特許 6890145 導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6890145

(24)【登録日】2021年5月26日

(45)【発行日】2021年6月18日

(54)【発明の名称】導入遺伝子発現を制御するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20210607BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210607BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20210607BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210607BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20210607BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210607BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20210607BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20210607BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20210607BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210607BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20210607BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20210607BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 100

   C07K19/00ZNA

   C12N15/55

   C12N15/62 Z

   C12N9/16 Z

   C12N5/10

   C12N5/0735

   C12N5/074

   A61K38/46

   A61K48/00

   A61K35/76

   A61P1/16

   A61P3/00

   A61P3/10

   A61P7/02

   A61P11/00

   A61P17/00

   A61P35/00

   A61P43/00

   A61P37/00

   A61P37/06

【請求項の数】10

【全頁数】56

(21)【出願番号】特願2019-42238(P2019-42238)

(22)【出願日】2019年3月8日

(62)【分割の表示】特願2017-146622(P2017-146622)の分割

【原出願日】2012年9月21日

(65)【公開番号】特開2019-80588(P2019-80588A)

(43)【公開日】2019年5月30日

【審査請求日】2019年3月8日

(31)【優先権主張番号】61/537,349

(32)【優先日】2011年9月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/560,506

(32)【優先日】2011年11月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/670,490

(32)【優先日】2012年7月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】エドワード ジェイ． レバール

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６４９６３６３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 国際公開第２０１１／０１１７６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 BHAKTA, M. et al.，The generation of zinc finger proteins by modular assembly，Methods Mol. Biol.，２０１０年，Vol. 649，pp. 3-30(1-25)

【文献】 KIM, Y. G. et al.，Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，１９９６年，Vol. 93，pp. 1156-1160

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルブミン遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼであって、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、第１および第２の二量体化ＺＦＮを含み、それぞれのＺＦＮはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、アルブミン遺伝子内の標的配列に結合し、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表８の３５３９３、３５３９４、３５３９６、３５３９８、または３５３９９で指定されるジンクフィンガータンパク質に示されるＦ１からＦ５またはＦ１からＦ６の順序の認識ヘリックス領域を含む５または６個のジンクフィンガードメインを含み、この第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは配列番号１２７中の標的部位に結合し、かつ第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、表８の３５３６１、３５３６４、３５３７０、または３５３７９で指定されるジンクフィンガータンパク質に示されるＦ１からＦ５またはＦ１からＦ６の順序の認識ヘリックス領域を含む５または６個のジンクフィンガードメインを含み、この第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは配列番号１２８中の標的部位に結合する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ。

【請求項2】

前記第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、３５３９６で指定されるジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ。

【請求項3】

請求項１または２に記載の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項１または２に記載の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／または請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。

【請求項5】

前記細胞が幹細胞である、請求項４に記載の細胞。

【請求項6】

前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、肝幹細胞、および肝臓幹細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の細胞。

【請求項7】

請求項１または２に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチド、および／または請求項４〜６のいずれかに記載の細胞を含むキット。

【請求項8】

哺乳動物対象の細胞における内因性アルブミン遺伝子を改変するための組成物であって、前記組成物は、請求項１または２に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ、または請求項３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドと、治療用タンパク質をコードする導入遺伝子を含むドナーポリヌクレオチドとを含む、組成物。

【請求項9】

前記ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドおよび／またはドナーポリヌクレオチドがＡＡＶベクターである、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記対象が、凝固障害、ＣＯＰＤもしくは肝臓損傷等のＡ１ＡＴ欠損障害、リソソーム貯蔵疾患、代謝性疾患、糖尿病、表皮水疱症、肝硬変、リポタンパク質リパーゼ欠損症、癌、および自己免疫疾患を含む群から選択される疾患または障害に罹患している、請求項８または９に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２１日出願の米国仮出願第６１／５３７，３４９号、２０１１年１１月１６日出願の米国仮出願第６１／５６０，５０６号、および２０１２年７月１１日出願の米国仮出願第６１／６７０，４９０号の利益を主張するものであり、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、ゲノム編集の分野に関する。

【背景技術】

【0003】

遺伝子治療は、ヒト治療薬の新時代に対する非常に大きな可能性を有している。これらの方法論は、標準の医療行為によって対処することができなかった状態の治療を可能にする。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊または修正、および導入遺伝子に融合される特異的外来プロモーターまたはゲノムへの挿入部位に見られる内在性プロモーターのいずれかによって制御され得る発現可能な導入遺伝子の挿入等のゲノム編集技術の多くの変形を含み得る。

【0004】

導入遺伝子の送達および挿入は、この任意の科学技術を実際に実装するために解決されなければならない障壁の例である。例えば、様々な遺伝子送達方法が治療上での使用に利用可能であり得るが、すべて、安全性、持続性、および発現レベルの間で実質的なトレードオフを伴う。導入遺伝子をエピソーム（例えば、基本的なアデノウイルス、ＡＡＶ、およびプラスミドベースの系）として提供する方法は、一般に安全であり、高い初期発現レベルをもたらし得るが、これらの方法は、ロバストなエピソーム複製を欠き、有糸分裂的に活性な組織における発現の期間を制限し得る。対照的に、所望の導入遺伝子のランダムな組み込み（例えば、組み込みレンチウイルス）をもたらす送達方法は、より持続的な発現を提供するが、ランダムな挿入を標的としない性質のため、レシピエント細胞における無秩序な成長を引き起こし得、ランダムに組み込まれた導入遺伝子カセットの近くで癌遺伝子の活性化を介した悪性腫瘍につながる可能性がある。さらに、導入遺伝子組み込みは複製による損失を回避するが、導入遺伝子に融合される外来プロモーターの最終的に起こるサイレンシングを阻止しない。継時的に、このようなサイレンシングは、ランダムな挿入事象の大部分において導入遺伝子発現の減少をもたらす。さらに、導入遺伝子の組み込みは、あらゆる標的細胞において稀にしか生じず、このことは、所望の治療効果を得るのに十分高い目的とする導入遺伝子の発現レベルを達成することを困難にし得る。

【0005】

近年、部位特異的ヌクレアーゼでの切断を用いて選択されたゲノム遺伝子座への挿入を付勢する導入遺伝子組み込みの新たな戦略が開発されている（例えば、共同所有の特許文献１を参照のこと）。このアプローチは、遺伝子サイレンシングまたは隣接した癌遺伝子の活性化の危険性を最小限に抑えるための正確な導入遺伝子の位置決めを可能にするため、典型的な組み込みアプローチと比較して、導入遺伝子発現の改善、安全性の向上、および発現持続性の向上の可能性を提供する。

【0006】

１つのアプローチは、導入遺伝子のその同族遺伝子座への組み込み、例えば、変異遺伝子を修正するための野生型導入遺伝子の内因性遺伝子座への挿入を含む。あるいは、導入遺伝子は、特にその有益な特性のために選択された非同族遺伝子座に挿入され得る。例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）導入遺伝子の標的挿入に関する特許文献２を参照されたい。同族遺伝子座の標的化は、内因性調節要素によってもたらされる発現制御を引き続き維持しながら内因性遺伝子の発現を導入遺伝子で置き換えることを望む場合に有用であり得る。内因性遺伝子座内または内因性遺伝子座の近くで切断する特異的ヌクレアーゼを使用することができ、導入遺伝子は、相同指向修復（ＨＤＲ）によって、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）中の末端捕捉によってその切断部位に組み込まれ得る。この組み込みプロセスは、ドナーと内因性遺伝子座との間の導入遺伝子ドナーにおける相同性の領域を用いて、または用いることなく決定される。

【0007】

あるいは、導入遺伝子は、そのセーフハーバー遺伝子座で見つけられるプロモーターを利用するか、または挿入前に導入遺伝子に融合される外因性プロモーターによる導入遺伝子の発現調節を可能にするかのいずれかを行い得るゲノム内の特定の「セーフハーバー」位置に挿入され得る。ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１およびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６を含むいくつかのそのような「セーフハーバー」遺伝子座が説明されている（例えば、共同所有の特許文献３、特許文献４、および特許文献５を参照のこと）。上述のように、導入遺伝子構築物がＨＤＲによるプロセスまたはＮＨＥＪによるプロセスのいずれかによって挿入されるようにセーフハーバーに特異的なヌクレアーゼを利用することができる。

【0008】

遺伝子治療の特に魅力的用途は、分泌された遺伝子産物の不足によって引き起こされる障害または治療用タンパク質の分泌によって治療可能である障害のいずれかの障害の治療を含む。そのような障害は、治療用導入遺伝子を適度な数の細胞に送達することによって対処可能であり得るが、但し、それぞれのレシピエント細胞が高レベルの治療用遺伝子産物を発現することを条件とする。そのようなシナリオにおいて、多数の細胞への遺伝子送達の必要性から解放されることで、さもなければ難治性の適応症に対する遺伝子治療の開発の成功を可能にし得る。そのような用途は、安全で永続的な非常に高いレベルの導入遺伝子発現を必要とする。したがって、これらの特性を呈するセーフハーバーの開発は、遺伝子治療の分野において実質的な実用性を提供する。

【0009】

かなりの数の障害は、分泌された遺伝子産物の不足によって引き起こされるか、または治療用タンパク質の分泌によって治療可能である。例えば、凝固障害は、凝固カスケード中の因子が何かしら異常である、すなわち、変異タンパク質の発現または産生を欠くかなり一般的な遺伝的障害である。多くの凝固障害は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損）、または血友病Ｃ（第ＸＩ因子欠損）等の血友病を引き起こす。これらの障害の治療は、多くの場合、重症度に関連している。軽度の血友病の場合、治療が低発現因子の発現を増加させるように設計された治療法を含み得る一方で、より重度の血友病の場合、治療は、不足した凝固因子を定期的に注入して（多くの場合、週に２〜３回）出血症状を予防することを含む。重度の血友病を有する患者は、多くの場合、多くの種類のスポーツへの参加をやめるよう指示され、日々の損傷に十分に注意すべできある。

【0010】

α−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損は、α１−抗トリプシンの産生不全によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、これは、血液および肺における不適正なＡ１ＡＴレベルにつながる。これは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肝臓障害の発症を伴い得る。現在、この欠損症を伴う疾患の治療は、外因性Ａ１ＡＴの注入および肺または肝臓移植を伴い得る。

【0011】

リソソーム貯蔵疾患（ＬＳＤ）は、通常、不要な脂質、糖タンパク質、およびムコ多糖の分解に関与する個々の機能的リソソームタンパク質の欠損を特徴とする希有な代謝性単一遺伝子疾患の一群である。これらの疾患は、特異的酵素の機能不全の理由からそれらを処理して再生利用することが不可能であるため、細胞内でのこれらの化合物の蓄積を特徴とする。一般的な例として、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損−遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ欠損−ＧＬＡ）、ハンター病（イズロン酸−２−スルファターゼ欠損−ＩＤＳ）、ハーラー病（α−Ｌイズロニダーゼ欠損−ＩＤＵＡ）、およびニーマン・ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損−ＳＭＰＤ１）が挙げられる。これらをまとめると、ＬＳＤは、人口の約７０００人に１人の割合で発生する。これらの疾患は、それらの罹患者に計り知れない影響を及ぼす。これらは、通常、顔面および身体発育パターンを有し得、かつ中度から重度の精神発達遅滞を有し得る乳児において最初に診断される。治療の選択肢には、不足した酵素が通常大量の静脈注入によって患者に与えられる酵素補充療法（ＥＲＴ）が挙げられる。そのような治療は、症状のみを治療するものであって治癒的ではなく、したがって、患者は、これらのタンパク質を生涯繰り返し投与されなければならず、注入されるタンパク質に対する中和抗体を発現させ得る可能性がある。多くの場合、これらのタンパク質は短い血清半減期を有するため、患者は、タンパク質の頻繁な注入にも耐えなければならない。例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）製品（イミグルセラーゼ）を投与されるゴーシェ病患者は、週に３回注入されなければならない。酵素の産生および精製にも問題があるため、治療には非常に費用がかかる（１患者当たり１年に１００，０００ドル超）。

【0012】

１型糖尿病は、膵臓β細胞の免疫介在性破壊が重度のインスリン欠損をもたらす障害であり、これらの細胞の一次分泌産物である。ベースラインインスリンレベルの回復は、大血管を巻き込む「大血管」合併症、虚血性心疾患（狭心症および心筋梗塞）、発作、および末梢血管疾患、ならびに微小血管損傷に由来する「微小血管」合併症を含み得るこの障害のより深刻な合併症の多くを大幅に緩和する。微小血管合併症には、目の網膜における血管形成に影響を及ぼし、視覚症状、弱視、および失明の可能性につながり得る糖尿病性網膜症、ならびに、腎組織における瘢痕変化を伴い得、尿中の少量または徐々に多くの量のタンパク質を失い、最終的には透析を必要とする慢性腎疾患になる糖尿病性腎症が含まれ得る。糖尿病性ニューロパチーは、足に無感覚、刺痛、および疼痛を引き起こし得、脚の血管疾患とともに、治療が困難であり、かつ関連感染の結果として切断術を必要とする場合があり得る糖尿病関連の足の障害（糖尿病による足の壊疽等）の危険性に寄与する。

【0013】

抗体は、分泌タンパク質産物であり、その結合柔軟性が様々な治療法の開発のために利用されている。治療用抗体は、疾患（例えば、黄斑変性におけるＶＥＧＦ）の直接的な原因となる標的タンパク質の中和、ならびにその持続性および複製がヒト卵巣表層上皮細胞を危険にさらす細胞（例えば、癌細胞、ならびに自己免疫疾患におけるある免疫細胞）の高選択的な死滅のために使用され得る。そのような適用において、治療用抗体は、その自らの抗体に対する身体の通常の応答を利用して、標的タンパク質またはその抗体の標的抗原を担持する細胞の選択的死滅、中和、またはクリアランスを達成する。したがって、抗体治療は、腫瘍学、リウマチ学、移植、および眼疾患を含む多くのヒト状態に広く適用されている。抗体治療薬の例として、黄斑変性治療用のＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、非ホジキンリンパ腫治療用のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、および乳癌治療用のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。アルブミンは、肝臓で産生されて血液中に分泌されるタンパク質である。ヒトにおいて、血清アルブミンは、血液中に見られるタンパク質の６０％を含み、その機能は、膠質浸透圧を調節することによって血液量を調節することのようである。これは、低溶解性の分子の担体、例えば、脂溶性ホルモン、胆汁塩、遊離脂肪酸、カルシウム、およびトランスフェリンとしての機能も果たす。加えて、血清アルブミンは、ワルファリン、フェノブタゾン（ｐｈｅｎｏｂｕｔａｚｏｎｅ）、クロフィブラート、およびフェニトインを含む治療薬を担持する。ヒトにおいて、アルブミン遺伝子座は高度に発現し、１日約１５ｇのアルブミンタンパク質の産生をもたらす。アルブミンは、自己分泌機能を有しず、単一対立遺伝子ノックアウトに関連した任意の表現型が存在するようには見えず、二対立遺伝子ノックアウトの軽度の表現型のみが観察される（Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：９４１７を参照のこと）。

【0014】

アルブミンは、治療試薬とカップリングされるときにも使用されており、それらの治療薬の血清半減期を延長させる。例えば、Ｏｓｂｏｒｎら（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ（２００２）３０３（２）：５４０）は、血清アルブミン−インターフェロンα融合タンパク質の薬物動態を開示し、融合タンパク質が約１４０倍遅いクリアランスを有し、したがって、融合物の半減期がインターフェロンαタンパク質単独の半減期よりも１８倍長かったことを実証している。アルブミン融合物である現在開発中の治療用タンパク質の他の例には、Ａｌｂｕｌｉｎ−Ｇ（商標）、Ｃａｒｄｅｖａ（商標）、およびＡｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、それぞれ、インスリン融合、ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、またはＧＣＳＦ）、Ｓｙｎｃｒｉａ（登録商標）（グルカゴン様ペプチド−１融合のＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅすなわち、ならびにＩＦＮ−α融合のＡｌｂｕｆｅｒｏｎ α−２Ｂが挙げられる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，（２００９），ｖｏｌ １２，Ｎｏ．２．ｐ．２８８を参照のこと）。これらの場合において、Ａｌｂｕｌｉｎ−Ｇ（商標）、Ｃａｒｄｅｖａ（商標）、およびＳｙｎｃｒｉａ（登録商標）がすべて、アルブミンが融合物のＮ末端上に見られる融合タンパク質である一方で、Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）およびＡｌｂｕｆｅｒｏｎ α ２Ｇは、アルブミンが融合物のＣ末端上に存在する融合物である。
したがって、任意の関連毒性を回避しながら所望の導入遺伝子を治療関連レベルで発現させるために使用され得、かつ導入遺伝子の発現を所望の組織型に制限して、例えば、血友病、糖尿病、リソソーム蓄積症、およびＡ１ＡＴ欠損症等の遺伝的疾患を治療し得るさらなる方法および組成物の必要性が未だ存在する。さらに、癌等の他の疾患を治療するために所望の導入遺伝子を治療関連レベルで発現させるさらなる方法および組成物の必要性が未だ存在する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【特許文献1】米国特許第７，８８８，１２１号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１２／０１２８６３５号明細書

【特許文献3】米国特許出願公開第２００８／０２９９５８０号明細書

【特許文献4】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書

【特許文献5】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

細胞のゲノムにおけるセーフハーバーの作成、標的挿入、および導入遺伝子のその後の発現、例えば、肝臓等の分泌組織からの導入遺伝子の発現のための方法および組成物が本明細書に開示される。一態様において、ゲノム中の目的とする領域（例えば、アルブミン遺伝子）内の標的部位に結合する非天然ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）が本明細書に記載され、ＺＦＰは、１つ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む。一実施形態において、ＺＦＰは、目的とする標的ゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１つ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得られ得る。一実施形態において、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）に由来する。ある実施形態において、ジンクフィンガードメインは、アルブミン遺伝子内の標的部位、例えば、表１、３、５、または８の単一列に示される順に並べられた認識ヘリックスドメインを有するジンクフィンガータンパク質を認識する。

【0017】

別の態様では、ゲノム中の目的とする領域（例えば、アルブミン遺伝子）内の標的部位に結合する転写活性化因子様（ＴＡＬＥ）タンパク質が本明細書に記載され、ＴＡＬＥは、１つ以上の操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含む。一実施形態において、ＴＡＬＥは、目的とする標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、ＴＡＬＥＮは、１つ以上の操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得られ得る。一実施形態において、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ Ｉ）に由来する。ある実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、アルブミン遺伝子内の標的部位、例えば、表１２の単一列に示される標的配列を有するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを認識する。

【0018】

本明細書に記載のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮは、遺伝子内または遺伝子に隣接したコーディング領域または非コーディング領域内の目的とする領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等、またはコーディング領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内の目的とする領域に結合し、かつ／または目的とする領域を切断し得る。ある実施形態において、ＺＦＮは、アルブミン遺伝子に結合し、かつ／またはアルブミン遺伝子を切断する。他の実施形態において、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮは、セーフハーバー遺伝子、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られている）遺伝子、またはＲｏｓａ遺伝子に結合し、かつ／またはそれらを切断する。例えば、米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。別の態様において、本明細書に記載のジンクフィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼのうちの１つ以上を含む組成物が本明細書に記載される。ある実施形態において、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて１つ以上のジンクフィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼを含む。

【0019】

別の態様において、本明細書に記載の１つ以上のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載される。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｍＲＮＡは、化学的に修飾され得る（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（２）：１５４−１５７を参照のこと）。

【0020】

別の態様において、プロモーターに作動的に連結される本明細書に記載の１つ以上のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを含む。ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターが本明細書に記載される。一実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターである。一態様において、ウイルスベクターは、組織特異的向性を呈する。

【0021】

別の態様において、１つ以上のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載される。宿主細胞は、１つ以上のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮ発現ベクターで安定的に形質転換されるか、一過性にトランスフェクトされるか、またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、宿主細胞は、胚幹細胞である。他の実施形態では、１つ以上のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターは、宿主細胞において１つ以上のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮを発現させる。別の実施形態において、宿主細胞は、外因性ポリヌクレオチドドナー配列をさらに含み得る。好適な宿主細胞の非限定的な例として、真核細胞または細胞株、例えば、分泌細胞（例えば、肝臓細胞、粘膜細胞、唾液腺細胞、下垂体細胞等）、血球（赤血球）、幹細胞等が挙げられる。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかにおいて、宿主細胞は、胚細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、または他の哺乳動物の胚細胞を含み得る。

【0022】

別の態様において、細胞内のアルブミン遺伝子を切断するための方法が本明細書に記載され、この方法は、ＺＦＮ（複数可）またはＴＡＬＥＮ（複数可）が発現され、かつ１つ以上のアルブミン遺伝子が切断される条件下で、細胞に、１つ以上のアルブミン遺伝子内の標的部位に結合する１つ以上のＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含む。

【0023】

他の実施形態では、任意の標的遺伝子のゲノム配列が、例えば、本明細書に記載のＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮ（またはこれらのＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮをコードするベクター）ならびにＺＦＮおよび／もしくはＴＡＬＥＮでの標的切断後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列（例えば、導入遺伝子）を用いて置換される。ドナー配列は、別個のベクター（例えば、ＡｄもしくはＬＶベクター）に存在するＺＦＮもしくはＴＡＬＥＮベクターに存在し得るか、またはあるいは、異なる核酸送達機構を用いて細胞に導入され得る。ドナーヌクレオチド配列の標的遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子、他のセーフハーバー遺伝子等）へのそのような挿入は、標的遺伝子座（例えば、アルブミン）の遺伝子制御要素の制御下でドナーによって運ばれる導入遺伝子の発現をもたらす。いくつかの態様において、例えばアルブミン遺伝子への目的とする導入遺伝子の挿入は、無傷の外因性タンパク質配列の発現をもたらし、任意のアルブミンによってコードされたアミノ酸を欠く。他の態様において、発現された外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子およびアルブミン遺伝子によってコードされたアミノ酸（例えば、内因性標的遺伝子座由来、またはあるいは、導入遺伝子上のアルブミンコード配列由来）を含む。いくつかの例において、アルブミン配列が外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在する一方で、他の例では、アルブミン配列は、外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在する。他の例において、アルブミン配列は、外因性タンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分の両方に存在する。アルブミン配列は、全長野生型または変異体アルブミン配列を含み得るか、またはあるいは、部分的アルブミンアミノ酸配列を含み得る。ある実施形態において、アルブミン配列（全長または部分的）は、それが融合される導入遺伝子によって発現されたポリペプチドの血清半減期を延長させるのに役立ち、かつ／または担体としての機能を果たす。いくつかの実施形態において、アルブミン−導入遺伝子融合物が細胞内の内因性遺伝子座に位置する一方で、他の実施形態では、アルブミン−導入遺伝子コード配列は、ゲノム内のセーフハーバーに挿入される。いくつかの態様において、セーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、ＨＰＲＴ、またはＣＣＲ５遺伝子座から選択される（共同所有の米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号、ならびに米国仮特許出願第６１／５５６，６９１号を参照のこと）。

【0024】

別の態様では、本発明は、インビボでのアルブミンプロモーター（例えば、内因性または外因性アルブミンプロモーター）の制御下で導入遺伝子を発現させるために使用することができる方法および組成物を記載する。いくつかの態様において、この導入遺伝子は、目的とする治療用タンパク質をコードし得る。この導入遺伝子は、本発明の方法が欠損または不足したタンパク質の産生（例えば、「タンパク質置換」）のために使用され得るようにタンパク質をコードし得る。いくつかの例において、このタンパク質は、リソソーム蓄積症の治療に関与し得る。表皮水疱症またはＡＡＴ欠損気腫等の様々な状態のタンパク質治療薬を含む他の治療用タンパク質が発現し得る。他の態様では、この導入遺伝子は、発現したタンパク質がそれに新規の望ましい特徴を与える特性（半減期の延長、血漿クリアランス特性の変化等）を有するような配列（例えば、操作された配列）を含み得る。操作された配列は、アルブミン配列に由来するアミノ酸も含み得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、治療用タンパク質、治療用ホルモン、血漿タンパク質、抗体等をコードする。いくつかの態様において、導入遺伝子は、凝固障害等の血液障害に関与するタンパク質をコードし得る。いくつかの態様において、導入遺伝子は、構造核酸（ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする。

【0025】

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、トランスジェニック動物系においてインビボで用いられ得る。いくつかの態様において、トランスジェニック動物は、導入遺伝子がヒト遺伝子をコードするモデル開発において用いられ得る。いくつかの例において、トランスジェニック動物は、対応する内因性遺伝子座でノックアウトされ得、ヒトタンパク質が単離について研究され得るインビボ系の開発を可能にする。そのようなトランスジェニックモデルは、目的とするヒトタンパク質と相互作用し得るか、またはそれを修飾し得る小分子、大きい生体分子、または他の実体を特定するスクリーニング目的のために用いられ得る。他の態様において、トランスジェニック動物は、産生目的、例えば、目的とする抗体または他の生体分子の産生のために用いられ得る。ある実施形態において、動物は、小型の哺乳動物、例えば、イヌ、ウサギ、またはラット、マウス、もしくはテンジクネズミ等の齧歯類である。他の実施形態では、動物は、非ヒト霊長類である。なおさらなる実施形態において、動物は、ウシ、ヤギ、またはブタ等の家畜動物である。いくつかの態様において、導入遺伝子は、選択された遺伝子座（例えば、アルブミンまたはセーフハーバー）、幹細胞（例えば、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞等）、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって得られる動物胚に組み込まれ、その後、この胚は、生きた動物が生まれるように移植される。その後、この動物を性的に成熟するまで育て、子孫を生ませ、子孫のうちの少なくともいくつかは、組み込まれた導入遺伝子を含む。

【0026】

なおさらなる態様において、染色体の内因性遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子）、例えば、胚の染色体に、核酸配列を部位特異的に組み込むための方法が本明細書に提供される。ある実施形態において、この方法は、（ａ）胚に、（ｉ）組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む少なくとも１つのＤＮＡベクター、ならびに（ｉｉ）ジンクフィンガーをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子および／または標的遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）における組み込み部位を認識するＴＡＬＥヌクレアーゼを注入することと、（ｂ）胚を培養してジンクフィンガーおよび／またはＴＡＬＥヌクレアーゼの発現を可能にすることとを含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮによって組み込み部位に導入される二本鎖切断は、核酸配列を染色体に組み込むように、ＤＮＡベクターとの相同的組換えによって修復される。

【0027】

好適な胚は、哺乳類を含むいくつかの異なる脊椎動物種、鳥類、爬虫類、両生類、および魚種から得られ得る。一般的に言えば、好適な胚は、収集、注入、および培養されてジンクフィンガーまたはＴＡＬＥヌクレアーゼの発現を可能にし得る胚である。いくつかの実施形態において、好適な胚には、小型の哺乳動物（例えば、齧歯動物、ウサギ等）、ペット動物、家畜、および霊長類由来の胚が含まれ得る。齧歯動物の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびテンジクネズミが挙げられ得る。ペット動物の非限定的な例として、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが挙げられ得る。家畜の非限定的な例として、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシが挙げられ得る。霊長類の非限定的な例として、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、および尾長ザルが挙げられ得る。他の実施形態では、好適な胚には、魚、爬虫類、両生類、または鳥類由来の胚が含まれ得る。あるいは、好適な胚は、昆虫胚、例えば、ショウジョウバエ胚または蚊胚であり得る。

【0028】

本明細書に記載の方法または組成物のうちのいずれかにおいて、操作された遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）を含む細胞は、幹細胞であり得る。本発明の方法および組成物とともに使用され得る特定の幹細胞型には、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、および肝または肝臓幹細胞が含まれる。ｉＰＳＣは、患者試料および正常対照に由来し得、患者由来のｉＰＳＣは、目的とする遺伝子で正常遺伝子配列に変異し得るか、または正常細胞は、目的とする遺伝子で既知の疾患対立遺伝子に改変され得る。同様に、肝幹細胞は、患者から単離され得る。これらの細胞は、その後、目的の導入遺伝子を発現するように操作され、増殖され、その後、患者に再導入される。

【0029】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）および／またはＴＡＬＥＮ（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、プラスミドを含む。他の実施形態では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。

【0030】

少なくとも１つのＤＮＡベクター（このＤＮＡベクターは、組み込まれる核酸配列に隣接する上流配列および下流配列を含む）ならびに染色体組み込み部位を認識するジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む胚も提供される。本明細書に記載の胚（例えば、性的に成熟するまで発育し、かつ子孫を生むことを許された胚）のうちのいずれかに由来する生物も提供される。

【0031】

別の態様において、凝固因子障害に罹患した動物の治療に用いる薬物ライブラリおよび／または他の治療用組成物（すなわち、抗体、構造ＲＮＡ等）のスクリーニングにおける細胞、細胞株、および動物（例えば、トランスジェニック動物）の使用が本発明の方法および組成物によって提供される。そのようなスクリーニングは、操作された細胞株または初代細胞を用いて細胞レベルで開始することができ、全動物（例えば、ヒト）の治療のレベルまで進み得る。

【0032】

本発明のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥＮを含むキットも提供される。このキットは、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする核酸（例えば、好適な発現ベクターに含まれるＲＮＡ分子またはＺＦＰもしくはＴＡＬＥＮをコードする遺伝子）、ドナー分子、好適な宿主細胞株、本発明の方法を実行するための説明書等を含み得る。

【0033】

したがって、本明細書の本開示は、以下の実施形態を含むが、これらに限定されない。

【0034】

１．内因性アルブミン遺伝子に結合するＤＮＡ結合タンパク質および切断ドメインを含む非天然融合タンパク質であって、内因性アルブミン遺伝子を修飾する、融合タンパク質。

【0035】

２．前記ＤＮＡ−結合タンパク質がジンクフィンガータンパク質を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。

【0036】

３．前記ジンクフィンガータンパク質が、認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１、表３、表５、または表８の単一列に示される認識ヘリックス領域を含む、実施形態２に記載の融合タンパク質。

【0037】

４．前記ＤＮＡ結合タンパク質がＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。

【0038】

５．ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが表１２の単一列に示される標的配列に結合する、実施形態４に記載の融合タンパク質。

【0039】

６．実施形態１〜５に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【0040】

７．実施形態１〜５に記載の１つ以上の融合タンパク質または実施形態６に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、単離細胞。

【0041】

８．前記細胞が幹細胞または胚細胞である、実施形態７に記載の細胞。

【0042】

９．前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、肝幹細胞、および肝臓幹細胞からなる群から選択される、実施形態８に記載の細胞。

【0043】

１０．実施形態１〜５に記載の融合タンパク質または実施形態６に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態７〜９に記載の細胞を含むキット。

【0044】

１１．細胞中の内因性アルブミン遺伝子を切断する方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質が発現し、前記アルブミン遺伝子が切断される条件下で、前記細胞に、実施形態６に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む１つ以上の発現ベクターを導入することを含む、方法。

【0045】

１２．前記ポリヌクレオチドがＡＡＶベクターを含む、実施形態１１に記載の方法。

【0046】

１３．前記細胞が肝臓細胞である、実施形態１１に記載の方法。

【0047】

１４．導入遺伝子を内因性アルブミン遺伝子に導入する方法であって、
前記導入遺伝子が内因性アルブミン遺伝子に組み込まれるように、前記導入遺伝子を含む外因性ポリヌクレオチドの存在下で、実施形態１５〜１７のいずれかに記載の方法に従って内因性アルブミン遺伝子を切断することを含む、方法。

【0048】

１５．前記導入遺伝子が治療用タンパク質を発現する、実施形態１４に記載の方法。

【0049】

１６．前記治療用タンパク質が、リソソーム蓄積症、表皮水疱症、ＡＡＴ欠損気腫、または凝固障害等の血液障害の治療に関与する、実施形態１５に記載の方法。

【0050】

１７．前記導入遺伝子の発現が内因性アルブミン制御配列によって駆動される、実施形態１５または１６に記載の方法。

【0051】

１８．前記導入遺伝子がアルブミン配列をさらに含む、実施形態１５〜１７のいずれかに記載の方法。

【0052】

１９．前記アルブミン配列が前記タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分および／またはカルボキシ（Ｃ）末端部上に存在する、実施形態１８に記載の方法。

【0053】

２０．内因性アルブミン遺伝子に組み込まれた導入遺伝子から発現されるポリペプチドの血清半減期を延長させる方法であって、実施形態１８または実施形態１９に記載の方法に従って前記導入遺伝子を前記内因性アルブミン遺伝子に導入することを含み、前記ポリペプチドの前記血清半減期が延長するように前記導入遺伝子が前記ポリペプチドおよびアルブミン配列を発現する、方法。

【0054】

２１．ポリペプチドの欠損によって引き起こされる疾患を有する対象を治療する方法であって、
導入遺伝子が単離細胞において発現されるように、実施形態１４〜１９に記載の方法に従って前記ポリペプチドをコードする前記導入遺伝子を前記単離細胞に導入することと、前記単離細胞を前記対象に導入し、それによって前記疾患を治療することと、を含む、方法。

【0055】

２２．前記細胞が肝臓細胞または幹細胞である、実施形態２１に記載の方法。

【0056】

２３．前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、肝幹細胞、および肝臓幹細胞からなる群から選択される、実施形態２２に記載の細胞。

【0057】

これらおよび他の態様は、本開示を全体として考慮することにより、当業者に容易に明らかになる。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
内因性アルブミン遺伝子に結合するジンクフィンガータンパク質および切断ドメインを含む非天然融合タンパク質であって、前記内因性アルブミン遺伝子を修飾する、融合タンパク質。
（項目２）
前記ジンクフィンガータンパク質が、認識ヘリックス領域を含む４、５、または６個のジンクフィンガードメインを含み、前記ジンクフィンガータンパク質が、表１、表３、表５、または表８の単一列に示される前記認識ヘリックス領域を含む、項目２に記載の融合タンパク質。
（項目３）
項目１に記載の１つ以上の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目４）
項目１または項目２に記載の１つ以上の融合タンパク質または項目３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む単離細胞。
（項目５）
前記細胞が幹細胞である、項目４に記載の細胞。
（項目６）
前記幹細胞が、胚幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、肝幹細胞、および肝臓幹細胞からなる群から選択される、項目５に記載の細胞。
（項目７）
項目１または項目２に記載の融合タンパク質または項目３に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
（項目８）
細胞中の内因性アルブミン遺伝子を切断する方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質が発現され、かつ前記アルブミン遺伝子が切断される条件下で、前記細胞に、項目１または項目２に記載の少なくとも１つの融合タンパク質または項目３に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む１つ以上の発現ベクターを導入することを含む、方法。
（項目９）
前記ポリヌクレオチドがＡＡＶベクターを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が肝臓細胞である、項目８または項目９に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】パネルＡおよびＢは、内因性染色体標的のＺＦＮ切断、その後のＮＨＥＪによる不完全修復が、標的とした遺伝子座の小さい挿入または欠失（「挿入欠失」）をもたらした程度を定量化するＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）の結果を示すゲルである。このアッセイの説明については、Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１０）６４９：２４７−５６を参照されたい。図１Ａは、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞にトランスフェクトしたマウスアルブミン遺伝子を標的としたＺＦＮの発現構築物を用いた結果を示し、この細胞をトランスフェクション後に３７℃で３日間処理し、その後、Ｃｅｌ−Ｉ分析を用いて修飾された標的部位の画分について分析した。図１Ｂは、細胞をトランスフェクション後の３日間の増殖中に低温ショック（３０℃）に供したことを除いて図１Ａと同一のＺＦＮおよび細胞の結果を示す。レーンの下に示されるパーセントミスマッチ、または％挿入欠失は、ＺＦＮ活性の程度であり、マウスアルブミン特異的ＺＦＮが、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるそれらの内因性染色体標的の切断後、最大５３％の挿入欠失を誘導することができることを示す。

【図2】パネルＡおよびＢは、プラスミドＤＮＡの２つの濃度（２０ｎｇまたは４０ｎｇ）でイヌアルブミン特異的ＺＦＮ対ＳＢＳ３３１１５／ＳＢＳ３４０７７を発現する構築物でトランスフェクトしたイヌＤ１７細胞上で行われたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルである。図２Ａは３日後の結果を示し、図２Ｂは１０日後の結果を示す。このＺＦＮ対は、３日目に標的部位配列の約２５〜３０％の挿入欠失を誘導することができた。

【図3A】パネルＡおよびＢは、目的とする様々な種由来のアルブミン遺伝子のアライメントを示す。図３Ａは、ヒト（ホモサピエンス、配列番号１６０）、アカゲザル（マカカムラッタ、配列番号７３）、マーモセット（カリトリックスジャッカス、配列番号７４）、イヌ（カニスファミリアス、配列番号７５）、ラット（ラッタスノルベジカス、配列番号７５）、およびマウス（ムスムスキュラス、配列番号７６）のエクソン１およびイントロン１の５’領域のアライメントを示す。図３Ｂは、イントロン１の残りおよびエクソン２の小断片のアライメントを示す。この領域は、ヒト（配列番号１６１）、アカゲザル（配列番号７７）、マーモセット（配列番号７８）、イヌ（配列番号７９）、ラット（配列番号８０）、およびマウス（ムスムスキュラス、配列番号８１）の遺伝子座１〜遺伝子座５を含み、これらは、ＺＦＮ標的化のために選択したアルブミン遺伝子の遺伝子座である。示される配列は、開始コドンＡＴＧ（図３Ａ中の大きい囲み）、ならびにエクソン１とイントロン１の境界線（図３Ａ）およびイントロン１とエクソン２の境界線（図３Ｂ）を示す。

【図3B】パネルＡおよびＢは、目的とする様々な種由来のアルブミン遺伝子のアライメントを示す。図３Ａは、ヒト（ホモサピエンス、配列番号１６０）、アカゲザル（マカカムラッタ、配列番号７３）、マーモセット（カリトリックスジャッカス、配列番号７４）、イヌ（カニスファミリアス、配列番号７５）、ラット（ラッタスノルベジカス、配列番号７５）、およびマウス（ムスムスキュラス、配列番号７６）のエクソン１およびイントロン１の５’領域のアライメントを示す。図３Ｂは、イントロン１の残りおよびエクソン２の小断片のアライメントを示す。この領域は、ヒト（配列番号１６１）、アカゲザル（配列番号７７）、マーモセット（配列番号７８）、イヌ（配列番号７９）、ラット（配列番号８０）、およびマウス（ムスムスキュラス、配列番号８１）の遺伝子座１〜遺伝子座５を含み、これらは、ＺＦＮ標的化のために選択したアルブミン遺伝子の遺伝子座である。示される配列は、開始コドンＡＴＧ（図３Ａ中の大きい囲み）、ならびにエクソン１とイントロン１の境界線（図３Ａ）およびイントロン１とエクソン２の境界線（図３Ｂ）を示す。

【図4】パネルＡおよびＢは、肝向性ＡＡＶ８ベクターから発現したアルブミン特異的ＺＦＮを注入したマウス由来の生検した肝臓組織由来のゲノムＤＮＡ上で行われたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示す。結果は、２組のＺＦＮ対（対１：ＳＢＳ３０７２４およびＳＢＳ３０７２５、対２：ＳＢＳ３０８７２およびＳＢＳ３０８７３）を尾静脈を介して静脈内注入した１０匹の野生型マウス（番号２７３〜２８２）のものである。図４Ａは、対１の部位を包含する増幅産物に存在する挿入欠失を定量化するゲルであり、図４Ｂは、対２の部位を包含する増幅産物に存在する挿入欠失を定量化する別のゲルである。肝臓生検におけるＺＦＮ誘導修飾を有するアルブミン遺伝子のパーセントがレーンの下に示されており、ヌクレアーゼがインビボで送達されるときにアルブミンＺＦＮ対が最大１７％の標的を修飾することができることを示す。

【図5】パネルＡおよびＢは、異なるキメラＡＡＶベクターから発現したアルブミン特異的ＺＦＮを注入したマウス由来の生検した肝臓組織由来のゲノムＤＮＡ上で行われたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示す。実験の詳細は実施例５に提供される。図５Ａは、ＡＡＶ媒介遺伝子送達を介して動物に導入されるときに、ＺＦＮが肝臓におけるアルブミン標的をインビボで切断することができることを示す。生検した肝臓におけるＺＦＮ誘導修飾を有するアルブミン遺伝子のパーセントは、最大１６パーセントに及んだ。図５Ｂは、抗Ｆｌａｇ抗体または抗ｐ６５のいずれかを用いた肝臓組織のウエスタンブロットを示す。ＺＦＮをコードするオープンリーディングフレームをポリペプチドＦＬＡＧタグをコードする配列に融合した。したがって、抗Ｆｌａｇ抗体はＺＦＮを検出し、ＺＦＮを受けたマウスにおけるＺＦＮ発現を実証した。抗ｐ６５抗体は、これらの実験において装填対照としての機能を果たし、同等の量のタンパク質を各レーンに装填したことを示した。

【図6】異なる用量の異なるＡＡＶ血清型を送達することによってマウス群をマウスアルブミン特異的ＺＦＮ対３０７２４／３０７２５で処理し、その後、Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて遺伝子修飾について評価したマウス研究の結果を示す。この研究で試験したＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８．２、およびＡＡＶ２／８であった（詳細については本文を参照のこと）。用量レベルは、５ｅ１０〜１ｅ１２ウイルスゲノムに及び、１群につき３匹のマウスに注入した。１個の二倍体細胞につき存在するウイルスゲノムも計算し、各レーンの下に示される。各処理によって誘導されたパーセント挿入欠失も各レーンの下に示されており、このＺＦＮ対がアルブミン遺伝子座を切断することができることを示す。対照マウスにリン酸緩衝生理食塩水を注入した。非特異的帯も図内に示される。

【図7】インビボでマウスアルブミン遺伝子座に挿入した導入遺伝子からのヒト第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の発現を示すグラフである。野生型マウスにおけるマウスアルブミン特異的ＺＦＮで切断した後、ヒトＦ．ＩＸドナー導入遺伝子をイントロン１またはイントロン１２のいずれかのマウスアルブミン遺伝子座に挿入した。このグラフは、ベクター注入後８週間にわたるＦ．ＩＸの発現レベルを示す。この実験において、マウスアルブミンのイントロン１またはイントロン１２のいずれかを標的とするＺＦＮ対を用い、ヒト遺伝子を標的としたＺＦＮを対照として用いた。ドナーＦ．ＩＸ遺伝子はイントロン１への挿入後に用いられるように設計されており、したがって、イントロン１２に挿入した場合は正しく発現されない。ヒトＦ．ＩＸ導入遺伝子は、マウスアルブミンイントロン１遺伝子座への挿入後、少なくとも８週間健全なレベルで発現される。

【図8】パネルＡおよびＢは、ＺＦＮ誘導型Ｆ．ＩＸ導入遺伝子挿入後の血友病マウスの血漿におけるヒトＦ．ＩＸ遺伝子の発現および機能性を示すグラフである。図７に記載の実験をアルブミンイントロン１特異的ＺＦＮおよびヒトＦ．ＩＸドナーを用いて血友病マウスにおいて繰り返した。処理から２週間後、血清における発現レベル（図８Ａ）および凝固時間（図８Ｂ）を分析した。血友病マウスにおけるヒトＦ．ＩＸ導入遺伝子の発現は、凝固時間を正常マウスの凝固時間に戻すことができた。

【図9】（配列番号８２）は、エクソン１およびイントロン１の一部を包含するヒトアルブミン遺伝子配列のセグメントを提供する。配列上の水平線は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの標的部位を示す。

【図10】ヒトであるホモサピエンス（配列番号１５４）、カニクイザル変異形（配列「Ｃ」および「Ｓ」が２つの異なるゲノム配列源に由来する）であるマカカファスシクラリス＿ｃ（配列番号１５５）およびマカカファスシクラリス＿ｓ（配列番号１５６）、ならびにアカゲザルであるマカカムラッタ（配列番号１５７）を含む様々な霊長類種由来のイントロン１におけるアルブミン遺伝子のセグメントのアライメントを示す。図は、アルブミン特異的ＴＡＬＥＮのＤＮＡ標的位置（配列上の水平線によって示される）を示す。

【図11-1】パネルＡ〜Ｃは、ヒトアルブミンを標的としたＴＡＬＥＮまたはＺＦＮで処理したＨｅｐＧ２細胞から単離したゲノムＤＮＡ上で行われたＣｅｌ−Ｉアッセイの結果（図１１ＡおよびＢ）、ならびに異なるギャップ間隔でのＴＡＬＥＮのＮＨＥＪ活性（図１１Ｃ）を示す。ヌクレアーゼを一過性のプラスミドトランスフェクションによってＨｅｐＧ２細胞に導入し、Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて標的修飾を３日後に定量化した。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの２つの変形を用い、それらのＣ末端切断点の位置が異なる＋１７バージョンおよび＋６３バージョンであった（本文を参照のこと）。使用した対が表１０に記載される。加えて、３つのＺＦＮ対も試験し、Ｃｅｌ１アッセイによって検出された％挿入欠失がレーンの下に示される。図１１Ｃは、ＴＡＬＥＮ結合部位間のギャップ間隔（ｂｐ）の観点から見たＮＨＥＪ活性を示すグラフである。

【図11-2】パネルＡ〜Ｃは、ヒトアルブミンを標的としたＴＡＬＥＮまたはＺＦＮで処理したＨｅｐＧ２細胞から単離したゲノムＤＮＡ上で行われたＣｅｌ−Ｉアッセイの結果（図１１ＡおよびＢ）、ならびに異なるギャップ間隔でのＴＡＬＥＮのＮＨＥＪ活性（図１１Ｃ）を示す。ヌクレアーゼを一過性のプラスミドトランスフェクションによってＨｅｐＧ２細胞に導入し、Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて標的修飾を３日後に定量化した。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの２つの変形を用い、それらのＣ末端切断点の位置が異なる＋１７バージョンおよび＋６３バージョンであった（本文を参照のこと）。使用した対が表１０に記載される。加えて、３つのＺＦＮ対も試験し、Ｃｅｌ１アッセイによって検出された％挿入欠失がレーンの下に示される。図１１Ｃは、ＴＡＬＥＮ結合部位間のギャップ間隔（ｂｐ）の観点から見たＮＨＥＪ活性を示すグラフである。

【図12】パネルＡ、Ｂ、およびＣは、アカゲザルアルブミン遺伝子座を対象としたＺＦＮ対の結果を示す。図１２Ａは、３５３９６／３６７９７対と比較した３５３９６／３６８０６対のＮＨＥＪ活性パーセントを示し、３つの独立した実験でＲＦ／６Ａ細胞において試験し、すべて４００ｎｇのＺＦＮ濃度を用いて行った。図１２Ｂは、これらの２つの対の各ＺＦＮ５０ｎｇから４００ｎｇまでの用量滴定を示し、これらの試料を形質導入後に３日目に分析した。図１２Ｂの下半分は、これらの２つの対を４００ｎｇのＺＦＮを用いて３日目または１０日目に比較した別の実験を示す。図１２Ｃは、比較した３つのＺＦＮのＳＥＬＥＸ分析（１００ｍＭの塩濃度で行った）の結果を示し、正中線上の棒線の大きさが予想した位置の結果を示す（すなわち、正中線上の１．０の値を有する単一棒線は、ＳＥＬＥＸ分析において分析される位置のあらゆる塩基が予想された塩基であることを意味する）一方で、正中線下の棒線は、予想外の塩基の存在を示す。分かれた棒線は、他の塩基の相対的寄与度を示す。

【図13】パネルＡおよびＢは、マウスにおけるアルブミン遺伝子座へのヒトＧＬａ導入遺伝子ドナー（ファブリー病に罹患した患者に不足した）の挿入を示す。図１３Ａは、導入遺伝子によってコードされたヒトＧＬａタンパク質に対するウエスタンブロットを示し、矢印は、推定したタンパク質を示す。ＺＦＮおよびドナーの両方を受けたマウスからのマウス試料（試料１−１、１−２、および１−３）とＺＦＮのみを受けたマウス（４−１、４−２、４−３）またはヒトＧＬａドナー（「ヒトファブリードナー」）のみを受けたマウスからのマウス試料（試料５−１および５−２）との比較は、ヒト肝臓溶解物対照と一致した帯の特定につながる。図１３Ｂは、ヒトＧＬａ特異的ＥＬＩＳＡキットを用いたＥＬＩＳＡ結果を示し、マウス由来の試料をウイルス導入の１４日後または３０日後に分析した（詳細については本文を参照のこと）。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を表す。結果は、ＺＦＮおよびドナーの両方を受けたマウスが、ＺＦＮのみを受けたマウスまたはドナーのみを受けたマウスよりも多い量のヒトＧＬａシグナルを有したことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

内因性アルブミン遺伝子を修飾するため、例えば、分泌組織において導入遺伝子を発現させるための組成物および方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、内因性アルブミン遺伝子に挿入されて、さらに肝組織に制限される非常に高い発現レベルを可能にする。導入遺伝子は、治療利益を提供するものを含む任意のタンパク質またはペプチドをコードし得る。

【0060】

したがって、本発明の方法および組成物を用いて、治療的に有益なタンパク質（導入遺伝子由来）を分泌組織において高度に発現された遺伝子座から発現することができる。例えば、導入遺伝子は、血液障害、例えば、凝固障害、および様々な他の単一遺伝子疾患に関与するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現がアルブミン発現制御要素によって制御されるように、内因性アルブミン遺伝子座に挿入され得、高濃度の導入遺伝子をコードするタンパク質の肝臓特異的発現をもたらす。発現され得るタンパク質には、凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、ｖＷＦ等、抗体、リソソーム蓄積に関連するタンパク質、インスリン、α１−抗トリプシン、およびそのように発現されたときに利益をもたらす実際に任意のペプチドまたはタンパク質が含まれ得る。

【0061】

加えて、任意の導入遺伝子は、患者由来の細胞、例えば、患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または他の種類の幹細胞（非限定的な組として、胚、造血、神経、または間葉）に導入されて、分泌組織への最終的な移植において用いられ得る。導入遺伝子は、アルブミン遺伝子またはセーフハーバー遺伝子を含むが、これらに限定されない、これらの細胞における目的とする任意の領域に導入され得る。これらの改変された幹細胞は、例えば、肝細胞に分化され、肝臓に移植され得る。あるいは、導入遺伝子は、特定の組織を標的とするウイルスまたは他の送達系を用いて、所望に応じて分泌組織に指向され得る。例えば、肝臓栄養性アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＡＡＶ８を送達ビヒクルとして用いることで、特異的ヌクレアーゼが導入遺伝子と同時に運ばれるときに所望の遺伝子座での導入遺伝子の組み込みをもたらし得る。
概要

【0062】

方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ
ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。
定義

【0063】

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。

【0064】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0065】

「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的かつ非共有結合的な相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０^−６Ｍ^−１以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋ_ｄの低下と相関性がある。

【0066】

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自身に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、かつ／または、異なるタンパク質（単数または複数）の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２つ異常の種類の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。

【0067】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によってその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。

【0068】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0069】

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を改変する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例には、設計および選択がある。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準によってもたらされる非天然タンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたく、国際公開第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６号、ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。

【0070】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択等の実験プロセスからもたらされる天然には見られないタンパク質である。例えば、米国第５，７８９，５３８号、米国第５，９２５，５２３号、米国第６，００７，９８８号、米国第６，０１３，４５３号、米国第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、および米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0071】

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間における遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同性指向性の修復機構を介して細胞における二本鎖切断の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達をもたらすため、「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に生じるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを含み得る。そのような特殊なＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらす。

【0072】

本開示の方法において、本明細書に記載の１つ以上の標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を作成し、この切断領域内のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の組み込みを促進することが示されている。ドナー配列は、物理的に組み込まれ得るか、またはあるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復用の鋳型として使用され、その結果、ドナーにおいて見られるようなヌクレオチド配列のすべてまたは一部を細胞クロマチンに導入する。したがって、細胞クロマチン内の第１の配列を改変することができ、ある実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用が、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味において、配列の置換）を表し、かつあるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要としないことが理解され得る。

【0073】

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質のさらなる対が、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。

【0074】

細胞クロマチンにおける目的とする領域内の配列の標的組換えおよび／または置換および／または改変のための方法のある実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって改変される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組換えは、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって促進される。

【0075】

本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的とする領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それによって、相同組換えを促進して目的とする領域内の非同一配列を挿入する。したがって、ある実施形態において、目的とする領域内の配列と相同であるドナー配列の一部は、置換されるゲノム配列に約８０〜９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１０１を超える連続した塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１つのヌクレオチドのみが異なる場合、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％よりも高い。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの例において、非相同配列は、概して、５０〜１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。

【0076】

本明細書に記載の方法のいずれかは、目的とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。

【0077】

さらに、本明細書に記載の標的組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコードもしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を産生し得る。

【0078】

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合の骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断に用いられる。

【0079】

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」、ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために同義に使用される。

【0080】

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）を有する偏性ヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号、および同第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。

【0081】

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「ドナー配列」という用語は、
ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。

【0082】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大半は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４をそれぞれ２つ含む八量体と会合した約１５０個の塩基対のＤＮＡを含み、（生物に応じて可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は、概して、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、すべての種類の細胞核タンパク質（原核および真核の両方）を包含するよう意図される。細胞クロマチンは、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方を含む。

【0083】

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。

【0084】

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびあるウイルスゲノムが挙げられる。

【0085】

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列であるが、但し、結合に十分な条件が存在することを条件とする。

【0086】

「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全型内因性分子の機能バージョン、または正常機能型内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。

【0087】

外因性分子は、とりわけ、小分子（組み合わせ化学プロセスによって生成される小分子等）、または高分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上述の分子の任意の修飾誘導体）、または上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線状、分岐状、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

【0088】

外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介導入、およびウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。

【0089】

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

【0090】

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上述の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝結合剤と核酸との間の融合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0091】

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他の個所で示される。

【0092】

本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

【0093】

「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集等のプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。

【0094】

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化および遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を用いて発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰまたはＴＡＬＥＮを含まない細胞と比較して遺伝子発現における任意の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。

【0095】

「目的とする領域」は、細胞クロマチンの任意の領域であり、例えば、遺伝子、または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列等であり、そこで外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断および／または標的組換えの目的のためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であるか、またはヌクレオチド対の任意の整数値であり得る。

【0096】

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

【0097】

「分泌組織」とは、産物を分泌する組織である。消化管に限局される分泌組織の例として、腸管、膵臓、および胆嚢を裏打ちする細胞が挙げられる。他の分泌組織には、肝臓、目および粘膜に関連する組織、例えば、唾液腺、乳腺、前立腺、下垂体、および他の内分泌系のメンバーが含まれる。さらに、分泌組織は、分泌することができる組織型の個々の細胞を含む。

【0098】

「作動可能な連結」および「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素等）の並列に関して同義に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置される。一例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、概して、コード配列とシスに作動可能に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが隣接していなくても、コード配列に作動可能に連結される転写調節配列である。

【0099】

融合ポリペプチドに関して、「作動可能に連結した」という用語は、構成要素の各々が、そのように連結されていない場合に実行したであろう機能と同一の機能を他の構成要素との連結において実行するという事実を指し得る。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが作動可能に連結している一方で、活性化ドメインは、遺伝子発現を上方制御することができる。ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合される融合ポリペプチドである場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインが作動可能に連結している一方で、切断ドメインは、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる。

【0100】

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能的断片」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、完全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能的断片は、対応する天然の分子よりも多いか、少ないか、もしくは同一の数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって評価することができる。上述のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝子的相補性もしくは生化学的相補性の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／４４３５０号を参照されたい。

【0101】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指向することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。

【0102】

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、日常的なアッセイにおいて必ずしも測定されないが、好ましくは容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、および強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープ標識は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。「発現標識」は、目的とする遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動的に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
ヌクレアーゼ

【0103】

組成物、具体的には、導入遺伝子の挿入のための遺伝子の標的化に有用なヌクレアーゼ、例えば、アルブミンに特異的なヌクレアーゼが本明細書に記載される。ある実施形態において、ヌクレアーゼは、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは天然には存在せず、すなわち、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインにおいて操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位（例えば、同族の結合部位とは異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）に結合するように改変され得る。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ、異種の切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含む。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン

【0104】

特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０個の塩基対切断部位を認識し、一般に、４つのファミリー、すなわち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示のホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。これらの認識配列は既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄ
ｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５-１１
２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４-２２８、Ｇｉ
ｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３-１８０、
Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５-３５
３、およびｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。

【0105】

ある実施形態において、ヌクレアーゼは、操作された（天然には存在しない）ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ認識配列が既知である。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９-３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１
５-１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．２２，１１２５-１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．
１２：２２４-２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２６３：１６３-１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２８０：３４５-３５３、およびｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ
４４１：６５６−６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６、米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてのヌクレアーゼという文脈において改変され得るか（すなわち、ヌクレアーゼが同族の切断ドメインを含むように）、または異種の切断ドメインに融合され得る。

【0106】

他の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然には存在しない）ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物に多くの病害を引き起こすことで知られている。キサントモナスの病原性は、２５個を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存ＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物の転写活性化因子を模倣し、かつ植物のトランスクリプトームを操る転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥのうちの１つに、キサントモナス・カンペストリス病原型ベシカトリア由来のＡｖｒＢｓ３がある（Ｂｏｎａｓ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８：１２７−１３６および国際公開第ＷＯ２０１００７９４３０号を参照のこと）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中ドメインを含み、それぞれの反復は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵となる約３４個のアミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。加えて、植物病原性細菌である青枯病菌において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と指定される２つの遺伝子は、青枯病菌の次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されている（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおいて１，５７５ｂｐの欠失分だけ異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物は、キサントモナスのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。

【0107】

したがって、いくつかの実施形態において、標的遺伝子座（例えば、アルブミンまたはセーフハーバー）における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインは、植物病原菌キサントモナス（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９−１５１２およびＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６：１５０１を参照のこと）ならびにラルストニア（Ｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３（１３）：４３７９−４３８４、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号および米国特許公開第２０１１０１４５９４０号を参照のこと）に由来するものと同様のＴＡＬＥ由来の操作されたドメインである。

【0108】

ある実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質（例えば、アルブミンまたは他のセーフハーバー遺伝子内の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質）を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択した標的部位に結合するように操作されるという点で非天然である。例えば、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたく、これらすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0109】

操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。

【0110】

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含む例示の選択方法は、米国特許５，７８９，５３８号、同第９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有の国際公開第０２／０７７２２７号に記載されている。

【0111】

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥドメイン）は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有の国際公開第ＷＯ０２／０７７２２７号に記載されている。

【0112】

標的部位の選択、ＤＮＡ結合ドメイン、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、国際公開第ＷＯ９５／１９４３１号、同第ＷＯ９６／０６１６６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ９８／５４３１１号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／６０９７０号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、同第ＷＯ０２／０９９０８４号、同第ＷＯ９８／５３０５８号、同第ＷＯ９８／５３０５９号、同第ＷＯ９８／５３０６０号、同第ＷＯ０２／０１６５３６号、および同第ＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号に詳述されている。

【0113】

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
Ｂ．切断ドメイン

【0114】

任意の好適な切断ドメインをＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合させてＺＦＮを作成しており、これは、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその目的とする核酸標的を認識し、かつヌクレアーゼ活性を介してＺＦＰ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（３）：１１５６−１１６０を参照されたい。最近になって、ＺＦＮは、様々な生物におけるゲノム修飾のために使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼに融合させてＴＡＬＥＮを作成している。例えば、米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0115】

上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。切断ドメインが由来し得る例示のエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼがあり、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を切断ドメインおよび切断ハーフドメインの源として用いることができる。

【0116】

同様に、上述のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断ハーフドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。概して、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が用いられ得る。２つの切断ハーフドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（もしくはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、互いに空間的定位でこれらの切断ハーフドメインを配置して、例えば二量体化によって切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、互いに対して配置される。したがって、ある実施形態において、標的部位の近端は、５〜８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチド分だけ離れている。しかしながら、任意の整数（なぜ我々は常に「整数」および「整数値」という限定詞を用いるのか？これらは本当に必要なのか？これらは限定するもののように見え、これらを用いることで、我々に次善策を受け入れさせるようである）のヌクレオチドまたはヌクレオチド対は、２つの標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０個以上のヌクレオチド対）。概して、切断部位は、標的部位の間に位置する。

【0117】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上でその認識部位から９ヌクレオチド離れた位置で、他方の鎖上でその認識部位から１３ヌクレオチド離れた位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ
ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。

【0118】

その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示のＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ
ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の一部は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を用いた細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、それぞれＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子を用いることもできる。

【0119】

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。

【0120】

例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。

【0121】

ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、すべての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限に抑えるか、または阻止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。Ｆｏｋ
Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、すべてＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインの二量体化に影響を与える標的である。

【0122】

偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋ Ｉの例示の操作された切断ハーフドメインには、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋ Ｉの４９０位および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、かつ第２の切断ハーフドメインが４８６位および４９９位のアミノ酸残基に変異を含む対が含まれる。

【0123】

したがって、一実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換し、４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置換し、４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置換する。具体的には、本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインを１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位での変異（Ｅ→Ｋ）および５３８位での変異（Ｉ→Ｋ）によって調製して「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と指定される操作された切断ハーフドメインを生成し、別の切断ハーフドメインにおいて４８６位での変異（Ｑ→Ｅ）および４９９での変異（Ｉ→Ｌ）によって調製して「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と指定される操作された切断ハーフドメインを生成した。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限に抑えられるか、または無効にされる偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許公開第２００８／０１３１９６２号を参照されたく、この開示は、参照によりその全体がすべての目的のために組み込まれる。

【0124】

ある実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６、４９９、および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基を４８６位でＧｌｕ（Ｅ）残基に、野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基を４９９位でＬｅｕ（Ｌ）残基に、かつ野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基を４９６位でＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ、「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０、５３８、および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けられた）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基を５３８位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対する番号付け）での変異、例えば、野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基を４９０位でＬｙｓ（Ｋ）残基に、かつ野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基を５３７位でＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ、「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）に置換する変異を含む（米国特許公開第２０１１０２０１０５５号を参照のこと）。本明細書に記載の操作された切断ハーフドメインは任意の好適な方法を用いて、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号、同第２００８０１３１９６２号、および同第２０１１０２０１０５５号に記載の野生型切断ハーフドメイン（Ｆｏｋ Ｉ）の部位特異的変異誘発によって調製され得る。

【0125】

あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸標的部位においてインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物のいずれかで発現され得るか、または個々の構成要素が例えば自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレームにおいて連結され得る。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであり得るか、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

【0126】

ヌクレアーゼは、例えば、国際公開第ＷＯ２００９／０４２１６３号および同第２００９００６８１６４号に記載の酵母菌ベースの染色体系において、使用前に活性化についてスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で既知の方法を用いて容易に設計することができる。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、および国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。ヌクレアーゼの発現は、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、かつグルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあり得る。
標的部位

【0127】

上で詳述されるように、ＤＮＡドメインは、遺伝子座、例えば、アルブミンまたはセーフハーバー遺伝子における任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計も実行され得る。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。

【0128】

ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含むＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示の選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８、ならびに国際公開第ＷＯ９８／３７１８６号、同第ＷＯ９８／５３０５７号、同第ＷＯ００／２７８７８号、同第ＷＯ０１／８８１９７号、そして英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。

【0129】

標的部位の選択、ヌクレアーゼ、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は、当業者に知られており、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳述されている。

【0130】

加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガージンクフィンガータンパク質）は、例えば、５アミノ酸以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。例示の６アミノ酸長以上のリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメイン間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
ドナー

【0131】

上述のように、例えば、変異体遺伝子の修正または野生型遺伝子の発現の増大ための外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも称される）の挿入。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことは容易に明らかになる。ドナー配列は、目的とする位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、２つの相同性領域に隣接した非相同配列を含み得る。さらに、ドナー配列は、細胞染色体内の目的とする領域と相同ではない配列を含むベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞染色体に対していくつかの不連続な相同性の領域を含み得る。例えば、通常は目的とする領域に存在しない配列の標的挿入の場合、この配列は、ドナー核酸分子に存在し得、目的とする領域内の配列に対して相同性の領域に隣接し得る。

【0132】

ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状または環状形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０００４７８０５号および同第２０１１０２０７２１号を参照されたい。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドは、一方の末端もしくは両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加、および修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含むが、これらに限定されない。

【0133】

ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子等のさらなる配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマー等の薬剤と複合された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。

【0134】

ドナーは、概して、その発現が組み込み部位で内因性プロモーターによって、すなわち、アルブミン遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入され得る。しかしながら、ドナーが、プロモーターおよび／あるいはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導的もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことは明らかである。

【0135】

ドナー分子は、内因性遺伝子のすべてもしくは一部が発現されるか、または内因性遺伝子のいずれも発現されないように内因性遺伝子に挿入され得る。例えば、本明細書に記載の導入遺伝子は、例えば、その導入遺伝子との融合物として、内因性アルブミン配列の一部が発現されるか、または内因性アルブミン配列のいずれも発現されないように、アルブミン遺伝子座に挿入され得る。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、アルブミンコード配列を有するか、または有しない）は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。例えば、米国特許公開第２００８０２９９５８０号、同第２００８０１５９９９６号、および同第２０１０００２１８２６４号を参照されたい。

【0136】

アルブミン配列（内因性であるか、または導入遺伝子の一部である）が導入遺伝子とともに発現されるときに、アルブミン配列は、全長配列（野生型もしくは変異体）または部分的配列であり得る。好ましくは、アルブミン配列は機能的である。これらの全長または部分的アルブミン配列の機能の非限定的な例には、導入遺伝子（例えば、治療用遺伝子）によって発現されるポリペプチドの血清半減期を延長させること、および／または担体の役割を果たすことが挙げられる。

【0137】

さらに、発現に必要とされないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。
送達

【0138】

ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によってインビボまたはエクスビボで送達され得る。

【0139】

本明細書に記載のヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号に記載されており、これらのすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0140】

本明細書に記載のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物も、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥＮタンパク質（複数可）のうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを用いて送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルスベクター等を含むが、これらに限定されない任意のベクターを用いてもよい。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号も参照されたく、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、これらのベクターのいずれも治療に必要とされる配列のうちの１つ以上を含み得ることは明らかである。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同一のベクター上または異なるベクター上に担持され得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、いは複数のヌクレアーゼおよび／もしくはドナー構築物をコードする配列を含み得る。

【0141】

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療手順の概説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂoｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、お
よびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。

【0142】

核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、デンドリマー、ポリカチオン、または脂質、核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によって強化されたＤＮＡの取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。

【0143】

さらなる例示の核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものを含む（例えば、米国第６００８３３６号を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第ＷＯ９１／１７４２４号、同第ＷＯ９１／１６０２４号に記載のものを含む。

【0144】

脂質の調製：免疫脂質複合体等の標的化リポソームを含む核酸複合体は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）、米国特許第４,１８６，１８３号、
同第４,２１７，３４４号、同第４,２３５，８７１号、同第４,２６１，９７５号、同第
４,４８５，０５４号、同第４,５０１，７２８号、同第４,７７４，０８５号、同第４,８３７，０２８号、および同第４,９４６，７８７号を参照のこと）。

【0145】

さらなる送達方法は、送達される核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達され、この抗体の一方のアームは、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームは、ＥＤＶに対する特異性を有する。この抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、その後、ＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。一旦細胞内に運び込まれると、その内容物は放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照のこと）。

【0146】

操作されたＺＦＰをコードする核酸を送達するためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を治療するために使用され得、修飾細胞が患者に投与される（エクスビボ）。ＺＦＰを送達するための従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ関連ウイルスによる遺伝子送達方法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、高い導入効率が多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。

【0147】

レトロウイルスの向性を、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡張する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか、または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生成するレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用性の長い末端反復からなる。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これはその後、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために用いられる。一般に用いられているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

【0148】

一過性の発現が好ましい用途において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。アデノ関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、細胞を標的核酸で形質導入するために、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ生成において、かつインビボおよびエクスビボ遺伝子治療手順のために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、国際公開第ＷＯ９３／２４６４１号、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含むいくつかの出版物に記載されている。

【0149】

少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、臨床試験における遺伝子導入に現在利用可能であり、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入される遺伝子による欠損ベクターの相補性に関与するアプローチを利用する。

【0150】

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療用ベクターである（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターにおいて観察されている（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。

【0151】

組換えアデノ関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ関連２型ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組み込みに起因した効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、および偽型ＡＡＶ（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６等）を含む他のＡＡＶ血清型も本発明に従って使用することができる。

【0152】

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で生成することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅される。Ａｄベクターは、例えば、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるもの等の非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注入での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含む（Ｓｔｅｒｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

【0153】

宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする生産細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列（必要に応じて）を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組み込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株内にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため、相当な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性の高い熱処理によって減少させることができる。

【0154】

多くの遺伝子治療の用途において、特定の組織型に対して高度の特異性を有する遺伝子治療ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対して特異性を有するように修飾され得る。リガンドは、目的とする細胞型上に存在することで知られている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、その組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現するあるヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、かつ、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞対にまで拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の説明は、主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理が非ウイルスベクターにも適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。

【0155】

遺伝子治療ベクターは、以下に記載されるように、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与によってインビボで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から移植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または普遍的なドナーの造血幹細胞／前駆細胞等にエクスビボで送達することもでき、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に、細胞が患者に再移植される。

【0156】

ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。あるいは、裸のＤＮＡは投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔を含むが、これらに限定されない、通常、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために用いられる経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能であって、かつ当業者に周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられてもよいが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができる。

【0157】

本明細書に記載のポリヌクレオチドの導入に好適なベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｙ
ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０、Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２、米国特許公開第２００９／０５４９８５号を参照されたい。

【0158】

薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、かつ組成物を投与するために使用される特定の方法によっても部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、様々な薬学的組成物の好適な製剤が利用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。

【0159】

ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物が同一または異なる系を用いて送達され得ることは明らかである。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、プラスミドによって運ばれてもよく、１つ以上のヌクレアーゼは、ＡＡＶベクターによって運ばれてもよい。さらに、同一または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって異なるベクターが投与されてもよい。ベクターは、同時にまたは任意の連続的順序で送達されてもよい。

【0160】

エクスビボ投与用の製剤およびインビボ投与用の製剤は両方ともに、液体中の懸濁液または乳化液を含む。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、かつ有効成分と相溶性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせを含む。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等の少量の補助物質を含有してもよい。
適用

【0161】

本発明の方法および組成物は、タンパク質（複数可）が標的細胞から分泌されるように１つ以上のタンパク質をコードする導入遺伝子を供給することが所望されるといったいかなる場合でも使用することができる。したがって、この技術は、ある問題（例えば、発現レベルの問題または副次機能もしくは非機能として発現されるタンパク質に関連する問題）が原因で患者がいくつかのタンパク質を欠損している条件下での使用である。本発明の特に有用な点は、凝固障害における機能性を修正するか、または回復させる導入遺伝子の発現である。さらに、ＣＯＰＤもしくは肝臓損傷等のＡ１ＡＴ欠損障害、または分泌器官による外因性タンパク質の供給によって軽減され得る他の障害、条件、もしくは疾患は、本発明の方法および組成物によってうまく治療され得る。リソソーム蓄積症は、糖尿病等の代謝性疾患のように本発明の方法および組成物によって治療され得る。

【0162】

治療的に有用であり、かつ典型的には、注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）によって送達されるタンパク質は、本発明の方法および組成物とともに有用である。非限定的な例として、Ｃ−ペプチド（例えば、ＣｅｂｉｘのＥｒｓａｔｔａ（商標））または糖尿病治療用のインスリンの産生がある。さらなる適用は、コラーゲンＶＩＩの産生による表皮水疱症の治療を含む。本明細書に記載の分泌組織におけるＩＧＦ−１の発現を用いて、リポタンパク質リパーゼの発現によって肝硬変およびリポタンパク質リパーゼ欠損症を有する患者におけるこのタンパク質のレベルを増加させることができる。治療利益のために、例えば、癌、自己免疫、および他の疾患の治療のために、抗体を分泌することもできる。凝固に関連した他のタンパク質は、分泌組織において産生され得、フィブリノゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン副因子ＩＩ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、タンパク質Ｚ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−２を含む。

【0163】

以下の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥＮを含む本開示の例示の実施形態に関する。これは例示目的のために過ぎず、例えば、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）および／または天然に存在する操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）のＤＮＡ結合ドメインと異種の切断ドメインとの融合物等の他のヌクレアーゼを用いることができることが理解される。

【実施例】

【0164】

実施例１：マウスアルブミン遺伝子を標的としたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計、構築、および特徴付け
ジンクフィンガータンパク質を、マウスアルブミン遺伝子のイントロン１、１２、および１３内の切断部位を標的化するように設計した。対応する発現構築物を、本質的にＵｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）：８０８−８１６に記載され、かつ米国特許第６，５３４，２６１号に記載されるように組み立て、プラスミドベクター、ＡＡＶベクター、またはアデノウイルスベクターに組み込んだ。表１は、例示のマウスアルブミン特異的ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックスを示し、表２は、これらのＺＦＰの標的部位を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスに接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示され、接触していないヌクレオチドは、小文字で示される。

【表1-1】

【表1-2】

【表2】

実施例２：マウスアルブミン特異的ＺＦＮの活性

【0165】

表１のＺＦＮを、マウス細胞におけるそれらの内因性標的配列を切断する能力について試験した。これを達成するために、表１のＺＦＮを発現する構築物を図１に示される対合のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞にトランスフェクトした。その後、細胞を３７℃で３日間維持するか、または低温ショック（３０℃、共同所有の米国特許公開第２０１１００４１１９５号を参照のこと）に供した。その後、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡをＮｅｕｒｏ２Ａ細胞から単離し、Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：８０８−８１６およびＧｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６４９：２４７−５６）に記載されるようにＣｅｌ−Ｉアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）に供して、ＺＦＮ切断によって誘導された染色体修飾を定量化した。このアッセイにおいて、ＰＣＲを用いてＺＦＮ標的部位を有するＤＮＡ断片を増幅し、その後、結果として得られる増幅産物をミスマッチ特異的ヌクレアーゼＣｅｌ−Ｉ（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，（２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，３５３３−３５４１）で消化し、続いて、無傷の切断された増幅産物をアガロースゲル上で分解する。増幅産物切断の程度を定量化することにより、増幅産物、ひいては最初の細胞プールにおける変異対立遺伝子の画分を計算することができる。これらの実験において、すべてのＺＦＮ対は、ＥＬＤ／ＫＫＲ ＦｏｋＩ変異体対（上述されたもの）であった。

【0166】

Ｃｅｌ−Ｉアッセイの結果が図１に示され、ＺＦＮがそれらのそれぞれの標的部位で切断および結果として生じる変異体を誘導することができることを示す。各ラインの下に示される「パーセント挿入欠失」値は、切断に成功し、その後にＮＨＥＪを介した二本鎖切断の細胞修復中に変異されたＺＦＮ標的の画分を示す。このデータは、形質導入手順が低温ショックを取り入れたときの活性の増加も示す。
実施例３：イヌアルブミン特異的ＺＦＮ

【0167】

イヌアルブミン遺伝子座を標的とするＺＦＮの対をインビボモデルで用いるために構築した。この対を実施例１に記載されるように構築し、以下の表３に示される。各ＺＦＮの標的が表４に提供される。

【表3】

【表4】

【0168】

イヌ特異的ＺＦＮを、イヌ細胞株Ｄ１７を用いたことを除いて本質的に実施例２に示されるように活性についてインビトロで試験した。図２に示されるように、ＺＦＮは、この研究において、約３０％の挿入欠失をもたらすことを示した。
実施例４：非ヒト霊長類アルブミン特異的ＺＦＮ

【0169】

アカゲザル（マカカムラッタ）におけるアルブミン遺伝子座を標的とするＺＦＮを作製した。これらの対を上述のように構築し、以下の表５に示される。ＺＦＮの標的が表６に示される。以下に示されるように、ＳＢＳ番号３５３９６の結合部位のヒト配列（配列番号９２）およびアカゲザル配列（配列番号９３）（以下の表７および８を参照のこと）は完全に保存される。ヒト配列とアカゲザル配列の違いがボックスで囲まれている。

【化1】

【0170】

したがって、アカゲザルアルブミン特異的対を開発するために、３５３９６を、ヒト３５３６４パートナーをアカゲザルにおいて置換するように設計された一連のパターンと対合した。これらのタンパク質は、それらの標的配列（表６）とともに以下（表５）に示される。

【表5】

【表6】

【0171】

アカゲザルアルブミン特異的ＺＦＮを二つ一組で試験して、最大の活性を有する対を決定した。各対において、ＳＢＳ番号３５３９６を、上述の方法を用いて、アカゲザル細胞株ＲＦ／６Ａにおける表５および６に示される可能性のあるパートナーと試験した。

【0172】

Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて検出されたミスマッチのパーセントによって決定された結果として生じた活性がマトリックスの本体に示され（表７）、ＺＦＮ対がアカゲザルアルブミン遺伝子座に対する活性を有することを示す。

【表7】

【0173】

２つの対をより大々的に試験し、ＳＥＬＥＸ分析を用い、かつインビトロでの活性について各対を滴定することによって配列特異性を比較した。結果は、３５３９６／３６８０６対が最も望ましいリード対であったことを示す（図１２を参照のこと）。

【0174】

ヒトアルブミン遺伝子座の配列と他の非ヒト霊長類の配列との比較は、同様の対がカニクイザル等の他の霊長類における作業のために開発され得ることを示す（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。
実施例５：マウスにおけるＺＦＮによるインビボ切断

【0175】

アルブミン特異的ＺＦＮをアルブミン産生の正常部位である肝臓にインビボで送達するために、アルブミン特異的ＺＦＮを肝臓特異的エンハンサーおよびプロモーターから発現する肝向性アデノ関連ウイルスベクター血清型８を生成した（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄおよびＭｉａｏ ｅｔ ａｌ，ｉｂｉｄ）。成人Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、以下のようにアルブミン遺伝子におけるゲノム編集に供した：成人マウスに１×１０^１１ｖ．ｇ．．（ウイルスゲノム）／マウスのＺＦＮ対１（ＳＢＳ３０７２４およびＳＢＳ３０７２５）またはＺＦＮ対２（ＳＢＳ３０８７２およびＳＢＳ３０８７３）のいずれかをｉ．ｖ．（静脈内）注入して処理し、７日後に屠殺した。対１の標的部位を包囲するアルブミン遺伝子の領域を、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイのために以下の２つのＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：
Ｃｅｌ１ Ｆ１：５’ＣＣＴＧＣＴＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＴ ３’（配列番号６９）
Ｃｅｌ１Ｒ１：５’ＣＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＴＧＴＴＣ ３’（配列番号７０）

【0176】

対２の標的部位を包囲するアルブミン遺伝子の領域を、Ｃｅｌ−ＩアッセイのためにこれらのＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：
ｍＡｌｂ ｓｅｔ４Ｆ４：５’ＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＣＡＧＧＡ ３’（配列番号７１）
ｍＡｌｂ ｓｅｔ４Ｒ４：５’ＧＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴ ３’（配列番号７２）

【0177】

図４に示されるように、ＺＦＮは、この研究において、それらの標的部位の最大１７％において挿入欠失をインビボで誘導する。

【0178】

イントロン１の配列を標的とするマウスアルブミン特異的ＺＦＮＳＢＳ３０７２４およびＳＢＳ３０７２５も第２の研究において試験した。ＺＦＮを発現する遺伝子を以前に説明されたようにＡＡＶ２／８ベクターに導入した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５（７３５５）：２１７）。バキュロウイルス系におけるＡＡＶ産生を促進するために、キメラ血清型８．２キャプシド遺伝子を含有するバキュロウイルスを用いた。血清型８．２キャプシドは、ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質ＶＰ１におけるホスホリパーゼＡ２ドメインがキメラキャプシドを作成するＡＡＶ２キャプシドの同等のドメインに置換されたという点で血清型８キャプシドとは異なる。当技術分野において標準の方法を用いてＨＥＫ２９３系またはバキュロウイルス系のいずれかを用いて調製することによって、ウイルス粒子を含有するＺＦＮの産生を行った（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，同書、例えば、米国第６７２３５５１号を参照のこと）。その後、ウイルス粒子を、２００マイクロリットルのマウスアルブミン特異的ＺＦＮをコードするＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／８．２のいずれかの１．０ｅ１１全ベクターゲノムを単一用量で正常雄マウス（ｎ＝６）に投与した。ｒＡＡＶベクターの投与の１４日後、マウスを屠殺し、肝臓を摘出し、当技術分野において標準の方法を用いてＤＮＡまたは総タンパク質のために処理した。ＡＡＶベクターゲノムコピーを定量ＰＣＲで検出した。簡潔に、ｑＰＣＲプライマーを以下のようにＡＡＶ内のｂＧＨｐＡ配列特異的にした。

【化2】

【0179】

ＺＦＮの切断活性を、製造業者のプロトコルに従ってＬＣ−ＧＸ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実行したＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて測定した。ＺＦＮのインビボにおける発現を、標準の方法に従ってＦＬＡＧ−Ｔａｇシステムを用いて測定した。

【0180】

図５に示されるように（この研究における各マウスについて）、ＺＦＮが発現され、マウス肝臓遺伝子中の標的を切断した。各マウス試料においてもたらされた％挿入欠失が、各ラインの下に提供される。ベクターの種類およびそれらの容量がラインの上に示される。ＺＦＮ切断後のミスマッチ修復（％挿入欠失に示される）は、これらのマウスのうちの何匹かにおいて約１６％で検出された。

【0181】

マウス特異的アルブミンＺＦＮを、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／８．２を含む様々なＡＡＶ血清型を用いて送達されるときのインビボ活性についても試験した。これらのＡＡＶベクターにおいて、すべてのＺＦＮコード配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接しており、ＡＡＶ５、６、または８を含み、その後、それぞれ、ＡＡＶ５、６、または８由来のキャプシドタンパク質を用いてカプセル化される。８．２指定は、上述と同一である。ＳＢＳ３０７２４およびＳＢＳ３０７２５ ＺＦＮを以前に説明されたように（Ｌｉ ｅｔ ａｌ、同書）ＡＡＶにクローニングし、ウイルス粒子を、上述のようにバキュロウイルスまたはＨＥＫ２９３一過性トランスフェクション精製のいずれかを用いて産生した。正常マウスに、１用量当たり５ｅ１０〜１ｅ１２ｖｇの用量で、１匹のマウスにつき２００μＬの量で尾注入によって投与した。ウイルスゲノムを二倍体マウスゲノムごとに１４日目に分析し、３０日目および６０日目に分析する。加えて、アルブミン遺伝子座のＺＦＮ指向切断を先に説明されたＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて１４日目に分析し、３０日目および６０日目に分析する。

【0182】

図６に示されるように、切断は、最大２１％の挿入欠失レベルで観察された。比較として先の研究からの試料も図に含まれる（一番右に「ミニ−マウス」研究−Ｄ１４および背景帯（「非特異的帯」）。
実施例６：ドナー核酸およびアルブミンＺＦＮのインビボにおける共送達

【0183】

ヒト第ＩＸ因子の挿入：ＺＦＮを用いて、成人野生型マウスにおけるアルブミン遺伝子座への凝固タンパク質第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の遺伝子の組み込みを標的化した。これらの実験において、マウスを、１×１０^１１ｖ．ｇ．／マウスのイントロン１＋ドナー（「ｍＡｌｂ（イントロン１）」）を標的とするアルブミン特異的ＺＦＮ対１、１×１０^１１ｖ．ｇ．／マウスのイントロン１２＋ドナー（「ｍＡｌｂ（イントロン１２）」）を標的とするアルブミン特異的ＺＦＮ対２、または対照（「対照」）としてヒト遺伝子＋ドナーを標的とするＺＦＮセットのいずれかをＩ．Ｖ．注入して処理した。ＺＦＮ対番号１は、イントロン１を標的とする３０７２４／３０７２５であり、ＺＦＮ対２は、エクソン１２を標的とする３０８７２／３０８７３である。これらの実験において、Ｆ．ＩＸドナー導入遺伝子を、ＺＦＮ誘導切断後に末端捕捉によって組み込んだ。あるいは、Ｆ．ＩＸ導入遺伝子を、導入遺伝子が切断部位への相同性を有するアームに隣接するようにドナーベクターに挿入した。いずれの場合でも、Ｆ．ＩＸ導入遺伝子は、「ＳＡ−野生型ｈＦ９エクソン２〜８」カセットであった（共同所有の米国特許出願第６１／３９２，３３３号を参照のこと）。

【0184】

その後、形質導入マウスを血清ヒトＦ．ＩＸレベルについてサンプリングし、これを評価した（イントロン１への挿入後少なくとも８週間ヒトＦ．ＩＸの安定化発現を示す図７を参照のこと）。発現されたヒトＦ．ＩＸは、アルブミン遺伝子座に標的化されたヒトＦ．ＩＸ導入遺伝子を有する血友病マウスにおける凝固時間の減少によって証明されるように、機能的でもある（図８を参照のこと）。注目すべきことに、導入遺伝子挿入後２週間までは、凝固時間は、野生型マウスの凝固時間と大きな差はない。イントロン１特異的ドナーをイントロン１２遺伝子座に挿入したとき、ヒトＦ．ＩＸの発現をもたらす正しいスプライシングは起こり得ない。この試料におけるシグナルの欠如は、イントロン１部位に組み込まれるイントロン１ドナーからのシグナルが、まさに正しい導入遺伝子組み込みに由来するものであり、別の非特異的部位でのランダムな組み込みおよび発現に由来するものではないことを立証する。

【0185】

ヒトαガラクトシダーゼ（ヒトＧＬａ）の挿入：ヒトＦ．ＩＸ遺伝子の挿入と同様に、ヒトαガラクトシダーゼ（ファブリー病を有する患者に不足した）をコードする遺伝子をマウスアルブミン遺伝子座に挿入した。ＺＦＮ対３０７２４／３０７２５を、Ｆ．ＩＸ導入遺伝子の代わりにαガラクトシダーゼ導入遺伝子を用いて上述のように使用した。この実験において、３匹のマウスを、１マウス当たり３．０ｅ１１ウイルスゲノムの用量のＺＦＮ対を含有するＡＡＶ２／８ウイルスおよび１マウス当たり１．５ｅ１２ウイルスゲノムのヒトＧＬａドナーを含有するＡＡＶ２／８ウイルスで処理した。対照動物に、ＺＦＮ含有ウイルスのみまたはヒトＧＬａドナーウイルスのみのいずれかを与えた。肝臓ホモジネート上で行ったウエスタンブロットは、αガラクトシダーゼ特異的シグナルの増加を示し、αガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれ、かつ発現されたことを示した（図１３Ａ）。加えて、ＥＬＩＳＡを、製造業者のプトロコルに従ってヒトαガラクトシダーゼアッセイキット（Ｓｉｎｏ）を用いて肝臓溶解物上で行った。図１３Ｂに示される結果は、ＺＦＮおよびヒトＧＬａドナーの両方で処理したマウスにおけるシグナルの増加を示した。
実施例７：ヒトアルブミン特異的ＺＦＮの設計

【0186】

ヒトアルブミン遺伝子に対する特異性を有するＺＦＮを設計するために、ヒトアルブミンイントロン１のＤＮＡ配列を先に説明された方法を用いて分析し、最良のＺＦＮ結合を有する標的配列を特定した。イントロンにわたる領域（遺伝子座１〜５）を選択し、いくつかのＺＦＮを、これらの領域を標的とするように設計した（例えば、遺伝子座１〜３からのＺＦＮの結合部位を示す図９を参照のこと）。この分析において、５つの遺伝子座がアルブミンイントロン１を標的とすると特定された（図３Ｂを参照のこと）。標的およびヘリックスが表８および９に示される。

【表8-1】

【表8-2】

【表9-1】

【表9-2】

【0187】

これらのヌクレアーゼを二つ一組で試験し、最大活性を有する対を決定した。試験した対の結果として生じたマトリックスが以下の表１０および１１に示され、二量体の右側に用いられたＺＦＮは、各マトリックスの上にわたって示されており、二量体の左側に用いられたＺＦＮは、各マトリックスの左側に列記されている。Ｃｅｌ−Ｉアッセイを用いて検出されたミスマッチのパーセントで決定した結果として生じた活性は、両マトリックスの本体に示される。

【表10】

【表11】

（注記：「ｎ．ｄ．」とは、この対におけるアッセイが行われなかったことを意味する）

【0188】

このようにして、ヒトアルブミンのイントロン１における標的配列を認識する高度に活性のヌクレアーゼが開発された。
実施例８：アルブミン特異的ＴＡＬＥＮの設計

【0189】

ＴＡＬＥＮを、ヒトアルブミンイントロン１内の配列を標的とするように設計した。ベース認識を正準のＲＶＤベース一致を用いて達成した（「ＴＡＬＥコード」：Ａに対してＮＩ、Ｃに対してＨＤ、Ｇに対してＮＮ（ＮＫ半繰り返し）、Ｔに対してＮＧ）。ＴＡＬＥＮを以前に説明されたように構築した（共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）。ＴＡＬＥＮのサブセットの標的をマカクザルアルブミン遺伝子およびアカゲザルアルブミン遺伝子に保存した（図１０を参照のこと）。ＴＡＬＥＮを米国２０１１０３０１０７３号において説明されるように「＋１７」および「＋６３」ＴＡＬＥＮ骨格に構築した。試験したＴＡＬＥＮの標的および数値識別子が以下の表１２に示される。

【表12】

【0190】

その後、ＴＡＬＥＮを、内因性染色体標的で修飾を誘導する能力についてＨｅｐＧ２細胞において二つ一組で試験し、結果は、＋１７切断点を有する多くのタンパク質が活性であったことを示した。同様に、＋６３切断点を有する多くのＴＡＬＥＮも活性であった（表１３および図１１を参照のこと）。表１３に示される対番号が図１１のレーン上に示される対番号と一致することに留意されたい。３つの組の非最適化アルブミンＺＦＮの並列比較は、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが略同一の範囲の活性を有することを示した。

【表13-1】

【表13-2】

【0191】

以前に言及されたように（共同所有の米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照のこと）、Ｃ１７ ＴＡＬＥＮは、２つのＴＡＬＥＮ標的部位間のギャップが約１１〜１５ｂｐであるときにより高い活性を有する一方で、Ｃ６３ ＴＡＬＥＮは、最大１８ｂｐまでのギャップで活性を維持する（図１０、図１１Ｃ、および表１３を参照のこと）。

【0192】

本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、および出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0193】

理解の明瞭化ために図解および例を用いてある程度詳しく開示を提供しているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明および実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]