特許 6903432 ＣＮＳの疾患および傷害を処置するために全身性調節性Ｔ細胞のレベルまたは活性を低下させること

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6903432

(24)【登録日】2021年6月25日

(45)【発行日】2021年7月14日

(54)【発明の名称】ＣＮＳの疾患および傷害を処置するために全身性調節性Ｔ細胞のレベルまたは活性を低下させること

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210701BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20210701BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 DZMD

   A61K39/395 N

   A61K39/395 U

   A61P25/28

【請求項の数】11

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2016-556895(P2016-556895)

(86)(22)【出願日】2015年3月12日

(65)【公表番号】特表2017-512771(P2017-512771A)

(43)【公表日】2017年5月25日

(86)【国際出願番号】IL2015050265

(87)【国際公開番号】WO2015136541

(87)【国際公開日】20150917

【審査請求日】2017年12月11日

【審判番号】不服2019-15661(P2019-15661/J1)

【審判請求日】2019年11月22日

(31)【優先権主張番号】61/951,783

(32)【優先日】2014年3月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/030,164

(32)【優先日】2014年7月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500018608

【氏名又は名称】イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アイゼンバッハ‐シュワルツ、ミハエル

(72)【発明者】

【氏名】バルーク、クティ

(72)【発明者】

【氏名】ローゼンツワイク、ネタ

【合議体】

【審判長】 岡崎 美穂

【審判官】 原田 隆興

【審判官】 齋藤 恵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５１３０７９号公報

【文献】 特開２０１２−１５８６０５号公報

【文献】 国際公開第２０１４／０３７９５２号

【文献】 特開２０１３−１５０６０６号公報

【文献】 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３年，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１，ｐｐ．７−２０

【文献】 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３年１２月１０日，Ｖｏｌ．５８，ｐｐ．８５−９１

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４年１０月１５日，Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１−２，ｐｐ．２０６−２０７，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１１５

【文献】 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７年，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．４１３−４１６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K39/00-39/44

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体のアルツハイマー病を処置するために使用されるための、個体における全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な薬剤を含む医薬組成物であって、該活性な薬剤は、抗ＰＤ−１中和抗体、抗ＰＤ−Ｌ１中和抗体またはこれらの組み合わせであり、
全身的免疫抑制のレベルを一時的に減少させる投薬計画によって投与され、
該投薬計画が、少なくとも２回の治療過程であって、ただし、それぞれの治療過程が順に、該個体に該医薬組成物が投与される処置期、その後での該個体に該医薬組成物が投与されない非処置期を含み、
前記非処置期が、２週間〜６ヶ月の長さであり、
前記処置期が反復投与を含む場合は：
前記医薬組成物が前記処置期中に３日毎に１回投与され；
前記処置期が３日〜４週間の長さであり；かつ
前記非処置期が前記処置期中における反復投与の間の期間よりも長い；
医薬組成物。

【請求項2】

前記処置期が反復投与を含む場合は、前記処置期が３日の長さである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記処置期が、前記医薬組成物を前記個体に投与することを含み、前記処置期が、少なくとも前記レベルが参照基準よりも低くなるまでは維持され、前記投与することが前記非処置期の期間中は休止され、かつ、前記非処置期が、前記レベルが前記参照基準よりも低い限りは維持され、
前記参照基準が、
（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる最も最近の血液サンプルにおいて測定される調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベル；あるいは
（ｂ）アルツハイマー病に苦しむ個体の集団に特徴的である調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベル
から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記参照基準が、前記投与する前における前記個体から得られる最も最近の血液サンプルにおいて測定される調節性Ｔ細胞の全身的存在または活性のレベルである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記処置期が、前記医薬組成物を前記個体に投与することを含み、かつ、前記処置期が、少なくともＩＦＮγ産生白血球の全身的存在またはレベルが参照基準を超えて増大するまでは維持され、そして、前記投与することが前記非処置期の期間中は休止され、かつ、前記非処置期が、前記レベルが前記参照基準を超えている限りは維持され、
ただし、前記参照基準が、
（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる直近の血液サンプルにおいて測定されるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在または活性のレベル；あるいは
（ｂ）アルツハイマー病に苦しむ個体の集団に特徴的であるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在または活性のレベル
から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記調節性Ｔ細胞が、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のうちの１つまたは複数を発現するＦｏｘＰ３^＋細胞、あるいは、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１の表面分子のうちの１つまたは複数を発現するＦｏｘＰ３⁻細胞から選択されるＣＤ４^＋細胞である、請求項３又は４に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記調節性Ｔ細胞がＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞またはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３⁻細胞である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記活性な薬剤が、抗ＰＤ−Ｌ１中和抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記薬剤が、抗ＰＤ−１中和抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記アルツハイマー病の処置が、認知機能の改善をもたらす、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記認知機能が、学習、記憶、心象の創造、思考、認識、推論、空間的能力、発話技能および言語技能、言語習得、及び／または判断注意のための能力である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般には、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または傷害を、循環における全身的免疫抑制のレベルを一時的に低下させることによって処置するための方法および組成物に関連する。

【背景技術】

【0002】

中枢神経系（ＣＮＳ）のほとんどの病変が、疾患進行の一部であり、かつ、疾患憎悪の一因である共通する神経炎症成分を介している。これらの病変の１つが、アルツハイマー病（ＡＤ）、すなわち、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド凝集体の蓄積がＣＮＳ内の炎症カスケードにおいて重要な役割を果たし、最終的にはニューロンの損傷および組織破壊を引き起こすことが示唆された、記憶機能および認知機能の進行性喪失によって特徴づけられる加齢に関連した神経変性疾患である（Ａｋｉｙａｍａ他、２０００；Ｈａｒｄｙ＆Ｓｅｌｋｏｅ、２００２；Ｖｏｍ Ｂｅｒｇ他、２０１２）。様々な神経変性疾患における長期間に及ぶ神経炎症性応答にもかかわらず、過去１０年間にわたる臨床研究および前臨床研究では、免疫抑制に基づく治療法が神経変性疾患において調べられる一方で、抗炎症性薬物がなぜ不足しているかに関して疑問が生じている（Ｂｒｅｉｔｎｅｒ他、２００９；Ｇｒｏｕｐ他、２００７；Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ＆Ｒｏｇｅｒｓ、２０１２）。本発明者らは、ＡＤならびにＣＮＳの類似する疾患および傷害の既存の治療法の欠点を克服する新規な答えを提供する；この方法は、ＣＮＳの維持および修復における全身性免疫系および中枢性免疫系の種々の成分の役割を本発明者らが独自の理解に基づいている。

【発明の概要】

【0003】

１つの局面において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害を処置する際に使用されるための、個体における全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な薬剤を含む医薬組成物であって、少なくとも２回の治療過程（ただし、それぞれの治療過程が順に、処置期、その後での非処置の間欠期を含む）を含む投薬計画によって投与するための医薬組成物を提供する。

【0004】

別の局面において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まない中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または傷害を処置するための方法であって、その必要性のある個体に、請求項１〜２４のいずれか一項に記載される医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物が、少なくとも２回の治療過程（ただし、それぞれの治療過程が順に、処置期、その後での非処置期間の間欠期を含む）を含む投薬計画によって投与される、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1A-B】ＡＤの５ＸＦＡＤ遺伝子組換えマウスモデル（ＡＤ−Ｔｇ）における疾患進行に沿う脈絡叢（ＣＰ）活性を示す。（Ａ）１月齢、２月齢、４月齢および８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスから単離されるＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される、ｉｃａｍ１、ｖｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２の各遺伝子についてのｍＲＮＡ発現レベルであって、月齢一致のＷＴ型コントロールと比較して変化倍数として示されるｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝６〜８／群；各時点についてのスチューデントｔ検定）。（Ｂ）上皮タイトジャンクション分子クローディン−１についての免疫染色、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色およびインテグリンリガンドＩＣＡＭ−１についての免疫染色が行われた８月齢ＡＤ−Ｔｇマウスおよび月齢一致ＷＴ型コントロールのＣＰの代表的な顕微鏡画像（スケールバー、５０μｍ）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図2A-C】（Ａ）若年者および高齢者のＣＮＳ非疾患者ならびにＡＤ患者のヒト死後ＣＰにおけるＩＣＡＭ−１免疫反応性の定量化（ｎ＝５／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）；（Ｂ）８月齢ＡＤ−Ｔｇマウスおよび月齢一致ＷＴ型コントロールのＣＰにおけるＩＦＮ−γ発現免疫細胞（細胞内染色され、ＣＤ４５に対してプレゲート処理されたもの）についてのフローサイトメトリー分析。網掛けヒストグラムはイソタイプコントロールを表す（ｎ＝４〜６／群；スチューデントｔ検定）；ならびに（Ｃ）月齢一致のＷＴ型コントロールと比較される４月齢および８月齢のＡＤ−Ｔｇマウスから単離されるＣＰ組織における、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されるｉｆｎ−γのｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝５〜８／群；各時点についてのスチューデントｔ検定）を示す。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図3A-B】（Ａ）８月齢のＡＤ−ＴｇマウスおよびＷＴ型コントロールマウスにおける（ＴＣＲβに対してプレゲート処理された）ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋脾細胞頻度の代表的なフローサイトメトリープロット、ならびに、（Ｂ）１月齢、２月齢、４月齢および８月齢のＡＤ−ＴｇマウスおよびＷＴ型コントロールマウスから得られる脾細胞の定量的分析（ｎ＝６〜８／群；各時点についてのスチューデントｔ検定）を示す。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図4】ＤＴｘの最後の注入の１日後におけるＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋／−マウスから得られる脾細胞のゲート処理戦略および代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＤＴｘを４日間連続してｉ．ｐ．注入し、これにより、Ｆｏｘｐ３^＋細胞の約９９％の枯渇化を達成した。

【図5A-G】ＡＤ−ＴｇマウスにおけるＴｒｅｇの一時的枯渇化の影響を示す。（Ａ）（ＤＴＲ導入遺伝子を発現する）ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋と、ＤＴＲを発現しないＡＤ−Ｔｇ同腹子（ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ⁻）コントロール群とを４日間連続してＤＴｘにより処置した。最後のＤＴｘ注入の１日後での、６月齢のＤＴｘ処置ＡＤ−Ｔｇマウスにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される、ｉｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２の各遺伝子についてのＣＰ ｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝６〜８／群；スチューデントｔ検定）。（Ｂ〜Ｄ）最後のＤＴｘ注入の３週間後での、６月齢のＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇマウスおよびコントロールの脳の実質組織（別個に切除された脈絡叢を除く）のフローサイトメトリー分析。ＤＴｘにより処置されたＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋マウスおよびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロールの脳の実質組織における、増大した数のＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ／ＣＤ４５^ｈｉｇｈｍｏ−ＭΦおよびＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す定量的フローサイトメトリー分析（Ｂ）、ならびに、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ頻度の代表的なフローサイトメトリープロット（Ｃ）および定量的分析（Ｄ）（ｎ＝３〜７／群；スチューデントｔ検定）。（Ｅ）最後のＤＴｘ注入の３週間後での、６月齢のＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ ＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋およびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ−コントロールの脳の実質組織におけるｆｏｘｐ３およびｉｌ１０のｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝６〜８／群；スチューデントｔ検定）。（Ｆ）最後のＤＴｘ注入の３週間後での、６月齢のＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋マウスおよびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ⁻コントロールマウスの海馬切片における低下したアストログリオーシスを示す、ＧＦＡＰ免疫染色の定量的分析（スケールバー、５０μｍ；ｎ＝３〜５／群；スチューデントｔ検定）。（Ｇ）最後のＤＴｘ注入の３週間後での、脳の実質組織におけるｉｌ−１２ｐ４０およびｔｎｆ−αのｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝６〜８／群；スチューデントｔ検定）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図6A-E】Ａβプラーク学習／記憶成績に対するＴｒｅｇの一時的枯渇化の影響を示す。Ａβプラークについての免疫染色およびＨｏｅｃｈｓｔ核染色が行われた、最後のＤＴｘ注入の３週間後での、５月齢のＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋マウスおよびＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ⁻コントロールマウスの脳の（Ａ）代表的な顕微鏡像および（Ｂ）定量的分析（スケールバー、２５０μｍ）。海馬の歯状回（ＤＧ）および大脳皮質の第５層における平均のＡβプラーク面積およびＡβプラーク数を定量化した（６μｍの脳薄片において；ｎ＝５〜６／群；スチューデントｔ検定）。図６Ｃ〜６Ｅは、最後のＤＴｘ注入の３週間後での、６月齢のＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ／Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲ^＋マウスおよびコントロールマウスのモリス水迷路（ＭＷＭ）試験成績を示す。一時的なＴｒｅｇ枯渇化の後、ＡＤ−Ｔｇマウスの方が、ＡＤ−Ｔｇコントロールと比較して、ＭＷＭの（Ｃ）習得期、（Ｄ）プローブ期および（Ｅ）反転期における良好な空間学習／記憶成績を示した（ｎ＝７〜９／群；個々のペア比較についての二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ事後解析；^＊、Ｐ＜０．０５、取得、プローブおよび反転のすべてについて）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図7】月齢一致のＷＴ型コントロールと比較される６月齢および１２月齢のＡＰＰ／ＰＳ１ ＡＤ−Ｔｇマウス（アルツハイマー病のためのマウスモデル（材料および方法を参照のこと））から単離されるＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されるｉｆｎ−γのｍＲＮＡ発現レベルを示す（ｎ＝５〜８／群；スチューデントｔ検定）。エラーバーは±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５。

【図8A-I】ＡＤ−Ｔｇマウスにおける毎週のグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）の投与の治療効果を示す。（Ａ）毎週ＧＡ処置療法の概略図。マウス（５月齢）にＧＡ（１００μｇ）を４週間の全期間にわたって、第１週の期間中は２回（１日目および４日目）、その後は毎週１回、ｓ．ｃ．注入した。マウスを認知成績について最後の注入の１週間後（ＭＷＭ）、１ヶ月後（ＲＡＷＭ）および２ヶ月後（ＲＡＷＭ；実験での異なる空間設定を使用する）に調べ、また、海馬の炎症について調べた。図８Ｂ〜８Ｄは、６ｍの月齢における非処置ＡＤ−Ｔｇマウスおよび毎週ＧＡ処置のＡＤ−Ｔｇマウスの海馬における様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示しており、（Ｂ）炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１２ｐ４０など）の低下した発現、（Ｃ）抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０およびＴＧＦ−β）の上昇、および、（Ｄ）神経栄養因子（ＩＧＦ−１およびＢＤＮＦ）の上昇が、毎週ＧＡ処置のマウスにおいて示される（ｎ＝６〜８／群；スチューデントｔ検定）。図８Ｅ〜図８Ｇでは、ＡＤ−Ｔｇマウス（５月齢）を毎週ＧＡにより、またはビヒクル（ＰＢＳ）によりそのどちらかで処置し、６ｍの月齢でＭＷＭ課題において月齢一致のＷＴ型同腹子と比較した。処置されたマウスの方が、コントロールと比較して、ＭＷＭの習得期（Ｅ）、プローブ期（Ｆ）および反転期（Ｇ）における良好な空間学習／記憶成績を示した（ｎ＝６〜９／群；個々のペア比較についての二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ事後）。図８Ｈ〜図８Ｉは、最後のＧＡ注入の１ヶ月後（Ｈ）または２ヶ月後（Ｉ）での、ＲＡＷＭ課題における同じマウスの認知成績を示す（ｎ＝６〜９／群；個々のペア比較についての二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ事後）。データは、少なくとも３回の独立した実験を表している。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図9A-H】ＡＤ−Ｔｇマウスにおける毎週ＧＡの投与のさらなる治療効果を示す。Ａ〜Ｂは、毎週ＧＡまたはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかにより処置され、投与計画の第１週終了時において（合計で２回のＧＡ投与の後で）調べられた５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスを示す。月齢一致のＷＴ型コントロールと比較される処置された６月齢のＡＤ−Ｔｇマウスにおける、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋脾細胞頻度についてのフローサイトメトリー分析（Ａ）、および、ＣＰのＩＦＮ−γ発現免疫細胞（Ｂ；細胞内染色され、ＣＤ４５に対してプレゲート処理されたもの）（ｎ＝４〜６／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。（Ｃ）毎週ＧＡまたはビヒクルのどちらかにより処置され、毎週ＧＡ療法の第１週または第４週の終了時のどちらかで調べられる４月齢のＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される、ｉｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２の各遺伝子についてのｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝６〜８／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。図９Ｄ〜図９Ｅは、毎週ＧＡの後での６月齢ＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}ＢＭキメラ体から得られる脳切片の代表的な像を示す。ＣＸ_３ＣＲ１^ＧＦＰ細胞が、毎週ＧＡにより処置されたＡＤ−Ｔｇマウスでは、第３脳室のＣＰ（３Ｖ；ｉ）、隣接する脳室空間（ｉｉ）、および、側脳室のＣＰ（ＬＶ；ｉｉｉ）に局在化していた（Ｄ；スケールバー、２５μｍ）。骨髄性マーカーＣＤ６８とのＧＦＰ^＋細胞の共局在化が、毎週ＧＡにより処置された７月齢のＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}マウスにおいて示され、しかし、コントロールのＰＢＳ処置ＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}マウスでは示されない、共焦点ｚ軸方向積重ねの代表的な直交投影図（Ｅ；スケールバー、２５μｍ）。（Ｆ）ＣＸ_３ＣＲ１^ＧＦＰ細胞が、ＧＡ処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}マウスの脳において、Ａβプラークの近傍に骨髄性マーカーＩＢＡ−１と共局在化し、骨髄性マーカーＩＢＡ−１を共発現する（スケールバー、２５μｍ）。図９Ｇ〜図９Ｈは、４月齢のＷＴ型マウス、非処置ＡＤ−Ｔｇマウス、および、毎週ＧＡ療法の第２週でのＡＤ−Ｔｇマウスの海馬から単離された細胞の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ／ＣＤ４５^ｈｉｇｈｍｏ−ΜΦをゲート通過させ（Ｇ）、定量化した（Ｈ；ｎ＝４〜５／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図10A-H】ＡＤ−Ｔｇマウスにおけるｐ３００阻害剤（Ｃ６４６）の投与の治療効果を示す。図１０Ａおよび図１０Ｂでは、高齢マウス（１８月）を１週間の期間にわたってｐ３００ｉまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかにより処置し、処置中断の１日後に調べた。ＩＦＮ−γを発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の脾臓での頻度（Ａ）およびＣＰでのＩＦＮ−γ発現免疫細胞数（Ｂ）における増大をｐ３００ｉ処置の後で示す代表的なフローサイトメトリープロット。図１０Ｃ〜図１０Ｅは、ｐ３００ｉまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかを１週間の期間にわたって受け、続いてさらに３週間の後で調べられた１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスの脳におけるＡβプラーク負荷の代表的な顕微鏡像（Ｃ）および定量的分析を示す。脳をＡβプラークについて免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色によって免疫染色した（ｎ＝５／群；スケールバー、２５０μｍ）。平均のＡβプラーク面積およびＡβプラーク数を海馬ＤＧ（Ｄ）および大脳皮質の第５層において定量化した（Ｅ）（６μｍの脳薄片において；ｎ＝５〜６／群；スチューデントｔ検定）。（Ｆ）月齢が７ヶ月であるＡＤ−Ｔｇマウスの種々の群に対する、１回または２回のどちらかでのｐ３００ｉ処置（またはビヒクルとしてのＤＭＳＯ）投与計画の概略図。図１０Ｇ〜図１０Ｈは、非処置ＡＤ−Ｔｇ群と比較して、大脳皮質（第５層）のＡβプラーク被覆率の変化平均（Ｇ）、ならびに、平均での脳の可溶性のＡβ_１＿４０タンパク質レベルおよびＡβ_１＿４２タンパク質レベルにおける変化（Ｈ）を示す（非処置群におけるＡβ_１＿４０およびＡβ_１＿４２の平均レベル、９０．５±１１．２ｐｇ／ｍｇ総タンパク質および６３．８±６．８ｐｇ／ｍｇ総タンパク質、それぞれ；ｎ＝５〜６／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図11A-B】ＡＤ−Ｔｇマウスにおける抗ＰＤ１抗体の投与の治療効果を示す。（Ａ）マウスの実験群、それらの月齢、処置投与計画、および、マウスが調べられた時点の概略図。１０ヶ月の月齢において、５ＸＦＡＤアルツハイマー病（ＡＤ）遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスに２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４）またはコントロールＩｇＧ（ラット）抗体のどちらかを実験の１日目および４日目にｉ．ｐ．注入した。マウスを３週間後に、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）での空間学習・記憶課題によってそれらの認知成績について調べた。月齢を一致させた未処置のＷＴ型マウスおよびＡＤ−Ｔｇマウスをコントロールとして使用した。（Ｂ）は、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）での空間学習・記憶課題によって評価されるような認知成績を示す。データを、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析し、ボンフェローニ事後手順を追跡調査でのペア毎の比較のために使用した。ｎ＝６〜１２／群。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図12A-B】ＡＤ−Ｔｇマウスにおける抗ＰＤ１抗体の投与のＩＦＮ−γ^＋産生Ｔ細胞に対する全身的影響を示す。（Ａ）マウスの実験群、それらの月齢、処置投与計画、および、マウスが調べられた時点の概略図。マウスに２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４）またはコントロールＩｇＧ（ラット）抗体のどちらかを実験の１日目および４日目にｉ．ｐ．注入し、マウスを７日目に調べた。（Ｂ）ＰＤ−１またはＩｇＧにより処置されたＡＤ−Ｔｇマウス、ならびに、非処置のＡＤ−ＴｇコントロールおよびＷＴ型コントロールにおけるＣＤ４^＋ＩＦＮ−γ^＋Ｔ細胞の脾細胞頻度（細胞内染色され、ＣＤ４５およびＴＣＲ−βに対してプレゲート処理されたもの）についてのフローサイトメトリー分析（ｎ＝４〜６／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析；^＊＊、Ｐ＜０．０１（示された処置群の間において；エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す）。

【図13A-B】ＡＤ−Ｔｇマウスにおける抗ＰＤ１処置の後でのＣＰに対する影響を示す。月齢が１０ヶ月であるＡＤ−ＴｇマウスをＰＤ−１またはＩｇＧにより処置したか、あるいは未処置のままにした。マウスに２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４）またはコントロールＩｇＧ（ラット）抗体のどちらかを実験の１日目および４日目にｉ．ｐ．注入し、マウスを７日目に調べた。（Ａ）リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定される場合のＣＰでのＩＦＮ−γレベルは、 に対して正の相関があり（ピアソンのｒ＝０．６２８４、Ｐ＜０．０５）、フローサイトメトリーによって測定される場合のＣＤ４^＋ＩＦＮ−γ^＋Ｔ細胞の脾細胞頻度に対して負の相関があった。ＣＰでのＩＦＮ−γレベルがＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇの脾細胞頻度と比較されたとき（ｎ＝３〜４／群）、逆の負の傾向が、同じマウスにおいて認められた。（Ｂ）同じマウスのＣＰにおける、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されるｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２の各遺伝子についてのｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝３〜４／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を意味する；^＊、Ｐ＜０．０５。

【図14A-B】１回の処置過程を２回の処置過程に対して比較したときの、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける抗ＰＤ１抗体の投与の治療効果を示す。１回の抗ＰＤ１処置過程を受けた図１１Ａ〜図１１Ｂに記載されるマウス群におけるマウスの半数が、最初のＲＡＷＭ課題の後でのもう１回の抗ＰＤ１処置過程を受けたか、または非処置のままにされた。さらに３週間の後において、すべてのマウスを、認知学習および記憶のための空間合図の異なる、かつ、新しい実験設定を使用するＲＡＷＭによって試験した。（Ａ）マウスの実験群、それらの月齢、処置投与計画、および、マウスが調べられた時点の概略図。それぞれの処置過程のために、マウスに２５０ｕｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４）またはコントロールＩｇＧ（ラット）抗体のどちらかをｉ．ｐ．注入した。（Ｂ）は、ＲＡＷＭでの空間学習・記憶課題によって評価されるような認知成績を示す。データを、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析し、ボンフェローニ事後手順を追跡調査でのペア毎の比較のために使用した。ｎ＝６〜１２／群。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図15A-H】オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）によって増強される全身性ＴｒｅｇレベルのＡＤ病理に対する有害影響を示す。図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかを１週間の期間にわたって受けた５月齢のＡＤ−ＴｇマウスにおけるＣＤ４^＋／Ｆｏｘｐ３^＋／ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ脾細胞の頻度における上昇を示す代表的なフローサイトメトリープロット（Ａ）および定量的分析（Ｂ）を示す（ｎ＝５／群；スチューデントｔ検定）。図１５Ｃ〜図１５Ｆは、５ヶ月の月齢でＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかにより１週間の期間にわたって処置され、続いてさらに３週間の後で調べられたＡＤ−Ｔｇマウスの脳におけるＡβプラーク負荷およびアストログリオーシスの代表的な顕微鏡像（Ｃ）および定量的分析（Ｄ、Ｅ、Ｆ）を示す。脳を、Ａβプラーク、（アストログリオーシスのマーカーとなる）ＧＦＡＰについて免疫染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色によって染色した（ｎ＝４〜５／群；スケールバー、２５０μｍ）。平均のＡβプラーク面積およびＡβプラーク数を海馬ＤＧおよび大脳皮質の第５層において定量化し、ＧＦＡＰ免疫反応性を海馬において測定した（６μｍの脳薄片において；ｎ＝５〜６／群；スチューデントｔ検定）。（Ｇ）５ヶ月の月齢でＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかにより１週間の期間にわたって処置され、続いてさらに３週間の後で調べられたＡＤ−Ｔｇマウスの大脳の脳実質における、ＥＬＩＳＡによって定量される可溶性のＡβ_１＿４０およびＡβ_１＿４２のレベル（ｎ＝５〜６／群；スチューデントｔ検定）。（Ｈ）５ヶ月の月齢でＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかにより１週間の期間にわたって処置され、続いてさらに３週間の後で調べられたＡＤ−ＴｇマウスのＲＡＷＭ課題における認知成績（ｎ＝５／群；個々のペア比較についての二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、それに続くボンフェローニ事後）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図16A-F】毎週ＧＡ投与によって増強される全身性ＴｒｅｇレベルのＡＤ病理に対する有害影響を示す。（Ａ）毎週ＧＡ療法と比較される毎日ＧＡ処置療法の概略図。毎日ＧＡ処置群において、マウスに、１００μｇのＧＡを１ヶ月の期間にわたって毎日、ｓ．ｃ．注入した。（Ｂ）ＲＡＷＭでの学習・記憶課題における１日あたりの誤りの平均数によって評価されるような、月齢一致のＷＴ型マウスおよび非処置ＡＤ−Ｔｇマウスと比較される、毎日ＧＡおよび毎週ＧＡにより処置された７月齢のＡＤ−Ｔｇマウスの認知成績（ｎ＝６〜８／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。（Ｃ）Ａβプラークについて免疫染色され、また、Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色について免疫染色される、未処置ＡＤ−Ｔｇマウスおよび毎日ＧＡまたは毎週ＧＡにより処置されたＡＤ−Ｔｇマウスの大脳皮質および海馬（ＨＣ）の代表的な顕微鏡像（スケールバー、２５０μｍ）。図１６Ｄ〜図１６Ｆは、ＧＡ処置ＡＤ−Ｔｇマウス（毎日ＧＡ群および毎週ＧＡ群）および非処置ＡＤ−Ｔｇマウスにおける（６μｍの薄片あたりの）Ａβプラークのサイズおよび数の定量化を示す。毎週ＧＡ処置のＡＤ−Ｔｇマウスは、それらの海馬歯状回（ＤＧ）の総面積の百分率としてのＡβプラーク負荷量における減少、および、平均Ａβプラーク数における減少を示した（ｎ＝６／群；一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くニューマン・クールス事後解析）。すべてのパネルにおいて、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を表す；^＊、Ｐ＜０．０５；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0006】

アルツハイマー病のマウスモデル（ＡＤ−Ｔｇマウス）におけるＦｏｘｐ３^＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の短期間の一時的枯渇化が、脳の脈絡叢を介したＣＮＳへの白血球の改善された動員、ＣＮＳに浸潤する抗炎症性単球由来マクロファージｍｏ−ＭΦおよびＣＤ４^＋Ｔ細胞の増大した数、ならびに、脳内に蓄積するＦｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇの顕著な富化をもたらすことが本発明に従って見出されている。そのうえ、ただ１回だけの処置期の長期効果は、海馬神経膠症における軽減、および、脳内における炎症促進性サイトカインの低下したｍＲＮＡ発現レベルを引き起こしている。重要なことに、疾患病理に対する効果には、海馬歯状回および大脳皮質（第５層）、すなわち、ロバストなＡβプラーク病理をＡＤ−Ｔｇマウスにおいて示す２つの脳領域における低下した脳アミロイドベータ（Ａβ）プラーク負荷が含まれる。最も重要なことに、Ｔｒｅｇの短期間の一時的枯渇化の後には、空間的な学習および記憶における劇的な改善がもたらされ、これにより、野生型マウスの認知成績と類似する認知成績が達成される（実施例２および実施例３）。まとめると、これらの発見から、短い期間のＴｒｅｇ枯渇化は、その後に非介入の期間が続く場合、Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制をＡＤ−Ｔｇマウスにおいて一時的に中断させることを生じさせ、このことは、炎症を解消する細胞（ｍｏ−ＭΦおよびＴｒｅｇ）を脳に動員することを可能にし、そして、神経炎症性応答の消散、Ａβの排除および認知低下の回復をもたらすことが明らかにされる。これらの発見は、この研究分野における常識（それによれば、増大する全身的免疫応答が神経炎症性応答の緩和を生じさせるであろう）に強く反論するものである。これに反して、本発明者らの発見は、全身的なＴｒｅｇ媒介抑制における短期間の短時間かつ一時的な低下によって全身的応答を高めることが、Ｔｒｅｇ自身を含めて、炎症消散免疫細胞の脳内の蓄積を達成するために、したがって、ＡＤ病理を撃退するために必要となることを示す。

【0007】

本明細書中に示される本発明者らの取組みの特異性が、下記において詳述されるように、いくつかの独立した実験的枠組みを使用することによって実証されている。簡単に記載すると、最初に本発明者らは、末梢Ｔｒｅｇレベルに対する逆の影響、ＣＰ活性化に対する逆の影響、そして、疾患病理に対する逆の影響をもたらした２つの異なる投与療法において、すなわち、末梢Ｔｒｅｇレベルを増強する毎日投与療法（Ｗｅｂｅｒ他、２００７）と、末梢Ｔｒｅｇレベルを低下させることが見出された毎週投与療法とにおいて、免疫調節化合物を使用した（実施例３および実施例５）。本発明者らはまた、末梢Ｔｒｅｇレベルと疾患病理との間における直接的な機能的連関を提供しており、このとき、本発明者らはＡＤ−Ｔｇマウスにおいて、Ｔｒｅｇの一時的なインビボでの遺伝的枯渇化（実施例２）によって、または、ＡＤ−ＴｇマウスのＦｏｘｐ３機能の薬理学的阻害（実施例３および４）によってそのどちらによってでも、これらの操作が、ＣＮＳへの白血球輸送、病変部位における炎症消散免疫細胞の蓄積、脳Ａβプラークの排除、および、脳実質組織の免疫学的環境を炎症の消散の方に向かわせることを促進させるためのＣＰの活性化を生じさせることを明らかにしている。

【0008】

さらには、万能的抗原のコポリマー−１を（１回の処置期を表す）限られた期間にわたってまれに投与する場合、Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制が低下し、また、ＣＮＳ内への白血球の選択的浸潤が、脳の脈絡叢入口活性が増大することによって改善され、これにより、アルツハイマー病病理における劇的な有益な効果がもたらされ（実施例３）、一方で、コポリマー−１を毎日投与した場合には、Ｔｒｅｇ免疫抑制が高まる（Ｈｏｎｇ他、２００５；Ｗｅｂｅｒ他、２００７）が、疾患病理に対する有益な効果が何ら示されなかったか、または、それどころか、何らかの大きくない有害な影響が示された（実施例５）ことが本発明に従って見出されている。本発明の発明者らはさらに本明細書中において、ｐ３００を特異的な小分子阻害剤（ｐ３００ｉ）により阻害することによって、または、ＰＤ−１受容体との相互作用を抗ＰＤ−１抗体により阻害することによってそのどちらによってでもＦｏｘｐ３のＴｒｅｇ活性を直接に妨げることにより、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける脈絡叢入口活性が改善され、そして、アルツハイマー病病理が緩和されることを示す（実施例４）。

【0009】

重要なことに、本発明者らによって提供されるこれらの実施例のそれぞれにより、全身的免疫抑制における短期間の低下を引き起こす異なる介入が明らかにされる：コポリマー−１は免疫調節化合物として作用し、ｐ３００ｉは、Ｆｏｘｐ３アセチル化およびＴｒｅｇ機能を低下させる小分子として作用し、抗ＰＤ−１は、Ｔｒｅｇ表面に発現されるＰＤ−１に対する中和抗体として使用される。これらの治療的取組みが、主には末梢ＩＦＮ−γレベルおよびＩＦＮ−γ産生細胞を増大させ、したがって、脳の脈絡叢を活性化し、これにより、Ｔ細胞および単球のＣＮＳ内への選択的な浸潤、ならびに、病変部位および神経炎症部位へのこれらの細胞のホーミングを可能にすることによって免疫応答を末梢において一時的に増強する短い処置期のために使用された。非処置の間欠期によって中断される反復した処置期は、ただ１回だけの処置期と比較して、処置の効力を劇的に改善することもまた見出された（実施例４）。非処理のその後の時間間隔は、脳内のＴｒｅｇレベルおよびＴｒｅｇ活性における一時的な増強、神経炎症の消散を促進させること、ならびに、ＣＮＳの治癒および修復に有利である環境条件を誘導し、その後、組織の回復を引き起こすことを可能にした。これらの場合のそれぞれにおいて、脳病理に対する効果は堅固であり、神経炎症応答の消散、ＡＤマウスの脳からのアミロイドベータプラークの排除、および、認知低下の回復を伴っていた。現時点での取組みの特異性がさらに、Ｆｏｘｐ３^＋調節性Ｔ細胞の一時的枯渇化の遺伝モデルを使用してＡＤの遺伝子組換えマウスモデルにおいて実証されている（実施例２）。

【0010】

このように、全身的なＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ媒介の免疫抑制が、ＣＰのＩＦＮ−γ依存的活性化（これは、ＣＮＳへの炎症消散白血球の動員を組織化するために必要である；Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆Ｂａｒｕｃｈ、２０１４ｂ）を阻害することによって少なくとも部分的に作用して、ＡＤ病理を撃退する能力を妨げることが本発明に従って見出されている。全身性Ｔｒｅｇは自己免疫恒常性の維持および自己免疫疾患からの保護のために非常に重要である（Ｋｉｍ他、２００７）。しかしながら、本発明者らの発見は、神経変性条件下では、修復免疫応答が脳において必要となるとき、この応答を開始する能力が全身性Ｔｒｅｇによって妨げられることを示唆している。それにもかかわらず、本発明者らの結果によれば、Ｔｒｅｇが脳内において必要となり、神経病変の部位にホーミングし、抗炎症活性を局所的に成し遂げる。本発明は、ＡＤの場合のような進行性のニューロン死を撃退する際における明らかな相反する必要性のための独特かつ予想外の解決策を表す：すなわち、Ｔｒｅｇを疾患脳において増大させることの代わりにＴｒｅｇを循環において一時的に低下させること／阻害する。したがって、末梢免疫抑制における短期間かつ一時的な低下は、脳のプラーク部位への抗炎症細胞（Ｔｒｅｇおよびｍｏ−ＭΦを含む）の動員を可能にする一方で、病理に対する長期効果を引き起こしている。しかしながら、特筆すべきことに、全身的なＴｒｅｇレベルおよびＴｒｅｇ活性の一時的低下は、ＣＮＳ特異的な保護的自己免疫応答を支援すること（Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆Ｂａｒｕｃｈ、２０１４ａ）、または、血管Ａβの排除において役割を果たす循環性単球のレベルを増強すること（Ｍｉｃｈａｕｄ他、２０１３）を含めて、さらなる機構を介した疾患緩和の一因となる場合がある。

【0011】

病因が異なる様々な神経変性疾患が、共通する局所的な神経炎症成分を介しているにもかかわらず、本発明者らの結果は、全身的な抗炎症治療から一様に利益を得るであろう疾患としてすべてのＣＮＳ病理を単純化して特徴づけることに対して強く反論するものである。したがって、自己免疫性炎症性の脳病変、例えば、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）などは、長期間持続する末梢免疫抑制を達成するための抗炎症性薬物および免疫抑制薬物の連続した全身投与から利益を受けるが、長期間持続する末梢免疫抑制は、慢性的神経変性疾患においては、例えば、ＡＤ、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰ−ＭＳ）および二次性進行型多発性硬化症（ＳＰ−ＭＳ）の場合などにおいては無効となるか、または、病理に悪影響を及ぼすことになるかのどちらかである（実施例５）。そのうえ、本発明者らの発見は、これらの病理における組織関連Ｔｒｅｇに対する全身性Ｔｒｅｇの役割に関する誤解を解明するために役立った（Ｈｅ＆Ｂａｌｌｉｎｇ、２０１３）。免疫−脳の軸は生涯にわたる脳可塑性の一部であり（Ｂａｒｕｃｈ他、２０１４）、様々な神経変性疾患が主に加齢に関連するので、本発明者らの発見はまた、全身的免疫抑制が脳機能を妨げるより一般的な現象を暗示している。したがって、全身的免疫抑制を低下させる短期間の周期的過程は、ＡＤおよび加齢関連認知症を含めて幅広い脳病理に対して適応可能である治療的な取組み、または予防的でさえある取組みを表す場合がある。

【0012】

重要なことに、ＡＤマウスモデルにおいて本明細書中に存在する本発明者らの取組みおよび発見は、ＡＤにおけるどのような疾患特異的要因（例えば、アミロイドベータまたはタウの病理など）であっても直接に標的とするのではなく、むしろ、幅広いＣＮＳ病理において臨床的に適応可能であることが予想される新規な取組み（すなわち、全身的なＴｒｅｇ媒介の免疫抑制を、ＣＮＳ内の病変部位への炎症消散免疫細胞の動員を増強するために一時的に低下させること）を明らかにする。

【0013】

上記で記載される予想外の結果を考慮すると、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害を処置する際に使用されるための、個体における全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な薬剤を含む医薬組成物であって、少なくとも２回の治療過程（ただし、それぞれの治療過程が順に、処置期、その後での非処置の間欠期を含む）を含む投薬計画によって投与するための医薬組成物を提供する。

【0014】

ある特定の実施形態において、投薬計画は、全身的免疫抑制のレベルが一時的に低下させられるように調整される。

【0015】

用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、所望の生理学的効果を得る手段を示す。この効果は、疾患および／または当該疾患に起因すると考えられる症状を部分的または完全に治すという点で治療的である場合がある。この用語は、疾患を阻害すること、すなわち、その発達を停止させることまたは遅らせること、あるいは、疾患を改善すること、すなわち、疾患の退行を生じさせることを示す。

【0016】

用語「非処置期」は、本明細書中では用語「非処置の期間」と交換可能に使用され、活性な薬剤が処置中の個体に何ら投与されない期間を示す。

【0017】

調節性Ｔ細胞の用語「全身的存在」は、本明細書中で使用される場合、（そのレベルまたは活性によって測定されるような）調節性Ｔ細胞が循環免疫系（すなわち、血液、脾臓およびリンパ節）に存在することを示す。脾臓における細胞集団プロフィルが血液における細胞集団プロフィルに反映されることは、免疫学の分野では周知の事実である（Ｚｈａｏ他、２００７）。

【0018】

本発明の処置は、全身的免疫抑制の上昇を示す患者に対して、同様にまた、そのような上昇を示さない患者に対して両方で適用可能である。ときには、本発明による処置を必要としている個体は末梢免疫抑制のある特定のレベルを有しており、この場合、そのようなレベルの末梢免疫抑制は、循環におけるＴｒｅｇの上昇した頻度または数、ならびに／あるいは、それらの高まった機能的活性、および／または、ＩＦＮγ産生白血球における低下、および／または、刺激に対する応答における白血球の低下した増殖によって反映される。Ｔｒｅｇの頻度または数の上昇は総数においてであることが可能であり、またはＣＤ４細胞全体の割合としてであることが可能である。例えば、アルツハイマー病の動物モデルは、野生型マウスと比較した場合、ＣＤ４細胞中のＦｏｘｐ３のより大きい頻度を有することが本発明に従って見出されている。しかしながら、たとえ前記個体において、全身性Ｔｒｅｇ細胞のレベルが上昇しないとしても、それらの機能的活性が高まらないとしても、ＩＦＮγ産生白血球のレベルが低下しないとしても、または、刺激に対する応答における白血球の増殖が低下しないとしても、全身的免疫抑制のレベルまたは活性を低下させる本発明の方法は、自己免疫性神経炎症性疾患のＲＲＭＳを含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害を処置することにおいて効果的である。重要なことに、前記全身的免疫抑制はまた、Ｔｒｅｇを除くさらなる免疫細胞タイプ、例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）などを伴う可能性がある（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ＆Ｎａｇａｒａｊ、２００９）。

【0019】

全身的免疫抑制のレベルは、当業者には広く知られている様々な方法によって検出される場合がある。例えば、Ｔｒｅｇのレベルが、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーまたは核の細胞内マーカーのどちらか（Ｃｈｅｎ＆Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、２０１１）、リンパ球のＣＤ４５マーカー、ＴＣＲ−βマーカーまたはＣＤ４マーカーについて免疫染色される末梢血単核細胞またはＴリンパ球のフローサイトメトリー分析によって、また、細胞に特異的に結合する抗体の量を測定することによって測定される場合がある。Ｔｒｅｇの機能的活性が様々なアッセイによって測定される場合がある；例えば、チミジン取り込みアッセイが一般に使用されており、この場合、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞（従来のＴ細胞）の、抗ＣＤ３ ｍＡｂにより刺激された増殖の抑制が、［^３Ｈ］チミジン取り込みによって、または、ＣＦＳＥ（細胞内に入ることができる５−（および６）−カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル；細胞分裂がＣＦＳＥの蛍光強度の連続的な半減として測定される）を使用することによって測定される。ＩＦＮγ産生白血球の数あるいはそれらの活性またはそれらの増殖能が、この技術分野で知られている方法を使用して当業者によって容易に評価されることが可能である；例えば、ＩＦＮγ産生白血球のレベルが、短期間のエクスビボ刺激およびゴルジ停止の後での末梢血単核細胞のフローサイトメトリー分析、ならびに、（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）固定／透過処理キットを使用する）ＩＦＮγ細胞内染色による免疫染色によって、または、これらの細胞の馴化培地を集め、分泌されたサイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡを使用して定量化することによって、または、馴化培地における種々のサイトカインの比率（例えば、ＩＬ２／ＩＬ１０、ＩＬ２／ＩＬ４、ＩＮＦγ／ＴＧＦβなど）を比較することによって測定される場合がある。ヒト末梢血におけるＭＤＳＣのレベルが、記載されるように（Ｋｏｔｓａｋｉｓ他、２０１２）、例えば、ＤＲ⁻／ＬＩＮ⁻／ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＤＲ⁻／ＬＩＮ⁻／ＣＤ１５＋細胞、ＤＲ⁻／ＬＩＮ⁻／ＣＤ３３＋細胞およびＤＲ（−／ｌｏｗ）／ＣＤ１４＋細胞の頻度のフローサイトメトリー分析を使用することによって当業者によって容易に評価されることが可能である。

【0020】

ヒトにおいては、末梢／全身的免疫抑制は、下記のときには上昇していると見なされる場合がある：循環におけるＴｒｅｇの総数が、健常なコントロール集団の場合よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上に大きいとき、ＣＤ４＋細胞全体におけるＴｒｅｇ細胞の割合が、健常なコントロール集団の場合よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上に上昇しているとき、あるいは、Ｔｒｅｇの機能的活性が、健常なコントロール集団の場合よりも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上に上昇しているとき。代替において、末梢／全身的免疫抑制は、下記のときには上昇していると見なされる場合がある：ＩＦＮγ産生白血球のレベルまたはそれらの活性が、健常なコントロール集団のレベルまたは活性に対して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下しているとき、あるいは、刺激に対する応答における白血球の増殖が、健常なコントロール集団の増殖に対して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下しているとき。

【0021】

薬剤は、下記のときには全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす薬剤であると見なされる場合がある：当該薬剤が個体に投与されたときにおいて、この個体の循環におけるＴｒｅｇの総数が、当該薬剤を投与する前のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下するとき、ＣＤ４＋細胞全体におけるＴｒｅｇ細胞の割合が、健常なコントロール集団の割合に対して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下するとき、あるいは、Ｔｒｅｇの機能的活性が、当該薬剤を投与する前のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低下するとき。代替において、薬剤は、下記のときには全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす薬剤であると見なされる場合がある：当該薬剤が個体に投与されたときにおいて、ＩＦＮγ産生白血球の総数またそれらの活性が、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％増大するとき、あるいは、刺激に対する応答における白血球の増殖が、健常なコントロール集団の増殖に対して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％増大するとき。

【0022】

本発明に従って使用される薬剤は、調節性Ｔ細胞のレベルまたは活性をダウンレギュレートするか、あるいはその活性を妨げるどのような薬剤であってもよく、しかし、代替においては、本発明による治療の過程に従った使用についてたとえ知られていないとしても、（ｉ）ドパミンまたはその医薬的に許容される塩、（ｉｉ）ドパミン前駆体またはその医薬的に許容される塩、（ｉｉｉ）ドパミン受容体１型ファミリーのアゴニスト（Ｄ１−Ｒアゴニスト）またはその医薬的に許容される塩、および、（ｉｖ）ドパミン受容体２型ファミリーのアンタゴニスト（Ｄ２−Ｒアンタゴニスト）またはその医薬的に許容される塩からなる群から選択される薬剤を除くそのような薬剤の群に限定される場合がある。

【0023】

ある特定の実施形態において、処置期は、医薬組成物を個体に投与することを含み、かつ、処置期は、少なくともレベルが参照基準よりも低くなるまでは維持され、そして、投与することが間欠期の期間中は休止され、かつ、間欠期は、レベルが参照基準よりも低い限りは維持される。参照基準が、（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる直近の血液サンプルにおいて測定される調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベル、あるいは、（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害に苦しむ個体の集団に特徴的である調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベルから選択される場合がある。

【0024】

代替において、処置期は、医薬組成物を個体に投与することを含み、かつ、処置期は、少なくともＩＦＮγ産生白血球の全身的存在またはレベルあるいは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度が参照基準を超えて増大するまでは維持され、そして、投与することが間欠期の期間中は休止され、かつ、間欠期は、前記レベルが前記参照基準を超えている限りは維持され、ただし、この場合、参照基準は、（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる最も最近の血液サンプルにおいて測定されるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在もしくは活性のレベルまたは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度、あるいは、（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害に苦しむ個体の集団に特徴的であるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在もしくは活性のレベルまたは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度から選択される。

【0025】

処置期および間欠期の長さは、免疫抑制のレベルを個人ベースでモニターすることを必要とすることなく、ある特定の患者集団に向けられる臨床試験において医師によって決定され、その後、この患者集団に対して一貫して適用される場合がある。

【0026】

ある特定の実施形態において、処置期は３日間〜４週間の間の長さである場合があり、例えば、１週間〜４週間の間の長さである場合がある。

【0027】

ある特定の実施形態において、間欠期は１週間〜６ヶ月の間である場合があり、例えば、２週間〜６ヶ月間の間の長さ、特に３週間〜６ヶ月の間の長さである場合がある。

【0028】

処置期において、薬学的組成物の投与は反復投与である場合があり、例えば、医薬組成物が、毎日、あるいは、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎または６日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回または４週間毎に１回投与される場合がある。これらの頻度は、どのような活性な薬剤に対しても適用可能であり、この技術分野における一般に使用されている慣行に基づく場合があり、最終的には臨床試験において医師によって決定される場合がある。代替において、処置期における反復投与の頻度は、活性な薬剤の性質に従って適合化され得るであろう。だが、この場合、例えば、小分子が毎日投与される場合がある；抗体が３日毎に１回投与される場合がある；また、コポリマー１が毎週、２週間毎に１回、３週間毎に１回または４週間毎に１回投与される。薬剤（例えば、コポリマー１など）が処置期の期間中に比較的低い頻度で投与されるとき、例えば、１ヶ月の処置期の期間中に週あたり１回、または、６ヶ月の処置期の期間中に月あたり１回投与されるとき、この処置期の後には、非処置の間欠期が続き、その長さは処置期の期間中における反復投与の間の期間よりも長いこと（すなわち、この例ではそれぞれ、１週間または１ヶ月よりも長いこと）を理解しなければならない。この例における処置期の期間中での投与の間における１週間または１ヶ月の休止は間欠期と見なされない。

【0029】

処置期および間欠期の長さは投与頻度に合わせて調節される場合があり、その結果、例えば、活性な薬剤を３日毎に１回投与するという頻度により、６日または９日の処置期と、それに従って開始される間欠期とがもたらされることがあるようにされる。

【0030】

事前に決定された一般的な処置療法に対する代替として、免疫抑制のレベルが、Ｔｒｅｇ細胞（またはＩＦＮ−γ産生白血球）のレベルまたは活性（あるいは刺激に対する応答における白血球の増殖速度）を個々にモニターし、処置期、投与頻度および間欠期をモニタリングの結果から決定されるように経験的かつ個人的に調節することによって、処置中であるそれぞれの患者のための所望のレベルに調整される場合がある（個別化医療）。

【0031】

したがって、処置期の長さが、（ａ）個体における調節性Ｔ細胞の全身的存在または活性のレベルを、前記投与した後における所定の期間の範囲内において個体から得られる血液サンプルにおけるレベルを測定することによりモニターすること、（ｂ）（ａ）で測定されたレベルを上述の参照基準と比較し、そのレベルが参照基準と異なるかどうかを明らかにすること、（ｃ）前記参照基準に対する、（ａ）で測定されたレベルの関係に基づいて、処置期を、投与することを繰り返すことによって継続するか、または、投与することを繰り返すことをやめることにより次回の間欠期を開始することによって継続するかを決定すること、そして、（ｄ）（ｃ）での決定に従って、投与することを繰り返し、または次回の間欠期を開始することによって決定される場合がある。代替において、ＩＦＮ−γ産生白血球のレベル、または、刺激に対する応答における白血球の増殖速度がモニターされ、上述されるような適切な参照基準と比較される場合がある。

【0032】

同様に、間欠期の長さが、（ａ）個体における調節性Ｔ細胞の全身的存在または活性のレベルを、前記投与した後における所定の期間の範囲内において個体から得られる血液サンプルにおけるレベルを測定することによりモニターすること、（ｂ）（ａ）で測定されたレベルを上述の参照基準と比較し、そのレベルが参照基準と異なるかどうかを明らかにすること、（ｃ）前記参照基準に対する、（ａ）で測定されたレベルの関係に基づいて、投与することならびに工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返すことにより新しい治療過程を開始するか、または、工程（ａ）および工程（ｂ）だけを繰り返すことにより間欠期を延長するかどうかを決定すること、そして、（ｄ）（ｃ）での決定に従って、投与することならびに工程（ａ）および工程（ｂ）を、または、工程（ａ）および工程（ｂ）だけを繰り返すことによって決定される場合がある。代替において、ＩＦＮγ産生白血球のレベル、または、刺激に対する応答における白血球の増殖速度がモニターされ、上述されるような適切な参照基準と比較される場合がある。

【0033】

いずれの場合でも、投薬計画、すなわち、処置期および間欠期の長さが調整され、その結果、例えば、個体における調節性Ｔ細胞の全身的存在または活性のレベルにおける低下によって測定されるような免疫抑制のレベルにおける低下が一時的であるようにされる。

【0034】

ある特定の実施形態において、上記の所定の期間、すなわち、活性な薬剤の最も最近の投与と、モニタリング工程との間において経過した時間は２日〜６ヶ月の間である。

【0035】

ある特定の実施形態において、モニターされる調節性Ｔ細胞は、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のうちの１つまたは複数を発現するＦｏｘＰ３^＋細胞、あるいは、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１の表面分子のうちの１つまたは複数を発現するＦｏｘＰ３⁻細胞から選択されるＣＤ４＋細胞である。具体的には、調節性Ｔ細胞の共通する表現型はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋細胞またはＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３⁻細胞である。

【0036】

調節性Ｔ細胞のレベルを低下させることができる様々な薬剤がこの技術分野では知られており（Ｃｏｌｏｍｂｏ＆Ｐｉｃｏｎｅｓｅ、２００７）、これらの薬剤は本発明に従って使用することができる。下記における引用された刊行物のそれぞれが、本明細書中に完全に開示されているかのように参照により組み込まれる。

【0037】

従って、薬剤が下記のものから選択される場合があり、しかし、薬剤は必ずしもそれらに限定されない：（ｉ）抗体、例えば、（ａ）抗ＰＤ−１、（ｂ）抗ＰＤ−Ｌ１、（ｃ）抗ＰＤ−Ｌ２（Ｃｏｙｎｅ＆Ｇｕｌｌｅｙ、２０１４；Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ他、２０１４；Ｚｅｎｇ他、２０１３）、（ｄ）抗ＣＴＬＡ−４（Ｓｉｍｐｓｏｎ他、２０１３；Ｔｅｒｍｅ他、２０１２）、（ｅ）インターフェロンαとの組合せでの抗ＰＤ−１（Ｔｅｒａｗａｋｉ他、２０１１）、（ｆ）抗ＣＴＬＡ−４との組合せでの抗ＰＤ−１、（ｇ）抗ＣＤ４７（Ｔｓｅｎｇ他、２０１３）、（ｈ）抗ＯＸ４０（Ｖｏｏ他、２０１３）、（ｉ）抗ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）（Ｔｅｒｍｅ他、２０１３）、（ｊ）抗ＣＤ２５（Ｚｈｏｕ他、２０１３）、（ｋ）抗ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲ誘因ｍＡｂ（ＤＴＡ−１）（Ｃｏｌｏｍｂｏ＆Ｐｉｃｏｎｅｓｅ、２００７）、（ｌ）抗ＣＣＲ４、（ｍ）抗ＴＩＭ−３／ガレクチン９（Ｊｕ他、２０１４）、（ｎ）抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、（ｏ）抗ＬＡＧ−３または（ｐ）抗４−１ＢＢ；（ｉｉ）（ａ）〜（ｐ）の任意の組合せ；（ｉｉｉ）アジュバントとの組合せでの（ａ）〜（ｐ）の任意の組合せ、例えば、抗ＯＸ４０抗体およびＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧなど）との組合せでの抗ＣＴＬＡ−４抗体（Ｍａｒａｂｅｌｌｅ他、２０１３）；（ｉｖ）下記から選択される小分子：（ａ）ｐ３００阻害剤（Ｌｉｕ他、２０１３）、例えば、ゲムシタビン（低用量）（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ他、２０１３）、あるいは、Ｃ６４６またはそのアナログ、すなわち、下記の式Ｉの化合物：

【化1】

（式中、
Ｒ_１は、Ｈ、−ＣＯ_２Ｒ_６、−ＣＯＮＲ_６Ｒ_７、−ＳＯ_３Ｈまたは−ＳＯ_２ＮＲ_６Ｒ_７から選択される；
Ｒ_２は、Ｈ、−ＣＯ_２Ｒ_６またはハロゲン（好ましくはＣｌ）から選択される；
Ｒ_３は、ハロゲン（好ましくはＦ）、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＣＯ_２Ｒ_６（好ましくはＣＯ_２ＣＨ_３またはＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）または−ＣＨ_２ＯＨから選択される；
Ｒ_４およびＲ_５はそれぞれ独立して、Ｈまたは−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル（好ましくはメチル）である；
Ｒ_６はＨまたは−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、好ましくは、Ｈ、メチルまたはエチルである；かつ
Ｒ_７はＨまたは−Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、好ましくはＨまたはメチルである）［（Ｂｏｗｅｒｓ他、２０１０）を参照のこと］、
（ｂ）スニチニブ（Ｔｅｒｍｅ他、２０１２）、（ｃ）ポリオキソメタラート（Ｐｏｌｙｏｘｏｍｅｔａｌａｔｅ）−１（ＰＯＭ−１）（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ他、２０１２）、（ｄ）α，β−メチレンアデノシン５’−二リン酸（ＡＰＣＰ）（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ他、２０１２）、（ｅ）三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）（Ｔｈｏｍａｓ−Ｓｃｈｏｅｍａｎｎ他、２０１２）、（ｆ）ＧＸ１５−０７０（オバトクラックス（Ｏｂａｔｏｃｌａｘ）（Ｋｉｍ他、２０１４）、（ｇ）レチノイン酸アンタゴニスト、例えば、Ｒｏ４１−５２５３（合成レチノイドで、選択的な小分子アンタゴニスト）（Ｇａｌｖｉｎ他、２０１３）またはＬＥ−１３５（Ｂａｉ他、２００９）、（ｈ）ＳＩＲＰα（ＣＤ４７）アンタゴニスト、例えば、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４（ＳＩＲＰα変化体）（単剤として、または抗ＣＤ４７抗体との組合せで）（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ他、２０１３）、（ｉ）ＣＣＲ４アンタゴニスト、例えば、ＡＦ３９９／４２０／１８０２５（単剤として、または抗ＣＣＲ４抗体との組合せで）（Ｐｅｒｅ他、２０１１）、（ｊ）アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト、例えば、ＰＳＢ６０３（Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ他、２０１１）、（ｋ）インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）のアンタゴニスト、または、（ｌ）ＨＩＦ−１調節因子；（ｉｖ）下記から選択されるタンパク質：（ａ）インドセンダンの葉の糖タンパク質（ＮＬＧＰ）（Ｒｏｙ他、２０１３）、または、（ｂ）ｓＣＴＬＡ−４（ＣＴＬＡ−４の可溶性イソ型）（Ｗａｒｄ他、２０１３）；（ｖｉ）サイレンシング分子、例えば、ｍｉＲ−１２６アンチセンス（Ｑｉｎ他、２０１３）および抗ガレクチン−１（Ｇａｌ−１）（Ｄａｌｏｔｔｏ−Ｍｏｒｅｎｏ他、２０１３）；（ｖｉｉ）ＯＫ−４３２（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の凍結乾燥調製物）（Ｈｉｒａｙａｍａ他、２０１３）；（ｖｉｉｉ）ＩＬ−１２および抗ＣＴＬＡ−４の組合せ；（ｉｘ）コポリマー１、あるいは、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマー；（ｘ）抗生剤、例えば、バンコマイシン（Ｂｒｅｓｔｏｆｆ＆Ａｒｔｉｓ、２０１３；Ｓｍｉｔｈ他、２０１３）；または（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）の任意の組合せ。

【0038】

ある特定の実施形態において、薬剤は、抗ＰＤ−１抗体、すなわち、ＰＤ−１に対して特異的な抗体である。

【0039】

多くの抗ＰＤ−１抗体がこの技術分野において知られている。例えば、本発明に従って使用される抗ＰＤ−１抗体が、Ｏｈａｅｇｂｕｌａｍ他（Ｏｈａｅｇｂｕｌａｍ他、２０１５；その全内容が本明細書により参照によって本明細書中に組み込まれる）に開示される抗ＰＤ−１抗体から選択される場合がある：すなわち、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）；ヒト化ＩｇＧ１；Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＭＫ−３４７５（ランブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）；ヒト化ＩｇＧ４；Ｍｅｒｃｋ）、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ；ヒトＩｇＧ４；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＡＭＰ−２２４（ＰＤ−Ｌ２とＩｇＧ２ａとの融合タンパク質；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ヒトＩｇＧ４；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ４７３６（ヒト化ＩｇＧ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ヒトＩｇＧ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ヒトＩｇＧ１；Ｍｅｒｃｋ−Ｓｅｒｏｎｏ）；または、本発明に従って使用される抗体は、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、すなわち、ヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂである場合がある。

【0040】

ある特定の実施形態において、ＣＴ−０１１抗体が、０．２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇの投薬量で、または、１．５ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇの間での投薬量でヒトに投与される場合がある；ＭＫ−３４７５抗体が１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒトに投与される場合がある；ＢＭＳ−９３６５５８が、０．３ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で、または、１ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇでヒトに投与される場合がある；ＢＭＳ−９３６５５９が０．３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒトに投与される場合がある；ＭＰＤＬ３２８０Ａが１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒトに投与される場合がある；ＭＥＤＩ４７３６が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒトに投与される場合がある；ＭＳＢ００１０７１８Ｃが１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量でヒトに投与される場合がある。

【0041】

抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、すなわち、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体、または、イピリムマブ、すなわち、完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である場合がある。

【0042】

抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）抗体は、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−９８６０１５；Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａによって開発され、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにライセンス供与される）、すなわち、完全ヒトモノクローナル抗体である場合がある。

【0043】

抗ＬＡＧ−３抗体はリンパ球活性化遺伝子−３に対して向けられる。本発明に従って使用されることがある１つのそのような抗体がモノクローナル抗体ＢＭＳ−９８６０１６（ペンブロリズマブ；ヒト化ＩｇＧ４；Ｍｅｒｃｋ）である。

【0044】

抗４−１ＢＢ抗体は、ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、すなわち、完全ヒト化ＩｇＧ２アゴニストモノクローナル抗体、または、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ−６６３５１３；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、すなわち、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である場合がある（これらは４−１ＢＢを標的とする）。

【0045】

ある特定の実施形態において、抗体の組合せが使用される場合があり、例えば、限定されないが、下記のものが使用される場合がある：タンパク質ＣＤ２０に対するキメラなモノクローナル抗体であるリツキシマブ（商品名：Ｒｉｔｕｘａｎ、ＭａｂＴｈｅｒａおよびＺｙｔｕｘ）との組合せでのＣＴ−０１１、例えば、それぞれが３ｍｇ／ｋｇで；イピリムマブ（例えば、３ｍｇ／ｋｇで）との組合せでのＢＭＳ−９３６５５８（例えば、１ｍｇ／ｋｇ）；または、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１制限の多ペプチドワクチンとの組合せでのＢＭＳ−９３６５５８（例えば、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）（Ｗｅｂｅｒ他、２０１３）。

【表1】

^＊Ｂｏｗｅｒｓ他（２０１０）に基づく。

【0046】

ある特定の実施形態において、薬剤は、式が表１に列挙されるｐ３００阻害剤であり、すなわち、Ｃ６４６（４−（４−（（５−（４，５−ジメチル−２−ニトロフェニル）フラン−２−イル）メチレン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）安息香酸）、Ｃ１４６（４−ヒドロキシ−３−（（（２−（３−ヨードフェニル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）イミノ）メチル）安息香酸）またはＣ３７５（２−クロロ−４−（５−（（２，４−ジオキソ−３−（２−オキソ−２−（ｐ−トリルアミノ）エチル）チアゾリジン−５−イリデン）メチル）フラン−２−イル）安息香酸）である。特に、ｐ３００阻害剤はＣ６４６である。

【0047】

ある特定の実施形態において、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ経路の小分子阻害剤が、Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ（ＮＬＧ９１８９；ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）またはＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）である場合がある。

【0048】

ＨＩＦ−１調節因子が、Ｍ３０、すなわち、Ｚｈｅｎｇ他（Ｚｈｅｎｇ他、２０１５）に記載される５−［Ｎ−メチル−Ｎ−プロパルギルアミノメチル］−８−ヒドロキシキノリンである場合がある。

【0049】

ある特定の実施形態において、薬剤は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を標的とし、それにより、Ｔｒｅｇの免疫調節を促進させる広範囲の抗生物質に由来することができ、例えば、グラム陽性細菌を標的とし、Ｔｒｅｇのレベル／活性を低下させることが示されているバンコマイシン（Ｂｒｅｓｔｏｆｆ＆Ａｒｔｉｓ、２０１３；Ｓｍｉｔｈ他、２０１３）に由来することができる。

【0050】

ある特定の実施形態において、薬剤は、ある特定の療法ではＴｒｅｇのダウンレギュレーションを引き起こすことになるどのようなコポリマーであってもよい（例えば、ＹＦＡＫ、ＶＹＡＫ、ＶＷＡＫ、ＶＥＡＫ、ＦＥＡＫ、ＦＡＫ、ＶＡＫまたはＷＡＫなど）。本明細書中で使用される場合、用語「Ｃｏｐ−１」および用語「コポリマー１」は交換可能に使用される。

【0051】

本発明の医薬組成物は、好適な量の正荷電アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニンなど）を（好ましくはより少ない量での）負荷電アミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸など）との組合せで、必要な場合にはフィラーとして役立つ非荷電中性アミノ酸（例えば、アラニンまたはグリシンなど）との組合せで、また、必要な場合にはコポリマーに免疫原性を与えるために適合化されたアミノ酸（例えば、チロシンまたはトリプトファンのような芳香族アミノ酸など）とともに含む、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するランダムコポリマーを活性な薬剤として含む場合がある。そのような組成物は、国際公開ＷＯ００／０５２５０（その全内容が本明細書により参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるそのようなコポリマーのいずれをも含む場合がある。

【0052】

より具体的には、本発明において使用されるための組成物は、下記群のうちの少なくとも３つのそれぞれから選択される１つのアミノ酸を含むランダムコポリマーからなる群から選択される少なくとも１つのコポリマーを含む：（ａ）リシンおよびアルギニン；（ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；（ｃ）アラニンおよびグリシン；ならびに（ｄ）チロシンおよびトリプトファン。

【0053】

本発明において使用されるためのコポリマーは、Ｌ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸またはその混合物から構成されることが可能である。当業者によって知られているように、Ｌ−アミノ酸はほとんどの天然タンパク質に存在する。しかしながら、様々なＤ−アミノ酸が市販されており、本発明において使用されるターポリマーおよび他のコポリマーを製造するために使用されるアミノ酸の一部またはすべての代わりに使用されることが可能である。本発明では、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のどちらかから本質的になるコポリマーと同様に、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含有するコポリマーの使用が意図される。

【0054】

ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、コポリマー１、すなわち、１．５：４．８：１：３．６のおおよその比率でのＬ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）およびＬ−リシン（Ｋ）のアミノ酸から本質的になり、正味の全体的な正の電荷を有し、かつ、分子量が約２ＫＤａ〜約４０ＫＤａであるランダムポリペプチドの混合物を含む。ある特定の実施形態において、Ｃｏｐ１は平均分子量が約２ＫＤａ〜約２０ＫＤａであり、または約４．７ＫＤａ〜約１３ＫＤａであり、または約４ＫＤａ〜約８．６ＫＤａであり、または約５ＫＤａ〜約９ＫＤａであり、または約６．２５ＫＤａ〜８．４ＫＤａである。他の実施形態において、Ｃｏｐ１は平均分子量が約１３ＫＤａ〜約２０ＫＤａであり、または約１３ＫＤａ〜約１６ＫＤａであり、または約１５ＫＤａ〜約１６ＫＤａである。４０ＫＤａ未満である、Ｃｏｐ１についての他の平均分子量もまた、本発明によって包含される。前記分子量範囲のコポリマー１は、この技術分野で知られている方法によって調製することができ、例えば、米国特許第５，８００，８０８号（その全内容が本明細書によってその全体において参照により組み込まれる）に記載されるプロセスによって調製することができる。コポリマー１は、長さにおいて約１５個〜約１００個のアミノ酸または約４０個〜約８０個のアミノ酸を含むポリペプチドである場合がある。ある特定の実施形態において、Ｃｏｐ１は、グラチラマー酢酸塩の一般名で知られているその酢酸塩の形態であり、これは、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）（Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、Ｐｅｔａｃｈ Ｔｉｋｖａ、イスラエル）の商品名で多発性硬化症（ＭＳ）の処置のためにいくつかの国で承認されている。本明細書中に開示される医薬組成物のためのコポリマー１の活性は、下記置換の１つまたは複数がなされるならば、残存することが予想される：グルタミン酸に代わるアスパラギン酸、アラニンに代わるグリシン、リシンに代わるアルギニン、および、チロシンに代わるトリプトファン。

【0055】

本発明のある特定の実施形態において、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマーは、３つの異なるアミノ酸（ただし、それぞれが群（ａ）〜群（ｄ）のうちの３つの群の異なる１つに由来する）からなるコポリマーである。これらのコポリマーは本明細書中ではターポリマーと呼ばれる。

【0056】

１つの実施形態において、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマーは、チロシン、アラニンおよびリシンを含有するターポリマー（これは以降、ＹＡＫと称される）であり、ただし、これらのアミノ酸の平均モル分率は変化させることができる：チロシンは約０．０５〜０．２５０のモル分率で存在することができ、アラニンは約０．３〜０．６のモル分率で存在することができ、リシンは約０．１〜０．５のモル分率で存在することができる。チロシン、アラニンおよびリシンのモル比がそれぞれ、約０．１０：０．５４：０．３５である場合がある。リシンをアルギニンに置換すること、アラニンをグリシンに置換すること、および／または、チロシンをトリプトファンに置換することが可能である。

【0057】

ある特定の実施形態において、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマーは、チロシン、グルタミン酸およびリシンを含有するターポリマー（これは以降、ＹＥＫと称される）であり、ただし、これらのアミノ酸の平均モル分率は変化させることができる：グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で存在することができ、チロシンは約０．００５〜０．２５０のモル分率で存在することができ、リシンは約０．３〜０．７のモル分率で存在することができる。グルタミン酸、チロシンおよびリシンのモル比がそれぞれ、約０．２６：０．１６：０．５８である場合がある。グルタミン酸をアスパラギン酸に置換すること、リシンをアルギニンに置換すること、および／または、チロシンをトリプトファンに置換することが可能である。

【0058】

ある特定の実施形態において、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマーは、リシン、グルタミン酸およびアラニンを含有するターポリマー（これは以降、ＫＥＡと称される）であり、ただし、これらのアミノ酸の平均モル分率は変化させることができる：グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で存在することができ、アラニンは約０．００５〜０．６００のモル分率で存在することができ、リシンは約０．２〜０．７のモル分率で存在することができる。グルタミン酸、アラニンおよびリシンのモル比がそれぞれ、約０．１５：０．４８：０．３６である場合がある。グルタミン酸をアスパラギン酸に置換すること、アラニンをグリシンに置換すること、および／または、リシンをアルギニンに置換することが可能である。

【0059】

ある特定の実施形態において、Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマーは、チロシン、グルタミン酸およびアラニンを含有するターポリマー（これは以降、ＹＥＡと称される）であり、ただし、これらのアミノ酸の平均モル分率は変化させることができる：チロシンは約０．００５〜０．２５０のモル分率で存在することができ、グルタミン酸は約０．００５〜０．３００のモル分率で存在することができ、アラニンは約０．００５〜０．８００のモル分率で存在することができる。グルタミン酸、アラニンおよびチロシンのモル比がそれぞれ、約０．２１：０．６５：０．１４である場合がある。チロシンをトリプトファンに置換すること、グルタミン酸をアスパラギン酸に置換すること、および／または、アラニンをグリシンに置換することが可能である。

【0060】

上記ターポリマー（ＹＡＫ、ＹＥＫ、ＫＥＡおよびＹＥＡ）の平均分子量は約２ＫＤａ〜４０ＫＤａの間で変化させることができ、好ましくは約３ＫＤａ〜３５ＫＤａの間で変化させることができ、より好ましくは約５ＫＤａ〜２５ＫＤａの間で変化させることができる。

【0061】

Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマー１および他のコポリマーは、この技術分野において知られている方法によって、例えば、所望のモル比のアミノ酸を溶液中で使用する縮合条件のもとでの方法によって、または、固相合成手順によって調製される場合がある。縮合条件には、１つのアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基と縮合して、ペプチド結合を形成するための適切な温度、ｐＨおよび溶媒条件が含まれる。様々な縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）を、ペプチド結合の形成を促進させるために使用することができる。様々なブロック基を、官能基（例えば、側鎖部分および一部のアミノ基またはカルボキシル基）を望ましくない副反応から保護するために使用することができる。

【0062】

例えば、上記コポリマーは、米国特許第３，８４９，５５０号に開示されるプロセスによって調製することができ、この場合、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタマートおよびＮε−トリフルオロアセチル−リシンのＮ−カルボキシアンヒドリドが、ジエチルアミンを開始剤として無水ジオキサン中において周囲温度（２０℃〜２６℃）で重合される。グルタミン酸のγ−カルボキシル基は氷酢酸中において臭化水素によって脱ブロック化することができる。トリフルオロアセチル基は１Ｍのピペリジンによってリシンから除かれる。当業者は、このプロセスが、グルタミン酸、アラニン、チロシンまたはリシンのうちのいずれか１つに関連する反応を選択的に除外することによって、所望のアミノ酸、すなわち、コポリマー１における４つのアミノ酸のうちの３つを含有するペプチドおよびポリペプチドを製造するために調節され得ることを容易に理解する。

【0063】

上記コポリマーの分子量は、ポリペプチド合成の期間中に、または、コポリマーが製造された後で調節することができる。分子量をポリペプチド合成の期間中に調節するために、合成条件またはアミノ酸の量が調節され、その結果、ポリペプチドが、所望されるおおよその長さに達したとき、合成が停止する。合成後、所望の分子量を有するポリペプチドを、どのような手順であれ、利用可能なサイズ選択手順によって、例えば、分子量サイズ分画用のカラムまたはゲルでのポリペプチドのクロマトグラフィー、および、所望される分子量範囲の回収などによって得ることができる。上記コポリマーはまた、高分子量の化学種を除くために、例えば、酸加水分解または酵素加水分解によって部分的に加水分解し、その後、酸または酵素を除くために精製することができる。

【0064】

１つの実施形態において、所望の分子量を有するコポリマーが、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させて、望ましい分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを形成させることを含むプロセスによって調製される場合がある。反応が、１回または複数回の試験反応によって事前に決定される時間および温度で行われる。試験反応の期間中において、時間および温度が変化させられ、試験ポリペプチドの所与の回分物の分子量範囲が決定される。最適な分子量範囲をポリペプチドのその回分物に与える試験条件が当該回分物のために使用される。したがって、所望の分子量プロファイルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドを、保護されたポリペプチドを試験反応によって事前に決定された時間および温度で臭化水素酸と反応することを含むプロセスによって製造することができる。所望の分子量プロフィルを有するトリフルオロアセチル−ポリペプチドはその後、所望の分子量を有する低毒性のポリペプチドを形成するためにピペリジン水溶液でさらに処理される。

【0065】

ある特定の実施形態において、所与の回分物に由来する保護されたポリペプチドの試験サンプルが、約２０℃〜２８℃の温度で約１０時間〜５０時間、臭化水素酸と反応させられる。その回分物のための最も良好な条件が、数回の試験反応を行うことによって決定される。例えば、１つの実施形態において、保護されたポリペプチドが、約２６℃の温度で約１７時間、臭化水素酸と反応させられる。

【0066】

ＭＳ関連ＨＬＡ−ＤＲ分子に対するＣｏｐ１の結合モチーフが知られている（Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ他、１９９９）ので、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ他（１９９９）の刊行物に記載されるように、規定された配列を有するポリペプチドを容易に調製し、ＨＬＡ−ＤＲ分子のペプチド結合溝に対する結合について試験することができる。そのようなペプチドの例が、国際公開ＷＯ００／０５２４９および同ＷＯ００／０５２５０に開示されるペプチドであり（それらの全内容が本明細書によって参照によって本明細書中に組み込まれる）、そのようなペプチドの例には、配列番号１〜配列番号３２のペプチド（表２）が含まれる。

【0067】

そのようなペプチドおよび他の類似ペプチドは、Ｃｏｐ１と同様な活性を有することが予想されるであろう。そのようなペプチドおよび他の類似ペプチドもまた、ＣＮＳミエリン抗原と交差反応するコポリマーの定義の範囲内であると見なされ、それらの使用は、本発明の一部であると見なされる。

【表2】

【0068】

本発明に従って「Ｔｒｅｇの活性またはレベルを調節するコポリマー」の定義は、他の合成アミノ酸コポリマー、例えば、Ｆｒｉｄｋｉｓ−Ｈａｒｅｌｉ他（２００２）および米国特許第８，０１７，１２５号によって（多発性硬化症を処置するための候補物として）記載されるランダムな４アミノ酸のコポリマーなど、すなわち、下記のコポリマーを包含することが意味される：バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＶＦＡＫコポリマー；バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＶＹＡＫコポリマー；バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＶＷＡＫコポリマー；バリン（Ｖ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＶＥＡＫコポリマー；フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＦＥＡＫコポリマー；フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＦＡＫコポリマー；バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＶＡＫコポリマー；ならびに、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびリシン（Ｋ）のアミノ酸を含むＷＡＫコポリマー。

【0069】

本発明による医薬組成物は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、一次性進行型多発性硬化症；二次性進行型多発性硬化症、皮質基底核変性症、レット症候群から選択される神経変性の疾患、障害または状態、加齢性黄斑変性症および網膜色素変性症からなる群から選択される網膜変性障害；前部虚血性視神経症；緑内障；ブドウ膜炎；うつ病；外傷関連ストレスまたは外傷後ストレス障害、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、後部皮質萎縮、原発性進行性失語または進行性核上性麻痺であるＣＮＳの疾患、障害または状態を処置するためのものである場合がある。ある特定の実施形態において、ＣＮＳの状態は加齢性の認知症である。

【0070】

ある特定の実施形態において、ＣＮＳの状態は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病である。

【0071】

本発明による医薬組成物はさらに、脊髄損傷、閉鎖性頭部外傷、鈍的外傷、穿通性外傷、出血性卒中、虚血性卒中、脳虚血、視神経損傷、心筋梗塞、有機リン中毒、および、腫瘍切除によって引き起こされる傷害から選択されるＣＮＳの傷害を処置するためのものである場合がある。

【0072】

上述のように、本発明者らは、本発明により、アルツハイマー病を模倣するマウスにおける認知機能が改善されることを見出している。したがって、医薬組成物は、ＣＮＳの運動機能および／または認知機能を改善する際に使用されるためのものである場合があり、例えば、診断された疾患を有しない個体において生じることがある、同様にまた、神経変性疾患に罹患する人々において生じることがある認知機能の加齢関連喪失を緩和する際に使用されるためのものである場合がある。そのうえ、医薬組成物は、急性ストレスまたは外傷性エピソードから生じる認知機能の喪失を緩和する際に使用されるためのものである場合がある。本明細書中で言及される認知機能は、学習、記憶または両者を含む場合がある。

【0073】

用語「ＣＮＳ機能」は、本明細書中で使用される場合、とりわけ、感覚情報を受け取ることおよび処理すること、思考すること、学習すること、記憶すること、認識すること、言語を発することおよび理解すること、運動機能ならびに聴覚応答および視覚応答を制御すること、バランスおよび平衡を維持すること、運動の協調、感覚情報の伝達、そして、呼吸、心拍数および消化のような自律神経機能を制御することを示す。

【0074】

用語「認知」、用語「認知機能」および用語「認知成績」は本明細書中では交換可能に使用され、学習、記憶、心象の創造、思考、認識、推論、空間的能力、発話技能および言語技能、言語習得、ならびに、判断、注意のための能力を伴うどのような精神プロセスまたは精神状態に対しても関連づけられる。認知は、脳の多数の領域において、例えば、海馬、皮質および他の脳構造などにおいて形成される。しかしながら、長期記憶は少なくとも一部が皮質に蓄えられると考えられており、また、感覚情報が、島皮質内にある特定の皮質構造（味覚野）によって取得され、固定され、そして取り出されることが知られている。

【0075】

ヒトにおいて、認知機能は、どのような方法であれ、知られている方法によって測定される場合があり、例えば、また、限定されないが、変化の臨床全般印象尺度（ＣＩＢＩＣ−ｐｌｕｓ尺度）；ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）；神経精神症状評価（ＮＰＩ）；臨床認知症評価尺度（ＣＤＲ）；ケンブリッジ神経心理学自動検査（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂａｔｔｅｒｙ）（ＣＡＮＴＡＢ）またはサンド臨床評価−老齢者（Ｓａｎｄｏｚ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ−Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ）（ＳＣＡＧ）によって測定される場合がある。認知機能はまた、様々な画像化技術を使用して、例えば、脳機能を測定することを可能にする陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または、どのような画像化技術であれ、他の画像化技術を使用して間接的に測定される場合がある。

【0076】

患者における認知に影響を及ぼすプロセスの１つまたは複数の改善は、前記患者における認知機能の改善を意味するであろうし、したがって、ある特定の実施形態においては、認知を改善することは、学習、可塑性および／または長期記憶を改善することを含む。用語「改善する」および用語「強化する」は交換可能に使用される場合がある。

【0077】

用語「学習」は、新しい知識、行動、技能、価値または好みを習得することまたは獲得すること、あるいは、既存の知識、行動、技能、価値または好みを修正することおよび増強することに関連する。

【0078】

用語「可塑性」は、脳が学習により変化することができること、また、既に獲得された記憶を変化させることができることに伴うシナプス可塑性、脳可塑性または神経可塑性に関連する。可塑性を反映する１つの測定可能なパラメーターが記憶消去である。

【0079】

用語「記憶」は、情報がコード化され、蓄えられ、そして取り出されるプロセスに関連する。記憶は、感覚記憶、短期記憶および長期記憶の３つの識別可能なカテゴリーを有する。

【0080】

用語「長期記憶」とは、情報を長期間または無限の期間にわたって保つことができることである。長期記憶は、顕在記憶（陳述記憶）および潜在記憶（非陳述記憶）の２つの主要な部分を含む。長期記憶は、記憶痕跡をその最初の取得の後で安定化させる一群のプロセスである記憶固定によって達成される。固定は下記の２つの特異的なプロセスに区別される：シナプス固定（これは学習後の最初の数時間のうちに生じる）および体系固定（海馬依存性の記憶が数週間〜数年の期間を超えて海馬に依存しなくなる）。

【0081】

さらなる局面において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患の再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を含まない中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、障害、状態または傷害を処置するための方法であって、その必要性のある個体に、上記で定義されるような本発明による医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物が、少なくとも２回の治療過程（ただし、それぞれの治療過程が順に、処置期、その後での間欠期を含む）を含む投薬計画によって投与される、方法に関する。

【0082】

ある特定の実施形態において、処置期は、医薬組成物を個体に投与することを含み、かつ、処置期は、少なくともレベルが参照基準よりも低くなるまでは維持され、そして、投与することが間欠期の期間中は休止され、かつ、間欠期は、レベルが参照基準よりも低い限りは維持される。参照基準が、（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる最も最近の血液サンプルにおいて測定される調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベル、あるいは、（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害に苦しむ個体の集団に特徴的である調節性Ｔ細胞または骨髄由来サプレッサー細胞の全身的存在または活性のレベルから選択される場合がある。

【0083】

代替において、処置期は、医薬組成物を個体に投与することを含み、かつ、処置期は、少なくともＩＦＮγ産生白血球の全身的存在またはレベルあるいは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度が参照基準を超えて増大するまでは維持され、そして、投与することが間欠期の期間中は休止され、かつ、間欠期は、前記レベルが前記参照基準を超えている限りは維持され、ただし、この場合、参照基準は、（ａ）前記投与する前における前記個体から得られる最も最近の血液サンプルにおいて測定されるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在もしくは活性のレベルまたは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度、あるいは、（ｂ）ＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害に苦しむ個体の集団に特徴的であるＩＦＮγ産生白血球の全身的存在もしくは活性のレベルまたは刺激に対する応答における白血球の増殖の速度から選択される。

【0084】

本発明の医薬組成物の種々の特徴を記載する上記の実施形態は、本発明の方法では同じ医薬組成物が用いられるので、本発明の方法のためにも関連がある。

【0085】

さらにさらなる局面において、本発明は、自己免疫性神経炎症性疾患のＲＲＭＳを含まないＣＮＳの疾患、障害、状態または傷害を処置する際に使用されるための医薬組成物であって、下記から選択される、個体における全身的免疫抑制のレベルの低下を引き起こす活性な薬剤を含む医薬組成物を提供する：（ｉ）下記に対して特異的な抗体：（ａ）ＣＤ４７、（ｂ）ＯＸ４０、（ｃ）ＶＥＧＦ−Ａ（ベバシズマブ）、（ｄ）ＣＤ２５、（ｅ）ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲ誘発ｍＡｂ（ＤＴＡ−１））、（ｆ）ＣＣＲ４、または（ｇ）ＴＩＭ−３／ガレクチン９、（ｈ）抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体、（ｉ）抗ＬＡＧ−３、または（ｊ）抗４−１ＢＢ；（ｉｉ）（ａ）〜（ｊ）の任意の組合せ；（ｉｉｉ）アジュバント（例えば、ＴＬＲ９リガンド（例えば、ＣｐＧなど）など）との組合せでの（ａ）〜（ｊ）の任意の組合せ；（ｉｖ）下記から選択されるタンパク質：（ａ）インドセンダンの葉の糖タンパク質（ＮＬＧＰ）または（ｂ）ｓＣＴＬＡ−４；（ｖ）下記から選択される小分子：（ａ）スニチニブ、（ｂ）ポリオキソメタラート−１（ＰＯＭ−１）、（ｃ）α，β−メチレンアデノシン５’−二リン酸（ＡＰＣＰ）、（ｄ）三酸化ヒ素（Ａｓ_２Ｏ_３）、（ｅ）ＧＸ１５−０７０（オバトクラックス）、（ｆ）レチノイン酸アンタゴニスト、例えば、Ｒｏ４１−５２５３またはＬＥ−１３５など、（ｇ）ＳＩＲＰα（ＣＤ４７）アンタゴニスト、例えば、ＣＶ１−ｈＩｇＧ４（単剤として、または抗ＣＤ４７抗体との組合せで）、（ｈ）ＣＣＲ４アンタゴニスト、例えば、ＡＦ３９９／４２０／１８０２５（単剤として、または抗ＣＣＲ４抗体との組合せで）、または（ｉ）アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト、例えば、ＰＳＢ６０３など；（ｊ）インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼのアンタゴニスト、（ｋ）ＨＩＦ−１調節因子；（ｖｉ）サイレンシング分子、例えば、ｍｉＲ−１２６アンチセンスおよび抗ガレクチン−１（Ｇａｌ−１）など；（ｖｉｉ）ＯＫ−４３２、（ｖｉｉｉ）ＩＬ−１２および抗ＣＴＬＡ−４の組合せ；（ｉｘ）抗生剤、例えば、バンコマイシンなど；または（ｘ）（ｉ）〜（ｉｘ）の任意の組合せ。

【0086】

本発明に従って使用されるための医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用して従来の様式で配合される場合がある。キャリアは、組成物のそれ以外の成分との適合性を有し、かつ、その受容者に対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。

【0087】

キャリア、投与様式、投薬形態物などの下記の例示が、キャリア、投与様式、投薬形態物などが本発明との使用のために選択されることがある既知の可能性として列挙される。しかしながら、当業者は、どのような配合物および投与様式であれ、選択された所与の配合物および投与様式は最初に、所望の結果を達成することを明らかにするために試験されなければならないことを理解するであろう。

【0088】

投与方法には、非経口経路、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、粘膜経路（例えば、経口、鼻腔内、口内、膣、直腸、眼内）、クモ膜下腔内経路、局所的経路および皮内経路が含まれるが、これらに限定されない。投与は全身的または局所的であることが可能である。

【0089】

用語「キャリア」は、活性な薬剤が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを示す。医薬組成物におけるキャリアは、バインダー、例えば、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物など；崩壊剤、例えば、アルギン酸およびトウモロコシデンプンなど；滑剤または界面活性剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウムなど；ならびに流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素などを含む場合がある。

【0090】

経口投与のために、医薬調製物は液体形態（例えば、溶液、シロップまたは懸濁液）である場合があり、あるいは、水または他の適当なビヒクルにより使用前に再構成されるための薬物製造物として提供される場合がある。そのような液体調製物は、医薬的に許容される添加剤（例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステルまたは分画化植物油）および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルあるいはソルビン酸）など）を用いて従来の手段によって調製される場合がある。医薬組成物は、例えば、医薬的に許容される賦形剤（例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤化剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など）を用いて従来の手段によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態を取る場合がある。錠剤は、この技術分野で広く知られている方法によって被覆される場合がある。

【0091】

経口投与のための様々な調製物が、活性な化合物の制御された放出を与えるために好適に配合される場合がある。

【0092】

口内投与のために、組成物は、従来の様式で配合される錠剤またはトローチ剤の形態を取る場合がある。

【0093】

組成物は、注入による非経口投与のために、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合される場合がある。注射用の配合物は、保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供される場合がある。組成物は、油状ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物、溶液または乳濁液のような形態を取る場合があり、また、様々な配合剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などを含有する場合がある。代替において、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の発熱物質非含有水）により使用前に構成されるための粉末形態である場合がある。

【0094】

組成物はまた、例えば、従来の座薬基剤（例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなど）を含有する直腸用組成物（例えば、坐剤または停留浣腸剤など）で配合される場合がある。

【0095】

吸入による投与のために、本発明に従って使用されるための組成物は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）の使用により、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位が、計量された量を送達するためのバルブを設けることによって決定される場合がある。吸入器または吹き入れ器において使用されるためのカプセル剤およびカートリッジ剤（例えば、ゼラチン製のもの）が、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）を含有して配合される場合がある。

【0096】

ヒトでの使用のために使用されるための有効成分の用量の決定は、この技術分野における一般に使用されている慣行に基づいており、最終的には臨床試験において医師によって決定されることになる。ヒトへの投与のための予想されるおおよその等価用量を、公知の公式を使用して、本明細書中下記において開示されるインビボ実験の証拠に基づいて計算することができる（例えば、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈｏｗ他（２００７）、動物研究からヒト研究への再考された用量変換、Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、２２：６５９〜６６１）。この理論的枠組みによれば、成人等価用量（ｍｇ／ｋｇ体重）は、０．０８１が乗じられる、マウスに与えられた用量（ｍｇ／ｋｇ体重）に等しい。

【0097】

本発明が次に、以下の限定されない実施例によって例示される。

【実施例】

【0098】

材料および方法
動物。ヒトＡＰＰの家族性ＡＤ変異型形態（スウェーデン変異、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ；フロリダ変異、Ｉ７１６Ｖ；およびロンドン変異、Ｖ７１７Ｉ）およびＰＳ１の家族性ＡＤ変異型形態（Ｍ１４６Ｌ／Ｌ２８６Ｖ）の導入遺伝子をニューロン特異的なマウスＴｈｙ−１プロモーター（Ｏａｋｌｅｙ他、２００６）の転写制御のもとで過剰共発現する５ＸＦＡＤ遺伝子組換えマウス（Ｔｇ６７９９）と、ＡＤ二重遺伝子組換えＢ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１ｄＥ９）８５Ｄｂｏ／Ｊマウス（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ他、１９９７）とを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。遺伝子型決定を以前の記載（Ｏａｋｌｅｙ他、２００６）のように尾ＤＮＡのＰＣＲ分析によって行った。ヘテロ接合性変異体ｃｘ_３ｃｒ１^{ＧＦＰ／＋}マウス（Ｊｕｎｇ他、２０００）（Ｂ６．１２９Ｐ−ｃｘ３ｃｒ１^{ｔｍ１Ｌｉｔｔ}／Ｊ、これは、ＣＸ_３ＣＲ１ケモカイン受容体対立遺伝子の１つが、ＧＦＰをコードする遺伝子により置換されたものである）を、ＢＭキメラ体のためのドナーとして使用した。Ｆｏｘｐ３．ＬｕｃｉＤＴＲマウス（Ｓｕｆｆｎｅｒ他、２０１０）を５ＸＦＡＤマウスと交配して、Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇの条件的枯渇化を可能にした。動物はワイツマン科学研究所の動物育種センターによって飼育され、維持された。本明細書中に詳述されるすべての実験が、ワイツマン科学研究所の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって策定される規則に従った。

【0099】

ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイムＰＣＲ分析。海馬歯状回（ＤＧ）の総ＲＮＡを、ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して溶解物から精製した。脈絡叢の総ＲＮＡを、ＲＮＡ ＭｉｃｒｏＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して抽出した。ｍＲＮＡ（１μｇ）を、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに変換した。特異的ｍＲＮＡの発現を、蛍光に基づく定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用してアッセイした。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応を、Ｆａｓｔ−ＳＹＢＲ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。定量化反応を、標準曲線法を使用してそれぞれのサンプルについて三連で行った。ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（ｐｐｉａ）を参照（ハウスキーピング）遺伝子として選定した。増幅サイクルは、９５℃を５秒間、６０℃を２０秒間、７２℃を１５秒間であった。アッセイが終了したとき、融解曲線を作製して、反応の特異性を評価した。ｉｆｎ−γおよびｐｐｉａの遺伝子分析のために、ｃＤＮＡを、製造者のプロトコル（ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、非ランダムなＰＣＲプライマーを用いた１４回のＰＣＲサイクルで予備増幅し、それにより、その後のリアルタイムＰＣＲ分析の感度を増大させた。ｍＲＮＡ発現を、ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ｑＰＣＲを製造者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して求めた。すべてのＲＴ−ｑＰＣＲ反応を、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウエアＶ２．２．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行い、分析した。下記のＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）プローブを使用した：Ｍｍ０２３４２４３０＿ｇ１（ｐｐｉａ）およびＭｍ０１１６８１３４＿ｍ１（ｉｆｎ−γ）。
調べられたすべての他の遺伝子については下記のプライマーを使用した：
ｐｐｉａ 順方向５’−ＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴ−３’（配列番号３３）および逆方向５’−ＣＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号３４）；
ｉｃａｍ１ 順方向５’−ＡＧＡＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＡ−３’（配列番号３５）および逆方向５’−ＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＴＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＧＡ−３’（配列番号３６）；
ｖｃａｍ１ 順方向５’−ＴＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号３７）および逆方向５’−ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３８）；
ｃｘｃｌ１０ 順方向５’−ＡＡＣＴＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号３９）および逆方向５’−ＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号４０）；
ｃｃｌ２ 順方向５’−ＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号４１）および逆方向５’−ＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＴ−３’（配列番号４２）；
ｔｎｆ−γ 順方向５’−ＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４３）および逆方向ＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧ−３’（配列番号４４）；
ｉｌ−１β 順方向５’−ＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号４５）および逆方向５’−ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＧ−３’（配列番号４６）；
ｉｌ−１２ｐ４０ 順方向５’−ＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡ−３’（配列番号４７）および逆方向５’−ＣＡＴＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４８）；
ｉｌ−１０ 順方向５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号４９）および逆方向５’−ＴＧＧＣＣＴＴＧＴＡＧＡＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＴＴ−３’（配列番号５０）；
ｔｇｆβ２ 順方向５’−ＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＴＴＴＡＣ−３’（配列番号５１）および逆方向５’−ＴＧＴＡＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号５２）；
ｉｇｆ−１ 順方向５’−ＣＣＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号５３）および逆方向５’−ＣＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＡＡＡ−３’（配列番号５４）；
ｂｄｎｆ 順方向５’−ＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴ−３’（配列番号５５）および逆方向５’−ＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＡ−３’（配列番号５６）；

【0100】

免疫組織化学。組織処理および免疫組織化学をパラフィン包埋の切片化されたマウス脳（６μｍ厚）およびヒト脳（１０μｍ厚）に対して行った。ヒトＩＣＡＭ−１染色のために、一次マウス抗ＩＣＡＭ抗体（１：２０；Ａｂｃａｍ；ａｂ２２１３）を使用した。スライドガラス標本を３％のＨ２Ｏ２と１０分間インキュベーションし、二次ビオチンコンジュゲート化抗マウス抗体を使用し、その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によるビオチン／アビジン増幅を行った。続いて、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ基質）（Ｚｙｔｏｍｅｄキット）を加えた；スライドガラス標本を脱水し、キシレン系封入液により封入した。組織染色のために、マウスを組織の切除および固定処理の前にＰＢＳによる経心的灌流に供した。ＣＰ組織を解剖顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ ＤＶ４；Ｚｅｉｓｓ）のもと、脳の側脳室、第３脳室および第４脳室から単離した。全載ＣＰ染色のために、組織を２．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により４℃で１時間にわたって固定処理し、続いて、０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに移した。染色に先立って、解剖組織をＰＢＳにより洗浄し、室温で１時間ブロッキング処理した（２０％ウマ血清、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＰＢＳ）。一次抗体（２％ウマ血清および０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳにおいて）または二次抗体による全載染色を室温で１時間行った。それぞれの工程の後、ＰＢＳにおける３回の洗浄を行った。組織をスライドガラスに載せ、Ｉｍｍｕ−ｍｏｕｎｔ（９９９０４０２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られた）により固定し、カバースリップにより密封した。切片化脳の染色のために、２つの異なる組織調製プロトコル（パラフィン包埋切片またはミクロトームで切片化された浮遊切片）を以前の記載（Ｂａｒｕｃｈ他、２０１３；Ｋｕｎｉｓ他、２０１３）のように適用した。下記の一次抗体を使用した：マウス抗Ａβ（１：３００、Ｃｏｖａｎｃｅ、＃ＳＩＧ−３９３２０）；ウサギ抗ＧＦＰ（１：１００、ＭＢＬ、＃５９８）；ラット抗ＣＤ６８（１：３００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１４−０６８１）；ラット抗ＩＣＡＭ−１（１：２００、Ａｂｃａｍ、＃ＡＢ２２１３）；ヤギ抗ＧＦＰ（１：１００、Ａｂｃａｍ、＃ａｂ６６５８）；ウサギ抗ＩＢＡ−１（１：３００、Ｗａｋｏ、＃０１９−１９７４１）；ヤギ抗ＩＬ−１０（１：２０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ５１９）；ラット抗Ｆｏｘｐ３（１：２０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１３−５７７３−８０）；ウサギ抗ＣＤ３（１：５００、Ｄａｋｏ、＃ＩＳ５０３）；マウス抗ＺＯ−１、マウス抗Ｅ−カドヘリンおよびウサギ抗クローディン−１（すべて１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃３３−９１００、＃３３−４０００、＃５１−９０００）；ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：２００、Ｄａｋｏ、＃Ｚ０３３４）。二次抗体には、下記のものが含まれた：Ｃｙ２／Ｃｙ３／Ｃｙ５−コンジュゲート化ロバ抗マウス／ヤギ／ウサギ／ラット抗体（１：２００；すべてが、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから得られた）。スライドガラス標本をＨｏｅｃｈｓｔ核染色に１分間さらした（１：４０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐｒｏｂｅｓ）。２つの陰性コントロールを免疫染色手順において、すなわち、イソタイプコントロール抗体、それに続く二次抗体による染色、または、二次抗体単独による染色において常法的に使用した。Ｆｏｘｐ３細胞内染色のために、パラフィン包埋されたスライドガラス標本からの抗原回復を、Ｒｅｔｒｅｉｖａｇｅｎ Ｋｉｔ（＃５５０５２４、＃５５０５２７；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を使用して行った。顕微鏡分析を、蛍光顕微鏡（Ｅ８００；Ｎｉｋｏｎ）またはレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。蛍光顕微鏡は、デジタルカメラ（ＤＸＭ １２００Ｆ；Ｎｉｋｏｎ）と、２０倍のＮＡ ０．５０対物レンズまたは４０倍のＮＡ ０．７５対物レンズ（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ；Ｎｉｋｏｎ）のどちらかとを備えた。共焦点顕微鏡は、ＬＳＭ５１０レーザー走査能を備えた（３つのレーザー光：Ａｒ ４８８、ＨｅＮｅ ５４３、およびＨｅＮｅ ６３３）。記録を、取得ソフトウエア（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｆ３［Ｎｉｋｏｎ］またはＬＳＭ［Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．］）を使用して後固定の組織に対して行った。染色強度の定量化のために、以前に記載されたように（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、２０１０）、細胞およびバックグラウンドの全体的染色を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して測定し、特異的染色の強度を計算した。画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ６ １３．０（Ａｄｏｂｅ）を使用して、不要部分の削除、画像の併合および最適化が行われ、そして、Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ＣＳ５ １５．１（Ａｄｏｂｅ）を使用して配置された。

【0101】

ヒトＣＰのパラフィン包埋切片。若年者および高齢者の死後のＣＮＳ非疾患個体のヒト脳切片、同様にまた、ＡＤ患者のヒト脳切片を、適切な同意および倫理委員会承認（ＴＷ２２０）により、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ（以前には、Ｔｈｏｍａｓ Ｗｉｌｌｉｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｒａｉｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＴＷＯＢＣ）として知られていた）から得た。これらの切片を伴う実験はワイツマン科学研究所生命倫理委員会によって承認された。

【0102】

フローサイトメトリー、サンプル調製および分析。マウスをＰＢＳによる経心的灌流に供し、組織を以前の記載（Ｂａｒｕｃｈ他、２０１３）のように処理した。脳を切開し、種々の脳領域を解剖顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ ＤＶ４；Ｚｅｉｓｓ）下、ＰＢＳに取り出し、組織を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）解離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して解離させた。脈絡叢組織を脳の側脳室、第３脳室および第４脳室から単離し、４００Ｕ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有するＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋を伴う）において３７℃で４５分間インキュベーションし、その後、ピペッティングによって手で均質化した。脾臓をシリンジのプランジャーですりつぶし、ＡＣＫ（塩化アンモニウムカリウム）溶解緩衝液により処理して、赤血球を除いた。すべての場合において、サンプルを製造業者のプロトコルに従って染色した。すべてのサンプルを７０μｍのナイロンメッシュでろ過し、抗Ｆｃ ＣＤ１６／３２（１：１００；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓ）によりブロッキング処理した。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、細胞をパラ−メトキシアンフェタミン（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と６時間インキュベーションし、ブレフェルジン−Ａ（１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を最後の４時間は加えた。サイトカインの細胞内標識化を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｐｌｕｓ固定／透過化キット（ｃａｔ．ｎｏ．５５５０２８）を用いて行った。Ｔｒｅｇ染色のために、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＦｏｘＰ３染色用緩衝液セット（ｃａｔ．ｎｏ．００−５５２３−００）を使用した。下記の蛍光色素標識化モノクローナル抗体を、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、製造者のプロトコルに従って使用した：ＰＥまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４５０コンジュゲート化抗ＣＤ４；ＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ２５；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート化抗ＣＤ４５；ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＴＣＲβ；ＡＰＣコンジュゲート化抗ＩＦＮ−γ；ＡＰＣコンジュゲート化抗ＦｏｘＰ３；ブリリアントバイオレットコンジュゲート化抗ＣＤ４５。細胞を、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアを使用してＬＳＲＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。それぞれの実験において、それぞれの組織についての関連する陰性コントロール群、陽性コントロールおよび単一染色サンプルを使用して、目的とする集団を特定し、かつ、他の集団を除外した。

【0103】

ＢＭキメラ体の調製。ＢＭキメラ体を以前の記載のように調製した（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２００９；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）。簡単に記載すると、性別一致のレシピエントマウスを、頭部を遮蔽しながら致死的全身照射（９５０ｒａｄ）に供した（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２００９）。その後、マウスにＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}ドナーからの５×１０^６個のＢＭ細胞を静脈内注入した。マウスを、実験における使用に先立って、造血系譜の再構成を可能にするためにＢＭ移植後８週間〜１０週間放置した。キメラ現象の割合を、循環する単球（ＣＤ１１ｂ^＋）の中のＧＦＰ発現細胞の割合に従って血液サンプルのＦＡＣＳ分析によって求めた。この頭部遮蔽モデルでは、平均して６０％のキメラ現象が達成され、ＣＮＳ浸潤のＧＦＰ^＋骨髄性細胞は、ＣＤ４５^ｈｉｇｈ／ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈであることが確認され、このことは、ミクログリアではなく、単球由来マクロファージを表していた（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）。

【0104】

モリス水迷路。マウスに、連続して４日間、１日に３回の試行を与えて、プール（直径が１．１ｍ）において水面下１．５ｃｍに位置する隠されたプラットホームを見つけることを学習させた。水温を２１℃〜２２℃の間で保った。水は粉ミルクにより不透明にされた。試験室内では、遠位の視覚的形状手がかりおよび物体手がかりのみが、水面下のプラットホームを突き止めることを助けるためにマウスには利用可能であった。逃避潜時、すなわち、プラットホームを発見し、その上に登るために要する時間を、６０秒を上限として記録した。それぞれのマウスは、１５秒間プラットホームに留まることが許され、その後、迷路から取り出され、そのホームケージに戻された。マウスが６０秒以内にプラットホームを発見しないならば、マウスを手でプラットホームに置き、１５秒後にそのホームケージに戻した。それぞれのマウスについての試行間の間隔が１０分であった。５日目に、プラットホームを除き、マウスに、利用可能な逃避を伴うことなく６０秒持続する１回だけの試行を与えた。６日目および７日目に、プラットホームを最初の訓練用象限の反対側の象限に置き、マウスに毎日３回の再訓練を与えた。データを、Ｅｔｈｏ Ｖｉｓｉｏｎ Ｖ７．１自動追跡システム（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して記録した。統計学的分析を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ事後検定を使用して行った。すべてのＭＷＭ試験を照明停止期間中の午前１０時〜午後５時の間で行った。

【0105】

放射状アーム水迷路。詳しくは以前に記載されたように（Ａｌａｍｅｄ他、２００６）、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）を使用して、空間学習および記憶を試験した。簡単に記載すると、６個のステンレススチール製インサートをタンクに置き、開いた中央領域から放射状に広がる６つの遊泳アームを形成させた。逃避プラットホームがプール（直径が１．１ｍ）において水面下１．５ｃｍのところに１つのアーム（ゴールアーム）の終点に位置した。水温を２１℃〜２２℃の間で保った。水は粉ミルクにより不透明にされた。試験室内では、遠位の視覚的形状手がかりおよび物体手がかりのみが、水面下のプラットホームを突き止めることを助けるためにマウスには利用可能であった。ゴールアームの場所は所与のマウスについては一定のままであった。１日目に、マウスを（３時間にわたって一定の間隔での）１５回の試行について訓練した：試行が、視認されるプラットホームと、隠されたプラットホームとの間で交互に行われ、最後の４回の試行では、隠されたプラットホームのみが用いられた。２日目に、マウスを、隠されたプラットホームを用いた１５回の試行について訓練した。間違ったアームへの進入、または、アームを１５秒以内に選択できなかったことを、エラーとしてスコア化した。空間学習および記憶を、それぞれの試行でのマウスのアーム進入エラーの数または逃避潜時を算出することによって測定した。訓練データを、３回の連続試行からなる一組の訓練について、平均エラーまたは平均逃避潜時として分析した。

【0106】

ＧＡ投与。それぞれのマウスに、２００μｌのＰＢＳに溶解されるＧＡ（バッチ番号Ｐ５３６４０；Ｔｅｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｐｅｔａｈ Ｔｉｑｖａ、イスラエル）の１００μｇの総用量を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。マウスには、毎週ＧＡ療法（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ他、２００６）または毎日ＧＡ投与に従ってどちらかが注入された（図８および図１６）。マウスを、それぞれの実験について示されるように、最後のＧＡ注入の１週間後に、または処置後１ヶ月でそのどちらかで安楽死させた。

【0107】

Ｔｒｅｇの条件的消失。ジフテリア毒素（ＤＴｘ；８ｎｇ／ｇ体重；Ｓｉｇｍａ）をＦｏｘｐ３．ＬｕｃｉＤＴＲマウス（Ｓｕｆｆｎｅｒ他、２０１０）に４日間連続して毎日、腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。ＤＴｘの効率を血液および脾臓における免疫細胞のフローサイトメトリー分析によって確認し、これにより、ＧＦＰを発現するＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞のほぼ完全な（９９％超の）枯渇化を達成した（図４）。

【0108】

Ｐ３００阻害。マウスにおけるｐ３００の阻害を以前の記載（Ｌｉｕ他、２０１３）と同様に行った。ｐ３００ｉ（Ｃ６４６；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＤＭＳＯに溶解し、１週間にわたって毎日、ｉ．ｐ．注入した（８．９ｍｇ ｋｇ^−１ ｄ^−１、ｉ．ｐ．）。ビヒクル処置マウスにＤＭＳＯを同様に注入した。

【0109】

ＡＴＲＡ処置。マウスへのオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）投与を以前の記載（Ｗａｌｓｈ他、２０１４）と同様に行った。ＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯに溶解し、１週間の間、１日おきにｉ．ｐ．注入した（８ｍｇ ｋｇ^−１ ｄ^−１）。ビヒクル処置マウスにＤＭＳＯを同様に注入した。

【0110】

可溶性Ａβ（ｓＡβ）タンパク質の単離および定量化。組織の均質化およびｓＡβタンパク質の抽出を以前の記載（Ｓｃｈｍｉｄｔ他、２００５）のように行った。簡単に記載すると、大脳の実質組織を切開し、急速凍結し、均質化まで−８０℃で保存した。タンパク質をサンプルから逐次的に抽出して、溶解性が異なるタンパク質を含有する別個の分画物を得た。サンプルを、すりガラス乳棒をＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいて使用して、２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ｐＨ７．４）を含有する１０体積の氷冷した組織均質化緩衝液において均質化した。６回のストロークの後、ホモジネートをさらなる６回のストロークの前に１００ｍＭのＮａＣｌ溶液における０．４％ジエチルアミン（ＤＥＡ）と１：１で混合し、その後、４℃で４５分間にわたって１３５，０００ｇで遠心分離した。上清（細胞外タンパク質および細胞質ゾルタンパク質を含有するＤＥＡ可溶性画分）を集め、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）の１０％により中和した。Ａβ_１＿４０およびＡβ_１＿４２を個々に、市販のキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；＃ＳＩＧ−３８９５４および＃ＳＩＧ−３８９５６）を製造業者の説明書に従って使用して可溶性画分から酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。

【0111】

Ａβプラークの定量化。それぞれの脳から、６μｍの冠状面薄片を集め、マウスあたり８個の切片（目的とする領域（歯状回または大脳皮質）の全体にわたる４つの異なる所定の深さからのもの）を免疫染色した。陽性染色画素のヒストグラム型セグメント化を、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウエア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用して行った。セグメント化アルゴリズムを歯状回領域または皮質層Ｖにおいて手動でそれぞれの画像に適用し、総Ａβ免疫染色によって占められる領域の百分率を求めた。プラーク数を同じ６μｍの冠状面脳薄片から定量化した。プラーク数が脳領域あたりの平均プラーク数として示される。定量化に先立って、薄片は、実験群の正体を隠すためにコード化され、プラーク負荷が、実験群の正体を知らない観測者によって定量化された。

【0112】

統計学的分析。それぞれの実験組を分析するために使用される具体的な検定が図の凡例に示される。データを、２つの群の間で比較するために両側スチューデントｔ検定を使用して分析し、一元配置ＡＮＯＶＡを、いくつかの群を比較するために使用し、その後、ニューマン・クールス事後手順を、帰無仮説が棄却された（Ｐ＜０．０５）後での群のペア毎の比較のために使用した。行動試験からのデータを、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して分析し、ボンフェローニ事後手順を追跡調査でのペア毎の比較のために使用した。サンプルサイズを、文献および過去の経験に基づく十分な統計学的検出力により選定し、マウスを、月齢、性別および遺伝子型に従って実験群に割り当てた。研究者には、実験群の正体を実験期間中および結果評価期間中は知らせなかった。すべての算入基準および除外基準がＩＡＣＵＣガイドラインに従って事前に確立された。結果が平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示される。グラフにおいて、ｙ軸の誤差バーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。統計学的計算を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。

【0113】

序論。アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能の段階的喪失および脳組織の破壊を引き起こす中枢神経系（ＣＮＳ）内のニューロン損傷、アミロイドベータ（Ａβ）プラーク形成および慢性的炎症によって特徴づけられる加齢関連の神経変性疾患である（Ａｋｉｙａｍａ他、２０００；Ｈａｒｄｙ＆Ｓｅｌｋｏｅ、２００２）。これらの状態のもとでは、循環する骨髄性細胞と、ＣＮＳの常在性の骨髄性細胞、すなわち、ミクログリアとが、非冗長的な役割を、神経炎症性応答を緩和する際に果たしている（Ｂｒｉｔｓｃｈｇｉ＆Ｗｙｓｓ−Ｃｏｒａｙ、２００７；Ｃａｍｅｒｏｎ＆Ｌａｎｄｒｅｔｈ、２０１０；Ｌａｉ＆ＭｃＬａｕｒｉｎ、２０１２）。具体的には、ミクログリアはＡβ沈着物を究極的には排除することができないが、ＣＮＳ浸潤の単球由来マクロファージ（ｍｏ−ＭΦ）は、Ａβプラーク形成を制限することおよびＡＤ様病理を撃退することにおいて有益な役割を果たしている（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ他、２００７；Ｋｏｒｏｎｙｏ−Ｈａｍａｏｕｉ他、２００９；Ｍｉｌｄｎｅｒ他、２０１１；Ｓｉｍａｒｄ他、２００６；Ｔｏｗｎ他、２００８）。脳の脈絡叢（ＣＰ）は、その上皮層が血液−ＣＳＦ関門（ＢＣＳＦＢ）を形成する一方で、神経組織損傷の後でのｍｏ−ＭΦ細胞およびＴ細胞の動員を可能にする、ＣＮＳへの白血球進入のための選択的入口として特定されている（Ｋｕｎｉｓ他、２０１３；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）。ここで、本発明者らは、ＡＤにおいて、罹患した実質組織への炎症消散免疫細胞の最適とはいえない動員は、ＣＰの入口機能不全を伴う全身的な免疫不全の結果であると仮定した。

【0114】

実施例１．ＡＤのマウスモデルにおける疾患進行に沿った脈絡叢（ＣＰ）入口活性。
本発明者らは最初に、ＡＤの５ＸＦＡＤ遺伝子組換えマウスモデル（ＡＤ−Ｔｇ）における疾患進行に沿ったＣＰ活性を調べた；これらのマウスは、家族性ＡＤに伴う５つの変異を共発現し、脳のＡβ病理および神経膠症を２ヶ月もの早期の月齢において発症する（Ｏａｋｌｅｙ他、２００６）。本発明者らは、疾患病理の進行段階に沿って、ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰが、月齢一致の野生型（ＷＴ）コントロールと比較した場合、ｉｃａｍ１、ｖｃａｍ１、ｃｘｃｌ１０およびｃｃｌ２（これらは、急性ＣＮＳ損傷に対する応答においてＣＰによってアップレギュレーションされることが示され、白血球の経上皮遊走のために必要であった；Ｋｕｎｉｓ他、２０１３；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）を含めて、白血球ホーミングおよび白血球輸送の決定因子の有意に低下したレベルを発現することを見出した（図１Ａ）。インテグリンリガンドＩＣＡＭ−１についての免疫組織化学的染色により、ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰ上皮によるその低下した発現が確認された（図１ｂ）。加えて、ヒト死後脳におけるＩＣＡＭ−１についての染色では、ＣＰ上皮におけるその加齢関連低下が、本発明者らの以前の観察結果（Ｂａｒｕｃｈ他、２０１４）と一致して示され、また、この影響の定量的評価では、さらなる低下が、ＣＮＳ疾患を有しない高齢者と比較されるＡＤ患者において明らかにされた（図２Ａ）。ＣＰによる白血球輸送決定因子の誘導が上皮でのインターフェロン（ＩＦＮ）−γのシグナル伝達に依存している（Ｋｕｎｉｓ他、２０１３）ので、本発明者らは次に、認められた影響がＣＰにおけるＩＦＮ−γ利用能の喪失を反映し得るであろうかどうかを検討した。５ＸＦＡＤ ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰを、フローサイトメトリー細胞内染色を使用して調べることにより、この区画におけるＩＦＮ−γ産生細胞の有意に低下した数が明らかにされ（図２Ｂ）、また、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析では、月齢一致のＷＴ型コントロールと比較されるＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおけるｉｆｎ−γのより低いｍＲＮＡ発現レベルが確認された（図２Ｃ）。

【0115】

実施例２．Ｔｒｅｇ媒介全身的免疫抑制、ＣＰ入口活性およびＡＤ病理の間における機能的関係。
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が、きわめて重要な役割を、全身的エフェクター免疫応答を抑制する際に果たしている（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他、２００８）。本発明者らは、Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制がＣＰにおけるＩＦＮ−γ利用能に影響を及ぼすことを想定し、したがって、ＡＤ病理におけるＴｒｅｇの関与に集中した。ＡＤ患者における上昇したＴｒｅｇレベルおよび抑制的活性の以前の報告（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ他、２００７；Ｓａｒｅｓｅｌｌａ他、２０１０；Ｔｏｒｒｅｓ他、２０１３）と一致しているが、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスの脾細胞におけるＦｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ頻度をそれらの月齢一致のＷＴ型同腹子と比較して評価することにより、それらの上昇したレベルが疾患進行に沿って明らかにされた（図３Ａ、図３Ｂ）。Ｔｒｅｇ媒介全身的免疫抑制、ＣＰ入口活性およびＡＤ病理の間における機能的関係を研究するために、本発明者らは、５ＸＦＡＤ ＡＤ−ＴｇマスをＦｏｘｐ３−ジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ^＋）マウスと交雑し、これにより、ジフテリア毒素（ＤＴｘ）の投与によるＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ^＋マウスにおけるＦｏｘ３^＋Ｔｒｅｇの一時的な条件的インビボ枯渇化を可能にした（図４Ａ）。Ｔｒｅｇの一時的な枯渇化は、ＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ⁻同腹子と比較して、ＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ^＋マウスのＣＰによる白血球輸送分子の上昇したｍＲＮＡ発現を生じさせた（図５Ａ）。脳の実質組織に対する一時的Ｔｒｅｇ枯渇化の長期影響の（３週間後での）分析により、上昇した数のＣＤ４５^ｈｉｇｈ／ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ骨髄性細胞（これは浸潤性ｍｏ−ＭΦを表す；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）およびＣＤ４^＋Ｔ細胞を含めて、脳における免疫細胞の蓄積が明らかにされた（図５Ｂ）。加えて、Ｔｒｅｇの短期間かつ一時的な枯渇化は、フローサイトメトリーによって評価された場合、脳内に蓄積するＣＤ４^＋Ｔ細胞の中でのＦｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇの際立った増強を生じさせた（図５Ｃ、図５Ｄ）。海馬のＲＴ−ｑＰＣＲ分析では、ｆｏｘｐ３およびｉｌ１０のｍＲＮＡの増大した発現が示された（図５Ｅ）。

【0116】

Ｔｒｅｇの短期間の枯渇化の後には、脳病理の部位における免疫調節細胞の蓄積が続くので、本発明者らは次に、Ｔｒｅｇの短期間の枯渇化が脳機能に対する長期影響を引き起こすかどうかを調べた。本発明者らは海馬の神経膠症における低下を認め（図５Ｆ）、また、炎症促進性サイトカイン（例えば、ｉｌ−１２ｐ４０およびｔｎｆ−αなど）の低下したｍＲＮＡ発現レベルを認めた（図５Ｇ）。そのうえ、海馬歯状回および大脳皮質（第５層）における、すなわち、堅固なＡβプラーク病理を５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて示す２つの脳領域（Ｏａｋｌｅｙ他、２００６）における脳Ａβプラーク負荷が低下した（図６Ａ、図６Ｂ）。認知機能に対する影響を、モリス水迷路（ＭＷＭ）試験を使用して評価することにより、Ｔｒｅｇ枯渇化後のＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ^＋マウスでの空間学習および記憶における著しい改善が、ＤＴｘ処置されたＡＤ−Ｔｇ／ＤＴＲ⁻月齢一致マウスと比較して明らかにされ、ＷＴ型マウスの成績と類似する成績に達した（図６Ｃ〜図６Ｅ）。まとめると、これらのデータにより、Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制をＡＤ−Ｔｇマウスにおいて一時的に中断させることは、ｍｏ−ＭΦおよびＴｒｅｇを含めて、炎症消散細胞の脳における蓄積をもたらし、その後には、神経炎症性応答の消散、Ａβの排除および認知低下の回復が続くことが明らかにされた。

【0117】

実施例３．コポリマー−１の毎週投与はＴｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制を低下させ、ＣＰ入口活性を改善し、ＡＤ病理を緩和する。
全身的免疫抑制、ＣＰ機能およびＡＤ病理の間における逆相関の因果性をさらに実証するために、本発明者らは次に、免疫調節化合物のグラチラマー酢酸塩（ＧＡ；これはコポリマー−１またはＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）としてもまた知られている）を使用した。グラチラマー酢酸塩は、毎週投与療法において、治療効果をＡＤのＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいて有することが見出されていた（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ他、２００６）；この効果には、疾患病理の脳部位へのｍｏ−ＭΦ動員が機能的に伴っていた（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ他、２００７）。ここで、本発明者らは最初に、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスにおける本発明者らの観測結果と同様に、ＡＰＰ／ＰＳ１ ＡＤ−ＴｇマウスにおけるＣＰもまた、ＩＦＮ−γ発現レベルに関して欠乏しているかどうかを調べた。本発明者らは、ＡＰＰ／ＰＳ１ ＡＤ−Ｔｇマウスでは、ＣＰにおけるＩＦＮ−γレベルが月齢一致のＷＴ型コントロールに対して低下したことを見出した（図７Ａ）。これらの結果は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける毎週ＧＡの治療効果（Ｂｕｔｏｖｓｋｙ他、２００６）が、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて再現され得るであろうかどうか、そして、もしそうであるならば、その治療効果は、全身的Ｔｒｅｇと、ｍｏ−ＭΦ輸送のためのＣＰの活性化とに影響を及ぼすであろうかどうかを検討することを本発明者らに促した。したがって、本発明者らは、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスを４週間の期間にわたるＧＡの毎週投与療法（以降、「毎週ＧＡ」）により処置した（図８Ａに概略的に示される）。本発明者らは、毎週ＧＡにより処置される５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスが、低下した神経炎症を示し（図８Ｂ〜図８Ｄ）、かつ、認知成績を改善し、改善が処置後２ヶ月に至るまで持続した（図８Ｅ〜図８Ｉ）ことを見出した。全身性免疫およびＣＰに対する毎週ＧＡの影響をフローサイトメトリーによって調べたとき、本発明者らは、脾細胞でのＦｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇレベルが低下したことを見出し（図９Ａ）、また、ＩＦＮ−γ産生細胞が、処置された５ＸＦＡＤ ＡＤ−ＴｇマウスのＣＰにおいて増大し、ＷＴ型コントロールにおいて認められるレベルと類似するレベルに達したことを見出した（図９Ｂ）。毎週ＧＡで処置されたマウスにおけるＣＰでのＩＦＮ−γ発現細胞の上昇したレベルには、白血球輸送分子のアップレギュレーションされた上皮発現が伴った（図９Ｃ）。

【0118】

浸潤するｍｏ−ＭΦのＣＮＳへの進入を検出するために、本発明者らは、（頭部保護を使用して調製される）５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}骨髄（ＢＭ）キメラマウスを使用した。このキメラマウスでは、循環する（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）^＋標識された）骨髄性細胞の可視化が可能であった（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２００９；Ｓｈｅｃｈｔｅｒ他、２０１３）。本発明者らは、ビヒクル処置のＡＤ−Ｔｇ／ＣＸ_３ＣＲ１^{ＧＦＰ／＋}コントロールと比較した場合、毎週ＧＡ処置の後におけるＣＰおよび隣接脳室空間へのＧＦＰ^＋ｍｏ−ＭΦの増大したホーミングを見出した（図９Ｄ〜図９Ｅ）。脳の実質組織の免疫組織化学により、脳のプラーク形成の部位におけるＧＦＰ^＋ｍｏ−ＭΦ蓄積の存在が明らかにされ（図９Ｆ）、浸潤する骨髄性細胞の定量化は、ＡＤ−Ｔｇ非キメラマウスにおける海馬のフローサイトメトリー分析による場合、ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈＣＤ４５^ｈｉｇｈ発現細胞の増大した数を示した（図９Ｇ、図９Ｈ）。まとめると、これらの結果により、ＡＤ病理の部位へのｍｏ−ＭΦ動員、全身的Ｔｒｅｇレベルの低下、および、ＣＰのＩＦＮ−γ依存的活性化の間における機能的連関が実証された。

【0119】

実施例４．Ｔｒｅｇ活性を短期間にわたって直接に妨げることにより、ＣＰ入口活性が改善され、ＡＤ病理が緩和される。
４．１ 小分子のヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤を使用するＴｒｅｇ活性の妨害。上記の発見は、Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制が、ＡＤ病理と闘う能力を妨げることを示唆した一方で、ガン免疫療法におけるＴｒｅｇに起因すると考えられる機能を連想させる。これは、ガン免疫療法では、これらの細胞が、効果的な抗腫瘍応答を免疫系が開始し得ることを妨げているからである（Ｂｏｓ＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ、２０１２；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、２０１０）。したがって、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ細胞活性を直接に妨げる処置はＡＤにおいて好都合であるかもしれないと考えた。本発明者らは、ｐ３００ｉ（Ｃ６４６（Ｂｏｗｅｒｓ他、２０１０））、すなわち、ｐ３００（Ｔｒｅｇ機能を調節するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（Ｌｉｕ他、２０１３））の非ペプチド性阻害剤を検討した：この阻害剤は、保護的なＴエフェクター細胞応答を損なわないままにしながら、Ｔｒｅｇ抑制活性に影響を及ぼすことが示された（Ｌｉｕ他、２０１３）。本発明者らは、ｐ３００ｉにより処置されたマウスが、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処置のコントロールと比較して、脾臓における全身的ＩＦＮ−γ発現細胞の上昇したレベルを示し（図１０Ａ）、同様にまた、ＣＰにおける全身的ＩＦＮ−γ発現細胞の上昇したレベルを示したこと（図１０Ｂ）を見出した。本発明者らは次に、ＡＤ−Ｔｇマウスを１週間の間、ｐ３００ｉまたはビヒクルのどちらかで処置し、脳のＡβプラーク負荷について３週間後に調べた。免疫組織化学的分析により、脳のＡβプラーク負荷における著しい低下がｐ３００ｉ処置のＡＤ−Ｔｇマウスにおいて明らかにされた（図１０Ｃ〜図１０Ｅ）。本発明者らはまた、１回の処置過程の後でのプラーク病理に対する影響が３週間を超えて持続するであろうかどうかを、そして、もしそうであるならば、さらなる回数の処置過程は、長く持続する効果に寄与するであろうかどうかを検討した。したがって、本発明者らは、ただ１回だけのｐ３００ｉ処置過程を受け、２ヶ月後に調べられたＡＤ−Ｔｇマウスを、１ヶ月の間欠を間に伴う２回の処置過程（図１０Ｆに概略的に示される）をこの期間の期間中に受けた月齢一致群と比較した。本発明者らは、脳のプラーク負荷の低下が、ただ１回だけの処置過程の２ヶ月後においてさえ明白であり、しかし、１ヶ月の間欠を間に伴う２回の処置過程を受けたマウスではより強かったことを見出した（図１０Ｇ）。ＡＤにおける損なわれたシナプス可塑性および記憶には、可溶性Ａβ_１＿４０／Ａβ_１＿４２（ｓＡβ）レベルの上昇した脳レベルが伴う（Ｓｈａｎｋａｒ他、２００８）ので、本発明者らはまた、ｓＡβレベルをｐ３００ｉ処置のただ１回だけのサイクルまたは反復したサイクルの後で測定した。再度ではあるが、本発明者らは、１回の過程および（１ヶ月の間欠を間に伴う）２回の過程の両方が、脳のｓＡβを低下させることにおいて効果的であったことを見出し、そして、それにもかかわらず、この効果は、ｓＡβ_１＿４２に対する影響に関して、反復した過程の後ではより強かった（図１０Ｈ）。これらの結果は、ただ１回だけの短期間の処置過程が効果的であるが、反復した回数の処置過程が、毎週ＧＡ処置の後での本発明者らの観測結果と同様な長期間持続する治療効果を維持するために好都合であろうことを示している。

【0120】

４．２ 抗ＰＤ１抗体を使用するＴｒｅｇ活性の妨害。１０ヶ月の月齢において、５ＸＦＡＤアルツハイマー病（ＡＤ）遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスに２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ；＃ＢＥ００８９；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかを実験の１日目および４日目にｉ．ｐ．注入し、そして、詳しくは以前に記載されるように（Ａｌａｍｅｄ他、２００６）、マウスを放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）での空間学習・記憶課題によってそれらの認知成績について３週間後に調べた（図１１Ａに概略的に示される）。簡単に記載すると、ＲＡＷＭ課題の１日目に、マウスを（３時間にわたって一定の間隔での）１５回の試行について訓練した：試行が、視認されるプラットホームと、隠されたプラットホームとの間で交互に行われ、最後の４回の試行では、隠されたプラットホームのみが用いられた。２日目に、マウスを、隠されたプラットホームを用いた１５回の試行について訓練した。間違ったアームへの進入、または、アームを１５秒以内に選択できなかったことを、エラーとしてスコア化した。空間学習および記憶を、それぞれの試行でのマウスのアーム進入エラーの数または逃避潜時を算出することによって測定した。月齢を一致させた未処置のＷＴ型マウスおよびＡＤ−Ｔｇマウスをコントロールとして使用した。本発明者らは、（１日目および４日目での）抗ＰＤ１の２回の注入を含む１回の治療期間により処置された５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスが、３週間後に評価された場合、ＲＡＷＭにおける著しい改善された空間認知成績を示したことを見出した（図１１Ｂ）。

【0121】

本発明者らは次に、疾患病理に対する影響には全身的免疫抑制の低下が伴うかどうかを調べた。本発明者らは上記実験を繰り返したが、今回は、マウスを、処置期が終了したとき（実験の７日目）に調べた（図１２Ａに概略的に示される）。本発明者らは、この時点では、ＰＤ−１で処置されたＡＤ−Ｔｇマウスにおける全身的免疫抑制の減弱には、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４脾細胞が上昇するという全身的影響が付随し（図１２Ｂ）、そして、この影響が、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡレベルが上昇するというＣＰでの局所的影響と相関し（図１３Ａ）、また、ＣＰの白血球輸送分子、ケモカインであるＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１０の発現における上昇と相関する（図１３Ｂ）ことを認めた。これらのデータは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける短期間の抗ＰＤ−１処置期には、予想されたように、Ｔｒｅｇ媒介の免疫抑制を弱めるという全身的応答（Ｎａｉｄｏｏ他、２０１４）、および、ＣＮＳへの白血球輸送のためのＣＰ入口活性の活性化が伴うことを示した。

【0122】

最後に、本発明者らは、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける疾患病理に対する影響を調べ、かつ、さらなる処置期が病理に対するその影響において好都合であるかどうかを調べた。この目的を達成するために、１０月齢のＡＤ−Ｔｇマウスは、上記で記載されるような１回の抗ＰＤ−１処置期、または、３週間の間欠を伴うさらなる処置のどちらかを受けた。コントロール群はＩｇＧによる処置または非処置のどちらかに供され、すべてのマウス群を３週間後にそれらの認知成績について試験した（図１４Ａに概略的に示される）。本発明者らは、１回の抗ＰＤ−１により処置されたＡＤ−Ｔｇマウス（「ＡＤ−Ｔｇ＋ＰＤ−１ Ｘ１」）で、２ヶ月後に調べられたＡＤ−Ｔｇマウスは、著しい認知改善を、ＩｇＧ処置および非処置のＡＤ−Ｔｇマウスとの比較において示したが、その効果は、同じマウスが１ヶ月早く認知成績について評価されたときよりも堅固でなかったことを見出した。対照的に、もう１回の抗ＰＤ−１処置期を受けたＡＤ−Ｔｇマウス（「ＡＤ−Ｔｇ＋ＰＤ−１ Ｘ２」）は、ＩｇＧ処置または非処置のＡＤ−Ｔｇマウスと比較された場合と同様に、１回の処置期を受けたＡＤ−ＴＧと比較して、ＲＡＷＭにおける著しくより良好な空間学習能および記憶能を示した（図１４Ｂ）。これらの発見により、長期間持続する治療効果を維持するためには、反復した処置期が必要であることが明らかにされた。

【0123】

４．３ 抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体の組合せを使用するＴｒｅｇ活性の妨害。
１０ヶ月の月齢において、５ＸＦＡＤアルツハイマー病（ＡＤ）遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスに２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）および２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ｍＣＤ１５２；＃ＢＥ０１３１；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９、または、ポリクローナルなゴールデンハムスターＩｇＧ、＃ＢＥ００８７；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかを実験の１日目および４日目にｉ．ｐ．注入し、マウスを、上記で記載されるように、放射状アーム水迷路（ＲＡＷＭ）での空間学習・記憶課題によってそれらの認知成績について３週間後に調べる。

【0124】

一部のマウスは、３週間の間欠期を有するさらなる処置期を受ける。コントロール群はＩｇＧによる処置または非処置のどちらかに供され、すべてのマウス群が３週間後にそれらの認知成績について試験される。

【0125】

抗体の組合せにより処置されるマウスは、著しい認知改善を、ＩｇＧ処置および非処置のＡＤ−Ｔｇマウスとの比較において示し、同様にまた、脳のプラーク負荷の著しい低下を示すことが予想される。

【0126】

実施例５．Ｔｒｅｇ活性の増強はＡＤ病理に対する悪影響を有する。
ＡＤにおけるＴｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制の負の役割を実証するために、本発明者らは次に、全身的Ｔｒｅｇレベルを増強することはＡＤ病理に対する逆の悪影響を有し得るであろうかどうかを調べた。このことを検討するために、本発明者らは、ＡＤ−ＴｇマウスにおけるＴｒｅｇ抑制機能をオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）の投与によって増強した：この場合、オールトランスレチノイン酸により、Ｔｒｅｇ分化が誘導され（Ｍｕｃｉｄａ他、２００７）、Ｔｒｅｇ表現型が安定化され（Ｚｈｏｕ他、２０１０）、Ｔｒｅｇがより抑制的にされる（Ｚｈｏｕ他、２０１０）。本発明者らは、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスを疾患進行の比較的早い段階で使用し、ＡＴＲＡまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）のどちらかで処置した。ＡＴＲＡで処置されたＡＤ−ＴｇマウスはＦｏｘｐ３^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇの著しくより大きい脾細胞頻度を示した（図１５Ａ、図１５Ｂ）。マウスを最後のＡＴＲＡ注入の３週間後に調べた場合、より大きい脳Ａβプラーク負荷および神経膠症が明らかにされ（およそ２倍〜３倍の増大；図１５Ｃ〜図１５Ｅ）、ｓＡβの評価により、脳での増大したｓＡβ_１＿４０レベルおよびｓＡβ_１＿４２レベルが全身的Ｔｒｅｇの増強の後で明らかにされた（図１５Ｆ〜図１５Ｇ）。ＲＡＷＭを使用した認知成績の評価では、空間記憶欠損の悪化が、ビヒクル処置のＡＤ−Ｔｇマウスと比較して、ＡＴＲＡ処置のＡＤ−Ｔｇマウスにおいて示された（図１５Ｈ）。

【0127】

ＧＡの毎日の投与は、Ｔｒｅｇを誘導することが知られており、また、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するために臨床で使用されるという事実（Ｈａａｒ他、２００９；Ｈｏｎｇ他、２００５；Ｗｅｂｅｒ他、２００７）と併せて、ＡＤ病理に対する全身的Ｔｒｅｇの負の影響の本発明者らの今回の発見を考慮して、本発明者らは、（１ヶ月の期間にわたる）毎日療法におけるＧＡは、毎週ＧＡとは対照的に、ＡＤ−Ｔｇマウスにおける疾患病理に対する負の影響を有するかもしれないかどうかを検討した。本発明者らは、（図１６Ａに概略的に示される）毎週ＧＡ投与に対する毎日ＧＡ投与の影響を、５ＸＦＡＤ ＡＤ−Ｔｇマウスにおいて比較した。ＲＡＷＭ課題による認知成績の評価では、毎週ＧＡ処置の有益な効果とは対照的に、空間記憶に対する有益な効果、または、悪化影響への傾向のどちらもが、毎日ＧＡを受けたＡＤ−Ｔｇマウスにおいて認められなかったことが明らかにされた（図１６Ｂ）。加えて、プラーク排除に対する毎週ＧＡ投与の堅固な影響とは異なり、毎日ＧＡで処置されたＡＤ−Ｔｇマウスは有益な効果を何ら示さず、または、プラーク負荷に対する中程度の悪影響を示した（図１６Ｃ〜図１６Ｆ）。これらの発見により、ＭＳおよびＡＤ、すなわち、神経炎症を伴う２つのＣＮＳ病理がどのように、毎日ＧＡによる同じ免疫調節処置によって逆向きかつ弁別的に影響され得るであろうかが強調される（Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆Ｂａｒｕｃｈ、２０１４ａ）。

【0128】

実施例６．Ｔｒｅｇ活性を直接に妨げることにより、ＣＰ入口活性が改善され、かつ、ＰＴＳＤ病理が妨げられ、または緩和される。
重度のストレス性状態または慢性的ストレスは心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）およびうつ病を引き起こす可能性がある。本発明者らは以前に、ＣＰ入口活性が、精神的ストレスに対処するために非常に重要であるかもしれないこと、そして、ＣＰの機能が最適とはいえない場合には、精神的な外傷性エピソードがＰＴＳＤを引き起こすかもしれないことを示唆した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ＆Ｂａｒｕｃｈ、２０１２）。本発明者らはさらに、外傷後の時宜を得た全身的介入が、ＣＰ応答を修正することを助けることになる一方で、ＰＴＳＤの慢性的状態の発症を妨げるかもしれないことを仮定した。Ｔｒｅｇ媒介の全身的免疫抑制を短期間弱めることは脳病理に対する長期影響を有するという本発明者らの発見は、この介入が、外傷事象の直後であれば、ＰＴＳＤの発症を妨げるであろうことを示唆している。

【0129】

ＣＰが、外傷性ストレスに対処する際には関与し、そして、外傷性ストレスがＰＴＳＤの発症を引き起こす場合、ＣＰは機能不全に陥っているかもしれないという本発明者らの作業仮説を検証するために、本発明者らは生理学的ＰＴＳＤ様動物モデルを採用した：このモデルにおいて、マウスは、過度に用心深い行動、注意力の低下、増大したリスク評価、および、睡眠不足を示す（Ｌｅｂｏｗ他、２０１２）。ＰＴＳＤ誘導のこの実験モデルにおいて、マウスは昼夜逆転サイクルに１０日間慣らされ、電気的ショックの２つのエピソード（外傷および誘因）が与えられ（これは「ＰＴＳＤ誘導」と呼ばれる）、外傷後の種々の時点で評価される。外傷事象の後、マウスには、末梢の免疫抑制を一時的に低下させる前記化合物が注入される。マウスは下記療法の１つまたは複数に従って処置される：
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を外傷事象後１日目および４日目に受け、２週間のさらなる間欠期の後で調べられる；
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）および２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ｍＣＤ１５２；＃ＢＥ０１３１；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９、または、ポリクローナルなゴールデンハムスターＩｇＧ、＃ＢＥ００８７；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を実験の１日目および４日目に受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、上記のような毎週ＧＡによるｉ．ｐ．注入を外傷事象の後で受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、１週間の過程にわたるｐ３００ｉまたはビヒクルによる処置を外傷事象の後で受け、上記で記載されるように３週間後に調べられる；
一部のマウスは、適切な間欠期を有するさらなる処置期を受ける。

【0130】

処置を受けるマウスは、探索に費やす時間、および、（Ｌｅｂｏｗ他、２０１２）に記載される明暗迷路または他の行動課題でのリスク評価によって評価されるような、この実験モデルにおけるＰＴＳＤに伴う不安行動を示さないことが予想される。

【0131】

実施例７．全身的免疫抑制の一時的低下はパーキンソン病の病理を緩和する。
パーキンソン病（ＰＤ）遺伝子組換え（Ｔｇ）マウスがこれらの実験では使用される。マウスは下記療法の１つまたは複数に従って疾患の進行段階において処置される：
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を外傷事象後１日目および４日目に受け、２週間のさらなる間欠期の後で調べられる；
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）および２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ｍＣＤ１５２；＃ＢＥ０１３１；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９、または、ポリクローナルなゴールデンハムスターＩｇＧ、＃ＢＥ００８７；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を実験の１日目および４日目に受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、上記のような毎週ＧＡによるｉ．ｐ．注入を外傷事象の後で受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、１週間の過程にわたるｐ３００ｉまたはビヒクルによる処置を外傷事象の後で受け、上記で記載されるように３週間後に調べられる；
一部のマウスは、適切な間欠期（約３週間〜１ヶ月）を有するさらなる処置期間を受ける。

【0132】

運動の神経学的機能が、例えば、ロータロッド成績試験（これにより、回転する棒の上に留まるマウスの能力が評価される）を使用して評価される。

【0133】

１回の処置期により処置されるＰＤ−Ｔｇマウスは、ＩｇＧ処置またはビヒクル処置のコントロール群あるいは非処置群と比較して、著しい改善された運動成績を示すことが予想される。２回の治療過程を受け、適切な間欠期の後で調べられるＰＤ−Ｔｇマウスは、長期間持続する治療効果を示すことが予想される。この治療効果を維持するために、マウスは、適切な間欠期をそれぞれの処置期の間に有する有効な処置期に供される。

【0134】

実施例８．全身的免疫抑制の一時的低下はハンチントン病の病理を緩和する。
これらの実験で使用されるモデルはハンチントン病（ＨＤ）Ｒ６／２遺伝子組換えマウス（Ｔｇ）試験系である場合がある。Ｒ６／２遺伝子組換えマウスは、多数のＣＡＧ反復の挿入を含む変異型ヒトハンチンチン遺伝子を疾患の進行段階でのマウスにおいて過剰発現する。これらのマウスは、５週〜６週もの早い週齢で始まり、１０週〜１３週での早過ぎる死を引き起こす進行性の行動−運動障害を示す。症状には、低体重、抱擁、振戦および痙攣が含まれる。

【0135】

マウスは生後４５日のときに下記療法の１つまたは複数に従って処置される：
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を外傷事象後１日目および４日目に受け、２週間のさらなる間欠期の後で調べられる；
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）および２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ｍＣＤ１５２；＃ＢＥ０１３１；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９、または、ポリクローナルなゴールデンハムスターＩｇＧ、＃ＢＥ００８７；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を実験の１日目および４日目に受け、２週間のさらなる間欠期の後で調べられる。
・マウスは、上記のような毎週ＧＡによるｉ．ｐ．注入を外傷事象の後で受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、１週間の過程にわたるｐ３００ｉまたはビヒクルによる処置を外傷事象の後で受け、上記で記載されるように３週間後に調べられる；
一部のマウスは、適切な間欠期（約３週間〜１ヶ月）を有するさらなる処置期間を受ける。

【0136】

運動の神経学的機能が、例えば、ロータロッド成績試験（これにより、回転する棒の上に留まるマウスの能力が評価される）を使用して評価される。

【0137】

１回の処置期により処置されるＨＤ−Ｔｇマウスは、ＩｇＧ処置またはビヒクル処置のコントロール群あるいは非処置群と比較して、著しい改善された運動成績を示すことが予想される。２回の治療過程を受け、適切な間欠期の後で調べられるＨＤ−Ｔｇマウスは、長期間持続する治療効果を示すことが予想される。この治療効果を維持するために、マウスは、適切な間欠期をそれぞれの処置期の間に有する有効な処置期に供される。

【0138】

実施例９．全身的免疫抑制の一時的低下は筋萎縮性側索硬化症の病理を緩和する。
この実験で使用されるモデルは、Ｇｌｙ９３→Ａｌａ（Ｇ９３Ａ）遺伝子を含有する欠損型ヒト変異ＳＯＤ１対立遺伝子を過剰発現する遺伝子組換えマウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ（本明細書中では「ＡＬＳマウス」）である場合がある。このモデルは運動ニューロン疾患を発症し、したがって、ＡＬＳを処置するための容認された動物モデルを構成する。

【0139】

マウスは生後７５日のときに下記療法の１つまたは複数に従って処置される：
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を外傷事象後１日目および４日目に受け、２週間のさらなる間欠期の後で調べられる；
・マウスは、２５０μｇの抗ＰＤ１抗体（ＲＭＰ１−１４；＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）および２５０μｇの抗ＣＴＬＡ４抗体（ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ抗ｍＣＤ１５２；＃ＢＥ０１３１；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）またはコントロールＩｇＧ抗体（ＩｇＧ２ａ、＃ＢＥ００８９、または、ポリクローナルなゴールデンハムスターＩｇＧ、＃ＢＥ００８７；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）のどちらかによるｉ．ｐ．注入を実験の１日目および４日目に受け、２週間の間欠期の後で調べられる。
・マウスは、上記のような毎週ＧＡによるｉ．ｐ．注入を外傷事象の後で受け、２週間の間欠期の後で調べられる；
・マウスは、１週間の過程にわたるｐ３００ｉまたはビヒクルによる処置を外傷事象の後で受け、上記で記載されるように３週間後に調べられる；
一部のマウスは、適切な間欠期（約３週間〜１ヶ月）を有するさらなる処置期間を受ける。

【0140】

運動の神経学的機能が、例えば、ロータロッド成績試験（これにより、回転する棒の上に留まるマウスの能力が評価される）を使用して評価されるか、または、マウスは、小さいループを下方端に有する垂直なワイヤ（直径が２ｍｍ）をつかみ、それにしがみつくことが許される。垂直なワイヤは、マウスが、ワイヤにつかまるために前足および後足の両方を使用することを可能にする。このワイヤは、２４ｒｐｍでの垂直配向の円形運動（円の半径が１０ｃｍであった）で維持される。マウスがワイヤにしがみつくことができる時間がタイマーにより記録される。

【0141】

１回の処置期により処置されるＡＬＳマウスは、ＩｇＧ処置またはビヒクル処置のコントロール群あるいは非処置群と比較して、著しい改善された運動成績を示すことが予想される。２回の治療過程を受け、適切な間欠期の後で調べられるＡＬＳマウスは、長期間持続する治療効果を示すことが予想される。この治療効果を維持するために、マウスは、適切な間欠期をそれぞれの処置期の間に有する有効な処置期に供される。

【0142】

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【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図9A-B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G-H】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D-F】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]