特許 6904382 改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6904382

(24)【登録日】2021年6月28日

(45)【発行日】2021年7月14日

(54)【発明の名称】改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20210701BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20210701BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20210701BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/54ZNA

   C12N9/12

   C12Q1/6844 Z

【請求項の数】17

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2019-126133(P2019-126133)

(22)【出願日】2019年7月5日

(62)【分割の表示】特願2017-93924(P2017-93924)の分割

【原出願日】2013年3月29日

(65)【公開番号】特開2019-187444(P2019-187444A)

(43)【公開日】2019年10月31日

【審査請求日】2019年7月5日

(31)【優先権主張番号】特願2012-217474(P2012-217474)

(32)【優先日】2012年9月28日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2012-217475(P2012-217475)

(32)【優先日】2012年9月28日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】小林 哲大

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２６５１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０７０１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２５３２６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−０４２８７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０５４１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０３５５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Protein Eng. Des. Sel.，２０１０年，Vol.23, No.8，pp.589-597

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおけるウラシル結合に関するアミノ酸配列のうち少なくとも２つのアミノ酸の改変を有するものであり、該改変が配列番号１に示されるアミノ酸配列のＰ３６に相当するアミノ酸にＰ３６Ｈのアミノ酸置換による改変を有し、かつ、Ｙ７に相当するアミノ酸を改変したものであって、該改変がＹ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ及びＹ７Ｉからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項2】

パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおけるウラシル結合に関するアミノ酸配列のうち少なくとも２つのアミノ酸の改変を有するものであり、該改変が配列番号２に示されるアミノ酸配列のＰ３６に相当するアミノ酸にＰ３６Ｈのアミノ酸置換による改変を有し、かつ、Ｙ７に相当するアミノ酸を改変したものであって、該改変がＹ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ及びＹ７Ｉからなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸置換である、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項3】

少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ及びＹ７Ｇのアミノ酸置換である請求項１または２に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項4】

少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ及びＹ７Ｖのアミノ酸置換である請求項１または２に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項5】

少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ及びＹ７Ｌのアミノ酸置換である請求項１または２に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項6】

少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ及びＹ７Ｉのアミノ酸置換である請求項１または２に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項7】

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域に関するアミノ酸配列のうち、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列におけるＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｈ１４７、Ｎ２１０及びＹ３１１に相当するアミノ酸のうちの少なくとも１つの改変を更に有する請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項8】

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＤ１４１Ａ及びＥ１４３Ａである請求項７に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項9】

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＩ１４２Ｒである請求項７に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項10】

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＹ３１１Ｆである請求項７に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項11】

前記改変型ＤＮＡポリメラーゼがＨ１４７Ｅ又はＨ１４７Ｄのアミノ酸置換を更に含む請求項１〜１０のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする核酸増幅方法。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用して、イノシンを含んだプライマーを用いることを特徴とする核酸増幅方法。

【請求項14】

請求項１〜１１のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用して、バイサルファイト処理したＤＮＡを増幅することを特徴とする核酸増幅方法。

【請求項15】

請求項１〜１１のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅した核酸を、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いて分解する工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。

【請求項16】

請求項１〜１１のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅用試薬。

【請求項17】

請求項１６に記載の核酸増幅用試薬を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの変異体及びその製法に関する。更には、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、並びに該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する試薬に関する。本発明は、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。

【背景技術】

【0002】

ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにはファミリーＡに属するものとファミリーＢに属するものが存在する。ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼとしてはサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラ−ゼ）やサーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）などが知られている。また、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしてはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）やサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔｌｉポリメラーゼ）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）などが知られている。

【0003】

一般的に、ＰＣＲには増幅効率が良く、条件設定が容易という点からファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼが用いられていた。しかし、最近では反応組成など様々な検討によりファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼでも容易に条件設定が可能となっている。正確性が高い点や熱安定性が高い点、また反応系に持ち込まれる阻害物質に強いといった点から、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。

【0004】

しかし、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、その高い忠実性からｄＵＴＰを取り込むと反応が停止してしまうという問題があった。ｄＵＴＰはｄＣＴＰが熱分解しても生じるため、ＰＣＲの熱サイクルで生じるｄＵＴＰの影響を受け、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼはその高い増幅効率を十分に発揮できていなかった。特に熱サイクルの時間が長い長鎖ターゲットのＰＣＲや多サイクルを回して行う微量テンプレートからのＰＣＲでは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの増幅効率が落ちることが知られていた。

【0005】

一方、ＰＣＲは非常に高感度な検出方法であるため、以前に行ったＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性が問題となる。そこで、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含む基質を用いてＰＣＲを行い、増幅産物にウラシル塩基を取り込ませ、次のＰＣＲを行う際にＵｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ(ＵＮＧ)処理することで、コンタミネーション（キャリーオーバー）した増幅産物を分解する手法（ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法）がとられている（非特許文献１）。しかし、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、正確性が高く、熱安定性が高い、また反応系に持ち込まれる阻害物質に強いといった利点をもつものの、ｄＵＴＰの取り込みができないため、このような手法では使用することはできなかった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。

【0006】

近年、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとｄＵＴＰを含む核酸の相互作用が研究され、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｔｇｏポリメラーゼ）においてｄＵＴＰとの結晶構造解析が実施された。解析結果から、アミノ酸１〜４０とアミノ酸７８〜１３０からなるウラシル結合ポケットの存在が示唆され、このウラシル結合ポケットとｄＵＴＰが強く相互作用を起こすため、ＰＣＲの伸長反応を止めることが分かっている（非特許文献５）。

【0007】

そこで、ウラシル結合ポケットに関与するアミノ酸を改変するとｄＵＴＰとの親和性が減少し、ｄＵＴＰが存在する条件でもＰＣＲを行えることが見出されてきた。しかしながら、これらの変異体でも、ＰＣＲの増幅量が減少するなど、その増幅効率を十分発揮することができていなかった。また、従来、酵素活性の低下が予想されていたため、多重変異は検討されていなかった（特許文献１、２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表第２００５−５２６５１０号公報

【特許文献2】特表第２００６−５０７０１２号公報

【特許文献3】米国特許第６９４６２７３号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．９３（１）， １２５−１２８ （１９９０）

【非特許文献2】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｖｏｌ．２１（３）， ３６８−３７０ （１９９６）

【非特許文献3】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．２１１（１）， １６４−１６９ （１９９３）

【非特許文献4】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ｖｏｌ．９９， ５９６−６０１ （２００２）

【非特許文献5】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ３８１（３）， ５２９−５３９ （２００８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上述したように、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。しかし、ｄＵＴＰによって反応が停止するため、ｄＵＴＰ／ＵＮＧコンタミネーション除去法は使用できず、また、熱サイクル中に生成されるｄＵＴＰにより、その増幅効率を十分発揮することができていなかった。本発明の目的は、ｄＵＴＰによって阻害されない、改変されたファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼにおいて、ウラシルの結合に関与するアミノ酸配列における２つ以上のアミノ酸を改変することにより、アミノ酸の単変異体よりもウラシルへの感受性がさらに低下することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸、もしくは他の種由来のＤＮＡポリメラーゼにおける７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸に相当するアミノ酸に少なくとも２つのアミノ酸の改変を導入することにより、ウラシルへの感受性が低下し、ｄＵＴＰ存在下でもＤＮＡ伸長反応を行うことができる改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを発明した。好ましい例は、７番目、３６番目、９３番目のいずれか２つ以上のアミノ酸の改変を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。より好ましい例は７番目のチロシンが非極性アミノ酸に置換されており、３６番目のプロリンが正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、及び／または９３番目のバリンが正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。

【0013】

さらに本発明らは、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列の改変に加え、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域を改変し、３‘−５’エキソヌクレアーゼ（エキソ）活性を欠損させることで、よりウラシルへの感受性が低下することを見出した。本出願はさらに、配列番号１における１３７〜１４６、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を有し、エキソ活性を５０％以下に減少させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。より好ましくは、配列番号１における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。さらに好ましくは、３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域のアミノ酸の改変が１４１番目のアスパラギン酸からアラニンへの置換及び１４３番目のグルタミン酸からアラニンへの置換、１４２番目のイソロイシンからアルギニンへの置換、２１０番目のアスパラギンからアスパラギン酸への置換、並びに３１１番目のチロシンからフェニルアラニンへの置換から選択されるいずれか一つである、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。

【0014】

本出願はさらに、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列の改変に加え、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域を改変し、ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼを提供する。より好ましくは配列番号1における１４７番目のヒスチジンからグルタミン酸への置換、または１４７番目のヒスチジンからアスパラギン酸への置換されるいずれか一つである、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。

【0015】

代表的な発明は以下の通りである。
（１）パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼであって、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち、少なくとも２つのアミノ酸の改変を有し、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0016】

（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸からなるウラシルの結合に関するアミノ酸配列のうち、少なくとも２つのアミノ酸の改変を有し、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、（１）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0017】

（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列におけるＹ７、Ｐ３６、およびＶ９３に相当するアミノ酸のうち、少なくとも２つのアミノ酸を改変し、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりもウラシルの感受性が低いことを特徴とする、（２）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0018】

（４）Ｙ７に相当するアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0019】

（５）Ｐ３６に相当するアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である、（３）または（４）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0020】

（６）Ｖ９３に相当するアミノ酸の改変が、Ｖ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である、（３）〜（５）のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0021】

（７）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＰ３６Ｈのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0022】

（８）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＰ３６Ｋのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0023】

（９）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＰ３６Ｒのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0024】

（１０）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＶ９３Ｑのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0025】

（１１）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＶ９３Ｋのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0026】

（１２）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｙ７Ａ及びＶ９３Ｒのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0027】

（１３）少なくとも２つのアミノ酸の改変が、Ｐ３６Ｈ及びＶ９３Ｋのアミノ酸置換である、（３）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0028】

（１４）さらに３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、（１）〜（１３）のいずれかに改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0029】

（１５）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列が、配列番号１に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸からなる、（１４）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0030】

（１６）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のＤ１４１、Ｉ１４２、Ｅ１４３、Ｎ２１０、及びＹ３１１に相当するアミノ酸に少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する、（１５）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0031】

（１７）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＤ１４１Ａ及びＥ１４３Ａである、（１６）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0032】

（１８）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＩ１４２Ｒである、（１６）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0033】

（１９）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＮ２１０Ｄである、（１６）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0034】

（２０）３’−５'エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列の改変がＹ３１１Ｆである、（１６）に記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0035】

（２１）前記改変型ＤＮＡポリメラーゼがＨ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄのアミノ酸置換を更に含む、（１）から（２０）のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0036】

（２２）パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のＤＮＡポリメラーゼが、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ、サーモコッカス・コダカラエンシス、サーモコッカス・ゴルゴナリウス、サーモコッカス・リトラリス、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１、サーモコッカス・セラー、又はサーモコッカス・シクリ由来のＤＮＡポリメラーゼである、（１）〜（２１）のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0037】

（２３）野生型が配列番号１〜１０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）に属するＤＮＡポリメラーゼである、（１）〜（２２）のいずれかに記載の改変型ＤＮＡポリメラーゼ。

【0038】

（２４）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う方法。

【0039】

（２５）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して、イノシンを含んだプライマーで核酸増幅反応を行う方法。

【0040】

（２６）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して、バイサルファイト処理したＤＮＡから核酸増幅反応を行う方法。

【0041】

（２７）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを使用して増幅した核酸を、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いて分解する方法。

【0042】

（２８）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを含む、核酸増幅反応を行うための試薬。

【0043】

（２９）（１）〜（２３）のいずれかに記載のポリメラーゼを含む、核酸増幅反応を行うための試薬を含むキット。

【発明の効果】

【0044】

本発明によって、ｄＵＴＰによって阻害されないＤＮＡポリメラーゼを提供することでき、熱サイクルの時間が長い長鎖ターゲットのＰＣＲや多サイクルを回して行う微量テンプレートからのＰＣＲにおいても高い増幅効率を発揮することができる。正確性、熱安定性が高く、反応系に持ち込まれる阻害物質に強いといった利点をもつファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの特徴と合わせて、非常に高感度な検出系に応用することができる。高感度であり、正確性が高いことから一分子からの増幅を行うエマルジョンＰＣＲや、ブリッジＰＣＲ、またそれらの技術をもとに行う次世代のシークエンス技術にも応用できる。また、コンタミネーション（キャリーオーバー）した増幅産物を分解する方法であるｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法を利用できるようになることから、同じターゲットを増幅することが多い診断用途でも擬陽性のない正確な結果を出すことができる。本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、研究分野を始め、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等において広く利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】ウラシルの結合に関するアミノ酸領域を示す図である。

【図2】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に関するアミノ酸領域を示す図である。

【図3】ｄＵＴＰの感受性を調べるため、反応系にｄＵＴＰを添加して行ったＰＣＲ増幅を示す図である。

【図4】ｄＵＴＰの感受性を調べるため、反応系にｄＵＴＰを添加して行ったＰＣＲ増幅を示す図である。

【図5】１００％ｄＵＴＰ存在下で４８２ｂｐのＰＣＲ増幅を示す図である。

【図6】図５におけるＰＣＲ増幅量を電気泳動のピーク面積で示す図である。

【図7】１００％ｄＵＴＰ存在下で４８２ｂｐのＰＣＲ増幅を示す図である。

【図8】図７におけるＰＣＲ増幅量を電気泳動のピーク面積で示す図である。

【図9】１００％ｄＵＴＰ存在下で長鎖長のＰＣＲ増幅を示す図である。

【図10】１００％ｄＵＴＰ存在下で長鎖長のＰＣＲ増幅を示す図である。

【図11】イノシンを含んだプライマーを用いて行ったＰＣＲ増幅を示す図である。

【図12】バイサルファイト処理したＤＮＡを用いて行ったＰＣＲ増幅を示す図である。

【図13】ｄＵＴＰ存在下で増幅したＰＣＲ産物のＵＮＧによる分解を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼに関する。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼはその酵素分子内にポリメラーゼ領域と３‘−５‘エキソヌクレアーゼ（エキソ）領域を保持していため、間違った塩基を連結してしまった場合には、エキソ領域で誤った塩基を除去し、校正することができる。そのため、複製の正確性が高いという特徴を持つ。

【0047】

本発明におけるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＰｏｌ Ｉ型又はＰｏｌ ＩＩ型のいずれかに属する。本発明においては、好ましくはＰｏｌ Ｉ型に属するＤＮＡポリメラーゼである。ファミリーＢのＰｏｌ Ｉ型に属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属およびサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｒｉｏｓｕｓ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ、Ｐｒｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏｅｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｉｉ、Ｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｓｓｕ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＪＤＦ−３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅ Ｎｏｒｔｈ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．９°Ｎ−７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ ｓｐ．ＫＳ−１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｓｕ ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）などがある。

【0048】

本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）を有している。ウラシルの結合に関するアミノ酸配列とは、ｄＵＴＰを認識する部位に関与するアミノ酸配列のことであり、古細菌に属するＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰが存在すると伸長反応を停止するという特徴を持つ。

【0049】

ウラシルはシトシンの熱分解により生じ、ウラシルはアラニンと対合するので，シトシン→ウラシルの変化は突然変異の原因となる。古細菌は好熱菌より高温で生育するため防護機構として、ＤＮＡポリメラーゼにこのような機能が付加されたことが考えられる。ウラシルの産出は、ＰＣＲの熱サイクルでも生じる。このウラシルの影響を受け、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲでその高い増幅効率を十分に発揮できていなかった。

【0050】

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。図１は配列番号１〜１０の配列におけるウラシルの結合に関するアミノ酸配列の比較を示す。本発明は図１に具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。

【0051】

これらの配列の中でもより好ましくは、結晶構造解析等のデータからウラシルと相互作用に直接関連していると考えられる、７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸をいう。なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。

【0052】

本発明は、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０からなるウラシルの結合に関するアミノ酸配列において、少なくとも２つのアミノ酸の改変を有する。より好ましくは、７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸において、少なくとも２つのアミノ酸の改変を有する。アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、欠失又は付加からなる。

【0053】

本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、より好ましくは配列番号１におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、またはＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも２つのアミノ酸の改変を有する。ここで、例えばＹ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。ここで、例えばＹ７Ａとは、７番目のアミノ酸のチロシン（Ｙ）がアラニン（Ａ）に置換されていることを意味しており、以下同様である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもち極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。

【0054】

より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９２Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも２つのアミノ酸の改変である。特に好ましくは、Ｐ３６Ｈ／Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｋ／Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｒ／Ｙ７Ａ、Ｖ９３Ｑ／Ｙ７Ａ、Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ、Ｖ９３Ｒ／Ｙ７Ａ、またはＰ３６Ｈ/Ｖ９３Ｋの組み合わせであるアミノ酸の改変である。

【0055】

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列の改変を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較して、ウラシルの感受性が低いことを特徴とする。ウラシルの感受性が低いとは、ｄＵＴＰの存在下でもファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されていることをいう。

【0056】

本発明におけるウラシル感受性はＰＣＲによって評価できる。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、鋳型となるＤＮＡ、および評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ〜２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの感受性を評価することが出来る。ウラシル感受性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。またウラシル感受性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによる遺伝子増幅が確認できる。

【0057】

本発明におけるウラシル感受性が低い改変型ＤＮＡポリメラーゼとは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、および鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。

【0058】

具体的には、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号２５及び２６に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することでウラシル感受性が評価できる。

【0059】

本発明の改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含む。３‘−５’エキソアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。図２は配列番号１〜１０の配列における３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域に関するアミノ酸配列の比較を示す。本発明は図２に具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１〜１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、図２に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。

【0060】

なお、「配列番号１に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。

【0061】

上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号１における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。より好ましくは、配列番号１における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものである。より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。さらにＨ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つであるエキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼであることも好ましい。なお、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。３‘−５’エキソヌクレアーゼＤＮＡポリメラーゼを生成し、解析するために使用される方法は、特許文献３などに開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。解析するための方法は、特許第３８９１３３０号に記載されている。

【0062】

これらの改変された酵素を製造する方法としては、従来の公知の方法が使用できる。例えば、野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、タンパク質工学的手法により新たな機能を有する変異型（改変型）ＤＮＡポリメラーゼを製造する方法がある。

【0063】

アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。

【0064】

上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。

【0065】

上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。

【0066】

本発明はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法およびサイクルシーケンス法を含む。

【0067】

本発明の改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは核酸増幅用試薬の態様で提供されることがある。核酸増幅用試薬の一例としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、及び上記のような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含み、さらに具体的には、一方のプライマーが他方のプライマーＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオン、ＢＳＡ、上述のような非イオン界面活性剤及び緩衝液を含む。

【0068】

核酸増幅用試薬の別の態様としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ及び上述したような本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、２価イオン、１価イオン、緩衝液、及び必要に応じて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を含む核酸増幅用試薬がある。該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本核酸増幅用試薬は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。

【0069】

本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼを用いた応用分野として、例として下記の分野に利用することができる。

【0070】

イノシン（ｄＩＴＰ）を含むプライマーを用いたＰＣＲ：
既知のアミノ酸配列からその遺伝子をクローニングする手法として、縮重プライマーを用いたＰＣＲ法が用いられる。縮重プライマーを用いたＰＣＲ法では、縮重プライマーの組み合わせ数を減らすため、イノシン（ｄＩＴＰ）を用いたプライマーが利用されることが多い。イノシンはどの塩基とも相補対とならず、二本鎖形成の阻害もしないため、アミノ酸に対する複数種類のコドンを網羅的に増幅することができる。ところが、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属又はサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属由来の野生型のＤＮＡポリメラーゼでは、イノシンを含むプライマーを使用すると、反応性が著しく低下するという問題がある。しかしながら、本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼは、イノシンを含むプライマーでも高い増幅効率が見られ、正確性もあることから、本発明はイノシンを含むプライマーを用いたＰＣＲに有用である。

【0071】

バイサルファイト処理をしたＤＮＡの増幅反応：
ＤＮＡメチル化解析の手法として、ゲノムＤＮＡにバイサルファイト（亜硫酸水素）処理を行い、メチル化の有無やポジションを解析できるバイサルファイト・シーケンス法（ＢＳＰ法）や、メチル化および非メチル化されている塩基を特異的にＰＣＲ増幅してメチル化の様子を解析するメチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ法）がある。ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を行うと、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは変換されない。そこでバイサルファイト処理の前後で生じるシトシンとチミン（ウラシル）の差異を元に、メチル化の解析を行うことが出来る。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼはウラシルを含むＤＮＡを効率的に増幅することが出来るため、バイサルファイト処理をしたＤＮＡの増幅反応、およびメチル化解析の手法に有用である。

【0072】

ｄＵＴＰ／ＵＮＧコンタミネーション除去法への利用：
ＰＣＲのキャリーオーバーの防止のため、ＰＣＲに際し、ウラシル（ｄＵＴＰ）を取り込ませてＰＣＲ反応を行い、次のＰＣＲ反応を行う前に、夾雜ＰＣＲ産物をウラシル−ＤＮＡ グリコシラーゼ（ＵＮＧ）により分解させることにより、キャリーオーバーを防ぐｄＵＴＰ／ＵＮＧコンタミネーション除去法が用いられる。ＵＮＧは一本鎖あるいは二本鎖ＤＮＡのウラシル−グリコシド結合を分解し，ウラシルの削除とＤＮＡ内にアルカリ感受性無塩基部位を生成する。本発明の改変型ＤＮＡポリメラーゼはウラシルを含むＤＮＡを効率的に増幅することが出来るため、ｄＵＴＰ／ＵＮＧコンタミネーション除去法に有用である。
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ

【実施例】

【0073】

（実施例１）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した。

【0074】

変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１１）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。変異作製用プライマーとしては、配列番号１３及び１４に記載されるプライマーを使用した。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例２）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ）の作製
実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する３ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍｌの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ）を得た。

【0075】

上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は以下の操作で行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
（試薬）
Ａ液： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ液： １．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液： １ｍｇ／ｍｌ仔牛胸腺ＤＮＡ
（方法）
Ａ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ及び滅菌水１０μｌをマイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後冷却し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）を用いて計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分当り１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
（実施例３）
ＫＯＤ Ｐ３６Ｈの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｈ（配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｈ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１５および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ３６Ｈ）を得た。
（実施例４）
ＫＯＤ Ｐ３６Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｋ（配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１６および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ３６Ｋ）を得た。
（実施例５）
ＫＯＤ Ｐ３６Ｒの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｒ（配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｒ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１７および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ３６Ｒ）を得た。
（実施例６）
ＫＯＤ Ｖ９３Ｑの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｑ（配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＣＡＧに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｑ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１９および２０に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｖ９３Ｑ）を得た。
（実施例７）
ＫＯＤ Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１９および２１に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例８）
ＫＯＤ Ｖ９３Ｒの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｒ（配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＣＧＴに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｖ９３Ｒ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号１９および２２に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｖ９３Ｒ）を得た。
（実施例９）
ＫＯＤ Ｐ１１５Δの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ１１５Δ（配列番号１１の３４３〜３４５番目のＣＣＣを欠損した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ１１５Δ）。鋳型にはｐＫＯＤ、変異作製用プライマーとしては配列番号２３および２５に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ１１５Δ）を得た。
（実施例１０）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）。鋳型には（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ）、変異作製用プライマーとしては配列番号１５および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）を得た。
（実施例１１）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号１６および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｋ）を得た。
（実施例１２）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号１７および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ）を得た。
（実施例１３）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号１９および２１に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例１４）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の３４３〜３４５番目のＣＣＣを欠損した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号２３および２４に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ１１５Δ）を得た。
（実施例１５）
ＫＯＤ Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｖ９３Ｋ、変異作製用プライマーとしては配列番号１５および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例１６）
ＫＯＤ Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＧＴに、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｖ９３Ｋ、変異作製用プライマーとしては配列番号１７および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例１７）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＡＣに、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、変異作製用プライマーとしては配列番号１５および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例１８）
ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１１の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１１の１０６〜１０８番目のＣＣＣをＣＧＴ、配列番号１１の２７７〜２７９番目のＧＴＣをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、変異作製用プライマーとしては配列番号１７および１８に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例１９）
ＫＯＤ Ｎ２１０Ｄ変異体の作製
ＫＯＤ Ｎ２１０Ｄは野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））改変型ＤＮＡポリメラーゼである。実施例１〜１８と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｎ２１０Ｄに様々な変異を挿入した。ｐＫＯＤ Ｎ２１０Ｄは配列番号１１の６２８〜６３０番目のＡＡＣをＧＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第３４８７３９４号に記載の配列である。更に実施例２同様の精製方法にて、それぞれ改変型ＤＮＡポリメラ−ゼを精製した。
（実施例２０）
ＫＯＤ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ変異体の作製
ＫＯＤ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａは野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））改変型ＤＮＡポリメラーゼである。実施例１〜１８と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａに様々な変異を挿入した。ｐＫＯＤ Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａは配列番号１１の４２１〜４２３番目のＧＡＣをＧＣＣに、４２７〜４２９番目のＧＡＡをＧＣＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、更に実施例２同様の精製方法にてそれぞれ改変型ＤＮＡポリメラ−ゼを精製した。
（実施例２１）
ＫＯＤ Ｉ１４２Ｒ変異体の作製
ＫＯＤ Ｉ１４２Ｒは野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変を含み、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））改変型ＤＮＡポリメラーゼである。実施例１〜１８と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｉ１４２Ｒに様々な変異を挿入した。ｐＫＯＤ Ｉ１４２Ｒは配列番号１１の４２４〜４２６番目のＡＴＴをＣＧＴに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第３４８７３９４号に記載の配列である。更に実施例２同様の精製方法にてそれぞれ改変型ＤＮＡポリメラ−ゼを精製した。
（実施例２２）
ＫＯＤ Ｈ１４７Ｅ変異体の作製
ＫＯＤ Ｈ１４７Ｅは野生型ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域に改変を含むが、３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性を維持した改変型ＤＮＡポリメラーゼである。実施例１〜１８と同様の方法にて、ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅに様々な変異を挿入した。ｐＫＯＤ Ｈ１４７Ｅは配列番号１１の４３９〜４４２番目のＣＡＴをＧＡＧに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミドであり、特許第３８９１３３０号に記載の配列である。さらに実施例２同様の精製方法にてそれぞれ改変型ＤＮＡポリメラ−ゼを精製した。
（実施例２３）
Ｐｆｕ Ｙ７Ａの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ（配列番号１２の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ）。鋳型にはｐＰｆｕ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに配列番号１２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングしたプラスミド、変異作製用プライマーとしては配列番号３２および３３に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｙ７Ａ）を得た。
（実施例２４）
Ｐｆｕ Ｐ３６Ｈの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｐ３６Ｈ（配列番号１２の１０６〜１０８番目のＣＣＡをＣＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｐ３６Ｈ）。鋳型にはｐＰｆｕ、変異作製用プライマーとしては配列番号３４および３５に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｐ３６Ｈ）を得た。
（実施例２５）
Ｐｆｕ Ｖ９３Ｒの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｖ９３Ｒ（配列番号１２の２７７〜２７９番目のＧＴＴをＣＧＴに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｖ９３Ｒ）。鋳型にはｐＰｆｕ、変異作製用プライマーとしては配列番号３６および３７に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｖ９３Ｒ）を得た。
（実施例２６）
Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ（配列番号１２の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１２の１０６〜１０８番目のＣＣＡをＣＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）。鋳型にはｐＰｆｕ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号３４および３５に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）を得た。
（実施例２７）
Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ（配列番号１２の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１２の２７７〜２７９番目のＧＴＴをＡＡＡに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＰｆｕ Ｙ７Ａ、変異作製用プライマーとしては配列番号３６および３７に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例２８）
Ｐｆｕ Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ(配列番号１２の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１２の１０６〜１０８番目のＣＣＡをＣＡＣに、配列番号１２の６２８〜６３０番目のＡＡＴをＧＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｎ２１０／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）。鋳型にはｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、変異作製用プライマーとしては配列番号３８および３９に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）を得た。
（実施例２９）
Ｐｆｕ Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの作製
実施例２と同様の方法にて、ｐＰｆｕ Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ(配列番号１２の１９〜２１番目のＴＡＣをＧＣＣに、配列番号１２の２７７〜２７９番目のＧＴＴをＡＡＡに、配列番号１２の６２８〜６３０番目のＡＡＴをＧＡＣに置換した改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を持つプラスミド）を作製した（ｐＰｆｕ Ｎ２１０／Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）。鋳型にはｐＰｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、変異作製用プライマーとしては配列番号３８および３９に記載のプライマーを使用した。更に実施例２同様の精製方法にて改変型耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）を得た。
（実施例３０）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのウラシルの感受性の評価
ウラシルの感受性は、以下のようにＰＣＲを行い測定した。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２(Ｔｏｙｏｂｏ社製)添付のものを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号２５及び２６に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ社製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加した。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて行った。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認した。

【0076】

結果、サーモコッカス・コダカラエンシス（ＫＯＤ）の野生型のＤＮＡポリメラーゼでは０．５μＭのｄＵＴＰの添加で阻害がかかり、ＰＣＲ産物が確認できないところ、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒのウラシル結合ポケットへの変異体では、多少のｄＵＴＰを添加してもＰＣＲ産物の確認が出来た。またＰ３６ＫとＰ３６Ｋ／Ｙ７Ａを比較すると、単変異に比べ２重変異を入れたものの方が、高濃度のｄＵＴＰ添加に寛容で、増幅量が多い結果となった（図３、図４）。

【0077】

ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈの多重変異体を比較し、多重変異体の方が、増幅量が多いといった同様の結果が得られた。

【0078】

また、ＫＯＤポリメラーゼにおいて野生型のＤＮＡポリメラーゼに比べ、エキソ（−）の変異体であるＮ２１０ＤやＤ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒの変異体はｄＵＴＰへの感受性が弱く、エキソ（−）の変異体に加え、Ｙ７ＡやＰ３６位やＶ９３位への変異を施すとさらにｄＵＴＰへの感受性が弱まることが確認された（図４）。これは、ＤＮＡポリメラーゼがｄＵＴＰをＤＮＡに取り込んだ際、野生型は校正機能が働き３‘−５’エキソヌクレアーゼを用い、ｄＵＴＰを切断してしまうのに対し、エキソ（−）の変異体では、ｄＵＴＰを切断できないため、そのまま伸長を進めることが可能なためだと考えられる。そのため、ウラシル結合ポケットへの変異に加え、エキソ活性を欠損させる改変を行うとｄＵＴＰの含まれるＰＣＲにおいて、増幅量が向上することが示唆される（図７、８）。
（実施例３１）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅量の評価
ＰＣＲにおいてｄＴＴＰとｄＵＴＰでの増幅の違いを、Ｈｕｍａｎ β−グロビンの４８２ｂｐを増幅することで比較し、ｄＵＴＰへの感受性を調べた。この際、各酵素は、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したものを用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、４８１ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号２７及び２８に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、通常のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭ添加したものと、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を０．２ｍＭになるよう添加したものをそれぞれ用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、ＭｕｌｉｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１０００キットに供し増幅ＤＮＡ断片を確認した。

【0079】

結果、Ｙ７Ａの変異体単体ではＰＣＲ増幅が出来なかったが、Ｖ９３ＫやＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒと組み合わせることでＰＣＲ増幅が可能になった。中でも、Ｖ９３Ｋに比べＶ９３Ｋ／Ｙ７Ａとの組み合わせでは大幅に増幅量が向上することが示された（図５、図６）。

【0080】

また、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３Ｋ／Ｙ７ＡやＰ３６Ｈなどの変異を施したものとエキソ（−）の変異体であるＮ２１０Ｄの変異体に、Ｖ９３Ｋ／Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈなどの変異を施したものを比較するとエキソ（−）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が増幅量が多い結果となり、エキソ（−）へ変異を入れたものではｄＵＴＰとｄＴＴＰで増幅量の差がほとんど見られなかった。ウラシル結合ポケットへの変異に加え、エキソ領域への変異を入れるとｄＵＴＰの感受性が減少し、増幅量が向上することが示唆される（図７、図８）。

【0081】

ＰｆｕにおいてもＮ２１０Ｄの変異体にＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異をいれ、同様の結果が得られた。
（実施例３２）
改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた長鎖ＤＮＡ増幅の評価
ｄＵＴＰを含むＰＣＲにおいてＨｕｍａｎ β−グロビンの１．３ｋｂｐおよび、２．８ｋｂｐ、３．６ｋｂｐの増幅を比較した。この際、各酵素は、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したものを用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（１．３ｋｂｐの増幅では配列番号２５及び２６、２．８ｋｂｐの増幅では配列番号２６および２９、３．６ｋｂｐの増幅では配列番号３０および３１）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では1分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行った。またコントロールとして、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼでの増幅も行った。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはＴｏｙｏｂｏ社製のものを用い、Ａｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）と混合したものを用いた。反応は１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１ｋｂｐあたり約１分（１．３ｋｂｐの増幅では１分３０秒、２．８ｋｂｐの増幅では３分、３．６ｋｂｐの増幅では４分）を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）にてＰＣＲを行った。それぞれ反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。

【0082】

Ｖ９３ＫとＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、またＰ３６ＨとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６ＲとＹ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６ＨやＶ９３ＫとＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋの増幅量を比較した結果、Ｖ９３Ｋの変異より、P３６位への変異の方が増幅量が多く、長いターゲットまで増幅できることが確認された。また、単変異のものよりウラシル結合ポケットへ二重変異入れたものの方が、増幅量が多くなった。これらの変異体はＴａｑでは増幅できないような長鎖長を増幅することが可能となっていた（図９）。また、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３ＫやＰ３６Ｈなどの変異を施したものとエキソ（−）の変異体であるＮ２１０Ｄ、Ｉ１４２Ｒ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａの変異体に、Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈなどの変異を施したものを比較するとエキソ（−）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果となった（図１０）。さらに、野生型のＤＮＡポリメラーゼにＶ９３ＫやＰ３６Ｈなどの変異を施したものとＰＣＲ効率が向上する変異体であるＨ１４７ＥにＶ９３Ｋ、Ｐ３６Ｈなどの変異を施したものを比較すると、Ｈ１４７Ｅ変異体の方が多い増幅量を示された。これはＨ１４７Ｅの改変の効果がウラシル結合ポケットへの改変とは独立しており、Ｈ１４７Ｅの改変による効果により増幅量が増えたことが考えられる。

【0083】

実施例３０〜３２の結果を表１に示す。表１において、ｄＵＴＰ耐性における１１段階評価は、０に近いほどｄＵＴＰに対する感受性が強く、１０に近いほどｄＵＴＰに対する感受性が低いことを表す。また表１中、○は十分に増幅した、△はある程度増幅した、×は増幅しないことを表している。

【0084】

【表1】

【0085】

ＰｆｕにおいてもＹ７ＡとＰ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋの単変異体とＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの多重変異体を比較し、多重変異体の方増幅量が多いといった同様の結果が得られた。

【0086】

また、野生型のＤＮＡポリメラーゼのウラシル結合ポケットに変異を施したものとエキソ（−）の変異体Ｎ２１０Ｄのウラシル結合ポケットに変異を施したものでは、エキソ（−）のＤＮＡポリメラーゼに変異を施した方が、増幅量が多い結果になった。ＰｆｕにおいてもＮ２１０Ｄの変異体にＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋの変異をいれ、同様の結果が得られた。
（実施例３３）
イノシンが含まれたプライマーを用いた増幅比較
イノシンが含まれたプライマーを用いて、ＰＣＲでの増幅の違いを比較した。比較には、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ変異体とＫＯＤ（野生型）、抗体を混合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用いた。ＫＯＤ変異体とＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ₄、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、７５ｐｍｏｌおよび１５０ｐｍｏｌのプライマー（配列番号４０および４１）、１００ｎｇのＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ＤＮＡ、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→５４℃、１０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、７５ｐｍｏｌおよび１５０ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、１００ｎｇのＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ＤＮＡ、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→５４℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、ＭｕｌｉｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１０００キットに供し増幅ＤＮＡ断片を確認した。

【0087】

結果、ＫＯＤ（野生型）はイノシンを含んだプライマーから増幅することはできず、ＫＯＤ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼからはしっかりとした増幅が確認された（図１１）。このことから、ウラシル感受性が低い変異体はイノシンにも感受性が低いことがわかる。ＫＯＤはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼより正確性が高いため、増幅産物にエラーが入ることなく増幅が可能となる。クローニングにおいて、正確性が高いことは非常に重要であり、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼよりＫＯＤ変異体の方が優位だと考えられる。またＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは１５０ｐｍｏｌのプライマーを添加しないと増幅が見られないところ、ＫＯＤ変異体では７５ｐｍｏｌの添加で増幅が見られ、ＫＯＤ変異体の方が、増幅効率が良いことが示される。
（実施例３４）
バイサルファイト処理したＤＮＡの増幅比較
バイサルファイト処理したＤＮＡを鋳型に、様々なプライマーでＰＣＲの増幅の違いを比較した。比較には、１Ｕあたり１μｇのＫＯＤ抗体と混合したＫＯＤ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）とＫＯＤ（野生型）、抗体を混合したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）とＡｎｔｉ−Ｔａｑ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を等量混合したもの）を用いた。バイサルファイト処理したＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔで処理したものを用いた。ＫＯＤ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ）とＫＯＤのＰＣＲは、ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のＢｕｆｆｅｒ、ＭｇＳＯ₄、ｄＮＴＰｓを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（ＭＩＮＴ１の増幅では配列番号４２及び４３、ＲＡＲの増幅では配列番号４４および４５、ＴＨＢＳ１の増幅では配列番号４６および４７、ＭＩＮＴ３１の増幅では配列番号４８および４９）、バイサルファイト処理したＤＮＡ抽出液１μｌ、抗体と混合した１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→５５℃、１５秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲは、１×ＢｌｅｎｄＴａｑに添付のＢｕｆｆｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ製品）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（上記と同様）、バイサルファイト処理したＤＮＡ抽出液１μｌ、抗体と混合した２．５Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を、９４℃、２分の前反応の後、９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→６８℃、１分を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、ＭｕｌｉｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１０００キットに供し増幅ＤＮＡ断片を確認した。

【0088】

結果、ＫＯＤ（野生型）はバイサルファイト処理したＤＮＡから増幅することはできず、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼからはしっかりとした増幅が確認された（図１２）。ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体と同様の方法でＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ変異体やＫＯＤ Ｎ２１０Ｄ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ変異体、Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ変異体でも同様の結果が得られている。このことから、ウラシル感受性が低い変異体はテンプレートにウラシルが含まれていても増幅ができることがわかり、バイサルファイト処理したＤＮＡからでも増幅ができることがわかった。
（実施例３５）
ｄＵＴＰ存在下で増幅したＤＮＡのＵＮＧによる分解確認
ウラシル感受性を弱めたＫＯＤ変異体（Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）を用いてｄＵＴＰを含むＰＣＲで増幅したＨｕｍａｎ β−グロビンの０．７ｋｂｐを、ＵＮＧと反応させることで分解できるかを確認した。ＰＣＲにはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付のものを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、２ｍＭ ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換したｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、１５ｐｍｏｌのプライマー（配列番号５０及び５１）、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）、抗体と混合した１Ｕの酵素を含む５０μｌの反応液を用いた。９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、３０秒→６８℃、１分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行った。その増幅産物を、上記１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒで１０ｎｇ／μｌに希釈し、希釈した増幅産物８μｌと様々な濃度のＵＮＧ（Ｒｏｃｈｅ社製）２μｌを混合し、３７℃、１０分反応させた。反応終了後、ＭｕｌｉｔｉＮＡ（島津製作所社製）のＤＮＡ−１０００キットに供し増幅産物の量を確認した。

【0089】

結果、０．２５ＵのＵＮＧで８０ｎｇのＤＮＡが完全に分解されたことが確認できた。このことからウラシル感受性を弱めたＫＯＤ変異体（Ｎ２１０Ｄ／Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）で増幅したＤＮＡでも、ＵＮＧを反応させることで分解できることが示された。他の変異体（ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｐｆｕ Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、ＫＯＤ Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ）で増幅したＤＮＡにおいても、上記と同様の方法で、ＵＮＧにより分解できたという同様の結果が得られている。

【産業上の利用可能性】

【0090】

本発明により、ファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの増幅効率を十分発揮することが可能となる。また、ファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼを用いてｄＵＴＰ／ＵＮＧコンタミネーション除去法を利用することができる。ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの高い正確性や共雑物に強い性能は、研究分野での応用を始め、遺伝子診断などの法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]