特許 6901571 ナノ炭素−鉄複合システム及びその組成物、調製方法並びに使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6901571

(24)【登録日】2021年6月21日

(45)【発行日】2021年7月14日

(54)【発明の名称】ナノ炭素−鉄複合システム及びその組成物、調製方法並びに使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/295 20060101AFI20210701BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20210701BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20210701BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210701BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/295

   A61K47/69

   A61K47/04

   A61K47/12

   A61K47/38

   A61K47/32

   A61K47/36

   A61K9/10

   A61P35/00

【請求項の数】14

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2019-537307(P2019-537307)

(86)(22)【出願日】2018年1月26日

(65)【公表番号】特表2020-504155(P2020-504155A)

(43)【公表日】2020年2月6日

(86)【国際出願番号】CN2018074361

(87)【国際公開番号】WO2018137708

(87)【国際公開日】20180802

【審査請求日】2019年7月9日

(31)【優先権主張番号】201710063374.1

(32)【優先日】2017年1月26日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519407161

【氏名又は名称】四川瀛瑞医薬科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＣＨＵＡＮ ＹＩＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】唐 小海

(72)【発明者】

【氏名】邱 宇

(72)【発明者】

【氏名】黄 源芳

(72)【発明者】

【氏名】夏 萍芳

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００７６８３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／００４５４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０３−５０２５７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３１８３３１１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３２３０６０４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 International Journal of Nanomedicine，２０１５年，Vol.10，p.3581-3591

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／２９５

Ａ６１Ｋ ９／１０

Ａ６１Ｋ ４７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複合システムは、キャリアとしてカルボキシ基を持つナノ炭素を採用し、鉄塩における鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンとからなる複合構造である複合システムであって、前記複合システムの粒子径は５０ｎｍ〜５００ｎｍの間にあり、好ましくは９０ｎｍ〜３００ｎｍであり、より好ましくは１００ｎｍ〜２５０ｎｍであり、さらに好ましくは１２０〜１８０ｎｍであり、前記複合システムには、クエン酸ナトリウムがさらに含まれ、前記クエン酸ナトリウムと鉄塩における鉄元素との質量比は０．１〜３であり、好ましくは、クエン酸ナトリウムと鉄塩における鉄元素との質量比は１〜２であり、固形腫瘍治療薬物の調製、好ましくは、肝臓癌、肺癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、又は卵巣癌治療薬物の調製、より好ましくは、乳癌、子宮頸癌、及び肝臓癌治療薬物の調製に使用されることを特徴とする、ナノ炭素−鉄複合システム。

【請求項2】

前記鉄塩において、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．３６〜１３．６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．５〜８．３３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２．７３〜５．４６ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１に記載の複合システム。

【請求項3】

前記複合システムのｐＨは３．０〜６．０であり、好ましくは、前記複合システムのｐＨは３．５〜４．５であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の複合システム。

【請求項4】

前記鉄塩は、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、鉄サッカラート、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、コハク酸鉄（ＩＩ）、ソルビトール鉄、フマル酸鉄（ＩＩ）から選択されるいずれか１種又は複数種であり、好ましくは、前記鉄塩は硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、又は塩化鉄（ＩＩＩ）であり、より好ましくは、前記鉄塩は硫酸鉄（ＩＩ）であることを特徴とする、請求項２に記載の複合システム。

【請求項5】

前記ナノ炭素と鉄塩における鉄元素との質量比は４０：１〜３：１であり、好ましくは３０：１〜５：１であり、より好ましくは１８：１〜６：１であることを特徴とする、請求項１〜請求項２、請求項４のいずれか１項に記載の複合システム。

【請求項6】

前記ナノ炭素において、炭素の含有量は８６〜９８％、水素の含有量は０．５〜２．５％、酸素の含有量は１．０〜１０．０％であり、好ましくは、炭素の含有量は９４〜９７％、水素の含有量は０．７〜１．０％、酸素の含有量は２．０〜４．５％であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の複合システム。

【請求項7】

前記ナノ炭素は、カーボンナノ粒子、カーボンナノチューブ、カーボン量子ドット、グラフェン、フラーレン、カーボンナノロッド、カーボンナノファイバーのうちの少なくとも１種又は複数種を含み、好ましくは、前記ナノ炭素はカーボンナノ粒子であり、より好ましくは、前記ナノ炭素はナノカーボンブラックＣ_４０であることを特徴とする、請求項６に記載の複合システム。

【請求項8】

前記ナノ炭素におけるカルボキシ基の含有量は０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜２．０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．０３ｍｍｏｌ／ｇ〜０．７ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、請求項７に記載の複合システム。

【請求項9】

前記ナノ炭素と鉄塩とが静電作用、錯化作用、及びファンデルワールス力などの複数種の相互作用によって結合されてなる複合構造であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の複合システム。

【請求項10】

前記クエン酸ナトリウムと鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンとが錯体を形成していることを特徴とする、請求項１に記載の複合システム。

【請求項11】

前記複合システムには、懸濁剤がさらに含まれ、前記懸濁剤は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、デキストランから選択されるいずれか１種又は複数種であり、好ましくはポリビニルピロリドンＫ_３０であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の複合システム。

【請求項12】

前記懸濁剤の濃度は１０〜４０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、濃度は１５〜２５ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１１に記載の複合システム。

【請求項13】

方法１又は方法２で請求項１に記載のナノ炭素−鉄複合システムを調製する方法であって、
方法１は、
ａ）酸処理したナノ炭素を懸濁剤の生理食塩水溶液に均一に分散させて、懸濁液を調製し、クエン酸ナトリウムで前記懸濁液をｐＨ値６．５〜８．０、好ましくはｐＨ値６．８〜７．２に調整する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られたナノ炭素の懸濁液を鉄塩と混合し、空気遮断下で、鉄塩が完全に溶解するまで撹拌して、混合液を得る工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合液を高圧ホモジナイザーで均質化して、均質液を得て、そのｐＨが３．０〜６．０、好ましくは、均質液のｐＨが３．５〜４．５であることが測定され、ナノ炭素−鉄複合システムが得られる工程であって、好ましくは、均質圧力が３０〜１２０ＭＰａであり、より好ましくは、均質圧力が９０ＭＰａである工程と、
を含み、
方法２は、
ａ）酸処理したナノ炭素を懸濁剤の生理食塩水溶液に均一に分散させ、５分間均一化して、懸濁液を調製し、クエン酸ナトリウムで前記懸濁液をｐＨ値６．５〜８．０、好ましくはｐＨ値６．８〜７．２に調整し、そして、高圧ホモジナイザーで均質化して、得られる混合液をバイアルに詰めて使用に備える工程であって、好ましくは、均質圧力が３０〜１２０ＭＰａであり、より好ましくは、均質圧力が９０ＭＰａである工程と、
ｂ）鉄塩を生理食塩水に溶解させ、バイアルに詰め、凍結乾燥させ、そして窒素ガスを充填し密封保存して、固体の鉄塩を得る工程と、
ｃ）使用する時に、工程ｂ）における固体を溶解させてから、工程ａ）で得られた混合液と均一に混合し、そのｐＨが３．０〜６．０、好ましくは、ｐＨが３．５〜４．５であることが測定され、ナノ炭素−鉄複合システムが得られる工程と、
を含むことを特徴とする、ナノ炭素−鉄複合システムの調製方法。

【請求項14】

請求項１−１２のいずれか１項に記載のナノ炭素−鉄複合システムを含む注射用懸濁液であって、前記ナノ炭素−鉄複合システムは、ポリビニルピロリドンとクエン酸ナトリウムとを含む混合液に均一かつ安定に分散されており、好ましくは、前記ポリビニルピロリドンがポリビニルピロリドンＫ_３０であり、好ましくは、前記複合システムにおいて、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．３６〜１３．６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記複合システムにおいて、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．５〜８．３３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２．７３〜５．４６ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、注射用懸濁液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナノ薬物の分野に関し、具体的には、ナノ炭素−鉄複合システム及びその組成物、調製方法、並びに腫瘍治療への使用に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、癌は人類の命を脅かす一番危険な疾患の１つであり、世界中で新たに増加する癌患者は毎年８００万人に達し、中国だけで年間３００万人の患者が発生する。固形腫瘍の場合、従来の主な治療手段は、手術による癌化組織の切除や、化学療法による癌細胞の消滅、又はその両方の組み合わせによる処置である。一般的に、手術による切除や化学療法は、いずれも比較的効果的な癌治療手段である。しかし、今まで、癌の治療において、手術で切除した後、腫瘍細胞が他の部位へ転移して再発した場合、化学療法では、化学療法の薬物が正常細胞と腫瘍細胞とを無差別に攻撃して、深刻な毒性・副作用を引き起こし、さらに、腫瘍細胞が化学療法の薬物に対して耐性（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、ＭＤＲ）を有するようになるという課題に直面している。

【0003】

ＰＤ−１、ＣＡＲ−Ｔなどに代表される免疫細胞療法は、上記のジレンマを解決する方法の１つであり、世界中で積極的に臨床研究が進められており、特定の腫瘍を克服するための究極の解決策になることが期待されている。しかし、免疫細胞療法は、その遺伝子レベルでの精度のゆえ、今のところ、特定の遺伝子に対して驚くべき臨床治療効果がある一方、別の遺伝子に対しては、全く無効である。より汎用的な腫瘍治療法については、全世界の科学者たちによってより多くの研究や模索を行う必要がある。

【0004】

免疫細胞療法の他、２０１２年にＤｉｘｏｎらは、低分子弾性タンパク質（ｅｒａｓｔｉｎ）の、発癌遺伝子であるＲＡＳの突然変異を有する腫瘍細胞を殺す作用機序を研究した際、新しい鉄依存的なアポトーシスを見出した。ＲＡＳは最も一般的な癌遺伝子であり、それがコードするＲＡＳタンパク質は低分子量Ｇタンパク質であり、その活性はＧＴＰとの結合に依存しており、突然変異したＲＡＳタンパク質がＧＴＰを加水分解する活性を失うことによって、ＲＡＳ経路の下流の関連遺伝子が活性化され、細胞の癌化が引き起こされる。ＲＡＳの突然変異した腫瘍細胞において、トランスフェリン受容体１を上方制御するとともに、フェリチンを下方制御することで、細胞内の鉄含有量を増加させることができる。この低分子でＲＡＳが発現されている細胞を処置することで、細胞は、「酸化的で、非アポトーシス的な」メカニズムで死亡する。Ｄｉｘｏｎらは、大量の研究に基づいて、この細胞死の形態がアポトーシスや、ネクローシス、オートファジーと異なる新規な形態であることを認識し、この鉄依存的な細胞死の形態を「フェロトーシス（Ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ）」と名付けた（参考文献１）。

【0005】

さらなる研究では、細胞表面トランスフェリン受容体と細胞内グルタミン刺激代謝経路は、細胞死の過程において決定的な役割を果たしていることが分かった。グルタミンの阻害は、フェロトーシスにおいて不可欠な部分であり、虚血・再灌流による心臓損傷を軽減することができ、これらのことから、フェロトーシスは関連疾患を治療するために有望な方法であることが示唆されている（参考文献２）。

【0006】

上記の研究に基づいて、「フェロトーシス」の作用機序が確認された後、２０１６年に、あるアメリカの腫瘍研究所は、メラノーマを標的とするポリペプチドによって機能化処理され、飢餓状態の癌細胞と担癌マウスにおいて「フェロトーシス」と呼ばれるプログラム細胞死を誘導することができる、超微細（直径１０ｎｍ未満）のポリエチレングリコール被覆シリコンナノ粒子を採用した。さらなる研究において、脂質活性酸素種（ＲＯＳ）の検出及び鉄キレート剤（ＤＦＯ）を利用した実験によって、シリコンナノ粒子はフェロトーシスによって、アポトーシスを誘導することが証明された（参考文献３）。

【0007】

さらに、２０１６年にＮａｔｕｒｅの関連誌で発表された総説論文「Ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ： ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」では、２０１２年にフェロトーシスが提出された後のフェロトーシスに関する研究結論を包括的にレビューしてまとめ、フェロトーシスの形態学的特徴は、ミトコンドリアが小さくなり、ミトコンドリア膜密度が大きくなり、ミトコンドリアクリステが減少又は消失し、ミトコンドリア外膜が破裂することであることを指摘した。癌細胞や特定の正常細胞（例えば、尿細管細胞、ニューロン、線維芽細胞及びＴ細胞）において、フェロトーシスは、実験化合物（例えば、ｅｒａｓｔｉｎ、Ｒａｓ選択的致死性低分子３及びブチオニンスルホキシイミン）又は臨床薬物（例えば、スルファサラジン、ソラフェニブ及びアーテスネート）によって誘導されうる。ミトコンドリア電位依存性アニオンチャネル及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの活性化、小胞体ストレスの上方制御及びシステイン／グルタミン酸アンチポータータンパク質の阻害は、フェロトーシスの誘導に関与する。この過程は、脂質過酸化生成物や鉄代謝由来の致死活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積を特徴とし、鉄キレート剤（例えば、デフェロキサミン及びデフェロキサミンメシル酸塩）や脂質過酸化防止剤（例えば、ｆｅｒｒｏｓｔａｔｉｎ、ｌｉｐｒｏｘｓｔａｔｉｎ及びｚｉｌｅｕｔｏｎ）によって阻害され得る。

【0008】

フェロトーシスにおいてアポトーシスを直接引き起こすＲＯＳは、その発生について、細胞内の鉄濃度の増加によって、細胞内Ｆｅｎｔｏｎ（フェントン）反応の進行が促進されることで、酸化性の極めて強いＲＯＳが発生し、細胞内に蓄積され、アポトーシスに繋がると考えるのが現時点で比較的合理的な解釈である（参考文献５）。

【0009】

今までの研究によると、鉄は人体において最も含有量の多い微量元素であり、人体の各臓器や組織に広く分布しており、ＤＮＡの合成、電子伝達、酸素輸送などの過程において重要な役割を果たしていることが分かっている。鉄、及び脳損傷や神経変性疾患が発生する時の細胞死に関与する現象はずっと前から注目されていた。パーキンソン病及びアルツハイマー病の患者の脳内において、いずれも鉄沈着が認められており、鉄キレート剤は、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＰ＋）又はβ−アミロイド（Ａβ）による神経毒性モデルに対して、保護作用を有する。フェロトーシスに関する研究の進行につれて、フェロトーシスは各種神経変性疾患に存在するか否かが確認され、薬物により神経細胞のフェロトーシスを調節することによって、このような神経系疾患の発症や発展を制御することができる。各種誘導剤によって、フェロトーシスが細胞に作用してアポトーシスを引き起こすように誘導することは、新しい腫瘍治療の概念であり得る。

【0010】

さらに、細胞鉄は、マクロファージの機能的選択も誘導しうることが研究で分かった。マクロファージは、かなりの可塑性及び多能性を有する細胞群であり、インビトロ・インビボの異なる微小環境の影響下で、主に、抗炎症性亜種のＭ２マクロファージから炎症誘発性亜種のＭ１マクロファージへの転換という顕著な機能的差異を示す。ナノ酸化鉄とマクロファージとを共培養した際、過酸化水素が１１倍、ヒドロキシラジカルが１６倍増加したことが分かっており、ナノ酸化鉄がマクロファージを介してＲＯＳの発生を増加させ、癌細胞の細胞毒性を増加させたことが示唆された。ナノ酸化鉄がＭ１マクロファージを誘導するか否かをさらに確認するために、共培養物からマクロファージを単離したところ、炎症誘発性Ｍ１型反応に関連するｍＲＮＡが増加し、Ｍ１関連のＴＮＦα及びＣＤ８６マーカーが顕著に上方制御され、Ｍ２関連のＣＤ２０６及びＩＬ１０マーカーが顕著に低下したことが分かった。インビボでは、ナノ酸化鉄は、マウスの皮下腺癌の増殖を有意に阻害した。さらに、腫瘍細胞を静脈注射する前にナノ酸化鉄を静脈注射すると、肝転移が予防された。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び組織病理学の研究から、観察された腫瘍増殖阻害は、腫瘍組織における炎症誘発性Ｍ１マクロファージの増加を伴ったことが分かった（参考文献６）。

【0011】

鉄によるマクロファージの機能的選択の調節に関する研究において、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）における鉄がＴＨＰ１細胞由来Ｍ２マクロファージから高いＣＤ８６＋、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α＋）のマクロファージサブタイプへの表現型転移を誘導することが分かった。Ｍ２マクロファージのこのような表現型転移は、Ｍ１マクロファージの特徴的標識である、細胞内のフェリチン及びカテプシンＬのレベルの上方制御を伴う（参考文献７）。

【0012】

従来の鉄に関連する医薬品のうち、注射によって非経口的に吸収され、重度の鉄欠乏や、鉄欠乏性貧血、腸の鉄吸収不全を治療する、Ｖｅｎｏｆｅｒ(登録商標)などの鉄サッカラート、Ｆｅｒｒｌｅｃｉｔなどのグルコン酸ナトリウム鉄（ＩＩＩ）錯体、デキストラン鉄、並びに新しいＦｅｒｕｍｏｘｙｔｏｌ（ナノ酸化鉄）などの市販が承認されており、いずれも鉄欠乏の患者の体内に微量元素の鉄を補うことで、貧血の問題を解決するためのものである。これらの製品は、血液へ直接静脈注射され、人体の血液における鉄元素の含有量を調節して、鉄欠乏の問題を解決するものである。しかしながら、細胞内トランスフェリンの存在により、このような鉄は細胞内へ取り入れられ、フェロトーシスを誘導することはできない。

【0013】

さらに、ナノ鉄に関する臨床開発について、例えば、ドイツの科学者が新しく出願した特許ＷＯ２０１５／００７７３０Ａ１では、フェロトーシスを阻害する阻害剤が提案されており、フェロトーシスによるＲＯＳストレス神経機能障害疾患を解決することが期待されている。
このように、鉄含有製剤は抗腫瘍薬の開発にとって重要な意義を有している。

【0014】

現在、腫瘍治療の研究方向は２つの方向に発展しており、一つは知能化、即ち正常細胞と腫瘍細胞とを知能的に認識することであり、もう一つは、抗腫瘍薬の毒性・副作用を低減し、耐性を低減ないし解消し、化学療法の投薬量を低減することである。長年の研究により、ナノ粒子は、細胞膜のバリア作用を通過し、直接細胞核に進入して腫瘍細胞に作用できることが分かった。グラフェン、磁性ナノ粒子、カーボンナノチューブなどのようなナノ粒子を薬物担体として用いることで、精度の高い薬物送達が図られ、例えば、中国特許ＣＮ１０５９４４１１０Ａにおいて、架橋剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、標的分子としてトランスフェリン（Ｔｆ）を用いて、共有結合によって標的ナノ担体を形成する、ナノカーボン量子ドット補助薬物送達担体システムが開示されている。

【0015】

しかしながら、一般的な標的ナノ担体薬は、調製・動物実験において、どのように薬物の担持量を増やすか、また、どのように薬物を精度よく標的で放出するか、という無視できない課題がある。ナノ担体薬によって標的薬物送達を行うには、まず、薬物の担持量を増加させ、即ち、ナノ担体を一定量の薬物分子と結合させなければならず、また、ナノ担体に担持された薬物分子は、臨床治療効果を達成するために、ナノ担体によって体内へ入り、標的に到着した後、自動的に落下し、一定の濃度にならなければならない。

【0016】

また、細胞は鉄を能動的に排出する機構を有することで、細胞内に十分に高い鉄濃度を生じさせることができず、したがって、フェロトーシスや炎症誘発性マクロファージの分極化を効果的に引き起こして、癌細胞死を誘導することはできない。そのため、鉄の細胞内への進入効率を向上させて、短時間で細胞の鉄濃度を比較的高くし、フェロトーシスや炎症誘発性マクロファージの分極化を誘導するために、適切な濃度のＦｅ製剤を担持して薬物担持システムを構成する、適切な標的ナノ薬物担持製剤を探すことが急務である。これら２つの作用機序において、癌細胞死を誘導する主な作用機序は、炎症誘発性マクロファージを分極化させて、一連の炎症因子やＲＯＳを生じさせ、さらにｃａｓｐａｓｅ−３の活性を活性化させて、癌細胞をアポトーシスによって死滅させることである。

【0017】

参考文献１：Ferroptosis: An Iron-Dependent Form of Nonapoptotic Cell Death, Cell 149, 1060-1072, May 25, 2012;

【0018】

参考文献２：Glutaminolysis and Transferrin Regulate Ferroptosis, Molecular Cell 59, 298-308, July 16, 2015;

【0019】

参考文献３：Ultrasmall nanoparticles induce ferroptosis innutrient-deprived cancer cells and suppress tumour growth, Nature Technology, 26 Sep, 2016;

【0020】

参考文献４：Ferroptosis: process and function, Cell Death and Differentiation 23, 369-379, 2016;

【0021】

参考文献５：Generation of hydrogenperoxide primarily contributes to the induction of Fe(II)-dependentapoptosis in Jurkat cells by (-)-epigallocatechin gallate, Carcinogenesis, 25(9), 1567-1574, 2004;

【0022】

参考文献６：Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues, Nature NanoTechnology, Sep 26 , 2016;

【0023】

参考文献７：SPION primes THP1 derived M2 macrophages towards M1-likemacrophages, Biochemical and Biophysical Research Communications 441, 737-742, 2013.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0024】

本発明は、従来腫瘍治療に存在する問題点に着目し、Ｍ１型マクロファージの分極化による癌細胞アポトーシス誘導、及びナノ粒子の薬物送達の正確性に基づいて、インビトロ細胞及び動物実験の両方で、固形腫瘍に対する良好な阻害作用が認められたナノ炭素担持鉄の複合システムを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0025】

本発明は、担体として酸処理したナノ炭素と、鉄塩における鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンとからなる複合構造である複合システムであって、前記複合システムの粒子径は５０ｎｍ〜５００ｎｍの間にあり、好ましくは９０ｎｍ〜３００ｎｍであり、より好ましくは１００ｎｍ〜２５０ｎｍであり、さらに好ましくは１２０〜１８０ｎｍであることを特徴とする、ナノ炭素−鉄複合システムを提供する。

【0026】

前記鉄塩において、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．３６〜１３．６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．５〜８．３３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２．７３〜５．４６ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0027】

前記鉄塩は、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、鉄サッカラート、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、コハク酸鉄（ＩＩ）、ソルビトール鉄、フマル酸鉄（ＩＩ）から選択されるいずれか１種又は複数種であり、好ましくは、前記鉄塩は硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、又は塩化鉄（ＩＩＩ）であり、より好ましくは、前記鉄塩は硫酸鉄（ＩＩ）であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0028】

前記複合システムのｐＨは３．０〜６．０であり、好ましくは、前記複合システムのｐＨは３．５〜４．５であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0029】

前記ナノ炭素と鉄元素との質量比は４０：１〜３：１であり、好ましくは３０：１〜５：１であり、より好ましくは１８：１〜６：１であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0030】

前記ナノ炭素において、炭素の含有量は８６〜９８％、水素の含有量は０．５〜２．５％、酸素の含有量は１．０〜１０．０％であり、好ましくは、炭素の含有量は９４〜９７％、水素の含有量は０．７〜１．０％、酸素の含有量は２．０〜４．５％であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0031】

前記ナノ炭素は、カーボンナノ粒子、カーボンナノチューブ、カーボン量子ドット、グラフェン、フラーレン、カーボンナノロッド、カーボンナノファイバーのうちの少なくとも１種又は複数種を含み、好ましくは、前記ナノ炭素はカーボンナノ粒子であり、より好ましくは、前記ナノ炭素はナノカーボンブラックＣ_４０であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0032】

前記ナノ炭素におけるカルボキシ基の含有量は０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜２．０ｍｍｏｌ／ｇであり、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜１．０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．０３ｍｍｏｌ／ｇ〜０．７ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0033】

前記ナノ炭素と鉄塩とが静電作用、錯化作用、及びファンデルワールス力などの複数種の相互作用によって結合されてなる複合構造であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0034】

前記複合システムには、クエン酸ナトリウムがさらに含まれ、前記クエン酸ナトリウムと鉄塩における鉄元素との質量比は０．１〜３であり、好ましくは、クエン酸ナトリウムと鉄塩における鉄元素との質量比は１〜２であり、好ましくは、前記クエン酸ナトリウムと鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンとが錯体を形成していることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。

【0035】

前記複合システムには、懸濁剤がさらに含まれ、前記懸濁剤は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、デキストランから選択されるいずれか１種又は複数種であり、好ましくはポリビニルピロリドンＫ_３０であることを特徴とする、前記いずれか１つに記載の複合システム。懸濁剤は、分散媒の粘度を増大させて、粒子の沈降速度を低下させる、または粒子の親水性を増加させることができる添加剤である。

【0036】

前記懸濁剤の濃度は１０〜４０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、濃度は１５〜２５ｍｇ／ｍｌである。

【0037】

本発明は、さらに、方法１又は方法２でナノ炭素−鉄複合システムを調製する方法であって、方法１は、
ａ）酸処理したナノ炭素を懸濁剤の生理食塩水溶液に均一に分散させて、懸濁液を調製し、クエン酸ナトリウムで前記懸濁液をｐＨ値６．５〜８．０、好ましくはｐＨ値６．８〜７．２に調整する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られたナノ炭素の懸濁液を鉄塩と混合し、空気遮断下で、鉄塩が完全に溶解するまで撹拌して、混合液を得る工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合液を高圧ホモジナイザーで均質化して、均質液を得て、そのｐＨが３．０〜６．０、好ましくは、均質液のｐＨが３．５〜４．５であることが測定され、ナノ炭素−鉄複合システムが得られる工程であって、好ましくは、均質圧力が３０〜１２０ＭＰａであり、より好ましくは、均質圧力が９０ＭＰａである工程と、
を含み、

【0038】

方法２は、
ａ）酸処理したナノ炭素を懸濁剤の生理食塩水溶液に均一に分散させ、５分間均一化して、懸濁液を調製し、クエン酸ナトリウムで前記懸濁液をｐＨ値６．５〜８．０、好ましくはｐＨ値６．８〜７．２に調整し、そして、高圧ホモジナイザーで均質化して、得られる混合液をバイアルに詰めて使用に備える工程であって、好ましくは、均質圧力が３０〜１２０ＭＰａであり、より好ましくは、均質圧力が９０ＭＰａである工程と、
ｂ）鉄塩を生理食塩水に溶解させ、バイアルに詰め、凍結乾燥させ、そして窒素ガスを充填し密封保存して、固体の鉄塩を得る工程と、
ｃ）使用する時に、工程ｂ）における固体を溶解させてから、工程ａ）で得られた混合液と均一に混合し、そのｐＨが３．０〜６．０、好ましくは、ｐＨが３．５〜４．５であることが測定され、ナノ炭素−鉄複合システムが得られる工程と、
を含むことを特徴とする、ナノ炭素−鉄複合システムの調製方法を提供する。

【0039】

本発明はさらに、前記ナノ炭素−鉄複合システムの、固形腫瘍治療薬物の調製、好ましくは、肝臓癌、肺癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、又は卵巣癌治療薬物の調製、より好ましくは、乳癌、子宮頸癌、及び肝臓癌治療薬物の調製への使用を提供する。

【0040】

本発明はさらに、前記いずれか１つに記載のナノ炭素−鉄複合システムを含む注射用懸濁液であって、前記ナノ炭素−鉄複合システムは、ポリビニルピロリドンとクエン酸ナトリウムとを含む混合液に均一かつ安定に分散されており、好ましくは、前記ポリビニルピロリドンはポリビニルピロリドンＫ_３０であり、好ましくは、前記複合システムにおいて、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．３６〜１３．６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記複合システムにおいて、鉄（ＩＩ）イオン及び／又は鉄（ＩＩＩ）イオンの濃度は１．５〜８．３３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは２．７３〜５．４６ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、注射用懸濁液を提供する。

【発明の効果】

【0041】

本発明において提供されるナノ炭素−鉄複合システムに基づいて、理論的分析、インビトロ細胞実験、及び動物実験を行った結果、本発明は、以下のような好適な効果を有することが分かった。

【0042】

１．良好な安定性、生体適合性を有する安定したナノ炭素−鉄複合システムを形成した。

【0043】

２．ナノ炭素を担体として鉄を輸送する輸送効果が好ましい。細胞自体は鉄を能動的に排出する機構を有することから、細胞内に十分に高い鉄濃度を生じさせることができず、従って、フェロトーシスや炎症誘発性マクロファージの分極化を効果的に引き起こして、癌細胞死を誘導することはできない。ナノ炭素を担体として用いれば、鉄の細胞内への進入効率を向上させて、短時間で細胞の鉄濃度を比較的高くし、フェロトーシスを生じさせるとともに炎症誘発性マクロファージの分極化を誘導して、癌細胞アポトーシスを促進することができる。

【0044】

３．この製剤は、ＳＭＭＣ７７２１肝臓癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、ＳＧＣ−７９０１胃癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｈｅｌａ子宮頸癌細胞、ＴＰＣ−１甲状腺癌細胞、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞、マウス由来肝臓癌Ｈ２２細胞を含むあらゆる固形腫瘍に対して、強い阻害作用を有し、なかでも、乳癌、子宮頸癌、及び肝臓癌に対する治療効果により優れる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1a】酸処理したナノ炭素のＸＰＳスペクトルである。

【図1b】酸処理したナノ炭素−鉄複合システムのＸＰＳスペクトルである。

【図2】ナノ炭素及びナノ炭素−鉄複合システムの赤外分光スペクトルである。

【図3】（ａ１）は陰性対照群の細胞の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であるり、（ｂ１）はナノ炭素群の細胞の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ｃ１））は硫酸鉄（ＩＩ）群の細胞の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ｄ１）はナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群の細胞の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ａ２）は陰性対照群のＨ２２腫瘍の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ｂ２）はナノ炭素群のＨ２２腫瘍の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ｃ２）は硫酸鉄（ＩＩ）群のＨ２２腫瘍の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、（ｄ２）はナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨ２２腫瘍の鉄イオンのプルシアンブルー染色の図であり、

【図4】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨ２２腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図5】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＨ２２腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図6】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨ２２腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図7】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＨ２２腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図8】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＡ５４９腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図9】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＡ５４９腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図10】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＡ５４９腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図11】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＡ５４９腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図12】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨＣＴ１１６腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図13】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＨＣＴ１１６腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図14】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨＣＴ１１６腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図15】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＨＣＴ１１６腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図16】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨｅｌａ腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図17】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＨｅｌａ腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図18】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨｅｌａ腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図19】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＨｅｌａ腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図20】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図21】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図22】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図23】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図24】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＧＣ−７９０１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図25】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＳＧＣ−７９０１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図26】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＧＣ−７９０１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図27】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＳＧＣ−７９０１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図28】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＫＯＶ３腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図29】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＳＫＯＶ３腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図30】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＫＯＶ３腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図31】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＳＫＯＶ３腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図32】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＭＭＣ−７７２１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図33】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＳＭＭＣ−７７２１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図34】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＳＭＭＣ−７７２１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図35】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＳＭＭＣ−７７２１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図36】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＴＰＣ−１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図37】ナノ炭素−鉄サッカラート複合システム群のＴＰＣ−１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図38】ナノ炭素−グルコン酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＴＰＣ−１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図39】ナノ炭素−クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム複合システム群のＴＰＣ−１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図40】２つの方法で調製したナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨ２２腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図41】２つの方法で調製したナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＨｅｌａ腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図42】２つの方法で調製したナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍の増殖体積のグラフである。

【図43】ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群がＨｅｌａ細胞に作用した場合の細胞生存率の図である。

【図44】（ａ）はナノ炭素のマウスリンパ節に対するトレース効果であり、（ｂ）はカーボンナノチューブのマウスリンパ節に対するトレース効果であり、（ｃ）はナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のマウスリンパ節に対するトレース効果であり、（ｄ）はカーボンナノチューブ−硫酸鉄（ＩＩ）複合システム群のマウスリンパ節に対するトレース効果である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

一．ナノ炭素−鉄複合システムの調製
以下の試料を調製した。各試料の原料組成の詳細を以下の１−１６に示す。

【0047】

１． ナノ炭素＋硫酸鉄（ＩＩ）

【0048】

２． ナノ炭素＋塩化鉄（ＩＩ）

【0049】

３．ナノ炭素＋塩化鉄（ＩＩＩ）

【0050】

４． ナノ炭素＋硫酸鉄（ＩＩＩ）

【0051】

５． カーボンナノチューブ＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物

【0052】

６．グラフェン＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物

【0053】

７．カーボン量子ドット＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物

【0054】

８．フラーレン＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物

【0055】

９．活性炭＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物

【0056】

１０．ナノ炭素＋水酸化鉄（ＩＩＩ）

【0057】

１１．ナノ炭素＋鉄サッカラート

【0058】

１２．ナノ炭素＋コハク酸鉄（ＩＩ）

【0059】

１３．ナノ炭素＋グルコン酸鉄（ＩＩ）

【0060】

１４．ナノ炭素＋ソルビトール鉄

【0061】

１５．ナノ炭素＋フマル酸鉄（ＩＩ）

【0062】

１６．ナノ炭素＋クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム

【0063】

各試料の具体的な調製プロセスは以下の通りである（試料Ａは方法１によって調製され、試料Ｂは方法２によって調製された）。
１．ナノ炭素＋硫酸鉄（ＩＩ）
試料１Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０１ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0064】

試料１Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０１ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。
試料２Ａ

【0065】

生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0066】

試料２Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0067】

試料３Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量２．００ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0068】

試料３Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量２．００ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0069】

試料４Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を６７．８ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0070】

試料４Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を４００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0071】

試料５Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を４００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0072】

試料５Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を８００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を５４２．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0073】

試料６Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を８００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を４０６．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0074】

試料６Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を１６００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を８１３．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0075】

試料７Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を１０００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を６７７．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0076】

試料７Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２０００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５５．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0077】

試料８Ａ
生理食塩水１００ｍｌにＰＶＰＫ３０を２０００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５００ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0078】

試料８Ｂ
生理食塩水１００ｍｌにＰＶＰＫ３０を２０００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５０００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１０ｍｇ採り、生理食塩水１０００ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、そして窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0079】

試料９Ａ
生理食塩水１０００ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０００ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５５０ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0080】

試料９Ｂ
１０００ｍｌ生理食塩水にＰＶＰＫ３０を２００００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１００ｍｇ採り、生理食塩水１００００ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0081】

試料１０Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を１００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0082】

試料１０Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を１００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0083】

試料１１Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を４００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0084】

試料１１Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を４００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0085】

試料１２Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径９０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力１２０ｍｐａ）を５回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0086】

試料１２Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径９０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力１２０ｍｐａ）を５回行ない、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0087】

試料１３Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１２０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力１１０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0088】

試料１３Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１２０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力１１０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0089】

試料１４Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１８０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力８０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0090】

試料１４Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１８０ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力８０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0091】

試料１５Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径３００ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力６０ｍｐａ）を３回行ない、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0092】

試料１５Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径３００ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力６０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0093】

試料１６Ａ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径５００ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力３０ｍｐａ）を２回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0094】

試料１６Ｂ
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径５００ｎｍ）を５００ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節し、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力３０ｍｐａ）を２回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する（第１成分）。固体である硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を２７１．０ｍｇ採り、生理食塩水１０ｍＬに溶解させたものをバイアルに詰め、凍結乾燥させ、窒素ガスを充填して密封保存する（第２成分）。使用する時に、第１成分と第２成分とを混合する。

【0095】

２．ナノ炭素＋塩化鉄（ＩＩ）
試料１７
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩ）を４８．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0096】

試料１８
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩ）を９６．９ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0097】

試料１９
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩ）を２９０．７ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0098】

３．ナノ炭素＋塩化鉄（ＩＩＩ）
試料２０
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩＩ）を６５．９ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0099】

試料２１
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩＩ）を１３１．８ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0100】

試料２２
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、塩化鉄（ＩＩＩ）を３９５．４ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0101】

４．ナノ炭素＋硫酸鉄（ＩＩＩ）
試料２３
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩＩ）を４８．７ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0102】

試料２４
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩＩ）９７．５ｍｇを加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0103】

試料２５
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素粉末（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩＩ）を２９２．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0104】

５．カーボンナノチューブ＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
試料２６
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、カーボンナノチューブ（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0105】

６．グラフェン＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
試料２７
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、グラフェン（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0106】

７．カーボン量子ドット＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
試料２８
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、カーボン量子ドット（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0107】

８．フラーレン＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
試料２９
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、フラーレン（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0108】

９．活性炭＋硫酸鉄（ＩＩ）七水和物
試料３０
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、活性炭（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物を１３５．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0109】

試料３１
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、水酸化鉄（ＩＩＩ）を５１．９ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0110】

試料３２
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、水酸化鉄（ＩＩＩ）を１５５．７ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0111】

１0．ナノ炭素＋鉄サッカラート
試料３３
生理食塩水９．３ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、鉄サッカラートを０．７ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0112】

試料３４
生理食塩水８．６ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、鉄サッカラートを１．４ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0113】

試料３５
生理食塩水５．８ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、鉄サッカラートを４．２ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0114】

１1．ナノ炭素＋コハク酸鉄（ＩＩ）
試料３６
生理食塩水９．７５ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、コハク酸鉄（ＩＩ）を０．２５ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0115】

試料３７
生理食塩水９．５ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、コハク酸鉄（ＩＩ）を０．５ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0116】

試料３８
生理食塩水８．５ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、コハク酸鉄（ＩＩ）を１．５ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0117】

１2．ナノ炭素＋グルコン酸鉄（ＩＩ）
試料３９
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、グルコン酸鉄（ＩＩ）を１０８．７ｍｇ加えて、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0118】

試料４０
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、グルコン酸鉄（ＩＩ）を２１７．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0119】

試料４１
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、グルコン酸鉄（ＩＩ）を６５２．５ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0120】

１3．ナノ炭素＋ソルビトール鉄
試料４２
生理食塩水９．４５ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、ソルビトール鉄を０．５５ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0121】

試料４３
８．９ｍｌ生理食塩水にＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、ソルビトール鉄を１．１ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0122】

試料４４
６．７ｍｌ生理食塩水にＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、ソルビトール鉄を３．３ｍＬ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0123】

１4．ナノ炭素＋フマル酸鉄（ＩＩ）
試料４５
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、フマル酸鉄（ＩＩ）を４１．４ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0124】

試料４６
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、フマル酸鉄（ＩＩ）を８２．８ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0125】

試料４７
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、フマル酸鉄（ＩＩ）を２４８．４ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0126】

１5．ナノ炭素＋クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム
試料４８
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを１１８．９ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0127】

試料４９
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを２３７．９ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0128】

試料５０
生理食塩水１０ｍｌにＰＶＰＫ３０を２００ｍｇ加え、室温で十分に溶解した後、ナノ炭素（カルボキシ基の含有量０．０７ｍｍｏｌ／ｇ、粒子径１６０ｎｍ）を２５０ｍｇ加え、十分に撹拌して均一に分散させ、ｐＨ値が６．８〜７．２の間になるようにクエン酸ナトリウムを（約５０ｍｇ）加えて調節した後、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを７１３．７ｍｇ加え、室温で均一になるように十分に混合し、その後、高圧均質化（圧力９０ｍｐａ）を３回行い、均質化終了後、懸濁液をバイアルに詰め、窒素ガスを充填して密封保存する。

【0129】

上記試料は、同様のプロセスで、異なる原料と異なる鉄塩とを組み合わせたものであり、ナノ炭素−鉄複合システムの構造や構成をＸＰＳスペクトル及び赤外分光スペクトルで調べたところ、ナノ炭素−鉄複合システムはかなり一致した構造を有していることが分かった。従って、各鉄塩はいずれも本発明を実現でき、ここで一々列挙はしない。

【0130】

図１に示すように、ナノ炭素のＸＰＳスペクトルと複合システムのＸＰＳスペクトルとの比較から、Ｆｅの添加によって、ナノ炭素のＯの新たなピークが現れ、ＦｅとＯとが相互作用を起こしたしていることを示している。ここで、ナノ炭素中の、Ｆｅと相互作用したＯの割合は５２．５％であり、元素構成によると、複数のＯ原子が同一のＦｅと相互作用していることを示している。ナノ炭素において、Ｏは主にＣ−Ｏ単結合（Ｃ−ＯＨ又はＣ−Ｏ−Ｃ）として存在しており、Ｃ−Ｏ−Ｃは完全にＣ−Ｏ−にイオン化され難く、−ＯＨのみが一部−Ｏ−にイオン化され得る。従って、ＦｅとＯとの相互作用には、静電相互作用（Ｆｅ^２＋／Ｆｅ^３＋と−Ｏ−とによるもの）とＦｅとＯとの間の錯化作用の両方があり、多配位相互作用である。

【0131】

元素分析マッピングから、表１７に示すように、ナノ炭素が鉄を吸着してから、組成への影響が少ないことが分かるが、これは、Ｆｅがナノ炭素の表面に吸着されたことによって、少量の水がＦｅに配位し、Ｏの含有量がわずかに増加したからであると推測される。

【0132】

図2に示す赤外分光スペクトルのように、ナノ炭素鉄複合物は、ナノ炭素にない１２１６ｃｍ^−１、１１２８ｃｍ^−１、６４０ｃｍ^−１、６０８ｃｍ^−１、４７１ｃｍ^−１のピークを有する。一般的に、６０４ｃｍ^−１、４４３ｃｍ^−１に新たな吸収ピークを有することは、Ｆｅ−Ｏ結合があることを示す（１２１６ｃｍ^−１、１１２８ｃｍ^−１はクエン酸鉄（ＩＩＩ）錯体の吸収ピークである）。

【0133】

ＸＰＳ、元素マッピング、赤外分光スペクトルの解析結果をまとめると、ナノ炭素−鉄複合物は、静電相互作用、錯化作用、及びファンデルワールス力等の複数の相互作用によって結合されてなる複合物であることが確認できた。

【0134】

粒子径と濃度の選択について、実験で使用されたナノ炭素は、酸による酸化処理によって表面に一定量のカルボキシ基を含有するものであり、そのカルボキシ基の含有量は０．０１ｍｍｏｌ／ｇ〜０．１０ｍｍｏｌ／ｇの間にある。カルボキシ基の含有量が０．０３ｍｍｏｌ／ｇ未満であると、懸濁系の安定性が低くなり、沈降しやすくなり、安定した懸濁液を形成するとができない。カルボキシ基は親水性基であるので、含有量が多いほど、懸濁系の安定性にとって有利になり、ポリビニルピロリドンＫ３０（ＰＶＰＫ３０）の含有量を増やして、懸濁系の安定性をある程度向上させることもできるが、それとともに、系の粘度も顕著に増加してしまい、注射投与に不利となる。カルボキシ基の含有量が０．０８ｍｍｏｌ／ｇより高くなると、懸濁液の色はより明るくなり（黒から薄黒へ）、これは、ナノ炭素のトレース効果の観察に不利となる。従って、総合的に考慮すると、好ましくは、カルボキシ基の含有量を０．０３ｍｍｏｌ／ｇ〜０．０８ｍｍｏｌ／ｇの範囲とすることが合理的である。

【0135】

ナノ炭素−鉄複合システムは、製剤の安定性と薬理学的効果との両方から、懸濁液粒子径について要求がある。腫瘍組織の毛細血管径が５０ｎｍ程度であり、リンパ管の孔径が１５０ｎｍ程度であるため、ナノ炭素鉄複合物の粒子径が５０ｎｍ未満であると、毛細血管に入りやすくなり、血中の鉄濃度に影響する一方、粒子に対するマクロファージの食作用は選択的であって、粒子径が大きいほど、粒子がマクロファージに飲み込まれやすくなり、また、ナノ炭素の粒子径が３００ｎｍを超えると、懸濁液の安定性が悪くなり、放置中に沈降や凝集が起こりやすく、安定性の要求を満足できなくなる。なお、リンパ管の開口は１５０ｎｍ程度であるので、３００ｎｍを超える大粒子径のナノ炭素鉄粒子は、リンパ管を塞ぎ、その後取り込まれるナノ炭素鉄粒子がリンパ管を通過できず、トレース効果や治療効果を損なう可能性が高い。したがって、製剤の安定性と薬理学的効果の観点から、ナノ炭素−鉄複合物の粒子径を９０ｎｍ〜３００ｎｍの間に制御し、なかでも、より好ましい態様では１００ｎｍ〜２５０ｎｍであり、さらに好ましい態様では１２０ｎｍ〜１８０ｎｍの間である。

【0136】

調製プロセスで添加されるクエン酸ナトリウムは、懸濁液のｐＨ値を調整することに加えて、もう一つより大きな用途は、注射後に、ナノ炭素−鉄複合物が有効成分である鉄を細胞内へ輸送できるように、懸濁液が一定の流動性を有することを確保する抗凝固剤として用いられることである。

【0137】

前記複合物は、第一鉄と第二鉄を含み、「フェロトーシス」及びマクロファージＭ２のＭ１への分極化によって、アポトーシスを誘導し抗癌作用を発揮する主な活性成分である。複合物中の鉄は、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、鉄サッカラート、コハク酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、デキストラン鉄、ソルビトール鉄、フマル酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムなどの有機鉄塩又は無機鉄塩由来のものであってよく、好ましい態様では、硫酸鉄（ＩＩ）を用いる。

【0138】

ナノ炭素−鉄複合システムにおいて、ナノ炭素は大きな比表面積と多数の空隙を有し、大きな吸着容量を有するとともに、表面における酸素含有基と鉄イオンとの間に、ファンデルワールス力、錯化作用、及び静電相互作用が存在し、炭素と鉄との吸着結合強度が適切であり、ナノ炭素鉄複合物が腫瘍のマクロファージに飲み込まれてから、２価鉄イオンがフェントン反応を起こす。したがって、ナノ炭素−鉄複合物は可溶性の２価鉄塩が好ましく、より好ましい態様では硫酸鉄（ＩＩ）である。

【0139】

本発明は、カーボンナノ粒子と硫酸鉄（ＩＩ）との質量比の範囲を含むものであり、これは、ナノ炭素鉄複合物が抗癌効果を発揮するのに重要な要素であって、主に薬理学的実験によって得られるものである。高投与量の鉄は、インビトロ・インビボの腫瘍細胞に対して直接的な細胞毒性を有するので、鉄の投与量を適切に選択しなければならない。多くの実験により、ナノ炭素と鉄との質量比が９．２：１であると、腫瘍細胞に対して高い阻害率を有することが確認されたので、薬理学的実験で、ナノ炭素と鉄との比を３：１〜４０：１とする。その結果、ナノ炭素と鉄との比が５：１〜３０：１であると、腫瘍に対して５０〜８０％と高い腫瘍阻害率を有することが示された。ナノ炭素と鉄との比が３０：１を超えると、腫瘍阻害率が低くなり、ナノ炭素と鉄との比が５：１未満であると、わずかでも毒性がある。したがって、組み合わせの質量比の好ましい範囲は５：１〜３０：１であり、より好ましい態様では６：１〜１８：１である。
上記の理論分析を基に、上記試料に対して以下のように細胞実験及び動物実験を行った。

【0140】

１．実験材料：
１）細胞株
ＳＭＭＣ７７２１肝臓癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞、ＳＧＣ−７９０１胃癌細胞、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｈｅｌａ子宮頸癌細胞、ＴＰＣ−１甲状腺癌細胞、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞、マウス由来肝臓癌Ｈ２２細胞

【0141】

２）細胞培地
細胞用ＤＭＥＭ培地、ＲＭＰＩ１６４０培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞消化液トリプシン、ペニシリン・ストレプトマイシン混合物、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）

【0142】

３）実験動物
ＢａｌＢ／ｃ−ｎｕマウス、雌、４〜６週齢、体重２０±２ｇ。実験中自由に摂食摂水。毎日１２時間光照射、マウス５匹／ケージ、独立送風隔離ケージで飼育。

【0143】

クリーングレードの近交系の昆明マウス、雌、６−７週齢、体重２０±２ｇ。実験中自由に摂食摂水。毎日１２時間光照射、ケージ（５匹／ケージ）は集中換気システムによって通気。

【0144】

４）実験用薬品及び主な機器設備
ナノ炭素−鉄懸濁液（ナノ炭素：鉄イオン＝９．２：１）、ナノ炭素懸濁液、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、鉄サッカラート、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、シスプラチン注射液、０．９％塩化ナトリウム注射液、プルシアンブルー染色キット、ヌクレアファストレッド染色液、キシレン、無水エタノール、塩酸、中性バルサム、脱水機、包埋機、病理スライサー、スライドドライヤー、高速遠心機、送風乾燥箱、恒温水槽、倒立型蛍光顕微鏡、生物光学顕微鏡、恒温インキュベータ、純水装置、オートクレーブ、クリーンベンチ、マイクロプレートリーダー、電子天秤

【0145】

２．実験方法：
１）細胞実験
対数期で増殖する細胞を採取し、細胞懸濁液の濃度を調整し、１ウェルあたり１００μＬずつ加えて、測定される細胞の密度が１×１０^３〜１０^４個／ウェルになるように播種した（周辺部のウェルは無菌ＰＢＳで充填された）。５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間インキュベートし、濃度勾配を有する（ナノ炭素１２５、６２．５、１５．６３、３．９１μｇ／ｍＬ、鉄イオン１３．６５、６．８３、１．７１、０．４３μｇ／ｍＬを含む）ナノ炭素鉄溶液を加え、重複ウェルを３つにした。そして、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で４８時間インキュベートした。１ウェルあたりＣＣＫ８溶液を１０μＬずつ加え、引き続き２時間培養した。マイクロプレートリーダーのＯＤ＝４５０ｎｍのところで、各ウェルの吸光度の値を測定した。なお、陰性対照群、同濃度ナノ炭素対照群、及び同濃度鉄剤対照群を設けた。

【0146】

対数期で増殖する細胞を採取し、細胞懸濁液の濃度を調整し、６ウェルプレートを取り、細胞懸濁液を１ウェルあたり１ｍＬずつ加え、細胞数を３×１０^４個にした。５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間インキュベートし、濃度勾配を有する（ナノ炭素１２５、６２．５、１５．６３、３．９１μｇ／ｍＬ、鉄イオン１３．６５、６．８３、１．７１、０．４３μｇ／ｍＬを含む）ナノ炭素鉄溶液を加え、重複ウェルを３つにした。そして、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で４８時間インキュベートした。細胞を消化しカウントし、なお、陰性対照群、同濃度ナノ炭素対照群、及び同濃度鉄剤対照群を設けた。

【0147】

２）腫瘍増殖阻害実験
対数増殖期の細胞を採取し、細胞懸濁液の濃度を３×１０^７個／ｍＬに調整し、細胞をヌードマウスの右上肢に０．１ｍＬ／匹（細胞数約３×１０^６個を含む）で皮下接種し、接種したマウスの腫瘍体積が平均１００ｍｍ^３になったとき、担癌マウスを無作為に、陰性対照群（０．９％塩化ナトリウム注射液）、ナノ炭素対照群、鉄剤対照群、ナノ炭素鉄懸濁液実験群、シスプラチン対照群（腹腔内注射、投与量５ｍｇ／ｋｇ）にヌードマウス８匹ずつ分けた。上記の各薬物を腫瘍内へ注射した。体積＝（長さ×幅^２）／２の式で体積を算出し、腫瘍体積の変化を記録した。

【0148】

Ｈ２２担癌マウスの乳白色の濃厚な腹水を抽出し、細胞数を３×１０^７個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を０．１ｍＬずつ（細胞数約３×１０^６個を含む）昆明マウスの右上肢に皮下接種し、接種したマウスの腫瘍体積が平均１００ｍｍ^３になったとき、担癌マウスを無作為に、陰性対照群（０．９％塩化ナトリウム注射液）、ナノ炭素対照群、鉄剤対照群、ナノ炭素−鉄懸濁液実験群、シスプラチン対照群（腹腔内注射、投与量５ｍｇ／ｋｇ）に８匹ずつ分けた。上記の各薬物を腫瘍内へ注射した。体積＝（長さ×幅^２）／２の式で体積を算出し、腫瘍体積の変化を記録した。

【0149】

３）リンパ節転移阻害実験
対数増殖期の細胞を採取し、細胞懸濁液の濃度を３×１０^７個／ｍＬに調整し、細胞を接種量０．０５ｍＬずつ（細胞数約１．５×１０^６個を含む）ヌードマウスの左後肢足蹠に皮下接種し、癌リンパ節転移マウスモデルを得た。腫瘍の直径が６〜８ｍｍになって、潰瘍や壊死がない場合にマウスを処置した。マウスを無作為に、陰性対照群（０．９％塩化ナトリウム注射液）、ナノ炭素対照群、鉄剤対照群、ナノ炭素鉄懸濁液実験群の４群に１０匹ずつ分けた。接種の１０日後、マウスを屠殺し、膝窩リンパ節を採集・秤量・固定し、病理学的検査を行った。

【0150】

Ｈ２２担癌マウスの乳白色の濃厚な腹水を抽出し、細胞数を３×１０^７個／ｍＬに調整し、細胞懸濁液を０．０５ｍＬずつ（細胞数約１．５×１０^６個を含む）昆明マウスの左後肢足蹠に皮下接種し、癌リンパ節転移マウスモデルを得た。腫瘍の直径が６〜８ｍｍになって、潰瘍や壊死がない場合にマウスを処置した。マウスを無作為に陰性対照群（０．９％塩化ナトリウム注射液）、ナノ炭素対照群、鉄剤対照群、ナノ炭素鉄懸濁液実験群の４群に１０匹ずつ分けた。接種の１０日後、マウスを屠殺し、膝窩リンパ節を採集・秤量・固定し、病理学的検査を行った。

【0151】

４）鉄イオン細胞内分布実験
対数期で増殖する細胞を採取し、細胞懸濁液の濃度を調整し、６ウェルプレートを取り、各ウェルをカバーガラスを覆って、細胞懸濁液を１ｍｌずつ加え、１ウェルあたりの細胞を３×１０^４個とした。５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間インキュベートし、濃度１２５：１３．６５μｇ／ｍＬのナノ炭素鉄溶液を加え、重複ウェルを３つにした。そして、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で、４８時間インキュベートした。各ウェルに４％パラホルムアルデヒド溶液を１ｍｌずつ加えて、３０分間固定し、プルシアンブルー染色を行った。

【0152】

Ｈ２２皮下腫瘍実験では、３週間の観察が終わってから、陰性群、ナノ炭素群、硫酸鉄（ＩＩ）群、及びナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）群の腫瘍を採集して固定し、プルシアンブルー染色を行って腫瘍内の鉄イオンを観察した。

【0153】

５）マウスリンパ節トレース実験
ＫＭマウスの足蹠に薬物を５０ｕｌ注射し、１０分間後、マウスを屠殺し、その膝窩リンパ節、総腸骨リンパ節、大動脈周囲リンパ節を解剖し、採点し、写真を撮影した。採点基準について、リンパ節全体が黒染された場合、１点とし、一部黒染された場合、０．５点とし、黒染なしの場合、０点とする。

【0154】

３．実験結果
１）細胞結果：
また、各癌細胞に対する、ナノ炭素と、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム及び鉄サッカラートとの混合物の阻害作用を調べた結果、４種類の鉄剤のうち、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）混合物の阻害作用が最も強く、Ｈｅｌａ細胞、ＳＭＭＣ−７７２１肝臓癌細胞、Ｈ２２肝臓癌細胞に対する効果がもっと良好で、細胞生存率が４９．５４％〜６１．２６％、即ち阻害率が３９．７４％〜５０．４６％であったことが分かった。結果を表１８〜２１に示す。図４３に、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）がＨｅｌａ子宮頸癌細胞に作用してから４８時間後の細胞生存率を示し、４９．５４％であった。

【0155】

【0156】

【0157】

【0158】

【0159】

腫瘍増殖阻害結果：
なお、各癌細胞移植皮下腫瘍に対する、ナノ炭素と、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、及び鉄サッカラートとの混合物の阻害作用を調べた結果、４種類の鉄剤のうち、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）混合物の阻害作用が最も強く、各癌細胞に対する腫瘍阻害率が５０〜７３％であり、なかでも、Ｈ２２肝臓癌細胞に対する皮下腫瘍阻害作用が最も強く、７３％に達しており、結果を図４に示す。９種類の癌細胞皮下移植腫瘍に対する４種類の鉄剤の増殖阻害作用を図４〜図３９に示す。ナノ炭素単体、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、鉄サッカラート、及びナノ炭素グルコン酸鉄（ＩＩ）、ナノ炭素クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、ナノ炭素鉄サッカラートは、９種類の腫瘍の増殖に対してほぼ阻害作用がなかったのに対して、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）は９種類の腫瘍に対する腫瘍阻害率がいずれも５０％以上になった。なお、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）の異なる質量比における腫瘍に対する増殖阻害作用を比較した。例えば、表２２に示すように、ナノ炭素の濃度が２５ｍｇ／ｍＬである場合、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）の質量比が２：１〜３０：１であると、腫瘍阻害率が５０％〜８０％で、良好であるが、質量比が２：１であると、毒性が大きく、質量比が５：１未満であると、やや毒性があり、質量比が３０：１を超えると、腫瘍増殖阻害作用に劣り、したがって、５：１〜３０：１とすることが考えられ、より好ましくは６：１〜１８：１である。

【0160】

ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システムの調製には２つの方法があるので、Ｈ２２肝臓癌細胞、Ｈｅｌａ子宮頸癌細胞、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞で、２つの方法の治療効果を比較し、結果を図４０−４２に示す。２つの方法によって調製されたナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）複合システムはいずれも３種類の癌細胞に対して良好な阻害作用を有し、かつ２つの方法の間に有意差はない。

【0161】

【0162】

なお、各癌細胞リンパ節転移に対する、ナノ炭素と、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、及び鉄サッカラートとの混合物の阻害作用を調べた結果、４種類の鉄剤のうち、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）混合物の阻害作用が最も強く、転移リンパ節の重量が有意に軽減され、転移率が有意に減少したことが示され、Ｈ２２、Ａ５４９、ＨＣＴ、Ｈｅｌａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＧＣ−７９０１、ＳＫＯＶ３、ＳＭＭＣ−７７２１、ＴＰＣ−１を含む９種類の腫瘍細胞に対する動物体内での阻害作用について、詳しい動物実験の比較結果を表２３に示す。ナノ炭素単体、硫酸鉄（ＩＩ）、グルコン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、鉄サッカラートは、転移リンパ節に対して阻害作用を有さず、ナノ炭素グルコン酸鉄（ＩＩ）、ナノ炭素クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムもリンパ節に対して阻害作用を有さず、ナノ炭素鉄サッカラートはＨ２２、ＴＰＣ−１リンパ節転移に対して阻害作用を有し（Ｐ＜０．０５）、ナノ炭素硫酸鉄（ＩＩ）は９種類のリンパ節転移の全てに対して阻害作用を有する。

【0163】

注：「＊」は陰性群と比較してＰ＜０．０５、「＊＊」は陰性群と比較してＰ＜０．０１であることを示す。

【0164】

細胞実験において、陰性群（ａ１）、ナノ炭素群（ｂ１）、及び硫酸鉄（ＩＩ）群（ｃ１）では、染色された鉄イオンが見られず、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）群（ｄ１）では、染色された鉄イオンが多く見られた。動物の腫瘍において、陰性群（ａ２）及びナノ炭素群（ｂ２）では、鉄イオンの存在が見られず、硫酸鉄（ＩＩ）群（ｃ２）では、鉄イオンが極僅かに見られたが、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）群の腫瘍（ｄ２）では、大量の鉄イオンの存在が見られた。結果を図３に示す。ナノ炭素−鉄複合システムは鉄を細胞内へ効率的に輸送し、細胞内の鉄の濃度を増加させることができることが示唆された。

【0165】

本発明者は、適切な担体を選別すために、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）とカーボンナノチューブ−硫酸鉄（ＩＩ）との間で、マウスリンパ節に対するトレース性を比較した。マウスリンパ節トレースの結果、ナノ炭素、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）によるトレースが良好な結果になったが、カーボンナノチューブ、カーボンナノチューブ−硫酸鉄（ＩＩ）によるトレースが劣る結果になり、結果を図４４に示し、採点結果を表２４に示す。ナノ炭素によるトレースが非常に良好な結果になり、３つのリンパ節ステーションがすべて黒染され、ナノ炭素−硫酸鉄（ＩＩ）によるトレースも良好な結果になり、３つのリンパ節ステーションはすべて黒染されたが、黒染されたリンパ節の黒さがナノ炭素より薄く、カーボンナノチューブによるトレース性が悪く、膝窩リンパ節のみが一部黒染され、総腸骨リンパ節及び大動脈周囲リンパ節に対してトレース性を有さず、カーボンナノチューブ−硫酸鉄（ＩＩ）はトレース性を有さず、これらのことから、担体としてナノ炭素を選択する。

【0166】

【0167】

なお、上記内容は説明を目的とするものに過ぎず、本発明の実施形態を限定するものではなく、上記実施例を参照して本発明を詳しく説明したが、本発明は当業者よって変更又は同等に置き換えられ得ることが理解されるべきであり、本発明の精神及び範囲を逸脱しない、いかなる変更又は部分的な置換は全て、本発明の特許請求の範囲に含まれる。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】