特許 6895140 融合タンパク質とその製造方法及びその眼疾患の治療、抗炎症、抗腫瘍薬物の製造における使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6895140

(24)【登録日】2021年6月9日

(45)【発行日】2021年6月30日

(54)【発明の名称】融合タンパク質とその製造方法及びその眼疾患の治療、抗炎症、抗腫瘍薬物の製造における使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20210621BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20210621BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20210621BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20210621BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210621BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20210621BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210621BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210621BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20210621BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20210621BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20210621BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20210621BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210621BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C07K14/54

   C07K14/78

   C07K16/00

   C07K19/00

   C12N15/24

   C12N15/12

   C12N15/13

   C12P21/02 C

   C12P21/02 K

   A61P35/00

   A61P27/02

   A61P29/00

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P19/08

   A61P31/00

   A61P17/06

   A61P37/02

   A61P19/06

   A61P27/06

   A61P3/10

   A61P31/12

   A61K38/20

   A61P33/00

   A61K38/02

   A61K39/395 A

   A61K39/395 H

【請求項の数】10

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2020-500947(P2020-500947)

(86)(22)【出願日】2018年3月5日

(65)【公表番号】特表2020-512015(P2020-512015A)

(43)【公表日】2020年4月23日

(86)【国際出願番号】CN2018077968

(87)【国際公開番号】WO2018171411

(87)【国際公開日】20180927

【審査請求日】2019年11月8日

(31)【優先権主張番号】201710165208.2

(32)【優先日】2017年3月20日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519339415

【氏名又は名称】ジャンスー ロンタール バイオテックノロジー カンパニー リミティド

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＲＯＮＧＴＡＩ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100166729

【弁理士】

【氏名又は名称】武田 幸子

(72)【発明者】

【氏名】シュ ハンメイ

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１１−５０１５０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０５４１８７６９（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３０８５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０９６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１６−５１９１１１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

分子中に血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列、インターロイキン４配列及び抗体ＩｇＧ１のＦｃ配列を含み、血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列、インターロイキン４配列及び抗体ＩｇＧ１のＦｃ配列間がフレキシブルリンカーにより接続され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１であることを特徴とする融合タンパク質。

【請求項2】

分子中に血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列、インターロイキン４配列及び抗体ＩｇＧ１のＦｃ配列を含み、血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列、インターロイキン４配列及び抗体ＩｇＧ１のＦｃ配列間がリジッドリンカーにより接続され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２であることを特徴とする融合タンパク質。

【請求項3】

配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２をコードする核酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４であることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項5】

前記炎症は、関節リウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、感染性関節炎、外傷性関節炎、全身性エリテマトーデス及び乾癬を含むことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項6】

前記腫瘍は、胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、結腸がん、膠腫、黒色腫及び子宮頸がん、並びにヒトの頭頚部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肺臓、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸若しくは直腸、卵巣、子宮頚、子宮、前立腺、膀胱、精巣に由来する原発性がん又は続発がん、黒色腫及び肉腫を含むことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項7】

前記眼科疾患は、虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患又は角膜新生血管性眼疾患を含むことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項8】

前記虹彩新生血管性眼疾患は、新生血管性緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜中心静脈閉塞症による虹彩新生血管性眼疾患を含み、前記脈絡膜新生血管性眼疾患は、加齢性黄斑変性、中心性滲出性脈絡網膜症、眼ヒストプラズマ症候群又は匍行性脈絡膜症による脈絡膜新生血管性眼疾患を含み、前記網膜新生血管性眼疾患は、糖尿病、腫瘍、網膜剥離、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、Ｅａｌｅｓ病又はＣｏａｔ病に関連する網膜新生血管性眼疾患を含み、前記角膜新生血管性眼疾患は、コンタクトレンズによる角膜新生血管性疾患、及びアルカリや他の化学物質火傷、角膜手術、細菌感染、クラミジア感染、ウイルス感染又は原虫感染による角膜新生血管性眼疾患を含むことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項9】

薬物の剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、注射剤、鼻スプレー剤又はエアロゾル剤であることを特徴とする請求項４〜８の何れか１項に記載の融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用。

【請求項10】

真核細胞による発現の方法及び精製方法を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物製剤の技術分野に属し、より具体的には、抗炎症、抗腫瘍、眼科疾患の治療機能を有する融合タンパク質とその製造方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

関節炎、腫瘍、細菌による炎症、眼科疾患（例えば、ＡＭＤ）等の疾患は、すべて血管関連疾患と呼ばれる。

【0003】

関節炎のような炎症性疾患は、人体の関節及びその周囲組織に発生する炎症性疾患であり、数十種類に分類できる。中国では、関節炎に罹患している患者が１億以上と多く、ますます増加している。臨床症状としては、関節の赤み、腫脹、熱、痛み、機能障害及び関節奇形であり、深刻化すると、関節障害を引き起こし、患者の生活の質に影響を与えてしまう。このような疾患には、主にリウマチ性関節炎、関節リウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、強直性脊椎炎、反応性関節炎、感染性関節炎等が含まれる。そのうち、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）は、臨床上最もよく見られる炎症性関節疾患の一つ、また障害になる主な因子の一つであり、発生率が全世界で約０．５％〜１．０％であり、中国で約０．４％であり、病因が未だに解明されていない慢性全身性炎症性疾患であり、慢性、対称性、多関節滑膜炎及び関節外病変を主な臨床症状とし、自己免疫炎症性疾患に属する。患者は、通常手又は手首部の痛み及び腫脹（特に手首の表の腫脹）を初期症状とし、症状が持続的に緩和されておらず、一般的な対症療法により症状を緩和できるが、服用の不規則や量の不十分により症状がぶり返すことが多い。症状が発展すると、顕著な朝のこわばりが出現し、通常１時間以上も続き、ますます深刻になるとともに、一定の関節機能障害が起こる。基本的な病理学的特徴は、血管炎と滑膜炎である。関節内で滑膜血管過形成が起こり、パンヌスが形成され、滑膜が厚くなり、滲出が多くなり、多種のサイトカインが分泌され、軟骨を侵して骨損傷を引き起こす。その周囲の筋腔、靭帯、腱鞘及び筋肉等の組織のいずれも侵すことができ、関節の安定性に影響を与え、関節奇形が起こり機能障害になりやすい。血管炎は、全身の各臓器組織を侵し、全身性疾患を発生させる可能性もある。関節炎の病理学的過程において、血管新生は象徴的な組織学的変化であり、新生血管の形成は滑膜過形成及び炎症性細胞浸潤を伴い、そのパンヌス形成及び関節破壊の基礎である。本来血管がない関節軟骨は、ある異常変化により、新しい血管を形成し、軟骨が侵され、関節の変形又は痛みを引き起こす。新生血管は、関節リウマチ患者の滑膜組織の異常変化を引き起こす。従って、新生血管形成の阻害は、関節炎のような炎症性疾患をある程度緩和又は治癒できる。

【0004】

近年、中国の腫瘍の発生率及び死亡率は高くなっている。無限の増殖、侵襲及び移転は、腫瘍の悪性徴候であり、治療ミス及び死亡を引き起こす主要な原因でもある。そのため、腫瘍の増殖、侵襲及び移転の制御は、予後改善、生存率向上のための主な措置となっている。１９７１年、Ｆｏｌｋｍａｎは、腫瘍の増殖が血管新生に依存する理論を初めて提案した。腫瘍血管新生は、腫瘍の増殖及び移転の形態学的基礎であり、腫瘍に栄養を提供するだけでなく、宿主にも大量の腫瘍細胞を輸送することにより、腫瘍の増殖及び移転が発生する。殆どの悪性固形腫瘍、例えば、卵巣がん、肝がん、子宮頸がん及び乳がん等は、血管新生依存性腫瘍である。新生血管は、腫瘍の増殖に栄養及び酸素を提供する一方、腫瘍の移転の重要な経路である。そのため、腫瘍血管形成の阻害は重要な抗がん対策であると考えられている。

【0005】

眼科疾患における虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患及び角膜新生血管性眼疾患等は、いずれの発症メカニズムも新生血管の過形成に繋がっている。そのため、血管新生の阻害はこのような疾患を治療するための鍵であるが、内皮細胞の増殖及び遊走は、新生血管形成の肝心なステップである。血管新生阻害剤は、近年、新生血管性疾患の治療において非常に重要視されている薬物である。そのため、新生血管の形成の阻害は、眼中の血管新生による患者の眼疾患を治療する新規な手段となりうる。これらの血管新生阻害剤の中では、特にアンギオスタチン及びエンドスタチンが注目されている。これらの血管阻害剤は、非常に魅力的な見通しを示しているが、その欠陥も明らかである。具体的には、従来の血管新生阻害剤系薬物、例えば、エンドスタチン、アンギオスタチン等は、作用ターゲットが明確ではなく、血管に対する特異性及び選択性が十分ではなく、効果に制限があるので、試験中の投与量が大きい。そのため、良好な血管新生阻害剤は、新生血管の標識分子に選択性を有することにより、新生血管へのガイド作用を達成し、全体として薬物の血管形成に対する阻害作用を向上させるものであって、低用量であっても効率的な血管形成阻害効果を奏することができるものであるべきである。Ａｖａｓｔｉｎは、現在、眼疾患の治療に成功裏に適用されているが、中国では、この種類の薬物の自主開発が不足している。本発明のインテグリンによる血管新生の標的阻害は、このような眼疾患を治療するための新しい選択肢となる。

【0006】

また、関節炎のような炎症、腫瘍、眼疾患は、いずれも血管に関連する疾患である。腫瘍の増殖及び移転が血管新生に依存する。炎症と血管新生は、互いにつながって共に進展する２つの病理学的過程である。眼科疾患、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、主に脈絡膜新生血管の形成で表される。

【0007】

新生血管の形成は、正常な生理的条件で、高いレベルで調節され、生殖、胚の成長、組織修復及び創傷治癒において不可欠な過程である。血管新生は、様々な病理学的条件でも発生し、前記病理学的条件は、腫瘍の増殖及び移転、炎症性障害、例えば、関節リウマチ、乾癬、骨関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎及び他の炎症性障害を含む。

【0008】

インテグリンは、細胞表面に広く分布している受容体であり、細胞と細胞外マトリックスとの間、及び細胞間の付着を媒介でき、細胞内の細胞骨格タンパク質と細胞外マトリックス分子とを連結する相互作用により血管形成に関与する。現在、少なくとも８種のインテグリン（α１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α６β４、α５β１、αｖβ３、αｖβ５）が血管形成に関与し、そのうち、αｖβ３は、重要な役割を果たしている。αｖβ３は、リガンド分子におけるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列（ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ，ＲＧＤ）を識別することができ、多くの細胞型に発現し、多細胞活動過程における多種のリガンドに結合して腫瘍の血管形成、侵襲、移転、炎症、創傷治癒及び凝血等の生理学的及び病理学的過程に関与することができる。従って、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドは、インテグリンアンタゴニストとしての作用を有し、ＲＧＤ配列は、担体として新生血管内皮に標的輸送することができ、新生血管性疾患をより効率的に治療することができる。従って、血管阻害剤ポリペプチドは、血管形成を阻害することにより、滑膜への酸素及び養分の供給を阻止するとともに、血管退化を直接引き起こすことができるので、ＲＡによる滑膜過形成が阻害される。新生血管形成の阻害はこのような疾患を治療するための鍵であり、内皮細胞の増殖及び遊走は、新生血管形成の肝心 なステップである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

既存のポリペプチドの半減期が短く、標的が単一である課題に対して、本発明は、哺乳動物細胞発現方法を提供し、異なる二種類の活性ポリペプチド及びタンパク質を接続することにより、１．ポリペプチド分子と標的との親和力、細胞傷害性を向上させ、ポリペプチド分子による治療効果を高めること、２．ポリペプチド分子の短半減期、頻繁な投与という欠点を克服すること、３．異なる標的に対するポリペプチドをリンカーにより接続し、二重機能タンパク質分子を形成するとともに、二重機能タンパク質の半減期を延長し、長期間作用薬物の開発に基礎を作ることが望まれる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記問題を解決するために、本発明の技術的解決策は以下の通りである。

【0011】

本発明は、分子中に血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列、インターロイキン４（ＩＬ−４）配列及び抗体ＩｇＧ１のＦｃ断片を含む融合タンパク質である。ここで、タンパク質一は、フレキシブル（Ｆ）リンカーにより接続され、両端のポリペプチドが変化移動でき、より良好な展開性を有する。タンパク質二は、リジッド（Ｒ）リンカーにより接続され、両端のポリペプチドが空間変位を形成し難く、両端の機能ドメインは互いに影響することがない。タンパク質一の構造模式図は図１に示される通りである。タンパク質二の構造模式図は図２に示される通りである。

【0012】

さらには、タンパク質一に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１であり、タンパク質二に対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２である。

【0013】

また、本発明は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２をコードする核酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４である、前記融合タンパク質をコードする遺伝子である。

【0014】

また、本発明は、前記融合タンパク質の、炎症治療薬、抗腫瘍薬及び眼科疾患の治療薬の製造における使用である。

【0015】

さらには、前記炎症は、関節リウマチ、骨関節炎、痛風性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、感染性関節炎、外傷性関節炎、全身性エリテマトーデス及び乾癬を含む。

【0016】

さらには、前記腫瘍は、胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、結腸がん、膠腫、黒色腫及び子宮頸がん、並びにヒトの頭頚部、脳、甲状腺、食道、膵臓、肺臓、肝臓、胃、乳腺、腎臓、胆嚢、結腸または直腸、卵巣、子宮頚、子宮、前立腺、膀胱、精巣に由来する原発性がん又は続発がん、黒色腫及び肉腫を含む。

【0017】

さらには、前記眼科疾患は、虹彩新生血管性眼疾患、脈絡膜新生血管性眼疾患、網膜新生血管性眼疾患又は角膜新生血管性眼疾患を含む。

【0018】

さらには、前記虹彩新生血管性眼疾患は、新生血管性緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜中心静脈閉塞症による虹彩新生血管性眼疾患を含み、前記脈絡膜新生血管性眼疾患は、加齢性黄斑変性、中心性滲出性脈絡網膜症、眼ヒストプラズマ症候群又は匍行性脈絡膜症による脈絡膜新生血管性眼疾患を含み、前記網膜新生血管性眼疾患は、糖尿病、腫瘍、網膜剥離、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈周囲炎、全身性エリテマトーデス、Ｅａｌｅｓ病又はＣｏａｔ病に関連する網膜新生血管性眼疾患を含み、前記角膜新生血管性眼疾患は、コンタクトレンズによる角膜新生血管性疾患、及びアルカリや他の化学物質火傷、角膜手術、細菌感染、クラミジア感染、ウイルス感染又は原虫感染による角膜新生血管性眼疾患を含む。

【0019】

さらには、薬物の剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、注射剤、鼻スプレー剤又はエアロゾル剤である。

【0020】

また、本発明は、原核細胞又は真核細胞による発現の方法及び精製方法を用いる前記融合タンパク質の製造方法である。

【発明の効果】

【0021】

従来技術に比べて、本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0022】

（１）ＨＭ−３は、多くの研究によると、優れた血管新生阻害効果を有するが、ポリペプチドであるため、半減期が短い。ＩＬ−４分子は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの増殖を促進し、体の免疫機能を向上させ、腫瘍を殺傷する作用を達成することができることを見出した。本発明は、両者を組み合わせることで、二重抗腫瘍作用、抗炎症作用及び血管新生阻害作用を発揮するとともに、体の免疫力を高めることができる。また、ＨＭ−３及びインターロイキン４は、いずれも分子量の小さいポリペプチドであり、体内での半減期が比較的短く、通常、いずれも３０分間〜２時間程度に達することができる。本発明では、ＩｇＧのＦｃ断片配列を導入し、融合タンパク質の構築技術により、ＨＭ−３、ＩＬ−４及びＩｇＧ１のＦｃ断片をリンカーにより接続して二重機能融合タンパク質を構成する。当該融合タンパク質は、ＨＭ−３ポリペプチドによる血管新生阻害とインターロイキン４による抗腫瘍の二重効果を有し、さらに重要なことは、Ｆｃ断片が加えられることにより、ＨＭ−３及びインターロイキン４の半減期を顕著に延長し、製品を薬物として製造した後、関連分野における疾患の治療において患者に長期間作用の二重機能薬を提供でき、１週間又は２週間、ひいては１ヶ月１回投与が予期でき、患者の服用頻度を効果的に低下させ、患者のコンプライアンスを向上させ、患者の治療コストを低減する。

【0023】

（２）本発明は、〔１〕分子量が大きく、構造が複雑なポリペプチド分子、特にジスルフィド結合等の二級構造と高級構造を有する大分子ポリペプチド分子の合成ボトルネックを解除する；〔２〕分子量の大きいポリペプチドの化学合成が困難であり、収率が低い等の技術的ボトルネックを克服し、大分子ポリペプチドの生産コストを顕著に低下させる；〔３〕哺乳動物細胞等の生体細胞でポリペプチド分子を発現させることにより、正確な高級構造を形成でき、化学合成によるポリペプチド分子よりもポリペプチド分子と標的との親和力等が優れる；〔４〕ポリペプチド分子と抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦｃ断片により融合タンパク質分子を形成し、ＩｇＧのＦｃ断片は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）媒介再循環機構により分解されることを回避するとともに、Ｆｃ断片の分子量が大きく、腎クリアランス速度が低く、融合タンパク質がポリペプチドよりも半減期が顕著に長くなることも確保する。同時に、ＩｇＧ１のＦｃ断片を融合させた融合タンパク質は、ＡＤＣＣとＣＤＣの細胞傷害性を向上させることもでき、抗腫瘍分子の活性を顕著に向上させることができ、ポリペプチド分子よりも抗腫瘍薬効が優れ、〔５〕真核発現システムにより、リンカーにより抗体Ｆｃ断片とＨＭ−３、ＩＬ−４配列を接続し、機能性タンパク質ＨＭ−３、ＩＬ−４の半減期を延長し、標的の異なる２種類のポリペプチドを同時に接続することにより、二重標的融合タンパク質を形成する。

【0024】

（３）本発明のタンパク質一（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）及びタンパク質二（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）は、インテグリン阻害剤及び免疫調節用の組換えタンパク質薬物であり、血管過形成を阻害する機能を有するだけでなく、免疫系を効果的に調節して腫瘍を阻害する機能を有する。当該二重機能融合タンパク質薬物は、単一のポリペプチド薬物に比べて、薬物が腫瘍細胞を阻害し殺傷するとともに、血管過形成を阻害する作用を顕著に強化することができる。融合タンパク質は、薬物の半減期を顕著に増加することができ、薬物による治療効果を向上させることができ、患者のコンプライアンスを顕著に向上させ、患者の治療費を顕著に低下させることができることがより重要である。当該融合タンパク質薬物は、以上の二重機能作用及び半減期延長により、関節炎治療、抗腫瘍及び炎症関連眼疾患治療という機能を達成する。

【0025】

（４）本発明における融合タンパク質配列は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含み、ＲＧＤ配列は、インテグリンの重要なリガンドであるため、ＲＧＤ配列を含むポリペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐは、インテグリンを特異的に識別することができ、新生血管形成を効果的に阻害することができ、腫瘍疾患、関節炎のような疾患及び眼科疾患の治療に使用できる。本発明では、フレキシブル（Ｓ）又はリジッド（Ｒ）リンカーにより二種類のポリペプチドを融合させ、それぞれタンパク質一及びタンパク質二を得ることにより、薬効を高め、半減期を延長し、安定性を向上させることができるとともに、作用効果が高く、毒性が小さい等の特徴を有する。

【0026】

（５）本発明の融合タンパク質は、新生血管内皮に標的し、新生血管形成を阻害し、さらに血管及び炎症関連疾患を予防又は治療する効果を達成することができる。

【0027】

（６）本発明は、抗腫瘍面で、多種の腫瘍を阻害する効果を有する。実施例２におけるＭＴＴ実験の結果から、融合タンパク質一、融合タンパク質二は、胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、膠腫及びの増殖を効果的に阻害することができ、３２μｇ／ｍＬの濃度で、黒色腫、胃がん、人脳膠腫に対する阻害率が５０％以上に達し、６４μｇ／ｍＬの濃度で、結腸がん細胞に対する阻害率が４０％以上に達し、子宮頸がん細胞に対する阻害率が５０％以上に達する。

【0028】

（７）本発明は、新生血管形成の阻害の面で、実施例３における細胞遊走実験から明らかなように、２μｇ／ｍＬの濃度でＨＵＶＥＣ遊走阻害に対して顕著な作用を有し、阻害率が７０％以上である。

【0029】

（８）本発明は、抗炎症効果面で、実施例４〜１０における一連の検証モデル実験から明らかなように、融合タンパク質一及び融合タンパク質二は、リンパ球の増殖を顕著に阻害し、マクロファージからのＩＬ−１β炎症因子の産生を阻害し、肉芽腫の形成を阻害し、モデル群の毛細血管透過性を低下させ、モデル群の耳腫脹及び足趾腫脹を阻害し、アジュバントラット関節炎慢性炎症の程度を低下させることができる。

【0030】

（９）本発明は、眼科疾患の治療の面で、実施例１１〜１９から明らかなように、融合タンパク質一及び融合タンパク質二は、ヒト網膜血管内皮細胞の増殖を顕著に阻害し、鶏胚漿尿膜新生血管形成を阻害し、角膜新生血管の増殖を阻害し、イエウサギの虹彩新生血管の増殖を阻害し、ウサギ眼脈絡膜血流量の増加を促進し、ＯＩＲマウス網膜における新生血管叢を減少させ、酸素誘導新生マウス網膜病変モデルの新生血管形成を阻害し、糖尿病性網膜症に対して一定の治療作用を生じることができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に対応するタンパク質の構造模式図である。

【図2】本発明におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に対応するタンパク質の構造模式図である。

【図3】本発明におけるＦｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１と発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４／ＭＣＳ（＋）をゲル抽出して得られた断片電気泳動図である。

【図4】本発明における菌液ＰＣＲ検証結果図である。

【図5】本発明における融合タンパク質の捕捉結果図である。

【図6】本発明における融合タンパク質の精密精製図である。

【図7】本発明におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法による融合タンパク質サンプルの分析結果図である。

【図8】本発明におけるＨＰＬＣによる融合タンパク質サンプルの分析結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。

【0033】

実施例１
（一）融合タンパク質の遺伝子の取得及び発現ベクターの構築
血管阻害剤ポリペプチドＨＭ−３配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される通りであり、インターロイキン４配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される通りであり、ヒトイムノグロブリンＩｇＧ１−Ｆｃドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）を、異なるリンカーペプチドであるＧｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒフレキシブル（Ｆ）リンカー、ＡｌａＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓＧｌｕＡｌａＡｌａ ＡｌａＬｙｓＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａリジッド（Ｒ）リンカーにより、ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３タンパク質と接続し、２種類の新規なＦｃ融合タンパク質Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３を設計する。フレキシブル（Ｆ）リンカーで構築されたタンパク質一のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される通りであり、リジッド（Ｒ）リンカーで構築されたタンパク質二のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される通りである。ＣＨＯ細胞コドンの好みにより、２種類の新規なＦｃ融合タンパク質Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３をコードする配列を最適化し、すべて３’端にＮｈｅＩ酵素切断部位、Ｋｏｚａｋ配列、シグナルペプチドを導入し、５’端にＸｈｏＩ酵素切断部位を導入し、全遺伝子合成方法によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４というＤＮＡ配列を得る。

【0034】

バイオテクノロジ会社により前記２種類の融合タンパク質Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３のＤＮＡ配列を合成し、ｐＵＣ５７ベクターに接続してクローニングベクターを形成し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中に保存してクローン菌株を形成するように委託する。２種類の融合タンパク質は、いずれもｐｃＤＮＡ３．４／ＭＣＳ（＋）を発現ベクターとして用い、ベクターの構築過程が完全に一致するので、Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１を例とし、実験過程は以下の通りである。

【0035】

１、無菌条件で、バイオテクノロジ会社から送られるＦｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１クローン菌株を穿刺細菌の表面から穿り、５ｍＬのＡｍｐ抵抗性ＬＢ培地の入った２本の試験管に投入し、３７℃、１２０ｒｐｍで振とうして終夜培養する。

【0036】

２、培養された２本の試験管の菌液について、一方の試験管に２．５ｍＬの無菌６０％グリセリンを加え、均一に混合した後、１ｍＬ／本で無菌遠心管に分装し、グリセリンチューブとし、−８０℃で凍結保存した。また、他方の試験管における菌液を１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離させて菌体を回収し、ルーチンの市販のプラスミドミニプレップキットを用いてＦｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１のクローニングベクターを抽出する。

【0037】

３、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ／ＸｈｏＩによりＦｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１クローニングベクター及び発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４／ＭＣＳ（＋）に対してダブル酵素切断を行い、水平核酸電気泳動により粘着末端を有する挿入断片Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１と発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４／ＭＣＳ（＋）を分離し、市販のＤＮＡゲル抽出キットにより回収する。ＤＮＡ断片の回収結果を図３に示す。

【0038】

４、Ｔ４リガーゼにより、挿入断片とベクターのモル比が１：５となる割合で、ゲル抽出して得られた挿入断片Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１と発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４／ＭＣＳ（＋）を１６℃で１６時間接続反応させる。

【0039】

５、２０ｕＬのＤＮＡを取り接続し、１００ｕＬの溶解した直後のＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０コンピテントセルに加え、軽く均一に混合し、３０ｍｉｎ氷浴する。その後、混合物を４２℃で４５ｓヒートショックした後、迅速に２〜３ｍｉｎ氷浴した。混合物に９００ｕＬの無抵抗性ＬＢ培地を加え、３７℃で振とうして１時間培養する。４℃で、４５００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、無菌条件で９００ｕＬの上澄みを捨て、残りの菌液を沈殿菌体とともに軽く吹き吸い均一に混合し、ピペッティングガンですべて吸い出し、Ａｍｐ抵抗性ＬＢ固体板に塗布し、３７℃で１２時間静置培養する。

【0040】

６、２０個のシングルコロニーを選別し、５ｍＬのＡｍｐ抵抗性ＬＢ培地の入った試験管に接種し、３７℃、１２０ｒｐｍで振とうして終夜培養する。

【0041】

７、前のステップで接種された菌株のうち、正常に増殖した菌株を、それぞれ３本のグリセリンチューブに保存する。同時に、各菌株に菌液ＰＣＲ検証を行い（図４を参照）、陽性クローンを選別し、保存されたグリセリンチューブをバイオテクノロジ社に送ってシーケンス検証を行わせる。最終的に正確な発現ベクターを得る。

【0042】

８、シーケンスが正確な菌株を保存したグリセリンチューブを取り出し、３０ｍＬのＡｍｐ抵抗性ＬＢ培地の入った２５０ｍＬの振とうフラスコに接続し、３７℃、１２０ｒｐｍで終夜培養し、２０本のグリセリンチューブを−８０℃で凍結保存した。これにより、Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１発現ベクターの構築作業が完成する。

【0043】

（二）融合タンパク質の発現
一過性トランスフェクションとは、ＤＮＡを真核細胞に導入する方法の一つである。一過性トランスフェクションにおいて、組換えＤＮＡを感染性の強い細胞系に導入することにより、目的の遺伝子を一過的でありながら高いレベルで発現する。短い時間で実験に用いられる十分なタンパク質を取得し、安定的トランスフェクションにおける細胞選別時間を節約することができる。Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ一過性トランスフェクション発現システムにより、２種類の新規な融合タンパク質Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３を発現する。融合タンパク質の発現過程が完全に一致するので、Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１を例とし、実験過程は以下の通りである。

【0044】

１、プラスミドの製造
−８０℃の冷蔵庫から、Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１発現ベクターによる菌株保存グリセリンチューブを１本取り出し、５００ｍＬのＡｍｐ抵抗性ＬＢ培地の入った２Ｌの振とうフラスコに接続し、３７℃、１６０ｒｐｍで終夜振とうして培養する。

【0045】

培養終了後、５０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集し、市販のエンドトキシン除去プラスミドマキシキットを用いてプラスミドを抽出する。プラスミドの濃度を１ｍｇ／ｍＬ以上（この濃度よりも低いと濃縮する）に制御し、口径０．２２μｍの無菌ろ過膜によりろ過し殺菌し、プラスミドの製造が完成する。

【0046】

２、一過性トランスフェクション細胞の前期準備作業
トランスフェクションに用いられる２９３Ｆ細胞を回復当日から４日間ずつ培養し、細胞密度０．４＊１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代培養し、少なくとも継代培養を三回行ってから一過性トランスフェクションを行う。継代培養過程において、最終的なトランスフェクション培地の体積により、必要に応じて継代培養体積を増大する。

【0047】

３、一過性トランスフェクション（３０ｍＬのトランスフェクション体積を例とし、必要に応じて倍増する）
（１） 実験前日に６＊１０^７の生細胞を３０ｍＬのＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに入れ、３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで振とう培養する。

【0048】

（２） 実験当日に、まず前日培養された細胞をカウントし、細胞密度が３〜５＊１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、生存率が９５％以上である。

【0049】

（３） ７．５＊１０^７ｃｅｌｌｓを新しい１２５ｍＬ三角フラスコに吸い込み、予熱したＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを２５．５ｍＬに補充する。

【0050】

（４） プラスミド−トランスフェクション試薬の混合液の準備
〔１〕３０μｇプラスミドＤＮＡを１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに再溶解し、軽く均一に混合する。

【0051】

〔２〕８１μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ ＲｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに加え、１．５ｍＬに定容する。軽く均一に混合し、室温で５ｍｉｎインキュベートする（長時間にわたりインキュベートすると転化率に影響を与える）。

【0052】

〔３〕前記二種類の溶液を軽く均一に混合し、室温で２０〜３０ｍｉｎインキュベートし、プラスミド−トランスフェクション試薬の混合液の準備作業を完成する。

【0053】

（５） ３ｍＬのプラスミド−トランスフェクション試薬の混合液をステップ（３）の細胞培養液に加え、計２８．５ｍＬである。

【0054】

（６） ３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで２０時間振とう培養する。

【0055】

（７） １５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を加える。これにより、総体積が３０ｍＬとなる。

【0056】

（８） ３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで振とう培養する。６日目に培養を終了し、タンパク質の精製を行う。

【0057】

（三）融合タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａは、黄色ブドウ球菌から分離された細胞壁タンパク質であり、主にＦｃ断片により哺乳動物ＩｇＧに結合し、極めて高い特異性と結合能力を有し、ＩｇＧ抗体とＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質の精製に広く用いられる。２種類の新規な融合タンパク質Ｆｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１は、いずれもＩｇＧ−Ｆｃ断片を有し、精製過程が完全に一致するので、１．６ＬでＦｃ−ＩＬ４ＤＭ−ＨＭ３−１を一過性トランスフェクションして製造することを例とし、実験過程は以下の通りである。

【0058】

１、サンプルの前処理：１．６Ｌの培養終了後の一過性トランスフェクション細胞培養液を４℃で７５００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、約１．４６Ｌの得られた上澄みを次のｐｒｏｔｅｉｎ Ａ捕捉に供する。

【0059】

２、目的のタンパク質のアフィニティー捕捉（図５の通り）
クロマトグラフィー用カラムの情報は以下の通りである。

【0060】

【表1】

【0061】

〔１〕まず、５００ｍＬの０．２Ｍ ＮａＯＨで滅菌し、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0062】

〔２〕２０ｍＭのＰＢ、０．１５ＭのＮａＣｌでｐＨ ７．０となるようにクロマトグラフィー用カラムを平衡化させ、体積を約１０００ｍＬとし、流速を２０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0063】

〔３〕サンプルの設置：サンプルをｐＨが中性になるまで予め調整し、流速を２０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0064】

〔４〕２０ｍＭのＰＢ、０．１５ＭのＮａＣｌでｐＨ ７．０となるようにクロマトグラフィー用カラムを洗い流し、約８００ｍＬとし、流速を２０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0065】

〔５〕５０ｍＭのクエン酸−クエン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣＬでｐＨ ３．０とうなるように目的のタンパク質を溶出させ、ピークが出るから２０ｍＡｕで収集し始め、ピーク後２０ｍＡｕで収集を停止し、流速を２０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0066】

〔６〕最後に、クロマトグラフィー用カラムを０．２ＭのＮａＯＨで５００ｍＬ洗浄し、中性になるまで水で洗い流した後、２０％エタノールでクロマトグラフィー用カラムを保存する。

【0067】

〔７〕最後に、クロマトグラフィー用カラムを０．２ＭのＮａＯＨで５００ｍＬ洗浄し、中性になるまで水で洗い流した後、２０％エタノールでクロマトグラフィー用カラムを保存する。

【0068】

３、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによるさらなる分離精製（図６の通り）

【0069】

【表2】

【0070】

〔１〕０．５ＭのＮａＯＨ ３００ｍＬで滅菌し、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとし、その後、だいたい中性になるまで超純水で洗い流す。

【0071】

〔２〕ＰＢＳ緩衝液でｐＨ ７．４となるようにクロマトグラフィー用カラムを平衡化させ、平衡体積を約１５００ｍＬとし、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0072】

〔３〕サンプルを設置し、サンプルをｐｒｏｔｅｉｎＡ溶出液とし、サンプルの設置量を４０ｍＬとする。

【0073】

〔４〕サンプルを収集し、ピーク３を目的のタンパク質のピークとし、ピーク３を収集し、ピークが出るから１０ｍＡｕで収集し始め、ピーク後１０ｍＡｕで収集を停止する。

【0074】

〔５〕最後に、０．１ＭのＮａＯＨでクロマトグラフィー用カラムを保存し、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとする。

【0075】

４．サンプルの限外ろ過濃縮：ピーク３のサンプルを合わせて限外ろ過濃縮を行い、限外ろ過膜を１０ｋＤａで用い、目的のタンパク質の濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上になるまでサンプルを濃縮した後、サンプルを分装し、−８０℃の冷蔵庫で保存する。初期濃度を約０．２９ｍｇ／ｍＬとし、最終濃縮を２７ｍＬとし、濃度を約５．５３ｍｇ／ｍＬとし、サンプルを分装し、凍結保存する。同時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＨＰＬＣ等の方法によりサンプルのリリース測定を行う（図７と図８）後、ドラッガビリティの評価研究に供する。

【0076】

実施例２
融合タンパク質の多種の腫瘍細胞に対する増殖阻害作用
ＭＴＴ法により、実施例１で得られたインテグリン阻害剤である融合タンパク質の、黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０、胃がん細胞ＭＧＣ−８０３、肺がん細胞Ａ５４９、肝がん細胞Ｈｅｐ−Ｇ２、乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、結腸がん細胞ＨＣＴ−１１６、ヒト脳膠腫Ｕ８７、子宮頸がん細胞Ｈｅｌａを含む多種の腫瘍細胞に対する増殖活性阻害作用を測定する。

【0077】

腫瘍細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで密度が９０％以上に達するまで培養し、トリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を３．０×１０^４個／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で一晩培養する。融合タンパク質一、融合タンパク質二、陽性薬タキソールＴａｘｏｌを培養液でそれぞれの所定濃度に希釈する。細胞が完全にプレートに接着した後、各希釈液をそれぞれ９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に加える。インテグリン阻害剤が加えられた融合タンパク質一、融合タンパク質二を投与群とし、タキソールを陽性対照群とし、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで４８時間インキュベートする。９６ウェルプレートの各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを２０μＬ加え、引き続き４時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長５７０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度値を測定し、以下の算式により増殖阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＰＩ）を算出する。

【0078】

【数1】

【0079】

Ｎ_ｔｅｓｔは試験群のＯＤ値、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群のＯＤ値である。

【0080】

データ統計：
実験を５回独立して繰り返し、実験結果からｍｅａｎ±ＳＤを算出し、統計Ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差があり、Ｐ＜０．０１の場合に極めて顕著な有意差がある。実験結果を表１〜８に示す。

【0081】

【表3】

【0082】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、黒色腫細胞Ｂ１６Ｆ１０を効果的に阻害することができ、８μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が４０％以上に達する。

【0083】

【表4】

【0084】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、胃がん細胞ＭＧＣ−８０３を効果的に阻害することができ、３２μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が５０％以上に達する。

【0085】

【表5】

【0086】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、肺がん細胞Ａ５４９を効果的に阻害することができ、１２８μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が４５％以上に達する。

【0087】

【表6】

【0088】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、肝がん細胞Ｈｅｐ−Ｇ２に対して一定の阻害作用を有し、阻害率は、濃度が増加するにつれて高くなる。

【0089】

【表7】

【0090】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を効果的に阻害することができ、１２８μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が４０％以上に達する。

【0091】

【表8】

【0092】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、結腸がん細胞ＨＣＴ−１１６を効果的に阻害することができ、６４μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が４０％以上に達する。

【0093】

【表9】

【0094】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、ヒト脳膠腫Ｕ８７を顕著に阻害することができ、３２μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が５０％以上に達する。

【0095】

【表10】

【0096】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、子宮頸がん細胞Ｈｅｌａを顕著に阻害することができ、６４μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が５５％程度に達する。

【0097】

以上をまとめると、融合タンパク質一、タンパク質二のインテグリン阻害剤の、多種の腫瘍細胞に対する増殖阻害作用は、表１〜８に示される通り、融合タンパク質は、胃がん、肺がん、肝がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、膠腫及び子宮頸がんの増殖を効果的に阻害することができる。そのうち、３２μｇ／ｍＬの濃度で、黒色腫、胃がん、ヒト脳膠腫に対する阻害率が５０％以上に達し、６４μｇ／ｍＬの濃度で、結腸がん細胞に対する阻害率が４０％以上に達し、子宮頸がん細胞に対する阻害率が５０％以上に達し、肺がん、肝がん、乳がん細胞に対しては、高い濃度でしか効果的に阻害することができない。

【0098】

実施例３
三次元ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法によるヒト臍静脈内皮細胞に対する融合タンパク質一、タンパク質二の遊走阻害活性の測定
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、５％ウシ胎児血清及び１×ＥＣＧＳを含有する内皮細胞培養液で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータでコンフルエンスが９０％以上になるように培養し、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法により内皮細胞に対する融合タンパク質一、タンパク質二の遊走阻害活性を測定し、内皮細胞ＨＵＶＥＣは第２〜８世代のみを用い、具体的には、以下の通り操作する。

【0099】

（１）１０ｍｇ／ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌをＤＭＥＭ培地により１：４で希釈した後、ｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー膜に塗布し、室温で空気乾燥させる。

【0100】

（２）対数増殖期に培養したＨＵＶＥＣ細胞を０．２％ＥＤＴＡで消化して収集し、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含有する内皮細胞培養液で再懸濁させる。顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を１×１０^５／ｍＬに調整する。

【0101】

（３）各群の試験用液を調製した後、０．１％ＢＳＡを含有する細胞培養液で１００μＬに希釈する。

【0102】

以下の通り群分けする。

【0103】

ブランク対照群：薬物を含まない細胞培養液である。

【0104】

エンドスター群：薬物を含まない細胞培養液で５ｍｇ／ｍＬのエンドスター薬液を所定濃度に希釈する。

【0105】

融合タンパク質群：薬物を含まない細胞培養液で融合タンパク質を１０μｇ／ｍＬに希釈する。

【0106】

（４）細胞を１００μＬ／ウェルでｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーに接種し、各群の試験用液をチャンバーに加える。２４ウェルプレートに５％ウシ胎児血清及び１％ＥＣＧＳを含有する内皮細胞培養液０．６ｍＬを加え、細胞を遊走するように刺激し、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間培養する。

【0107】

（５）ウェルにおける培養液を捨て、９０％アルコールにより常温で３０ｍｉｎ固定し、０．１％クリスタルバイオレットにより常温で１０ｍｉｎ染色した後、清水でリンスし、綿棒を用いて上層にある遊走していない細胞をやさしく拭き取り、顕微鏡で観察し、４つの視野を選択し、撮影してカウントする。以下の算式により遊走阻害率（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＭＩ）を算出する。

【0108】

【数2】

ここで、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群の細胞遊走数、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群の細胞遊走数である。

【0109】

データ統計：
実験を３回独立して繰り返し、実験結果からｍｅａｎ±ＳＤを算出し、統計Ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差があり、Ｐ＜０．０１の場合に極めて顕著な有意差がある。実験結果を表９に示す。

【0110】

【表11】

【0111】

実験結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二の作用により、遊走した内皮細胞数が陰性対照群に比べて顕著に減少する。２μｇ／ｍＬの濃度でＨＵＶＥＣ遊走阻害に対して顕著な作用を有し、阻害率が７０％以上であり、細胞遊走に対する阻害率は、陰性対照群に比べて極めて顕著な有意差があり（Ｐ＜０．０１）、濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜４μｇ／ｍＬである場合に阻害効果が最も好ましい。

【0112】

実施例４
マウス脾臓リンパ球の増殖に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
無菌条件でマウス脾臓を取り出し、ブランク１６４０培地で３回洗浄し、５ｍＬシリンジのピストンを用いて脾臓を押しつぶし、その後２００メッシュの篩で濾過し、単細胞懸濁液を調製し、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）した後、上澄みを捨て、Ｔｒｉｓ−ＮＨ_４Ｃｌで赤血球を破砕し、氷水浴で４ｍｉｎ静置し、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）した後、上澄みを捨て、無菌ＰＢＳで細胞を２回洗浄する。最後に１０％子牛血清のＲＰＭＩ１６４０培養液（５ｍＬ）を加えて細胞を懸濁させ、細胞をカウントし、細胞濃度を５×１０^６個／ｍＬに調整した後、９６ウェル培養プレートで培養する。

【0113】

試験では、ブランク対照群、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）群、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）群（０．０２ｍｇ／ｍＬ）、タンパク質一及びタンパク質二の試験群とする。各群にそれぞれ１００μＬ／ウェルで脾臓リンパ球懸濁液を加えた後、ブランク対照群にブランク１６４０培養液１００μＬ、ＣｏｎＡ群にＣｏｎＡ（最終濃度：５μｇ／ｍＬ）、Ｄｅｘ群にＤｅｘ、タンパク質一及びタンパク質二に濃度の異なる抽出物を加えた上でＣｏｎＡ（最終濃度：５μｇ／ｍＬ）を加える。３７℃の細胞インキュベータで４８時間静置培養し、培養終了後に各ウェルに２０μＬのＭＴＴを加え、引き続き４時間培養し、最後に各ウェルにおけるすべての溶液を捨て、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを加え、振とうし、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍでのＯＤ値を測定し、各ウェルについて５個の並行群をセットする。実験結果を表１０に示す。

【0114】

【表12】

【0115】

結果から明らかなように、ＣｏｎＡ群に比べて、融合タンパク質一、タンパク質二は、いずれもマウス脾臓リンパ球の増殖をある程度阻害することができる。

【0116】

実施例５
マウス腹腔マクロファージのＩＬ−１β産生に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
（１）ＩＬ−１βの産生：マウスに１ｍＬのブロス培地（６％）澱粉を腹腔内注射し、３日後、無菌条件でマウス腹腔マクロファージを取り、１６４０培地で２回洗浄し、細胞濃度を２×１０^６個／ｍＬに調整した後、１ｍＬ／ウェルで２４ウェル培養プレートに注入し、細胞インキュベータに置き３時間インキュベートし、３０ｍｉｎ毎に振とうすることで細胞を完全にプレートに接着させる。次いで、培養液で２回洗浄することでプレートに接着していない細胞を除去する。ブランク群はＰＢＳを加え、陽性群は陽性薬デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を加え、対照群は、濃度が低、中、高の３種類の融合タンパク質一と二であり、投与後、４８時間継続的に培養した後、１０００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離する。上澄みをＩＬ−１β活性測定サンプルとして回収する。

【0117】

（２）ＩＬ−１βの含有量測定：Ｒ＆Ｄ会社のマウスＩＬ−１β酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて測定し、キットの説明書に従って以下の通り操作する。即ち、測定サンプル及び濃度の異なる標準品を、それぞれプレートシールで反応ウェルをカバーし、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、ビオチン化抗体作動流体（１００μＬ／ウェル）を加え、プレートシールで反応ウェルをカバーし、３７℃で６０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、酵素コンジュゲート作動流体（１００μＬ／ウェル）を加え、プレートシールで反応ウェルをカバーし、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、プレートを４回洗浄し、顕色剤（１００μＬ／ウェル）を加え、暗所で３７℃で１０−２０ｍｉｎインキュベートし、停止液（１００μＬ／ウェル）加え、均一に混合した後、ＯＤ４５０値を測定する。実験結果を表１１に示す。

【0118】

【表13】

【0119】

実験結果から明らかなように、融合タンパク質一及びタンパク質二は、いずれもマウス腹腔マクロファージのＩＬ−１β産生に対して顕著な阻害作用を有する。

【0120】

実施例６
ラット綿球肉芽腫のような亜急性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
分析天秤で脱脂綿４０部を正確に秤量し、３０ｍｇ／部で形状と大きさがほとんど同じ球形に丸める。使用のために、１．５ｋｐａで３０ｍｉｎ高圧滅菌し、５０℃でべーキングする。

【0121】

雄性ＳＤラット４０匹を取り、１０匹／群で４群にランダムに分ける。それぞれモデル群、デキサメタゾン陽性群（１０ｍｇ／ｋｇ）、融合タンパク質一、タンパク質二の試験群とし、有効用量を６４ｍｇ／ｋｇとする。投与前にラットをペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することで麻酔させ、腹部コートをはさみで取り除き、無菌条件で、切欠長さが約１ｃｍとなるように下腹部の真ん中の皮膚を剪み、止血鉗子で皮下組織を拡張し、片側の鼠蹊に無菌乾燥綿球を皮下移植し、切欠を縫合し、感染を防止するために切欠に適量のアモキシシリンを散らす。術後当日から群別５日に１回注射投与する。７日目に、投与後の２４時間目に、頸椎脱臼でマウスを死亡させ、鼠蹊の皮膚を切り、綿球を周囲の肉芽組織とともに取り出し、周囲組織を取り除く。６０℃のオーブンに入れて４８時間連続して乾燥させた後、重量を精密に秤量し、以下の算式により肉芽腫重量を算出する。肉芽腫重量（ｍｇ／１００ｇ体重）＝肉芽腫の正味重量（ｍｇ）／ラットの体重（１００ ｇ）。実験結果を表１２に示す。

【0122】

【表14】

【0123】

実験結果から明らかなように、ブランクモデル群に比べて、融合タンパク質一及びタンパク質二は、有効用量６４ｍｇ／ｋｇで、いずれもラット綿球肉芽腫に対して顕著な阻害作用を有する。陽性薬は、阻害率が高いが、ラットの体重が顕著に低下し、毒性副作用が大きく、融合タンパク質が比較的安全である。

【0124】

実施例７
マウス腹腔毛細血管透過性に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
昆明マウス８０匹を準備し、１０匹／群で８群にランダムに分け、それぞれブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群（１０ｍｇ／ｋｇ）、高、中、低用量（１２８、３２、８ｍｇ／ｋｇ）の融合タンパク質一及びタンパク質二を試験群とする。５日に１回注射投与し、ブランクモデル群に対して等体積の生理食塩水を５日間持続して投与し、正常に給餌する。投与後５日目に、５ｇ／Ｌエバンスブルー生理食塩水溶液を１０ｋｇ／ｍＬ尾静脈注射した後、すぐにＨＡｃ溶液（６ｍＬ／Ｌ）を１０ｋｇ／ｍＬ腹腔内注射して炎症を誘発する。２０ｍｉｎ後に頸椎脱臼でマウスを死亡させ、５ｍＬの生理食塩水を腹腔内注射し、腹部を２ｍｉｎ軽く揉み、腹腔を切り、腹腔洗浄液を収集し、４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、１ｍＬの上澄みを取り３ｍＬの生理食塩水に加えて４ｍＬの希釈液を得、紫外分光光度計により波長５９０ ｎｍで希釈液の吸光度ＯＤ値を測定し、ＯＤ５９０ ｎｍ値によって色素滲出量を表し、マウス腹腔毛細血管透過性を観察する。実験結果を表１３に示す。

【0125】

【表15】

【0126】

実験結果から明らかなように、融合タンパク質一及びタンパク質二は、いずれも氷酢酸によるマウス腹腔毛細血管透過性の増加に対して顕著な阻害作用を有し、用量が高いほど、作用が強くなる。

【0127】

実施例８
キシレンによるマウスの耳腫脹に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
昆明マウス８０匹を取り、１０匹／群で８群に分け番号付けする。生理食塩水群をブランク対照群、アスピリン群（２００ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照群、融合タンパク質一及びタンパク質二の高、中、低用量（１２８、３２、８ｍｇ／ｋｇ）を試験群とする。マウスに対して５日に１回注射投与する。ブランク対照群に対して等体積の生理食塩水を投与する。投与後５日目に、マウスの右耳の両面にキシレン０．０５ｍＬを塗布して炎症を誘発し、左耳には塗布せずに正常耳とする。２時間後に頸椎脱臼でマウスを死亡させ、耳介に沿って両耳を切り、イヤーパンチで耳ピースを取り、重さを測り、以下の算式で腫脹度及び腫脹率を算出する。腫脹度＝右耳ピースの重さ−左耳ピースの重さ、腫脹率＝（腫脹度／左耳ピースの重さ）×１００％。実験結果を表１４に示す。

【0128】

【表16】

【0129】

実験結果から明らかなように、融合タンパク質一及びタンパク質二の中、高用量は、いずれもキシレンによるマウスの耳腫脹に対して顕著な阻害作用を有し、阻害作用は、用量の増加につれて強くなる。

【0130】

実施例９
カラギーナン誘導ラット足趾腫脹急性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
ＳＤラット８０匹を取り、１０匹／群で８群にランダムに分け、それぞれブランクモデル群、デキサメタゾン陽性群（５ｍｇ／ｋｇ）、及び融合タンパク質一とタンパク質二の高、中、低用量群（１２８、３２、８ｍｇ／ｋｇ）の試験群とする。５日に１回注射投与し、モデル群に等体積の生理食塩水を３日間持続して投与し、正常に給餌する。投与後３日目に、右後足の足裏に１％カラギーナン０．１ｍＬを皮下注射することで炎症を誘導し、炎症誘導後の１時間、３時間、５時間、７時間にそれぞれ足の体積を測定する。以下の算式により足腫脹度を算出する。足腫脹度（ｍＬ）＝炎症誘導後の足の体積−炎症誘導前の足の体積。こぼれた液体のミリリットル数を記録する（方法：右関節の突起箇所に対しボールペンで測定マークとして円を描き、後肢が装置外に露出し且つ円が描かれた箇所が液面と重なり合うように、各ラットの右後足を体積測定装置内に順次入れる。足が液体に入ると、液面が高くなり、こぼれた液体の体積をラットの右後足の体積として各ラットの右後足の正常体積を測定する）。実験結果を表１５に示す。

【0131】

【表17】

【0132】

実験結果から明らかなように、モデル構築後、各群のラットの足趾部は迅速に腫脹し、約３〜５時間目に腫脹はピークに達し、７時間目から消失し始める。融合タンパク質一及びタンパク質二の高用量は、いずれもカラギーナン誘導ラット足趾腫脹に対して顕著な阻害作用を有し、低用量の阻害作用が顕著ではない。

【0133】

実施例１０
アジュバントラット関節炎慢性炎症に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
モデルの構築：
ＳＰＦレベルのＳＤラット８０匹を取り、８群にランダムに分け、各群のラットをエーテルで浅麻酔させた後、ラットの左後のつま先に不活性化された結核菌を含む完全フロイントアジュバント０．１ｍＬを皮下注射した後、左後足に原発性関節炎が迅速に生じ、モデル構築後の１３日目程度に、右後足に続発性関節炎が発生し始める。ブランク対照群に等体積の生理食塩水を注射する。モデル構築後の１３日目から投与する。ここで、メトトレキセート群に５日に１回、１５日計４回注射投与する。融合タンパク質一及びタンパク質二の高、中、低の３種類の用量（１２８ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ）で５日に１回、１５日注射投与する。

【0134】

治療効果の評価：
１．原発性及び続発性足趾腫脹度
足の体積測定方法により、各ラットの左右後足の足首関節に脂溶性標識ペンで標識し、動物の左右後足をそれぞれ体積測定装置に浸漬する。浸漬深さは、マーカーを限界とし、当該装置の目盛ピペットでの読取値を動物の左右後足の初期体積とする。

【0135】

モデル構築の当日を０日目とし、ｄ０と記し、モデル構築後の１日目ｄ１から左後足（モデル構築の足）の体積を２日おきに１回測定し、反対側の非炎症誘導足（右後足）に腫脹（即ち、続発性関節炎）が発生すると投与し、左右後足の体積を２日おきに１回測定し、以下の算式により原発性と続発性足趾腫脹度を求める。

【0136】

原発性足趾腫脹度（ｍＬ）＝測定当日の左後足の体積−左後足の初期体積
続発性足趾腫脹度（ｍＬ）＝測定当日の右後足の体積−右後足の初期体積
２．臨床スコア
全身スコア：続発性炎症が発生した後、２日おきに全身スコアを行う。

【0137】

後足：腫脹がない＝０点、１つの後足に腫脹が発生する＝１点、２つの後足に腫脹が発生する＝２点、
前足：腫脹がない＝０点、１つの前足に腫脹が発生する＝１点、２つの前足に腫脹が発生する＝２点、
耳：赤みと結節がない＝０点、１つの耳に赤み又は結節が発生する＝１点、２つの耳に赤みと結節が発生する＝２点、
鼻：腫脹がない＝０点、顕著な腫脹＝１点、
尾：結節がない＝０点、結節がある＝１点。満点８点。

【0138】

関節炎の指数スコア：続発性炎症が発生した後、２日おきに関節炎の指数スコアを行う。

【0139】

正常＝０点、足首関節に紅斑と軽い腫脹が発生する＝１点、足首関節から中足指節関節又は足底関節までに紅斑と軽度腫脹が発生する＝２点、足首関節から中足指節関節又は足底関節までに紅斑と中度腫脹が発生する＝３点、足首関節から中足指節関節又は足底関節までに紅斑と重度腫脹が発生する＝４点、各足で満点４点であり、最高スコアは１６点である。

【0140】

３．体重増加値
モデル構築前に各群のラットの初期体重を秤量し、モデル構築のｄ１日目から、２日おきに体重を測り、初期体重を引き、各群のラットの体重増加値とする。実験結果を表１６に示す。

【0141】

【表18】

【0142】

実験結果から明らかなように、各群のラットのモデル構築を行った後、左後足に腫脹（原発性炎症）が迅速に発生し、１３日目に、左右後足（非反対側炎症誘導足）に赤い腫れ（即ち、続発性炎症）が発生し、関節炎指数及び全身スコアが高くなり始め、１９日目に最大値に達し、投与するにつれて各群の腫脹度及びスコアが徐々に低下する。原発性足趾腫脹度によって各治療群の原発性関節炎に対する治療作用を反映し、各投与群の高、中の２種類の用量は、モデル群に比べて、いずれも原発性関節炎をある程度治療することができ、陽性薬メトトレキセートの効果が最も好ましく、融合タンパク質一及びタンパク質二は、高用量群の効果が好ましく、極めて顕著な有意差があり（＊＊Ｐ＜０．０１）、続発性足趾腫脹度によって各治療群の続発性関節炎に対する治療作用を反映する。

【0143】

実施例１１
ヒト網膜血管内皮細胞（ＨＲＣＥＣ）に対する融合タンパク質一、タンパク質二の増殖阻害作用
ＭＴＴ法により、インテグリン阻害剤であるポリペプチドの、ヒト網膜血管内皮細胞に対する増殖活性阻害を測定する。ＨＲＣＥＣ細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で密度９０％以上まで培養し、トリプシンで消化して収集し、培養液で細胞を再懸濁させ、顕微鏡下でカウントする。細胞濃度を３．０×１０^４個／ｍＬに調整した後、細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で一晩培養する。ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩ、ポリペプチドＩＩＩ、Ａｖａｓｔｉｎを培養液でそれぞれの所定濃度に希釈する。細胞が完全にプレートに接着した後、各希釈液をそれぞれ９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に加える。インテグリン阻害剤であるポリペプチドを加えたものを投与群、Ａｖａｓｔｉｎを加えたものを陽性対照群、いずれの薬物も加えなかった培養液をブランク対照群とし、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで４８時間インキュベートする。９６ウェルプレートの各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを２０μＬ加え、引き続き４時間培養する。培地を吸引により除去した後、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを加えて溶解する。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長５７０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度値を測定し、以下の算式により増殖阻害率（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＰＩ）を算出する。

【0144】

【数3】

ここで、Ｎ_ｔｅｓｔは試験群のＯＤ値、Ｎ_{ｃｏｎｔｒｏｌ}はブランク対照群のＯＤ値である。

【0145】

データ統計：
実験を５回独立して繰り返し、実験結果からｍｅａｎ±ＳＤを算出し、統計Ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に有意差があり、Ｐ＜０．０１の場合に極めて顕著な有意差があった。実験結果を表１７に示す。

【0146】

【表19】

【0147】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、ヒト網膜血管内皮細胞（ＨＲＣＥＣ）の増殖に対して顕著な阻害作用を有し、用量依存関係を示し、６４μｇ／ｍＬの濃度で、阻害率が５０％以上に達する。

【0148】

実施例１２
鶏胚漿尿膜（ＣＡＭ）による融合タンパク質一、タンパク質二のインビボでの血管新生に対する阻害活性作用の分析
本研究では、ＣＡＭ試験により融合タンパク質一、タンパク質二のインビボでの血管新生に対する阻害活性を検討する。研究によると、鶏胚が成長する８日目から１１日目まで、コラーゲンタンパク質の生合成速度が最大に達し、このときが血管新生の最も盛んな段階となり、体内免疫システムはまだ完全に構築されていないので、８日目に成長する鶏胚を選択して投与し始める。薬物担持紙上のポリペプチドは、鶏胚漿尿膜に一定の拡散範囲制限があることを考慮すると、試験では、紙の縁から半径５ｍｍの範囲での新生血管数のみをカウントする。以下の通り操作する。

【0149】

（１）６日目の白杭鶏胚を湿度６０％〜７０％、３７℃のインキュベータで２日培養する。

【0150】

（２）鶏胚気嚢の上方に１．０ｃｍ×１．０ｃｍの窓を開け、ピンセットで内膜を剥がし、漿尿膜を露出させる。直径５ｍｍのレンズ拭紙をサンプル添加キャリアとし、鶏胚気嚢の漿尿膜に放置する。ろ紙にＰＢＳを加えたものをブランク群、それぞれ異なる用量の融合タンパク質を加えたものを投与群、Ａｖａｓｔｉｎを陽性対照群とする。

【0151】

（３）鶏胚気嚢を無菌透明テープでカバーし、３７℃で７２時間培養した後、鶏胚気嚢を開け、固定液（ホルムアルデヒド：アセトン＝１：１）を加えて１５ｍｉｎ固定する。レンズ拭紙付の漿尿膜を取り出し、新生血管分布状況を観察し、新生血管をカウントし撮影する。各群の用量を５回繰り返し、試験結果を統計分析する。

【0152】

鶏胚漿尿膜（ＣＡＭ）による融合タンパク質のインビボでの血管新生に対する阻害活性の分析を行ったところ、陰性対照群ではＰＢＳ処理を行い、陽性対照群ではＡｖａｓｔｉｎの用量を１０μｇとし、融合タンパク質一、タンパク質二ではそれぞれ１２８μｇ、３２μｇ、８μｇという高、中、低の３種類の用量で鶏胚を処理する。結果を表１８に示す。

【0153】

【表20】

【0154】

実験結果から明らかなように、融合タンパク質一及びタンパク質二は、いずれもＣＡＭの新生血管形成を阻害することができ、高用量下で５０％に近い強い阻害効果を有する。

【0155】

実施例１３
マウス角膜新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスアルカリ火傷誘導角膜新生血管モデルの構築：
健康ＢＡＬＢ／ｃマウス１５匹（雄性、体重２０〜２５ｇ）を、細隙灯顕微鏡下で両眼前眼部及び付属器官を検査し、眼病変を排除する。アルカリ火傷のモデル構築前日に０．３％オフロキサシン点眼薬を１日２回投与して点眼する。マウスを１．８％Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することで麻酔させた後、ピンセットで直径２ｍｍの単層ろ紙を挟み、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液に浸漬し、飽和状態になった後、余分な液体を取り除き、ろ紙をＢＡＬＢ／ｃマウス角膜中央に４０Ｓ放置し、ろ紙を捨て、すぐに１５ｍＬのＰＢＳで火傷領域及び結膜嚢を１ｍｉｎ十分に洗い流す。綿棒で余分な水分を拭き取り、上皮下基質層及び角膜縁に損傷を与えないように、手術用顕微鏡下でブレードで角膜縁に平行になるように角膜上皮を回転して剥離し、手術終了後に感染を予防するために結膜嚢にエリスロマイシン眼軟膏を塗布する。

【0156】

（２）実験動物の群分け及び標本取得：
マウス１５匹を５匹／群でランダムに分け、融合タンパク質一群、融合タンパク質二群及び対照群と記し、アルカリ火傷を加えた後、それぞれ６４μｇの融合タンパク質一、６４μｇの融合タンパク質二及び生理食塩水を硝子体注射により７日１回投与する。アルカリ火傷を加えた後の１、７、１４日目に細隙灯顕微鏡下で各群角膜の炎症反応及び新生血管の状況を観察する。アルカリ火傷を加えた後の１４日目に前眼部撮影付きの細隙灯顕微鏡下で撮影し各群角膜の新生血管形成状況を記録した後、頸椎脱臼で全てのマウスを死亡させ、眼球を摘出し、生理食塩水で洗い流して血痕を除去し、４％パラホルムアルデヒドで１．５時間固定し、３０％スクロースを含むＰＢＳに入れて終夜脱水した後、ＯＣＴ凍結組織切片作製用包埋剤で包埋し、−８０℃の冷蔵庫中に保存し、８μｍの凍結切片を作製し、免疫組織化学法によりＣＤ３１の発現を検出する。

【0157】

（３）角膜組織微小血管密度の定量測定：
微小血管密度（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＭＶＤ）は、血管形成を評価する指標である。抗ＣＤ３１抗体免疫組織化学法により血管内皮細胞を標識し、単位面積当たりの微小血管数をカウントすることにより、新生血管形成の程度を評価する。微小血管の統計は、以下のように行われる。顕微鏡下で角膜組織における隣接する組織の境界が明確で、琥珀色若しくは褐色に染色された内皮細胞又は細胞集団を観察し新生血管としてカウントする。１０×２０の顕微鏡下で切片全体における新生血管の数をカウントし、角膜組織切片を撮影した後、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊにより角膜組織切片全体の面積を算出し、切片全体における新生血管の密度を求める。結果を表１９に示す。

【0158】

【表21】

【0159】

結果から明らかなように、ＣＤ３１は、微小血管マーカーとして主に血管内皮細胞の細胞質に発現され、染色された陽性細胞は、背景染色を行わずに、琥珀色若しくは褐色に染色された血管内皮細胞である。融合タンパク質一、タンパク質二の試験群は、対照群に比べて、ＣＤ３１陽性新生血管が顕著に減少する。融合タンパク質一、タンパク質二は、対照群に比べて有意差を有する。実験結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二は、いずれも角膜新生血管の増殖を阻害することができ、角膜新生血管性眼疾患の治療薬として用いられることができる。

【0160】

実施例１４
イエウサギの虹彩新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
５７７ｎｍのアルゴンイオンレーザーによりイエウサギの網膜の主分枝静脈を凝固・閉塞させ、蛍光眼底血管造影（ＦＦＡ）により静脈が成功裏に閉塞されたことを確認する。５〜１２日後に、蛍光虹彩血管造影（ＩＦＡ）により、虹彩血管は、正常対照群に比べてフルオレセイン漏出が顕著であり、これは虹彩新生血管化動物モデル（ＮＶＩ）の形成を実証している。

【0161】

モデル構築後に９眼を取り、３眼／群で陰性対照群、融合タンパク質一治療群、融合タンパク質二治療群にランダムに分ける。それぞれ生理食塩水、１２８μｇの融合タンパク質一、１２８μｇの融合タンパク質二を硝子体注射により７日１回で２週間投与する。３週目に光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察する。

【0162】

結果：光学顕微鏡から観察されるように、虹彩前表面は、主に線維組織からなる線維血管膜残留物であり、僅かな開放血管腔がある。虹彩基質内に壊死細胞及び細胞破片である血管残留物が認められる。光学顕微鏡から分かるように、対照眼の虹彩表面は、分枝及び潜在管腔のある線維血管膜である。

【0163】

治療群虹彩の超微細構造に一連の退行性変化があり、虹彩基質中央部の大血管の内皮細胞に正常な細胞核、細胞質及び細胞間の結合があり、虹彩基質及び虹彩前表面に毛細血管の残留物があり、周囲に細胞破片及び浸潤してきたマクロファージがあり、潜在管腔の毛細血管及び退化した壁細胞がなく、これは新生血管の消失を示している。

【0164】

虹彩新生血管化動物モデル実験から明らかなように、融合タンパク質一及びタンパク質二が新生血管の形成を阻害すると共に、形成した血管を退化させることができる。

【0165】

実施例１５
ウサギ眼脈絡膜血流に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
体重が２．５〜３．０キログラムであるニュージーランドウサギを取り、３群にランダムに分け、それぞれ対照群、融合タンパク質一群、タンパク質二群と標識する。各群のウサギに対して３５ｍｇ／ｋｇのキシラジンで混合した後筋肉内麻酔させ、その後、１時間ごとに初期量の半分で連続して筋肉内注射で麻酔させる。左眼の眼圧を４０ｍｍＨｇに上げ、当該圧力下で眼血流を正常値の１／３に低下させることができる。ミクロスフェアを注射するために（眼血流量を算出する）右頸動脈を経由して左心室まで挿管し、採血のために股動脈に挿管する。各群に硝子体注射によりそれぞれ生理食塩水を投与し、１２８μｇの融合タンパク質一、１２８μｇの融合タンパク質二を投与した後０、３０、６０分にカラーミクロスフェア技術により高眼圧のウサギ眼の眼血流量を測定する。各時点で、０．２ｍＬ（約２００万）のミクロスフェアを注射し、ミクロスフェアを注射した直後股動脈採血を６０秒行い、ヘパリン化抗凝固管に放置し、採血量を記録する。最後に採血した後、１００ｍｇ／ｋｇのフェノバルビタールを静脈注射して動物を死亡させ、眼球を摘出し、網膜、脈絡膜、虹彩及び毛様体を分離し、組織重量を記録する。各時点で以下の算式により組織の血流を算出する。Ｑｍ＝（Ｃｍ×Ｑｒ）／Ｃｒ。ここで、Ｑｍは、単位がμＬ／ｍｉｎ／ｍｇである組織の血流を表し、Ｃｍは、１ミリグラム当たりの組織のミクロスフェア数であり、Ｑｒは、単位がμＬ／ｍｉｎである血流量であり、Ｃｒは、参照とする血液のミクロスフェア数である。実験結果を表２０に示す。

【0166】

【表22】

【0167】

結果から明らかなように、全ての観察時点で、融合タンパク質一、タンパク質二治療群の脈絡膜血流量は、いずれも顕著に増加する。

【0168】

実施例１６
ＯＩＲマウスにおける網膜血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の影響
ＯＩＲモデルの構築：Ｃ５７／Ｂ１６マウス出生後の７〜１２日目に、マウス幼畜とその親マウスを７５％の高酸素雰囲気に暴露させることにより、その中央網膜における毛細血管をすぐに消失させることができる。１２日目に室内空気に戻したところ、高酸素雰囲気に暴露された網膜血管がすぐに消失し、広範な異常な血管新生の形成を引き起こし、網膜の中央部分は、長時間かなりの程度無血管状態のままである。血管が完全に消失した後、１３日目に融合タンパク質（投与群、融合タンパク質一、タンパク質二の用量がいずれも６４μｇである）又は生理食塩水（陰性群）を硝子体注射により投与し、１７日目に網膜血管を評価する（閉合していない血管に標識を付けるために、テキサスレッドで標識したトマトレクチン５０ｍＬを左心室に注射し５ ｍｉｎ循環させる）。実験結果を表２１に示す。

【0169】

【表23】

【0170】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二をＯＩＲマウスに投与後、病理学的新生血管の形成を改善することができる。陰性対照群に比べて、融合タンパク質一、タンパク質二で処理したＯＩＲマウス網膜における新生血管叢が顕著に減少し、面積がそれぞれ５２．９７％及び３５．１７％減少する。

【0171】

実施例１７
未熟児網膜症ラットモデルの新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
変動酸素誘導動物モデルを取り、同じ日に自然分娩された新生ラット（１２時間内）を酸素供給モデル群、酸素供給治療群、正常対照群の３群にランダムに分ける。酸素供給モデルをさらに３つのサブモデル群に分け、治療群と共にアクリルガラス製の半閉鎖酸素室に置き、室内に医療用酸素を導入し、酸素計により濃度を８０％±２％に調整し、２４時間後に酸素室内に窒素を導入することで酸素濃度を１０％±２％に迅速に調整して２４時間維持する。これを繰り返して、酸素室内の酸素濃度が２４時間毎に８０％と１０％とを交互するように保持し、７日後に、空気雰囲気で飼育する。毎日酸素濃度を８回モニタリングし、酸素室内の温度を２３℃±２℃に制御し、パット交換、食料追加、水交換、親マウス交換を１回行う。正常対照群を動物飼育環境に置く。モデル群は、対照群に比べて、網膜ホールマウントのＡＤＰ酵素染色による血管変化が顕著であり、網膜内膜を通過して硝子体に入った血管内皮細胞核の数が多くなり、差が統計的に有意である場合に、モデル構築が成功する。

【0172】

酸素供給治療群を２つのサブ群に分け、モデル構築の７日目にそれぞれ融合タンパク質一、タンパク質二をいずれも１００μｇの用量で硝子体注射により投与し、酸素供給モデル群及び対照群に生理食塩水のみを投与し、１週間連続投与する。

【0173】

１４日目に、エーテル麻酔で死亡させた後、眼球を摘出し、４０ ｇ／Ｌパラホルムアルデヒド溶液中で２４時間固定する。グラジエントアルコールで脱水し、キシレンで透明にする。ワックスに浸漬した後、視神経乳頭の周囲をできるだけ避けるように連続して厚さ４μｍの切片を作製する。切片は、角膜から視神経乳頭の矢状面に平行である。各眼球は、ランダムに１０枚の切片を取り、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った後、網膜内膜を通過した血管内皮細胞核（内膜に密接に関連している血管内皮細胞核のみ）の数をカウントし、各眼球の各切片における細胞数を統計する。

【0174】

結果：対照群では、切片に網膜内膜を通過して硝子体に入った血管内皮細胞核が僅かに認められているか、又は認められない。モデル群では、網膜内膜に通過した血管内皮細胞核が多く認められ、単独で現れるものも、クラスタで現れるものもあり、また、いくかの切片には、これらの血管内皮細胞核が深部網膜血管に隣接することも認められており、これは、硝子体又は眼部の他の組織ではなく網膜に由来することを示している。治療群切片では、網膜内膜を通過した少数の血管内皮細胞核のみが認められている。実験結果を表２２に示す。

【0175】

【表24】

【0176】

結果から明らかなように、融合タンパク質一、タンパク質二治療群の網膜血管内皮細胞核の数は、６．６９３±２．１０９、７．３３３±１．２６３であり、酸素供給モデル群の２８．３９２±２．２２０に比べて顕著に減少しているが、これは、酸素誘導新生マウス網膜病変モデルの新生血管の形成をある程度阻害できる。

【0177】

実施例１９
糖尿病性網膜症ラットモデルの新生血管に対する融合タンパク質一、タンパク質二の作用
実験では糖尿病ラットをストレプトゾシンＳＴＺでモデルを構築する。ＳＴＺを０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液に溶解して２％溶液に配合する。全ての実験では、Ｗｉｓｔａｒラットに注射する前に１２時間断食させ、各ラットを６５ｍｇ／ｋｇの用量で２％ ＳＴＺ溶液を腹腔内注射する。注射した後、単独で籠で飼育し、４８時間後尿糖と血糖を測定する。尿糖＋＋＋以上、血糖１６．７ｍｍｏｌ／Ｌ以上をモデル構築が成功する標準とする。血糖、尿糖、尿量の測定及び網膜ＶＥＧＦ免疫組織化学的測定により、糖尿病性網膜症モデル構築が成功する。

【0178】

モデル構築が成功するラット１５匹を取り、３群にランダムに分け、対照群、融合タンパク質一治療群、融合タンパク質二治療群と記する。硝子体注射により投与し、対照群に生理食塩水（０．１ｍＬ）を注射し、融合タンパク質一、融合タンパク質二にいずれも１００μｇ（０．１ｍＬ）、７日１回投与し、２週、４週、８週、１２週目に観察する。実験結果を表２３に示す。

【0179】

【表25】

【0180】

結果から明らかなように、光学顕微鏡で測定し、各眼球については、１０枚の後極網膜神経節細胞の数をカウントし、１０枚の後極網膜の厚さを測定する。試験群のラット網膜組織は、対照群のラット網膜組織に比べて各層の厚さが増加している。試験群は、対照群に比べてラット網膜神経節細胞数が増加し、治療群は、対照群に比べて視細胞数が増加している。融合タンパク質一、タンパク質二は、１００μｇの用量下でいずれも糖尿病性網膜症に一定の治療作用を有することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]