特許 6898674 ディスバイオシスの治療のために用いられるブドウ果皮

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6898674

(24)【登録日】2021年6月15日

(45)【発行日】2021年7月7日

(54)【発明の名称】ディスバイオシスの治療のために用いられるブドウ果皮

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/87 20060101AFI20210628BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20210628BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210628BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210628BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20210628BHJP

   A23L 19/00 20160101ALI20210628BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALN20210628BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20210628BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/87

   A61P1/00

   A61P1/04

   A61P43/00 121

   A23L33/10

   A23L19/00 Z

   !C12Q1/689 ZZNA

   !C12Q1/686 Z

【請求項の数】15

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2019-566351(P2019-566351)

(86)(22)【出願日】2018年6月4日

(65)【公表番号】特表2020-521801(P2020-521801A)

(43)【公表日】2020年7月27日

(86)【国際出願番号】EP2018064669

(87)【国際公開番号】WO2018220237

(87)【国際公開日】20181206

【審査請求日】2020年8月3日

(31)【優先権主張番号】17382332.9

(32)【優先日】2017年6月2日

(33)【優先権主張国】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】518052289

【氏名又は名称】グッドガット エッセ．エッレ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アルデゲール マンテ ハビエル

(72)【発明者】

【氏名】ガルシア−ジル リブラード ヘスス

(72)【発明者】

【氏名】セッラ ページズ マリオーナ

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 Food Res Int., 2013, Vol.53, p.659-669

【文献】 Goodgut: Goodgut “Junts, ferm front a les malaties digestives”，２０１４年，ＵＲＬ，https://www.accucatalunya.cat/ca/notices/goodgut-junts-ferm-front-a-les-malalties-digestives/

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００

Ａ６１Ｐ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験体において腸内ディスバイオシスを予防的又は治療的に処置する方法に用いるための、直腸投与用の、又は胃抵抗性遅延放出経口形態としての経口投与用の、分離された、白ブドウ品種ヴィティス・ビニフェラ（Vitis vinifera）由来の、水分含有量が２０％以下の脱水されたブドウ果皮を含む組成物であって、前記腸内ディスバイオシスが、ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）、及びサブドリグラニュラム・バリアビレ（Subdoligranulum variabile）からなる群より選択される酪酸産生細菌の存在量の低下及び／又は活性の減少を特徴とし、かつ前記酪酸産生細菌の、腸内存在量及び／又は活性を増加させるプレバイオティクス効果を有する、組成物。

【請求項2】

前記酪酸産生細菌の活性を増加させる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記酪酸産生細菌の前記活性が、酪酸塩／酪酸産生細菌比（ＢＢ指数）によって決定される、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記方法が、腸内ディスバイオシスを予防的に処置する方法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記被験体が、腸疾患の徴候及び／又は症状を呈さない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記被験体が、潰瘍性大腸炎、クローン病又は過敏性腸症候群からなる群より選択される腸疾患を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記被験体がヒト被験体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

酪酸産生細菌の減少が、
ａ．前記被験体の腸内サンプル中の酪酸産生細菌の存在量を決定することと、
ｂ．前記被験体サンプル中の前記酪酸産生細菌の存在量を参照サンプル中の存在量と比較することと、
を含む方法によって判断され、
前記被験体サンプルの存在量が前記参照サンプルの存在量を下回る場合に酪酸産生細菌の減少がある、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記腸内サンプルが、糞便サンプルである、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記参照サンプルが、腸疾患を有していない被験体又は被験体群のサンプルである、請求項８又は９に記載の組成物。

【請求項11】

前記酪酸産生細菌の存在量が定量的ＰＣＲによって判断される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記酪酸産生細菌のそれぞれの存在量が、
ロゼブリア・ホミニスの存在量を決定するための配列番号１１からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１２からなるポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、
サブドリグラニュラム・バリアビレの存在量を決定するための配列番号１３からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１４からなるポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド
の１つ以上の使用を含む方法によって決定される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記ヴィティス・ビニフェラのブドウ種が、ホワイトグルナッシュ種である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記脱水されたブドウ果皮が、５〜１５％の水分含有量を有することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

プレバイオティクス、単一のプロバイオティクス種、及び一群のプロバイオティクス種からなる群より選択される化合物を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、治療薬及び栄養補助食品の分野に関し、特に、被験体において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium prausnitzii）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）、及びサブドリグラニュラム・バリアビレ（Subdoligranulum variabile）等の酪酸産生細菌の腸内レベル及び／又は活性を増加させるためのプレバイオティクスとしてのブドウ果皮又はそれを含む組成物の使用に関する。

【0002】

より具体的には、本発明は、被験体の腸内ディスバイオシスを治療する方法のために用いられるブドウ果皮又はそれを含む組成物に関し、腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌のレベル及び／又はその活性の低下を特徴とする。さらに、本発明は、酪酸産生細菌のレベルが減少した及び／又は活性が減少した被験体の炎症性又は非炎症性の腸疾患を治療する方法のために用いられるブドウ果皮又はそれを含む組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

腸内微生物叢のディスバイオシスは、腸及び腸外の障害のいずれの病因にも関連する状態であるという証拠が増えつつある（非特許文献１、非特許文献２）。腸障害には、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群及びセリアック病が含まれ得るのに対して、腸外障害には、例えばアレルギー、喘息、メタボリックシンドローム、心血管疾患及び肥満が含まれる。

【0004】

クローン病、潰瘍性大腸炎又は結腸直腸癌等の腸障害におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの存在量の減少が様々な著者によって報告されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）。特に、炎症性腸疾患（ＩＢＤ：inflammatory bowel disease）の患者は、しばしば、Ｆ．プラウスニッツイの腸内レベルの低下を呈する。例えば、Miquel S. et al.（非特許文献３）は、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＦＩＳＨ等の種々の定量技術を使用したＩＢＤ患者の粘膜サンプル及び糞便サンプルの両方でのＦ．プラウスニッツイのレベルの減少が様々な研究で報告されていることを提示している（非特許文献３の表１を参照されたい）。別の酪酸産生種であるロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）も、潰瘍性大腸炎の患者で減少することが報告されている（非特許文献８）。

【0005】

プレバイオティクス戦略を通じて、Ｆ．プラウスニッツイの腸レベルを高めることを目的として、その腸内存在量を調節する努力が行われている。それにもかかわらず、Ｆ．プラウスニッツイの腸内存在量及びそれら影響の程度を調節する要因は不明のままである（非特許文献７）。特に、イヌリン（非特許文献９）、リボフラビン（特許文献１）、並びにポリデキストロース及び可溶性トウモロコシ繊維（特許文献２）等の様々なプレバイオティクス基質のＦ．プラウスニッツイによる使用が報告されている。

【0006】

ブドウ果皮繊維の主な発酵性成分はペクチンであると記載されている（非特許文献１０）。Lopez-Siles M. et al.（非特許文献１１）は、Ｆ．プラウスニッツイが基質としてリンゴペクチンを使用することを見出したが、試験したＦ．プラウスニッツイ株はいずれも柑橘類ペクチンでは増殖することができないことを開示している（４２４頁、表２の説明を参照されたい）。これは、Ｆ．プラウスニッツイが（柑橘類）ペプチンを利用することができなかったことを報告しているSlayers A. et al.（非特許文献１２）の知見と一致する。

【0007】

また、Benus R. et al.（非特許文献１３）は、全てのペクチンがＦ．プラウスニッツイによって等しく使用され得るわけではないことを教示している。特に、著者らは、エンドウ繊維添加食で治療した健康なヒト被験体において、Ｆ．プラウスニッツイ及びロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）群の減少が観察されたと報告し、これは、使用される繊維がこれらの細菌種の増殖を支援することができなかったことを示しており、エンドウペクチン中のウロン酸とキシロースとの間の強い結合によって説明されることが著者らによって見出された。

【0008】

さらに、Bralley E. et al.,（非特許文献１４）は、ラットの大腸炎のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸誘発モデルにおける脱水マスカダイン（ヴィティス・ロトゥンディフォリア（Vitis rotundifolia））の皮の抗炎症効果について記載している。この文献は、大腸炎を患っている被験体におけるディスバイオシスの治療に関するものではないが、腸の炎症性疾患に特徴的な炎症を治療することを目的とし、抗炎症効果の獲得を担うブドウ果皮の成分として、マスカダイングレープに存在する抗酸化特性を持つ植物性化学物質（例えば、ケルセチン及びレスベラトロール）を挙げている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２０１４／０７００１４号

【特許文献2】国際公開第２０１３／０６７１４６号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Carding et al., Microb Ecol Health Dis.2015; 26:10.3402

【非特許文献2】Lopetuso et al., Gut Pathogens 2013, 5:23

【非特許文献3】Miquel S. et al., Current Opinion in Microbiology 2013, 16:1-7

【非特許文献4】Sartor R.B, The 111th Abbott Nutrition Research Conference 2010, p23-29

【非特許文献5】Lopez-Siles et al., Appl.Environ Microbiol.2015, 81:7582-7592

【非特許文献6】Lopez-Siles et al.Inflamm Bowel Dis 2016, 22:28-41

【非特許文献7】Lopez-Siles et al., The ISME Journal 2017, 11:841-852

【非特許文献8】Machiels et al., Gut.2014, 63(8):1275-83

【非特許文献9】Ramirez-Farias C. et al., British Journal of Nutrition.2019, 101:541-550

【非特許文献10】Bravo L. and Saura-Calixto F., "Characterization of Dietary Fiber and the In Vitro Indigestible Fraction of Grape Pomace", Am.J. Enol.Vitic., 1998, 49:135-141

【非特許文献11】Appl.Environ.Microbiol.2012, 78(2):420

【非特許文献12】Salyers A. et al."Fermentation of Mucins and Plant Polysaccharides by Anaerobic Bacteria from the Human Colon", Appl.Environ.Microbiol.1977, 34:529-533

【非特許文献13】"Association between Faecalibacterium prausnitzii and dietary fibre in colonic fermentation in healthy human subjects", British Journal of Nutrition.2010, 104:693-70

【非特許文献14】"Anti-inflammatory effects of muscadine skin extract in experimentally-induced ulcerative colitis in rats", from the thesis Nutraceutical properties of the muscadine grape (Vitis rotundifolia), Sorghum Bicolor, and Polygonum cuspidatum, 1998, Georgia University

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

したがって、Ｆ．プラウスニッツイ及びその他の酪酸産生細菌は腸内微生物叢の一部であり、腸の健康に保護的な役割を果たす。近年努力がなされているにもかかわらず、特にＦ．プラウスニッツイ及びその他の酪酸産生細菌等の有益な細菌種の腸内レベルを増加させるため、被験体における腸内微生物叢のディスバイオシスを治療する戦略を見つけることが今も必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の第１の態様は、被験体において腸内ディスバイオシスを治療する方法のために用いられるブドウ果皮、好ましくは分離されたブドウ果皮に関し、腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌のレベルの低下及び／又は活性の減少（例えば、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ：short chain fatty acid）産生レベルが低い又は減少した酪酸産生細菌）を特徴とし、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択されることが好ましい。

【0013】

別の態様では、本発明は、被験体の腸疾患を治療する方法のために用いられるブドウ果皮、好ましくは分離されたブドウ果皮に関し、上記被験体は、酪酸産生細菌のレベルの低下及び／又は活性の減少（例えば、ＳＣＦＡ産生レベルが低い又は減少した酪酸産生細菌による）を特徴とする腸内ディスバイオシスを有し、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択されることが好ましい。

【0014】

更なる態様では、本発明は、被験体の腸疾患を治療する方法のために用いられるブドウ果皮、好ましくは分離されたブドウ果皮に関する。

【0015】

また更なる態様では、本発明は、ブドウ果皮と、プレバイオティクス、単一種又は一群のプロバイオティクス種、細菌の二次生成物、細菌／宿主相互作用の分子経路の調節物質、及び狭域抗生物質からなる群より選択される化合物との相乗的な組み合わせに関する。本発明はさらに、ブドウ果皮と、腸内ディスバイオシスの治療に相乗効果をもたらす上に定義される化合物とを含む組成物、及び腸内ディスバイオシスの治療、好ましくは酪酸産生細菌のディスバイオシスの治療におけるその使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】クローン病（ＣＤ：Crohn's Disease）患者サンプルにおけるＦｐｒａレベル／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図1B】潰瘍性大腸炎（ＵＣ：Ulcerative Colitis）患者サンプルにおけるＦｐｒａ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図1C】健康な（Ｈ）被験体サンプルにおけるＦｐｒａ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図2A】ＣＤ患者サンプルにおけるＰＨＧ−Ｉ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図2B】ＵＣ患者サンプルにおけるＰＨＧ−Ｉ／ＥＵＢ Ｉ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図2C】Ｈ被験体サンプルにおけるＰＨＧ−Ｉ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図3A】ＣＤ患者サンプルにおけるＰＨＧ−ＩＩ／ＥＵＢ Ｃｔ値（実験３）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図3B】ＵＣ患者サンプルにおけるＰＨＧ−ＩＩ／ＥＵＢ Ｉ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図3C】Ｈ被験体サンプルにおけるＰＨＧ−ＩＩ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図4A】ＣＤ患者サンプルにおけるＥｃｏ／ＥＵＢ Ｉ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図4B】ＵＣ患者サンプルにおけるＥｃｏ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図4C】Ｈ被験体サンプルにおけるＥｃｏ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図5A】ＣＤ患者サンプルにおけるＢ４６／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図5B】ＵＣ患者サンプルにおけるＢ４６／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図5C】Ｈ被験体サンプルにおけるＢ４６／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図6A】ＣＤ患者サンプルにおけるＲｏｓ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図6B】ＵＣサンプルにおけるＲｏｓ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図6C】Ｈ被験体サンプルにおけるＲｏｓ／ＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図7A】ＣＤ患者サンプルにおける酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図7B】ＵＣ患者サンプルにおける酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図7C】Ｈ被験体サンプルにおける酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図8A】ＣＤ患者サンプルにおける酢酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図8B】ＵＣ患者サンプルにおける酢酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図8C】Ｈ被験体サンプルにおける酢酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図9A】ＣＤ患者サンプルにおけるプロピオン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図9B】ＵＣ患者サンプルにおけるプロピオン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）（実験３）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図9C】Ｈ被験体サンプルにおけるプロピオン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図10A】ＣＤ患者サンプルにおけるヘキサン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図10B】ＵＣ患者サンプルにおけるヘキサン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図10C】Ｈ被験体サンプルにおけるヘキサン酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図11A】ＣＤ患者サンプルにおける吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図11B】ＵＣ患者サンプルにおける吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図11C】Ｈ被験体サンプルにおける吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図12A】ＣＤ患者サンプルにおけるイソ吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図12B】ＵＣ患者サンプルにおけるイソ吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図12C】Ｈ被験体サンプルにおけるイソ吉草酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図13A】ＣＤ患者サンプルにおけるイソ酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図13B】ＵＣ患者サンプルにおけるイソ酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図13C】Ｈ被験体サンプルにおけるイソ酪酸レベル（ｍｇ／Ｌ）を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ６００ｍｇ、４＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ＋ペクチン２００ｍｇ、５＝ペクチン２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図14A】過敏性腸症候群（ＩＢＳ：Irritable bowel syndrome）患者サンプルにおけるＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ（Plantago ovata）２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図14B】健康な被験体サンプルにおけるＥＵＢ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図15A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＦｐｒａ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図15B】健康な被験体サンプルにおけるＦｐｒａ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図16A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＰｈＧＩ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図16B】健康な被験体サンプルにおけるＰｈＧＩ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図17A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＰｈＧＩＩ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図17B】健康な被験体サンプルにおけるＰｈＧＩＩ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図18A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＥｃｏ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図18B】健康な被験体サンプルにおけるＥｃｏ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図19A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＲｏｓ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図19B】健康な被験体サンプルにおけるＲｏｓ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図20A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＢ４６ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図20B】健康な被験体サンプルにおけるＢ４６ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図21A】ＩＢＳ患者サンプルにおけるＡｋｋ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図21B】健康な被験体サンプルにおけるＡｋｋ Ｃｔ値を示す図である。１＝陰性対照（基質なし）、２＝Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ ２００ｍｇ、３＝プランタゴ・オバタ２００ｍｇ。有意な値の差をアスタリスクで表す（ｐ≦０．０５の場合は^＊、ｐ≦０．０１の場合は^＊＊、及びｐ≦０．００１の場合は^＊＊＊）。

【図22】６０℃〜６２℃の空気循環オーブンで５日間（０日目〜５日目）脱水に供したブドウサンプルの湿度（％）及び水分活性を表すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

定義
「被験体」又は「個体」という用語は、哺乳動物として分類される全ての動物を指すため本明細書において同じ意味で使用され、飼育動物及び家畜、霊長類及びヒト、例えば、人間、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、又は齧歯類を含むがこれらに限定されない。被験体は、あらゆる年齢又は人種の男性又は女性の人間であることが好ましい。

【0018】

「治療」という用語は、予防的処置及び治療的処置の両方を含む。本明細書で使用される「治療的処置」又は「治療法」という用語は、身体を病的状況又は疾患からその正常で健康な状態に戻すことを指す。本明細書で使用される「予防的処置」という用語は、病的状況を予防することを指す。

【0019】

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、本明細書で定義される疾患、障害、又は病的状態の予防的又は治療的な処置において被験体（ヒト患者等）に単回又は複数回の用量が投与される際に有効な量を指す。

【0020】

「プレバイオティクス」という用語は、１９９５年にGibson及びRoberfroid（The journal of nutrition, 125, 1401-1412）によって提案され、「結腸内の１つ又は限られた数の細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激して健康を改善することにより宿主に有益な影響を与える非消化性食品原料」を指す。プレバイオティクスは、腸内微生物叢の不均衡として定義され得る腸内ディスバイオシスを治療又は予防するために使用することができる。プレバイオティクスは、１）腸内に存在する有益な常在細菌（典型的には、ビフィドバクテリウム属及びラクトバチルス属）の増殖及び／又は活性の賦活、並びに２）短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生の増加の２つの主なメカニズムによって腸機能にプラスの効果を発揮することが知られている。食物繊維の全ての構成要素がプレバイオティクスであるわけではないことに留意されたい。未消化の基質のプレバイオティクスの特徴は、常在の腸内ミクロフローラの有益な成分がそれを基質として選択的に使用するかどうかに依存する（Galvez et al., "Prebiotics and Probiotics in Experimental Models of Rodent Colitis:Lessons in Treatment or Prevention of Inflammatory Bowel Diseases",Bioactive Foods in promoting healthの書籍の第３５章（６０１頁〜６１０頁），Ed:R. R.Watson and V.R.Preedy, 2010, Academic Press、Manning T.S. and Gibson G.R."Prebiotics", Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 2004, 18(2):287-298）。

【0021】

本明細書で使用される「プローブ」という用語は、所定の条件下で標的核酸配列への特異的及び選択的なハイブリダイゼーションを可能にし、検出又はアッセイ性能の向上のための部分を任意に含む、特定のヌクレオチド配列を含む長さが１０塩基対〜２８５塩基対の合成の又は生物学的に産生された核酸を指す。統計学的には、特異性を獲得して安定したハイブリダイゼーション産物を形成するためには、一般に最低１０ヌクレオチドが必要であり、一般に最大２８５ヌクレオチドが、反応パラメーターを容易に調整してミスマッチ配列及び選択的ハイブリダイゼーションを決定することができる長さの上限となる。プローブには、任意に、或る特定のアッセイ条件下でそれらの適切な又は最適な機能に寄与する或る特定の構成要素が含まれてもよい。例えば、プローブは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善するため（例えば、エンドキャッピングによって）、検出リガンド（例えば、フルオレセイン）を運ぶため、又は固体支持体（例えば、ポリデオキシアデノシン「テイル」）へのそれらの捕捉を促進するため修飾されてもよい。

【0022】

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、ヌクレオチド配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）等の増幅方法で使用され得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、特定の標的配列のポリヌクレオチド配列、例えば或る特定の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に基づいて設計される。プライマー及びプローブの設計及び検証は、当該技術分野でよく知られている。定量的リアルタイムＰＣＲ法については、例えばRodriguez A et al.（Methods Mol Biol., 2015, 1275:31-56）を参照されたい。

【0023】

本明細書で使用される「特異的（な）」という用語は、ヌクレオチド配列が所定の標的配列にハイブリダイズし／所定の標的配列を増幅し、アッセイ条件下で実質的に非標的配列にハイブリダイズしない／非標的配列を増幅しないことを意味し、一般的にはストリンジェントな条件が使用される。

【0024】

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、所定の反応条件下で、核酸の２つの部分的又は完全に相補的な鎖が、どの核酸塩基が互いに対となり得るかに関する明確な規則に従って、逆平行様式で一緒になって特異的で安定な水素結合により二本鎖核酸を形成させるプロセスを指す。

【0025】

「実質的なハイブリダイゼーション」という用語は、観察されるハイブリダイゼーションの量が、陽性対照及び陰性対照のハイブリダイゼーションデータに対して結果を観察する人がその結果を陽性とみなすような量であることを意味する。「バックグラウンドノイズ」と見なされるデータは、実質的なハイブリダイゼーションではない。

【0026】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、およそ０．９モルのＮａＣｌの塩溶液中においておよそ３５℃〜６５℃を意味する。また、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度及び種類、存在する変性剤の種類及び濃度、並びにハイブリダイゼーションの温度等の反応パラメーターによっても左右され得る。一般的には、安定したハイブリッドを形成するには、ハイブリダイゼーション条件がよりストリンジェントになるにつれて、より長いプローブが好ましい。原則として、ハイブリダイゼーションが行われる条件のストリンジェンシーが、用いられる好ましいプローブの或る特定の特徴に影響する。

【0027】

本明細書で使用される「同一性」という用語は、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）を、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較することができる。核酸配列又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列の「パーセント同一性」は、２つの整列させた配列間の完全一致の数をより短い配列の長さで割って１００を掛けたものである。配列間のパーセント同一性又は類似性の計算に適したプログラムは、例えばデフォルトパラメータ（http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST）を用いて使用されるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム等、当該技術分野で良く知られている。

【0028】

詳細な説明
第１の態様では、本発明は、酪酸産生細菌の腸内レベルを増加させるためのプレバイオティクスとしてのブドウ果皮又はそれを含む組成物の使用に関する。

【0029】

酪酸産生菌は、ブチリルＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を示す（Duncan et al., Appl Environ Microbiol.2002, 68:5186-5190）。この活性は、クロストリジウム・レプタム（Clostridium leptum）グループとしても知られるクロストリジウムクラスターＩＶ（Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol 2002, 52, 2141-2146）、及びクロストリジウム・コッコイデス（Clostridium coccoides）グループとしても知られるクラスターＸＩＶａ（Hold et al., Appl Environ Microbiol 2003, 69, 4320-4324、Barcenilla et al., Appl Environ Microbiol 2000, 66, 1654-166）のメンバー等のクロストリジウム亜門に属する嫌気性細菌に広く存在する。Ｆ．プラウスニッツイは、クロストリジウムクラスターＩＶに属する代表的な酪酸産生菌であるのに対し、ロゼブリア・セシコラ（Roseburia cecicola）、ロゼブリア・インテスティナリス、及びロゼブリア・ホミニス等のロゼブリア属の様々な種は、クロストリジウムクラスターＸＩＶａに分類される酪酸産生菌である。

【0030】

より具体的には、第１の態様では、本発明は、被験体において腸内ディスバイオシスを治療する方法のために用いられるブドウ果皮に関し、腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌レベルの低下及び／又は酪酸産生細菌活性の減少（本明細書では「酪酸産生細菌のディスバイオシス」とも称される）を特徴とする。好ましくは、上記酪酸産生細菌は、その系統群（例えば、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩ）を含むＦ．プラウスニッツィ、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択される。

【0031】

関連する態様では、本発明は、被験体において腸内ディスバイオシスを治療する方法であって、腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌レベルの低下及び／又は酪酸産生細菌の活性の減少（例えば、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生レベルが低い又は減少した酪酸産生細菌）を特徴とし、かかる治療を必要とする被験体に、治療有効量の本明細書に記載されるブドウ果皮を投与することを含む、方法を提供する。

【0032】

好ましくは、被験体において腸内ディスバイオシスを治療する上記方法は予防方法であり、すなわち、上記被験体は、酪酸産生細菌の低い又は低下したレベル及び／又は活性を示さない。

【0033】

微生物叢の組成及び多様性は、疾患で変化することが報告されている。「ディスバイオシス」という用語は、保護細菌と有害細菌との間の身体に対する又は体内の微生物のバランスが崩れている状態を指す。「腸内ディスバイオシス」という用語は、腸内微生物叢の好ましくない変化に関する。例えば、数名の著者は炎症性腸疾患の微生物組成を研究して、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を特徴付けるディスバイオシスの特徴を定義した。特に、Joosens et al.(Gut 2011, 60:631-7）は、５つの細菌種、すなわち、Ｆ．プラウスイニッツイ、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ディアリスター・インヴィスス（Dialister invisus）、及びクロストリジウムクラスターＸＩＶａの性質が不明な種の減少、並びにルミノコッカス・グナバス（Ruminococcus gnavus）の増加（この細菌の特徴は、疾患の病因における酪酸産生細菌の欠如を示す）がＣＤにおけるディスバイオシスを特徴付けると報告した。最近では、ＵＣのディスバイオシスを特徴付けるロゼブリア・ホミニス及びＦ．プラウスニッツイの減少が報告されている（非特許文献８）。

【0034】

特定の実施形態では、腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌の低レベル又は減少を特徴とし、好ましくは、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択される。

【0035】

酪酸産生細菌の低レベル又は減少は、
ａ）上記被験体の腸内サンプル中の酪酸産生細菌のレベルを決定することと、
ｂ）上記被験体サンプル中の上記酪酸産生細菌のレベルを参照サンプル中のレベルと比較することと、
を含む方法によって決定され得て、
上記被験体サンプル中のレベルが上記参照サンプル中のレベルを下回る場合、酪酸産生細菌の減少がある。腸内サンプル中の細菌種のレベルを定量する方法は、本明細書において以下に記載される。

【0036】

腸内サンプルは、例えば回腸、結腸及び／又は直腸の粘膜組織からの生検材料であってもよい。この腸内サンプルは、糞便サンプルであることが好ましい。これらのタイプのサンプルは、臨床業務で日常的に使用されており、当業者は、それらの取得及び保存の最も適切な手段を識別する方法を知っているであろう。サンプルが得られると、新鮮なものを使用してもよく、適切な手段を使用して凍結、凍結乾燥、又は保存してもよい。

【0037】

本明細書で使用される「参照値」という用語は、被験体から収集されたサンプルから得られた値又はデータを評価するための参照として使用される予め定められた基準に関する。参照値又は参照レベルは、絶対値、相対値、上限若しくは下限を有する値、値の範囲、代表値（average value）、中央値、平均値、又は特定の対照値若しくはベースライン値と比較した値であってもよい。参照値は、個々のサンプル値に基づいてもよく、又は時系列の年齢が一致した群の被験体の集団等の多数のサンプルに基づいてもよく、又は試験されるサンプルを含む若しくは除外するサンプルのプールに基づいてもよい。

【0038】

参照値は、腸疾患の兆候及び／又は症状を呈していない被験体若しくは被験体群、腸疾患を有していない被験体若しくは被験体群、又は同じ健康な被験体若しくは腸疾患を有すると診断されたが、より早期の時点の被験体から得ることができる。上記参照サンプルは、腸疾患を有していない被験体又は被験体群のサンプルであることが好ましい。

【0039】

マーカーのレベルは、サンプル内の上記マーカーのレベルがその参照値よりも低い場合に「低下した」とみなされる。マーカーのレベルは、その参照値よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上低い場合に、その参照値よりも低いとみなされる。腸内ディスバイオシスを確立するため、参照値に対する被験体のサンプル中の１つ以上の細菌マーカーの存在量レベルの低下は統計学的に有意であることが好ましい。

【0040】

同様に、サンプル中のマーカーのレベルがその参照値よりも高い場合、そのマーカーのレベルは「上昇した」とみなされる。マーカーのレベルは、その基準値よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％以上高い場合に、その参照値よりも高いとみなされる。

【0041】

代替的に又は追加的に、本明細書に記載される参照値よりも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍又は２０倍超のレベルの逸脱（すなわち、上昇又は低下）を有する被験体は、腸内ディスバイオシスを有すると識別され得る。

【0042】

統計学的に有意な量は、種々の統計学的手法を使用することにより、当業者によって確立され得て、該統計学的手法の例示的で非限定的な例としては、信頼区間の決定、ｐ値の決定、カイ二乗検定識別関数等が挙げられる。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは０．１未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、又は０．００１未満である。典型的には、適切な統計学的分析は、例えばコルモゴロフ−スミルノフの検定を使用して調査中の変数が正規分布を有しているかどうか、及び例えばレーベン検定で決定される等分散性があるかどうかに基づいて判断される。正規分布及び等分散性がある場合、ｔ検定又はＡＮＯＶＡ検定等のパラメトリックモデルを使用し、正規性が達成されない場合、一般的にはマン−ホイットニーＵ検定又はクラスカル−ウォリス検定等のノンパラメトリックモデルを使用することが好ましい。

【0043】

或いは、酪酸産生細菌の減少は、特定の被験体における他の細菌種又は一群の種に対する該被験体における１つ以上の酪酸産生細菌種又は一群の種の存在量レベルの比率を決定することにより定義され得て、例えば、酪酸産生細菌の減少は以下の場合に見られることがある：
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ／エシェリキア・コリのレベルの比率（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー／細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー１００万個の中央値ｌｏｇ_１０）が２．５未満である、又は、
真正細菌／ロゼブリア・ホミニスのレベルの比率が１２．５を超えている。

【0044】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態又は特徴の１つ以上と組み合わせて、酪酸産生細菌の減少は、特定の被験体における他の細菌種又は一群の種に対する該被験体における１つ以上の酪酸産生細菌種又は一群の種の存在量レベルの比率を決定することにより定義され、以下を含むがこれらに限定されない正規化された指数として表される：
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ／エシェリキア・コリ比（ＦＥ指数）：値が低いほど、被験体のディスバイオシスの程度が高くなる、及び／又は、
酪酸産生細菌／炎症性細菌比（ＢＰ指数）：値が低いほど、被験体のディスバイオシスの程度が高くなり、例えば、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（任意に、それに加えて又はその代替としてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレの総存在量の合計によって計算され、炎症性細菌はエシェリキア・コリの総存在量である。

【0045】

加えて、被験体における腸内ディスバイオシスは、酪酸産生細菌の活性の減少、例えば、ＳＣＦＡ産生レベルが低いか又は低下した酪酸産生細菌を更に特徴とする場合がある。これは、酪酸塩／酪酸産生細菌比（ＢＢ指数）によって決定され得て、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（任意に、それに加えて又はその代替としてフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのＰＨＧＩ及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレの総存在量の合計によって計算され得て、酪酸塩は発酵チューブ内で得られた酪酸塩の濃度である。値が低いほど、酪酸産生細菌の活性は低くなる。例えば、被験体におけるＢＢ指数が参照又は対照サンプルよりも低い場合、酪酸産生のレベルが低下している又は低い可能性がある。

【0046】

本明細書で使用される「存在量」、「レベル」又は「負荷（load）」という用語は、生体サンプル内の標的微生物の量の尺度を指す。細菌の定量は、一般的には分子法によって、典型的には、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はＰＣＲ／ピロシーケンシングによって、上記標的微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピーの数を決定することによって行われる。生体サンプル内の標的核酸配列の存在量の定量は、絶対的であってもよく又は相対的であってもよい。「相対的定量」は一般的には、１つ以上の内部参照遺伝子、すなわち参照株に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づき、ユニバーサルプライマーを使用し、標的核酸配列の存在量を全細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピーのパーセンテージとして表す又はＥ．コリの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピーにより正規化した総細菌の決定等がある。「絶対的定量」は、ＤＮＡ標準との比較又はＤＮＡ濃度による正規化によって、標的分子の正確な数を与える。

【0047】

定量レベルは、濃度（単位体積当たりのＤＮＡ量）、細胞数当たりのＤＮＡ量若しくは遺伝子コピー数、サイクル閾値（Ｃｔ値）、又は遺伝子コピー数のｌｏｇ１０等のその数学的な変換として表される場合がある。Ｃｔ値は、サンプル中の標的核酸濃度のｌｏｇ１０に反比例する。

【0048】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、本明細書に記載される酪酸塩産生種はｑＰＣＲにより定量される。好ましくは、定量はｑＰＣＲによって実行されて、定量レベルはサイクル閾値（Ｃｔ値）として表され、この場合、酪酸産生細菌の存在量レベルの低下はＣｔ値の増加として示される。

【0049】

リアルタイムＰＣＲとしても知られる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、当該技術分野で良く知られている。Applied Biosystems製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ＳＤＳ、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＳＤＳ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ ＨＴ ＳＤＳ、Bio-Rad製のｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、Cepheid製のＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ、Corbett Research製のＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ、Roche Molecular Biochemicals製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、及びStratagene製のＭｘ４０００ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ等の種々の機器が利用可能である。ｑＰＣＲプロセスは、反応の対数期の非常に早い段階でＰＣＲ産物の蓄積を測定することによってリアルタイムでＰＣＲ産物を正確に定量することを可能にすることで、エンドポイントＰＣＲで生じるＰＣＲ増幅効率に関連する定量のバイアスが減少される。ｑＰＣＲに関する技術概要及びプロトコルは、例えば上記の供給業者、例えばhttp://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html又はhttp://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html.から入手可能である。ｑＰＣＲ法の総説については、Smith CJ and Osborn AM., FEMS Microbiol Ecol., 2009;67(1):6-20、及びGiulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401を参照されたい。特定の実施形態では、定量方法は、例えば、単一のｑＰＣＲ反応においてＦ．プラウスニッツイの系統群Ｉ及び系統群ＩＩのレベルを定量する場合、マルチプレックスｑＰＣＲを含む。

【0050】

幾つかの遺伝子を、細菌の定量を目的として使用することができる。典型的には、特定の標的細菌は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅によって定量され得る。１６Ｓ ｒＲＮＡは、ほぼ全ての細菌種で異なる。細菌種を定義するのは困難であるが、しばしば、操作的分類単位（ＯＴＵ：operational taxonomic unit）として定義される少なくとも９７％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を持つ生物とする。約１．５キロベースの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列には、細菌の分類群を区別する９つの短い超可変領域があり、これらの領域の１つ以上の配列は、地域調査で標的とされている（Weinstock B.M, Nature 2012, 489,250-256）。

【0051】

タンパク質をコードする遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子も使用され得る。Roux et al.（FEMS Microbiol Ecol 78 (2011) 617-628）は、生態学的研究のための分類学的マーカーとしてプライマーセットが利用可能であった、５つのタンパク質マーカー遺伝子（ｒｐｌＢ、ｐｙｒＧ、ｆｕｓＡ、ｌｅｕＳ、及びｒｐｏＢ）の使用について記載している。特定の標的細菌の定量を目的としたヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子及びブチリル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の使用も記載されている（Jia et al.FEMS Microbiol Lett.2010; 310:138-144）。

【0052】

ｑＰＣＲに対して種々の検出化学が利用可能である。それらはいずれも、上記のｑＰＣＲ機器で使用され得る。「検出化学」という用語は、リアルタイムＰＣＲで特定のＰＣＲ産物の増幅を報告する方法を指し、加水分解又はＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子ビーコン、スコーピオン（scorpions）、ハイブリダイゼーションプローブ及びＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ等のＤＮＡ結合色素を含む場合がある。これらは、例えばGiulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401に詳述される。

【0053】

本明細書に記載される酪酸産生種の定量は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量により実施されることが好ましい。好ましい実施形態では、本明細書に記載される酪酸産生種の定量のためのポリヌクレオチド（例えば、プライマー及びプローブ）は、実施例に開示されたもの、又はそれに対して少なくとも８５％、好ましくはそれに対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも約９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチドである。

【0054】

好ましくは、上記ポリヌクレオチドは１０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１５ヌクレオチド〜２６ヌクレオチド、更により好ましくは１８ヌクレオチド〜２２ヌクレオチド、更により好ましくは約２０ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、上記プライマー及び／又はプローブは、検出のため又はアッセイ性能を高めるため修飾されている。

【0055】

特定の実施形態では、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択され、以下の１つ以上の使用を含む方法によってそれぞれの存在量レベルが決定される：
Ｆ．プラウスニッツイのレベルを決定するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、及びそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、
任意に配列番号４及び／又は配列番号５、又はそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドと組み合わせた、ＰＨＧＩのレベルの決定のための配列番号６からなるポリヌクレオチド又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、
任意に、配列番号４及び／又は配列番号５、又はそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドと組み合わせた、ＰＨＧＩＩのレベルの決定のための配列番号７からなるポリヌクレオチド又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、
ロゼブリア・ホミニスのレベルを決定するための配列番号１１、配列番号１２、及びそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、並びに、
サブドリグラニュラム・バリアビレのレベルを決定するための配列番号１３、配列番号１４、及びそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド。

【0056】

フィーカリバクテリウムは、Duncan et al.（Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol.2002; 52, 2141-2146）によって作り出された新しい属である。非芽胞形成性、非運動性のグラム陽性で絶対嫌気性の該生物は、酪酸塩、ｄ−乳酸塩、及びギ酸塩を産生し、酢酸塩を利用する。ゲノムＤＮＡのＧ−Ｃ含有量は４７±５７モル％（熱変性により決定される）である。その特性がCato et al.(1974)によって報告された基準株は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＡＴＣＣ２７７６８Ｔ（ＮＣＩＭＢ １３８７２Ｔ）である。しかしながら、過去１０年間にこの種で行われた最近の研究のほとんどは、同じくDuncan et al.（Duncan et al., Int J Syst Evol Microbiol.2002; 52, 2141-2146）によって記載された株Ａ２−１６５（ＤＳＭ１７６７７）に基づいている。今日、Ｆ．プラウスニッツイ種は、フィルミクテス門、クロストリジウム綱、ルミノコッカス科を代表する（非特許文献３）。

【0057】

Ｆ．プラウスニッツイの２つの系統群は以前に記載されている（非特許文献１１）。この研究は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいてクロストリジウムクラスターＩＶの他のメンバーに対するＦ．プラウスニッツイ分離株の系統関係を分析し、Ｆ．プラウスニッツイ種内の２つの系統群を初めて定義し（非特許文献１１の図１）、具体的には、９７％超の配列同一性を持つルミノコッカス科の２つの枝を定義している。これらには、分離株Ｍ２１／２、ＡＴＣＣ２７７６６、ＡＴＣＣ２７７６８（ＰＨＧＩに属する）、並びにＡ２−１６５及びＬ２−６（ＰＨＧＩＩに属する）について以前に報告された５つの配列が含まれる。

【0058】

国際公開第２０１７／０２５６１７号は、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対する独自の種特異的プライマー対、及び各Ｆ．プラウスニッツイの系統群を標的とする２つの加水分解プローブの使用を含む、Ｆ．プラウスニッツイの両方の系統群を同時に定量するｑＰＣＲアッセイを記載している。このアッセイに使用されるオリゴヌクレオチドは、国際公開第２０１７／０２５６１７号の表１５に示されており、その内容は引用することで本明細書の一部をなす。

【0059】

本明細書で使用される表現「フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのディスバイオシス」は、Ｆ．プラウスニッツイ（Ｆｐｒａ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及び／又はＦ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）全体の減少を指す。

【0060】

ロゼブリア・ホミニスは、Duncan et al.（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2006, 56, 2437-2441）によって最初に記載された。ロゼブリア・ホミニスは、グラム不定又はグラム陰性で絶対嫌気性のわずかに湾曲した桿菌であり、系統発生的にＲ．インテスティナリスに関連しているが、既存の種に含めるには関連性が十分ではない。基準株はＡ２−１８３である。Ｒ．ホミニスはグリセロールでは増殖することができるが、イヌリン、キシラン、及びアミロペクチン等の複合基質では増殖することができなかった（表１を参照されたい）。酪酸塩及びギ酸塩は、Ｒ．ホミニス代謝の主要な生成物である（表２を参照されたい）。

【0061】

サブドリグラニュラム・バリアビレは、Holmstrom et al.（Anaerobe 2004, 10, 197-203）によって最初に記載された。サブドリグラニュラム・バリアビレは、幾分可変性の球形の形態を示す、絶対嫌気性で非芽胞形成性のグラム陰性染色生物である。比較１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列決定研究は、系統発生的にクロストリジウム・レプタム属より上位の分類群のｒＲＮＡクラスターのメンバーであることを示した。Ｓ．バリアビレの基準株はＢＩ １１４Ｔである。グルコース発酵の主な生成物は、酪酸及び乳酸である。

【0062】

上記被験体は、腸疾患の症状を呈さない被験体であってもよい。実際、被験体は、腸疾患を発症する前に、例えば、炎症性疾患の場合、炎症の徴候及び／又は症状が現れる前に、Ｆ．プラウスニッツイ及び／又はその他の酪酸産生細菌の減少を特徴とするディスバイオシス等の腸内ディスバイオシスを経験する場合がある。実施例２のｉｎ ｖｉｔｒｏ発酵実験では、陰性対照に対して、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）を基質として使用する健康な被験体に由来する糞便サンプルにおいて、ロゼブリア・ホミニス、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ及びサブドリグラニュラム・バリアビレの存在量の統計学的に有意な増加が観察された。この増加は、真正細菌に対するこれらのマーカーの相対レベルが決定される際に、ロゼブリア・ホミニス及びＦ．プラウスニッツイの系統群ＩＩで維持される（表１及び表２を参照されたい）。特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体は腸疾患の症状を示すことなく、ＰＨＧＩＩ、サブドリグラニュラム・バリアビレ及び／又はロゼブリア・ホミニスのディスバイオシスを有する。

【0063】

或いは、上記被験体は腸疾患を有していてもよい。この腸疾患は、炎症性腸疾患（inflammatory intestinal disease）、例えば「炎症性腸疾患（ＩＢＤ：inflammatory bowel disease）」、又は非炎症性腸疾患であってもよい。

【0064】

本明細書で使用される「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）」という用語は、特発性慢性炎症性腸疾患のグループを指す。該用語に含まれる２つの主要な疾患カテゴリーは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、どちらも重複する明確な臨床的及び病理学的のの特徴を備えている。ＩＢＤの診断には、包括的な身体検査及び患者の病歴のレビューが必要である。血液検査、検便、内視鏡検査、生検、及び画像診断を含む様々な検査は、他の原因を除外して診断を確定するのに役立つ（World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, Inflammatory bowel disease: a global perspective, June 2009、及びSilverberg et al., Can J Gastroenterol.2005, 19 Suppl A:5-36）。ＩＢＤの疫学及び遺伝学の理解が深まるにつれて、ＵＣ及びＣＤが実際にＩＢＤの幾つかの形態を表す可能性があることが臨床医に明らかとなった。したがって、本明細書で使用される「ＩＢＤ」という用語は、その表現型を含む。

【0065】

本明細書で使用される「ＩＢＤ表現型」という用語は、ＣＤ、ＵＣ、分類不能大腸炎、タイプ未分類炎症性腸疾患（ＩＢＤＵ）、嚢炎、顕微鏡的大腸炎、直腸炎、憩室炎等の疾患又は障害を含む（Mowat et al., Gut 2011, 1-37、Geboes et al., J Clin Pathol 2005;58:1133-1134、Regueiro M, J Clin Gastroenterol.2004, 38(9):733-740、Cheifetz A, and Itzkowitz S., J Clin Gastroenterol.2004 May-Jun;38(5 Suppl 1):S44-50）。該用語には、ＩＢＤの疾患又は障害のサブタイプが更に含まれる。ＣＤサブタイプは、例えばモントリオール分類によって定義されるものであり、ＣＤは診断時の年齢、場所、及び／又は挙動に従って分類される。ＵＣサブタイプは、モントリオール分類によって定義されているものであってもよく、ＵＣは疾患の範囲及び／又は疾患の重症度に従って分類される（World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, Inflammatory bowel disease: a global perspective, June 2009、及びSilverberg et al., Can J Gastroenterol.2005, 19 Suppl A:5-36）。

【0066】

本明細書で使用される用語「分類不能大腸炎（ＩＣ）」は、結腸切除標本中のＵＣ又はＣＤのいずれの特徴も持たない慢性ＩＢＤの症例を指す（Silverberg et al., Can J Gastroenterol.2005, 19 Suppl A:5-36; Satsangi et al., Gut 2006; 55, 749-753）。

【0067】

本明細書で使用される「タイプ未分類炎症性腸疾患（ＩＢＤＵ）」という用語は、小腸の関与なしに、結腸を冒す慢性炎症性腸疾患の臨床的及び内視鏡的な根拠に証拠があり、ＣＤ又はＵＣのいずれを確立する組織学的又はその他の証拠のない、感染が除外されている症例を指す（Satsangi et al., Gut 2006; 55, 749-753）。

【0068】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体はＩＢＤを有する。上記被験体はＵＣを有することが好ましい。ＵＣ患者は、以前にＰＨＧＩＩレベルの低下を特徴とすることが報告されている（国際公開第２０１７／０２５６１７号）。

【0069】

実施例２のｉｎ ｖｉｔｒｏ発酵実験では、真正細菌に対する相対レベルが決定される場合にも、陰性対照に対して、基質としてＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）を使用するＵＣ患者に由来する糞便サンプル中のＦ．プラウスニッツイの系統群ＩＩの存在量の統計学的に有意な増加が観察される（表４及び表５を参照されたい）。特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体は潰瘍性大腸炎及びＰＨＧＩＩのディスバイオシスを有する。

【0070】

別の特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体は非炎症性腸疾患を有する。非炎症性腸疾患の例示的で非限定的な例は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌である（非特許文献３）。本発明の特定の実施形態では、上記腸疾患は非炎症性腸疾患であるが、ただし結腸直腸癌ではない。別の特定の実施形態では、上記非炎症性腸疾患は過敏性腸症候群である。実施例３は、ＩＢＳ患者及び健康な被験体において糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００、リンゴペクチン及びプランタゴ・オバタとインキュベートした場合に得られた実験結果を提供する。表１２に示すように、陰性対照に対して、ＩＢＳ患者の糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００とインキュベートすると、Ｆ．プラウスニッツイ、ロゼブリア・ホミニス、及びサブドリグラニュラム・バリアビレ全体で総存在量の統計学的に有意な増加が観察された。特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体は、ＩＢＳ及びＦ．プラウスニッツイ、ロゼブリア・ホミニス及び／又はサブドリグラニュラム・バリアビレのディスバイオシスを有する。

【0071】

更なる特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記被験体はヒト被験体である。

【0072】

第２の態様では、本発明は、被験体において腸疾患を治療する方法に使用されるブドウ果皮、好ましくは分離されたブドウ果皮に関し、該被験体は酪酸産生細菌の減少を特徴とする腸内ディスバイオシスを有し、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択されることが好ましい。

【0073】

さらに、本発明は、被験体において腸疾患を治療する方法であって、該被験体が酪酸産生細菌の減少を特徴とする腸内ディスバイオシスを有し、酪酸産生細菌がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス、及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択される、方法に関し、該方法は、かかる治療を必要とする被験体に、治療有効量の本明細書に記載のブドウ果皮を投与することを含む。

【0074】

特定の実施形態では、腸疾患を治療する上記方法は予防方法であり、上記被験体は腸疾患の徴候及び／又は症状を呈していない。別の実施形態では、腸疾患を治療する上記方法は治療方法であり、上記被験体は腸疾患を有する、すなわち腸疾患の徴候及び／又は症状を呈する。これらの態様の特定の実施形態及び好ましい特徴は上記の通りである。

【0075】

更なる態様では、本発明は、被験体において腸疾患を治療する方法に使用されるブドウ果皮、好ましくは分離されたブドウ果皮に関する。関連する態様では、本発明は被験体において腸疾患を治療する方法に関し、該方法は、かかる治療を必要とする被験体に、治療有効量の本明細書に記載されるブドウ果皮を投与することを含む。上記のいずれかの特定の実施形態では、上記腸疾患は潰瘍性大腸炎以外であり、好ましくは潰瘍性大腸炎以外の上記疾患はＣＤ又はＩＢＳである。これらの態様の特定の実施形態及び好ましい特徴は上記の通りである。

【0076】

本明細書で言及されるブドウ果皮は、好ましくは「分離されたブドウ果皮」である。本明細書で使用される「分離されたブドウ果皮」という用語は、果肉、種子及び茎から分離されたブドウ果皮を指す。果肉及び他の搾りかすからブドウ果皮を分離する方法は、当業者によく知られている。例えば、ブドウ果皮は手作業で分離されてもよい。特定の実施形態では、ブドウ全体を脱水した後、ブドウ果皮を他の搾りかす（例えば、種子及び茎）から分離する。

【0077】

ブドウは、任意のブドウ種、白ブドウ又は赤ブドウの品種、好ましくは白ブドウ品種に由来し得る。ブドウ搾りかすのペクチン含有量は、赤ブドウ品種と白ブドウ品種との間で有意差を示すことが報告されており、白品種の搾りかすではより高い（Gonzalez-Centeno MR, et al.Food sci technol.2010; 43:1580-1586）。白ブドウ品種の例示的で非限定的な例としては、ヴィティス・ビニフェラ（Vitis vinifera）、ヴィティス・ラブラスカ（Vitis labrusca）、ヴィティス・リパリア（Vitis riparia）、Ｖ．ビニフェラハイブリッド及び非Ｖ．ビニフェラハイブリッドが挙げられる。

【0078】

ブドウ果皮は、ヴィティス・ロトゥンディフォリア（Vitis rotundifolia）以外のブドウ種に由来することが好ましい。マスカディンブドウ（ヴィティス・ロトゥンディフォリア）ワインの化学組成は、房状ブドウ（ヴィティス・ビニフェラ）ワインとは、特に抗酸化化合物の組成に関して異なるとBasha et al.（African Journal of Biotechnology 2004, Vol. 3 (10), 523-528）に記載されている。特に、マスカディンブドウは、高濃度の或る特定のフェノール化合物の存在を特徴とし、マスカディン以外のブドウ種には通常見られないエラグ酸を含むことが報告されている（Olien et al.Hortsci.199025, 732-739、Lin and Vine J. Food Sci.1990, 55, 1607-1613）。

【0079】

好ましい実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記ブドウはブドウ種ヴィティス・ビニフェラに由来する。ヴィティス・ビニフェラ種の白ブドウ品種の例は当該技術分野でよく知られており、ホワイトグルナッシュ、ピノブラン、シャルドネ、及びソーヴィニヨンブランが含まれるが、これらに限定されない。このブドウはブドウ種ヴィティス・ビニフェラ及びホワイトグルナッシュ品種に由来することが好ましい。

【0080】

分離されたブドウ果皮を、脱水（凍結乾燥を含む）又は粉砕等の物理的変換プロセスにかけてもよい。特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記ブドウ果皮は、水分含有量が２０％以下、例えば１８％付近であることを特徴とする脱水ブドウ果皮である。好ましくは、上記ブドウ果皮は、水分含有量が１５％以下、例えば水分含有量が５％〜１５％、より好ましくは１０％〜１２％、例えば１１％付近の脱水ブドウ果皮である。

【0081】

更なる実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記ブドウ果皮は、
ａ）ブドウ全体を乾燥させることと、
ｂ）ブドウ果皮を分離することと、
ｃ）任意に、ｂ）で得られた生成物を粉砕することと、
ｄ）任意に、ｃ）で得られた生成物を篩にかけることと、
を含む方法により得られる又は得ることができる。

【0082】

工程ａ）では、ブドウを少なくとも２日間、６０℃〜６２℃の空気循環オーブンで乾燥させることが好ましい。例えば、２日間〜５日間、より好ましくは２日間乾燥させてもよい。

【0083】

粉砕生成物は、その粒径によって特に限定されない。工程ｃ）の後に得られる粉砕生成物の粒径は、例えば、０．００１ｍｍ〜５ｍｍであってもよい。典型的には粉砕生成物は、２ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、より好ましくは０．１ｍｍ未満の粒径を有する。特定の実施形態では、粉砕生成物は微粒子化される。

【0084】

本明細書で使用される「微粒子化」という用語は、固体材料の粒子の平均直径を減少させるプロセスを指す。通常、微粒子化という用語は、直径がわずか数マイクロメートル（通常は１００μｍ未満）からナノメートルの範囲で生成される粒子の場合に使用される。従来の微粒子化技術は、摩擦を使用して粒径を縮小することに基づいている。本明細書で使用される「粉砕」という用語は、製粉及び粉砕等の粒径の縮小を目的とする任意の技術を包含するように広く使用される。

【0085】

好ましい実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、本発明は、被験体において腸内ディスバイオシスを治療する方法に使用される、本明細書に記載される分離されたブドウ果皮と、少なくとも１つの薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はビヒクルとを含む組成物に関し、腸内ディスバイオシスは、本明細書に記載される酪酸産生細菌の減少を特徴とする。本発明はさらに、被験体において腸疾患を治療する方法に使用される上記医薬組成物の使用に関し、上記被験体は、本明細書に記載される酪酸産生細菌の減少を特徴とする腸内ディスバイオシスを有する。

【0086】

「薬学的、獣医学的又は栄養学的に許容可能な賦形剤又はビヒクル」という用語は、組成物を調製するための薬学的な、獣医学な又は食品の技術での使用に適した賦形剤又はビヒクルを指す。これらの成分、賦形剤又は担体は、組成物の他の材料と適合性でなくてはならない。また、合理的なベネフィット／リスク比で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の免疫原性の問題若しくは合併症を伴わずに、人間及び動物の組織又は器官と接触させて使用するのに適していなければならない。賦形剤又はビヒクルは、医薬品の形で存在する濃度で薬理学的活性を欠いている物質である。賦形剤又はビヒクルは、１つ以上の有効成分の安定性、バイオアベイラビリティ、忍容性、及び投与の容易さを保証する薬学的又は獣医学的な形態特性を提供するために使用される。賦形剤が有効成分の放出に影響する程度に関して、賦形剤は、そのバイオアベイラビリティの変化によって薬品の薬理活性の大きさ及び時間プロファイルを変更することができる。賦形剤はまた、適切な形態又は粘稠度の調製物を提供するために使用される。賦形剤の種類の例：可溶化剤、崩壊剤（disintegrants）又は崩壊物質（disintegrating agents）、乳化剤（emulsifiers）（乳化物質（emulsifying agents））、色素、香料、結合剤、酸化防止剤、滑沢剤、防腐剤、増粘剤等。また、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)又はRemington:The Science and Practice of Pharmacy 22^nd edition, Pharmaceutical press (2012), ISBN-13:9780857110626に記載されているもの等の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は、医薬組成物の所望の特性に悪影響を与えない限り、本明細書に記載される医薬組成物に含まれ得る。

【0087】

好ましい実施形態によれば、組成物は医薬組成物である。任意の投与経路が適切であるが、経口又は直腸投与が好ましい場合がある。医薬組成物は、好ましくは経口又は直腸投与用に製剤化される。経口組成物は、例えば、丸剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、粉末、ウェーハ、発泡性の粉末若しくは錠剤、溶液、懸濁液、シロップ又は顆粒の形態であってもよい。固体医薬組成物については、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む従来の非毒性固体担体を使用してもよい。直腸組成物は、とりわけ坐剤、浣腸剤又は特殊なカテーテルの形態であってもよい。別の好ましい実施形態によれば、組成物は食品組成物である。食品組成物は、液体組成物又は飲料、固体組成物又は栄養補助食若しくは栄養補完食（complement）（栄養補助又は栄養補完の食餌又は食品とも称される）であってもよい。本発明の文脈では、「食品組成物」という用語は、分離されたブドウ果皮が豊富な任意の固体又は液体の食品と並んで、分離されたブドウ果皮を含む任意の栄養補助食又は栄養補完食を包含する。

【0088】

食品組成物は、社会で最も一般的に使用されるという点で液体組成物、すなわち飲料であってもよい。本発明の文脈では、かかる液体組成物としては、限定されないが、動物性又は植物性のミルクと並んでその派生物、例えば、ミルクシェイク、ヨーグルト、ケフィア等；果物及び／又は野菜のジュース；静水（still water）若しくはスパークリングウォーター、又は風味若しくは甘みを付けた（栄養甘味料（スクロース、フルクトース等）又は人工甘味料による）水又は飲料；例えば、任意のサルサ、ドレッシング、ケチャップ、油、酢又は酢調製品等の調味料；任意の種類のアルコール飲料；茶、コーヒー；また同様に、あらゆる種類の清涼飲料若しくはソフトドリンク、又はエナジー飲料（energizing beverages）からなる群より選択される任意の飲料が挙げられる。

【0089】

食品組成物はまた、固体組成物であってもよい。かかる固体組成物は、例えば、チーズ、バター、マーガリン、及び豆腐等の動物性又は植物性のミルクの派生物；焼きたての、包装された、又は冷凍のパン、スライスしたパン、全粒粉パン、スパイスパン、甘いパン、塩味のパン等を含む任意の種類のパン；小麦粉又はセモリナ粉（マカロニ、スパゲッティ、麺等）等の任意の穀物粉から調製したパスタ；ケーキ、クッキー、マフィン、ドーナツ等を含む焼き菓子；飲料を調製するためのバルクの又はサシェ入りのインフュージョン（infusions）、茶又はコーヒー；「ソフトフルーツキャンディー」としてより知られているグミキャンディーを含む、ゼリー、キャンディー；また同様に、任意の種類の固体調味料、例えばオレガノ、塩、コリアンダー、パセリ、バジル等、又はそれらの混合物からなる群より選択され得るが、これらに限定されない。

【0090】

最後に、食物組成物は、栄養学上の補助又は補完の食餌又は食品であってもよく、これらのいずれの用語も本発明の文脈で同じように使用される。これらの用語は通常、経口で消費される組成物に使用され、本発明の場合では分離されたブドウ果皮である、食事を補完することを意図した材料を含む。食物組成物は、従来の食品に取って代わるものではなく、食事又は食餌の唯一の成分であってはならない。食物組成物は、トローチ、丸剤、錠剤、カプセル剤、ソフトゼラチンカプセル剤、ゼラチンカプセル剤、ウェーハ、発泡錠、液体（溶液、懸濁液、シロップ）、顆粒、及び粉末等の種々の提示で見られてもよく、いずれも本発明の範囲内に特定の実施形態として含まれる。栄養学的又は薬学的に許容可能な賦形剤は、前述の提示のいずれかを得ることについて当業者にとって明らかであり、それらは本発明の範囲内に含まれる。

【0091】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、分離されたブドウ果皮の組成物は、遅延放出又は腸溶性の経口形態として製剤化される。遅延放出経口形態では、外表面又は内容物のいずれかが胃液の作用に抵抗するが、腸液の存在下では有効成分（複数の場合もある）を放出する。かかる遅延放出経口形態としては、顆粒剤、錠剤と並んで、硬質又は軟質のカプセル剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0092】

上記遅延放出経口形態は、少なくとも１つの胃抵抗性の層又はコーティングを含み、該胃抵抗性の層又はコーティングは、少なくとも１つの胃腸ポリマー（gastro-intestinal polymer）を含む。本明細書で使用される「コーティング」という用語は、表面全体、例えば、カプセルのシェル又は有効成分を含むコアに層を塗布することを指す。いくつかの実施形態では、上記遅延放出形態は、２つ、３つ又はそれ以上の胃抵抗性の層又はコーティングを備えてもよい。

【0093】

胃抵抗性ポリマーは、当該技術分野でよく知られている。これらのポリマーは、一般に５．５を超えるｐＨで溶解し、コーティングされた物質又は組成物を胃の環境から保護することを可能とする。胃抵抗性のポリマー及びポリマーコーティングの例示的で非限定的な例は、酢酸セルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（商標）、主にＥＵＤＲＡＧＩＴ（商標）Ｌ及びＥＵＤＲＡＧＩＴ（商標）Ｓの商品名で商業的に知られている種々の比率のメタクリル酸及びメタクリル酸エステルのコポリマー、ポリビニルアセトフタレート及びヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートである。さらに、上記胃抵抗性の層又はコーティングは、ジエチルフタレート、ジブチルフタレート、トリアセチン、ポリエチレングリコール及びアセチル化モノグリセリド等の可塑剤を更に含んでもよい。典型的には、可塑剤は、コーティング剤の量に対して５重量％〜１５重量％の量で含まれる。

【0094】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記組成物は、プレバイオティクス、単一種又は一群のプロバイオティクス種（天然又は遺伝子組み換えの微生物を含む）、細菌の二次生成物（例えば、酪酸塩）、細菌／宿主相互作用の分子経路のモジュレーター、及び狭域抗生物質からなる群より選択される化合物を更に含む。プレバイオティクス及びプロバイオティクスの化合物は、当該技術分野で良く知られており、単独で又は組み合わせて（すなわち、シンバイオティクス用途）使用され得る。例えば、The Handbook of Prebiotics and Probiotics Ingredients; Health benefits and food applications (Ed. Ungsoo Cho S. and Finocchiaro T., CRC press, 2009)を参照されたい。

【0095】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記組成物はプレバイオティクス化合物を更に含む。本明細書に記載されるブドウ果皮と組み合わせて使用され得るプレバイオティクス化合物の例示的で非限定的な例としては、他のブドウ派生物（例えば、ブドウ種子又はブドウ種子プロアントシアニジン抽出物（ＧＳＰＥ、Liu W. et al., Mol.Nutr.Food Res 61, 9, 2017を参照されたい））、発芽オオムギ麦食品（ＧＢＦ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリン、リンゴペクチン、及びイスパキュラ殻（Ispaghula husk）（プランタゴ・オバタとも称される）種子及び／又は花及び／又は植物のその他の任意の部分が挙げられ、それらから選択され得る。上記プレバイオティックス化合物はリンゴペクチンであることが好ましい。

【0096】

ヨーグルト及び他の乳製品に存在するものを含む、多くのプロバイオティクス種が記載されている。プロバイオティクス種の例示的で非限定的な例としては、乳酸桿菌（例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリウス（Lactobacillus bulgarius）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri））、ビフィズス菌（例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum））、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、サッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びＥ．コリ（E.coli）の非病原性種が挙げられる。

【0097】

特定の実施形態では、任意に、上記又は下記の実施形態の１つ以上と組み合わせて、上記組成物は、酪酸産生細菌、乳酸桿菌、ビフィズス菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、サッカロマイセス・ブラウディ、バチルス・サブチリス及びＥ．コリの非病原性種からなる群より選択される単一種又は一群のプロバイオティクス種を更に含み、該酪酸産生細菌は、Ｆ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ、Ｒ．ホミニス、及びＳ．バリアビレからなる群より選択されることが好ましい。

【0098】

上記組成物は、凍結乾燥形態、液体形態又は噴霧形態等の任意の形態であってもよい。例えば、組成物を作製するために凍結乾燥された細菌を使用する場合、凍結乾燥された細菌の上記予備組成物は、所望の総濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）の最終組成物を得ることができるように、例えば滅菌等張食塩水で再水和されてもよい。

【0099】

容易な使用を提供するため、上記組成物は投与形態であってもよい。例えば、各用量は、１０^７以上、１０^８以上、１０^９以上、１０^１０以上、１０^１１以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌を含む（１０^９以上が好ましい場合がある）。用量は、０．１ｍｌ〜１００ｍｌ、好ましくは０．２ｍｌ〜５０ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌ〜１０ｍｌ、より好ましくは１．５ｍｌ〜５ｍｌの範囲の体積を有してもよい。

【0100】

更なる態様では、本発明は、ブドウ果皮と、プレバイオティクス、単一種又は一群のプロバイオティクス種、細菌の二次生成物、細菌／宿主相互作用の分子経路のモジュレーター、及び狭域抗生物質からなる群より選択される化合物との相乗的な組み合わせに関する。本発明はさらに、ブドウ果皮と、腸内ディスバイオシスの治療に相乗効果をもたらす上に定義される化合物とを含む組成物、及び腸内ディスバイオシスの治療、好ましくは酪酸産生細菌のディスバイオシスの治療におけるその使用に関する。特定の実施形態及び好ましい特徴は、本明細書に記載されている通りである。

【0101】

本明細書に記載される任意の特徴は、本発明の任意の医学的使用、組成物、医薬組成物、治療方法、組成物の製造方法及び／又は併用療法の実施形態のいずれかと任意に組み合わせられてもよいことが企図され、本明細書で述べられる任意の実施形態を、これらのいずれに関して実施することができる。本明細書に記載される特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、実例として示されることが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で用いられ得る。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の手順について多くの等価物を認識する、又は確認することができる。かかる等価物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。

【0102】

全ての出版物及び特許出願は、各個々の出版物又は特許出願が引用することで本明細書の一部をなすことが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、引用することで本明細書の一部をなす。

【0103】

数量を特定していない語（the word "a" or "an"）の使用は「１つ」を意味する場合があるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は２つ以上」の意味とも一致する。「別の」という用語の使用は、１つ以上を指す場合もある。特許請求の範囲における「又は」の用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するため使用される。

【0104】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される「含む、含んでいる（comprising）（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」等の「含む」の任意の形態）、「有する、有している（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」等の「有する」の任意の形態）、「含む、含んでいる（including）」（及び「含む（includes）」及び「含む（include）」等の「含む」の任意の形態）、又は「含有する、含有している（containing）」（及び「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」等の「含む」の任意の形態）の単語は、包括的又は無制限であり、追加の引用されていない要素又は方法の工程を除外しない。また、「含む（comprises）」という用語は、「からなる（consists of）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」という用語も包含し、明示的に開示する。本明細書で使用される「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を明示される材料又は工程、及び特許請求の範囲に記載される発明の基本的及び新規の特性（複数の場合もある）に実質的に影響しないものに限定する。本明細書で使用される「からなる」という語句は、例えば要素又は制限に通常関連する不純物を除き、特許請求の範囲で明示されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。

【0105】

本明細書で使用される「又はそれらの組み合わせ」という用語は、その用語に先立って列挙される項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」には、以下の少なくとも１つ：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣが含まれ、特定の文脈で順序が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含まれることを意図する。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等の１つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、通常、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に制限がないことを理解する。

【0106】

本明細書で使用される、「約（about）」、「付近（around）」、「およそ（approximately）」等の限定されない近似語は、そのように修飾される場合、必ずしも絶対的又は完全であると理解されるものではなく、その状態を存在すると指定する根拠を与えるように十分近いと当業者にみなされる状態を指す。説明が変化し得る程度はどの程度の変更を行うことができるかに依存し、当業者に、修飾された特徴が必要な特性及び修飾されていない特徴の能力をまだ持っていると認識させる。一般的に、前述の記述を条件として、「約」等の近似語によって修飾される本明細書の数値は、表示される値から±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％異なってもよい。したがって、「約」という用語は、その値の表示値±５％、好ましくはその値の表示値±２％を意味し得て、最も好ましくは「約」という用語は表示値（±０％）を正確に意味する。

【0107】

本発明の項目
１．被験体において腸内ディスバイオシスを治療する方法のために用いられる分離されたブドウ果皮であって、腸内ディスバイオシスが、酪酸産生細菌の減少を特徴とし、好ましくは、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス、及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択される、分離されたブドウ果皮。
２．前記被験体が、腸疾患の徴候及び／又は症状を呈さない、項１に記載の分離されたブドウ果皮。
３．前記被験体が腸疾患を有する、項１に記載の分離されたブドウ果皮。
４．被験体において腸疾患を治療する方法のために用いられる分離されたブドウ果皮であって、前記被験体が、酪酸産生細菌の減少を特徴とする腸内ディスバイオシスを有し、好ましくは、酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス、及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択される、分離されたブドウ果皮。
５．前記方法が予防的方法であり、前記被験体が腸疾患の徴候及び／又は症状を呈さない、項４に記載の分離されたブドウ果皮。
６．前記方法が治療方法であり、前記被験体が腸疾患を有する、項４に記載の分離されたブドウ果皮。
７．前記腸疾患が炎症性腸疾患である、項３〜項６のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
８．前記腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、項３〜項７のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
９．前記腸疾患が過敏性腸症候群である、項３〜項６のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１０．前記被験体がヒト被験体である、項１〜９のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１１．酪酸産生細菌の減少が、
ａ．前記被験体の腸内サンプル、好ましくは糞便サンプル中の酪酸産生細菌のレベルを決定することと、
ｂ．前記被験体サンプル中の前記酪酸産生細菌のレベルを参照サンプル中のレベルと比較することと、
を含む方法によって判断され、好ましくは、前記参照サンプルが、腸疾患を有していない被験体又は被験体群のサンプルであり、
前記被験体サンプルのレベルが前記参照サンプルのレベルを下回る場合に酪酸産生細菌の減少がある、
項１〜項１０のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１２．前記酪酸産生細菌のレベルが定量的ＰＣＲによって判断される、項１１に記載の分離されたブドウ果皮。
１３．前記酪酸産生細菌が、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）、ロゼブリア・ホミニス、及びサブドリグラニュラム・バリアビレからなる群より選択され、
前記酪酸産生細菌のそれぞれのレベルが、
Ｆ．プラウスニッツイのレベルを決定するための配列番号１、配列番号２、配列番号３、及びそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、
配列番号４及び／又は配列番号５と、又はそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドと任意に組み合わせた、ＰＨＧＩレベルを決定するための配列番号６からなるポリヌクレオチド又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、
配列番号４及び／又は配列番号５と、又はそれらに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドと任意に組み合わせた、ＰＨＧＩＩレベルを決定するための配列番号７からなるポリヌクレオチド又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド、
ロゼブリア・ホミニスのレベルを決定するための配列番号１１、配列番号１２、及びそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、及び、
サブドリグラニュラム・バリアビレのレベルを決定するための配列番号１３、配列番号１４、及びそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチド、
の１つ以上の使用を含む方法によって決定される、項１１又は項１２に記載の分離されたブドウ果皮。
１４．ヴィティス・ロトゥンディフォリア以外のブドウ種に由来する、項１〜項１３のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１５．ヴィティス・ビニフェラのブドウ種、好ましくは白ブドウ品種に由来する、項１〜項１４のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１６．２０％以下の水分含有量を有することを特徴とする脱水されたブドウ果皮である、項１〜項１５のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮。
１７．項１〜項１６のいずれかに記載の分離されたブドウ果皮であって、
ａ）ブドウ全体を乾燥させることと、
ｂ）ブドウ果皮の分離することと、
ｃ）任意に、ｂ）で得られた生成物を粉砕することと、
ｄ）任意に、ｃ）で得られた生成物を篩にかけ、好ましくは粒径が１ｍｍ以下の生成物を得ることと、
を含む方法によって得られる又は得ることができる、ブドウ果皮。
１８．工程ａ）において、前記ブドウ全体を少なくとも２日間、６０℃〜６２℃の空気循環オーブンで乾燥させる、項１７に記載の分離されたブドウ果皮。
１９．項１〜項１８のいずれかに記載の用途のために用いられる、項１〜項１８のいずれかに定義される分離されたブドウ果皮を含む組成物。
２０．プレバイオティクス、単一種又は一群のプロバイオティクス種、細菌の二次生成物、細菌／宿主相互作用の分子経路のモジュレーター、及び狭域抗生物質からなる群より選択される化合物を更に含む、項１９に記載の組成物。
２１．発芽オオムギ食品（ＧＢＦ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリン、リンゴペクチン、及びイスパキュラ殻種子及び／又は花及び／又は植物の任意の他の部分からなる群より選択されるプレバイオティックス化合物を更に含む、項１９又は項２０のいずれかに記載の組成物。
２２．前記組成物が、酪酸産生細菌、乳酸菌、ビフィズス菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、サッカロマイセス・ブラウディ、バチルス・サブチリス及びＥ．コリの非病原性種からなる群より選択される単一種又は一群のプロバイオティクス種を更に含み、好ましくは前記酪酸産生細菌がＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ、Ｒ．ホミニス、及びＳ．バリアビレからなる群より選択される、項１９〜項２１のいずれかに記載の組成物。
２３．経口投与用又は直腸投与用に製剤化されている、項１〜項２２のいずれかに記載の組成物。

【0108】

以下の実施例は、本発明を例示する役割を果たすものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0109】

実施例１．−アッセイされた脱水ブドウ果皮の組成の特性評価
脱水されたブドウ果皮組成物は、ブドウのヴィティス・ビニフェラ種の白ブドウ品種（すなわち、ホワイトグルナッシュ（スペイン国カタルーニャ州アールテンポルダー）の全ブドウ果皮を６０℃〜６２℃の空気循環オーブンで２日間乾燥することと、その後、ブドウ果皮を粉砕することと、１ｍｍの篩を使用してブドウ果皮を篩い分けすることとを含む方法によって得られた。１ｍｍ以下の粒径を持つ得られた組成物は、本明細書では「Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）」と称される。

【0110】

以下の表は、このブドウ果皮の組成の化学組成分析の結果を提供し、表中、例えば可溶性及び不溶性の繊維と並んで中性糖の含有量を明示する。

【0111】

化学組成分析：
結果：
全糖（グルコースで表される）％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ５３．２４
方法：Ｌｕｒｆｆ−Ｓｃｈｏｏｒｌ体積法（規制（ＥＣ）ｎｏ １５２／２００９）
糖のクロマトグラム
方法：ＨＰＬＣ−屈折率（ＲＩ）
フルクトース％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ２５．８
グルコース％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ６．１
スクロース％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ＜０．５
マルトース％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ＜０．５
ラクトース一水和物％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ＜０．５
可溶性及び不溶性の食物繊維％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ
方法：重量分析（AOAC Official Method 993. 19 1(1996)16^th.Edition）
総食物繊維％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ３２．１６
可溶性食物繊維％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ３．３０
不溶性食物繊維％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ２８．８６
湿度及び揮発性物質（１０３℃）％（ｐ／ｐ）ｓ．ｓ．ｎ ６．３０
方法：重量分析（規制（ＥＣ）ｎｏ １５２／２００９）
ナトリウム（Ｎａ）ｍｇ／Ｋｇ ｓ．ｓ．ｎ ７８
方法：フレーム原子吸光分析（Ａ．Ａ．Ｓ．）
硝酸塩（ＮＯ_３Ｎａ）ｍｇ／Ｋｇ ｓ．ｓ．ｎ ２６
方法：ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＤＡＤ）

【0112】

脱水試験
６０℃〜６２℃の空気循環オーブンで５日間乾燥させた後、ヴィティス・ビニフェラ種（ホワイトグルナッシュ品種）のブドウ果皮のサンプルの水分含有量を決定するため、熱天秤を使用した。結果は、２日後の湿度のパーセンテージが２０％未満であり、３日後の湿度のパーセンテージが１１％付近で安定していることを示す。結果を以下に示し、図２２に提示する。

【0113】

ｔ（日） 湿度（％） 水分活性（ａｗ）
０ ７５．５３ ０．９２１
１ ５９．０５ ０．８８６
２ １８．２２ ０．２４２
３ １１．５５ ０．２６５
４ １１．２５ ０．１６４
５ １１．５６ ０．１５１

【0114】

実施例２．−Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）とＩＢＤ患者及び健康な被験体に由来する糞便サンプルとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
材料及び方法
１．患者、臨床データ及びサンプリング
糞便サンプルを、１３名の健康な被験体（Ｈ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断された１１名の患者（５名がクローン病（ＣＤ）と診断され、６名が潰瘍性大腸炎（ＵＣ）と診断された）から採取した。それらのボランティアは、大学病院の消化器内科のJosep Trueta医師（スペイン国ジローナ）によって募集された。

【0115】

ＩＢＤ患者として募集された被験体は、標準的な臨床的、病理学的及び内視鏡の基準に従って診断され、炎症反応の点でいずれも活動性疾患であった（２５０μｇ／Ｇ超のカルプロテクチンレベル又は０．５μｇ／Ｌ超のプロテインＣ反応性（ＰＣＲ）レベルを伴う）。既知の胃腸障害のない健康な被験体からなる対照群を、臨床基準に従って募集した。

【0116】

２．サンプルの収集、保存、及び保管
被験体はそれぞれ、１つの糞便サンプルを提供した。これらは、大学病院の消化器内科Josep Trueta医師のところで収集された。簡潔に言えば、サンプルを滅菌尿ポット（ドイツ国ニュームブレヒトのSarstedt）に収集し、室温に維持して、寄託後４時間未満の新鮮なものを使用した。全被験体に由来する全てのサンプルをホモジナイズし、直ちに実験に使用した。

【0117】

３．糞便のインキュベーション
上記のように、ＩＢＤ及び健康な被験体から得られた新鮮なヒトの糞便を用いて糞便発酵を行った。実験室において、糞便サンプルをストマッカー滅菌プラスチックバッグに移し、５：１の発酵バッファー（０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５ｍＭ ＮａＯＨ；ｐＨ ７．０）を加えた後、バッグを慎重に絞って内容物を混合した。混合物又は糞便スラリーをＳｔｏｍａｃｈｅｒ ４００（英国ワージングのSeward）において２３０ｒｐｍで３分間撹拌した。この懸濁液１０ミリリットルをフェノールキャップ（phenolic cap）付きホウケイ酸ガラスチューブに移した。以下の各化合物を先に追加しておいた：
陰性対照：発酵バッファー１０ｍｌ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇ；
ペクチン２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したリンゴペクチン（スペイン国マドリードのSolgar）２００ｍｇ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）＋ペクチン２００：どちらも発酵バッファー１０ｍｌで希釈したリンゴペクチン２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ。

【0118】

基質の入ったチューブを、脱気するため１００℃で１０分間、先にオートクレーブした。発酵チューブをしっかりと閉じ、穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。

【0119】

７２時間後、チューブを滅菌プラスチックチューブに移し、４℃にて４５００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を別のチューブに移し、４℃で１５分間、４５００×ｇで再度遠心分離した。最後に、上清を−２０℃の閉じたバイアルに保存した。

【0120】

実験の内部対照として採取した１名の健康な被験体を除き、各ボランティアから１つずつ、独自の糞便サンプルを使用した。しかしながら、実験で報告された変動のため、この被験体を各実験において異なる被験体と見なした。

【0121】

４．ＤＮＡ抽出
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｓｏｉｌ Ｋｉｔ（ドイツ国デューレンのMacherey-Nagel GmbH &Co.）を使用して、遠心分離前に発酵チューブからＤＮＡを抽出した。簡潔に説明すると、サンプル２５０μｌをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎビーズチューブに入れた。ＤＮＡ回収率を向上させるために、７００μｌのＳＬ１及び１５０μｌのエンハンサー（ＳＸ）を各サンプルに添加した。その後、製造業者の指示に従ってＤＮＡを抽出し、精製した。ゲノムＤＮＡを１００μｌの溶出バッファーで溶出し、使用するまで−２０℃で保存した。抽出物のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（米国のInvitrogen detection Technologies）にて決定した。ｑＰＣＲ分析の前に、ＤＮＡ不含水（free DNA water）でＤＮＡ濃度を８ｎｇ／μｌに調整した。

【0122】

５．短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の分析
糞便インキュベーションに由来する上清２ミリリットルを０．２２μｌの滅菌フィルターに通して新しいチューブに入れた。内部標準として８５ミリリットルのクロトン酸（１００００ｐｐｍ）、更に８５％リン酸１００μｌを加えて、サンプル１．５ｍｌごとに非イオン化サンプルに変換した。バイアルをＧＣ−ＦＩＤシステム（米国カリフォルニア州Agilent）のＤＢ−ＦＦＡＰカラム（米国カリフォルニア州Agilent）に入れた。測定された短鎖脂肪酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸及びヘキサン酸であった。

【0123】

６．糞便サンプルから抽出されたＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
糞便インキュベーションに由来するＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。より具体的には、本発明者らは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆｐｒａ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰｈＧＩ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰｈＧＩＩ）、エシェリキア・コリ（Ｅｃｏ）、ロゼブリア・ホミニス（ＲＯＳ）、Ｂ４６（サブドリグラニュラム・バリアビレ）、及び真正細菌（ＥＵＢ）全体の量を評価した。Ｆｐｒａ、ＰＧｈＩ、ＰＧｈＩＩ、及びＥｃｏの細菌配列をＴａｑｍａｎ（商標）プローブベースアッセイを用いる定量的リアルタイムＰＣＲを使用して定量し、一方でＲＯＳ、Ｂ４６及びＥＵＢをＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎアッセイを用いて定量した。プライマー及びｑＰＣＲ条件は以下の通りとした。

【0124】

【表1】

【0125】

サンプルを同じプレートにて二連で扱った。データ分析では、二連の定量の平均を使用した。各サンプルの細菌存在量は、総ＤＮＡ濃度に対して正規化されたＣｔとして表され、Ｃｔ（サイクル閾値）値は、蛍光シグナルが閾値を超えるために必要なｑ−ＰＣＲサイクルの数として定義される。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸濃度の対数に反比例する。リアルタイムアッセイは４０サイクルの増幅を経る。

【0126】

全ての定量的ＰＣＲは、ＡｒｉａＭｘ ＰＣＲシステム（米国カリフォルニア州サンタクララのAgilentによるStratagene）を使用して実行され、ＡｒｉａＭｘソフトウェアバージョン１．２（米国カリフォルニア州サンタクララのAgilentによるStratagene）を使用して分析された。

【0127】

７．統計学的分析の方法
データの統計学的な正規分布を、コルモゴロフ−スミルノフ検定により分析した。データの統計学的な正規分布があるかどうかに応じて、以下の群を比較するために適切な統計学的検定を使用した。通常のｔ検定を使用して、正規分布した群を比較したのに対して、マン−ホイットニーノンパラメトリック検定を使用して、正規分布のない群を比較した。

【0128】

結果
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）の添加によって引き起こされる腸内微生物叢の改善の可能性を判断するため、これらの患者の真正細菌、Ｂ４６、ロゼブリア・ホミニス、Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ、系統群ＩＩ及びＥ．コリの存在量を５つの異なる基質とのインキュベーション後に調査した。細菌種の定量結果を図１Ａ〜図６Ｃに示す。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）の添加後に短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができる微生物叢の代謝活性の予想される増加を評価するため、酪酸、ヘキサン酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、プロピオン酸、吉草酸、及び酢酸等のＳＣＦＡの濃度も定量した。ＳＣＦＡの定量結果を図７Ａ〜図１３Ｃに示す。

【0129】

健康な（Ｈ）被験体、クローン病（ＣＤ）患者及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の３つの異なるサンプル群において５つの処理の間で統計学的比較を行った。データが正規分布を示さなかったため、処理を比較するためノンパラメトリック検定であるマン−ホイットニー検定を使用した。

【0130】

統計学的な比較の結果
健康な（Ｈ）被験体

【0131】

【表2】

【0132】

陰性対照（基質なし）をＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇと比較すると、Ｂ４６、ロゼブリア・ホミニス、Ｆ．プラウスニッツイ、特にＦ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ等の酪酸産生種の全般的な増加が観察される。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇをペクチン２００ｍｇ（すなわち、リンゴペクチン）と比較すると、ロゼブリア・ホミニスの存在量の増加が観察される。

【0133】

【表3】

【0134】

真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、（陰性対照に対して）Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇにて観察されたロゼブリア・ホミニス及び系統群ＩＩの存在量の統計学的に有意な増加は維持される。同様に、真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇをペクチン２００ｍｇと比較したときに観察されたロゼブリア・ホミニスの存在量の増加も維持される。

【0135】

【表4】

【0136】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）は代謝的に豊富であることがわかっている。特に、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇを陰性対照と比較すると、酪酸及び酢酸の濃度の増加が観察された。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇをペクチン２００ｍｇ（すなわち、リンゴペクチン）と比較すると、酪酸及び酢酸の産生の統計学的に有意な増加が観察された。

【0137】

酪酸濃度の増加は、結腸細胞により良好な環境を提供することが報告されている（Benus R. et al.（非特許文献１３））。同様に、酢酸濃度の増加も、クロストリジウムグループＸＩＶ等の腸内微生物叢に見られる他のクロストリジウム種の栄養素濃度が高くなるため、有益である。クロストリジウムグループＸＩＶは、腸内細菌叢の全細菌のかなりの部分（１０％〜４０％）を占めると報告されている。クロストリジウムは、他の常在微生物集団と相互作用するだけでなく、特定の必須機能を提供することにより、腸のホメオスタシスに重要な役割を果たす（Lopetuso et al., "Commensal Clostridia: leading players in the maintenance of gut homeostasis" Gut Pathogen 2013, 5:23）。

【0138】

潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者

【0139】

【表5】

【0140】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇを陰性対照と比較すると、Ｂ４６、Ｆ．プラウスニッツイ、特にＵＣ患者では欠乏すると記載されているＦ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ等の特定の指標を含む微生物叢の存在量の増加が観察される。

【0141】

【表6】

【0142】

陰性対照と比較したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇについて真正細菌の存在量に対する存在量の値が表される場合、系統群ＩＩの統計学的に有意な増加が維持される。

【0143】

【表7】

【0144】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）は代謝的に豊富であることがわかっている。特に、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇを陰性対照と比較すると、酪酸及び酢酸の濃度の増加が観察された。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００をペクチン２００と比較すると、酢酸の産生の増加が観察された。

【0145】

クローン病（ＣＤ）患者

【0146】

【表8】

【0147】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇを陰性対照と比較すると、ロゼブリア及びＦ．プラウスニッツイ等の特定の種の増加が観察される。

【0148】

【表9】

【0149】

存在量のレベルが真正細菌の存在量に対して表される場合、異なる基質間で統計学的に有意な差は観察されなかった。

【0150】

【表10】

【0151】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）は代謝的に豊富であることがわかっている。特に、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇを陰性対照と比較すると、酪酸及び酢酸の濃度の増加が観察された。

【0152】

実施例３−Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）とＩＢＳ患者及び健康な被験体に由来する糞便サンプルとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
材料及び方法
１．患者、臨床データ及びサンプリング
糞便サンプルを、３名の健康な被験体（Ｈ）及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と診断された３名の患者から得た。それらのボランティアは、大学病院の消化器内科のJosep Trueta医師（スペイン国ジローナ）によって募集された。

【0153】

ＩＢＳ患者として募集された被験体はＩＢＳのローマＩＶ基準に従って診断され、該基準は、下記：
１．排便に関連
２．糞便の頻度の変化に関連
３．糞便の形態（粘稠度）の変化に関連
の２つ以上に関連する少なくとも過去３ヶ月間に平均で週に少なくとも１日の再発性腹痛であり、症状は少なくとも６ヶ月前に開始していなければならない（Lacy et al., Gastroenterology 2016, 150(6), 1393-1407）。

【0154】

既知の胃腸障害のない健康な被験体からなる対照群を、臨床基準に従って募集した。

【0155】

２．サンプルの収集、保存、及び保管
被験体はそれぞれ、１つの糞便サンプルを提供した。これらは、大学病院の消化器内科Josep Trueta医師のところで収集された。簡潔に言えば、サンプルを滅菌尿ポット（ドイツ国ニュームブレヒトのSarstedt）に収集し、室温に維持して、寄託後４時間未満の新鮮なものを使用した。全被験体の全てのサンプルをホモジナイズし、直ちに実験に使用した。

【0156】

３．糞便のインキュベーション
上記のように、ＩＢＳ及び健康な被験体から得られた新鮮なヒトの糞便を用いて糞便発酵を行った。実験室において、糞便サンプルをストマッカー滅菌プラスチックバッグに移し、５：１の発酵バッファー（０．１Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５ｍＭ ＮａＯＨ；ｐＨ ７．０）を加えた後、バッグを慎重に絞って内容物を混合した。混合物又は糞便スラリーをＳｔｏｍａｃｈｅｒ ４００（英国ワージングのSeward）において２３０ｒｐｍで３分間撹拌した。この懸濁液１０ミリリットルをフェノールキャップ付きホウケイ酸ガラスチューブに移した。以下の各化合物を先に追加しておいた：
陰性対照：発酵バッファー１０ｍｌ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ；
プランタゴ・オバタ２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したプランタゴ・オバタ（スペイン国のCinfa）２００ｍｇ；
ペクチン２００：十分なサンプルが提供された場合、発酵バッファー１０ｍｌで希釈したリンゴペクチン（スペイン国マドリードのSolgar）２００ｍｇ。

【0157】

基質の入ったチューブを、脱気するため１００℃で１０分間、先にオートクレーブした。発酵チューブをしっかりと閉じ、穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートした。

【0158】

７２時間後、チューブを滅菌プラスチックチューブに移した後、４℃で３０分間、４５００×ｇで遠心分離した。上清を別のチューブに移し、４℃で１５分間、４５００×ｇで再度遠心分離した。最後に、上清を−２０℃の閉じたバイアルに保存した。

【0159】

各患者から１つずつ、独自の糞便サンプルを使用した。健康な被験体に由来する全てのサンプルは、同じ人によって提供された。しかしながら、実験で報告された変動のため、この被験体を各実験において異なる被験体とみなした。

【0160】

４．ＤＮＡ抽出
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｓｏｉｌ Ｋｉｔ（ドイツ国デューレンのMacherey-Nagel GmbH &Co．）を使用して、遠心分離前に発酵チューブからＤＮＡを抽出した。簡潔に説明すると、サンプル２５０μｌをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎビーズチューブに入れた。ＤＮＡ回収率を向上させるために、７００μｌのＳＬ１及び１５０μｌのエンハンサー（ＳＸ）を各サンプルに添加した。その後、製造業者の指示に従ってＤＮＡを抽出し、精製した。ゲノムＤＮＡを１００μｌの溶出バッファーで溶出し、使用するまで−２０℃で保存した。抽出物のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（米国のInvitrogen detection Technologies）にて決定した。ｑＰＣＲ分析の前に、ＤＮＡ不含水でＤＮＡ濃度を８ｎｇ／μｌに調整した。

【0161】

５．糞便サンプルから抽出されたＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
糞便インキュベーションに由来するＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。より具体的には、本発明者らは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Ｆｐｒａ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群Ｉ（ＰｈＧＩ）、Ｆ．プラウスニッツイの系統群ＩＩ（ＰｈＧＩＩ）、エシェリキア・コリ（Ｅｃｏ）、ロゼブリア・ホミニス（ＲＯＳ）、Ｂ４６（サブドリグラニュラム・バリアビレ）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）（ＡＫＫ）、及び真正細菌（ＥＵＢ）全体の量を評価した。Ｆｐｒａ、ＰＧｈＩ、ＰＧｈＩＩ、及びＥｃｏの細菌配列をＴａｑｍａｎ（商標）プローブベースアッセイを用いる定量的リアルタイムＰＣＲを使用して定量し、一方でＲＯＳ、Ｂ４６及びＥＵＢをＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎアッセイを用いて定量した。プライマー及びｑＰＣＲ条件は以下の通りとした。

【0162】

【表11】

【0163】

サンプルを同じプレートにて二連で扱った。データ分析では、二連の定量の平均を使用した。各サンプルの細菌存在量は、総ＤＮＡ濃度に対して正規化されたＣｔとして表され、Ｃｔ（サイクル閾値）値は、蛍光シグナルが閾値を超えるために必要なｑ−ＰＣＲサイクルの数として定義される。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸濃度の対数に反比例する。リアルタイムアッセイは４０サイクルの増幅を経る。

【0164】

全ての定量的ＰＣＲは、ＡｒｉａＭｘ ＰＣＲシステム（米国カリフォルニア州サンタクララのAgilentによるStratagene）を使用して実行され、ＡｒｉａＭｘソフトウェアバージョン１．２（米国カリフォルニア州サンタクララのAgilentによるStratagene）を使用して分析された。

【0165】

６．統計学的分析の方法
データの統計学的な正規分布を、コルモゴロフ−スミルノフ検定により分析した。データの統計学的な正規分布があるかどうかに応じて、以下の群を比較するために適切な統計学的検定を使用した。通常のｔ検定を使用して、正規分布した群を比較したのに対して、マン−ホイットニーノンパラメトリック検定を使用して、正規分布のない群を比較した。

【0166】

結果
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）の添加によって引き起こされる腸内微生物叢の改善の可能性を判断するため、これらの患者の真正細菌、Ｂ４６、ロゼブリア・ホミニス、Ａ．ムシニフィラ、Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ、系統群ＩＩ及びＥ．コリの存在量を５つの異なる基質とのインキュベーション後に調査した。細菌種の定量結果を図１４Ａ〜図２１Ｂに示す。アッカーマンシア・ムシニフィラはムチン重合体を分解すると説明されている粘液栄養（muconutritive）細菌である（Derrien et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 1469-1476）。

【0167】

統計学的比較は、健康な（Ｈ）被験体及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）患者の２つの異なるサンプル群において４つの処理の間で行われた。データが正規分布を示さなかったため、処理を比較するためノンパラメトリック検定であるマン−ホイットニー検定を使用した。

【0168】

統計学的な比較の結果
健康な（Ｈ）被験体

【0169】

【表12】

【0170】

陰性対照（基質なし）をＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ及びプランタゴ・オバタ２００ｍｇと比較すると、酪酸産生種であるロゼブリア・ホミニスの増加が観察される。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇをペクチン２００ｍｇと比較すると、Ｒ．ホミニスの減少が観察される。さらに、陰性対照（基質なし）をＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ、プランタゴ・オバタ２００ｍｇ及びペクチン２００ｍｇ（すなわち、リンゴペクチン）と比較すると、アッカーマンシア・ムシニフィラの存在量の減少が観察される。

【0171】

【表13】

【0172】

真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇにて観察されたロゼブリア・ホミニスの存在量の統計学的に有意な増加（陰性対照に対する）及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ２００ｍｇに対するペクチン２００ｍｇでのＲ．ホミニスの存在量の有意な減少は維持される。同様に、真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、陰性対照をＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ、プランタゴ・オバタ２００ｍｇ、及びペクチン２００ｍｇと比較したときに観察されたアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量の減少も維持される。さらに、真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、陰性対照をＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇと比較すると、Ｅ．コリは減少する。

【0173】

過敏性腸症候群（ＩＢＳ）患者

【0174】

【表14】

【0175】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ、プランタゴ・オバタ２００ｍｇ、及びペクチン２００ｍｇを陰性対照と比較すると、Ｂ４６、Ｆ．プラウスニッツイ、及びＲ．ホミニス等の酪酸産生菌を含む微生物叢の存在量の増加が観察される。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇをプランタゴ・オバタ２００ｍｇと比較すると、Ａ．ムシニフィラの減少が観察される。

【0176】

【表15】

【0177】

陰性対照と比較した任意の処理について真正細菌の存在量に対する存在量の値が表される場合、観察された統計学的に有意な増加は維持されない。真正細菌に対する相対レベルを決定する場合、プランタゴ・オバタ２００ｍｇ及びペクチン２００ｍｇを陰性対照と比較すると、Ａ．ムシニフィラの存在量の減少が観察される。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇを陰性対照と比較した場合、Ａ．ムシニフィラの存在量の統計学的に有意な減少は観察されない。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇをプランタゴ・オバタ２００ｍｇと比較した場合にもＡ．ムシニフィラの減少が観察される。

【0178】

実施例４．−Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）と糞便サンプルとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション−分析された異なる被験体のディスバイオシス指数
材料及び方法
健康な被験体及び腸障害患者の結腸に存在する微生物叢に対するＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）の効果を確認するため、２つの異なる実験を行った。使用した材料及び方法は両方の実験で同じであった。分析された被験体の初期のディスバイオシス、またサンプルのインキュベーション後の種々の基質の効果を観察するため、３つの異なる指数を計算した。

【0179】

患者、臨床データ及びサンプリング
糞便サンプルは、１６名の健康な被験体（Ｈ）及び腸障害と診断された１４名の患者から得られた。１１名の患者が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と診断され、５名がクローン病（ＣＤ）と診断され、６名が潰瘍性大腸炎（ＵＣ）と診断され、３名の患者が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）と診断された。それらのボランティアは、大学病院の消化器内科のJosep Trueta医師（スペイン国ジローナ）によって募集された。

【0180】

ＩＢＤ患者として募集された被験体は、標準的な臨床的、病理学的及び内視鏡の基準に従って診断され、炎症反応の点でいずれも活動性疾患であった（２５０μｇ／Ｇ超のカルプロテクチンレベル又は０．５μｇ／Ｌ超のプロテインＣ反応性（ＰＣＲ）レベルを伴う）。既知の胃腸障害のない健康な被験体からなる対照群を、臨床基準に従って募集した。

【0181】

ＩＢＳ患者として募集された被験体はＩＢＳのローマＩＶ基準に従って診断され、該基準は、「下記：
１．排便に関連
２．糞便の頻度の変化に関連
３．糞便の形態（粘稠度）の変化に関連
の２つ以上に関連する少なくとも過去３ヶ月間に平均で週に少なくとも１日の再発性腹痛である。症状は少なくとも６ヶ月前に開始していなければならない。」

【0182】

既知の胃腸障害のない健康な被験体からなる対照群は、臨床基準に従って募集された。

【0183】

指数の計算
３つの異なる指数を計算した。
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ／エシェリキア・コリ比（ＦＥ指数）：値が低いほど、被験体のディスバイオシスの程度が高くなる。
酪酸産生細菌／炎症性細菌比（ＢＰ指数）：酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩＩ、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレの総存在量の合計によって計算され、炎症性細菌はエシェリキア・コリの総存在量である。値が低いほど、被験体のディスバイオシスの程度は高くなる。
酪酸塩／酪酸産生細菌比（ＢＢ指数）：酪酸産生細菌は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩＩ、ロゼブリア・ホミニス及びサブドリグラニュラム・バリアビレの総存在量の合計によって計算され、酪酸塩は発酵チューブ内で得られた酪酸塩の濃度である。値が低いほど、酪酸産生細菌の活性は低くなる。

【0184】

３つの指数の値が大きいことが推奨される。

【0185】

サンプルの収集、保存、及び保管に関するプロトコル：糞便インキュベーション、ＤＮＡ抽出、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の分析、及び糞便サンプルから抽出されたＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を本明細書の上記の通り実施した。

【0186】

結果
実験４．１：Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）と、健康な被験体、潰瘍性大腸炎患者、及びクローン病患者に由来する糞便サンプルとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者に由来する糞便サンプルでＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）を比較するため使用した化合物は以下の通りであった：
初期サンプル：インキュベーション処理をしていない初期状態のサンプル；
陰性対照：基質を含まない発酵バッファー１０ｍｌ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）６００ｍｇ；
ペクチン２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したリンゴペクチン（スペイン国マドリードのSolgar）２００ｍｇ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）＋ペクチン２００：どちらも発酵バッファー１０ｍｌで希釈したリンゴペクチン２００ｍｇ及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ。

【0187】

【表16】

【0188】

健康な被験体及び潰瘍性大腸炎におけるいずれかの基質のインキュベーション中にＦＥ指数が増加したことを観察することができ、これは、ディスバイオシスの程度が修正されたことを意味する。しかしながら、クローン病患者では、全ての基質とのインキュベーション後にＦＥ指数が低下した。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。健康な被験体では、ＦＥ指数を分析すると有意差が見られたが（ｐ＝０．０３５）、潰瘍性大腸炎患者又はクローン病患者で観察された差は有意ではなかった（ｐ＝０．１１０及びｐ＝０．５９７）。

【0189】

【表17】

【0190】

陰性対照と比較して、糞便サンプルのインキュベーションに対してペクチン、及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔとペクチンとの組み合わせの両方を使用した場合、健康な被験体で有意差が見られた。また、潰瘍性大腸炎患者にも有意差が見られた。ペクチンインキュベーションは、陰性対照及びＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００と比較した場合、より良好な結果を示した。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）とインキュベートしたサンプルを他のサンプルと比較した場合、クローン病の患者には有意差は見られなかった。

【0191】

【表18】

【0192】

健康な被験体、潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者におけるいずれかの基質のインキュベーション中にＢＰ指数が増加したことを観察することができる。健康な被験体では、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔは、最も高い値を示し、ディスバイオシスの程度を修正する能力がより高い基質であった。潰瘍性大腸炎の場合、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ及びペクチンは、ディスバイオシスの程度の修正に関して同様の能力を示した。しかしながら、クローン病患者では、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔインキュベーションによって得られたＢＰ指数が最も低かった。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。健康な被験体では、ＢＰ指数を分析すると有意差が見られたが（ｐ＝０．００６）、潰瘍性大腸炎患者又はクローン病患者で観察された差は有意ではなかった（それぞれｐ＝０．２７７及びｐ＝０．８３７）。

【0193】

【表19】

【0194】

陰性対照と比較すると、糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔ、ペクチンと組み合わせたＰｒｅｖｉｐｅｃｔ、及びペクチンとインキュベートした場合、健康な被験体には有意差が見られた。また、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔとペクチンとの組み合わせのインキュベーションと比較した場合、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔはより良好な結果を示すことが観察された。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）とインキュベートしたサンプルを他のサンプルと比較した場合、クローン病の患者には有意差は見られなかった。

【0195】

【表20】

【0196】

健康な被験体、潰瘍性大腸炎患者（ペクチンを除く）及びクローン病患者におけるいずれかの基質のインキュベーション中にＢＢ指数が増加したことを観察することができ、これは、サンプル中の酪酸産生細菌の生産性が基質によって向上したことを意味する。全ての被験体（健康な被験体、潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者）において、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔインキュベーション後にＢＢ指数の最高値が見られた。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。潰瘍性大腸炎患者では、ＢＢ指数を分析すると有意差が見られたが（ｐ＝０．０２３）、健康な被験体又はクローン病患者で観察された差は有意ではなかった（それぞれｐ＝０．２５３及びｐ＝０．６３０）。

【0197】

【表21】

【0198】

Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔを糞便サンプルにおいてインキュベートし、陰性対照と比較すると、健康な被験体で有意差が見られた。また、糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔとインキュベートし、ペクチン及び陰性対照と比較すると、潰瘍性大腸炎患者で有意差が見られた。Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔとのインキュベーションでより高い結果が得られた。

【0199】

結論：Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔは、健康な被験体及び潰瘍性大腸炎患者のディスバイオシスの程度（指数ＢＰ）を低下させることができる。さらに、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔは、ＢＢ指数を増加させ、結腸での酪酸塩産生を増強する能力がより高い分析された基質である。

【0200】

実験４．２：Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）と健康な被験体及び過敏性腸症候群患者に由来する糞便サンプルとのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション
過敏性腸症候群患者に由来する糞便サンプル中のＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）を比較するため使用した化合物は以下の通りであった：
陰性対照：発酵バッファー１０ｍｌ；
Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したＰｒｅｖｉｐｅｃｔ（商標）２００ｍｇ；
プランタゴ・オバタ２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したプランタゴ・オバタ（スペイン国のCinfa）２００ｍｇ；
ペクチン２００：発酵バッファー１０ｍｌで希釈したペクチン２００ｍｇ。

【0201】

【表22】

【0202】

健康な被験体におけるいずれかの基質のインキュベーション中にＦＥ指数が増加し、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔインキュベーション後に最高値を示したことを観察することができる。過敏性腸症候群患者では、プランタゴ・オバタインキュベーションでのみＦＥ指数値のみが高かった。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。しかしながら、ＦＥ指数を分析すると、健康な被験体又は過敏性腸症候群患者のいずれにも有意差は見られなかったものの（それぞれｐ＝０．４９２及びｐ＝０．２８２）、健康な被験体又はクローン病患者で観察された差は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。

【0203】

【表23】

【0204】

糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔとインキュベートし、ペクチンと比較すると、過敏性腸症候群患者で有意差が見られた。ペクチンとのインキュベーションでより高い結果が得られた。

【0205】

【表24】

【0206】

健康な被験体におけるいずれかの基質、及び過敏性腸症候群患者におけるほぼ全ての基質のインキュベーション中に、ＢＰ指数が増加したことを観察することができる。全ての処理のうち、健康な被験体ではＰｒｅｖｉｐｅｃｔ処理が最高のＢＰ指数値を示した。しかしながら、過敏性腸症候群の患者では、ＰｒｅｖｉｐｅｃｔはＢＰ指数の最低値を示した。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。ＢＰ指数を分析すると健康な被験体又は過敏性腸症候群患者のいずれについても有意差は見られなかった（それぞれｐ＝０．５８７及びｐ＝０．５７６）。

【0207】

【表25】

【0208】

糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔとインキュベートした場合、健康な被験体又は過敏性腸症候群患者に有意な差は見られなかった。

【0209】

【表26】

【0210】

健康な被験体についてＰｒｅｖｉｐｅｃｔ及びプランタゴ・オバタのインキュベーション中にＢＢ指数が増加したことを観察することができ、これはサンプル中の酪酸産生細菌の生産性が向上したことを意味する。さらに、ペクチンには酪酸生産性を高める能力がないようであった。過敏性腸症候群の患者にとって、プランタゴ・オバタは、酪酸塩産生を増加させる能力を持つ唯一の基質であった。使用した基質間の有意差を観察するため、クラスカル−ウォリス統計検定を行った。健康な被験体で有意差が観察されたが（ｐ＝０．００２）、過敏性腸症候群患者のＢＢ指数を分析した際には有意な差は見られなかった（ｐ＝０．１２０）。

【0211】

【表27】

【0212】

糞便サンプルをＰｒｅｖｉｐｅｃｔとインキュベートし、プランタゴ・オバタと比較すると、健康な被験体において有意差がみられた。しかしながら、プランタゴ・オバタとのインキュベーションでより高い結果が得られた。

【0213】

結論：Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔは、ペクチンと同様に、健康な被験体で酪酸産生種及びその生産性を選択的に高めることができる。過敏性腸症候群の患者では、Ｐｒｅｖｉｐｅｃｔは生産性についてはペクチンと同様の効果を示したが、指数になんらの重要な変更もなかった。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]