特許 6892141 ＡｏｇｄｈＢをコードする遺伝子の機能が欠損している、醸造食品の製造に利用可能な麹菌および当該麹菌を用いた醸造食品の製造法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6892141

(24)【登録日】2021年5月31日

(45)【発行日】2021年6月23日

(54)【発明の名称】ＡｏｇｄｈＢをコードする遺伝子の機能が欠損している、醸造食品の製造に利用可能な麹菌および当該麹菌を用いた醸造食品の製造法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20210614BHJP

   A23L 27/50 20160101ALI20210614BHJP

   A23L 11/50 20210101ALI20210614BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20210614BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20210614BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/15ZNA

   A23L27/50 103Z

   A23L11/50 103

   A23L5/00 J

   C12N15/53

【請求項の数】5

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2019-181178(P2019-181178)

(22)【出願日】2019年10月1日

(65)【公開番号】特開2021-52702(P2021-52702A)

(43)【公開日】2021年4月8日

【審査請求日】2020年5月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000006770

【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社

(72)【発明者】

【氏名】豊島 快幸

【審査官】 関 景輔

(56)【参考文献】

【文献】 KINGHORN J. R., et al.，Journal of Bacteriology，１９７６年，Vol. 125, No. 1，p.42-47

【文献】 KINGHORN J. R., et al.，Journal of General Microbiology，１９７３年，Vol. 78，p. 39-46

【文献】 Zhao G. et al.，Eukaryotic Cell，２０１２年，Vol. 11, No. 9，p.1178

【文献】 Machida M. et al.,，Nature，２００５年，Vol. 438，p.1157-1161

【文献】 櫻井 浩輔 ，麹菌のグルコース代謝抑制株の育種（第２報）有機酸代謝活性株の取得 Breeding of Glucose Metabolism Repressed Mutants from Aspergillus oryzae(Part2)，日本醤油研究所雑誌，財団法人日本醤油研究所，２００２年，第28巻, 第４号，p.169-174

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ａ２３Ｌ ５／００

Ａ２３Ｌ １１／５０

Ａ２３Ｌ ２７／５０

Ｃ１２Ｎ １５／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡｏｇｄｈＢをコードする遺伝子の機能が欠損している、醸造食品の製造に利用可能な麹菌。

【請求項2】

麹菌がアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）である請求項１記載の麹菌。

【請求項3】

請求項１または２に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。

【請求項4】

請求項１または２に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする醸造食品の製造法。

【請求項5】

醸造食品が醤油または味噌である、請求項４の製造法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願発明は、ＡｏｇｄｈＢをコードする遺伝子の機能が欠損している、醸造食品の製造に適した麹菌株および当該菌株を用いた醸造食品の製造法に関する。

【背景技術】

【0002】

醤油の醸造工程における諸味のｐＨは、各種酵素の作用や発酵微生物の挙動に大きな影響を及ぼすものであり、ｐＨの制御は、原料窒素の回収率や風味を管理する上で非常に重要である。中でも、諸味熟成の上流である製麹工程における醤油麹のｐＨは、培地や製麹条件、他の微生物など様々な要素により複雑に制御されている。

【0003】

醤油麹を製造する際には、水分、原料の配合割合、培養温度、時間などの影響で麹ｐＨが過剰に上昇し、その後の発酵へ悪い影響を与えることがある。また麹ｐＨが高いことで、それにより得られる醤油のｐＨが高くなる場合には、色の濃化や、味のぼやけた風味の悪い醤油となり、品質上問題が生じることもある。

【0004】

麹のｐＨに影響を及ぼす要素として、従来、麹中におけるクエン酸等の有機酸の減少とアンモニアの生成により、製麹中におけるｐＨの上昇が生じることが報告されている（非特許文献１）。また、製麹工程のｐＨを制御する方法としては、原料配合や原料の種別の選択、製麹方法などによる方法が検討されているものの（非特許文献２）、醤油麹の製麹において、麹菌のどのような遺伝子がアンモニア生成やｐＨの変動に関わるのか、従来まったく知られていない。

【0005】

なお、麹菌によるアミノ酸代謝経路について様々な研究が従来なされている。たとえば、醤油や酒の製造に用いられるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）について、親株と比べて酸性プロテアーゼの分泌が上昇し、生育が良好な変異株の網羅的な遺伝子発現解析を行った結果、変異株では各種のアミノ酸脱水素酵素の発現量が変化しており、グルタミン酸脱水素酵素ＡＯ１００８＿０９３３４の発現量が大きく上昇していたことが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、当該知見は、実際の醤油麹の製造中における遺伝子発現を解析したものではなく、解析結果が製麹工程における実態を反映しているか不明であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】日本醤油研究所雑誌 第１２巻 第６号，２２４−２２８頁

【非特許文献2】やさしい醤油の技術のまとめ 上巻（一般財団法人日本醤油技術センター），９３−９９頁

【非特許文献3】Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．２０１５，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４５６８０２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記のように、製麹におけるアンモニアの含有量は、麹ｐＨの上昇や、醤油におけるアミノ酸態窒素の含量に影響しうるものであり、麹生成におけるアンモニア生成を適切に制御することは、醤油の製造工程やできあがる醤油の品質を適切に管理する上で非常に重要である。

【0008】

また、製麹中にはアンモニア態窒素が全窒素の１１〜１５％存在しているが、これらはアミノ酸の分解に起因している。一方でグルタミン酸をはじめとする各種の呈味性アミノ酸は、醤油の旨みや甘み、濃厚さに大きく寄与する成分であり、全窒素に対するアンモニア態窒素を低減させ、アミノ酸態窒素の含有量を増加させることは、醤油中のアミノ酸率を高め、呈味をさらに改善するためにも有効な手法であると期待できる。

【0009】

したがって本願発明の課題は、製麹工程においてアンモニア生成に係る麹菌中の酵素を特定することで、製麹工程におけるアンモニア生産やｐＨの制御を容易にし、品質の高い醤油を容易に得られるような醤油菌株を得ること、および当該菌株を用いた製麹方法・醸造食品の製造方法を得ることである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本願発明者は、麹菌を育種し、製麹工程においてｐＨの上昇が生じにくいような変異菌株を得た。そして、当該菌株のゲノムシークエンスを実施した結果、非特許文献３に記載されるような網羅的解析では従来まったく検出されていなかった、配列番号１に記載するアミノ酸配列から成る遺伝子が変異し、機能欠損していることを明らかにした。

【0011】

当該配列番号１に記載するアミノ酸配列から成る遺伝子は、アスペルギルス・ニドゥランスにおいてグルタミン酸脱水素酵素をコードするｇｄｈＢ遺伝子と高い相同性を示すものであることから、ＡｏｇｄｈＢと称する。アスペルギルス・ニドゥランスにおけるｇｄｈＢは、グルタミン酸脱水素酵素活性を有することが知られているものの、例えば製麹工程等において実際に機能しているのか、その寄与はどの程度なのかは明らかになっていない。

【0012】

そこで、さらなる検討として、醸造食品の製造に使用可能なゲノム中のＡｏｇｄｈＢ遺伝子を、遺伝子組み換えにより機能欠損させ、得られた株を用いて製麹を行った結果、製麹工程におけるアンモニア生成および麹ｐＨの上昇が抑制されることが判明した。

【0013】

以上のような検討から本願発明者は、ＡｏｇｄｈＢは、醸造食品製造の製麹工程における麹のｐＨ制御に実際に関わる遺伝子であり、醸造食品製造におけるｐＨ管理において重要であること、麹菌において当該遺伝子の機能を欠損させることで、アンモニアの生成が少なく、麹ｐＨの上昇を抑えられた良好な麹を得ることができることを明らかにし、本願発明を完成させた。

【発明の効果】

【0014】

本願発明の、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能欠損した麹菌を用いて麹を得ることで、製麹工程における麹ｐＨを低く維持することができ、安定的な醸造食品の製造が可能となる。また、例えば醸造食品として醤油を製造した時には、醤油中のアンモニア態窒素が減少するために、遊離アミノ酸量の多い醤油が得られ、官能的に良好な醤油を醸造することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、ヤマサ保有麹菌株である親株Ａ、Ｂと、それぞれから得られた変異株Ａ、Ｂについて醤油培地で培養を行ったときの、ｐＨの時間的推移を表すものである。

【図2】図２は、変異株Ａ、ＢにおけるＡｏｇｄｈＢのアミノ酸配列において変異が生じている部分のアミノ酸配列を、野生株の配列と比較したものである。

【図3】図３は、親株（ΔｌｉｇＤ株）のＡｏｇｄｈＢ遺伝子への変異導入の様子および変異導入後の機能欠損株（ΔＧｄｈＢ株）におけるＡｏｇｄｈＢ遺伝子構造を模式的に表したものである。

【図4】図４は、変異導入株において、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子への変異導入が行われたことを確認するためのＰＣＲを行った結果を表す電気泳動図である。

【図5】図５は、ΔＧｄｈＢ株および親株について醤油培地で培養を行ったときの、ｐＨの時間的推移を表すものである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本願発明において、醸造食品製造に使用できる麹菌とは、醤油、味噌、焼酎、清酒、みりん等の醸造食品の製造に使用可能で、安全性の確立されているアスペルギルス属に属する麹菌であれば、特に限定はされない。具体的には、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリゼーまたはアスペルギルス・ソーヤであり、さらに好ましいのはアルペルギルス・オリゼーである。

【0017】

本願発明においてＡｏｇｄｈＢ遺伝子とは、塩基配列を配列番号２に、遺伝子産物のアミノ酸配列を配列番号１に示す遺伝子を指す。アスペルギルス・オリゼーにおけるＡｏｄｇｈＢ遺伝子（ＡＯ０９０００１０００７１７遺伝子）は、例えばＮＣＢＩのウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）等から情報を取得することが可能である。

【0018】

ＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能欠損株は、相同組換えによる遺伝子破壊や、変異導入、ゲノム編集等による機能欠損の誘導により取得することができる。

【0019】

相同組換えによる遺伝子の破壊方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを麹菌に取り込ませ、相同組換えによって当該ＤＮＡ断片を麹菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としては、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。

【0020】

相同組換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。

【0021】

また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、イオンビーム、紫外線を照射する方法を挙げることができる。

【0022】

さらに、ゲノム編集による方法としては、ＺＦＮ（Zinc-Finger Nuclease）、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ９等の部位特異的ヌクレアーゼを用いて、標的のゲノム部位におけるＤＮＡの二本鎖切断を起こし、その後に誘導されるＤＮＡの修復機構を利用して標的ゲノムの破壊や塩基置換を生じさせる方法を挙げることができる。

【0023】

上記のような遺伝子破壊法、変異導入法またはゲノム編集等によってＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能が欠損した株において、実際にアンモニア生成能が低下しているかどうかは、例えば下記のような試験方法によって検証することが可能である。

【0024】

（検証方法）
醤油培地（脱脂加工大豆５ｇに水を７ｍｌ加え、割砕小麦５ｇをよく混合したのち、オートクレーブにて１２１℃、４０分間処理）に麹菌胞子を１０^６個／ｇ程度となるように植菌し、所定の時間培養し、培養産物中のアンモニア量を定量することで検証する。アンモニアの抽出は培養物に水１００ｍｌを加えてよく撹拌し、５℃で４時間以上静置後、ろ過し、分析サンプル液を得る。分析は市販のアミノ酸分析装置やＦ−キット アンモニア（Ｊ．Ｋ．インターナショナル）などを用いて分析できる。

【0025】

本願発明の麹菌は、各種の醸造食品の製造に使用することができる。醸造食品の例としては、醤油、味噌、焼酎、清酒、みりん等が挙げられ、中でも醤油または味噌に用いることが好ましく、醤油に用いることが特に好ましい。

【0026】

本願発明の麹菌を用いた麹の製法およびその麹を用いた醸造食品を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。一例として、醤油の製造においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とすればよい。

【実施例】

【0027】

（実施例１：アンモニア低生産変異麹菌株の取得と変異箇所の分析）
２種のヤマサ保有麹菌株（アルペルギルス・オリゼー、以下「親株Ａ」、「親株Ｂ」と記載する）に対して紫外線を照射し、変異原処理を行った。なお、変異原処理の方法は下記に拠った。

【0028】

（変異処理の方法）
メンブレンフィルターに麹菌胞子を吸着させ、当該フィルターにＵＶを照射した後、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に懸濁した（生存率１％程度）。１プレートあたり１０コロニー程度となるように、０．０５％ツィーン液にて１０００倍希釈し、Ｌ−アルギニン、オルニチンを含む最小培地（組成：スクロース０．５％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、トレースエレメント０．１％、ブロモクレゾールパープル０．００５％、寒天１．５％、ｐＨ５．５）へプレーティングした。

【0029】

当該培地における培養では、ブロモクレゾールパープルの作用により、ｐＨが上昇するとコロニーが青く呈色する。３日間培養した後、黄色のコロニーを、ｐＨ上昇が生じない変異候補菌株として選抜した。

【0030】

取得した麹菌変異候補菌株を、醤油培地（脱脂加工大豆５ｇに水を７ｍｌ加え、割砕小麦５ｇをよく混合したのち、オートクレーブにて１２１℃、４０分間処理）に植菌し、２８℃で２４、４８、７２時間培養することで培養物（麹）を製造した。各培養物に水１００ｍｌを加えてよく撹拌し、５℃で４時間以上静置後、ろ紙ろ過した。ろ液のｐＨを測定し、ｐＨの上昇が抑制されている株を２次スクリーニングした。

【0031】

結果、親株Ａ由来、親株Ｂ由来の変異体候補株からそれぞれ１株ずつの変異株を取得した（以下それぞれ「変異株Ａ」、「変異株Ｂ」と記載する）。

【0032】

ｐＨの測定結果を図１に示す。結果、親株Ａ、Ｂでは培養時間が長くなるにつれてｐＨの上昇が確認されたのに対し、取得された変異株Ａ、Ｂでは、ｐＨの過剰な上昇は確認されなかった。

【0033】

そこで、これら変異株Ａおよび変異株Ｂのゲノム配列を解読し、変異点解析を行った。異なる親株で同じ箇所に変異がみられれば、当該変異がｐＨ過剰上昇の抑制をもたらす機能遺伝子である可能性が高いと考えられる。

【0034】

ゲノム抽出にはＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、得られたゲノムＤＮＡの解析をフィルジェン株式会社に委託した。ゲノム解析はｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００（イルミナ株式会社）を用いてＰＥ１５０で２Ｇｂｐずつシークエンスを実施し、両側で合計４Ｇｂｐのシークエンスデータが得られた。 変異点解析の手順は、下記のようにして行った。

【0035】

（解析方法）
親株、変異株それぞれのシークエンスデータについて、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）を使用し、アスペルギルス・オリゼー ＲＩＢ４０株の全ゲノム配列を参照配列としてマッピングを行った。Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌ Ｋｉｔ （ＧＡＴＫ）のＨａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃａｌｌｅｒで変異株に特有の変異箇所を検出した。

【0036】

変異点解析の結果、変異株Ａは親株Ａの遺伝子領域の２７箇所、変異株Ｂは親株Ｂの遺伝子領域の４８箇所に変異が確認された。そのうち、両者に共通する変異遺伝子は、ＡＯ０９０００１０００７１７のみであった。

【0037】

ＡＯ０９０００１０００７１７遺伝子は、１０６１アミノ酸をコードし、アスペルギルス・ニドゥランスのグルタミン酸脱水素酵素（ＧＤＨ）であるｇｄｈＢとアミノ酸レベルで８９．６％と高い相同性を示した。以下、当該遺伝子（ＡＯ０９０００１０００７１７遺伝子）をＡｏｇｄｈＢ遺伝子と称する。

【0038】

変異株Ａ、Ｂはいずれも、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子において、変異によりフレームシフトが生じており、変異株Ａでは６９７番目以降（７０４番目にＳｔｏｐコドン）、変異株Ｂでは２４９番目以降（２９８番目にＳｔｏｐコドン）のアミノ酸配列が全く異なるものとなったために、機能を失っていることが強く示唆された（図２）。

【0039】

（実施例２：供与菌株を用いたＡｏｇｄｈＢ機能欠損株の作成と評価）
（実施例２−１：ｇｄｈＢ破壊株ベクターおよび破壊株の作成）
アスペルギルス・オリゼーにおけるＡｏｇｄｈＢ遺伝子が製麹中に実際に機能しているか否かをさらに明らかにするため、供与菌株を親株に用いたＡｏｇｄｈＢ機能欠損株の作成を試みた。

【0040】

ＡｏｇｄｈＢ遺伝子のＯＲＦ上流１．８ｋｂｐ（配列番号３）、下流１．３ｋｂの領域（配列番号４）、アスペルギルス・ニドゥランス由来のｓＣマーカー（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）の３断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて結合し、破壊用ベクターを作成した。

【0041】

得られた破壊断片をＰＣＲにて増幅し、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株由来であるΔｌｉｇＤ株（ｎｉａＤ⁻， ｓＣ⁻， ｌｉｇＤ：：ｐｔｒＡ）を親株に用いて形質転換を行った。コントロール株として、アスペルギルス・オリゼーのｓＣ遺伝子領域に、アスペルギルス・ニドゥランス由来のｓＣマーカーを挿入した株をコントロール株とした。なお、ＲＩＢ４０株は公知の供与株であり、ΔｌｉｇＤおよびその作成方法も論文により公知である（Ｍｉｚｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４５（２００８） ８７８−８８９頁）。

【0042】

得られた形質転換体について、ベクター由来のＤＮＡ断片が組換えにより確かに挿入されている株であることをＰＣＲによって確認した（図３、４）。ＰＣＲではフォワードプライマーとしてプライマーＡ（配列番号５）、リバースプライマーとしてプライマーＢ（配列番号６）を用いた。プライマーＡ、Ｂの作成位置は、図３に示す通りである。
以上の方法により、アスペルギルス・オリゼーＡｏｄｇｈＢ遺伝子機能欠損株（以下、「ΔＡｏｇｄｈＢ株」と記す場合がある）を得た。

【0043】

（実施例２−２：原料培地での生育）
脱脂加工大豆５ｇに水を７ｍｌ加え、割砕小麦５ｇをよく混合したのち、オートクレーブにて１２１℃、４０分間処理した。得られた原料に、コントロール株およびΔＡｏｇｄｈＢ株の胞子懸濁液（１．４×１０^７個／ｍｌ）を１ｍｌずつ加え、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間培養した。各培養物に水１００ｍｌを加えて振とうし、４時間静置後、ろ紙ろ過したろ液のｐＨを測定した。

【0044】

［結果］
結果、コントロール株では時間と共にｐＨが直線的に上昇しているのに対し、ΔＡｏｇｄｈＢ株では、製麹後期でのｐＨ上昇は確認されなかった。このことから、製麹後期におけるｐＨの上昇にはＡｏｇｄｈＢが寄与していることが明らかとなった（図５）。

【0045】

（実施例２−３：遺伝子破壊株の醤油醸造における評価）
脱脂加工大豆２００ｇに水を２６０Ｌ加え吸水させ、常法に従って蒸煮した。また、生小麦２００ｇを常法に従って焙焼し、割砕した。ΔＡｏｇｄｈＢ株およびコントロール株の胞子１×１０^６ｃｆｕ／ｇをそれぞれ混合し、常法に従い４８時間製麹した。

【0046】

得られた麹について食塩濃度約２５％（ｗ／ｖ）の塩水を７００ｍＬ添加して、濃口醤油の仕込みを行った。麹と塩水が十分になじんだ翌日によく撹拌した後、諸味をろ過し、それぞれのろ液のアンモニア量とｐＨを測定した。なお、アンモニア量はアミノ酸分析装置（日立ハイテク）を用いて測定した。

【0047】

結果、コントロール株におけるろ液１ｍＬ当たりのアンモニア濃度は２．２２（ｍｇ／ｍＬ）であったのに対し、ΔＡｏｇｄｈＢ株におけるアンモニア濃度は１．３７（ｍｇ／ｍＬ）に低下していた。アンモニア量比およびｐＨについて、コントロール株における測定値を１．００としたときの比を表１に示す。このように、ΔＡｏｇｄｈＢ株を用いて製造した麹では、コントロール株を用いて製造した麹と比べて有意にアンモニア量の低減が確認され、ｐＨも有意に低かった。

【0048】

【表1】

【0049】

塩水を添加して仕込んだ諸味は、常法に従って乳酸菌、酵母を添加し、４ヶ月間発酵・熟成させた。熟成後の諸味をろ過し、生醤油を得た。

【0050】

当該生醤油中の総遊離アミノ酸量およびアンモニア量を、アミノ酸分析装置（日立ハイテク）を用いて測定した。結果、コントロール株使用生醤油における全窒素濃度１％（ｗ／ｖ）当たりのアンモニア濃度は１．６５（ｍｇ／ｍＬ）であったのに対し、ΔＡｏｇｄｈＢ株使用生醤油におけるアンモニア濃度は１．０５（ｍｇ／ｍＬ）に低下していた。また、コントロール株使用生醤油における全窒素濃度１％（ｗ／ｖ）当たりの総遊離アミノ酸濃度は３１．５７（ｍｇ／ｍＬ）であったのに対し、ΔＡｏｇｄｈＢ株使用生醤油における総遊離アミノ酸濃度は３５．２７（ｍｇ／ｍＬ）に増加していた。コントロール株における測定値を１．００としたときの量比を下記表２に示す。

【0051】

このように、ΔＡｏｇｄｈＢ株を用いて製造した濃口醤油では、コントロール株を用いて製造した濃口醤油と比べて、有意に遊離アミノ酸量が増加し、かつアンモニア量が低減していることが確認された。

【0052】

【表2】

【0053】

（実施例３：実用麹菌株の醤油醸造における評価）
実施例１で得られた、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能が欠損している変異株である変異株Ｂを用いて、醤油醸造を行った。

【0054】

脱脂加工大豆１５ｋｇに水を２０Ｌ加え吸水させ、常法に従って蒸煮した。また、生小麦１５ｋｇを常法に従って焙焼し、割砕した。親株Ｂおよび変異株Ｂの胞子１×１０^６ｃｆｕ／ｇをそれぞれ混合し、常法に従い４８時間製麹した後、得られた麹に食塩濃度約２５％（ｗ／ｖ）の塩水を５０Ｌ添加して、濃口醤油の仕込みを行った。麹と塩水が十分になじんだ翌日によく撹拌した後、諸味をろ過し、ｐＨを測定した。変異株Ｂでは有意にｐＨの低下が確認された（表３）。

【0055】

【表3】

【0056】

塩水を添加して仕込んだ諸味は、常法に従って乳酸菌、酵母を添加し、４ヶ月間発酵・熟成させた。熟成後の諸味をろ過し、遊離アミノ酸量を測定した。

【0057】

結果、親株Ｂ使用生醤油における全窒素濃度１％（ｗ／ｖ）当たりのアンモニア濃度は１．２２（ｍｇ／ｍＬ）であったのに対し、変異株Ｂ使用生醤油におけるアンモニア濃度は１．０３（ｍｇ／ｍＬ）に低下していた。また、親株Ｂ使用生醤油における全窒素濃度１％（ｗ／ｖ）当たりの総遊離アミノ酸濃度は３３．２９（ｍｇ／ｍＬ）であったのに対し、変異株Ｂ使用生醤油における総遊離アミノ酸濃度は３４．３２（ｍｇ／ｍＬ）に増加していた。親株Ｂにおける測定値をそれぞれ１．００としたときの量比を下記表４に示す。

【0058】

【表4】

【0059】

このように、ＡｏｇｄｈＢ遺伝子の機能欠損した変異株Ｂを用いて製麹を行い、濃口醤油を製造したときには、野生株を用いて濃口醤油を製造したときと比較して、できあがる醤油において有意な遊離アミノ酸量の増加およびアンモニア量の低減が確認され、良好な品質の醤油を製造できることが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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