特許 6895297 細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6895297

(24)【登録日】2021年6月9日

(45)【発行日】2021年6月30日

(54)【発明の名称】細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20210621BHJP

   G06T 7/00 20170101ALI20210621BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20210621BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210621BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/48 M

   G06T7/00 630

   C12Q1/02

   C12M1/34 D

【請求項の数】19

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-73891(P2017-73891)

(22)【出願日】2017年4月3日

(65)【公開番号】特開2018-174716(P2018-174716A)

(43)【公開日】2018年11月15日

【審査請求日】2020年2月12日

(73)【特許権者】

【識別番号】000236436

【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140442

【弁理士】

【氏名又は名称】柴山 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100174399

【弁理士】

【氏名又は名称】寺澤 正太郎

(72)【発明者】

【氏名】後藤 謙太郎

(72)【発明者】

【氏名】山内 豊彦

(72)【発明者】

【氏名】山田 秀直

【審査官】 佐田 宏史

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−０１６６６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１２３３６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−０６４５３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８

Ｇ０６Ｔ １／００，７／００−７／９０

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ１２Ｍ １／３４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の細胞が集合してなる細胞塊を評価する方法であって、
前記細胞塊への光照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップにより得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析ステップと、
前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価ステップと、
を含み、
前記パラメータは、細胞数密度である、細胞塊の評価方法。

【請求項2】

複数の細胞が集合してなる細胞塊を評価する方法であって、
前記細胞塊への光照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップにより得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析ステップと、
前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価ステップと、
を含み、
前記パラメータは、前記サンプリング円の周方向に沿った前記画像データの自己相関関数の最初の波形の幅である、細胞塊の評価方法。

【請求項3】

前記細胞塊は、幹細胞によって構成され、前記評価ステップにおいて、前記パラメータに基づいて前記細胞塊の分化度合いを評価する、請求項１または２に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項4】

前記解析ステップにおいて、一つの前記細胞塊に対し、共通の前記基準点を中心とし半径が互いに異なる複数の前記サンプリング円を設定し、前記複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関する複数のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記複数のパラメータの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項5】

前記撮像ステップにおいて、第１の前記細胞塊及び前記第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む画像を取得し、
前記解析ステップにおいて、前記画像に含まれる前記第１の細胞塊に関する前記パラメータである第１のパラメータと、前記画像に含まれる前記第２の細胞塊に関する前記パラメータである第２のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比較に基づいて前記第１の細胞塊及び前記第２の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項6】

前記撮像ステップにおいて、第１の前記細胞塊を含む第１の画像と、前記第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む第２の画像とを取得し、
前記解析ステップにおいて、前記第１の画像に含まれる前記第１の細胞塊に関する前記パラメータである第１のパラメータと、前記第２の画像に含まれる前記第２の細胞塊に関する前記パラメータである第２のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比較に基づいて前記第１の細胞塊及び前記第２の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項7】

第１の前記細胞塊に対して前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記第１の細胞塊の状態に関する前記パラメータである第１のパラメータを求め、
前記第１の細胞塊とは別の第２の前記細胞塊に対して前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記第２の細胞塊の状態に関する前記パラメータである第２のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比較に基づいて前記第１の細胞塊及び前記第２の細胞塊の少なくとも一方を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項8】

前記撮像ステップにおいて、前記細胞塊を含む第１の画像を第１のタイミングにおいて取得し、前記細胞塊を含む第２の画像を前記第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて取得し、
前記解析ステップにおいて、前記第１の画像に含まれる前記細胞塊に関する前記パラメータである第１のパラメータと、前記第２の画像に含まれる前記細胞塊に関する前記パラメータである第２のパラメータと、を求め、
前記評価ステップにおいて、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項9】

第１のタイミングにおいて、前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記細胞塊に関する前記パラメータである第１のパラメータを求め、
前記第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて、前記撮像ステップ及び前記解析ステップを行い、前記細胞塊に関する前記パラメータである第２のパラメータを求め、
前記評価ステップにおいて、前記第１のパラメータと前記第２のパラメータとの比較に基づいて前記細胞塊を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項10】

前記細胞塊に照射される光は、赤外光である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項11】

前記撮像ステップにおいて、薄層状に圧潰された前記細胞塊に対して厚み方向から前記光を照射する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞塊の評価方法。

【請求項12】

複数の細胞が集合してなる細胞塊の評価に用いられる装置であって、
前記細胞塊に照射される光を出力する光源と、
前記光の照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像部と、
撮像により得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析部と、
を備え、
前記パラメータは、細胞数密度である、細胞塊の状態解析装置。

【請求項13】

複数の細胞が集合してなる細胞塊の評価に用いられる装置であって、
前記細胞塊に照射される光を出力する光源と、
前記光の照射により前記細胞塊から得られる光を撮像する撮像部と、
撮像により得られた画像に含まれる前記細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、前記サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、前記細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析部と、
を備え、
前記パラメータは、前記サンプリング円の周方向に沿った前記画像データの自己相関関数の最初の波形の幅である、細胞塊の状態解析装置。

【請求項14】

前記解析部によって求められた前記パラメータに基づいて前記細胞塊を評価する評価部を更に備える、請求項１２または１３に記載の細胞塊の状態解析装置。

【請求項15】

前記細胞塊は、幹細胞によって構成され、前記評価部は、前記パラメータに基づいて前記細胞塊の分化度合いを評価する、請求項１４に記載の細胞塊の状態解析装置。

【請求項16】

前記解析部は、一つの前記細胞塊に対し、共通の前記基準点を中心とし半径が互いに異なる複数の前記サンプリング円を設定し、前記複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて複数の前記パラメータを求める、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。

【請求項17】

前記撮像部は、第１の前記細胞塊及び前記第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む画像を取得し、
前記解析部は、前記画像に含まれる前記第１の細胞塊に関する前記パラメータである第１のパラメータと、前記画像に含まれる前記第２の細胞塊に関する前記パラメータである第２のパラメータと、を求める、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。

【請求項18】

前記細胞塊に照射される光は、赤外光である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。

【請求項19】

前記細胞塊を薄層状に圧潰した状態で保持する保持部を更に備え、
前記細胞塊に対して厚み方向から前記光が照射される、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の細胞塊の状態解析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置に関するものである。

【背景技術】

【0002】

特許文献１は、細胞塊の複層化の状態を判断する方法を開示する。この文献に記載された方法では、所定時間を隔てて同一の細胞塊が撮影された第１画像及び第２画像を取得する。そして、第１画像の細胞塊における局所領域の輝度分布を基準とし、第２画像の細胞塊における対応位置を含む近傍部で輝度分布のブロックマッチングを行って、最もマッチングの高い領域の近似度を当該位置での代表近似度とする。第１画像の局所領域を移動させながら細胞塊各部の代表近似度を算出し、算出された細胞塊各部の代表近似度に応じて細胞塊の複層化の状態を判断する。

【0003】

特許文献２は、未分化多能性幹細胞の識別方法を開示する。この文献に記載された方法では、多能性幹細胞からなるコロニーの撮像画像により、コロニーの識別を行う。具体的には、撮像画像における輝度に基づいて、分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーと、未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーとを識別する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２０１０／１４６８０２号

【特許文献2】国際公開第２０１１／０４３０７７号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

バイオ・再生医療分野においては、細胞塊を用いた研究が盛んに行われており、特に、大量培養やドラッグスクリーニング等への応用が期待されている。そして、使用可能な細胞塊を識別するために、細胞塊の状態を解析して評価する技術が求められている。例えば、細胞塊に光を照射しながら細胞塊を撮像し、得られた画像に基づいて細胞塊の状態を評価することができる（例えば特許文献１，２を参照）。しかしながら、通常、細胞塊の形状は３次元の球状に近い。従って、２次元の画像に基づいて細胞塊の状態を正確に評価することは容易ではない。

【0006】

本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、画像に基づいて細胞塊の状態をより正確に評価することができる細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上述した課題を解決するために、本発明の一実施形態による細胞塊の評価方法は、複数の細胞が集合してなる細胞塊を評価する方法であって、細胞塊への光照射により細胞塊から得られる光を撮像する撮像ステップと、撮像ステップにより得られた画像に含まれる細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析ステップと、パラメータに基づいて細胞塊を評価する評価ステップと、を含む。

【0008】

また、本発明の一実施形態による細胞塊の状態解析装置は、複数の細胞が集合してなる細胞塊の評価に用いられる装置であって、細胞塊に照射される光を出力する光源と、光の照射により細胞塊から得られる光を撮像する撮像部と、撮像により得られた画像に含まれる細胞塊に対し、基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定し、サンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、細胞塊の状態に関するパラメータを求める解析部と、を備える。

【0009】

上記の評価方法及び状態解析装置では、撮像ステップにおいて又は撮像部が、光照射によって細胞塊から得られる光を撮像することにより、細胞塊を含む画像を取得する。そして、解析ステップにおいて又は解析部が、画像に含まれる細胞塊に対して基準点を設定し、該基準点を中心とするサンプリング円を設定する。基準点としては、例えば画像中の細胞塊の中心付近の一点が選ばれる。本発明者の知見によれば、細胞の状態（例えば幹細胞の分化／未分化状態、或いは癌細胞の壊死状態）は、中心付近から周縁部に向けて変化し、その変化の様子は、中心付近から等距離の位置であればほぼ一様である。すなわち、細胞の状態がほぼ一様な領域から抽出された画像データに基づいて、細胞塊の状態に関するパラメータを求めることができる。従って、上記の評価方法及び状態解析装置によれば、画像に基づいて細胞塊の状態をより正確に評価することができる。

【0010】

また、上記の評価方法及び状態解析装置において、パラメータは細胞数密度であってもよい。例えばｉＰＳ細胞或いはＥＳ細胞等の幹細胞においては、細胞の状態が変化（例えば未分化状態から分化状態に変化）すると、個々の細胞形態が変化して細胞塊の細胞数密度が変わる。従って、細胞塊の細胞数密度を求めることにより、当該細胞塊を構成する各細胞の分化度合いを精度良く評価することができる。

【0011】

或いは、上記の評価方法及び状態解析装置において、パラメータは、サンプリング円の周方向に沿った画像データの自己相関関数の最初の波形の幅であってもよい。本発明者の知見によれば、この自己相関関数の最初の波形の幅は、細胞塊の当該サンプリング円上の細胞数密度と関連する。従って、上記の自己相関関数の最初の波形の幅を求めることにより、細胞塊の当該サンプリング円上の細胞数密度の推定や比較が可能となり、細胞塊を構成する各細胞の分化度合いを精度良く評価することができる。

【0012】

更に、上記の評価方法において、細胞塊が幹細胞によって構成される場合、評価ステップにおいて、細胞数密度、若しくは自己相関関数の最初の波形の幅といったパラメータに基づいて、細胞塊の分化度合いを評価してもよい。また、上記の状態解析装置は、解析部によって求められた、細胞数密度、若しくは自己相関関数の最初の波形の幅といったパラメータに基づいて、細胞塊を評価する評価部を更に備えてもよい。更に、細胞塊が幹細胞によって構成される場合、評価部は、パラメータに基づいて細胞塊の分化度合いを評価してもよい。これにより、細胞塊の状態を評価でき、特に、複数の幹細胞によって構成された細胞塊の分化度合いを好適に評価することができる。

【0013】

また、上記の評価方法において、解析ステップにおいて、一つの細胞塊に対し、共通の基準点を中心とし半径が互いに異なる複数のサンプリング円を設定し、複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、細胞塊の状態に関する複数のパラメータを求め、評価ステップにおいて、複数のパラメータの比較に基づいて細胞塊を評価してもよい。このように、複数のサンプリング円上の画像データから複数のパラメータを求め、これらを比較することにより、複数のサンプリング円上の細胞の状態を相対的に評価することができる。従って、当該細胞塊の状態変化の傾向を容易に知ることができる。また、上記の状態解析装置において、解析部は、一つの細胞塊に対し、共通の基準点を中心とし半径が互いに異なる複数のサンプリング円を設定し、複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて複数のパラメータを求めてもよい。これにより、前記の評価方法を好適に実施可能な状態解析装置を提供できる。

【0014】

また、上記の評価方法の撮像ステップにおいて、第１の細胞塊及び第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む画像を取得し、解析ステップにおいて、画像に含まれる第１の細胞塊に関するパラメータである第１のパラメータと、画像に含まれる第２の細胞塊に関するパラメータである第２のパラメータと、を求め、評価ステップにおいて、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて第１の細胞塊及び第２の細胞塊の少なくとも一方を評価してもよい。このように、第１の細胞塊に関する第１のパラメータと、第２の細胞塊に関する第２のパラメータとを求め、これらを比較することにより、第１の細胞塊の細胞の状態と、第２の細胞塊の細胞の状態とを相対的に評価することができる。従って、例えば第１の細胞塊及び第２の細胞塊が同じ容器内で培養されているような場合に、当該容器内で同時に培養されている複数の細胞塊の状態がどの程度安定しているかを容易に評価することができる。また、上記の状態解析装置において、撮像部は、第１の細胞塊及び第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む画像を取得し、解析部は、画像に含まれる第１の細胞塊に関するパラメータである第１のパラメータと、画像に含まれる第２の細胞塊に関するパラメータである第２のパラメータと、を求めてもよい。これにより、前記の評価方法を好適に実施可能な状態解析装置を提供できる。

【0015】

また、上記の評価方法の撮像ステップにおいて、第１の細胞塊を含む第１の画像と、第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊を含む第２の画像とを取得し、解析ステップにおいて、第１の画像に含まれる第１の細胞塊に関するパラメータである第１のパラメータと、第２の画像に含まれる第２の細胞塊に関するパラメータである第２のパラメータと、を求め、評価ステップにおいて、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて第１の細胞塊及び第２の細胞塊の少なくとも一方を評価してもよい。或いは、上記の評価方法において、第１の細胞塊に対して撮像ステップ及び解析ステップを行い、第１の細胞塊の状態に関するパラメータである第１のパラメータを求め、第１の細胞塊とは別の第２の細胞塊に対して撮像ステップ及び解析ステップを行い、第２の細胞塊の状態に関するパラメータである第２のパラメータを求め、評価ステップにおいて、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて第１の細胞塊及び第２の細胞塊の少なくとも一方を評価してもよい。これらの方法のように、第１の細胞塊に関する第１のパラメータと、第２の細胞塊に関する第２のパラメータとを求め、これらを比較することにより、第１の細胞塊の細胞の状態と、第２の細胞塊の細胞の状態とを相対的に評価することができる。従って、例えば第１の細胞塊及び第２の細胞塊が同じ容器内で培養されているような場合に、当該容器内で同時に培養されている複数の細胞塊の状態がどの程度安定しているかを容易に評価することができる。

【0016】

また、上記の評価方法の撮像ステップにおいて、細胞塊を含む第１の画像を第１のタイミングにおいて取得し、細胞塊を含む第２の画像を第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて取得し、解析ステップにおいて、第１の画像に含まれる細胞塊に関するパラメータである第１のパラメータと、第２の画像に含まれる細胞塊に関するパラメータである第２のパラメータと、を求め、評価ステップにおいて、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて細胞塊を評価してもよい。或いは、上記の評価方法は、第１のタイミングにおいて、撮像ステップ及び解析ステップを行い、細胞塊に関するパラメータである第１のパラメータを求め、第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて、撮像ステップ及び解析ステップを行い、細胞塊に関するパラメータである第２のパラメータを求め、評価ステップにおいて、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて細胞塊を評価してもよい。これらの方法のように、同一の細胞塊に関し異なるタイミングにおいて得られた複数のパラメータを比較することにより、当該細胞塊を構成する細胞の状態の経時変化（若しくは、状態が不変であること）を容易に知ることができる。

【0017】

また、上記の評価方法及び状態解析装置において、細胞塊に照射される光は赤外光であってもよい。可視光の場合、細胞塊の内部における光の散乱が強いので、細胞塊の直径が大きくなると、細胞塊の中央付近を明瞭に撮像することが難しい。これに対し、赤外光の場合には細胞塊の内部における光の散乱が弱いので、細胞塊の直径が大きい（例えば１００μｍ以上）場合であっても、細胞塊の中央付近を含む全体を明瞭に撮像することが可能になる。

【0018】

また、上記の評価方法の撮像ステップにおいて、薄層状に圧潰された細胞塊に対して厚み方向から光を照射してもよい。同様に、上記の状態解析装置は、細胞塊を薄層状に圧潰した状態で保持する保持部を更に備え、細胞塊に対して厚み方向から光が照射されてもよい。これにより、細胞塊を薄くして、細胞塊の中央付近を含む全体を明瞭に撮像することができる。

【発明の効果】

【0019】

本発明による細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置によれば、画像に基づいて細胞塊の状態をより正確に評価することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】一実施形態に係る状態解析装置の構成を概略的に示す図である。

【図2】撮像部から出力された画像データの一例を模式的に示す図である。

【図3】或るサンプリング円に関する自己相関関数の一例を示すグラフである。

【図4】一実施形態による細胞塊ＣＭの評価方法を示すフローチャートである。

【図5】（ａ）（ｂ）細胞塊の画像データに対して複数のサンプリング円を設定した様子を示す画像である。

【図6】（ａ）（ｂ）細胞塊の画像データに対して複数のサンプリング円を設定した様子を示す画像である。

【図7】自己相関距離とサンプリング円の半径との相関を示すグラフである。

【図8】（ａ）細胞塊に可視光を照射してその透過光を撮像することにより得られた画像データである。（ｂ）細胞塊に赤外光を照射してその透過光を撮像することにより得られた画像データである。

【図9】（ａ）第１実施例において取得した画像データを示す図である。（ｂ）細胞塊の輪郭の内側の点を、周方向に沿って複数設定した状態を示す図である。

【図10】サンプリング円を設定した状態を示す図である。

【図11】（ａ）（ｂ）サンプリング円上の画素値列を示すグラフである。

【図12】自己相関関数を示すグラフである。

【図13】第１変形例において取得された、第１の細胞塊及び第２の細胞塊を含む画像データを示す図である。

【図14】（ａ）第１の細胞塊を含む第１の画像データを示す図である。（ｂ）第２の細胞塊を含む第２の画像データを示す図である。

【図15】第３変形例に係る評価方法を示すフローチャートである。

【図16】（ａ）第１のタイミングにおいて取得された、細胞塊を含む第１の画像データを示す図である。（ｂ）第２のタイミングにおいて取得された、同じ細胞塊を含む第２の画像データを示す図である。

【図17】第５変形例に係る評価方法を示すフローチャートである。

【図18】（ａ）（ｂ）第２実施例において取得された、規格化後の画像データを示す図である。

【図19】（ａ）（ｂ）第３実施例において取得された、規格化後の画像データを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、添付図面を参照しながら本発明による細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

【0022】

図１は、一実施形態に係る状態解析装置１Ａの構成を概略的に示す図である。本実施形態の状態解析装置１Ａは、複数の細胞が集合してなる細胞塊ＣＭの評価に用いられる装置である。細胞塊ＣＭは、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の幹細胞、或いは癌細胞などの細胞によって構成される。図１に示されるように、状態解析装置１Ａは、光源３と、保持部５と、対物レンズ７と、第１の反射鏡９と、集光レンズ１１と、第２の反射鏡１３と、撮像部１５と、解析部１７と、評価部１９とを備えている。

【0023】

光源３は、細胞塊ＣＭに照射される光Ｌ１を出力する。光Ｌ１は、例えば赤外光であり、好適な波長は例えば０．９５μｍ〜１．７μｍである。一例では、光源３は半導体レーザ素子を有しており、細胞塊ＣＭに照射される光Ｌ１はコヒーレントなレーザ光である。また、光Ｌ１は連続光（ＣＷ光）である。

【0024】

保持部５は、培養液Ｂに浸された状態の細胞塊ＣＭを保持する容器である。本実施形態の保持部５は、細胞塊ＣＭを薄層状に圧潰した状態で保持する。なお、圧潰される前の細胞塊ＣＭは略球形であり、その直径は例えば２０μｍ〜４００μｍである。

【0025】

本実施形態の保持部５は、本体部５ａ及び蓋部（カバーガラス）５ｃを有する。本体部５ａは、底の浅い有底容器であって、保持部５を収容するための凹部５ｂを有する。蓋部５ｃは、本体部５ａ上に載置され、凹部５ｂの開口を上方から封じる平板状の部材である。互いに対向する凹部５ｂの底面及び蓋部５ｃの裏面は、高い精度でもって平行且つ平坦とされている。本体部５ａ及び蓋部５ｃは、光源３から出力される光に対して透明である。本体部５ａ及び蓋部５ｃの構成材料は例えば石英ガラスである。凹部５ｂの底面と蓋部５ｃとの間隔（言い換えれば、細胞塊ＣＭを収容する空間の深さ）は、例えば１０μｍ以上であり、また３５０μｍ以下である。一実施例では、該間隔は１００μｍである。細胞塊ＣＭは、凹部５ｂの底面と蓋部５ｃとによって圧潰される。従って、圧潰された細胞塊ＣＭの厚さは、凹部５ｂの底面と蓋部５ｃとの間隔と等しくなる。このような保持部５としては、例えば血球計算盤が好適に用いられる。保持部５は、図示しない光学系を介して光源３と光学的に結合されており、凹部５ｂに収容された細胞塊ＣＭに対し、厚み方向から蓋部５ｃを介して光Ｌ１が照射される。

【0026】

対物レンズ７は、光Ｌ１の照射により細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２（例えば透過光、反射光、蛍光、散乱光など）を取り出すための凸レンズである。対物レンズ７は、保持部５と光学的に結合されている。対物レンズ７は、細胞塊ＣＭの厚み方向に配置され、その光軸は厚み方向と一致する。対物レンズ７は、図１に示されるように保持部５の光照射側とは反対側（すなわち本体部５ａの下面側）に配置されてもよく、或いは、保持部５の光照射側（すなわち蓋部５ｃ側）に配置されてもよい。

【0027】

集光レンズ１１は、対物レンズ７と撮像部１５との間の光路上に配置され、細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２を撮像部１５に向けて集光する。なお、図１に示される例では、集光レンズ１１と対物レンズ７との間の光路上に反射鏡９が設けられており、光Ｌ２の光路が曲げられている。また、集光レンズ１１と撮像部１５との間の光路上に反射鏡１３が設けられており、光Ｌ２の光路が再び曲げられている。反射鏡９及び１３は、対物レンズ７と撮像部１５との間の光学系の一例であり、光学系は適宜変更され得る。

【0028】

撮像部１５は、光Ｌ１の照射により細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２を撮像するカメラである。例えば、撮像部１５は、複数の画素を有する撮像面を有し、光Ｌ２の光強度に応じた電気信号を画素毎に生成するイメージセンサを有するカメラである。そして、撮像部１５は、生成された電気信号群である画像データＤを出力する。撮像部１５としては、光Ｌ２の波長に感度を有するものが用いられる。光Ｌ１が赤外光であり、光Ｌ２が透過光または反射光である場合には、撮像部１５として赤外域に感度を有するものが用いられる。赤外領域に感度を有するカメラとしては、例えば、波長９００ｎｍ〜１６００ｎｍに感度を有するＩｎＧａＡｓカメラである。

【0029】

解析部１７及び評価部１９は、コンピュータ２１によって実現される。コンピュータ２１は、ＣＰＵ及びメモリを有し、プログラムを実行することにより動作する。コンピュータ２１は、例えば、パーソナルコンピュータ或いはスマートデバイス、マイクロコンピュータ、クラウドサーバなどである。解析部１７及び評価部１９は、１つのコンピュータによって実現されてもよいし、それぞれ別個のコンピュータによって実現されてもよい。解析部１７は、撮像部１５からの画像データＤに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関するパラメータを求める。パラメータは、例えば細胞塊ＣＭに設定されたサンプリング円上の細胞数密度（単位長さ当たりの細胞の個数。厚さ方向の細胞数密度も含めた数値）である。評価部１９は、解析部１７から出力されたパラメータに基づいて、細胞塊ＣＭの状態を評価する。例えば、複数の幹細胞によって構成された細胞塊ＣＭを対象とする場合、細胞塊の分化度合いを評価する。具体的には、細胞の大量培養のため、未分化状態が維持されているか否かの評価を行う。或いは、分化誘導を行う際に、問題無く細胞が分化しているか否かの評価を行う。また、複数の癌細胞によって構成された細胞塊ＣＭを対象とする場合、細胞塊の状態（例えば、癌細胞の壊死状態）を評価する。

【0030】

ここで、解析部１７におけるパラメータ算出方法について詳細に説明する。図２は、撮像部１５から出力された画像データＤの一例を模式的に示す図である。画像データＤには、撮像された細胞塊ＣＭが含まれている。この細胞塊ＣＭは、略球形のものが圧潰されてなるので、その平面形状は略円形である。細胞塊ＣＭとその周囲の媒質（培養液Ｂ）とでは屈折率が異なり、また細胞塊ＣＭの内部において散乱が生じるため、画像データＤでは細胞塊ＣＭの輪郭ＣＭａが明瞭に現れる。

【0031】

解析部１７は、画像データＤに含まれる一つの細胞塊ＣＭに対し、基準点Ａを設定する。基準点Ａは、例えば画像データＤにおける細胞塊ＣＭの中心点である。但し、この場合、基準点Ａが厳密な意味での中心点である必要は無く、大凡の中心点付近に位置していれば良い。多くの場合、画像データＤにおける細胞塊ＣＭの輪郭は厳密な円形ではないため、細胞塊ＣＭの中心点を求める際には工夫を要する。例えば、解析部１７は、図２に示されるように、細胞塊ＣＭの内側における輪郭近傍の任意の点Ｆを、周方向に間隔をあけながら複数選択する。そして、解析部１７は、これらの点Ｆからの距離がほぼ均等になる点を計算により求める。この計算には、例えば最小二乗中心法が適用され得る。解析部１７は、例えばこのようにして求められた点（細胞塊ＣＭの略中心点）を、基準点Ａとする。

【0032】

次に、解析部１７は、画像データＤ中の一つの細胞塊ＣＭに対し、共通の基準点Ａを中心とする複数のサンプリング円を設定する。例えば、図２には共通の基準点Ａを中心とする４つのサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を設定した例が示されている。サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４の半径は互いに異なる。最も大きなサンプリング円Ｃ１の半径は、例えば基準点Ａと複数の点Ｆとの距離に対して、単純平均、二乗平均平方根、或いは最小二乗中心法といった演算方法を用いて算出することができる。また、他のサンプリング円の半径は、最も大きなサンプリング円Ｃ１の半径に対し、所定の比率を乗じて決定される。例えば、図２のサンプリング円Ｃ２〜Ｃ４の半径は、サンプリング円Ｃ１の半径にそれぞれ０．８、０．５、及び０．１を乗じたものである。

【0033】

続いて、解析部１７は、複数のサンプリング円上の領域に含まれる画像データに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関する複数のパラメータを求める。図２に示された例では、４つのサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の領域に含まれる画像データのそれぞれに基づいて、４つのパラメータを求める。パラメータは、細胞塊ＣＭの状態に関するものであれば特に限定されないが、一例としては細胞数密度である。例えばｉＰＳ細胞或いはＥＳ細胞等においては、幹細胞の状態が変化（例えば未分化状態から分化状態に変化）すると、個々の細胞形態が変化して細胞塊の細胞数密度が変わる。従って、細胞塊ＣＭのサンプリング円上の領域における細胞数密度を求めることにより、当該サンプリング円上の領域に位置する各幹細胞の分化度合いを精度良く評価することができる。また、細胞塊ＣＭの状態が劣化すると細胞塊ＣＭが崩れてしまうが、細胞塊ＣＭが崩れる前には、細胞数密度にばらつきが生じる。従って、細胞塊ＣＭのサンプリング円上の領域における細胞数密度を求めることにより、細胞塊ＣＭの劣化度合いを精度良く評価することができる。

【0034】

本発明者の知見によれば、下記の演算により、細胞数密度の指標値を容易に求めることができる。下記の数式（１）は、サンプリング円上の輝度値の自己相関関数を求める式である。

【数1】

但し、ｒ，ｒ’は、サンプリング円上の各画素に対し周方向に沿って順に与えられた画素番号である。ｆ（ｒ）は、画素番号ｒにおける画素値（すなわち輝度）である。μは平均値である。ｎはサンプリング円上のデータ数である。Δｒ’は、ｒとｒ’との差である。

【0035】

図３は、数式（１）によって計算された、或るサンプリング円に関する自己相関関数の一例を示すグラフである。横軸は相関距離を表し、縦軸は自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）の自己相関係数を表す。解析部１７は、自己相関関数の最初の波形Ｐ１の幅（自己相関係数の最大値のＮ分の１の値における幅（Ｎ＞１）であり、例えば、Ｎ＝５の場合、最大値の半値における幅）Ｗを求める。この幅Ｗは、細胞数密度の指標値であって、細胞塊の当該サンプリング円上の細胞数密度と関連する。すなわち、この幅Ｗは画像データの強弱の周期を表しており、細胞数密度が大きい（細胞が密集している）場合には画像データの強弱の周期が短くなるので幅Ｗは小さくなる。逆に、細胞数密度が小さい場合には画像データの強弱の周期が長くなるので幅Ｗは大きくなる。従って、各サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４に関する幅Ｗを求めることにより、各サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４における細胞数密度の推定や比較が可能となる。例えば、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４に関して算出された幅Ｗを互いに比較することにより、細胞塊ＣＭの中心点からの距離に応じた細胞数密度の変化の様子を知ることができる。なお、解析部１７は、この幅Ｗを、細胞塊ＣＭの状態に関するパラメータとしてもよい。以下の説明において、幅Ｗを「自己相関距離」と称することがある。

【0036】

評価部１９は、解析部１７によって求められたパラメータに基づいて、細胞塊ＣＭの分化度合いを評価する。前述したように、或る種の細胞では、幹細胞の状態が未分化状態から分化状態に変化すると細胞塊の細胞数密度が変わる。従って、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４に関して得られた細胞数密度から、当該細胞塊ＣＭにおける幹細胞の分化度合いを評価して、細胞塊ＣＭの細胞状態を判断することができる。評価部１９は、得られた結果を、例えばコンピュータ２１に接続された表示装置（ディスプレイ）に表示させる。

【0037】

続いて、一実施形態による細胞塊ＣＭの評価方法について説明する。図４は、本実施形態による細胞塊ＣＭの評価方法を示すフローチャートである。この評価方法は、複数の幹細胞が集合してなる細胞塊ＣＭを評価する方法であって、例えば上述した状態解析装置１Ａを用いて好適に実施される。

【0038】

まず、評価対象である細胞塊ＣＭに光を照射し、光照射により細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２を撮像する（ステップＳ１、撮像ステップ）。具体的には、まず、評価対象である細胞塊ＣＭを保持部５の凹部５ｂに収容し、蓋部５ｃを介して上方から圧力を与えることにより、細胞塊ＣＭを薄層状に圧潰する（ステップＳ１ａ）。次に、保持部５を光源３と対物レンズ７との間に配置することにより、保持部５の上面側と光源３とを光学的に結合させ、保持部５の裏面側と対物レンズ７とを光学的に結合させる（ステップＳ１ｂ）。続いて、細胞塊ＣＭへの光Ｌ１の照射を開始する（ステップＳ１ｃ）。この光照射は光源３によって行われ、光Ｌ１は例えば赤外光であり連続光である。また、このとき、細胞塊ＣＭに対して厚み方向から光Ｌ１を照射する。続いて、光照射により細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２を撮像する（ステップＳ１ｄ）。前述したように、細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２は、例えば透過光、反射光、若しくは蛍光である。このステップＳ１ｄでは、撮像部１５によって画像データＤが生成される。

【0039】

続いて、撮像により得られた画像データＤに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関するパラメータを求める（ステップＳ２、解析ステップ）。このステップＳ２は、例えば解析部１７によって行われる。具体的には、まず、画像データＤに含まれる一つの細胞塊ＣＭに対して基準点Ａを設定する（ステップＳ２ａ、図２を参照）。次に、一つの細胞塊ＣＭに対し、共通の基準点Ａを中心とし半径が互いに異なる第１のサンプリング円及び第２のサンプリング円を設定する（ステップＳ２ｂ）。本実施形態では、４つのサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４（図２を参照）を設定する。そして、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の領域に含まれる画像データに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関する４つのパラメータを求める（ステップＳ２ｃ）。パラメータは、例えばサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４における細胞数密度である。或いは、パラメータは、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４の周方向に沿った画像データの自己相関関数の最初の波形Ｐ１の幅Ｗ（図３を参照）であってもよい。

【0040】

最後に、ステップＳ２において求められた４つのパラメータに基づいて、細胞塊ＣＭを評価する（ステップＳ３、評価ステップ）。先のステップＳ２において求められたパラメータが細胞数密度か、或いは最初の波形Ｐ１の幅Ｗである場合、このステップＳ３において、細胞塊ＣＭの分化度合いを評価することができる。例えば、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４に関して算出されたパラメータを互いに比較することにより、当該細胞塊ＣＭの分化度合いを知ることができる。このステップＳ３は、例えば評価部１９によって行われてもよく、観察者により行われてもよい。

【0041】

以上に説明した本実施形態の評価方法及び状態解析装置１Ａによって得られる効果について説明する。上述したように、本実施形態の評価方法及び状態解析装置１Ａでは、光照射によって細胞塊ＣＭから得られる光Ｌ２を撮像することにより、細胞塊ＣＭを含む画像データＤを取得する。そして、画像データＤに含まれる細胞塊ＣＭに対して基準点Ａを設定し、基準点Ａを中心とするサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を設定する。基準点Ａとしては、例えば画像データＤ中の細胞塊ＣＭの中心付近の一点が選ばれる。Michal Amit, et al., “Suspension Culture of Undifferentiated HumanEmbryonic and Induced Pluripotent Stem Cells”, Stem Cell Reviews and Reports,Vol.6, 2, pp. 248-25, (2010)によれば、幹細胞の状態（例えば分化／未分化状態）は、中心付近から周縁部に向けて変化し、その変化の様子は、中心付近から等距離の位置であればほぼ一様である。すなわち、幹細胞の状態がほぼ一様な領域から抽出された画像データに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関するパラメータを求めることができる。また、P. Yu, et al., “Holographic optical coherence imaging of tumor spheroids”,Applied Physics letters, Vol. 83, 3, pp. 575-577, (2003) によれば、複数の癌細胞から構成される細胞塊は、その中心から状態が変化し、その変化の様子は、中心付近から等距離の位置であれば、一様である。すなわち、癌細胞の状態がほぼ一様な領域から抽出された画像データに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関するパラメータを求めることができる。従って、本実施形態によれば、２次元の画像データＤに基づいて、細胞塊ＣＭの状態をより正確に評価することができる。また、撮像時の細胞塊ＣＭが球形である場合、細胞塊ＣＭの中心付近の一点を中心とする円を描くと、該円上の細胞塊ＣＭの厚さはほぼ均等となる。従って、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の画素データからパラメータを求めることにより、パラメータの算出精度を高めることができる。

【0042】

図５（ａ）、図５（ｂ）、図６（ａ）、及び図６（ｂ）は、それぞれ異なる細胞塊ＣＭ１〜ＣＭ４の画像データＤ１〜Ｄ４に対して複数のサンプリング円（図には４つのサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を代表して示す）を設定した様子を示す画像である。また、図７は、これらの細胞塊ＣＭ１〜ＣＭ４に関して得られた、自己相関距離とサンプリング円の半径との相関を示すグラフである。図７において、グラフＧ１〜Ｇ４は、それぞれ細胞塊ＣＭ１〜ＣＭ４における相関を示す。なお、この例では、保持部５として血球計算盤を用い、細胞塊ＣＭを厚さ１００μｍまで圧潰した。また、細胞数密度を定量的に評価するため、血球計算盤を使って均一な高さになるように校正を行った。使用した細胞塊ＣＭ１〜ＣＭ４は、継代から４日目のものであり、高さを校正した後の半径が２００μｍ程度の大きさとなったものを選んでデータ解析を行った。図７に示される結果から、これらの細胞塊ＣＭ１〜ＣＭ４は径方向にほぼ一定の細胞数密度を有しており、未分化状態であることがわかる。なお、グラフＧ２の半径１６０μｍ辺りの自己相関距離が大きくなっているのは、画像データＤ２に写り込んだ塵の影響である。このように、本実施形態の評価方法によれば、細胞とは異なる塵等が画像データに含まれているような場合であっても、細胞塊の状態を好適に評価することができる。

【0043】

また、本実施形態の評価方法のように、一つの細胞塊ＣＭに対し、共通の基準点Ａを中心とし半径が互いに異なる複数のサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を設定し、これらのサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の領域に含まれる画像データのそれぞれに基づいて、細胞塊ＣＭの状態に関する複数のパラメータを求め、これら複数のパラメータの比較に基づいて細胞塊ＣＭを評価してもよい。これにより、サンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の幹細胞の状態を相対的に評価することができる。従って、当該細胞塊ＣＭの状態変化の傾向を容易に知ることができる。また、本実施形態の状態解析装置１Ａのように、解析部１７は、一つの細胞塊ＣＭに対し、共通の基準点Ａを中心とし半径が互いに異なる複数のサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を設定し、複数のサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４上の領域に含まれる画像データに基づいて複数のパラメータを求めてもよい。これにより、上記の評価方法を好適に実施可能な状態解析装置１Ａを提供できる。

【0044】

また、細胞塊ＣＭを顕微鏡にて観察する際には、細胞塊ＣＭの大きさが問題となる。すなわち、個々の細胞とは異なり細胞塊ＣＭの直径は５０〜４００μｍといった比較的大きな値である。細胞観察に使用される一般的な光学顕微鏡では、可視光を照明光源とする場合が多く、その場合、細胞塊ＣＭの内部における光の散乱の影響が顕著に生じてしまう。このような問題に対し、本実施形態では、細胞塊ＣＭに照射する光を赤外光としている。

【0045】

図８（ａ）は、細胞塊ＣＭに可視光（波長６６０ｎｍ）を照射してその透過光を撮像することにより得られた画像データである。図８（ｂ）は、細胞塊ＣＭに赤外光（波長１４５０ｎｍ）を照射してその透過光を撮像することにより得られた画像データである。これらの図において、各画素の光強度が濃淡によって示されている。これらの細胞塊ＣＭは同じディッシュ内で培養されたものであり、細胞塊ＣＭの直径は何れも約４００μｍである。細胞塊ＣＭに可視光を照射した場合、図８（ａ）に示されるように、細胞塊ＣＭの内部における光の散乱が強いので、細胞塊ＣＭの中央付近の光学密度値が高くなり明瞭に撮像することが難しい。これに対し、細胞塊ＣＭに赤外光を照射した場合、図８（ｂ）に示されるように、細胞塊ＣＭの内部における光の散乱が弱いので、光透過方向における細胞塊ＣＭの厚さが厚い（例えば１００μｍ以上）場合であっても、細胞塊ＣＭの中央付近の光学密度値が高くならず、中央付近を含む全体を明瞭に撮像することが可能になる。

【0046】

また、本実施形態のように、薄層状に圧潰された細胞塊ＣＭに対して厚み方向から光を照射してもよい。これにより、光透過方向における細胞塊ＣＭの厚さを直径よりも薄くして、細胞塊ＣＭの中央付近を含む全体を明瞭に撮像することができる。また、複数のサンプリング円における細胞塊ＣＭの厚さを互いに等しくできるので、パラメータの比較が容易になる。

【0047】

（第１実施例）
上記実施形態の第１実施例について詳細に説明する。

【0048】

（１）観察試料準備
まず、培養した細胞塊ＣＭを、ピペットを用いて培養ディッシュから取り出す。このとき、細胞塊ＣＭが潰れないように慎重に取り出す。勢いよく培養液Ｂを吸入すると細胞塊ＣＭが傷つくので、培養液Ｂを緩やかに吸入する。次に、予め準備した血球計算盤（保持部５）の中央付近に、細胞塊ＣＭを培養液Ｂと共に載せる。そして、細胞塊ＣＭの上にカバーガラス（蓋部５ｃ）を被せ、細胞塊ＣＭを圧潰して細胞塊ＣＭの厚さを均一（１００μｍ）にする。続いて、血球計算盤を試料台にセットする。

【0049】

（２）観察
まず、解析部１７及び評価部１９を含むコンピュータ２１を起動する。次に、赤外光源（光源３）の電源を投入する。これと前後して、赤外カメラ（撮像部１５）を起動する。そして、試料台または対物レンズ７を光軸方向に移動させて焦点位置を調整する。細胞塊ＣＭが視野に入るように、光軸方向と交差する方向における血球計算盤の位置を調整する。細胞塊ＣＭを透過した赤外光を赤外カメラ（撮像部１５）により撮像して、画像データＤを取得する。

【0050】

（３）解析及び評価
図９（ａ）は、取得した画像データＤを示す。まず、この画像データＤに対して画素値の規格化を行う。すなわち、背景領域（細胞塊ＣＭが存在しない領域）Ｅを選択し、背景輝度（バックグラウンド）の平均値を算出する。このとき、例えば細胞塊ＣＭが存在しない四隅のうち対角に位置する二隅において、四角形状の領域Ｅを選択する。次に、下記の数式を用いて、画像データＤに含まれる複数の画素の各画素値の規格化を行う。
（規格化画素値）＝−ｌｏｇ_１０｛（画素値）／（バックグラウンドの平均値）｝

【0051】

続いて、画像データＤに含まれる複数の細胞塊ＣＭのなかから、評価対象とする細胞塊ＣＭを選択する。そして、図９（ｂ）に示すように、この細胞塊ＣＭの輪郭ＣＭａの内側の点Ｆを、周方向に沿って複数（この例では１０点）設定する。続いて、複数の点Ｆからの距離が略等しくなる基準点Ａの座標を最小二乗中心法を用いて算出し、この基準点Ａを細胞塊ＣＭの中心点とする。その後、図１０に示すように、複数の点Ｆと基準点Ａとの平均距離を半径とするサンプリング円Ｃ１を設定する。サンプリング円Ｃ１と同心であり半径がサンプリング円Ｃ１の０．２倍であるサンプリング円Ｃ５を更に設定する。

【0052】

こうして設定されたサンプリング円Ｃ１，Ｃ５上の画素値を抽出する。図１１（ａ）及び図１１（ｂ）は、それぞれサンプリング円Ｃ１及びＣ５上の画素値列を示すグラフであって、縦軸は画素値（輝度）を表し、横軸は画素番号を表す。そして、抽出した画素値列に対し、前述した数式（１）を用いて自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）を算出する。図１２は、サンプリング円Ｃ１に関する自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）を示すグラフであって、縦軸は自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）の自己相関係数を表し、横軸は相関距離を表す。この自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）の最初の波形Ｐ１の幅Ｗを、サンプリング円Ｃ１に関する自己相関距離として算出する。なお、幅Ｗは、自己相関係数の最大値のＮ分の１の値における幅（Ｎ＞１）であり、例えば、Ｎ＝５の場合、最大値の半値における幅となる。更に、ノイズの影響を抑えるために、サンプリング円Ｃ１の半径よりも１画素分小さい半径を有するサンプリング円、及び１画素分大きい半径を有するサンプリング円に関しても各々自己相関距離を算出し、算出された自己相関距離の平均値を、サンプリング円Ｃ１の平均自己相関距離とする。サンプリング円Ｃ５に対しても同様に平均自己相関距離を求める。

【0053】

得られたサンプリング円Ｃ１，Ｃ５に関する各平均自己相関距離を互いに比較し、細胞塊ＣＭの状態を評価する。この例では、サンプリング円Ｃ１の平均自己相関距離は３．９μｍであり、サンプリング円Ｃ５の平均自己相関距離は３．５μｍであった。従って、細胞数密度は細胞塊ＣＭの径方向にほぼ均一であり、分化度合いがほぼ一定であると評価された。

【0054】

（第１変形例）
上記実施形態では、撮像ステップＳ１において（撮像部１５が）一つの細胞塊ＣＭを含む画像データＤを生成し、該一つの細胞塊ＣＭについて複数のサンプリング円Ｃ１〜Ｃ４を設定した。本変形例では、図１３に示されるように、撮像ステップＳ１において（撮像部１５が）、細胞塊ＣＭ１（第１の細胞塊）、及び細胞塊ＣＭ１とは別の細胞塊ＣＭ２（第２の細胞塊）を含む画像データＤＤを取得する。そして、解析ステップＳ２において（解析部１７は）、画像データＤＤに含まれる細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２に対して個別に基準点Ａ１，Ａ２及びサンプリング円Ｃ６，Ｃ７を設定し、細胞塊ＣＭ１のサンプリング円Ｃ６上の画像データに基づいて第１のパラメータを求め、細胞塊ＣＭ２のサンプリング円Ｃ７上の画像データに基づいて第２のパラメータを求める。なお、第１のパラメータ及び第２のパラメータは、上記実施形態と同様（例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅）である。そして、評価ステップＳ３の際に（評価部１９が）、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の少なくとも一方の状態（例えば分化度合い）を評価する。

【0055】

このように、細胞塊ＣＭ１に関する第１のパラメータと、細胞塊ＣＭ２に関する第２のパラメータとを求め、これらを比較することにより、細胞塊ＣＭ１の幹細胞の状態と、細胞塊ＣＭ２の幹細胞の状態とを相対的に評価することができる。従って、例えば細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２が同じ容器内で培養されているような場合に、当該容器内で同時に培養されている複数の細胞塊の状態がどの程度安定しているかを容易に評価することができる。また、状態解析装置が本変形例の撮像部１５及び解析部１７を備えることにより、本変形例の評価方法を好適に実施可能な状態解析装置を提供できる。なお、本変形例において、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のサンプリング円を設定し、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のパラメータを取得しても良い。また、この例では２つの細胞塊に関するパラメータを比較しているが、３つ以上の細胞塊に関するパラメータを取得し、これらを相互に比較してもよい。

【0056】

（第２変形例）
本変形例では、図１４（ａ）及び図１４（ｂ）に示されるように、撮像ステップＳ１において（撮像部１５が）、細胞塊ＣＭ１（第１の細胞塊）を含む画像データＤ１（第１の画像データ）と、細胞塊ＣＭ１とは別の細胞塊ＣＭ２（第２の細胞塊）を含む画像データＤ２（第２の画像データ）とを取得する。そして、解析ステップＳ２において（解析部１７が）、画像データＤ１に含まれる細胞塊ＣＭ１に対して基準点Ａ１及びサンプリング円Ｃ６を設定し、画像データＤ２に含まれる細胞塊ＣＭ２に対して基準点Ａ２及びサンプリング円Ｃ７を設定する。その後、解析ステップＳ２において（解析部１７が）、細胞塊ＣＭ１のサンプリング円Ｃ６上の画像データに基づいて第１のパラメータを求め、細胞塊ＣＭ２のサンプリング円Ｃ７上の画像データに基づいて第２のパラメータを求める。なお、第１のパラメータ及び第２のパラメータは、上記実施形態と同様（例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅）である。そして、評価ステップＳ３の際に（評価部１９が）、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の少なくとも一方の状態（例えば分化度合い）を評価する。

【0057】

このように、細胞塊ＣＭ１に関する第１のパラメータと、細胞塊ＣＭ２に関する第２のパラメータとを求め、これらを比較することにより、細胞塊ＣＭ１の幹細胞の状態と、細胞塊ＣＭ２の幹細胞の状態とを相対的に評価することができる。従って、例えば細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２が同じ容器内で培養されているような場合に、当該容器内で同時に培養されている複数の細胞塊の状態がどの程度安定しているかを容易に評価することができる。なお、本変形例においても、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のサンプリング円を設定し、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のパラメータを取得しても良い。また、この例では２つの細胞塊に関するパラメータを比較しているが、３つ以上の細胞塊に関するパラメータを取得し、これらを相互に比較してもよい。

【0058】

（第３変形例）
本変形例に係る評価方法のフローチャートを図１５に示す。本変形例の評価方法は、第１の撮像ステップＳ１１、第１の解析ステップＳ２１、第２の撮像ステップＳ１２、及び第２の解析ステップＳ２２を含む。なお、第１の撮像ステップＳ１１及び第２の撮像ステップＳ１２の詳細は上記実施形態の撮像ステップＳ１と同様であり、第１の解析ステップＳ２１及び第２の解析ステップＳ２２の詳細は上記実施形態の解析ステップＳ２と同様である。第１の撮像ステップＳ１１では、細胞塊ＣＭ１を含む画像データＤ１（図１４（ａ）参照）を取得する。第１の解析ステップＳ２１では、画像データＤ１に含まれる細胞塊ＣＭ１に対して基準点Ａ１及びサンプリング円Ｃ６を設定し、細胞塊ＣＭ１のサンプリング円Ｃ６上の画像データに基づいて第１のパラメータを求める。第２の撮像ステップＳ１２では、細胞塊ＣＭ２を含む画像データＤ２（図１４（ｂ）参照）を取得する。第２の解析ステップＳ２２では、画像データＤ２に含まれる細胞塊ＣＭ２に対して基準点Ａ２及びサンプリング円Ｃ７を設定し、細胞塊ＣＭ２のサンプリング円Ｃ７上の画像データに基づいて第２のパラメータを求める。なお、第１のパラメータ及び第２のパラメータは、上記実施形態と同様（例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅）である。そして、評価ステップＳ３の際に、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の少なくとも一方の状態（例えば分化度合い）を評価する。

【0059】

このような方法によれば、上記第２変形例と同様の効果を得ることができる。なお、本変形例においても、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のサンプリング円を設定し、各細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２毎に複数のパラメータを取得しても良い。また、この例では２つの細胞塊に関するパラメータを比較しているが、３つ以上の細胞塊に関するパラメータを取得し、これらを相互に比較してもよい。

【0060】

（第４変形例）
本変形例では、圧潰されていない或る細胞塊について、異なるタイミングで少なくとも２枚の画像データを取得し、それらの画像データに基づいてパラメータを求める。具体的には、撮像ステップにおいて（撮像部１５が）、図１６（ａ）に示されるように、細胞塊ＣＭを含む画像データＤ３（第１の画像データ）を第１のタイミングにおいて取得する。次に、撮像ステップにおいて（撮像部１５が）、図１６（ｂ）に示されるように、同じ細胞塊ＣＭを含む画像データＤ４（第２の画像データ）を、第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて取得する。第１のタイミングと第２のタイミングとの時間差は、例えば数日である。そして、解析ステップＳ２において（解析部１７が）、画像データＤ３に含まれる細胞塊ＣＭに対して基準点Ａ３及びサンプリング円Ｃ８を設定し、画像データＤ４に含まれる細胞塊ＣＭに対して基準点Ａ４及びサンプリング円Ｃ９を設定する。その後、解析ステップＳ２において（解析部１７が）、サンプリング円Ｃ８上の画像データに基づいて第１のパラメータを求め、サンプリング円Ｃ９上の画像データに基づいて第２のパラメータを求める。なお、第１のパラメータ及び第２のパラメータは、上記実施形態と同様（例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅）である。そして、評価ステップＳ３の際に（評価部１９が）、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊ＣＭの状態（例えば分化度合い）を評価する。

【0061】

このように、同一の細胞塊ＣＭに関し異なるタイミングにおいて得られた複数のパラメータを比較することにより、当該細胞塊ＣＭを構成する細胞の状態の経時変化（若しくは、状態が不変であること）を容易に知ることができる。なお、本変形例において、各タイミング毎に複数のサンプリング円を設定し、各タイミング毎に複数のパラメータを取得しても良い。また、この例では２回のタイミングにおいてパラメータを取得しているが、３回以上のタイミングにおいてパラメータを取得し、これらを相互に比較してもよい。

【0062】

（第５変形例）
本変形例に係る評価方法のフローチャートを図１７に示す。本変形例の評価方法は、第１の撮像ステップＳ１３、第１の解析ステップＳ２３、第２の撮像ステップＳ１４、及び第２の解析ステップＳ２４を含む。なお、第１の撮像ステップＳ１３及び第２の撮像ステップＳ１４の詳細は上記実施形態の撮像ステップＳ１と同様であり、第１の解析ステップＳ２３及び第２の解析ステップＳ２４の詳細は上記実施形態の解析ステップＳ２と同様である。第１の撮像ステップＳ１３では、細胞塊ＣＭを含む画像データＤ３（図１６（ａ）参照）を、第１のタイミングにおいて取得する。第１の解析ステップＳ２３では、画像データＤ３に含まれる細胞塊ＣＭに対して基準点Ａ３及びサンプリング円Ｃ８を設定し、細胞塊ＣＭのサンプリング円Ｃ８上の画像データに基づいて第１のパラメータを求める。第２の撮像ステップＳ１４では、同じ細胞塊ＣＭを含む画像データＤ４（図１６（ｂ）参照）を、第１のタイミングより後の第２のタイミングにおいて取得する。第２の解析ステップＳ２４では、画像データＤ４に含まれる細胞塊ＣＭに対して基準点Ａ４及びサンプリング円Ｃ９を設定し、細胞塊ＣＭのサンプリング円Ｃ９上の画像データに基づいて第２のパラメータを求める。なお、第１のパラメータ及び第２のパラメータは、上記実施形態と同様（例えば、細胞数密度或いは自己相関関数の最初の波形の幅）である。そして、評価ステップＳ３の際に、第１のパラメータと第２のパラメータとの比較に基づいて、細胞塊ＣＭの状態（例えば分化度合い）を評価する。

【0063】

このような方法によれば、上記第４変形例と同様の効果を得ることができる。なお、本変形例においても、各タイミング毎に複数のサンプリング円を設定し、各タイミング毎に複数のパラメータを取得しても良い。また、この例では２回のタイミングでパラメータを取得しているが、３回以上のタイミングでパラメータを取得し、これらを相互に比較してもよい。

【0064】

（第２実施例）
同じ培養ディッシュで４日間培養した２つの細胞塊を解析し、比較した実施例について説明する。まず、第１実施例に示された方法と同様にして、或る細胞塊ＣＭ１を含む画像データＤ１を取得した。次に、第１実施例に示された方法と同様にして、別の細胞塊ＣＭ２を含む画像データＤ２を取得した。このとき用いた対物レンズ７の倍率は１０倍であり、赤外カメラの分解能は２．９７（μｍ／画素）であった。そして、これらの画像データＤ１，Ｄ２に対して画素値の規格化を行った。図１８（ａ）及び図１８（ｂ）は、それぞれ規格化後の画像データＤ１，Ｄ２を示す。

【0065】

続いて、第１実施例に示された方法と同様にして、これらの細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の基準点Ａ１，Ａ２を算出した。その後、基準点Ａ１を中心とするサンプリング円Ｃ６、及び基準点Ａ２を中心とするサンプリング円Ｃ７をそれぞれ設定した。このとき、サンプリング円Ｃ６の半径を第１実施例に示された方法により求め、サンプリング円Ｃ７の半径をサンプリング円Ｃ６の半径に一致させた。続いて、サンプリング円Ｃ６上の画素値を抽出した。抽出した画素値列に対し、前述した数式（１）を用いて自己相関関数Ｒ_ＯＤ（Δｒ’）を算出し、サンプリング円Ｃ６に関する自己相関距離を求めた。更に、ノイズの影響を抑えるために、サンプリング円Ｃ６の半径よりも１画素分小さい半径を有するサンプリング円、及び１画素分大きい半径を有するサンプリング円に関しても各々自己相関距離を算出し、それらの自己相関距離の平均値を平均自己相関距離として算出した。サンプリング円Ｃ７についても、同様に平均自己相関距離を算出した。

【0066】

得られたサンプリング円Ｃ６，Ｃ７に関する各平均自己相関距離を互いに比較し、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の状態を相対的に評価した。この例では、サンプリング円Ｃ６の平均自己相関距離は３．８μｍであり、サンプリング円Ｃ７の平均自己相関距離は３．７μｍであった。従って、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の細胞数密度はほぼ等しく、分化度合いが同程度であると評価された。

【0067】

（第３実施例）
それぞれ別の培養ディッシュで培養し、培養日数が互いに異なる２つの細胞塊ＣＭ１（培養日数４日）及び細胞塊ＣＭ２（培養日数６日）を解析し、比較した実施例について説明する。なお、これらの細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２に関する画像データＤ１，Ｄ２の取得及び規格化、基準点Ａ１，Ａ２の算出、サンプリング円Ｃ６，Ｃ７の設定、及び平均自己相関距離の算出を、前述した第２実施例と同様にして行った。画像データＤ１に用いた対物レンズ７の倍率は１０倍であり、赤外カメラの分解能は２．９７（μｍ／画素）であった。画像データＤ２に用いた対物レンズ７の倍率は２０倍であり、赤外カメラの分解能は１．９８（μｍ／画素）であった。図１９（ａ）及び図１９（ｂ）は、それぞれ規格化後の画像データＤ１，Ｄ２を示す。この例では、サンプリング円Ｃ６の平均自己相関距離は３．５μｍであり、サンプリング円Ｃ７の平均自己相関距離は２．７μｍであった。従って、細胞塊ＣＭ１，ＣＭ２の細胞数密度に顕著な相違は見られず、分化度合いが同程度であると評価された。

【0068】

本発明による細胞塊の評価方法及び細胞塊の状態解析装置は、上述した実施形態に限られるものではなく、他に様々な変形が可能である。例えば、上述した実施形態及び各変形例を、必要な目的及び効果に応じて互いに組み合わせてもよい。また、上記実施形態及び各変形例では、細胞塊の状態に関するパラメータとして細胞数密度を例示したが、本発明においてパラメータはこれに限られず、細胞塊の状態に関する他の様々な数値をパラメータとすることができる。

【0069】

また、上記実施形態及び各変形例では、細胞数密度に基づいて細胞塊の分化度合いを評価する例を示しているが、細胞数密度に基づいて評価できる事項はこれに限られない。例えば、文献「Kazuya Arai et. al., “A Novel High-Throughput 3D Screening Systemfor EMT Inhibitors: A Pilot Screening Discovered the EMT Inhibitory Activity ofCDK2 Inhibitor SU9516”, PLOS ONE, September 13, (2016)」には、試薬「ＴＧＦ−β２」を添加することにより細胞形状がコントロールの状態に比べて細長くなることが報告されている。このように、添加する試薬が、細胞形態に働きかける場合がある。細胞形態変化は細胞数密度と関係するので、例えばがん細胞塊等への試薬の影響を評価しながらスクリーニングを行う場合などにおいても、細胞数密度を評価パラメータとして用いることができる。

【0070】

また、上記実施形態及び各変形例では、複数のサンプリング円上の画像データから得られた複数のパラメータを相互に比較しているが、単一のサンプリング円上の画像データから得られた単一のパラメータに基づいて、細胞塊の状態を評価してもよい。例えば、適切な閾値を定めてパラメータが閾値を超えたか否かを判定することにより、単一のパラメータを用いて細胞塊の評価を行うことができる。

【0071】

また、上記実施形態及び各変形例では、撮像部１５が二次元の画像データを取得している。撮像部は三次元画像を取得するものであってもよく、その場合、断層画像に基づいて、細胞塊を圧潰することなく非染色及び非侵襲にてパラメータの算出を行うことができる。さらに、上記実施形態及び各変形例では、細胞塊ＣＭを構成する細胞として、幹細胞或いは癌細胞を挙げたが、そのほかの種類の細胞であってもよい。

【符号の説明】

【0072】

１Ａ…状態解析装置、３…光源、５…保持部、５ａ…本体部、５ｂ…凹部、５ｃ…蓋部、７…対物レンズ、９，１３…反射鏡、１１…集光レンズ、１５…撮像部、１７…解析部、１９…評価部、２１…コンピュータ、Ａ，Ａ１〜Ａ４…基準点、Ｂ…培養液、Ｃ１〜Ｃ９…サンプリング円、ＣＭ，ＣＭ１〜ＣＭ４…細胞塊、ＣＭａ…輪郭、Ｄ，ＤＤ，Ｄ１〜Ｄ４…画像データ、Ｌ１，Ｌ２…光、Ｐ１…最初の波形。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】