とペンタサッカライド減損との両方が、低下した抗凝固活性を有するヘパリン画分をもたらすことを示している。

【図3】ヒストンＨ３の細胞毒性の中和。図は、ヒストンＨ３細胞毒性が、脱硫酸化ヘパリン画分において減少するが、ペンタサッカライド減損ヘパリンにおいて全く影響を受けていないことを示している。

【0020】

［実施例］
実施例１：ＡＴカラムの準備
ＡＴカラムは、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標））の添付文書に従って準備された。イソプロパノールをカラムから洗浄した後、５ｍｌのカップリング緩衝液中の約２．５ｍｇ ＡＴがカラムに加えられた。続いて、タンパク質をカラム物質に固定化し、カラムを洗浄するための記載された手順が実施された（添付文書に従って）。最後に、カラムは、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて平衡化された。

【0021】

実施例２：ＬＡＭおよびＨＡＭへのＵＦＭの分離
２ｍｇの未分画ヘパリンをカラムに加えた。ＬＡＭは、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて溶出され、ＨＡＭは、２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いた。最後の緩衝液は、ブロック勾配で加えられた。図１において、溶出パターンの一例が示される。

【0022】

より多量のＬＡＭを得るために、図１に記載された手順が数回繰り返された。

【0023】

ＬＡＭがＨＡＭを含むか否かを測定するために、２つの試験が使用された。第１に、収集されたＨＡＭは、ＡＴカラムに再度加えられ、上述のように実施された。ＨＡＭピークは、観察されなかった。第２に、トロンビン生成におけるＬＡＭ効果が測定された。反応混合物（１２０μｌ）は、１．５×希釈の通常血漿、３μｌのＬＡＭまたは緩衝液、４μＭのＤＯＰＬ（６０％ＤＯＰＣ，２０％ＤＯＰＣ，および２０％ＤＯＰＥ）、５ｐＭの組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ社）、１００ｍＭのＣａＣｌ２、および４１７μＭのＺＧＧＲ−ＡＭＣを含んでいた。反応は、ＣａＣｌ２＋ＺＧＧＲ−ＡＭＣを用いて開始された。トロンビン生成は、Hemker, H. C., P. Giesenら (2003) 「Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma.」 Pathophysiol Haemost Thromb 33(1): 4-15に記載されたように測定された。トロンビン生成は、３μｌのＨＡＭを添加することによって抑制されなかった。

【0024】

ＬＡＭを含むカラム画分は、収集された。緩衝液は、セファデックスＧ−２５ ｍｅｄｉｕｍを用いて重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）に交換され、画分は、凍結乾燥された。乾燥されたＬＡＭは、秤量され、所望の濃度に達するまで、リン酸緩衝生理的食塩水に溶解された。

【0025】

実施例３：移植不全の予防
我々は、マウス腎臓を移植した腎臓移植モデルを観察した。我々は、移植用の腎臓が機能不全の可能性が高まった条件を決定し、続いて３０匹のマウスが、注入ごとにマウス一匹につき０．１〜１０ｍｇのＬＡＭを投与される実験を実施した。適切なマウスコントロール群は、何の処置も受けず、他のコントロール群は、同等の量の、ＨＡＭまたは天然ヘパリンを受けた。
ＬＡＭを受けた群は、低い移植不全率を有することが観察された。

【0026】

実施例４：様々なヘパリン調製物の抗凝固活性
未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は、固定化された抗トロンビンを有するカラムにおけるアフィニティクロマトグラフィーによってペンタサッカライドを減らされた。非結合通過流は、ペンタサッカライド減損ヘパリン（ＬＡＭ）を含んでいた。

【0027】

未分画ヘパリンは、Yuko InoueおよびKinzo Nagasawa，Carbohydrate Research (1976) 46: 87-95に記載された方法に従って脱硫酸化された。

【0028】

脱硫酸化ヘパリン（ＤＳ）、ＵＦＨ、およびＬＡＭは、それらの抗凝固活性を測定するために内在性トロンビン生成能（ＥＴＰ）アッセイで試験された（図２）。我々は、ペンタサッカライドの脱硫酸化と減損とは、ＵＦＨの本来の活性の少なくとも１０％以下まで、ＵＦＨの抗凝固活性をほとんど完全に消失させると結論付ける。

【0029】

実施例５：ヒストンＨ３の細胞毒性の中和
ＤＳ、ＵＦＨ、およびＬＡＭは、ヒストンＨ３の細胞毒性に対するそれらの保護活性を測定するために、Wildhagenらによって記載されたようなヒストンＨ３細胞毒性アッセイ（Blood 2014; 123:1098-1101）において試験された（図３）。ヒストンＨ３細胞毒性に対する保護効果は、ＬＡＭ画分において抑制された（未分画ヘパリンの活性の１００％（図３））が、脱硫酸化ヘパリンは、未分画ヘパリンと比べて保護効果において顕著な減少（５０％以上）を示すことが観察された。我々は、ＵＦＨおよびＬＡＭが、ヒストンＨ３の細胞毒性活性を同程度まで中和するが、ヘパリンの脱硫酸化（ＤＳ）が、ヒストンＨ３の細胞毒性活性を中和する能力の低下をもたらすと結論付ける。

【0030】

文献
1. Morris PJ, Knechtle SJ. Kidney Transplanatation: principles and practice. Sixth ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2008.
2. Foundation E. Annual report 2013. 2013.
3. Colvin-Adams M, Smith JM, Heubner BM, Skeans MA, Edwards LB, Waller CD, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: heart. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-28.
4. Israni AK, Zaun DA, Rosendale JD, Snyder JJ, Kasiske BL. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: deceased organ donation. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-13.
5. Kandaswamy R, Skeans MA, Gustafson SK, Carrico RJ, Tyler KH, Israni AK, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: pancreas. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-20.
6. Kim WR, Lake JR, Smith JM, Skeans MA, Schladt DP, Edwards EB, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: liver. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-28.
7. Matas AJ, Smith JM, Skeans MA, Thompson B, Gustafson SK, Stewart DE, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: kidney. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-34.
8. Schnitzler MA, Skeans MA, Axelrod DA, Lentine KL, Tuttle-Newhall JE, Snyder JJ, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: economics. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-24.
9. Smith JM, Skeans MA, Horslen SP, Edwards EB, Harper AM, Snyder JJ, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: intestine. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-16.
10. Valapour M, Skeans MA, Heubner BM, Smith JM, Hertz MI, Edwards LB, et al. OPTN/SRTR 2013 Annual Data Report: lung. Am J Transplant. 2015;15 Suppl 2:1-28.

【図1】

【図2】

【図3】