特許 6890111 ラクトバチルス属微生物の種及び菌株の判別方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6890111

(24)【登録日】2021年5月26日

(45)【発行日】2021年6月18日

(54)【発明の名称】ラクトバチルス属微生物の種及び菌株の判別方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20210607BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20210607BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/686 ZZNA

   C12Q1/6876 Z

【請求項の数】7

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2018-213104(P2018-213104)

(22)【出願日】2018年11月13日

(65)【公開番号】特開2020-78271(P2020-78271A)

(43)【公開日】2020年5月28日

【審査請求日】2021年1月5日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】596126465

【氏名又は名称】アサヒ飲料株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】000000055

【氏名又は名称】アサヒグループホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100154988

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 真知

(72)【発明者】

【氏名】青山 冬樹

【審査官】 山内 達人

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０２０−０６８７１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−００６５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−００６５５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２６３９７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 International Journal of Food Microbiology，２０１３年，166，p. 117-124

【文献】 Food Biotechnology，２０１３年，27，p. 222-234

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８６

Ｃ１２Ｑ １／６８７６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な５０ｂｐ〜４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的微生物が存在していたと決定する工程、
を含み、
前記プライマーセットが、
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ａ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットである、
前記方法。

【請求項2】

試料が飲料である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された飲料である、請求項１記載の方法。

【請求項4】

試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）ＣＰ２３０５株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。

【請求項5】

工程ｉｉｉ）において、プライマー対（８）を用いるＰＣＲとプライマー対（９）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われる、請求項５記載の方法。

【請求項6】

下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）を含む、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株検出用キット：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。

【請求項7】

下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラクトバチルス属微生物の特定の種及び特定の菌株の判別方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来細菌や真菌の菌種同定に関してはＤＮＡまたはＲＮＡの配列解析を利用して行うのが一般的な手法である。このような一般的な菌株を同定する手法としては、純粋培養された菌株の生菌のＤＮＡを用いて、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒやＰｕｌｓｅｄ Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）法、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法、Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法、Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｉｓｙｓ（ＭＬＳＡ）法などの解析が一般的である（非特許文献１参照）。
また、このような菌種同定の応用として、特許文献１には、乳製品中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプローブ、および、このようなプローブの調製についての試みが開示されている。また、特許文献２には、環境汚染物質の分解、除去を促進することのできるＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属に属する新規微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子または１６ＳｒＲＮＡから調製したプローブを用いて、環境汚染物質分解促進能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うとともに、汚染環境のモニタリング、評価を行うことが開示されている。
このように、細菌や真菌の菌種や菌株の同定技術は、様々な場面で必要とされ、開発されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開平０３−２３６７９９号公報

【特許文献2】特開２００６−２３０２５５号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｔｉｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｃｏｍｐｌｅｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ７９ Ｎｕｍｂｅｒ ２３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、現在数多く販売されている死菌の乳酸菌などを混入する清涼飲料などの飲料や食品などにおいては、その製造工程中のｐＨや加熱条件、保存期間中のｐＨや温度条件において、菌体のＤＮＡが分解されてしまうため、菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡを十分に得にくいという問題がある。そうすると、品質保証の観点から必要とされる製造した商品（すなわち食品や飲料）に混入している菌種や菌株を同定することが極めて困難である。
したがって、本発明の目的は、飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、鋭意研究の結果、食品や飲料清涼水などの飲料中に含まれる菌体（死菌を含む）の特定の種や菌株を検出するために、これまで全く着目されてこなかった製品中の菌体の約５０−約４５０ｂｐ程度のＲＮＡ断片を使用することで、予想外にも菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡ断片配列が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔９〕に関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔２〕試料が飲料である、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、前記〔１〕記載の方法。

【0007】

〔４〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ種（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ａ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（１）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

【0008】

・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（６）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（４）及び（７）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（６）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）
・プライマー対（２）、（３）、（５）及び（７）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）
からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）：前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号４３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号５３の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号６３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号７３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・ガセリ種（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。

【0009】

〔５〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）ＣＰ２３０５株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、
・プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）
を用いてＰＣＲを行う工程、および、
ｉｖ）前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔６〕工程ｉｉｉ）において、プライマー対（８）を用いるＰＣＲとプライマー対（９）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われる、前記〔５〕記載の方法。
〔７〕工程ｉｖ）において、プライマー対（８）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（９）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合した融合配列と配列番号１０３の配列との同一性が決定される、前記〔５〕記載の方法。

【0010】

〔８〕下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）を含む、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株検出用キット：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。
〔９〕下記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）：
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）。

【0011】

本発明のプライマー対（１）〜（９）をまとめると、以下の表１のとおりである。

【表1】

【発明の効果】

【0012】

本発明の方法によると、飲料中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】本発明で使用される各プライマー対によって増幅される領域を簡単に模式化した図である。

【図1B】本発明で使用される各プライマー対によって増幅される領域を簡単に模式化した図である。

【図2】プライマー対（１）、（３）、（４）及び（６）によって増幅される領域に基づいて、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列からそれぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して作成した比較用配列データを、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトで解析して作成した系統樹を示す。

【図3】プライマー対（８）及び（９）によって増幅される領域の配列に基づいてそれぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して作成した比較用配列データ（配列番号１０３〜１１２参照）を、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトで解析して作成した系統樹を示す（配列番号１０３〜１１２参照）。

【図4】実施例１において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。

【図5】実施例１において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。

【図6】実施例４において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。

【図7】ＣＰ２３０５株において、本発明のプライマー対（１）〜（５）で増幅された領域を、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの他の菌株における対応する領域と比較するために短く調整した配列の例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明者らは、殺菌処理、長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡを鋳型として比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株を特異的に検出することができることを見いだした。
特に、本発明者らは、殺菌処理および／または数ヶ月以上の長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡに対して比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができることを見いだした。長期保存とは例えば１ヶ月以上、または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、さらに好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月またはこれと同等の条件下での保存をいい、特に試料が飲料や食品の場合、製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間の保存も「長期保存」に含まれる。そして、試料を２５℃の保存環境下またはそれに相当する環境下においた場合であれば、例えば９ヶ月以内、少なくとも６ヶ月以内であれば問題なく、試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。なお、保存温度は通常、４〜３５℃の条件で行われる。ただし、当該試料が例えば５５℃という過酷な温度条件下で保存された場合であっても３〜５日間程度であれば、プライマーセットの種類によっては試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出しうることがある。
したがって、本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の菌種または菌株を特異的に検出することができる。特に本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬ．ｇａｓｓｅｒｉあるいはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。

【0015】

本発明によってＬ．ｇａｓｓｅｒｉ、特にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる試料には、乳酸菌（乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物））入りの食品、飲料、飼料等、特に乳酸菌の死菌入りの食品、飲料、飼料等が含まれる。本発明における飲料には、発酵乳、発酵乳(殺菌)、乳製品乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料(殺菌)、乳酸菌飲料及び清涼飲料水が含まれる。
本明細書において「特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉの他の菌株とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株とを区別して、弁別的にＬ．ｇａｓｓｅｒｉまたはＬ．ｇａｓｓｅｒｉの特定の株を検出することを言う。たとえば、「Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出」するとは、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの他の菌株とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株とを区別して弁別的に試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を検出することを言う。また、「Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉを特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種とＬ．ｇａｓｓｅｒｉとを区別して弁別的に試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉを検出することを言う。

【0016】

本発明の方法において、１組以上のプライマー対を用いて、試料中に含まれ得る生物体由来のＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅された配列の配列を決定する。１組のプライマー対では十分な特異性が得られない場合は、同じ遺伝子の他の領域または別の遺伝子を増幅するプライマー対を更に組み合わせて２組以上のプライマー対（各組の各プライマー対は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）を含むプライマーセットとすることができる。本発明においては十分な特異性を得るために２組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行うのが好ましく、さらに好ましくは３組以上、特に好ましくは４組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行なう。プライマーセットを構成する各プライマー対は、このプライマー対によって増幅される配列が検出標的の菌種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）または特定の菌株（たとえば、特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）と他の菌種または菌株の少なくとも１つと異なるように選ばれる。各プライマー対は公知のデータベースから対象となる菌種または菌株の遺伝子配列を入手し、他の菌種または菌株の同じ遺伝子の配列を入手し、これらをアラインメントすることによって目的の菌種または菌株に特徴的な配列、好ましくは可能な限り特異性の高い配列を同定することによって設計することができる。プライマー設計のために、与えられた配列に対してプライマー配列の候補を出力するコンピュータープログラムも利用することができる。各プライマー対が増幅する領域の長さは、一般に約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約８０ｂｐ〜約４５０ｂｐがより好ましく、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐがより好ましく、特に約１００〜約２５０ｂｐ程度が好ましい。増幅する領域の長さを４５０ｂｐよりも長く設定した場合には、飲料中にその長さのＲＮＡが残存していない恐れがあり、所望の量に増幅できない可能性がある。

【0017】

各プライマーセットに含まれるプライマー対の配列および数を上述のように選択することによって、特定の種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）、または特定の種の特定の株（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）を試料中で同定することができる。
ＰＣＲによって増幅された配列を、同じプライマーセットによって増幅される検出標的の菌種または菌株（たとえばＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株）のそれぞれの遺伝子領域の配列と比較する。２以上のプライマー対によって試料から増幅された２以上の遺伝子領域の配列が同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列とそれぞれと一致することは、目的の標的菌種または菌株を同定することの指標となる。２以上のプライマー対を含むセットを用いて増幅された２以上の遺伝子領域の（２以上の）配列の少なくとも１つが同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列と一致しない場合は、その検出標的菌種または菌株が試料中に存在したとは認められない。

【0018】

具体的には、下記のプライマーセットのいずれかをＰＣＲに使用してＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種であるか、及びその中の菌株を特異的に検出することができる。

【0019】

＜プライマーセット（Ａ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

【0020】

＜プライマーセット（Ｂ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

【0021】

＜プライマーセット（Ｃ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

【0022】

＜プライマーセット（Ｄ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCTTATCGTCAGCCATAAGTTCAACTTC（配列番号２）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

【0023】

＜プライマーセット（Ｅ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

【0024】

＜プライマーセット（Ｆ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーTGCTGCCTTAGAGTTTGAACCTG（配列番号６）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

【0025】

＜プライマーセット（Ｇ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーGTACCACATCCATATGAAGCAATC（配列番号１０）

【0026】

＜プライマーセット（Ｈ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーTGAAGTAAACGTCCAACACGTTCAC（配列番号３）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーCGGGGTYGTTTTATCGGTTCG（配列番号４）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーCCTGAAACTTCTCAAGCATTAGG（配列番号８）および
リバースプライマーTTCTCCGCGTTTTCGTTGACA（配列番号７）；
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーCAAGTCTTTCTTGTACCACATCCA（配列番号１１）

【0027】

＜プライマーセット（Ｚ）＞
ｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTTTAAAGCGTCGTAACGAATT（配列番号１）および
リバースプライマーCACCATCAAGCATCATTTGAACAC（配列番号１２）；
並びに
ｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーGCGCTGAAAATCCAACTG（配列番号９）および
リバースプライマーAAGTTTCAGGTTCAAACTCTAAGGC（配列番号５）

【0028】

＜（ｉ）プライマーセット（Ａ）〜（Ｈ）＞
プライマー対（１）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｆｕｓＡ遺伝子領域の配列は配列番号１３に示され、プライマー対（２）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｆｕｓＡ遺伝子領域の配列は配列番号２３に示され、プライマー対（３）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号３３に示され、プライマー対（４）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号４３に示され、プライマー対（５）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号５３に示され、プライマー対（６）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号６３に示され、プライマー対（７）によって増幅されるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のｌｅｐＡ遺伝子領域の配列は配列番号７３に示される（いずれもプライマー配列を含まない）。
また、後述する方法でプライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｆｕｓＡ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）と、プライマー対（４）及び（５）のいずれか１つと、プライマー対（６）及び（７）のいずれか１つとによって増幅されるｌｅｐＡ遺伝子配列上の３か所の遺伝子配列部分の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析することが好ましい。ｆｕｓＡ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位８個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その配列同一性は９８−１００％である。またそれ以外にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉなどが上位に確認できるが、その配列同一性は９０−９５％程度である。ｌｅｐＡ遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その配列同一性は９３−１００％である。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどが上位に確認できたが、その配列同一性は高くても９０％程度である。
以上から、プライマー対（１）又は（２）によって増幅されるｆｕｓＡ遺伝子配列、及び、プライマー対（３）と、プライマー対（４）及び（５）のいずれか１つと、プライマー対（６）及び（７）のいずれか１つとによって増幅されるｌｅｐＡ遺伝子配列の組み合わせでＢＬＡＳＴ解析した場合において、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されたＬ．ｇａｓｓｅｒｉの９種類のいずれの菌株の配列とも上記いずれかのプライマーセットで得られたＰＣＲ産物の配列は、９５〜１００％の配列同一性を有するが、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種以外のラクトバチルス属微生物の配列とは９０％程度の配列同一性しか有さない。

【0029】

各プライマー対によって増幅される領域を図１に模式化した。なお、図１は、簡単な模式化であり、実際のプライマーの長さと厳密に対応するものではない。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出するためには、プライマー対（１）と（３）と（４）と（６）とからなるプライマーセットを使用することが特に好ましい。

【0030】

たとえば、試料に対してプライマーセット（Ａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号１３の配列と同一であり、かつ、プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号３３の配列と同一であり、プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号４３と同一であり、プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号６３と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（３）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合し、さらにその下流にプライマー対（４）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）とプライマー対（６）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）とを結合させた融合配列を用いて同一性を決定してもよい。

【0031】

プライマーセット（Ｂ）〜（Ｈ）を用いた場合にも、上記プライマーセット（Ａ）を用いる場合と同様に操作することで、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。

【0032】

ここで、非特許文献１に記載の既存のプライマー配列によって解析された既存のデータベース登録配列は、当該プライマー配列分から２０〜１００塩基程度が削除されてデータベースに登録されているため、必要に応じて、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５菌株におけるＰＣＲ産物の配列データの長さを調整し、比較することが必要となる。例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、図７に示すように、本発明に使用されるプライマー対（１）〜（５）で増幅される領域の遺伝子配列の長さを調整し得る。

【0033】

また、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセット（Ａ）〜（Ｈ）のいずれかで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、長さを合わせたそれぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することが可能である（図２参照）。Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各種菌株については、ｆｕｓＡ遺伝子配列およびｌｅｐＡ遺伝子配列は、以下のアクセッション番号から取得できる。本系統樹解析により、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各種菌株のいずれかであるか同定することが可能であるが示される。

【0034】

【表2】

【0035】

Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列は、以下の表３のように対応する。なお、これらの配列は、上述のように、既存のプライマー配列によって解析されたＣＰ２３０５株以外のＬ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株の既存のデータベース登録配列は、当該プライマー配列分から２０〜１００塩基程度が削除されている。

【0036】

【表3】

【0037】

＜（ｉｉ）プライマーセット（Ｚ）＞
試料に対して、プライマーセット（Ｚ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、含まれる菌体がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種であるか、及びその中の菌株がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５であるかを特異的に検出することができる。

【0038】

より具体的に説明すると、試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマーセット（Ｚ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号８３の配列と同一であり、かつ、プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号９３の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であると決定することができる。
プライマー対（８）を用いるＰＣＲとプライマー対（９）を用いるＰＣＲが別個の容器内で行われることが好ましい。

【0039】

増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（８）によって得られたｆｕｓＡ遺伝子配列と相同性が高かった上位９個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９８−９９％である。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが確認できるが、その相同性は９２−９４％程度である。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｆｕｓＡ遺伝子であるとの判別が可能である。
また、増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（９）によって得られたｌｅｐＡ遺伝子配列と相同性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９５−９９％であった。また、１１位以降の菌種はＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどのその他の菌種であり、最も相同性が高くても９１％程度である。以上のことから解析配列によりＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｌｅｐＡ遺伝子での判別が可能である。

【0040】

本発明の別の態様において、各プライマーセット中の１組のプライマー対によって増幅された領域の配列の下流に同じプライマーセット中の他の組のプライマー対によって増幅された領域の配列を結合して融合遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成し、この配列を検出標的菌種または菌株について同じプライマー対を用いて同様に作成した融合遺伝子配列と比較することができる。融合遺伝子配列を作成する場合、プライマー配列は共通しているので、プライマー配列を除くことが好ましい。
たとえば、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を検出標的菌株として上記プライマー対（８）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列番号１１３（GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAAATCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGG）で示されるｆｕｓＡ配列の下流に上記プライマー対（９）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列番号１１４（AGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAACACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT）で示されるｌｅｐＡ配列（いずれもプライマー配列を含まない）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下の通りである。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ＣＰ２３０５（配列番号１０３）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAAATCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAACACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT

【0041】

また、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録のＬ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株９種類を検出標的菌株として上記プライマーセット（Ｚ）を使用して増幅された、上記配列番号１１３に対応するｆｕｓＡ配列の下流に、上記配列番号１１４に対応するｌｅｐＡ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列は以下のとおりである。
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１１４１３（配列番号１０４）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCTGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿１９９９２（配列番号１０５）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿４９６３（配列番号１０６）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTACCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿９８５７（配列番号１０７）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT

【0042】

Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿４９６２（配列番号１０８）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGCGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGTATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿２９６０１（配列番号１０９）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATCTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAGAAACCACTTCCCGGTTATCGCCAAATTCCACCAATGGTTTACTCTGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTGCAGTTAAATGATGCT
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１８１７６（配列番号１１０）
GATGACGGCATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATCCGTAAAGCTACTTTGAACTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＬＭＧ＿１０７７１（配列番号１１１）
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＿ＡＴＣＣ＿３３３２３（配列番号１１２）
GATGACGGTATTATGGACAAGTACCTTGGTGGTGAAGAAATTTCTAATGATGAATTAAAAGCAGCTATTCGTAAAGCTACTTTGAATTTGGAATTCTTCCCAGTTTATGCTGGTTCAGCATTTAAGAACAAGGAAAAACCACTTCCTGGTTATCGTCAAATTCCACCAATGGTTTATTCCGGTATGTATCCAGTTGATAATCAAAAATATGATGATTTAAAAGAAGCACTGCAAAAATTACAGTTAAATGATGCG

【0043】

得られた配列番号１０３〜１１２の遺伝子配列に関して、例えばＮｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ ＭｅｔｈｏｄでＭＥＧＡ６等配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、作成した系統樹を図３に示す。図３に示す系統樹からも分かるように、ＣＰ２３０５株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なり、ＣＰ２３０５株であることを明確に確認できる。当該菌株であることが確認できる。

【0044】

上記プライマー対（８）及び（９）からなるプライマーセット（Ｚ）によると、試料に含まれる菌体がＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であるか否か明確に検出することができるため、当該プライマーセットからなるキットも本発明に含まれる。プライマー対（８）及び（９）で増幅される領域は１００〜２００ｂｐと大変小さく、試料中に多く残存している可能性が高いＲＮＡ部分をターゲットとしているため、高い確率でＲＴ−ＰＣＲを成功させることができる。また、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの菌株間の比較において、ＣＰ２３０５株に特異的な領域をターゲットとしているため、明確にＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が試料に含まれているか否かを判別することができる。

【0045】

本発明によって特異的に検出することができるＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株は２００７年９月１１日に特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（旧住所：〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）（ＩＰＯＤはＮＩＴＥ−ＩＰＯＤとして２０１３年４月１日に下記に移転：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３１が付与されている。

【0046】

本発明の方法において、ＲＴ−ＰＣＲは当業者によく知られた方法に従って行うことができる。すなわち、試料から常法にしたがってＲＮＡを抽出し、常法に従ってオリゴｄＴプライマーなどを用いてＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、上記プライマーセットのいずれかを用いて常法にしたがってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことができる。ＰＣＲの条件はプライマーのＴｍ値、増幅される領域の長さ、配列等から導かれる標準的な条件を利用することができる。プライマーセットに含まれる２組のプライマー対（各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）によるＰＣＲは同一の容器中で行うこともできるが、増幅産物を個別にシーケンシングする必要があるのでプライマー対ごとにそれぞれ別個の容器でＰＣＲを行うのが好ましい。得られた増幅産物を電気泳動にかけ、予想される長さの断片が増幅されていることを確認し、そのＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、当分野でよく知られた方法によってシーケンシングする。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ゲルからのＤＮＡ断片の抽出、シーケンシング等を行うための種々の方法、試薬、キットおよびこれらの操作に必要な装置等も当業者にはよく知られており、商業的に容易に入手することもできる。

【0047】

得られた増幅産物の配列とＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株由来の配列（たとえばｆｕｓＡおよびｌｅｐＡ配列）との比較は目視で行うこともできるが配列比較のための各種アルゴリズムやプログラムは商業的に入手可能であり、ＢＬＡＳＴＮなどのツールもＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されており広く公衆に利用可能である。このようなアルゴリズムやプログラムを利用する場合、上述の融合遺伝子配列を比較すれば１回の解析で配列同一性を決定することができるので有利であろう。
またＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株が他の乳酸菌種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株と異なることをより理解しやすくするため、作成した融合遺伝子配列を用いて系統樹を作成することができる。系統樹作成のためのアルゴリズムや具体的なプログラムは当業者にはよく知られており、商業的あるいは公共的に利用可能である。たとえば、ＭＥＧＡなどのフリーソフトウエアや、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されているアラインメントおよび系統樹作成用のＣｌｕｓｔａｌＷなどが利用可能である。

【0048】

試料中の乳酸菌が殺菌処理等により本質的に死滅していると考えられる場合、特に殺菌処理および／または長期保存（例えば、４℃〜３５℃にて、１ヶ月以上または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、特に好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月、またはこれらと同等な条件下における保存）により試料中の乳酸菌が死滅し、かつ乳酸菌由来の核酸が相当程度損傷（分解等）していると考えられる場合においても、本発明によればＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。本発明は試料が飲料や食品の場合、一般に製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間保存されていた場合でもＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種またはＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を特異的に検出することができる。

【0049】

本発明によってＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株と区別され得る他の乳酸菌およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株には、たとえば以下の乳酸菌が含まれるが、これらに限定されない：
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ３１４、ＡＴＣＣ４３５６、ＡＴＣＣ９２２４、ＡＴＣＣ５３５４４、ＡＴＣＣ４３５７）；
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（ＡＴＣＣ３３６２０、ＡＴＣＣ３３６２１、ＬＭＧ１８１８８、ＡＴＣＣ３３６２２、ＡＴＣＣ５３６７１、ＬＭＧ１８１９２、ＬＭＧ１８１７９、ＬＭＧ１８１９０、ＡＴＣＣ３３１９８、ＬＭＧ１８１８０、ＬＭＧ１８１８６）；
Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（ＡＴＣＣ５３５４５、ＡＴＣＣ５５２２１、ＪＣＭ５８１０、ＬＭＧ１１４１５、ＬＭＧ１７７５３、ＡＴＣＣ３３８２０、ＬＭＧ１１４４０、ＬＭＧ１８１８７、ＬＭＧ１２００３、ＬＭＧ１２００５、ＬＭＧ１８１８９）；
Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＬＭＧ１４７５１、ＬＭＧ１８１８１、ＡＴＣＣ５３６７３、ＬＭＧ１４７５２、ＬＭＧ１４７５３、ＬＭＧ１４７５４、ＬＭＧ１４７５５、ＡＴＣＣ３３１９９）；
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ（ＡＴＣＣ４９６３、ＡＴＣＣ１９９９２、ＬＭＧ１１４１３、ＡＴＣＣ２９６０１、ＡＴＣＣ９８５７、ＡＴＣＣ４９６２、ＡＴＣＣ３３３２３、ＬＭＧ１０７７１、ＬＭＧ１８１７６）；
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＬＭＧ１８１７５、ＬＭＧ１８１８４、ＬＭＧ１８１９３、ＮＣＣ５３３、ＡＴＣＣ３３２、ＡＴＣＣ３３２００、ＬＭＧ１８２０４、ＬＭＧ１８１９５）。

【0050】

以下に公知のプライマー対を用いて種々の試料中のＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株の検出を試みたが失敗に終わった結果を参考性１及び２として、簡単に示す。
（参考例１）
（i）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株の生菌体、（ii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の３種類のサンプルから、それぞれ公知の方法でＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡをテンプレートとして、上記非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ７９ Ｎｕｍｂｅｒ ２３）に記載の試験方法に従い、６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）を非特許文献１に記載のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。結果としては、上記（i）及び（ii）のサンプルからは目的の増幅産物が確認されたが、（iii）のサンプルからは配列解析可能な増幅産物が確認されず、菌株の解析を行うことができなかった。

【0051】

（参考例２）
（ii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を加熱殺菌し、乾燥させた菌体（死菌）、及び、（iii）Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株を飲料製品中に混合し加熱殺菌したのちに集菌した菌体（死菌）の２種類のサンプルから公知の方法で抽出した、ＲＮＡをテンプレートにして、参考例１で使用したのと同じプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより６つのハウスキーピング遺伝子（ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ）の一部（約５００ｂｐ〜１０００ｂｐ）の増幅を行った。結果としては、上記（ii）のサンプルからは目的の増幅産物を得ることができたが、（iii）のサンプルからは、目的の増幅産物を得ることができないか、又は非特異的な増幅産物が多く生成され、塩基配列解析に十分な純度の増幅産物を得ることができなかった。

【0052】

参考例１及び２で使用したプライマーは以下のとおりであった。

【0053】

したがって、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株に対する特異的検出能力を試験するまでもなく、非特許文献１（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３ Ｖｏｌｕｍｅ ７９ Ｎｕｍｂｅｒ ２３）に記載された方法およびプライマーは加熱殺菌された乳酸菌（死菌）入り飲料ではそもそもＰＣＲによる増幅産物を得ることすらできず、本発明の目的には利用できないことが明らかになった。
本発明をより理解しやすくすることを目的として本発明の具体的態様を記載する。

【実施例】

【0054】

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらより何ら限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えてもよい。
以下の実施例及び比較例では、以下の実験手順によってシークエンスサンプルを得た。

【0055】

＜実験手順＞
１．集菌とサンプルの洗浄
試料としてのサンプル飲料が入ったペットボトルを開栓前に上下に数回反転させてよく混合し、沈殿物がペットボトルの下部に残っていないことを確認した。次に、ペットボトルを開栓し、サンプル飲料液１０ｍＬを１５ｍＬ容滅菌ディスポプラスティックチューブに採取し、６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離した。遠心分離したサンプル飲料の上澄みを廃棄したのち、１０ｍＬの滅菌水をチューブに入れて再懸濁させた。再懸濁液を６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。沈殿物における下側には必要な菌体、上側には乳タンパク等の夾雑物があるため、滅菌水５ｍＬを添加して菌のペレットを崩さないように上部の乳タンパク等の夾雑物のみを軽く懸濁して上澄みを廃棄し、この洗浄作業を２回繰り返した。菌の沈殿を滅菌水１ｍＬに再懸濁し、滅菌済の１．５ｍＬチューブに採取した。そして、菌の沈殿物の再懸濁液を１４，０００ｒｐｍ（１９，０００×ｇ）にて２分間遠心分離し、滅菌水１ｍＬを添加してペレット上部を洗浄してＲＮＡ抽出用のサンプルとした。

【0056】

２．ＲＮＡ抽出
上記１で得られたＲＮＡ抽出用のサンプルを３５０μｌのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＢＰ）に懸濁しよく溶解した。そして、キットのＤＮＡ除去用カラムを用いてＤＮＡを除去した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ｐｌｕｓキットのマニュアルに従い、ＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ溶液を得た。

【0057】

３．ＲＴ−ＰＣＲによる目的遺伝子領域の増幅
上記２で調製したＲＮＡ溶液から、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^TM Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を使用して目的遺伝子領域を増幅した。
各実施例で使用する各プライマーセットに含まれるそれぞれのプライマーの１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調整した。各プライマーは必要な配列をユーロフィンジェノミクス社のＰＣＲｅａｄｙプライマーにて合成依頼（５０ｐｍｏｌ／ｌ）したものを使用し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの滅菌水にて、５倍に希釈した。

【0058】

ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^TM Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２を用いて、下記反応組成通りに溶液を調製し、ＰＣＲ用の２００μｌ容チューブに下記組成を入れてよく混合した。当該キットのプロトコルではＰＣＲ反応液組成は総量５０μｌとするように指定されていたが、反応液中のＴｅｍｐｌａｔｅ濃度を上げるために総量２５μｌとし、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡの量を４μｌとした。プライマー及びＴｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ（上記２にて調製したＲＮＡ溶液）以外はキットに付属したものを使用した。

【0059】

ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １μｌ
２× １ ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ １２．５μｌ
Ｆｏｒｗａｏｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） １μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μＭ） １μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡ （２にて調整のＲＮＡ溶液） ４μｌ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ₂Ｏ Ｂａｌａｎｃｅ
総量２５μｌ
上記組成で増幅産物が確認されない場合は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＲＮＡの量を８μｌに増量し、再度ＲＴ−ＰＣＲを実施した。

【0060】

サーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットして、以下のように動かした。
ＳＴＥＰ１：５０℃、３０分、
ＳＴＥＰ２：９５℃、２分、
ＳＴＥＰ３：９５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ４：５５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ５：７２℃、３０秒
の条件でＳＴＥＰ３−５を計４０サイクルとして、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。得られたサンプルについて、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認した。

【0061】

４−１．目的バンドのみがきれいに増幅されている場合
（１）反応液５μｌを新品の２００μｌ容ＰＣＲチューブ採取し、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ^TM ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｒｅａｇｅｎｔを２μｌ添加してマイクロピペッターでよく混合した。
（２）サーマルサイクラーで５０℃１５分→８５℃１５分のインキュベーションを行い、ＰＣＲ産物を精製した。

【0062】

４−２．目的バンド以外に１００ｂｐ前後のＰｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒやその他の増幅産物が確認される場合
電気泳動後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐを用いて精製した。
（１）定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認後、アガロースゲルから目的バンドの部分を切り出し、滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取した。
（２）ＮＴＩ溶液２００μｌを添加し、５０℃で５−１０分程度インキュベートする。インキュベート中２−３分おきにＶｏｒｔｅｘにてよく混合しゲルを完全に溶解させた。
（３）Ｎｅｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｃｏｌｕｍｎを付属の２ｍｌのコレクションチューブにセットし（２）で溶解したサンプル液全量をカラムの上に供し、１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットした。
（４）７００ｍｌのＮＴ３溶液をカラムに供し１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットする。この工程をもう１回繰り返した。
（５）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムに残ったＮＴ＃溶液を除去した。
（６）新しい滅菌済みの１．５ｍｌチューブにカラムをセットし、ＮＥ溶液を１５μｌ添加し、室温で１分間静置した。
（７）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムを廃棄し、シーケンス用の精製ＰＣＲ産物とした。

【0063】

５．シーケンスサンプルの調製
Ｂｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ Ｋｉｔ、精製したＰＣＲ産物、並びに、各菌株用のプライマーセットのプライマー対のフォワード及びリバースプライマー両方を用いてシーケンス反応を実施した。
（１）上記３にてＰＣＲに使用したプライマー対のフォワード及びリバースプライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ溶液を、８μｌを滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取し、９２μｌの滅菌水を用いて希釈し、０．８ｐｍｏｌ／μｌの溶液とした。
（２）Ｂｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ Ｋｉｔ付属の溶液と４−１又は４−２で得られたＰＣＲ産物、プライマー溶液、滅菌水を用いて、下記の通りの組成のシーケンス反応用の液を２００μｌ容ＰＣＲチューブに調製した。一つのＰＣＲ産物あたりフォワード解析用とリバース解析用の２サンプルを用意した。

【0064】

フォワード解析サンプル
精製ＰＣＲ産物 ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗａｔｅｒ（滅菌水） ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＲＲ−１００ ４μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ） ４μｌ
２０μｌ

【0065】

リバース解析サンプル
精製ＰＣＲ産物 ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｗａｔｅｒ（滅菌水） ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＲＲ−１００ ４μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ） ４μｌ
２０μｌ
（３）サーマルサイクラーにセットして、
９６℃、１０秒、
５０℃、５秒、
６０℃、４分の条件で計２５サイクル反応を実施した。

【0066】

６．シーケンスサンプルの精製
（１）サンプル数の分の新しい滅菌済みの１．５ｍＬチューブ、及びＢｉｇｄｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用意した。
（２）ＳＡＭ溶液９０μｌとＸｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μｌをチューブに採取し、上記シーケンス反応産物２０μｌを添加した。
（３）チューブシェーカーにセットし、攪拌スピードを最大値にセットし３０分間攪拌した。
（４）７５０×ｇにて２分間遠心を行い、上澄み２０μｌをサンプルとして、ＨｉＤｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄを２０μｌと混合しＤＮＡシーケンサに供し、配列の解析を行った。

【0067】

７．配列の解析と配列同一性及び菌種判別
（１）得られたそれぞれの配列フォワード、リバースの配列をＭＥＧＡ（フリーソフトウエア）の配列解析ソフトを用いて、コンセンサスシーケンスを得た。
（２）得られた配列をＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴＮ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）にて既存のＤＮＡデータと配列同一性の確認を行った。
（３）データベースにＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）を選択し、検索対象の制限を設定せずに配列同一性を確認した。

【0068】

８．配列の解析と配列同一性及び系統樹解析による菌株判別
（１）ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の上記表２に示されるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、解析した遺伝子とそれぞれの遺伝子の配列比較し、今回解析した遺伝子の配列と長さを合わせるために前後の余分な部分を削除した。
（２）長さをそろえた遺伝子の配列を用いて、それぞれの菌株のｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工した。
（３）加工して作成した遺伝子配列に関して、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。系統樹解析の結果ＣＰ２３０５株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なることが判明した。図２及び図３の系統樹は上述したとおりである。

【0069】

［実施例１］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６カ月間保存したペットボトル入りカラダカルピス（登録商標）を使用した。この試料に対し、プライマー対（１）〜（７）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた７種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図４及び図５に示す。図４中レーン１〜３が、それぞれプライマー対（１）〜（３）によるＰＣＲ産物を示す。また、図５中レーン８、６、４及び２が、それぞれサンプル飲料のＲＮＡを利用してプライマー対（４）〜（７）を用いて得られたＰＣＲ産物を示す。なお、図５中レーン７、５、３及び１は、培養したＣＰ２３０５菌体のＲＮＡを利用してプライマー対（４）〜（７）を用いて得られたＰＣＲ産物を示す（ポジティブコントロール）。

【0070】

［実施例２］
実施例１で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｆｕｓＡ遺伝子配列について＞
実施例１のサンプルのプライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号１３の配列とが同一であり、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一であることを確認した。
＜ｌｅｐＡ遺伝子配列について＞
実施例１のサンプルの前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３３の配列とが同一であり、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３４の配列とが同一であることを確認した。また、実施例１のサンプルの前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号５３の配列とが同一であり、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号６４の配列とが同一であり、実施例１のサンプルの前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号７３の配列とが同一であることを確認した。
実施例１のサンプルの含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉである可能性が極めて高いことが明らかになった。

【0071】

［実施例３］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株についてプライマー対（１）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（３）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（４）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（６）によるＰＣＲ産物の塩基配列をつなぎ合わせて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとのｆｕｓＡ遺伝子配列の後ろにｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。結果を図２に示す。図２からも分かるように本試験で解析した実施例１のサンプルから得られたＤＮＡ配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株を含む１０株とは配列が異なることが分かり、サンプルに含まれる菌株はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であることが明らかになった。

【0072】

［実施例４］
試料であるサンプル飲料として、以下の４種類を準備し、それぞれのサンプルについてｆｕｓＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）及びｌｅｐＡ遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行った。
サンプル（ア）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／製造直後
サンプル（イ）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／２５℃で９ヶ月間（賞味期限）保存後
サンプル（ウ）：ペットボトル入りのＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株含有飲料／２５℃で９ヶ月間（賞味期限）保存後
サンプル（エ）：培養したＣＰ２３０５菌末から得られたＲＮＡ（ポジティブコントロール）

【0073】

上記４種類のサンプル（ア）〜（エ）から得られた各２種のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。その結果を図６に示す。図６中レーン１がサンプル（ア）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン２がサンプル（イ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン３がサンプル（ウ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン４がサンプル（エ）のプライマー対（８）によるＰＣＲ産物を示し、レーン５がサンプル（ア）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン６がサンプル（イ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン７がサンプル（ウ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示し、レーン８がサンプル（エ）のプライマー対（９）によるＰＣＲ産物を示す。増幅される鎖長はｆｕｓＡ遺伝子配列増幅用のプライマー対（８）で１５７ｂｐであり、ｌｅｐＡ遺伝子配列増幅用のプライマー対（９）で１６５ｂｐであった。
この結果から、プライマー対（８）及び（９）によって得られるＤＮＡ配列は、比較的短いため、２５℃で長期間保存した後のサンプルであっても、ＰＣＲ産物が得られることが分かった。

【0074】

［実施例５］
実施例４で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｆｕｓＡ遺伝子配列について（図６のレーン１〜４）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（８）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位９個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９８−９９％であった。またそれ以外にＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどが確認できたが、その相同性は９２−９４％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｆｕｓＡ遺伝子であると予測された。
＜ｌｅｐＡ遺伝子配列について（図６のレーン５〜８）について＞
サンプル（ア）〜（エ）のそれぞれのプライマー対（９）を用いて得られたＰＣＲ産物のシークエンス解析結果は全て同じであった。そして、得られたシークエンス解析に基づくＢＬＡＳＴ解析の結果、配列同一性が高かった上位１０個までの菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉであり、その相同性は９５−９９％であった。また１１位以降の菌種はＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓなどのその他の菌種であり、最も相同性が高くても９１％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉのｌｅｐＡ遺伝子であると考えられた。
以上の結果から、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ｇａｓｓｅｒｉである可能性が極めて高いことが明らかになった。

【0075】

［実施例６］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株について実施例４で使用したプライマー対（８）を用いて増幅したｆｕｓＡ遺伝子配列の下流にプライマー対（９）を用いて増幅したｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号１０３）を作成した。また、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＬ．ｇａｓｓｅｒｉ株を含む１０株のそれぞれについても同様に、プライマー対（８）を用いて増幅したｆｕｓＡ遺伝子配列の下流にプライマー対（９）を用いて増幅したｌｅｐＡ遺伝子配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列（配列番号１０４〜１１２）を作成した。作成した融合遺伝子配列群を用いて、ＭＥＧＡ６によりＮｅｉｂｅｒｈｏｏｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ法にて系統樹を作成した。結果を図３に示す。図３からも分かるように本試験で解析したすべてのサンプル（ア）〜（エ）から得られたＤＮＡ配列はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ種の他の株を含む１０株とは配列が異なることが分かり、サンプル（ア）〜（エ）に含まれる菌株はＬ．ｇａｓｓｅｒｉ ＣＰ２３０５株であることが明らかになった。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]