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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6894889
(24)【登録日】2021年6月8日
(45)【発行日】2021年6月30日
(54)【発明の名称】アミノ酸を含有する筋細胞分化促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/198 20060101AFI20210621BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20210621BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20210621BHJP
A23L 33/175 20160101ALI20210621BHJP
【ＦＩ】
A61K31/198
A61P43/00 121
A61P21/00
A23L33/175
【請求項の数】5
【全頁数】15
(21)【出願番号】特願2018-513476(P2018-513476)
(86)(22)【出願日】2016年9月13日
(65)【公表番号】特表2018-527364(P2018-527364A)
(43)【公表日】2018年9月20日
(86)【国際出願番号】KR2016010371
(87)【国際公開番号】WO2017048072
(87)【国際公開日】20170323
【審査請求日】2019年6月18日
(31)【優先権主張番号】10-2015-0130265
(32)【優先日】2015年9月15日
(33)【優先権主張国】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】506213681
【氏名又は名称】アモーレパシフィック コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100132230
【弁理士】
【氏名又は名称】佐々木 一也
(74)【代理人】
【識別番号】100082739
【弁理士】
【氏名又は名称】成瀬 勝夫
(74)【代理人】
【識別番号】100198269
【弁理士】
【氏名又は名称】久本 秀治
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ ヒュン ウ
(72)【発明者】
【氏名】ラ チャン スウ
(72)【発明者】
【氏名】ソン ヨン ヒイ
(72)【発明者】
【氏名】キム ワン ギ
(72)【発明者】
【氏名】シン ソン セオ
【審査官】
古閑 一実
(56)【参考文献】
【文献】
British Journal of Nutrition，２０１４年，Vol.111，p.201-206
【文献】
J. Nutr.，１９９８年，Vol.128，p.251-256
【文献】
J. Am. Geriatr. Soc.，２０１２年，Vol.60，p.16-23
【文献】
医学のあゆみ，２０１４年，Vol.248, No.9，p.747-752
【文献】
外科と代謝・栄養，２０１３年，Vol.47, No.2，p.71-75
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２
Ａ６１Ｐ １／００−４３／００
Ａ２３Ｌ ３３／００−３３／２９
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）からなる筋細胞分化促進剤。
【請求項2】
請求項１において、前記フェニルアラニン（Ｐｈｅ）及びメチオニン（Ｍｅｔ）は１：４〜４：１の重量比で混合されることを特徴とする、筋細胞分化促進剤。
【請求項3】
請求項１または請求項２の筋細胞分化促進剤を有効成分として含有し、薬学的又は食品学的に許容される添加剤を補助成分としてさらに含有する、筋細胞分化促進用組成物（但し、フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン(Met)以外の必須アミノ酸を含む場合を除く）。
【請求項4】
請求項１または請求項２の筋細胞分化促進剤を有効成分として含有する、老人性筋損失予防または治療用薬学組成物（但し、フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン(Met)以外の必須アミノ酸を含む場合を除く）。
【請求項5】
請求項１または請求項２の筋細胞分化促進剤を有効成分として含有する、老人性筋損失予防または改善用健康機能食品組成物（但し、フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン(Met)以外の必須アミノ酸を含む場合を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はアミノ酸を含有する筋細胞分化促進用組成物に関し、より具体的には、フェニルアラニン及びメチオニンからなる筋細胞分化促進剤と、これを含有する老人性筋損失予防または治療用薬学組成物及び老人性筋損失予防または改善用健康機能食品組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
我々の体の筋肉は骨に付いて骨を保護し、体形を正しく保持するなど様々な機能を果たす。また、筋肉はカルシウムの流入を促進して骨密度を高めたりする。しかし、体は老化しながら構成成分の変化で体脂肪と体タンパク質の再分布が発生し、約５０歳になると筋細胞内のタンパク質の合成速度が分解速度より遅くなって筋肉が急激に退化を始めるようになって、筋肉減少疾患に露出される虞がある。
【0003】
筋肉減少の疾患の一つである筋肉減少症は普段自分の体質量の約１３〜２４％が減少した状態を言い、筋肉減少症があれば行動量が格段と減って精神健康を損なうだけでなく、生活の満足度も下がって、簡単な日常生活でも容易に負傷を負い、深刻な重傷に至ったりする。
【0004】
筋肉減少症の原因は老化が進行するにつれて発生する骨格筋の量と質の漸進的減少及び不適切な食餌エネルギーの攝取による脂肪と体脂肪成分を含む体重減少などを原因として挙げることができ、よく老化によるもので、年齢との係わり合いが深い。それ故、老化による筋肉減少症または筋損失を防止するための研究が必要な実情である。
【0005】
ロイシン（leucine）を含む分岐鎖アミノ酸（branched-chain amino acid）がｍＴＯＲ（Mammalian Target of Rapamycin）信号伝逹を通じて筋肉細胞でタンパク質を合成するメカニズムを通じた筋肉強化効果は９０年代末から報告されており、大きく二つの部分で研究方向が行われて来た。第一は、ある特定アミノ酸がｍＴＯＲを通じた筋肉強化効果があるかに関する研究であり、これに対して個別アミノ酸を取り除いた状態で筋肉強化効果を測定した結果、分岐鎖アミノ酸が効果がよく、その中でもロイシン（leucine）が最も効果が優れるという報告があった。また、多くのアミノ酸の間のシナジー効果においては、グルタミン（glutamine）がロイシン（leucine）の細胞内の吸収を促進してｍＴＯＲ信号伝逹を通じた筋肉強化効果が増加されるという報告があった。第二は、アミノ酸がどのように細胞内で認識されてｍＴＯＲ信号伝逹を活性化させるかに関する研究であり、これに対して２０００年代後半から報告され始めたが、Ｖｐｓ３４、ＭＡＰ４Ｋ３、Ｒａｇ ＧＴＰａｓｅが中間媒介体に提示されて来た。その後、本発明者はロイシン−ｔＲＮＡ合成酵素（leucyl-tRNA synthase）がロイシン（leucine）を直接認識してＲａｇ ＧＴＰａｓｅを活性化させることによりｍＴＯＲが活性化されるということを明かした事がある。
【0006】
しかしながら、ｍＴＯＲ信号伝逹関連機作は何れも筋肉内のタンパク質の合成を増加させることにより筋肉強化効果を現わすだけで、筋芽細胞を筋細胞に分化させて筋細胞の数自体を増加させることにより、減少されたり損失された筋肉量を根本的に回復させるメカニズムとは差がある。
【0007】
ここで、本発明者等は筋肉内タンパク質の合成ではない、筋細胞の分化形成を増加させるための方法を見つけるために鋭意努力した結果、アミノ酸の中でフェニルアラニン（phenylalanine）とメチオニン（methionine）が一緒に作用して筋芽細胞が筋肉細胞に分化されることを促進することにより老人性筋損失を予防したり、改善、治療することができることを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン（Met）からなる筋細胞分化促進剤と、ここに薬剤学的または食品学的に許容される添加剤をさらに含有する筋細胞分化促進用組成物を提供することにある。
【0009】
即ち、本発明の目的は、前記筋細胞分化促進剤を有効成分として含有する、老人性筋損失予防または治療用薬学組成物、または予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達するために、本発明はフェニルアラニン（Phe）及びメチオニン（Met）からなる筋細胞分化促進剤を提供する。
【0011】
本発明はまた、本発明による筋細胞分化促進剤を主成分として含有し、薬剤学的または食品学的に許容される添加剤を補助成分としてさらに含有する、筋細胞分化促進用組成物を提供する。
【0012】
本発明はまた、本発明による筋細胞分化促進用組成物を含有する、老人性筋損失予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0013】
本発明はまた、本発明による筋細胞分化促進用組成物を含有する、老人性筋損失予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【0014】
本発明の筋細胞分化促進用組成物及びこれを含有する薬学組成物または健康機能食品組成物は、筋芽細胞が筋肉細胞に分化されることを促進して筋肉減少症や筋損失を予防、改善及び治療することができ、特に老人性筋損失に効果的であり、筋細胞数の増加により基礎代謝量が増加して体内脂肪酸を酸化させるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】アミノ酸の欠乏状況でＣ２Ｃ１２細胞の分化による細胞模様変化を顕微鏡で観測した図である。
【0016】
【図2】アミノ酸の欠乏状況でＬ６細胞の分化による細胞模様変化を顕微鏡で観測した図である。
【0017】
【図3】各種必須アミノ酸の欠乏状況でＣ２Ｃ１２細胞の分化マーカータンパク質（MyoDとMyogenin）の発現パターンをウェスタンブロットを通じて分析した図である。
【0018】
【図4】アミノ酸の中でフェニルアラニンの欠乏状況でタイロシン（Tyr）またはフェニルアラニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのか実験して観測した図である。
【0019】
【図5】アミノ酸の中でフェニルアラニンの欠乏状況でタイロシン或はフェニルアラニンをＬ６細胞に処理する場合、Ｌ６細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのか実験して観測した図である。
【0020】
【図6】アミノ酸の中でフェニルアラニンの欠乏状況でタイロシンまたはフェニルアラニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0021】
【図7】アミノ酸の中でフェニルアラニンの欠乏状況でタイロシン或はフェニルアラニンをＬ６細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0022】
【図8】アミノ酸全体の欠乏状況でタイロシンまたはフェニルアラニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのかを実験して観測した図である。
【0023】
【図9】アミノ酸全体の欠乏状況でタイロシンまたはフェニルアラニンをＬ６細胞に処理する場合、Ｌ６細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのかを実験して観測した図である。
【0024】
【図10】アミノ酸全体の欠乏状況でタイロシンまたはフェニルアラニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0025】
【図11】アミノ酸全体の欠乏状況でタイロシンまたはフェニルアラニンをＬ６細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0026】
【図12】アミノ酸全体の欠乏状況でメチオニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのか実験して観測した図である。
【0027】
【図13】アミノ酸全体の欠乏状況でメチオニンをＬ６細胞に処理する場合、Ｌ６細胞の分化に濃度依存的に影響を及ぼすのか実験して観測した図である。
【0028】
【図14】アミノ酸全体の欠乏状況でメチオニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0029】
【図15】アミノ酸全体の欠乏状況でメチオニンをＬ６細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現に濃度依存的に影響を及ぼすのか分析した図である。
【0030】
【図16】アミノ酸全体の欠乏状況でフェニルアラニン、メチオニン或は多様な比率のフェニルアラニン＋メチオニンをＣ２Ｃ１２細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現様相変化を観測した図である。
【0031】
【図17】アミノ酸全体の欠乏状況でフェニルアラニン、メチオニン或は多様な比率のフェニルアラニン＋メチオニンをＬ６細胞に処理する場合、筋細胞マーカー遺伝子の発現様相変化を観測した図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
他の式で定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野において熟練された専門家によって通常的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で用いられた命名法は本技術分野で周知の通常的に用いられるのである。
【0033】
本発明で用いられる「筋芽細胞（myoblast）」とは筋肉細胞への分化能力を有する幹細胞を意味する。これら筋芽細胞は特異的に衛星細胞（satellite cells）に逆分化されることもあるが、長期間筋肉細胞への転換が発生しない一部筋芽細胞で起きる現象である。しかし、このような衛星細胞でも適切な刺激（運動など）が与えられると、いつでも筋芽細胞から筋肉細胞への分化が可能である。
【0034】
本発明で用いられる「筋芽細胞分化」とは単核の筋芽細胞が融合を通じて多核の筋管（myotube）を形成する過程である。筋芽細胞から筋管への分化過程で、ミオシンＤ（MyoD）、ミオゲニン（myogenin）などの遺伝子の発現が増加する。従って、筋芽細胞分化マーカー遺伝子としてミオシンＤとミオゲニンを利用すれば筋細胞の分化有無を確認することができる。
【0035】
本発明で用いられる「筋肉細胞分化形成」とは、筋芽細胞が分化されて長い模様への変化と共に筋纎維及び多数のミトコンドリア含有など筋肉の特性を有する筋肉細胞が形成されることを意味し、形成された筋肉細胞が融合を経て多核の筋管（myotube）を形成することを意味する。ただし、細胞融合を通じた筋管形成は骨格筋のみで起きる現象であり、心筋及び平滑筋では起きない。
【0036】
本発明で用いられる幹細胞「分化」は幹細胞で特定細胞に完全に分化された場合だけでなく、幹細胞で特定細胞へ完全に分化される前の中間段階も含む。
【0037】
以下、本発明について具体的に説明する。
【0038】
本発明ではフェニルアラニン及びメチオニンを含む９種のアミノ酸（Leu、Ile、Met、Val、Lys、Trp、Phe、Thr、Gln）の中でどのアミノ酸が筋肉細胞の分化形成に影響を及ぼすのか確認するための実験を行った。その結果、特にフェニルアラニン（Phe）とメチオニン（Met）が欠乏された場合、筋肉細胞の分化形成が大きく阻害されることが分かり、フェニルアラニンとメチオニンの混合比率が重量比で２：１の場合、筋肉細胞の分化形成が最も大きく起きることを確認することができた。
【0039】
従って、本発明は一観点で、フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン（Met）からなる筋細胞分化促進剤に関する。
【0040】
本発明において、前記筋細胞分化促進剤の前記フェニルアラニン（Phe）及びメチオニン（Met）は１：４〜４：１、好ましくは２：１の重量比で混合することを特徴とすることができる。前記重量比で含まれる場合、筋肉細胞の分化形成効果を現わすのに適切であるだけでなく、組成物の安定性及び安全性を全部満足することができ、費用対比効果の側面でも上記の範囲で含むことが適切である。
【0041】
また、前記フェニルアラニン及び／またはメチオニンは単量体、オリゴマー、重合体などで存在することができる。
【0042】
本発明は他の観点で、本発明による筋細胞分化促進剤を主成分として含有し、薬剤学的または食品学的に許容される添加剤を補助成分としてさらに含有する、筋細胞分化促進用組成物に関する。
【0043】
また、本発明において、前記筋細胞分化促進用組成物はトレオニン（Thr）、バリン（Val）、イソロイシン（Ile）、グルタミン（Gln）及びリシン（Lys）からなる群で選択された何れか１種以上のアミノ酸を補助成分としてさらに含有することを特徴とすることができる。
【0044】
また、前記フェニルアラニン（Phe）は組成物総重量に対して０．０２〜６４重量％、好ましくは０．０５〜５４重量％で含有され、メチオニン（Met）も０．０２〜６４重量％、好ましくは０．０５〜２７重量％で含有されることを特徴とすることができる。前記二つのアミノ酸含量の総和が０．１重量％未満である場合効果が微弱であり、８０重量％を超える場合、アミノ酸の代謝に問題のある患者は高フェニルアラニン血症（フェニルケトン尿症外）や高メチオニン血症（高ホモシステイン血症外）が発生する可能性がある。従って、正常人の場合は問題がないが、アミノ酸代謝異常患者を考慮した場合、フェニルアラニン／メチオニン混合製剤の量を組成物総重量に対して０．１〜８０重量％の間で用いることが好ましい。
【0045】
本発明は他の観点で、本発明による筋細胞分化促進剤を有効成分として含有する老人性筋損失予防または治療用薬学組成物に関する。
【0046】
本発明による組成物を薬学組成物に適用する場合には、前記組成物を有効成分として常用される無機または有機担体を加えて、固体、半固体または液状の形態で製剤化することができる。本発明の有効成分を常法によって実施すれば容易に製剤化することができ、界面活性剤、賦形剤、着色剤、香辛料、安定化剤、防腐剤、保存剤、水和剤、乳化促進剤、懸濁剤、滲透圧を調節するための塩及び／または緩衝剤、その他常用の補助剤を適当に用いることができる。
【0047】
前記経口投与のための製剤としては錠剤、丸剤、顆粒剤、軟硬質カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、液剤、懸濁剤、乳濁剤、シロップ剤、ペレット剤などを挙げることができる。これら剤形は有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウムまたはカルシウム塩及びポリエチレングリコール）を含有することができる。錠剤はまたマグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンのような結合剤を含有することができ、場合によっては、澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤または甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有することができる。前記錠剤は通常的な混合、顆粒化またはコーティング方法によって製造されることができる。
【0048】
本発明による前記薬学組成物は経口、非経口、直腸、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などに投与されることができる。
【0049】
また、前記有効成分の投与量は治療を受ける対象の年齢、性別、体重または治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路または処方者の判断によって変わることができる。このような因子に基づいた投与量の決定は当業者の水準内にある。一般的な投与量は、好ましくは１．３７５ｍｇ／ｋｇ／日〜１１００ｍｇ／ｋｇ／日になることがあるが、前記投与量はいかなる方法でも本発明の範囲を限定するのではない。
【0050】
本発明はまた他の観点で、本発明による筋細胞分化促進剤を有効成分として含有する老人性筋損失予防または改善用健康機能食品組成物に関する。
【0051】
前記健康機能食品組成物の剤形は特に限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤、キャラメル、ダイエットバー、飲み物などに剤形化されることができる。各剤形の食品組成物は有効成分以外に当該分野で通常用いられる各種成分を剤形または使用目的によって当業者が困難なく簡単に適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合上昇効果を奏することができる。
【0052】
前記有効成分の投与量の決定は当業者の水準内にあり、この１日投与用量は投与しようとする対象の年齢、健康状態、合併症などの多様な要因によって変わることがある。
【実施例】
【0053】
以下、実施例を通じて本発明についてより詳しく説明する。これら実施例はただ本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されることに解釈されないことは本技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。従って、本発明の実質的な範囲は添付される特許請求範囲及びそれらの等価物によって定義されると言える。
【0054】
［試験例１］必須アミノ酸欠乏による筋肉細胞分化形成効果確認９種のアミノ酸（Leu、Ile、Met、Val、Lys、Trp、Phe、Thr、Gln）中の何れか一つの欠乏状況でそれぞれＣ２Ｃ１２筋肉細胞の分化形成過程をオリンパス社のＣＫ４０光学顕微鏡（４０ｘ）を利用して観察した結果、図１に示すように、９種のアミノ酸の中でフェニルアラニン（Phe）の欠乏状況は筋肉細胞の分化形成を深刻に阻害していることが分かり、メチオニン（Met）の欠乏がフェニルアラニンの次に筋肉細胞の分化形成をたくさん阻害していることを確認することができた。よって、フェニルアラニン及びメチオニンの十分な提供が筋肉細胞の形成に重要であることを確認することができた。
【0055】
他種の筋肉細胞であるＬ６の細胞でも上記と同じ方法で分化形成過程を観察した結果、図２に示すように、Ｃ２Ｃ１２と同様にフェニルアラニン欠乏が筋肉細胞の分化形成に及ぶす影響が最も大きく、メチオニン欠乏も大きな影響を及ぼすことが分かった。
【0056】
前記二つの実験結果により、９種のアミノ酸が筋肉細胞分化形成に及ぶす影響を次のような手順で整理することができた。
【0057】
総必須アミノ酸＞Ｐｈｅ＞Ｍｅｔ＞Ｔｈｒ＝Ｖａｌ＝Ｉｌｅ＝Ｇｌｎ＝Ｌｙｓ＞Ｌｅｕ＝Ｔｒｐ
【0058】
総アミノ酸が欠乏された状況で筋肉細胞の分化形成に最も大きい影響を及ぼし（分化が最も遅い）、その次はフェニルアラニンの欠乏、その次はメチオニンの欠乏が大きな影響を及ぼした。トリプトファンの欠乏状況は筋肉細胞の分化形成に及ぶす影響が最も少ないことを確認することができた。
【0059】
筋肉細胞の分化形成時に細胞の模様変化を観測するとともに、分化マーカータンパク質（ミオシンＤとミオゲニン）の発現パターンを調べるために分化された筋肉細胞からタンパク質を抽出した後、ミオシンＤとミオゲニン特異抗体を当該技術分野で通常用いられるウエスタンブロッティング方法に利用して比較分析した。図３に示すように、前記光学顕微鏡による観察結果と同様にフェニルアラニンが欠乏された状況で分化マーカータンパク質の発現も著しく減少されることを確認することができ、フェニルアラニンよりは影響が些細であるが、メチオニン欠乏も分化マーカータンパク質の発現を減少させることを確認することができた。
【0060】
［試験例２］フェニルアラニンの筋肉細胞分化形成効果確認試験例１によれば、必須アミノ酸の中でフェニルアラニンが筋肉細胞分化形成に及ぶす影響が最も大きく現われ、フェニルアラニンの添加により筋肉細胞分化形成が促進されることができるのかを調べるために後続の実験を用意した。また、アミノ酸代謝経路でフェニルアラニンはタイロシン（Tyr）に転換されるという点を考慮して、筋肉細胞の形成にタイロシン欠乏が影響を及ぼすのか調べるための実験を一緒に行った。フェニルアラニンが欠乏された細胞培養液にタイロシンまたはフェニルアラニンをそれぞれ濃度別（０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ）添加した後、Ｃ２Ｃ１２細胞とＬ６細胞それぞれの分化形成能力を試験例１と同じ方法で光学顕微鏡を利用して測定した。
【0061】
その結果、図４（C2C12）及び図５（L6）に示すように、タイロシンではなくフェニルアラニンが筋肉細胞の形成に濃度依存的に影響を及ぼすということが分かった。
【0062】
また、それぞれの場合、筋肉細胞マーカー遺伝子の発現を確認するために、当該技術分野において通常用いられるｑＲＴ−ＰＣＲ方法のように、分化された筋細胞でＲＮＡを抽出し、これに基づいて相補的ＤＮＡ（cDNA）を合成した後、ｑＲＴ−ＰＣＲ（quantitative real-time polymerase chain reaction）にミオシンＤ及びミオゲニンのＰＣＲプライマーを利用してマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現変化を観察した。
【0063】
その結果、図６（C2C12）及び図７（L6）に示すように、分化マーカー遺伝子であるＭｙｏ ＤのｍＲＮＡ発現程度も濃度依存的に現われることを確認することができた。
【0064】
さらに、フェニルアラニンとタイロシンの筋肉細胞形成に対する影響を確認するために、アミノ酸が全部欠乏された細胞培養液にフェニルアラニンまたはタイロシンをそれぞれ濃度別（０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ）添加した後、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＬ６筋肉細胞の分化形成能力を前記と同じ方法でそれぞれ測定した。
【0065】
その結果、図８（C2C12）及び図９（L6）に示すように、タイロシンではないフェニルアラニンが添加された時、筋肉形成能力が増大されるという結果をもう一度確認することができた。また、図１０（C2C12）及び図１１（L6）に示すように、各筋肉細胞内マーカー遺伝子の発現もフェニルアラニンの添加のみによって増加することを確認することができた。
【0066】
［試験例３］メチオニンの筋肉細胞分化形成効果確認試験例１の結果を通じて、メチオニンはフェニルアラニンほどではないが、その外他の必須アミノ酸に比べて筋肉細胞分化形成に及ぶす影響が大きいことを類推することができた。これと関連して、メチオニンの添加によっても筋肉細胞の分化形成が可能であるか調べるために、アミノ酸が欠乏されたＣ２Ｃ１２及びＬ６細胞にメチオニンを添加した後、筋肉細胞への分化の有無をそれぞれ観察した。
【0067】
その結果、図１２（C2C12）及び図１３（L6）に示すように、メチオニン単独でも筋肉細胞分化形成に影響を与えることを確認することができ、図１４（C2C12）及び図１５（L6）に示すように、筋肉細胞マーカー遺伝子の発現が増加することを通じてもメチオニンの筋肉細胞分化形成に影響を及ぼすことをもう一度確認することができた。
【0068】
［実施例］フェニルアラニン及びメチオニンの混合比率による筋肉細胞形成効果確認前記試験例１〜３でアミノ酸の中でフェニルアラニン及びメチオニンが筋肉細胞分化形成に最も効果が良かった点に着眼して、最適な効果を現わすフェニルアラニン及びメチオニンの混合比率を調べるために実施例１〜７を以下の表１の成分及び含量で製造した。比較例１はメチオニンを全く含まないように製造し、比較例２はフェニルアラニンを全く含まないようにして製造した。また筋肉細胞分化には些細な影響を及ぼすが、筋肉内タンパク質の合成を誘導すると知られた分岐鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）も少量添加した。
【0069】
【表1】
【0070】
前記実施例１〜７と比較例１及び２を、試験例１〜３に記載されたのと同じ方法でＣ２Ｃ１２細胞及びＬ６細胞に処理し、筋肉細胞の分化形成を観測及び測定した。その結果、図１６（C2C12）及び図１７（L6）に示すように、フェニルアラニンとメチオニンを２：１の重量比で混合した実施例３の筋肉細胞分化形成効果が最も優れることを確認することができた。
【0071】
以上、本発明内容の特定部分を詳しく記述したが、本技術分野における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術はただ好ましい実施態様であるだけであり、それにより本発明の範囲が制限されるのではない点は明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は添付される特許請求範囲とそれらの等価物によって定義される。
【0072】
また、以下本発明の組成物を含む薬学組成物及び健康機能食品組成物の剤形例をより詳しく説明するが、それによって本発明の範囲が制限されるのではないことは明白である。
【0073】
［剤形例１］錠剤の製造実施例３．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
とうもろこし澱粉．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．２ｍｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
【0074】
前記成分を混合した後、通常の錠剤製造方法によって打錠して錠剤を製造する。
【0075】
［剤形例２］カプセル剤の製造実施例３．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
とうもろこし澱粉．．．．．．．．．．１００ｍｇ
乳糖．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．２ｍｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
セリン．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
【0076】
通常のカプセル剤の製造方法によって前記成分を混合してゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
【0077】
［剤形例３］液剤の製造実施例３．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
異性化糖．．．．．．．．．．．．．．．．１０ｇ
マンニト−ル．．．．．．．．．．．．．．．．５ｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
セリン．．．．．．．．．．．．．．．．．５０ｍｇ
油脂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．適量
精製水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．残量
【0078】
通常の液剤製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記成分を混合し、その後精製水を加えて全体１００ｍｌに調節した後、遮光ビンに充填し且つ滅菌して液剤を製造する。
【0079】
［剤形例４］健康機能食品の製造実施例３．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
ビタミン混合物
ビタミンＡ アセテート．．．．．．．．．７０μｇ
ビタミンＥ．．．．．．．．．．．．．．１．０ｍｇ
ビタミンＢ１．．．．．．．．．．．．．０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２．．．．．．．．．．．．０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６．．．．．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２．．．．．．．．．．．．．０．２μｇ
ビタミンＣ．．．．．．．．．．．．．．．１０ｍｇ
ビオチン．．．．．．．．．．．．．．．．．１０μｇ
ニコチン酸アミド．．．．．．．．．．．．１．７ｍｇ
葉酸．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０μｇ
パントテン酸カルシウム．．．．．．．．．．０．５ｍｇ
無機質混合物
硫酸第一鉄．．．．．．．．．．．．．．．１．７５ｍｇ
酸化亜鉛．．．．．．．．．．．．．．．．０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．２５．３ｍｇ
第１リン酸カルシウム．．．．．．．．．．．．１５ｍｇ
第２リン酸カルシウム．．．．．．．．．．．．５５ｍｇ
クエン酸カリウム．．．．．．．．．．．．．．９０ｍｇ
炭酸カルシウム．．．．．．．．．．．．．．１００ｍｇ
塩化マグネシウム．．．．．．．．．．．．．２４．８ｍｇ
【0080】
前記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は比較的健康食品に相応しい成分を好ましい実施例で混合したが、その配合比を任意に変形実施しても構わなく、通常の健康食品の製造方法によって前記成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康機能食品組成物の製造に用いることができる。
【0081】
［剤形例５］飲み物の製造実施例３．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
クエン酸．．．．．．．．．．．．．．１０００ｍｇ
オリゴ糖．．．．．．．．．．．．．．．．１００ｇ
梅濃縮液．．．．．．．．．．．．．．．．．．２ｇ
タウリン．．．．．．．．．．．．．．．．．．１ｇ
精製水を加えて全体．．．．．．．．．．．１０００ｍｌ
【0082】
通常の飲み物の製造方法によって前記成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱する。作られた溶液を濾過して滅菌された２Ｌの容器に取得し、その後密封滅菌した後、冷蔵保管して本発明の飲み物組成物の製造に用いる。