6892180 活性型インターロイキン−１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6892180

(24)【登録日】2021年5月31日

(45)【発行日】2021年6月23日

(54)【発明の名称】活性型インターロイキン−１８タンパク質のネオエピトープを認識する抗体、及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210614BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20210614BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210614BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210614BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20210614BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210614BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/24

   A61K39/395 N

   A61P37/02

   G01N33/53 N

   !C12P21/08

【請求項の数】13

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2020-559206(P2020-559206)

(86)(22)【出願日】2019年12月3日

(86)【国際出願番号】JP2019047154

(87)【国際公開番号】WO2020116423

(87)【国際公開日】20200611

【審査請求日】2020年12月2日

(31)【優先権主張番号】特願2018-226667(P2018-226667)

(32)【優先日】2018年12月3日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2019-104826(P2019-104826)

(32)【優先日】2019年6月4日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】518139719

【氏名又は名称】株式会社ｍＡｂＰｒｏｔｅｉｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】浦野 健

(72)【発明者】

【氏名】成相 裕子

(72)【発明者】

【氏名】加美野 宏樹

(72)【発明者】

【氏名】尾林 栄治

【審査官】 関 景輔

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−１３９２２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−２３１５９８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００ − １６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項2】

配列番号４（ＹＦＧＫＬＥＳＫ）で表されるアミノ酸に結合することを特徴とする請求項１記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項3】

配列番号５（ＹＦＧＫ）で表されるアミノ酸に結合することを特徴とする請求項１記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項4】

前記抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＳＳＳＧＭＧ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、
ＩＷＷＤＤＤＫ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、
ＴＲＴＲＴＹＳＮＦＧＧＧＭＡＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、
軽鎖可変ドメインが、ＱＳＩＡＨＳＮＧＹＴＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、
ＫＶＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、
ＶＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項5】

前記抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、
ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、
ＡＲＥＳＳＹＤＡＭＤＹ（配列番号３８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、
軽鎖可変ドメインが、ＥＮＶＶＴＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、
ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、
ＧＱＧＹＳＹＰＹＴ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項6】

Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１であり、
Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１５であることを特徴とする請求項４記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項7】

Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３であり、
Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であることを特徴とする請求項５記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項8】

請求項４、もしくは５記載のＣＤＲ配列、又は請求項６、もしくは７記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子。

【請求項9】

請求項１〜７いずれか１項記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又はジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）。

【請求項10】

請求項１〜７いずれか１項記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体、又は請求項９記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、若しくはジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）を含む、
活性型ＩＬ−１８を検出、及び／又は定量するためのキット。

【請求項11】

前記モノクローナル抗体が、
ヒト化抗体、又はヒト抗体であることを特徴とする請求項４、又は５記載のＣＤＲ配列、又は請求項６、又は７記載の可変領域を備えている抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。

【請求項12】

請求項１１記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又はジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）。

【請求項13】

請求項１１記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体、又は請求項１２記載のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、若しくはジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）を有効成分として含む、
ＩＬ−１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

炎症性サイトカインであるインターロイキン１８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８、以下ＩＬ−１８と記載する。）タンパク質の活性型のみを認識する抗体、及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＬ−１８は、ＩＬ−１βファミリーのサイトカインであり、主としてマクロファージで発現しているが、樹状細胞、上皮細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞で発現している。また、ＩＬ−１８受容体はＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の他、Ｂ細胞、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞など様々な細胞で発現している。ＩＬ−１８発現細胞、受容体発現細胞の多様性は、ＩＬ−１８の機能の多様性を示しており、種々の免疫系に関与していることが知られている。

【0003】

ＩＬ−１８は、発見当初寄生虫や細菌感染などの病原体に対する防御機構において重要な役割を果たすことが示されてきたが、それだけではなく、アレルギー疾患や自己免疫疾患においても重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１、２）。

【0004】

ＩＬ−１８は、ＴＮＦなどのサイトカインとは異なり、ｍＲＮＡレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）として細胞内に豊富に存在する。前駆体であるｐｒｏ−ＩＬ−１８は、ｃａｓｐａｓｅ−１、あるいはｃａｓｐａｓｅ−４によって、３７位〜１９３位のペプチドに切断されることで、ネオエピトープが形成され、活性型となり細胞外に放出される。したがって、ｍＲＮＡ発現量や、細胞内の前駆体タンパク質の測定を行っても、ＩＬ−１８の活性を測定することにはならない。

【0005】

ＩＬ−１８は種々の免疫系に関与し、活性型ＩＬ−１８が過剰に細胞外に放出されることにより惹起されると考えられている多くの疾患がある。そのため、活性型ＩＬ−１８を測定することができれば、ＩＬ−１８関連疾患の診断や治療に役立てることができる。

【0006】

ＩＬ−１８を特異的に認識する抗体は多数報告されている（例えば、特許文献１〜１０）。これらの多くは中和抗体として機能するものであり、エピトープについて開示されている抗体は少ない。また、多くの抗体が開示されているにもかかわらず、活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗体の報告はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１６／１３９２９７号

【特許文献2】国際公開第２０１５／０３２９３２号

【特許文献3】国際公開第２０１４／０８０８６６号

【特許文献4】国際公開第２０１２／０８５０１５号

【特許文献5】国際公開第２０１４／０３７８９９号

【特許文献6】特開２０１２−１３９２２４号公報

【特許文献7】特開２０１２−１３９２２３号公報

【特許文献8】国際公開第２０１１／０９８４２４号

【特許文献9】国際公開第２０１０／０４８１８３号

【特許文献10】国際公開第２０１０／０２０５９３号

【特許文献11】国際公開第２０１２／１２４６８３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Arend, W.P. et al., Immunol. Rev., 2008, Vol.223, p.20-38.

【非特許文献2】Sanders, N.L. & Mishra, A., Cytokine Growth Factor Rev., 2016, Vol.32,pp.31-39.

【非特許文献3】Hirel, P-H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, Vol.89,pp.8247-8251.

【非特許文献4】Dalboge, H. et al., FEBS Lett., 1990, Vol.266(1-2), pp.1-3.

【非特許文献5】Girard, C. et al., Rheumatology (Oxford), 2016, Vol.55(12),pp.2237-2247.

【非特許文献6】Okamura, H. et al., Nature, 1995, Vol.378(6652), pp.88-91.

【非特許文献7】Krumm, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, Vol.105,pp.20711-20715.

【非特許文献8】Krumm, B. et al., PLOS Pathogens, 2012, Vol.8, Issue 8, e1002876.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らのグループをはじめ、いくつかのグループが活性型のＩＬ−１８のみを認識する抗体の作製を試みてきた。しかしながら、今まで活性型のＩＬ−１８を認識する抗体は作製されていない。

【0010】

本発明者らは、ｐｒｏ−ＩＬ−１８をｃａｓｐａｓｅ１／４で切断し、活性型ＩＬ−１８を免疫することによって、活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗体の作製を試みた。しかし、活性化ＩＬ−１８、ｐｒｏ−ＩＬ−１８の両方を認識するＩＬ−１８の６２位〜７０位を認識するモノクローナル抗体が６種、１２８位〜１４２位の領域を認識する抗体は２種得られたが、活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗体は得られなかった。

【0011】

特許文献１〜１０に開示されている抗体は多くは中和活性を示す抗体であり、例えば特許文献１〜４に開示されている抗体は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の結合部位、又はその近傍に結合する抗体である。特許文献５には、ＩＬ−１８ＢＰが結合しているＩＬ−１８には結合しない抗体が開示されている。特許文献６には、ＩＬ−１８活性を阻害する抗体が開示されている。活性型ＩＬ−１８のＮ末（アミノ酸３７位〜５０位）のペプチド配列もエピトープとして開示されているものの、実際に得られた抗体のエピトープは異なる領域であり、活性型ＩＬ−１８のみを認識することは開示されていない。特許文献７、８は、ＩＬ−１８に対して中和活性を備えた抗体が開示されている。特許文献９、１０には治療に使用し得る抗体が記載されている。しかしながら、これら文献に開示されている抗体は、いずれも活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗体ではない。

【0012】

上述のように、活性型ＩＬ−１８のみを検出する抗体が得られていないことから、活性型ＩＬ−１８はウエスタンブロット法で分子量を確認することによって解析されている。ウエスタンブロット法は時間と手間を要することから、ＩＬ−１８の関与が疑われる疾患であっても、臨床現場で活性型ＩＬ−１８の存在が検査されるには至っていない。

【0013】

活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗体を得ることができれば、ＥＬＩＳＡなどの簡便な方法によって、活性型ＩＬ−１８の量を測定することが可能となり、ＩＬ−１８関連疾患の診断に用いることができる。本発明は、活性型ＩＬ−１８を特異的に認識する抗体を得ることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は以下のネオエピトープに結合する物質、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の機能的断片、及びこれら抗体を含むキット、また、前記モノクローナル抗体、又は機能的断片をコードする遺伝子、アミノ酸配列、及びヒト化抗体、ヒト抗体、医薬組成物に関する。また、ネオエピトープの範囲を同定する新しい方法、及び該方法に使用するキットに関する。

【0015】

（１）活性型ＩＬ−１８のみを認識する抗ＩＬ−１８抗体。
（２）ヒトＩＬ−１８のネオエピトープを認識する（１）記載の抗ＩＬ−１８抗体。
（３）前記抗ＩＬ−１８抗体がモノクローナル抗体であり、重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＳＳＳＧＭＧ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、ＩＷＷＤＤＤＫ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、ＴＲＴＲＴＹＳＮＦＧＧＧＭＡＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、ＱＳＩＡＨＳＮＧＹＴＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、ＫＶＳ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、ＶＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号２９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする（１）、又は（２）記載の抗ＩＬ−１８抗体。
（４）前記抗ＩＬ−１８抗体がモノクローナル抗体であり、重鎖可変ドメインが、ＧＦＳＬＴＳＹＧ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、ＡＲＥＳＳＹＤＡＭＤＹ（配列番号３８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、ＥＮＶＶＴＹ（配列番号３９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、ＧＡＳ（配列番号４０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、ＧＱＧＹＳＹＰＹＴ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする（１）又は（２）記載の抗ＩＬ−１８抗体。
（５）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１であり、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１５であることを特徴とする（３）記載の抗ＩＬ−１８抗体。
（６）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３であり、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７であることを特徴とする（４）記載の抗ＩＬ−１８抗体。
（７）（３）、もしくは（４）記載のＣＤＲ配列、又は（５）、もしくは（６）記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子。
（８）（３）〜（６）いずれか１つ記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の機能的断片。
（９）（１）〜（６）いずれか１つ記載の抗ＩＬ−１８抗体、又は（８）記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の機能的断片を含む、活性型ＩＬ−１８を検出、及び／又は定量するためのキット。
（１０）前記モノクローナル抗体が、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることを特徴とする（３）、又は（４）記載のＣＤＲ配列、又は（５）、又は（６）記載の可変領域を備えている抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
（１１）（１０）記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の機能的断片。
（１２）（１０）記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体、又は（１１）記載の機能的断片を有効成分として含む、ＩＬ−１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
（１３）配列番号５（ＹＦＧＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
（１４）配列番号４（ＹＦＧＫＬＥＳＫ）により表されるアミノ酸に結合する抗体、若しくはその機能的断片からなるフラグメント、又は結合物質。
（１５）抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法であって、ネオエピトープ断端から５〜１５アミノ酸の長さのペプチドにおいて、ネオエピトープ断端の反対のＮ末端、又はＣ末端のアミノ酸を起点に順次連続的にアラニン、又はグリシンに置換したペプチドを作製し、抗体とペプチドの結合を測定することによって抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法。
（１６）基板と、ペプチドをクロスリンクするための試薬と、抗体の結合を可視化するための試薬を含むことを特徴とする（１５）に記載の抗体のネオエピトープ認識範囲を解析する方法に用いるキット。
（１７）対象に対して、（３）〜（６）、（１０）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、（８）、（１１）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体の機能的断片を投与するＩＬ−１８関連疾患の治療方法。
（１８）前記対象は活性化型ＩＬ−１８が健常者に比べて高値である（１７）記載の治療方法。
（１９）前記ＩＬ−１８関連疾患が、成人スチル病、マクロファージ活性化症候群／血球貪食症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、間質性肺疾患、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、２型糖尿病、虚血性腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、乾癬、痛風、関節リウマチのいずれかであることを特徴とする（１７）、又は（１８）に記載の治療方法。
（２０）（３）〜（６）、（１０）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体、（８）、（１１）のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体の機能的断片、（９）記載のキットを用いて活性化型ＩＬ−１８量を検査し、活性化型ＩＬ−１８が健常者よりも高値を示す場合にはＩＬ−１８関連疾患であると判断する診断方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１が、活性型ＩＬ−１８を認識することをキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により解析した図。

【図2】成人スチル病（ ａｄｕｌｔ ｏｎｓｅｔＳｔｉｌｌ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＯＳＤ、あるいは成人発症スティル病とも言う。）患者血清中の活性型ＩＬ−１８の検出結果を示す図。

【図3】免疫沈降法への応用結果を示す図。

【図4】モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１のヒトＩＬ−１８機能阻害活性を示す図。

【図5】細胞免疫染色法への応用を示す図。

【図6】（Ａ）モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１のエピトープのネオエピトープ微分析法によるエピトープ解析結果を示す図。（Ｂ）アラニンスキャニングによるエピトープ解析結果を示す図。

【図7】（Ａ）モノクローナル抗体９−１０．２のＩＬ−１８^{３７−４４}ペプチドとのネオエピトープ微分析法による表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム。（Ｂ）アラニンスキャニングによる表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム。（Ｃ）立体構造上のエピトープの位置を示す図。

【図8】９−１０．２抗体とＩＬ−１８^{３７−４４}ペプチドとの表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム

【図9】モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１の競合実験の結果を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0017】

「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原（本発明の場合には活性型ＩＬ−１８）の一部をいう。また、ネオエピトープとは、タンパク質分解酵素によりタンパク質が切断され、元のタンパク質には存在しない新しく形成されたタンパク質断端のことをいう。ＩＬ−１８は、ｐｒｏ−ＩＬ−１８がｃａｓｐａｓｅ１／４で切断され、活性型ＩＬ−１８となる。活性型ＩＬ−１８に新しく形成された断端をＩＬ−１８のネオエピトープという。活性型ＩＬ−１８とは、ネオエピトープを有したＩＬ−１８の３７位〜１９３位のペプチドをいう。

【0018】

本発明の抗体は、以下に示すように活性型ＩＬ−１８に特異的に結合するモノクローナル抗体、又は誘導体をいう。また、モノクローナル抗体と同様の方法で得ることのできるポリクローナル抗体も含むものとする。さらに、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の機能的断片をも含むものとする。抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。

【0019】

また、本発明で特定した活性型ＩＬ−１８に特異的に結合するモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト化ＣＤＲ移植抗体などとしたヒト化抗体、遺伝子改変マウス、ファージディスプレイ法を用いて作製したヒト抗体もまた本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体、ヒト抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ副作用が少なく、その治療効果が長時間持続する。

【0020】

さらに、本発明で特定した活性型ＩＬ−１８断端のエピトープに結合する物質も同様に活性化型ＩＬ−１８の検出等に使用することができる。そのような物質としては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマーなど抗体以外の物質で特異的にネオエピトープに結合する物質がある。アプタマーの作製方法は、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、ＳＥＬＥＸ法など、公知の方法を用いれば良い。

【0021】

本明細書において「ＩＬ−１８関連疾患」とは、活性型ＩＬ−１８が過剰に細胞外に放出されることにより惹起される疾患、あるいはＩＬ−１８によって増悪する可能性のある疾患をいう。ＩＬ−１８関連疾患は、ＩＬ−１８の過剰発現で発症、増悪している疾患である。ＩＬ−１８関連疾患には、成人スチル病（ＡＯＳＤ）、若年性スチル病、膵がん、肺がん、大腸がんなどの悪性腫瘍、クリオピリン関連周期熱症候群、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）、気管支喘息、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＤＰＤ）、輸血関連肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、関節リウマチ、代謝性骨疾患、肝臓及び腸管での重篤な臓器傷害、心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、眼球乾燥症（ＤＥＤ）、角膜炎、角膜血管新生、病的眼球内血管新生、虹彩炎、緑内障、黄斑変性症、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、結膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼皮膚炎、アレルギー性鼻炎、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎、虚血再灌流傷害、家族性地中海熱、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、痛風、シュニッツラー症候群、顕微鏡的多発血管炎、肉芽腫性多発血管炎、好酸球肉芽腫性多発血管炎からなるＡＮＣＡ関連血管炎、橋本病、クローン病、潰瘍性大腸炎、免疫グロブリン−４（ＩｇＧ４）関連疾患、肺動脈高血圧症、アトピー性皮膚炎、ＮＬＲＣ４関連自己炎症性疾患（あるいはＮＬＲＣ４インフラマソーム症）などが含まれる。

【0022】

これらＩＬ−１８関連疾患ではＩＬ−１８の機能を阻害する薬剤によって治療効果が得られることが期待される。したがって、これらＩＬ−１８関連疾患が疑われる患者において、活性型ＩＬ−１８の発現量を検査することによって、ＩＬ−１８の機能を阻害する薬剤を適用すべきか否かを判断することができる。また、以下の実施例で示すように、ネオエピトープを認識する抗体自体がＩＬ−１８の機能を抑制することから、これを治療に用いることができる。

【0023】

本明細書において「キット」とは、以下の実施例で示すウエスタンブロット法、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡに限らず、本明細書で開示する抗体を用いてＩＬ−１８を検出、定量、あるいは、その機能を評価する目的のために、必要な試薬、器具などを構成要素とするパッケージングされた組み合わせをいう。また、ネオエピトープ解析するためのキットとしては、ネオエピトープを解析する方法に必要な基板、発色試薬などの構成要素がパッケージングされた組み合わせをいう。

【実施例】

【0024】

以下の実施例において、本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。

【0025】

［実施例１］抗体の作製
抗体の作製に関しては、島根大学動物実験専門委員会に動物実験計画承認申請書を申請し、承認を受けたうえで施行した。

【0026】

活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列に位置する３７位〜４４位のペプチドにシステイン（Ｃ）をＣ末端に付加したペプチド（配列番号１、ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ）を常法に従い合成した。

【0027】

感作抗原としてｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨ）をＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて配列番号１のペプチドにクロスリンク後、常法に従いマウスに免疫した。

【0028】

同じペプチドを牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）にＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてクロスリンクし、これを用いてＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングを行い、ハイブリドーマ９−１０．２、及び８−４．１を選別樹立した。なお、ハイブリドーマ９−１０．２、８−４．１が産生する抗体を、それぞれ９−１０．２抗体、８−４．１抗体と称する。

【0029】

ＩｓｏＳｔｒｉｐ マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ハイブリドーマ９−１０．２、及び８−４．１が産生する活性型ＩＬ−１８を認識するモノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１のアイソタイプを確認したところ、共にＩｇＧ１，κであった。

【0030】

［実施例２］９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の評価（キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法）
認識部位の異なる抗ＩＬ−１８抗体（１１−４．１、エピトープ：ＩＬ−１８の６３位から６８位の領域、配列番号２、ＲＰＬＦＥＤ）との性能比較を行った。１１−４．１抗体は、本発明者らが樹立したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であり、ＩＬ−１８を高感度に検出することがすでに示されている抗体である。

【0031】

大腸菌で発現し精製した全長ＩＬ−１８を、大腸菌で発現精製した活性型ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}（ｃａｓｐａｓｅ−４の１０５位〜３７７位のペプチドを意味する。以下、Ｎ末端のアミノ酸位置、Ｃ末端のアミノ酸位置でペプチドを特定して記載することがある。）と混合し、活性型ＩＬ−１８タンパク質（ＩＬ−１８^{３７−１９３}）を精製取得した。エドマン分解法により精製したタンパク質のＮ末端配列を決定したところ、予想通りＹＦＧＫＬであった。これは活性型のＩＬ−１８のＮ末端である３７位のチロシンから、４１位のロイシンに該当する。

【0032】

また、開始コドンＡＴＧ、及びＣ末端にＨｉｓタグを付加したＩＬ−１８タンパク質（３７位〜１９３位）を大腸菌で発現精製した。この場合、合成開始メチオニン（Ｍｅｔ）の次のアミノ酸がチロシン（^３７Ｙ）であるため、メチオニンアミノペプチダーゼが作用できないため合成開始メチオニンが脱離せず（非特許文献３、４）、Ｍｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質となると考えられる。エドマン分解法により精製タンパク質のＮ末端配列を決定したところ、予想通り合成開始メチオニンが付加していた。

【0033】

これらタンパク質を用いて、認識部位の異なる抗ＩＬ−１８抗体（１１−４．１、エピトープ：ＩＬ−１８の^６３ＲＰＬＦＥＤ^６８）と９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体との比較を行った。

【0034】

活性型ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}で切断した２００、１００、５０、２５ｎｇ／ｍＬ濃度の活性型ＩＬ−１８タンパク質、及び２００、１００ｎｇ／ｍＬ濃度のＮ末端に合成開始メチオニンが付加したＭｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質をＷｅｓ（プロテインシンプル社）を用いてキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。１次抗体として、各精製抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１２５倍希釈で使用した。露光時間、２次抗体など他の条件はすべて同一条件で行った。結果を図１に示す。

【0035】

９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体は、活性型ＩＬ−１８タンパク質ＩＬ−１８^{３７−１９３}は認識するにもかかわらず、活性型ＩＬ−１８のＮ末端にメチオニンが付加されたＭｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質は認識しなかった。一方、ＩＬ−１８の６３位〜６８位をエピトープとする１１−４．１抗体は、活性型ＩＬ−１８（ＩＬ−１８^{３７−１９３}）、Ｍｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質も同じように認識した。

【0036】

活性型ＩＬ−１８もＭｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質も、ＩＬ−１８の３７位から１９３位の領域を含んでいる。しかし、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体は、Ｍｅｔ−ＩＬ−１８^{３７−１９３}−Ｈｉｓタンパク質を認識しなかった。すなわち、これら抗体は３７位のチロシンのＮ末側にアミノ酸が付加しているペプチドは認識できず、ＩＬ−１８^{３７−１９３}タンパク質、すなわち、活性型ＩＬ−１８に存在するネオエピトープを認識することを示している。

【0037】

［実施例３］臨床検体を用いた９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の評価（キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法）
成人スチル病（ＡＯＳＤ）は、ＩＬ−１８タンパク質が高値を示すことが報告されている疾患である（非特許文献５）。島根大学医学部の倫理委員会の承認を受け、患者血清中のＩＬ−１８タンパク質を、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。患者血清は１０倍希釈し、１次抗体として、９−１０．２抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１：１２５倍希釈で使用した。内部標準タンパク質として、実施例２で用いた活性型ＩＬ−１８タンパク質（ＩＬ−１８^{３７−１９３}）を用い、患者血清中に含まれる活性化型ＩＬ−１８の量及び分子量を実施例２と同様にして解析を行った。結果を図２に示す。１０名の患者において活性型ＩＬ−１８、すなわち標準タンパク質として用いたＩＬ−１８^{３７−１９３}と同じサイズにバンドが検出された。また、図２の下に患者血清中に存在した活性型ＩＬ−１８の量を示しているが、極めて微量の活性化型ＩＬ−１８も定量することができた。

【0038】

実施例３で示すように、活性型ＩＬ−１８を認識する抗体である９−１０．２、及び８−４．１抗体を用いれば、非常にシンプルな方法によって活性型ＩＬ−１８を検出することができる。

【0039】

［実施例４］９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の免疫沈降法への応用
免疫沈降法における有用性について、認識部位の異なる１１−４．１抗体と比較し評価した。全長ＩＬ−１８タンパク質を活性型ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}とともに２９３Ｔ細胞で発現させた。既存のＦｌａｇタグ抗体（Ｍ２）はネガティブコントロール抗体として使用した。免疫沈降産物は自家製の抗ＩＬ−１８ウサギポリクローナル抗体でウエスタンブロット法により検出した。結果を図３に示す。

【0040】

図３上段には、全長ＩＬ−１８、活性型ＩＬ−１８、各抗体が認識する部位を模式的に示している。２９３Ｔ細胞に全長ＩＬ−１８、及び活性形ｃａｓｐａｓｅ−４を発現させると、全長ＩＬ−１８タンパク質は、活性型ｃａｓｐａｓｅ−４で切断されるが、細胞内には切断されていない全長ＩＬ−１８が存在している。１１−４．１抗体で免疫沈降した結果は、全長ＩＬ−１８タンパク質が多く免疫沈降されてきており、細胞内には切断されていないｐｒｏ−ＩＬ−１８が多く存在していることを示している。一方、８−４．１、９−１０．２抗体で免疫沈降した場合には、全長ＩＬ−１８は免疫沈降されておらず、より多くのＩＬ−１８^{３７−１９３}が免疫沈降されている。つまり、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体は細胞内でｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}により切断された活性型ＩＬ−１８^{３７−１９３}タンパク質を特異的に認識し効率よく免疫沈降できるモノクローナル抗体であることが明らかとなった。

【0041】

［実施例５］９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体のヒトＩＬ−１８機能阻害活性
大腸菌で発現精製した活性型ＩＬ−１８タンパク質を急性骨髄性白血病細胞株ＫＧ−１（ＪＣＲＢ００６５）に添加するとＩＦＮ−γが産生されることが知られている（非特許文献６）。抗体がＩＬ−１８機能阻害抗体であれば、ＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ産生を阻害する（図４上模式図参照）。

【0042】

ＫＧ−１細胞に活性型ＩＬ−１８を０．５ｎｇ、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の濃度を変えて添加して、ＩＦＮ−γの産生をＩＦＮ−γ検出ＥＬＩＳＡ法（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡセット）により検出した。その結果、９−１０．２、及び８−４．１抗体は量依存的にＩＦＮ−γの産生に対し阻害活性を示した（図４下）。９−１０．２、及び８−４．１抗体はいずれもヒトＩＬ−１８機能を阻害する抗体として作用することから、ＩＬ−１８が過剰に発現することによって惹起される疾患や増悪する疾患の治療に用いることができる。特に、９−１０．２はＩＣ_５０が２．８ｎＭと非常に強い阻害活性を示した。

【0043】

［実施例６］９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の細胞免疫染色法への応用
全長ＩＬ−１８タンパク質（ｈｕｍａｎ ＩＬ−１８）をＧ１９６タグ（ＤＬＶＰＲ、配列番号３、特許文献１１）が融合した活性型ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}（Ｇ１９６−Ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}）の存在下（図５左）あるいは非存在下（図５右）で２９３Ｔ細胞に発現させた。ホルマリン固定後、常法に従い９−１０．２抗体を用いて細胞免疫染色を行った。

【0044】

活性型ｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}の存在は、Ｇ１９６を認識するウサギポリクローナル抗体（Ｇ１９６ ｐＡｂ）により検出した（図５左、右上）。また、活性型ｃａｓｐａｓｅ−４非存在下においてＩＬ−１８の存在は、ＩＬ−１８を認識するウサギポリクローナル抗体（αＩＬ−１８ ｐＡｂ）により検出した（図５右、右上）。活性型ｃａｓｐａｓｅ−４存在下（図５左）では、９−１０．２抗体によってＩＬ−１８の存在が確認されている。一方、ｃａｓｐａｓｅ−４非存在下（図５右）では、ＩＬ−１８の存在がウサギポリクローナル抗体によって確認されているにもかかわらず、ＩＬ−１８は９−１０．２抗体によって検出されない。すなわち、９−１０．２抗体は、細胞免疫染色法においても細胞内でｃａｓｐａｓｅ−４^{１０５−３７７}により切断された活性型ＩＬ−１８^{３７−１９３}タンパク質を特異的に認識できるモノクローナル抗体であることを示している。

【0045】

［実施例７］９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体のエピトープの検討
上述のようにｃａｓｐａｓｅなどのタンパク質分解酵素によりタンパク質が切断されると、通常のタンパク質には存在しないタンパク質断端、ネオエピトープが形成される。抗体作製に用いたネオエピトープペプチドにおいて、抗体認識に重要なネオエピトープ断端とは反対のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドを作製し、抗体のネオエピトープ認識範囲を同定した。この抗体が認識するネオエピトープの範囲を決定する方法を「ネオエピトープ微分析法」と命名した。ネオエピトープ微分析法は、１アミノ酸ずつアラニンに置換するアラニンスキャニング法とは異なり、連続してアラニンに置換することにより抗体のエピトープを決定する方法である。ネオエピトープ微分析法は、ネオエピトープにおける抗体の結合領域を決定するのに優れた方法である。ここでは以下に示すようにＥＬＩＳＡによって定量的な解析を行っているが、ＥＬＩＳＡに限らず、ＳＰＲ法などによっても解析が可能である。また、以下の実施例ではアラニンに置換して解析を行っているが、分子量が小さく、構造的に大きな変化をもたらさないアミノ酸、例えば、グリシンなどを用いることもできる。

【0046】

ネオエピトープペプチド（３７位〜４４位）のＣ末端のアミノ酸（４４位のリシン（Ｋ４４））を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドにクロスリンク用ＣｙｓをＣ末端に付加したペプチドを常法に従い合成した。各ペプチドにＢＳＡをＩｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ ｓｐｉｎ Ｋｉｔによりクロスリンクし、ＥＬＩＳＡ法により９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の認識部位の解析を行った。図６（Ａ）のＥＬＩＳＡプレート写真の右には、プレートリーダーで取得した吸光度を野生型のペプチドを１００として標準偏差と共に示した。

【0047】

４０位のリシンから４４位のリシンまでをアラニンに置換したペプチドに対しては、どちらの抗体もほとんど反応性を示さないが、４０位のリシンが存在することにより、野生型のペプチドの１／４程度の反応性を示す。さらに、４１位から４３位まで置換するアラニンの数が減っても抗体の反応性にはさほど変化はない。

【0048】

次に、アラニンスキャニング法により、エピトープ解析を行った。活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列ペプチド（３７位〜４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）の各アミノ酸のアラニン変異体を常法に従い合成した。上記と同様に、ＢＳＡをクロスリンクした各ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法により９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体の認識部位解析を行った（図６（Ｂ））。

【0049】

９−１０．２、及び８−４．１抗体は共に、活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドの一番目のアミノ酸（３７位のチロシン（Ｙ）をアラニン（Ａ）に変えたペプチド（Ｙ３７Ａ）、Ｇ３９Ａペプチド及びＫ４０Ａペプチドをほとんど認識できなかった。また、Ｌ４１Ａ、Ｅ４２Ａの変異体に対しては弱い結合を示し、Ｆ３８Ａ、Ｓ４３Ａ、及びＫ４４Ａの変異体に対しては、５０％程度の結合を示した。

【0050】

さらに、同じペプチドを用い表面プラズモン共鳴解析を行った。ネオエピトープペプチド（３７位〜４４位）のＣ末端のアミノ酸（４４位のリシン（Ｋ４４））を起点に順次連続的にアラニンに置換したペプチドにクロスリンク用ＣｙｓをＣ末端に付加した各ペプチドをリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１０００１２）に固定化した。精製抗体９−１０．２を５０ｎＭの濃度で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅで測定し「ネオエピトープ微分析」を行なった（図７（Ａ））。

【0051】

４０位のリシンから４４位のリシンまでをアラニンに置換したペプチドに対しては、まったく結合しなかったが、４０位のリシンが存在することにより、結合がみられるようになった。さらに、４０位のリシンが存在することにより、ペプチドからの乖離については４１位から４３位まで置換するアラニンの数が減っても抗体の反応性にはさほど変化はなかった。

【0052】

次に、活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列ペプチド（３７位〜４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）の各アミノ酸のアラニン変異体をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製抗体９−１０．２を５０ｎＭの濃度で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いてｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅで測定し「アラニンスキャニング分析」を行なった（図７（Ｂ））。

【0053】

９−１０．２抗体は、活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドの三番目のアミノ酸（３９位のグリシン（Ｇ））をアラニン（Ａ）に変えたペプチド（Ｇ３９Ａ）をまったく認識できなかった。Ｙ３７Ａ、Ｋ４０Ａ変異体に対しては乖離しやすくなっており、Ｆ３８Ａ、Ｌ４１Ａ、Ｅ４２Ａ、Ｓ４３Ａ、及びＫ４４Ａの変異体に対しては、乖離には影響していないことが明らかとなった。

【0054】

表面プラズモン共鳴解析によっても、図６に示したＥＬＩＳＡによる解析と同様の結果を得ることができた。「ネオエピトープ微分析」によって結合に重要となるコア領域を、「アラニンスキャニング分析」によって、結合に重要なアミノ酸の情報を得ることができる。

【0055】

既知のヒトＩＬ−１８のＮＭＲ構造解析（ＰＤＢ：１Ｊ０Ｓ、図７（Ｃ））も併せて考えると、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体は、構造表面に露出している３７位のチロシン（Ｙ３７）から４４位のリシン（Ｋ４４）までの８アミノ酸が認識には重要であると考えられる。

【0056】

さらに、上記ネオエピトープ微積分法による結果から、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体が認識するためには、３７位から４０位までのペプチドが特に重要であることが明らかとなった。すなわち、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体はともにエピトープとしてＹＦＧＫＬＥＳＫ（配列番号４）、ミニマムエピトープとしてＹＦＧＫ（配列番号５）を認識することが明らかとなった。

【0057】

ペプチドＹＦＧＫＬＥＳＫ、あるいはＹＦＧＫは、活性化型ＩＬ−１８を認識する抗体が結合するエピトープである。したがって、これら配列を含むペプチドを免疫原とするワクチン、あるいはこのペプチドを含む領域とともに、ＩＬ−１８受容体と結合するＩＬ−１８の他の領域のペプチドとを組み合わせて治療薬として使用できる可能性がある。

【0058】

また、ＩＬ−１８ＢＰのうち構造解析されている３Ｆ６２（ｐｏｘｖｉｒｕｓのＩＬ−１８ＢＰ）、及び４ＥＥＥ（ｙａｔａｐｏｖｉｒｕｓのＩＬ−１８ＢＰ）のＩＬ−１８結合部位は、Ｙ３７、Ｆ３８、Ｇ３９の領域が含まれている（非特許文献７、８）。ヒトＩＬ１８ＢＰの構造解析はまだ行われていないが、一次配列が類似しており、同じ領域に結合する可能性が高い。ＩＬ−１８ＢＰが結合したＩＬ−１８には、９−１０．２抗体、及び８−４．１抗体は結合しないものと考えられる。したがって、これら抗体を使用することによって、ＩＬ−１８ＢＰが結合していないフリーのＩＬ−１８を測定することができる。

【0059】

具体的には、９−１０．２抗体、あるいは８−４．１抗体を基板にコートし、血清と反応させる。ＩＬ−１８ＢＰが結合したＩＬ−１８には９−１０．２抗体や８−４．１抗体は結合することができず、ネオエピトープが露出している活性化型ＩＬ−１８のみを捕捉することができる。捕捉されたＩＬ−１８を別の部位を認識する抗体と反応させ、測定を行えばよい。これまで、煩雑な方法で測定していたＩＬ−１８ＢＰと結合していないフリーのＩＬ−１８もＥＬＩＳＡによって簡便に測定することが可能となる。

【0060】

［実施例８］９−１０．２抗体とＩＬ−１８^{３７−４４}ペプチドとの親和性解析（表面プラズモン共鳴解析）
活性型ＩＬ−１８タンパク質のネオエピトープペプチド（３７位〜４４位）にクロスリンク用にシステインをＣ末端に付加したペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ、配列番号１）をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５に固定化した。精製抗体９−１０．２を０．４ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲で５濃度、５倍希釈系列でＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００を用いてｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅで測定した（図８）。解析はｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓで行った。

【0061】

結果は、Ｋ_Ｄ：１．９ｘ１０^−１０Ｍ、Ｋ_ａ：２．１ｘ１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、Ｋ_ｄ：４．０ｘ１０^−５ｓ^−１であった。９−１０．２抗体は、非常に高い親和性で、活性型ＩＬ−１８タンパク質のＮ末端配列ペプチドに結合していることが明らかとなった。

【0062】

［実施例９］モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１の競合実験解析
実施例７のエピトープ解析からモノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１は同じエピトープを認識していると考えられる。さらに、実施例８の結果から、９−１０．２抗体は非常に高い親和性でネオエピトープに結合していることが明らかになった。そこで、モノクローナル抗体９−１０．２、及び８−４．１の競合実験を行い、９−１０．２抗体、８−４．１抗体が同一のエピトープを認識し、競合するか解析を行った（図９）。

【0063】

配列番号１のペプチド（ＹＦＧＫＬＥＳＫＣ）にＢＳＡをクロスリンクさせ、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を用い５ｎｇ／１００μｌに調整し、ＥＬＩＳＡプレートに、４℃で一晩コーティングした。常法によりＥＬＩＳＡプレートはブロッキング、洗浄を行い、０、１００、３００、１０００ｎｇ／１００μｌに調整した９−１０．２、あるいは８−４．１抗体溶液を添加し、２５℃で１時間反応を行った。なお、抗体を入れないウェルには洗浄液のみを添加している（図９、ＨＲＰを付加していない１次抗体参照。）。

【0064】

次に、ＨＲＰラベルした各抗体（０．５μｇ／μｌ）を洗浄液にて１００倍希釈し、一次抗体として８−４．１抗体をペプチドに結合させたウェルには、ＨＲＰ標識した９−１０．２抗体を、９−１０．２抗体をペプチドに結合させたウェルにはＨＲＰ標識した８−４．１抗体を１００μｌずつ添加し、２５℃ １時間インキュベートした（図９、ＨＲＰを付加した２次抗体参照。）。その後、洗浄を行い、発色させ、吸光度を測定した（図９、吸光度 ４５０ｎｍ−６２０ｎｍ参照。）。

【0065】

１次抗体として８−４．１抗体を、２次抗体としてＨＲＰ標識した９−１０．２抗体を用いると、９−１０．２抗体が１次抗体である８−４．１抗体と競合した結果、ペプチドに結合することが示された。したがって、９−１０．２、８−４．１抗体は互いに競合し、９−１０．２抗体は８−４．１抗体と比較して、活性形ＩＬ−１８に高い親和性を有することが明らかとなった。

【0066】

［実施例１０］抗体遺伝子の解析
次に、各抗体の遺伝子解析を行った。ハイブリドーマ９−１０．２、８−４．１よりＲＮＡを抽出後、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いて逆転写しｃＤＮＡを作成した。合成したｃＤＮＡを、Ｈ鎖及びＬ鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。

【0067】

用いたＨ鎖及びＬ鎖のプライマーの配列は以下のとおりである。
Ｈ鎖プライマー
ＶＨ１−１Ｓ:5′-ggggatcc ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3′（配列番号６）
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
ＩｇＧ２−１ＡＳ:5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’（配列番号７）
Ｌ鎖プライマー
ＶＫ−１Ｓ:5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3（配列番号８）
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
ＣＫ−２ＡＳ：5’-gggaattc gaa gat gga tac agt tgg
tgc-3’（配列番号９）
なお、下線部は制限酵素の認識サイトを示す。

【0068】

Ｈ鎖の遺伝子解析によって、９−１０．２抗体のＨ鎖の塩基配列（配列番号１０）、アミノ酸配列（配列番号１１）、８−４．１抗体のＨ鎖の塩基配列（配列番号１２）、アミノ酸配列（配列番号１３）を決定した。また、Ｌ鎖の遺伝子解析によって、９−１０．２抗体のＬ鎖の塩基配列（配列番号１４）、アミノ酸配列（配列番号１５）、８−４．１抗体のＬ鎖の塩基配列（配列番号１６）、アミノ酸配列（配列番号１７）を決定した。

【0069】

９−１０．２抗体、８−４．１抗体の各相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、遺伝子配列について以下にまとめる。
［表１］

【0070】

［表２］

【0071】

［表３］

【0072】

［表４］

【0073】

本実施例で示したように、上記ＣＤＲを有する抗体は、感度、特異度良く活性型ＩＬ−１８を特異的に認識する抗体である。したがって、ＥＬＩＳＡなど臨床現場でも簡便に実施できる方法によって、活性型のＩＬ−１８を検出することが可能となる。その結果、臨床現場においてＩＬ−１８関連疾患か否かを簡便に判断することできることが可能となり、治療方針の策定に役立てることができる。また、ウエスタンブロッティング、キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法、免疫沈降法、細胞免疫染色法など様々な方法に応用することができるので、研究用試薬としても広く応用することができる。さらに、ＩＬ−１８の機能を阻害することができることが明らかになっており、ＩＬ−１８関連疾患を治療する薬剤としても非常に有用な抗体である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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