特許 6902235 核酸の送達のためのリポソーム製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6902235

(24)【登録日】2021年6月23日

(45)【発行日】2021年7月14日

(54)【発明の名称】核酸の送達のためのリポソーム製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/127 20060101AFI20210701BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20210701BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20210701BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210701BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/127

   A61K31/7088

   A61K47/36

   A61K47/24

   A61K47/28

   A61P35/00

   A61K31/713

   A61K31/7105

   A61K31/711

   A61K47/18

   A61K47/14

   A61K48/00

【請求項の数】13

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2020-18811(P2020-18811)

(22)【出願日】2020年2月6日

(62)【分割の表示】特願2016-573909(P2016-573909)の分割

【原出願日】2015年6月25日

(65)【公開番号】特開2020-79287(P2020-79287A)

(43)【公開日】2020年5月28日

【審査請求日】2020年2月6日

(31)【優先権主張番号】62/017,276

(32)【優先日】2014年6月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507253749

【氏名又は名称】ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ピア，ダン

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５３１４６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１３１９９５（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびリン脂質に結合したＰＥＧ−アミンを含む脂質膜と、
ｂ）前記リポソーム内に被包された核酸と、
ｃ）６００〜１０００ＫＤの範囲の分子量を有するヒアルロン酸であって、前記ＰＥＧ−アミンに結合しているヒアルロン酸と、
を含む、核酸を送達するためのリポソームであって、
前記ヒアルロン酸は、リポソームの外部表面をコーティングしている、
リポソーム。

【請求項2】

前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ；モノカチオン性脂質 Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ Ｏ−（２Ｒ−１，２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデカニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ν−（Ν’，Ν’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＬＫＤ（Ο，Ο’−ジラウリル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ο，Ο’−ジミリスチル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイル（ｄｉｏｌｃｙｌ）グリセロール、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ウイオコイル（Ｕｉｏｌｃｏｙｌ）−３−トリメチルアンモニオプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｃ））、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰからなる群から選択される、または、
前記膜安定化脂質が、コレステロール、リン脂質、セファリン、スフィンゴ脂質、およびグリセロ糖脂質からなる群から選択される、または、
リポソームが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群から選択されるホスファチジルアミンをさらに含む、または、
リポソームが、ＤＭＧ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン；ＰＥＧ−ｃＤＳＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジステアリルオキシ−プロピルアミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の追加的なＰＥＧ誘導体をさらに含む、または、
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの修飾形態からなる群から選択され、前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、または、
リポソームが、５０ｎｍ〜３００ｎｍの直径を有する、
請求項１に記載のリポソーム。

【請求項3】

前記脂質膜が、
ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン；
ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン；
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン；または
ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン；
を含む、請求項１に記載のリポソーム。

【請求項4】

前記脂質膜が、
ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）；
ＤＬｉｎＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）；
ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）；
ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）；
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）；または
ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）；
を含む、請求項１に記載のリポソーム。

【請求項5】

請求項１に記載のリポソームを複数含む組成物。

【請求項6】

前記リポソームが、標的部位に核酸を送達でき、前記標的部位が、細胞、組織、臓器、および微生物からなる群から選択され、前記標的細胞が、ＣＤ４４受容体を有する、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

局所投与または経口、非経口、および局所からなる群から選択される経路を介した投与に適した剤形の、請求項５に記載の組成物を含む医薬組成物。

【請求項8】

癌の治療用の請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記癌が、腺癌および多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

核酸の送達のためのヒアルロン酸でコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、前記方法が、
ａ）有機溶媒中で、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびリン脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を得るステップと、
ｂ）ステップａ）の脂質混合物に、核酸を含む水溶液を導入するステップにより、リポソームを作製するステップと、
ｃ）前記混合物に６００〜１０００ＫＤの範囲の分子量を有するヒアルロン酸を添加するステップと
を含む、方法。

【請求項11】

前記脂質の粒子が、５０ｎｍ〜３００ｎｍの直径を有する、または、
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ；モノカチオン性脂質 Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ Ｏ−（２Ｒ−１，２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデカニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ν−（Ν’，Ν’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＬＫＤ（Ο，Ο’−ジラウリル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ο，Ο’−ジミリスチル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイル（ｄｉｏｌｃｙｌ）グリセロール、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ウイオコイル（Ｕｉｏｌｃｏｙｌ）−３−トリメチルアンモニオプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｃ））、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰからなる群から選択される、または、
前記膜安定化脂質が、コレステロール、リン脂質、セファリン、スフィンゴ脂質、およびグリセロ糖脂質からなる群から選択される、または、
前記方法が、ホスファチジルアミンを混合することをさらに含み、前記ホスファチジルアミンが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）から選択される、または、
前記方法が、１つまたは複数の追加的なＰＥＧ誘導体を混合することをさらに含み、前記追加的なＰＥＧ誘導体が、ＤＭＧ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン；ＰＥＧ−ｃＤＳＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジステアリルオキシ−プロピルアミン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

酸性緩衝液にヒアルロン酸を溶解し、架橋剤を添加することにより、前記ヒアルロン酸を活性化して、活性化ヒアルロン酸を形成する、または、
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、または、
前記核酸が酸性緩衝液中にある、
請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

核酸の送達のための、ヒアルロン酸でコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、
ａ）脂質相を形成するステップであって、
ｉ）有機溶媒中、カチオン性脂質、膜安定化脂質、および脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）緩衝液に前記脂質混合物を懸濁して多層小胞を作製するステップと
を含む、ステップと、
ｂ）
ｉ）前記核酸とともに、ステップａ）の脂質相をインキュベートするステップと、
ｉｉ）前記混合物に６００〜１０００ＫＤの範囲の分子量を有するヒアルロン酸を添加するステップと
により、前記リポソームを作製するステップと
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｓｉＲＮＡ分子などの核酸の効率的な送達および癌などの様々な病態を治療するための、カチオン性脂質を含むリポソーム、同カチオン性脂質を含む組成物、それらの調製方法、および使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

望ましい標的部位への核酸の効率的な送達は、多くの重要な研究で焦点が当てられている。標的部位に導入すると、核酸は、標的部位で生物学的な作用を直接的または間接的に行うことができる。一部の例では、核酸の送達は、標的部位に核酸を送達するように設計されている担体を利用する場合がある。標的部位に送達され得る例示的な核酸として、たとえばデオキシリボヌクレオチド核酸（ＤＮＡ）、および例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（ＡＳ−ＲＮＡ）などのリボヌクレオチド核酸（ＲＮＡ）などが挙げられる。

【0003】

細胞へのｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの送達では、従来法のトランスフェクション法が一般的に使用されている。ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの送達は、２つの群：局所性または全身性に分類することができる。細胞送達および局所送達は、細胞の細胞質でのｓｉＲＮＡのインターナリゼーション、放出、および集積の必要性に対処しているが、動物全体の全身性送達は、たとえば血液成分とのｓｉＲＮＡの相互作用、毛細血管内での捕捉、細網内皮性細胞による取り込み、ＲＮａｓｅによる分解、解剖学上の障壁（肝臓、脾臓など、および腎臓によるろ過）、免疫の刺激、血管から標的組織への滲出、組織の中の浸透などの、さらなる問題を強いる。

【0004】

様々な方法および担体が、ｓｉＲＮＡ分子の全身性送達に関して提案されている。この方法および担体として、ｓｉＲＮＡの受動的な送達、またはｓｉＲＮＡの標的化した送達が挙げられる。当該分野で述べられている例示的な担体として、安定した核酸‐脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、中性リポソーム、脂質付加グリコサミノグリカン粒子（Ｇａｇｏｍｅｒｓ）、リピドイド含有リポソーム、ペグ化リポソーム、アテロコラーゲン、コレステロール‐ｓｉＲＮＡ、動的ポリ結合体、ＰＥＩナノプレックス（ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ）、抗体‐プロタミン融合タンパク質、アプタマー‐ｓｉＲＮＡ、標的化カチオン性リポソーム、およびシクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）が挙げられる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｅｒ （２０１０）， Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） ａｎｄ Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ． （２０１３）により論評）。たとえば、Ｌｉｕらによる刊行物は、ＲＰＥ細胞およびレーザー誘導型マウスＣＮＶモデルにおけるｓｉＲＮＡの有効性を脂質ナノ粒子系が改善することを対象とする。たとえば、Ｓｈｉｍらによる刊行物は、核酸の送達のためのカチオン性リポソームの使用を対象としている。たとえば、国際特許公開公報第２０１１／０７５６５６号は、核酸の送達のための方法および組成物を対象とする。

【0005】

当該分野に記載されている核酸および担体の一部は、粒子の成分および／または標的化部分として使用され得るヒアルロン酸を利用する。たとえば、Ｔａｅｔｚらによる刊行物は、ＣＤ４４を発現する肺癌細胞への抗テロメラーゼｓｉＲＮＡの標的化送達のためのヒアルロン酸修飾型ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームを対象とする。Ｌｅｅらによる刊行物は、分解可能なヒアルロン酸ナノゲルを使用したｓｉＲＮＡの標的特異的な細胞内送達を対象とする。Ｃｈｏｉらによる刊行物は、活性腫瘍の標的化のための自己集積性ヒアルロン酸ナノ粒子を対象とする。Ｐｅｅｒらによる刊行物は、抗炎症性標的としてサイクリンＤ１を明らかにした全身性白血球配向型ｓｉＲＮＡ送達を対象とする。たとえば、Ａｒｐｉｃｃｏらによる刊行物は、ＣＤ４４を過剰表現する腫瘍細胞の標的化のための脂質系のナノベクターを対象とする。たとえば、米国特許出願第２００２／００１２９９８号は、カチオン性リポソームを対象とする。たとえばＰＣＴ出願国際特許公開公報第２０１１／０１３１３０号は、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子およびその使用を対象とする。たとえば米国特許第７，５４４，３７４号は、診断および治療のための薬剤および遺伝子送達における脂質付加グリコサミノグリカン粒子およびその使用を対象とする。Ｃｏｈｅｎら（２０１５）による刊行物は、ヒアルロナン移植脂質系ナノ粒子を使用した化学療法抵抗性グレードＩＶグリオーマの局所ＲＮＡｉ治療を対象とする。

【0006】

しかしながら、ヒアルロン酸を利用する担体を含む当該分野に記載された担体は、特に、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達における、ｓｉＲＮＡなどの核酸の標的細胞への送達の成功に関連するすべての問題を解決するものではない。

【0007】

よって、所望の標的部位への核酸ｓｉＲＮＡの効率的かつ特異的な送達のための組成物であって、上記担体組成物が安定であり、長期間の保存可能期間を有し、生分解性を有し、工業生産工程に適しており、高い被包特性を有し、非毒性であり、免疫応答の誘導を回避し、その中に被包されたｓｉＲＮＡに対する保護（安定性および統合性）の改善を提供し、ｓｉＲＮＡをその標的部位にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで効率的に送達することによりｓｉＲＮＡが所望の効果を発揮することができる、組成物が当該分野で必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体に共有結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含み、ＰＥＧ誘導体に結合しているグリコサミノグリカンでコーティングされたリポソームを提供する。一部の実施形態によると、ＰＥＧ誘導体は、グリコサミノグリカンのカルボキシル基に結合できるアミノ基を有するＰＥＧ−アミンである。一部の実施形態では、リポソームは、核酸分子をさらに含む。このようなリポソームは、たとえばｓｉＲＮＡ分子などの核酸分子の有効かつ効率的なｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの送達システムとして有益である。

【0009】

本発明は、ＰＥＧ誘導体、特にＰＥＧ−アミン誘導体を含めることが、開示されたカチオン性リポソームの構造を安定化し、さらに、リポソームの表面をコーティングするグリコサミノグリカンの結合のためのアンカーとしてさらに作用するとの予測し得なかった驚くべき知見に、部分的に基づくものである。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、様々な分子量のヒアルロン酸（ＨＡ）である。初めて本明細書中にさらに開示されるように、ＰＥＧ誘導体を含むカチオン性リポソームは、ＰＥＧ−アミンまたは他のＰＥＧ誘導体を含まない同様の脂質系組成物と比較して、驚くべきことに予想外に安定である。さらに、以下に例示されるように、本開示のリポソームは、好ましくは比較的小さな多分散指数（ＰＤＩ）を有する。さらに以下に例示されるように、本開示のリポソームは、好ましくは、グリコサミノグリカンでコーティングされた粒子のサイズが直径約３００ｎｍ〜５００ｎｍ以下となるようにより簡単に調節することができ、それによって核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達に有利に作用する。さらに、粒子の調製方法は、好ましくは、商業的に応用可能で、強力であり、費用効率が良く、スケールアップに適している。

【0010】

一態様では、本発明は、核酸の送達のためのカチオン性リポソームであって、ａ）カチオン性脂質、膜安定化脂質、および脂質に結合したＰＥＧ−アミンを含む脂質膜と、ｂ）リポソーム内に被包された核酸と、ｃ）ＰＥＧアミン誘導体に結合し、リポソームの外部表面をコーティングするグリコサミノグリカンと
を含む、リポソームを提供する。

【0011】

別の態様では、本発明は、核酸の送達のための組成物であって、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体に結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含み、ＰＥＧ誘導体に結合しているグリコサミノグリカン分子でコーティングされている複数のリポソームと、リポソーム内に被包された核酸とを含む組成物を提供する。

【0012】

一部の実施形態では、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体に結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含むリポソームと、リポソーム内に被包された核酸とを含む組成物であって、 上記リポソームが、ＰＥＧ誘導体に結合したグリコサミノグリカン分子（ＨＡなど）でコーティングされている、
組成物を提供する。

【0013】

一部の実施形態では、リポソーム（脂質相／その膜）は、限定するものではないが、イオン化脂質およびホスファチジルエタノールアミンから選択される１つまたは複数の追加的な脂質をさらに含み得る。

【0014】

一部の実施形態では、追加的なＰＥＧ誘導体（ＰＥＧ−アミン以外）が、リポソームの脂質相に含まれていてもよい。追加的なＰＥＧ誘導体は、その結合性または他の特性を改善する部分で修飾され得る。一部の実施形態では、追加的なＰＥＧ誘導体は、脂質などの１つまたは複数の追加的な分子に結合し得る。

【0015】

一部の実施形態では、脂質に結合したＰＥＧ−アミンは、限定するものではないが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−アミン）；ＰＥＧ−アミンに結合した１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）；ＰＥＧ−アミンに結合した１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンＤＯＰＥ、およびＰＥＧ−アミンに結合した１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）など、またはそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は、別々の実施形態である。一部の実施形態では、ＰＥＧ−アミンは、追加的な分子が結合または反応し得る一級アミンを提供する。一部の実施形態では、ＰＥＧ−アミンは、脂質に結合している。一部の実施形態では、ＰＥＧ−アミンはリン脂質に結合している。

【0016】

一部の実施形態では、追加的なＰＥＧ誘導体は、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＭＧ（分子の端部にアミン基を含む選択肢を有する）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン；ＰＥＧ−ｃＤＳＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジステアリルオキシ−プロピルアミンなど、またはそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0017】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、合成カチオン性脂質であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ；モノカチオン性脂質 Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ Ｏ−（２Ｒ−１，２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデカニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ν−（Ν’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＬＫＤ（Ο，Ο’−ジラウリル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ο，Ο’−ジミリスチル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイル（ｄｉｏｌｃｙｌ）グリセロール、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ウイオコイル（Ｕｉｏｌｃｏｙｌ）−３−トリメチルアンモニオプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｃ））、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0018】

一部の例示的な実施形態では、カチオン性脂質は、約６．５〜７の範囲のｐＫａを有する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、（脂質のｐＫａは６．８である）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（脂質のｐＫａは約６．４４である）およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（脂質のｐＫａは約６．７である）、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0019】

一部の実施形態では、膜安定化脂質は、限定するものではないが、コレステロール、リン脂質、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質）、グリセロ糖脂質など、またはそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0020】

一部の実施形態では、リン脂質は、限定するものではないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、またはそれらのいずれかの誘導体もしくは組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0021】

一部の実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、限定するものではないが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ））および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）から選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0022】

一部の実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥＧ−アミン誘導体に結合され得る。

【0023】

さらなる実施形態では、グリコサミノグリカンは、限定するものではないが、ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチンスルファート、デルマタンスルファート、ケラタンスルファート、ヘパリン、ヘパランスルファート、ならびにそれらのフラグメント、塩、および混合物から選択され得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、限定するものではないが、様々な鎖長の、高分子量のヒアルロン酸、低分子量のヒアルロン酸、またはそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約１ｋＤａ〜約５０００ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約１ｋＤａ〜１０００ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約５ｋＤａ〜８５０ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約５ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約５ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、ヒアルロン酸は、約７ｋＤａの分子量を有し得る。一部の実施形態では、約６００ｋＤａ〜１０００ｋＤａの分子量を有し得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0024】

一部の実施形態では、本発明のリポソーム（すなわち外部のグリコサミノグリカンのコーティングおよびその中に被包した核酸を含む）は、直径２０〜５００ｎｍの粒径を有する。

【0025】

一部の実施形態では、リポソーム内に被包／捕捉／保有される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択され得る。

【0026】

さらなる実施形態では、リポソームは標的化部分をさらに含み得る。

【0027】

追加の実施形態では、リポソームは、脂質構造（脂質相／膜）内に被包された核酸を標的部位に送達できる。標的部位は、細胞、組織、臓器、および微生物から選択され得る。一部の実施形態では、標的部位は、グリコサミノグリカンでコーティングした粒子により認識されている。一部の例示的な実施形態では、標的部位はＣＤ４４受容体を含み、グリコサミノグリカンがＨＡである。

【0028】

一部の実施形態では、経口、非経口、および局所から選択される経路を介した投与に適した剤形の、核酸を被包／保有する複数のリポソームを含む医薬組成物を提供する。

【0029】

追加の実施形態では、リポソームは、フリーズドライした粒子または凍結乾燥した粒子の形態であり得る。

【0030】

例示的な実施形態では、本発明のリポソームは、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡから選択される合成カチオン性脂質；ホスファチジルコリン（ＰＣ）（たとえばＤＳＰＣ）などのリン脂質；コレステロールなどの膜安定化脂質；脂質に結合したポリエチレングリコールアミン誘導体（ＰＥなど）；脂質に結合した追加的なＰＥＧ誘導体（ＤＭＧ−ＰＥＧなど）；ＰＥＧ―アミン由来の一級アミンに結合したヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン、およびリポソーム内に被包した核酸を含み得る。

【0031】

一部の実施形態では、その必要のある対象の癌の治療のための方法であって、核酸または同核酸を含む医薬組成物を含むまたは被包する本開示のカチオン性リポソームを含む組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、癌はグリオーマである。一部の実施形態では、グリオーマは、多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）である。

【0032】

一部の実施形態では、グリオーマなどの癌を治療する際に使用するための、核酸または核酸を含む医薬組成物を含むまたは被包する本開示のカチオン性リポソームを含む組成物を提供する。

【0033】

一部の実施形態では、核酸の送達のためのグリコサミノグリカンでコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、
ａ）有機溶媒中で、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびリン脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップと、
ｂ）ステップａ）の脂質混合物に核酸を含む水溶液を導入するステップによりリポソームを作製するステップと、
ｃ）上記混合物に活性化したグリコサミノグリカンを添加するステップと
を含む、方法を提供する。

【0034】

一部の実施形態では、核酸の送達のためのグリコサミノグリカンでコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、
ａ）脂質相を形成するステップであって、
ｉ）有機溶媒中、カチオン性脂質、膜安定化脂質、および脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）緩衝液に脂質混合物を懸濁して多層小胞を作製するステップと
を含む、ステップと、
ｂ）
ｉ）上記核酸とともに、ステップａ）の脂質相をインキュベートすることと、
ｉｉ）上記混合物に活性化グリコサミノグリカンを添加するステップと
により、リポソームを作製するステップと
を含む、方法を提供する。

【0035】

特定の実施形態では、有機溶媒は、エタノール、クロロホルム、メタノールなどから選択される。

【0036】

特定の実施形態では、緩衝液は水性緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液は酸性の水性緩衝液である。一部の例示的な実施形態では、緩衝液は酢酸塩の緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝液である。

【0037】

一部の実施形態では、多層小胞の形成前に、１つまたは複数の脂質に核酸を含む酸性緩衝液が添加され得る。

【0038】

一部の実施形態では、核酸の送達のためのグルコサミノグリカンでコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、
ａ）脂質相を形成するステップであって、
ｉ）有機溶媒中に、カチオン性脂質、膜安定化物質、および脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）緩衝液に上記脂質混合物を懸濁して多層小胞を作製するステップと
を含むステップと、
ｂ）
ｉ）上記核酸とステップａ）の脂質相をインキュベートするステップと、
ｉｉ）上記混合物に活性化グリコサミノグリカンを添加するステップと
によりリポソームを作製するステップと
を含む、方法を提供する。

【0039】

上述の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照し、以下の詳細な説明を検討することにより明らかとなる。

【0040】

例示的な実施形態を図面に表す。図面に示されている構成要素の寸法および特性は、一般的に提示の簡便さおよび明確性のために選択されており、必ずしもこの尺度で示されるわけではない。図面を以下に列挙する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1A】一部の実施形態に係る、カチオン性リポソームの調製のために使用される様々な合成カチオン性脂質の合成スキーム。

【図1B】一部の実施形態に係る、コーティングされた粒子（８）を形成するための、核酸分子（６）を被包するリポソーム粒子（２）へのグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸（ＨＡ）として例示、４）の結合の略図。

【図2A】（ＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）を含む脂質相を含み、７ｋＤａ ＨＡでコーティングされた）例示的なリポソームの表面の特徴の原子間力顕微鏡のピクトグラム。

【図2B-E】単独（図２Ｂおよび２Ｄ）、またはＨＡ（５ｋＤａの分子量）（図２Ｃおよび２Ｅ）と結合した、例示的なリポソーム（ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）で構成される）の表面の特徴のピクトグラム。図２Ｂおよび図２ＤはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）およびＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）−ＨＡ（５ＫＤａのＭＷ）のＴＥＭ解析のピクトグラムをそれぞれ示す；図２Ｃおよび２Ｅは、ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）およびＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）−ＨＡ（５ＫＤａのＭＷ）のＳＥＭ解析のピクトグラムをそれぞれ示す。バースケールは、μｍである。

【図3】ｐａｎ−ＣＤ４４モノクローナル抗体（クローンＩＭ７）またはそのアイソタイプ対照ｍＡｂ（ラットＩｇＧ２ｂ）で染色した、Ａ４５９細胞およびＬｎＣａｐ細胞中のＣＤ４４の発現のＦＡＣＳ走査解析。１０，０００個の細胞を各実験点で解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ． Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）を使用してデータ解析を行った。矢印は、Ａ５４９細胞、ＬｎＣａｐ細胞、およびＣＴＲＬ（アイソタイプ対照染色）を示す。

【図4A-B】製剤１〜３（図４Ａ）および４〜６（図４Ｂ）をそれぞれトランスフェクトした、Ａ５４９細胞（ＣＤ４４＋細胞）中のＰＬＫ１の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフ。製剤１〜６は、以下の表２に詳述されている。モック＝核酸を用いないトランスフェクション。ｓｉＰＬＫ１＝ネイキッドｓｉＲＮＡｂ分子を用いたトランスフェクション。

【図4C-D】製剤１〜３（図４Ｃ）および４〜６（図４Ｄ）をそれぞれトランスフェクトした、ＬｎＣａｐ細胞中のＰＬＫ１の相対的な遺伝子発現を示す棒グラフ。製剤１〜６は、以下の表２に詳述されている。モック＝核酸を用いないトランスフェクション。ｓｉＰＬＫ１＝ネイキッドｓｉＲＮＡ分子を用いたトランスフェクション。

【図5】本発明のカチオン性リポソーム（サイクリンＤ１を対象とする特異的なｓｉＲＮＡを含む）の静脈内投与から９６時間後に、７匹のモデルマウス（以下に詳述するようにＡ４５９細胞を注射）から得た様々な組織におけるサイクリンＤ１の相対的な発現を示すグラフ。サイクリンＤ１標的遺伝子の発現を、Ｕ６、ｅＩＦ３ａおよびｅＩＦ３ｃ対照遺伝子の発現に対して正規化した。

【図6A-B】ＧＢＭ細胞におけるＣＤ４４の発現。図６Ａ−ＧＢＭ細胞株におけるＣＤ４４の発現の代表的なＦＡＣＳ解析。抗ｐａｎ−ＣＤ４４ ｍＡｂを、３つの異なるＧＢＭ細胞株：Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、およびＵ２５１を染色するために使用した。（「−」染色なし；「Ｃｔｒ−アイソタイプ対照ｍＡｂ」；「ＣＤ４４」−抗ｐａｎ−ＣＤ４４ ｍＡｂ（クローンＩＭ７）；図６Ｂ．詳述される免疫組織化学的検査を使用した、患者から排泄された初代培養グリオーマの試料におけるＣＤ４４発現。解析スコアは、腫瘍部位内のＣＤ４４の散乱に基づくものであった。この染色を半定量的にスコア付けする：＋（陽性）、＋＋（強力に陽性）、または＋＋＋（非常に強力に陽性）。

【図7A-B】ＨＡを含むリポソーム粒子は、グリオーマ細胞に特異的に結合する。対照マーカーとしてＣｙ５−ｓｉＲＮＡを捕捉／被包するリポソーム粒子（ＨＡを含む、またはＨＡを含まない）を使用し、ＦＡＣＳ解析により、ＧＢＭ（Ｕ８７ＭＧ）細胞におけるＣｙ５の存在に関して解析した。図７Ａは、ＨＡを含む粒子（ＨＡ−ＬＰ、ＧＢＭ細胞株（Ｕ８７ＭＧ細胞）に特異的に結合する）、およびＨＡを含まない粒子（ＬＰ、ＧＢＭグリオーマ細胞株に結合しない）の、代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。図７Ｂは、ＧＢＭ患者に結合したＨＡを含む粒子（ＨＡ−ＬＰ）、および細胞に結合しない対照粒子（ＬＰ）の、代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。

【図8】ＧＢＭ細胞は、ＤＯＸまたはＢＣＮＵでの化学療法の治療に耐性がある。Ｕ８７ＭＧ細胞は、変動する濃度（１μＭ、１０μＭ、および１００μＭ）のドキソルビシン（ＤＯＸ）および１，３−ビス（２−クロロエチル）−ｌ−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）で処置した。図８の棒グラフは、処置から４８時間後の細胞の生存を示す。

【図9A-C】ＰＬＫ１は、グリオーマ細胞の特異的な細胞死を誘導する。図９Ａは、Ｕ８７ＭＧ細胞におけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）の遺伝子発現のＱＰＣＲの棒グラフを示す。ＣＳＦフローを模倣するためのせん断流条件下で、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃｉ）またはＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＫ１）のいずれかをさらに被包した、ＨＡを含むリポソーム粒子（ＨＡ―ＬＮＰ）またはＨＡを含まないリポソーム粒子（ＬＮＰｓ−ＮＨ２）と共に、細胞をインキュベートした。図９Ｂ−ｓｉＰＬＫ１を含むＨＡ−ＬＰで処置した後の、細胞におけるＰＬＫ１タンパク質発現のウェスタンブロット解析を示すピクトグラム。９６〜１４４時間後に細胞を収集し、ＰＬＫ１抗体を使用して、ＰＬＫ１タンパク質レベルに関して解析した。βチューブリンを陽性対照として使用した。図９Ｃ−様々な実験条件下での細胞の生存（ＸＴＴアッセイにより決定）を示す棒グラフ。ドキソルビシン（ＤＯＸ）を陽性対照として使用した。＊は、ｐ＜０．００１を表す。

【図10】Ｕ８７ＧＭ細胞の定位的な移植による腫瘍の接種から１２日後の腫瘍の大きさおよび位置を評価するための、同所性ＧＢＭモデル上のＨ＆Ｅ染色を使用した代表的な組織学の解析のピクトグラムを示す。

【図11A-C】ＨＡを含み、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡを包有するリポソーム粒子の腫瘍部位への投与（注射による）後の異なる時点での、組織切片の代表的な共焦点顕微鏡のピクトグラムを示す。図１１Ａ−投与から３時間後：図１１Ｂ−投与から６時間後；および図１１Ｃ−投与から２４時間後に、動物を屠殺し、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（薄灰色（元は赤色）の、１つの例示的な位置を各図面において矢印で示す）の位置を、共焦点顕微鏡解析を使用して検出した。ＤＡＰＩ（灰色（元は青色）、１つの例示的な位置を、各図面において矢印で示す）を、核染色に使用した。バーのスケール‐５０μｍ。

【図12A】ＧＢＭ細胞に及ぼす標的遺伝子（ＰＬＫ１）のｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング効果、およびＧＢＭ担癌マウスの生存を示すグラフ。図１２Ａは、担癌マウスの腫瘍部位に投与したＨＡを含むリポソーム粒子内に被包／包有されている、ＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡによるＰＬＫ１遺伝子のサイレンシングのパーセンテージを示す棒グラフである。マウス（ｎ＝１０匹のマウス／群）を、モックトランスフェクション（モック処置）、または、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃｉ）もしくはＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＫ１）をさらに包有するＨＡを含むリポソーム粒子（ＨＡ−ＬＮＰ）のいずれかで２回処置した。腫瘍細胞を、表面マーカーを介してＦＡＣＳによりソーティングして、ＰＬＫ１のｍＲＮＡレベルを、ＱＰＣＲを使用して定量化した。＊はｐ＜０．００１を表す。

【図12B】ＧＢＭ細胞に及ぼす標的遺伝子（ＰＬＫ１）のｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング効果、およびＧＢＭ担癌マウスの生存を示すグラフ。図１２ＢおよびＣは、ＨＡ−ＬＮＰに捕捉されたｓｉＰＬＫ１によるミクログリア細胞におけるサイトカイン（ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６）誘導の棒グラフを示す。マウスの初代培養ミクログリア細胞を、０．０５および０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡでＨＡ−ＬＮＰに捕捉されたｓｉＰＬＫ１と共に、３７℃で６時間インキュベートした。培地へのＴＮＦ−α（図１２Ｂ）およびＩＬ―６（図１２Ｃ）の放出を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した（ｐｇ／ｍｌ）。データを、少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＤとして提示した。

【図12C】ＧＢＭ細胞に及ぼす標的遺伝子（ＰＬＫ１）のｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング効果、およびＧＢＭ担癌マウスの生存を示すグラフ。図１２ＢおよびＣは、ＨＡ−ＬＮＰに捕捉されたｓｉＰＬＫ１によるミクログリア細胞におけるサイトカイン（ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６）誘導の棒グラフを示す。マウスの初代培養ミクログリア細胞を、０．０５および０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡでＨＡ−ＬＮＰに捕捉されたｓｉＰＬＫ１と共に、３７℃で６時間インキュベートした。培地へのＴＮＦ−α（図１２Ｂ）およびＩＬ―６（図１２Ｃ）の放出を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した（ｐｇ／ｍｌ）。データを、少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＤとして提示した。

【図12D】ＧＢＭ細胞に及ぼす標的遺伝子（ＰＬＫ１）のｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング効果、およびＧＢＭ担癌マウスの生存を示すグラフ。図１２Ｄは、ｓｉＬｕｃｉ（ｓｉ対照）、ｓｉＰＬＫ１、または生理食塩水で処置したＧＢＭ担癌同所性（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ）Ｕ８７ＭＧ細胞（ｎ＝１０／群）のカプランマイヤーの生存解析を示す折れ線グラフである。腫瘍の接種から７日後および９日後、次いで腫瘍の接種から２０日後および２２日後に、合計４回の投与を行った。

【発明を実施するための形態】

【0042】

定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語および文言を以下に定義する。これらの用語および文言は説明の目的のためのものであり、限定するものではなく、このため、当業者は、本明細書の用語法および表現を、当業者の知識と合わせて、本明細書に提示される教示及び指針に照らして解釈すべきであると理解される。

【0043】

本明細書中に記載されるように、用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「ヌクレオチド」は、本明細書中互換可能に使用され得る。この用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および別々のフラグメントの形態またはより大きな構築物の成分としてのそれらの修飾形態、直鎖または分枝鎖、一本、二本鎖、三本鎖、またはそれらのハイブリッドのポリマーを対象とする。またこの用語は、ＲＮＡ／ＤＮＡのハイブリッドをも包有する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、たとえば、限定するものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、もしくはそれらのハイブリッド、またはＲＮＡ分子、たとえばｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどであり得る。各可能性は、別々の実施形態である。この用語は、天然に存在する塩基、糖、およびヌクレオシド間共有結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびにそれぞれの天然に存在する部分と同じように機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。

【0044】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように、本明細書中互換可能に使用されている。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的な類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。

【0045】

本明細書中に使用される用語「複数」は、１超の成分を含むことを対象とする。

【0046】

用語「グリコサミノグリカン」または「ムコ多糖」は、反復する二糖単位からなる長い非分枝鎖多糖を対象とする。この反復単位は、ヘキソサミンに結合したヘキソース（６炭糖）またはヘキスロン酸を含み得る。グリコサミノグリカンファミリーのメンバーは、メンバーが含むヘキソサミン、ヘキソース、またはヘキスロン酸の単位の種類（たとえばグルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコサミン）、およびグリコシド結合の配置が、多様であり得る。用語グリコサミノグリカンは、天然、合成、または半合成のグリコサミノグリカン分子を含む。例示的なグリコサミノグリカンとして、限定するものではないが、コンドロイチンスルファート、デルマタンスルファート、ケラタンスルファート、ヘパリン、ヘパランスルファート、ヒアルロナン（ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ＨＡとしても知られている）、ならびにそれらのフラグメント、塩、および混合物などのグリコサミノグリカンが挙げられる。用語グリコサミノグリカンは、限定するものではないが、エステル化、硫酸化、ポリ硫酸化、およびメチル化などの修飾により化学的に修飾されているグリコサミノグリカンをさらに含む。ヒアルロン酸を除くグリコサミノグリカンは、天然では、多糖部分に共有結合したタンパク質部分の形態である。タンパク質‐糖の結合を化学的および酵素的に加水分解する方法は、当業者によく知られている。

【0047】

用語「ＨＡ」および「ヒアルロナン」は、遊離形態および細胞外マトリックス成分などの結合形態であり得るヒアルロン酸を表す。用語ＨＡは、たとえばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、およびヒアルロン酸カルシウムを含むヒアルロン酸塩のいずれかにさらに関連する。ＨＡ多糖は、交互のβ−１，３グルクロニドおよびβ‐１，４−グルコサミド結合により結合した、交互のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸残基からなる。ＨＡは、低分子量（たとえばＭＷ＝１０４〜７．２×ｌ０４の範囲内）、および／または高分子量（たとえば、約ＭＷ＝３．１×ｌ０５〜５×ｌ０６ｋＤａの範囲内）のＨＡであり得る。ＨＡは、多様な鎖長のＨＡであり得る。一部の実施形態では、ＨＡは、約１ｋＤａ〜１０００ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、ＨＡは、約５ｋＤａ〜８５０ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、ＨＡは、約７ｋＤａの分子量を有する。一部の実施形態では、Ｈａは、約８００ｋＤａの分子量を有する。ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスに対して高い親和性を有し、かつ乳房、脳、肺、皮膚、および他の臓器および組織の腫瘍を含む様々な腫瘍に対して高い親和性を有する。ＨＡは、ＣＤ４４細胞受容体に高い親和性を有する。

【0048】

本明細書中に使用されるように、用語「カチオン性リポソーム」、「リポソーム」、および「脂質ベースのナノ粒子」は、互換可能に使用され得る。これら用語は、組み合わせた／複数の脂質（限定するものではないが、カチオン性脂質、膜安定化脂質、ホスファチジルエタノールアミン、リン脂質から選択される）；脂質に結合したポリエチレングリコール誘導体から選択される）を含む脂質相（本明細書中膜をも表す）を含む／備える／から作製され、リポソームのＰＥＧアミン誘導体に結合した活性化グリコサミノグリカンでさらにコーティングされ；さらに核酸分子を被包する、本発明のカチオン性リポソームに関する。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子（リポソーム）は、多層小胞である。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子は、修飾されたリポソームである。一部の実施形態では、脂質ベースのナノ粒子は、当該ナノ粒子中に被包された核酸分子を標的部位に送達する効率的な送達系として使用され得る。

【0049】

本明細書中に使用される用語「構築物」は、１つまたは複数の核酸配列を含み得る人工的に構築または単離された核酸分子であって、上記核酸配列が、コード配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、制御配列、非コード配列、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み得る、核酸分子を表す。用語構築物は、たとえばベクターを含むが、それに限定されると理解されるべきではない。

【0050】

「発現ベクター」は、外来細胞において、異種性核酸フラグメント（たとえばＤＮＡなど）を組み込み、発現する能力を有する構築物を表す。言い換えると、発現ベクターは、転写可能な核酸配列／フラグメント（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ）を含む。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターは既知であり、かつ／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。一部の例示的な実施形態では、発現ベクターは、標的部位において二本鎖ＲＮＡ分子をコードし得る。

【0051】

本明細書中で使用される用語「発現」は、標的細胞中の所望の最終産物の分子の産生を表す。最終産物の分子は、たとえばＲＮＡ分子；ペプチドもしくはタンパク質など；またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0052】

本明細書中で使用されるように、用語「導入する」および「トランスフェクション」は、互換可能に使用され、たとえば核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどの分子の、標的細胞、具体的には標的細胞の膜封入腔の内側への移行を表し得る。このような分子は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２００１）により教示されているように、当業者に知られているいずれかの手段により、標的細胞に「導入」することができる。この文献の内容は本明細書中参照として援用されている。細胞に分子を「導入する」手段として、たとえば、限定するものではないが、ヒートショック、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、トランスフェクション試薬、ウイルス媒介性の移行など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。細胞のトランスフェクションは、たとえばヒトの細胞、動物の細胞、植物の細胞、ウイルスの細胞などのいずれかの起源のいずれかの種類の細胞で行われ得る。この細胞は、単離した細胞、組織培養細胞、細胞株、生物の体内に存在する細胞などから選択され得る。

【0053】

本明細書中に記載されるように、用語「標的部位」は、核酸が向けられる位置、および／または核酸がその生物学的な作用を発揮する部位を表す。一部の例示的な実施形態では、標的部位は、限定するものではないが、培養細胞（初代培養細胞または細胞株由来細胞）、および生物の体内の細胞；組織、臓器、微生物（たとえばウイルス、細菌、寄生体）などから選択され得る細胞である。生物は、限定するものではないが、ヒトまたは動物などの哺乳類、哺乳類ではない動物（たとえば鳥類、魚類など）などのいずれかの生物であり得る。一部の例示的な実施形態では、標的部位は、細胞下の位置または細胞のオルガネラ（たとえば核、細胞質など）である。一部の実施形態では、標的部位はＣＤ４４受容体を含む。

【0054】

本明細書中で使用される用語「治療する」および「治療」は、疾患もしくは病態の進行の抑止、阻害、遅延、もしくは反転、疾患もしくは病態の臨床症状の軽減、または疾患もしくは病態の臨床症状の出現の予防を表す。用語「予防する」は、本明細書中、対象が、障害または疾患または病態を得ないようにすることと定義されている。

【0055】

用語「癌の治療」は、以下のうちの１つまたは複数を含むことを目的とする：癌の増殖速度の減少（すなわち、癌が未だ増殖しているが遅い速度で増殖）；癌性増殖の増殖の休止、すなわち、腫瘍増殖の停止、および腫瘍が縮小する、または大きさが減少する。またこの用語は、転移の数の減少、形成される新規転移の数の減少、１つのステージから他のステージへの癌の進行の遅延、および癌により誘導される血管新生の減少をも含む。最も好ましい場合、腫瘍は完全に取り除かれている。さらに、この用語には、治療を受けている対象の生存期間の延長、疾患進行の時間の延長、腫瘍の退縮などが含まれる。

【0056】

本明細書中使用されるように、用語「約」は±１０％を表す。

【0057】

本発明の一部の実施形態によると、核酸の送達のためのリポソームであって、複数の脂質（カチオン性脂質、膜安定化脂質、および任意に、限定するものではないが、イオン化脂質および／またはホスファチジルエタノールアミンなどの追加的な脂質を含む）と、ＰＥＧ−アミン誘導体（脂質に結合）とを含む脂質相（膜）を含み；粒子のＰＥＧアミン誘導体に結合した活性化グリコサミノグリカンでさらにコーティングされており、核酸をさらに被包する、リポソームを提供する。一部の実施形態では、追加的なＰＥＧ誘導体が、粒子に含まれ得る。一部の実施形態では、リポソームは、所望の標的部位に核酸分子を送達するための効率的な送達系として使用され得る。
標的部位は、限定するものではないが、細胞、組織、臓器、微生物などのいずれかの標的部位を含み得る。標的部位は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの標的部位であり得る。

【0058】

一部の実施形態では、核酸送達のためのカチオン性リポソームであって、ａ）カチオン性脂質、膜安定化物質、および脂質に結合したＰＥＧ−アミンを含む脂質膜と、ｂ）リポソーム内に被包された核酸分子と、ｃ）ＰＥＧアミン誘導体に結合し、リポソームの外部表面をコーティングするグリコサミノグリカンとを含む、カチオン性リポソームを提供する。

【0059】

一部の実施形態では、本発明は、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体に結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含むリポソームであって、上記粒子がＰＥＧ誘導体に結合した、グリコサミノグリカン分子でコーティングされている、リポソームを提供する。一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧ−アミンを含む。一部の実施形態では、リポソームは、核酸分子を被包／担持する。

【0060】

さらなる実施形態では、本発明は、複数のリポソームを含む組成物であって、上記リポソームが、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−アミン誘導体に結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含む脂質相を含み、上記粒子が、ＰＥＧ−アミン誘導体に結合したグリコサミノグリカン分子でコーティングされており、さらに核酸を被包／担持する、組成物を提供する。

【0061】

さらなる追加的な実施形態では、本発明は、カチオン性脂質、膜安定化脂質、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−アミン誘導体に結合した少なくとも１つの脂質を含む複数の脂質を含む複数のリポソームを含む組成物であって、上記粒子が、ＰＥＧ−アミン誘導体に結合したグリコサミノグリカン分子でコーティングされており、リポソームの脂質構造内に被包された核酸分子をさらに含む、組成物を提供する。

【0062】

図１Ｂを参照すると、一部の実施形態に係る、コーティングされたリポソーム粒子（８）を形成するために、核酸分子（６）を被包するリポソーム粒子（２）へのグリコサミノグリカン（ヒアルロン酸（ＨＡ）として例示、４））の結合の略図である。さらに、活性化グリコサミノグリカンと相互作用できるＮＨ２残基が示されている。

【0063】

一部の例示的な実施形態では、リポソームの脂質相（膜）の複数の脂質は、天然または合成供給源由来であり、限定するものではないが、カチオン性脂質、ホスファチジルエタノールアミン、イオン化脂質、膜安定化脂質、リン脂質など、またはそれらの組み合わせから選択され得る。

【0064】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、合成カチオン性脂質であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡおよびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ；モノカチオン性脂質 Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ Ｏ−（２Ｒ−１，２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデカニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ν−（Ν’， Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）、ＤＬＫＤ（Ο，Ο’−ジラウリル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ο，Ο’−ジミリスチル Ｎ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイル（ｄｉｏｌｃｙｌ）グリセロール、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ウイオコイル（Ｕｉｏｌｃｏｙｌ）−３−トリメチルアンモニオプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、ＤＰＰＥＳ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｃ））、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0065】

一部の例示的な実施形態では、カチオン性脂質は、約６．５〜７の範囲のｐＫａを有する。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、（脂質のｐＫａは６．８である）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（脂質のｐＫａは６．４４である）およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（脂質のｐＫａは６．７である）、またはそれらの組み合わせから選択される。各可能性は別々の実施形態である。

【0066】

一部の実施形態では、膜安定化脂質は、限定するものではないが、コレステロール、リン脂質（たとえばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなど）、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質）、グリセロ糖脂質、およびそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0067】

一部の実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、限定するものではないが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、またはそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥＧ−アミン誘導体に結合し得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0068】

一部の実施形態では、リポソーム（その脂質相）は、ＰＥＧ−アミン誘導体に加えて追加的なＰＥＧ誘導体をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、脂質などの１つまたは複数の追加的な分子に結合し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ｃＤＭＡ ３−Ｎ−（−メトキシポリエチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン；ＰＥＧ−ｃＤＳＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジステアリルオキシ−プロピルアミン、またはそれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。

【0069】

一部の実施形態では、脂質に結合したＰＥＧ−アミンは、活性化グリコサミノグリカンが共有結合し得る一級アミンを提供する。

【0070】

一部の実施形態では、様々な脂質間の比率は変動し得る。一部の実施形態では、この比率はモル比である。一部の実施形態では、この比率は重量比である。一部の実施形態では、脂質基のそれぞれは、約１％〜９９％のモル比／重量比で存在し得る。

【0071】

一部の実施形態では、核酸と脂質相との間の重量比は、標的部位に核酸が及ぼす最大の生物学的効果を達成するために調節され得る。一部の実施形態では、核酸と脂質相との間の比率は、１：１であり得る。たとえば、核酸と脂質相との間の比率は１：２であり得る。たとえば、核酸と脂質相との間の重量比は１：５であり得る。たとえば、核酸と脂質相との間の重量比は１：１０であり得る。たとえば核酸と脂質相との間の重量比は１：１６であり得る。たとえば、核酸と脂質相との間の重量比は１：２０であり得る。一部の実施形態では、核酸と脂質相との間の重量比は約１：５〜１：２０（ｗ：ｗ）である。

【0072】

一部の実施形態では、リポソームの調製に使用されるグリコサミノグリカンは、何等かの修飾されていないグリコサミノグリカンおよび／または修飾されたグリコサミノグリカンを含み得る。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、限定するものではないが、ＨＡ、コンドロイチンスルファート、デルマタンスルファート、ケラタンスルファート、ヘパリン、ヘパランスルファート、およびそれらの塩から選択され得る。グリコサミノグリカンは、多様な長さのグリコサミノグリカンであり得る。一部の例示的な実施形態では、グリコサミノグリカンは、高分子量（ＨＭＷ）のＨＡである。一部の例示的な実施形態では、グリコサミノグリカンは、低分子量（ＬＭＷ）のＨＡである。他の例示的な実施形態では、グリコサミノグリカンは、多様な分子量を有するＨＡの組み合わせである。一部の実施形態では、ＨＡは、約３〜２０ｋＤａ（たとえば７ｋＤａ）の分子量を有する。一部の実施形態では、ＨＡは、約６００〜１０００ｋＤａ（たとえば８００ｋＤａ）の分子量を有する。一部の実施形態では、グリコサミノグリカンは、リポソームの脂質相のＰＥＧ−アミン誘導体と反応する前に、活性化され得る。たとえば、活性化は、限定するものではないが、グリコサミノグリカンの酸性化、グリコサミノグリカンへの架橋剤の付加などを含み得る。例示的な実施形態では、架橋剤は、限定するものではないが、ＥＤＣ（ＥＤＡＣ、ＥＤＣＩ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＤＣＣ（Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、およびＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）から選択されるカルボジイミドであり得る。

【0073】

さらなる実施形態では、追加的な分子／部分／誘導体は、リポソームのＰＥＧ−アミン誘導体と反応する前に、グリコサミノグリカンに最初に結合し得る。追加的な分子は、たとえば、抗体、葉酸塩、ポルフィリン、またはレクチンであり得て、特異的な標的部位へのリポソームの標的化のために使用され得る。追加的な実施形態では、追加的な標的化分子／誘導体は、リポソームに直接結合し得る。

【0074】

一部の実施形態では、リポソーム（グリコサミノグリカンのコーティングおよび内部に被包した核酸を含む）は、約５〜５００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１０〜３５０ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約５０〜２５０ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１０〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約２０〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約５０〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約７５〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約９０〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１００〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１２０〜２００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１５０〜２００の範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約５０〜１５０ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１０ｎｍ超の範囲の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約２０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約３０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約４０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約５０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約６０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約７０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約８０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約９０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１００ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１１０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１２０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１３０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１４０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１５０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１６０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１７０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１８０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約１９０ｎｍ超の粒径（直径）を有する。一部の実施形態では、リポソームは、約５００ｎｍ以下の粒径（直径）を有する。

【0075】

例示的な実施形態では、リポソームは、カチオン性脂質（たとえばＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＭＣ３またはＤｌｉｎＫＣ２−ＤＭＡなど）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ誘導体（ＤＭＧ−ＰＥＧなど）および脂質に結合したＰＥＧ−アミン（ＰＥ−ＰＥＧ−アミン）を様々なモル：モル比で含み、低分子量および／またはより高分子量（３〜１０ｋＤａ（たとえば７ｋＤａ）および／または５００〜１０００ｋＤａ（たとえば８００ｋＤａ）のＨＡでコーティングされ得る。たとえば脂質相は、ＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）で構成され得る。たとえば脂質相は、ＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）で構成され得る。たとえば脂質相はＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）で構成され得る。たとえば脂質相はＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）で構成され得る。たとえば脂質相は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）で構成され得る。たとえば脂質相は、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）で構成され得る。

【0076】

一部の実施形態では、脂質相は約３０〜６０％（ｍｏｌ：ｍｏｌ）のカチオン性脂質を含み得る。たとえばカチオン性脂質は、約４０〜５０％（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の脂質相を含み得る。

【0077】

一部の実施形態では、脂質相は、約２０〜７０％（ｍｏｌ：ｍｏｌ）の膜安定化物質を含み得る。たとえば膜安定化物質は、脂質相の約４０〜６０％を構成し得る。一部の実施形態では、１種類超の膜安定化物質が脂質相に使用され得る。たとえば膜安定化脂質は、コレステロール（脂質相の約３０〜５０％（ｍｏｌ：ｍｏｌ））、および脂質相の約５〜１５％（ｍｏｌ：ｍｏｌ）であり得るリン脂質（たとえばＤＳＰＣなど）を含み得る。

【0078】

一部の実施形態では、脂質相は、約０．２５〜３％（ｍｏｌ：ｍｏｌ）のＰＥＧ−アミン（脂質に結合）を含み得る。たとえばＰＥＧ−アミンは、脂質相の約０．５〜１．５％を構成し得る。

【0079】

一部の実施形態では、もし存在する場合、追加的なＰＥＧ誘導体（脂質に結合）は、脂質相組成物の約０．５〜１０％を構成し得る。たとえば追加的なＰＥＧ誘導体は、脂質相の約１．５〜５％を構成し得る。

【0080】

一部の実施形態では、核酸の送達のためのグリコサミノグリカンでコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、上記方法が、
ａ）有機溶媒中、カチオン性脂質、膜安定化物質、およびリン脂質に結合したＰＥＧ−アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップを含む脂質相を形成するステップと、
ｂ）ステップａ）の脂質混合物に核酸水溶液を導入するステップによりリポソームを作製するステップと、
ｃ）上記混合物に活性化グリコサミノグリカンを添加するステップと
のうちの１つまたは複数を含む、方法を提供する。

【0081】

一部の実施形態では、脂質は、酸性水性緩衝液に懸濁されている。

【0082】

一部の実施形態では、核酸の送達のためのグリコサミノグリカンでコーティングされたリポソームの調製のための方法であって、
ａ）脂質相を形成するステップであって、
ｉ）有機溶媒中、カチオン性脂質、膜安定化脂質、および脂質に結合したＰＥＧ―アミンを望ましい比率で混合し、脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）緩衝液に脂質混合物を懸濁して多層小胞を作製するステップと
を含むステップと、
ｂ）
ｉ）酸性緩衝液にグリコサミノグリカンを溶解し、架橋剤を添加して、活性化グリコサミノグリカンを形成することを含む、グリコサミノグリカンの活性化のステップと、
ｃ）
ｉ）核酸とともにステップａ）の脂質相をインキュベート／混合／懸濁するステップと、
ｉｉ）上記混合物に、上記活性化グリコサミノグリカンを添加するステップと
によりリポソームを作製するステップと
のうちの１つまたは複数を含む、方法を提供する。

【0083】

一部の実施形態では、脂質は、酸性水性緩衝液に懸濁されている。一部の実施形態では、酸性水性緩衝液は、限定するものではないが、ＭＥＳ緩衝液（たとえば５０ｍＭ〜１００ｍＭ、ｐＨ５．５）、酢酸塩緩衝液（たとえば１００ｍＭ、ｐＨ４．０）などから選択される。一部の実施形態では、核酸は、たとえば限定するものではないが、ＭＥＳ緩衝液（たとえば５０ｍＭ〜１００ｍＭ、ｐＨ５．５）、酢酸塩緩衝液（たとえば１００ｍＭ、ｐＨ４．０）などの酸性緩衝液に添加され得る。一部の実施形態では、多層小胞の形成の前に核酸は脂質と混合され得る。このような実施形態では、核酸（たとえば酢酸塩緩衝液中）および脂質（たとえば１００％のエタノール中）はいずれも、核酸を被包した粒子を形成するためにマイクロフルダイザーに導入され得る。

【0084】

一部の実施形態では、リポソームの調製のための方法は、最も有効な組成物を得るために、組成物の成分および成分間の比率を細かく調節する様々な修正を含み得る。この修正は、たとえば、限定するものではないが、脂質組成物の形成に使用される特定の脂質、脂質組成物の脂質間の比率、被包される核酸の同一性、核酸と脂質組成物との間の比率、使用される特定のグリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンと脂質組成物との間の比率、反応を行うｐＨ、反応を行う温度、反応を形成する条件、様々なステップの時間の長さなど、またはそれらの組み合わせなどのパラメータを含み得る。

【0085】

一部の実施形態では、本発明のリポソームの調製のための方法は、均一に分布した脂質組成物の粒径を有益にもたらし得る。

【0086】

一部の実施形態では、本発明の方法により形成されるリポソームは、形成の様々な段階で、凍結乾燥または脱水され得る。

【0087】

一部の実施形態では、本開示のリポソーム（すなわちグリコサミノグリカンのコーティングおよび内部に被包した核酸を含む）は、それを必要とする生物の様々な病態の治療に使用することができる。

【0088】

一部の実施形態では、リポソームはそのまま投与され得る。一部の実施形態では、リポソームは、溶液で投与され得る。一部の実施形態では、リポソームは、いずれかの所望の投与経路により投与される適切な医薬組成物に製剤化され得る。例示的な投与経路は、限定するものではないが、局所、経口、または非経口などの経路を含む。意図される投与形式に応じて、使用される組成物は、たとえば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤などの固体、半固体、または液体の剤形などであり得て、好ましくは正確な用量の単回投与に適した単位剤形であり得る。医薬組成物は、カチオン性リポソーム、薬学的に許容可能な賦形剤を含み、任意に、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバントなどを含み得る。薬学的に許容可能な担体は、粒子内に被包した核酸に対して不活性であり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さないものであることが好ましい。一部の実施形態では、投与は局所投与である。

【0089】

一部の実施形態では、非経口投与のための注射可能な製剤は、液剤または懸濁剤、注射前に液体への溶解または懸濁に適した固体の形態として、または乳剤として調製することができる。適切な賦形剤は、たとえば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに必要に応じて、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、たとえば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどの、少量の非毒性の補助物質をも含み得る。また、水性注射懸濁剤は、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含み得る。任意に懸濁剤は、安定化剤をも含み得る。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単位剤形または複数用量の密封容器に存在することができ、たとえば使用の直前に注射するための水などの滅菌性の液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。一部の実施形態では、非経口投与は、静脈内投与を含む。

【0090】

他の実施形態では、経口投与に関して、薬学的に許容可能な非毒性の組成物は、たとえばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、クロスカルメロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｒｏｓｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤のいずれかの組み込みにより、形成され得る。このような組成物として、液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放製剤などが挙げられる。経口投与に適した製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物などの液体溶液；それぞれが、固体または顆粒としての所定量の活性成分を含むサシェ、ロゼンジ、およびトローチ；散剤、適切な液体中の懸濁剤；ならびに適切な乳化剤からなることができる。液体製剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤、懸濁剤、または乳化剤を添加するまたは添加することなく、水およびアルコール（たとえばエタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコール）などの希釈剤を含み得る。

【0091】

投与されるリポソームの用量を決定する際に、用量および投与頻度は、粒子内に被包された特定の生物学的に活性な薬剤の薬理学的特性に関連して選択される。

【0092】

一部の実施形態では、核酸を含む本発明のリポソームは、核酸の同一性、標的部位などに応じて、様々な病態の治療に使用され得る。例示的な病態は、限定するものではないが、様々な種類の癌、様々な感染症（たとえばウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症など）、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症（たとえばクローン病、大腸炎などの炎症性腸疾患）、眼に関連した症候群および疾患、肺に関連した疾患、胃腸に関連した症候群および疾患などから選択され得る。

【0093】

一部の例示的な実施形態では、たとえばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの核酸を含むリポソームは、核酸の同一性、標的部位などに応じて、様々な病態の治療に使用され得る。一部の実施形態では、リポソーム内に被包した核酸は、標的遺伝子のサイレンシングを誘導できる核酸であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、遺伝子の発現が治療される病態に関連するいずれかの遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、限定するものではないが、増殖因子（ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲなど）、血管新生経路に関連する遺伝子（ＶＥＧＦ、インテグリンなど）、細胞内シグナリング経路および細胞周期の調節に関与する遺伝子（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ、ＰＤＫ１、ＣＨＫ１、ＰＬＫ１、サイクリンなど）から選択される遺伝子であり得る。一部の実施形態では、それぞれが１つまたは複数の標的を有する核酸の組み合わせが、リポソーム粒子内に被包され得る。

【0094】

一部の実施形態では、核酸を含むリポソーム粒子により治療され得る例示的な病態は、限定するものではないが、様々な種類の癌、様々な感染症（たとえばウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症など）、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症（たとえばクローン病、大腸炎などの炎症性腸疾患など）、眼に関連する症候群および疾患、肺に関連する疾患、胃腸に関連する症候群および疾患などから選択されてもよい。

【0095】

一部の例示的な実施形態では、核酸（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）を含むリポソームは、癌の治療に使用され得る。癌は、細胞集団が、増殖および分化を通常支配する制御機構に対して様々な度合で応答しなくなる障害である。癌は、異なる部位への転移を含む様々な種類の悪性新生物および腫瘍を表す。脂質ベースの組成物により治療できる癌の非限定的な例は、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、黒色腫、結腸癌、肺癌、膵癌、胃癌、膀胱癌、ユーイング肉腫、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、頭頸部癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌および甲状腺癌である。癌の具体的な例として、限定するものではないが、腺癌、副腎腫瘍、エナメル上皮腫、退形成腫瘍、甲状腺細胞の退形成細胞腫、血管線維腫、血管腫、血管肉腫、アプドーマ、カルチノイド腫瘍、男化腫瘍、腹水腫瘍細胞、腹水腫瘍、星状芽細胞腫、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、心房粘液腫、基底細胞癌、骨癌、骨腫瘍、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、癌腫、小脳性星状細胞腫、子宮頸癌、胆管細胞癌、胆管腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、絨毛芽腫、絨毛癌、結腸癌、一般的な急性リンパ芽球性白血病、頭蓋咽頭腫、嚢胞癌、嚢胞線維腫、嚢腫、細胞腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、乳管内乳頭腫、未分化胚細胞腫、脳腫瘤、子宮内膜癌、内皮腫、上衣腫、上皮腫、赤白血病、ユーイング肉腫、節外性リンパ腫、ネコの肉腫、乳腺線維腺腫、線維肉腫、甲状腺の濾胞癌、神経節膠腫、ガストリノーマ、多形膠芽細胞腫、グリオーマ、性腺芽腫、血管芽腫、血管内皮芽細胞腫、血管内皮腫、血管外皮腫、血管リンパ管腫、血球芽細胞腫、血液細胞腫（ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍａ）、ヘアリーセル白血病、過誤腫、肝臓癌、肝細胞癌、肝細胞腫、組織腫、ホジキン病、副腎腫、浸潤性癌、浸潤性乳管癌（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｄｕｃｔａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、インスリノーマ、若年性血管線維腫、カポジ肉腫、腎臓腫瘍、大細胞型リンパ腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、肝臓癌、肝臓転移、Ｌｕｃｋｅ癌、リンパ節腫、リンパ管腫、リンパ性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ球腫、リンパ浮腫、リンパ腫、肺癌、悪性中皮腫、悪性奇形腫、マスト細胞腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、転移性癌、モートン神経腫、多発性骨髄腫、骨髄芽球腫、骨髄性白血病、骨髄脂肪腫、骨髄腫、筋芽細胞腫、粘液腫、上咽頭癌、腎芽腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経膠腫、神経腫、非ホジキンリンパ腫、乏突起神経膠腫、視神経膠腫、骨軟骨腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭のパジェット病、パンコースト腫瘍、膵癌、クロム親和性細胞腫、褐色細胞腫、形質細胞腫、原発性脳腫瘍、プロラクチノーマ、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｓａｒｃｏｍａ）、固形腫瘍、肉腫、続発性腫瘍、セミノーマ、皮膚癌、小細胞癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、奇形癌、精巣癌、胸腺腫、絨毛性腫瘍、前庭神経鞘腫、ウィルムス腫瘍、またはそれらの組み合わせなどの種類が挙げられる。

【0096】

一部の例示的な実施形態では、癌の治療に使用され得る核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）は、細胞周期の調節に関与する標的遺伝子を対象とする。一部の例示的な実施形態では、標的遺伝子は、Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、サイクリンＤ１、ＣＨＫ１、Ｎｏｔｃｈ経路遺伝子、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＤ−Ｌ１、ＲｅｌＢなどであり得る。

【0097】

よって、一部の実施形態では、癌の治療方法であって、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物をその必要がある対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、癌の治療のための本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物の使用を提供する。

【0098】

一部の例示的な実施形態では、癌は癌腫である。一部の実施形態では癌は腺癌である。

【0099】

一部の実施形態では癌はグリオーマである。一部の実施形態では、グリオーマは、星状細胞腫（若年性毛様細胞性星状細胞腫、ローグレード星状細胞腫、未分化星状細胞腫、または神経膠芽腫）；上衣腫；混合膠腫（乏突起星状細胞腫）；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠腫；視神経膠腫および大脳神経膠腫症から選択される。一部の例示的な実施形態では、癌はグレードＩＶの星状細胞腫（多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ））である。一部の実施形態では、ＧＢＭは、化学療法抵抗性ＧＢＭである。

【0100】

一部の実施形態では、本開示のリポソーム粒子または同リポソーム粒子を含む医薬組成物は、局所的な方法で投与され得る。たとえば、ＧＢＭを治療する場合、本粒子または同粒子を含む医薬組成物をＧＢＭ部位に直接投与され得る。

【0101】

一部の実施形態では、本粒子または同粒子を含む組成物の脳の領域（たとえばＧＢＭ対象の初代ニューロスフェアなど）への局所投与は、脳脊髄液の流れに耐えることができ、標的部位へ治療核酸を送達することによりその効果を発揮する。

【0102】

一部の実施形態では、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物は、ｓｉＲＮＡ核酸をその中に被包する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）を対象とするｓｉＲＮＡ分子である（すなわち、ｓｉＲＮＡはＰＬＫ１の遺伝子産物の発現を低減または排除することができる）。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、前神経ＧＢＭを治療するためのＮｏｔｃｈ経路遺伝子またはＰＤＧＦＲＡに対するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、古典的なＧＢＭを治療するためのＥＧＦＲｖＩＩＩに対するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、間葉系ＧＢＭを治療するためのＰＤ−Ｌ１に対するｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、間葉系ＧＢＭに関するＲｅｌｂ（腫瘍の増殖および浸潤の発がんドライバー）に対するｓｉＲＮＡである。

【0103】

一部の実施形態では、ＧＢＭを治療する方法であって、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物の局所投与を含み、上記リポソームがＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡ核酸を被包する、方法を提供する。

【0104】

一部の実施形態では、前神経ＧＢＭを治療する方法であって、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物の局所投与を含み、上記リポソームがＰＤＧＦＲＡのｎｏｔｃｈ経路遺伝子に対するｓｉＲＮＡ核酸を被包する、方法を提供する。

【0105】

一部の実施形態では、古典的なＧＢＭを治療する方法であって、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物の局所投与を含み、上記リポソームが、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するｓｉＲＮＡ核酸を被包する、方法を提供する。

【0106】

一部の実施形態では、間葉系ＧＢＭを治療する方法であって、本開示のリポソームまたは同リポソームを含む医薬組成物の局所投与を含み、上記リポソームが、ＰＤ−Ｌ１および／またはＲｅｌＢに対するｓｉＲＮＡ核酸を被包する、方法を提供する。

【0107】

一部の実施形態では、リポソーム内に被包される複数の核酸種による併用治療は、有益な効果を増大させるために使用され得る。

【0108】

一部の実施形態では、病態を治療する場合に、核酸を担持するリポソームの投与は、１つまたは複数の追加的な治療と併用して行われ得る。たとえば癌を治療する場合、このような併用治療は、化学療法および放射線照射に対する腫瘍の感受性を増加するために使用され得る。一部の例示的な実施形態では、癌治療に関して、ＭＧＭＴ、Ｃｘ４３、ＨｅＲ１／ＥＧＦ−Ｒ４６、ＶＥＧＦ４４、ＢＣＬ−２およびＴｏｌｌ様受容体などの遺伝子を標的とするサイレンシング核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）が使用され、これはさらに相乗的な応答を提供し得る。たとえば、ＭＤＲ−１（多剤耐性）遺伝子の標的化は、この遺伝子の過剰発現がＧＢＭなどの癌における薬剤耐性と相関しているため、抗癌剤の治療の有効性を増大することができる。

【0109】

一部の実施形態では、病態を治療する場合に、核酸を担持するリポソームの反復投与を行ってもよく、ここで投与される用量およびその中に被包された核酸の組成物は同一、類似、または異なってもよい。一部の実施形態では、投与は長期間（１〜１２０時間にわたるなど）であってもよい。

【0110】

多くの例示的な態様および実施形態を上述してきたが、当業者は、これらの特定の修正、並べ替え、追加、およびサブコンビネーションを認識するものである。よって、以下に添付の特許請求の範囲および本明細書の後に導入される特許請求の範囲は、本発明の趣旨および範囲内にあることから、このような修正、並べ替え、追加、およびサブコンビネーションをすべて含むように解釈されると意図されている。

【0111】

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に示すために提示されている。しかしながらこれらは、本発明の広い範囲を限定するように解釈するべきでは決してない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中に開示される原則の多くの変更および修正を容易に考案することができる。

【0112】

実施例
実施例１−ｓｉＲＮＡを被包するカチオン性リポソームの調製
カチオン性脂質の調製
３種類のカチオン性脂質を合成した：脂質のｐＫａが６．７（ＫＣ２およびＭＣ３）ならびに６．８（ＤＬｉｎＤＭＡ）であるＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ。カチオン性脂質を、本質的に図１に要約した通りに合成した。

【0113】

ＤＬｉｎＤＭＡ：３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（１４０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および９５％の水素化ナトリウム（ＮａＨ、３２２ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下で３０分ベンゼン（１０ｍｌ）中で攪拌した。リノール酸（１ｇ、３ｍｍｏｌ）のメシルエステルを添加し、反応物を１８時間アルゴン下で還流した。次に反応混合物を、エタノールをゆっくりと添加することによりクエンチしつつ、氷槽で冷却した。さらにベンゼン５０ｍｌで希釈した後、混合物を蒸留水（２×１００ｍｌ）および鹹水（１００ｍＬ）で洗浄し、必要に応じて、エタノール（〜２０ｍｌ）を使用して相の分離を支援した。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥、蒸発させた。粗製生成物を、０〜５％のメタノールを含むクロロホルムで溶出したシリカゲルカラムで精製した。カラムの分画を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲル、クロロホルム／メタノール９：１ ｖ／ｖ）により解析し、純粋な生成物を含む分画を回収し、濃縮して、淡黄色の油として純粋な生成物ＤＬｉｎＤＭＡ４００ｍｇを得た。

【0114】

２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）：
ジリノレイルケトンの合成：ＣＨ２Ｃｌ２ １００ｍｌ中ジリノレイルメタノール（２．０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）および無水炭酸ナトリウム（０．２ｇ）の混合物に、ピリジニウムクロロクロマート（ＰＣＣ、２．０ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁物を室温で６０分間攪拌した。次に、エーテル（３００ｍｌ）を混合物に添加し、得られた褐色の懸濁物を、シリカゲル（３００ｍｌ）のパッドを介してろ過した。シリカゲルパッドをエーテル（３×２００ｍｌ）でさらに洗浄した。エーテルろ過物および洗浄水を合わせた。溶媒を蒸発させて、粗製生成物として油状の残渣３．０ｇを得た。粗製生成物を、ヘキサン中０〜３％のエーテルで溶出したシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、２５０ｍｌ）でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、ジリノレイルケトン１．８ｇ（９０％）を得た。
２，２−ジリノレイル−４−（２−ヒドロキシエチル）−［１，３］‐ジオキソランの合成：トルエン５０ｍｌ中のジリノレイルケトン（５２７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）；１，２，４−ブタントリオール（工業等級、約９０％、２３６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）；およびピリジニウム ｐ−トルエンスルホナート（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の混合物を、ディーン・スターク管を用いて窒素下で一晩還流して水を除去した。結果として得られる混合物を室温に冷却した。有機相を水（２×３０ｍｌ）、次に鹹水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、帯黄色の油状残渣（０．６ｇ）を得た。粗製生成物を、溶離液としてのジクロロメタンを含むシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍｌ）でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。これにより、純粋な２，２−ジリノレイル−４−（２−ヒドロキシエチル）−［１，３］−ジオキソラン０．５ｇを得た。２，２−ジリノレイル−４−（２−メタンスルホニルエチル）−［１，３］‐ジオキソランの合成：無水ＣＨ２Ｃｌ ２５０ｍｌ中に１（５００ｍｇ、０．８１ｍｍｍｏｌ）の無水トリエチルアミン（２１８ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下でメタンスルホニル無水物（２９０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩攪拌した。混合物をＣＨ２Ｃ１２ ２５ｍｌで希釈した。有機相を水（２×３０ｍｌ）、次に鹹水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、帯黄色の油５１０ｍｇを得た。粗製生成物（２，２−ジリノレイル−４−（２−メタンスルホニルエチル）−［１，３］−ジオキソラン）を、さらなる精製を行うことなく以下のステップに使用した。上記の粗製生成物に、窒素下で、ＴＨＦ中のジメチルアミン２０ｍｌ（２．０Ｍ）を添加した。得られた混合物を室温で６日間攪拌した。油状残渣を、溶媒を蒸発して得た。溶離液としてのジクロロメタン中０〜５％のメタノール勾配を用いたシリカゲル（２３０〜４００メッシュ、１００ｍｌ）でのカラムクロマトグラフィーから、薄色の油として生成物ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ３８０ｍｇを得た。

【0115】

以下のカチオン性リポソームを調製した。
以下の製剤（脂質相組成物）を、１００％エタノール中で調製した：
１．ＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）
２．ＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）
３．ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）．
４．ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）．
５．ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）．
６．ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１５：３：２）。
（Ｃｈｏｌ＝コレステロール；ＤＳＰＣ＝１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＤＭＧ−ＰＥＧ＝１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール；ＰＥ−ＰＥＧ−アミン １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エタノールホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］

【0116】

上述の製剤を以下のように調製した：１００％のエタノールに各脂質相製剤を攪拌しながら注意深く溶解した後、脂質を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）に添加し、多層小胞を作製した（合計３３％のエタノール）。次に、形成した多層小胞を、直径８０ｎｍのフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて、小さな単層の小胞に押し出した。

【0117】

１：１６（ｗｔ／ｗｔ）のｓｉＲＮＡ：脂質の比率で、ｓｉＲＮＡ分子（酢酸塩緩衝液ｐＨ４．０中１．５ｍｇ／ｍｌ−原液）を添加して、３３％のエタノールおよび６６％の酢酸塩緩衝液を形成した。

【0118】

あるいは脂質をエタノール（１００％）と混合し、ｓｉＲＮＡ分子を、酢酸塩緩衝液に再懸濁し、両方をマイクロフルダイザー混合器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）に導入して粒子を形成した。簡潔に述べると、エタノール中に調製した１容量の脂質混合物、および３容量のｓｉＲＮＡ（１：１６ ｗ／ｗ ｓｉＲＮＡ対脂質、酢酸塩緩衝液溶液を含む）を、デュアルシリンジポンプ（Ｍｏｄｅｌ Ｓ２００， ｋＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＡ）を使用して混合し、２ｍｌ／分の組み合わせた流速（エタノールでは０．５ｍｌ／分および水性緩衝液では１．５ｍｌ／分）で、マイクロ混合器を介して溶液を駆動した。

【0119】

粒子（調製方法のいずれかにより調製）を、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して一晩透析して、エタノールを除去した。被包されていないｓｉＲＮＡを除去するために、Ａｍｉｃｏｎ １００Ｋ ＭＷカットオフまたはＭｏｎｏ Ｑカラムを使用した。

【0120】

粒子へのヒアルロン酸（ＨＡ）の結合
低分子量および高分子量の大きさのＨＡ（ＬｉｆｅＣｏｒｅ）を結合に使用した
低ＭＷ ＨＡ ５ｋＤａまたは７Ｋｄａ
高ＭＷ ＨＡ −８００ＫＤａ

【0121】

ＨＡを、アミンカップリング法によりＰＥＧアミンに結合した：まず、ＨＡ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＬＬＣ， ＵＳＡ）のカルボキシル基を、ＤＩＷ中のＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ（１：１の比率のＥＤＣ：ＣＯＯＨ、１：１の比率のＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ）により１〜２時間活性化した。ＨＡ（０．３ｍｇ、５×１０５ｍｍｏｌ）を水に溶解し、（０．２ｍｇ，１０×１０５ｍｍｏｌ）およびスルホ−ＮＨＳ（０．３ｍｇ、１０×１０５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、脂質粒子（アミン―官能基化粒子）をＰＢＳ（ｐＨ７．８〜８．２）に添加した。反応を２〜３時間継続し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して、１２〜１４ｋＤａのカットオフを用いて室温で２３時間透析し、過剰なＨＡおよびＥＤＣおよび非結合の小さなＨＡ（５〜７ｋＤａ）を除去するか、または超遠心を使用して３回洗浄することにより非結合の８００ｋＤａのＨＡを除去した。ＨＡ対アミンの比率を、５：１に維持した（ＨＡ：アミン）。最終的なＨＡ／脂質の比率は、３Ｈ−ＨＡ（ＡＲＣ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＩ）によりアッセイした場合、典型的に７５μｇのΗΑ／μモル濃度脂質であった。

【0122】

実施例２−様々なカチオン性リポソーム製剤の特徴づけ
ｓｉＲＮＡ捕捉効率のアッセイ
ｓｉＲＮＡ被包の効率を、以前に報告された（Ｌａｎｄｅｍａｎ−Ｍｉｌｏ ｅｔ ａｌ． ２０１２ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ａｎｄ Ｐｅｅｒ Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８）Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定した。簡潔に述べると、捕捉効率を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下および非存在下で、異なる製剤試料においてＲＮＡ結合色素ＲｉｂｏＧｒｅｅｎの蛍光を比較することにより決定した。界面活性剤の非存在下では、蛍光を、利用可能な（捕捉されていない）ｓｉＲＮＡのみから測定することができる。対して、界面活性剤の存在下では、蛍光は総ｓｉＲＮＡから測定され、よって、捕捉（％）は、式：ｓｉＲＮＡの捕捉（％）＝［１−（遊離ｓｉＲＮＡ濃度／総ｓｉＲＮＡ濃度）］×１００により表される。

【0123】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析。粒子の大きさおよび形状を、透過型電子顕微鏡により解析した。ＬＮＰを含む水溶液の液滴（ＨＡを含む、または含まない）を、炭素コーティングした銅のグリッドに入れ、空気乾燥した。解析を、Ｊｏｅｌ １２００ ＥＸ （Ｊａｐａｎ）透過型電子顕微鏡で行った。

【0124】

走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：水性試料（ＨＡを含むまたは含まない）を含む粒子を、シリカウェーハ上で乾燥させ、解析を、Ｑｕａｎｔａ ２００ ＦＥＧ（ＵＳＡ）走査型電子顕微鏡で行った。

【0125】

捕捉アッセイの結果を表１に提示する。各組成物の製剤を示す。

【表1】

【0126】

この結果は、粒子内の核酸分子の捕捉の非常に高いパーセンテージ（９１％超）を示唆するものである。

【0127】

粒子の特徴づけのための動的光散乱を行って、粒子の表面特徴を同定した。表面の特徴づけを、７ｋＤａのＨＡでコーティングされたＤＬｉｎＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ４０：４０：１８：１．５：０．５）を含む表１の第１の製剤で行った。原子間力顕微鏡から得た粒子のピクトグラムを図２Ａに示す。この結果は、ヤング係数４３．１ＭＰａの丸い形状の粒子の分散を示す。

【0128】

対照的に、製剤中にＰＥＧ−アミンを含まなかったが、ＰＥ（２０％モル濃度から、１０％、５％、２％、１％または０．５％）を含んだ同様の製剤は、外観検査（沈殿物の凝集のみを示す）により決定されるように、粒子を形成することができなかった。さらに、典型的な動的光散乱サイズ分布は、ノイズ対シグナル比が高いために得ることができず、このことは、このような製剤では十分に安定した粒子が存在しないことを示す。

【0129】

ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）単独またはＨＡ（５Ｋｄａ ＭＷ）に結合したＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）を含む例示的な製剤の解析を、図２〜Ｅに示す。図２Ｂおよび２ＤはＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）およびＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）−ＨＡ（５ＫＤａのＭＷ）のＴＥＭ解析のピクトグラムをそれぞれ示す。図２Ｃおよび２Ｅは、ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）およびＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＣＰＥ−ＰＥＧ−アミン（ｍｏｌ／ｍｏｌ ５０：１０：３８：１８：１．５：０．５）−ＨＡ（５ＫＤａのＭＷ）のＳＥＭ解析のピクトグラムをそれぞれ示す。製剤のゼータ電位は、ＨＡが結合していない場合には３．８±１であり、ＨＡへの結合後では、−８．２±０．７であった。図２Ｂ〜Ｅに示されるように、ＨＡが結合していない粒子は、球形の形状および丸い表面を有し、対してＨＡが結合している粒子は、粒子上に花のような形状を呈する。

【0130】

まとめると、これら結果は、製剤にＰＥＧ−アミンを含めると、安定し、等しく均等に分布した粒子の形成が可能となることを示す。この結果はさらに、追加的なＰＥＧ誘導体を含めると、リポソームの凝縮および安定性をさらに改善することを示唆する。この結果は、リポソーム中の核酸の存在が、粒子の形成を可能にすることをさらに証明する。

【0131】

実施例３：ＣＤ４４を有する標的細胞におけるリポソーム内に被包されたｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の効率的なノックダウン
材料および方法：
細胞株：
ＣＤ４４を発現するヒトの肺腺癌細胞（Ａ５４９）およびＣＤ４４を欠いているヒトの前立腺癌（ＬｎＣａｐ）細胞（フローサイトメトリーによる）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＡＴＣＣにより推奨されるように、１５％のＦＢＳおよび１％の抗生剤を補充したＲＰＭＩ−１６４０で細胞を増殖させた。

【0132】

ｓｉＲＮＡ分子：ＰＬＫ１ ｓｉＲＮＡ分子を、以下の公開されている配列：５’−ＵｍＧｍＡＡＧＡＡＧＡＵＣｍＡｍＣＣｍＣＵＣＣＵＵｍＡ−３’（センス）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に従って合成した。ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、センス鎖およびアンチセンス鎖を、２’−Ｏ−メチル化（ｍ）により修飾した。

【0133】

ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＬｕｃｉ）：センス鎖：５’ ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）’アンチセンス鎖：５’ ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）

【0134】

２’−ＯＭｅ修飾したヌクレオチドを小文字で示し、ホスホロチオエート結合を、「ｓ」で表す。

【0135】

ヒトのＡ５４９およびＬｎＣａｐ細胞におけるトランスフェクション：１５％のＦＢＳおよび１％の抗生剤を含むＲＰＭＩ−１６４０中、３７℃で細胞を増殖させた。トランスフェクションの日に、細胞を、ポリスチレンでコーティングした１２ウェルプレートに、７×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。完全培地中０．３７μＭの濃度の、脂質相および／または遊離（ネイキッド）ｓｉＲＮＡの異なる製剤を添加し、４８時間または７２時間インキュベートした。総ＲＮＡを、２４時間後および４８時間後に単離し、ＰＣＲを行って、トランスフェクション後の癌細胞に存在するＰＬＫ１転写物の量を計算した。

【0136】

定量リアルタイムＰＣＲ解析：製造社のプロトコルに従って、異なるナノ粒子製剤およびネイキッドｓｉＲＮＡと共に２４時間または４８時間インキュベートした後に、ＥＺ−ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して総ＲＮＡを単離した。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ＳＷＩＦＴ−Ｍａｘ Ｐｒｏ， ＥＳＣＯ）を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。その後、ｃＤＮＡ０．６２５ｎｇに、ＰＬＫ１およびＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子として）を標的とする定量的リアルタイムＰＣＲ解析を行った。プライマー配列はＰＬＫ１ フォワード ５’−ＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＴＡＧＧＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＰＬＫ１ リバース ５’−ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。ＧＡＰＤＨ フォワード ５’−ＴＣＡＧＧＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＧＡＰＤＨ リバース ５’−ＧＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）であった。サイバーグリーンを使用して、ＰＣＲ産物を検出した。ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍおよびＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析を行った。相対的な遺伝子発現の値を、ＳｔｅｐＯｎｅ ｖ２．０ ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してΔΔＣＴ法により決定した。内因性の参照物質としてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化し、未処置の対照細胞と比較したＰＬＫ１の発現の差の倍率として、データを提示する。

【0137】

細胞生存率のアッセイ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の生存率を、ＸＴＴアッセイにより測定した。ＸＴＴ試薬（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を、リポソーム製剤での処置から４８時間後に細胞に添加し、製造社のプロトコルに従って４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴＥｋ， Ｉｓｒａｅｌ）により、４５０〜５００ｎｍの波長での吸光度を測定した。

【0138】

粒径の測定：リポソームの大きさを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＫ）を使用した動的光散乱により、ＰＢＳ中で測定した。

【0139】

標的細胞（ＣＤ４４を有する）における、標的遺伝子の発現の低減に及ぼすリポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏでの作用を試験するために、大量のＣＤ４４を発現するヒトの肺腺癌細胞株Ａ５４９、および特異性対照としての非ＣＤ４４発現細胞のＬＮＣＡＰ（ヒトの前立腺癌）を使用した。

【0140】

統計解析
２つの平均値間の差異を、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して試験した。治療グループ間の差異を、ＳＰＳＳソフトウェアの一元配置分散分析により評価した。カプランマイヤー生存解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ｂを用いて行った。

【0141】

ＣＤ４４を、ｐａｎ−ＣＤ４４モノクローナル抗体（クローンＩＭ７）またはそのアイソタイプ対照ｍＡｂ（Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ）を用いて、以前に報告されるように（Ｌａｎｄｅｓｍａｎ−Ｍｉｌｏ Ｄ． ｅｔ ａｌ，． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１２）標識した。試料を回収し、ＦＡＣＳｓｃａｎ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を使用して解析した。各実験点で１０，０００個の細胞を解析した。データ解析を、Ｆｌｏｗ Ｊｏ ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ． Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）を使用して行った。図３は、試験した細胞（Ａ５４９細胞、ＬｎＣａｐ細胞、およびＣＴＲＬ（アイソタイプ対照染色））における代表的なＣＤ４４染色を示す。

【0142】

次に、細胞に以下の脂質ベースの組成物（製剤）をトランスフェクトした（表２）。

【表2】

【0143】

図４Ａ〜Ｂに提示された結果は、製剤１〜３および４〜６でそれぞれトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＰＬＫ１の相対的な遺伝子発現を示す。図４Ｃ〜Ｄに提示された結果は、製剤１〜３および４〜６をそれぞれトランスフェクトしたＬｎＣａｐ細胞におけるＰＬＫ１の相対的な遺伝子発現を示す。

【0144】

これら結果は、粒子の表面上にＨＡコーティングを有する製剤が、ＣＤ４４を有する標的細胞を特異的に向けられるが、ＣＤ４４受容体を担持しない細胞には向けられないため、ＨＡコーティングがリポソーム標的化特性を提供することを示す。この結果はさらに、試験した製剤が、実際に、標的細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達できることにより、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を低減することにより生物学的な作用を発揮することができることを示す。さらに、この結果は、高分子量（８００ｋＤａ）のＨＡが、低分子量（７ｋＤａ）のＨＡと比較して、標的細胞に対して増強された作用をもたらすことを示す。

【0145】

実施例４−単回ｉ．ｖ．注射後の、Ａ５４９ヒト異種移植片モデルにおける標的遺伝子発現の特異的なノックダウン
Ａ５４９細胞（ヒトの肺腺癌細胞（３×１０６個の細胞）を、ＨＢＳＳ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｓｒａｅｌ）で３回洗浄した後に、ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ）の大腿関節の上に移植して、Ａ４５９腫瘍モデルを確立した。

【0146】

次にマウスに、様々な粒子組成物を静脈内注射し、単回ｉ．ｖ．注射から９６時間後に、標的遺伝子（サイクリンＤ１）の遺伝子発現に関する効果をアッセイした。

【0147】

２ｍｇ／ｋｇの濃度のサイクリンＤ１−ｓｉＲＮＡを、ＭＣ３−ＰＥＧ−アミン−ＨＡ（高Ｍｗ ８００ｋＤａ）に配合し、マウスにｉ．ｖ．投与した。

【0148】

サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）遺伝子ＮＭ＿０５３０５６（ｓｉＤ１，センス鎖：ＧＵＡＧＧＡＣＵＣＵＣＡＵＵＣＧＧＧＡＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））に対するｓｉＲＮＡ配列を設計し、Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ， ＵＳＡ）が従来公開されているように（ＷｅｉｎｓｔｅｉｎＳ． ｅｔ ａｌ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ， ２０１２参照）スクリーニングした。サイクリンＤ１標的遺伝子の発現が正規化される対照遺伝子は、Ｕ６、ｅＩＦ３ａおよびｅＩＦ３ｃであった。

【0149】

粒子の組成物の静脈内注射を、５％のグルコースを補充した生理食塩水１００μｌ容量で、０日目、３日目、および６日目に行った。体重を２日ごとにモニタリングした。結果を図５に提示し、これは、粒子の投与から９６時間後の、マウスの様々な組織におけるサイクリンＤ１の相対的な発現を示す。この結果は、注射から９６時間後の腫瘍においてサイクリンＤ１の発現が特異的に低減したが、肺、脾臓、または腎臓では発現が特異的に低減しなかったことを証明している。サイクリンＤ１の発現の約７５％の低減を、腫瘍において、最後のｉ．ｖ．注射から９６時間後に観察することができる。この結果は、他の非腫瘍細胞にはない、腫瘍に対する粒子の特異性を示す。この結果は、機能的な核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの標的細胞への送達における粒子の効率をさらに示し、標的細胞における標的遺伝子の発現に効果的に影響することができる。

【0150】

実施例５：神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞と、ＨＡに結合したリポソーム粒子の特異的な相互作用
材料および方法
細胞株：ヒトの神経膠芽腫細胞株、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１、およびＵ８７ＭＧ（ＷＨＯグレードＩＶ）を、ＧＢＭのモデル細胞として使用した。選択した細胞株は、異なる遺伝的病変のスペクトラムを表す。すべての細胞株を、単層で増殖させ、１０％のウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、および２ｍＭＬのグルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を補充した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に維持した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートし、週に２回継代培養した。

【0151】

フローサイトメトリー解析および免疫組織化学的検査：細胞表面ＣＤ４４抗原のフローサイトメトリーを、Ｃｏｅｈｎ ｅｔ．ａｌ． （２０１４）に記載されるように行った。簡潔に述べると、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−結合型ラット抗ヒトＣＤ４４（クローン１Ｍ７）またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照を、０．５ １０６のＧＢＭ細胞（１０６細胞あたり０．２５μｇ）と共に氷中で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ， ＵＳＡ）を備えるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用してデータを得た。データ解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）を使用して行った。

【0152】

ＧＢＭの患者の８つのパラフィンブロックおよび１つの膠肉腫のブロックを、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したスライドを調べることにより同定した。各腫瘍のブロックから、厚さ４μｍの切片を切断して、正に帯電スライドに載せ、ＩＨＣに使用した。このスライドを、最大６０℃に１時間温め、完全に自動化したプロトコル（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ， Ｖｅｎｔａｎａ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｃ．， Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ， ＵＳＡ）で処理した後、関連するＶｅｎｔａｎａ試薬を標準的な製造社の指示を使用して使用した。簡潔に述べると、切片を脱脂し、再水和した後、抗原の回収のためのＣＣ１の標準的なＢｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ前処理（６０分）を選択した（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。次に切片をあらかじめ希釈したマウス抗ヒトＣＤ４４（０８−０１８４、 Ｚｙｍｅｄ製， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）と共に４０分間インキュベートした。ｕｌｔｒａ Ｖｉｅｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出を行い、ヘマトキシリン（４分）（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で対比染色した。自己染色装置（ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ）での作動が完了した後、スライドを、７０％のエタノール、９５％のエタノール、および１００％のエタノール中で、各エタノールに関して１０秒間脱水させた。カバーガラスを載せる前に、切片を、１０秒間キシレンで清澄にし、エンテランで封入した。解析スコアは、腫瘍部位内のＣＤ４４散乱に基づくものであった。この染色を半定量的にスコア付けする：＋（陽性）、＋＋（強力に陽性）、または＋＋＋（非常に強力に陽性）。

【0153】

様々なヒトＧＢＭ細胞株および原発性ヒトグリオーマ試料（ＧＢＭ患者から入手）におけるＣＤ４４の発現を試験した。この目的のために、３つの代表的なＧＢＭ細胞株：９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、およびＵ２５１を使用した（これらすべては化学療法の治療に耐性があることが報告されている）。Ｐａｎ抗ＣＤ４４ｍＡｂ（モノクローナル抗体）を使用して、３つすべての細胞株のＣＤ４４の発現を検出し、図６Ａに提示されるＦＡＣＳ解析に示されるように、すべての細胞株が、高いＣＤ４４発現を有することが示された。次に、ヒト患者から排出した初代培養グリオーマ細胞におけるＣＤ４４の発現を、免疫組織化学的検査を使用して試験した。代表的な染色ピクトグラムを、図６Ｂの右手のパネルに示す。さらに、ＣＤ４４発現の半定量的な解析を行った患者の試料のリストを、図６Ｂに示す。

【0154】

次に、リポソーム粒子（５０：１０：３８：１．５：０．５のモル比のＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｉ、ＤＭＧ−ＰＥＧ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧアミンを含む、総脂質濃度９．６４ｍＭ）を、グリオーマ細胞に対する結合能に関して試験した。粒子は、対照マーカーとしてＣｙ５−ｓｉＲＮＡ（１：１６ ｗ／ｗ ｓｉＲＮＡ：脂質）を捕捉した（これにより、標的細胞におけるこれらが同定されれば、粒子と細胞が会合していることを表す）。図７Ａ〜Ｂに提示される結果は、ＨＡを含む粒子（ＨＡ−ＬＰ（ＨＡ−脂質ベースの粒子））は、Ｕ８７ＧＭ細胞（図７Ａ）、ならびにＧＢＭ患者からの初代培養ＧＢＭ細胞（図７Ｂ）に相互作用／結合することができるが、ＨＡを含まない粒子（ＨＡ（ＬＰ（脂質粒子））は結合することができないことを証明する。

【0155】

実施例６−ＨＡ−リポソーム粒子を使用した神経膠芽腫（ＧＢＭ）細胞株における細胞死の誘導
神経膠芽腫細胞は、化学療法に耐性があることが知られている。化学療法に対するＵ８７ＭＧ細胞の耐性を検証するために、２つの従来の化学療法剤（すなわちドキソルビシン（ＤＯＸ）および１，３−ビス（２−クロロエチル）−ｌ−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ））を、細胞に及ぼす効果に関して試験した。

【0156】

簡単にまとめると、Ｕ８７ＭＧ細胞を、２００μｌの培養培地中９６マルチウェルプレート上に接種した（１×１０４細胞／ウェル）。２４時間後、異なる濃度のＤＯＸ（Ｔｅｖａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ， Ｉｓｒａｅｌ）およびＢＣＮＵ（ＭＷ ２１４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から購入）を含んだ処置培地に４８時間交換し、次に、ＰＢＳで徹底的に洗浄し、標準的なＸＴＴ生存アッセイを行った。

【0157】

図８に提示した結果は、４８時間の静置培養条件下で１００μＭの最高用量であっても、細胞の生存が＞５０％であったことを示し、化学療法に対するそれらの固有の耐性を確認した。

【0158】

流出ポンプ（ｅｆｌｕｘ ｐｕｍｐ）による細胞からの大きな分子の押し出しを含む細胞の耐性機構に打ち勝つ／迂回するために、たとえばｓｉＲＮＡなどの核酸の形態の特異的細胞周期阻害剤が使用され得る。

【0159】

この目的のために、細胞周期の調節に関与するセリン‐スレオニンプロテインキナーゼであるＰｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）に対する特異的なｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＰＬＫ１）、または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉルシフェラーゼ；ｓｉＬｕｃｉ）を、ＨＡ−ＬＰまたは標的リガンドを欠いた対照粒子（ＬＰ）に捕捉した。脳脊髄液（ＣＳＦ）の流れを模倣するために、Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ．ａｌ． （２００９）により記載されるせん断流条件下でこの実験を１０分（ｍｉｎ）間行い、次いで新鮮な培地による静置条件でのインキュベーションを行った。トランスフェクションから７２時間後に、細胞を、ＰＬＫ１のｍＲＮＡレベルに関して解析した。簡単に述べると、細胞におけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１遺伝子）のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲにより定量化した。トランスフェクションから７２時間後（せん断流下で１０分、および完全に新鮮な培地を伴う静置条件下でさらに７２時間）、総ＲＮＡを、ＥｚＲＮＡ ＲＮＡ精製キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）を使用して単離し、各試料由来のＲＮＡ１μｇを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡ（合計５ｎｇ）の定量化を、サイバーグリーン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ｓｔｅｐ ｏｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）で行った。ＧＡＰＤＨを、ハウスキーピング遺伝子として選択した。プライマー配列は、実施例３に詳述されている。

【0160】

図９Ａ〜Ｂに提示された結果は、ＨＡ−コーティングされた粒子が、ｍＲＮＡおよびＰＬＫ１タンパク質レベル（それぞれ図９Ａおよび９Ｂ）の両方で、せん断流下で強力な遺伝子のサイレンシングを誘導したことを証明する。ＰＬＫ１タンパク質を、９６時間サイレンシングし、タンパク質レベルの回収を、トランスフェクションから１４４時間後に観察した（図９Ｂ）。このサイレンシングの効果は、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃｉ）を捕捉（ｎｅｔｒａｐ）したＨＡ−コーティングされたＬＮＰが、細胞においてＰＬＫ１ｍＲＮＡの発現を低減しなかったため特異的であった。さらに、ＨＡ−ＬＮＰを介して送達されたｓｉＰＬＫ１で観察された強力なサイレンシングは、有効な細胞死に翻訳された（図９Ｃ）。ＨＡを含まない対照粒子（ＬＰ）は、ｓｉＰＬＫ１またはｓｉＬｕｃｉをその中に捕捉してもＰＬＫ１のｍＲＮＡレベルを低減せず、細胞死を誘導しなかった。この結果は、ＬＮＰ表面上のＨＡコーティングが、せん断流下であってもＧＢＭ細胞上で発現したＣＤ４４に高い親和性で結合し、インターナリゼーションの工程が迅速かつ効率的であることを示唆している。

【0161】

実施例７：確立されたグリオーマモデルへの核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの送達
材料および方法
Ｕ８７ＭＧ同所性ＧＢＭモデルの確立：細胞を、１０％のウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地に維持し、５％の二酸化炭素／９５％の空気を含む加湿した大気中、３７℃でインキュベートした。移植の日に、単層の細胞培養物を、０．０５％のトリプシン／エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｅｄｉａｍｉｎｅ）テトラ酢酸溶液を使用して回収した。細胞を計測し、ＰＢＳ３μｌに再懸濁した。５×１０５個のＵ８７ＭＧ細胞を、各動物に３μｌ容量で注射した。

【0162】

動物の宿主
それぞれが〜２０ｇの４〜６週齢の雌性ヌードマウス（系統ｎｕ／ｎｕ）をこの試験に使用した。すべての手法を、Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規則に従って行った。マウスを、標準化された隔離施設内のケージに１群５匹で収容し、２３℃の１２時間の明／暗周期に維持した。動物には実験動物飼料および水を自由に与えた。すべての器具を、取り扱う前に滅菌し、小動物用の無菌的外科技術を使用した。外科手術の時間までマウスに餌を与えた。０．１５ｍｇ／１０ｇ体重の用量でのケタミン／キシラジン溶液（生理食塩水１７ｍｌ中２００ｍｇのケタミンおよび２０ｍｇのキシラジン）の腹腔内注射により、動物に麻酔をかけた。

【0163】

移植部位の同定：動物の頭部を、両外耳道を結ぶ線の後ろを１本の指で保持することにより手動で安定化した。皮膚をポビドンヨード溶液で準備し、次に、正中線のすぐ右で両外耳道を結ぶ線の前方に長さ２〜３ｍｍの切開部を作製して、冠状縫合および矢状縫合を同定できるようにして、ブレグマの位置を特定した。刺入点として、ブレグマの２．５ｍｍ外側および１ｍｍ前方に印をつけた。この点は、腫瘍の生着に関して非常に信頼できる頭蓋内部位であることが示されている尾状核の真上に位置しているため、選択されている。

【0164】

穿孔の配置：直径１ｍである小さな手動のツイストドリルを使用して、動物の頭蓋のエントリポイントに穿孔を作製した。ドリルビットは、硬膜を貫通し、これにより硬膜を開く。

【0165】

ハミルトンシリンジによる細胞の注射：細胞浮遊液３μｌを、カフ付きの２６ゲージ針のハミルトンシリンジに入れた。定位固定装置を使用して、ツイストドリルにより作製した中心となる頭蓋の穴に、ハミルトンシリンジの針をゆっくりと下げた。刺入点および針の進入の深さに基づき、細胞を、尾状核に確実に注射する。細胞浮遊液をゆっくりとマウスの脳に注射した（典型的に５分間にわたり）。細胞浮遊液の全量を注射した後、針を手動で除去した。頭皮を閉じるように縫合を行った。麻酔から回復するまでマウスを温め続け、治療介入の腫瘍内注射の時間まで、自由に周囲を移動させた。この間に、注射した腫瘍細胞は増殖し、実質内異種移植片として自身を確立する。腫瘍内注射の技術は、ＨＡ−ＬＮＰがそれぞれ３μｌの４回投与で確立した異種移植片へ送達されることを除き、腫瘍細胞の移植技術と類似である。第１の投与を、７日目および０日目に行い、次の投与を、２０日目および２２日目に行った。マウスを、全実験期間で観察されなかった体重の変化を含む総合的な毒性試験に関してモニタリングした。

【0166】

上述するように、ヒトＵ８７Ｇ細胞を使用して、胸腺欠損ＢＡＬＡ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて同所性異種移植片モデルを作製した。これは、ヒトのグリオーマの増殖、生物学、および処置を試験するモデルとして作用する。５×１０５個のＵ８７Ｇ細胞の浮遊液３μｌを各動物に注射した。組織学解析を、１２日目（接種後）に行った。代表的な組織学のピクトグラムを図１０に提示する。

【0167】

次に、粒子（ＨＡ−ＬＰ）またはＬＰを介した）内に被包した０．２ｍｇ／ｋｇ体重のＣｙ３−ｓｉＲＮＡ３μｌを、腫瘍の接種から２０日後に、腫瘍の近くに直接投与（注射）した。マウス（ｎ＝６）を、投与から３時間後、６時間後、および２４時間後に屠殺した。脳の切片を作製して、直ちに共焦点顕微鏡解析を行い、異なる時点での腫瘍内のＣｙ３−ｓｉＲＮＡの分布を同定した。ＨＡ−ＬＰ粒子の投与後の結果の代表的なデータを、図１１Ａ〜Ｃに示されるピクトグラムに提示する。Ｃｙ３シグナルの検出は、すべての切片においてＨＡ−ＬＰで処置したマウスでのみ観察され、これは、投与から３時間後、６時間〜２４時間後まで増大した（それぞれ図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃ）。ＬＰ（すなわちＨＡを含まない粒子）を用いて投与した場合、Ｃｙ３シグナルは腫瘍の組織で検出されなかった。これは、このような粒子をＵ８７ＭＧ細胞に接着させないようにする脳脊髄液（ＣＳＦ）によるせん断流に起因し得る。対して、ＨＡを含む粒子は、細胞上に発現されたＣＤ４４に対するＨＡの特異的な結合により、細胞に接着する。

【0168】

実施例８：Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＰＬＫ１のｉｎ ｖｉｖｏでのサイレンシングはＧＢＭ担癌マウスの生存を延長させる。
材料および方法
脳組織からの単細胞浮遊液の調製：製造社のプロトコルに従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒおよび神経組織分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した酵素分解により、神経組織を単細胞浮遊液に解離させた。簡潔に述べると、ＨＢＳＳまたはＰＢＳのいずれかを用いてマウスを灌流し、脳を摘出し、組織量に対する緩衝液および酵素ミクスを調節するために重量を測定した。あらかじめ温めた酵素混合物を組織に添加し、３７℃で攪拌しながらインキュベートした。組織を機械的に解離させて、浮遊液を７０μｍのろ過器に適用した。フローサイトメトリー解析に干渉する可能性があるため、ミエリンを、ミエリン除去ビーズＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して除去した。直ちに細胞を処理し、抗ヒトＣＤ４４ｖ６−ＦＩＴＣ（マウスと非交差反応性、クローンＭＣＡ１７３０Ｆ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色して、Ｕ８７ＭＧ細胞を同定した。細胞を氷中で３０分間インキュベートし、次に２回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）を使用してＦＡＣＳソーティングを行った。ソーティングした細胞を、ＥｚＲＮＡ ＲＮＡ精製キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ， Ｉｓｒａｅｌ）に直接移動させ、上述のＱＰＣＲを使用してＰＬＫ１ ｍＲＮＡレベルに関して解析した。

【0169】

ＧＢＭ同所性モデルをさらに使用して、腫瘍の接種の２０日目および２２日目に、ＰＬＫ１に対するｓｉＲＮＡを被包した粒子（実施例６）の局所投与（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）後のＰＬＫ１遺伝子発現のｉｎ ｖｉｖｏでのサイレンシングを試験した。脳において他の種類の細胞から腫瘍細胞を同定するために、腫瘍組織を採取し、単細胞浮遊液を作製し、細胞を、Ｕ８７ＭＧ細胞（ＣＤ４４ｖ６）上で発現される表面マーカーと共にインキュベートした。抗ヒトＣＤ４４ｖ６−ＦＩＴＣ抗体（マウスと非交差反応性）を、氷中で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、ＦＡＣソーティングを行った。ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ，ＢＤ）でソートした細胞を、ＱＰＣＲを使用してＰＬＫ１ ｍＲＮＡレベルに関して解析した。図１２Ａの棒グラフに示されるように、８０％の強力なノックダウンが、ＨＡ−ＬＰ（「ＨＡ−ＬＮＰ」）で送達されたｓｉＰＬＫ１で処置されたＵ８７ＭＧ ＣＤ４４ｖ６＋細胞において観察された。ＰＬＫ１発現に関する効果は、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃｉ）を使用した場合には観察されなかった。

【0170】

次に、粒子中に捕捉されたｓｉＲＮＡが、炎症誘発性応答の引き金とならないことを示すために、初代培養マウス細胞を脳から単離し、この細胞を、抗マウスＣＤ１１ｂ ｍＡｂを使用してソートし（ＦＡＣＳにより）、マウスのミクログリア細胞を得た。これら細胞は、ｓｉＲＮＡが送達される場合に潜在的な局所的炎症性応答に関与し得る。この細胞を、２つの用量（０．０５および０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ）で、粒子（ＨＡ−ＬＰ）に捕捉／被包されたｓｉＲＮＡと共にインキュベートし、初代培養細胞とのインキュベーションから６時間後のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６レベルに関して調べた。ＬＰＳを、陽性対照として使用した。図１２Ｂ〜Ｃに示されるように、低濃度では炎症誘発性サイトカイン（それぞれＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）の誘導は観察されず、より高濃度では、非常に軽度の誘導が観察された。よってこれらの結果は、ＨＡを含む粒子（ＨＡ−ＬＰ）が、非常に効率的にｓｉＲＮＡを保護し、ＣＤ１１ｂ＋細胞と直接相互作用する場合であっても炎症誘発性応答の引き金とはならないという知見を裏付ける。

【0171】

ＰＬＫ１の強力なサイレンシングが、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスに移植された異なる腫瘍で腫瘍の退縮を誘導したことが示されている（Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ．ａｌ． （２０１４））。よって、同所性ＧＢＭモデルを使用して、マウスの生存に及ぼすＰＬＫ１サイレンシングの効果を試験した（図１２Ｄ）。ＧＢＭ腫瘍部位に、０．５ｍｇ／ｋｇ体重の、ｓｉＰＬＫ１またはｓｉＬｕｃｉを被包する粒子３μｌ（投与あたり）を、腫瘍の接種から７日後、９日後、２０日後、および２２日後に局所投与した。モック処置したマウスの生存時間中央値は、３３日であると決定された。カプランマイヤー生存解析に従って、ｓｉＬｕｃを被包したＨＡ−ＬＰを４回投与したマウスは、３４．５日の生存時間中央値を有し、ｓｉＰＬＫ１を被包したＨＡ−ＬＰを投与したマウスは、腫瘍の接種から９５日目に、顕著な６０％の生存を伴う長期間の生存時間を有した（ｓｉＰＬＫ１およびｓｉＬｕｃｉで処置した群の間でｐ＝０．００１２）。これは、この同所性ＧＢＭモデルにおいて今まで報告されている最も長い生存時間である。さらにこれは、治療的ｓｉＲＮＡを局所治療で使用して、ＧＢＭの同所性モデルにおいて治療上の有益性を達成した最初の例である。

【0172】

【表3】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B-E】

【図3】

【図4A-B】

【図4C-D】

【図5】

【図6A-B】

【図7A-B】

【図8】

【図9A-C】

【図10】

【図11A-C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]