特許 6906812 テバインが増加したポピーおよびおよびその生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6906812

(24)【登録日】2021年7月2日

(45)【発行日】2021年7月21日

(54)【発明の名称】テバインが増加したポピーおよびおよびその生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20210708BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20210708BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20210708BHJP

   A01H 6/64 20180101ALI20210708BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210708BHJP

   C12P 17/18 20060101ALI20210708BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 ZZNA

   C12N15/82 Z

   A01H1/00 A

   A01H6/64

   C12N5/10

   C12P17/18 A

【請求項の数】19

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2019-521398(P2019-521398)

(86)(22)【出願日】2017年8月11日

(65)【公表番号】特表2019-528084(P2019-528084A)

(43)【公表日】2019年10月10日

(86)【国際出願番号】CA2017050951

(87)【国際公開番号】WO2018027324

(87)【国際公開日】20180215

【審査請求日】2019年4月19日

(31)【優先権主張番号】62/374,682

(32)【優先日】2016年8月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】2,941,315

(32)【優先日】2016年9月7日

(33)【優先権主張国】CA

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】519049101

【氏名又は名称】エー・ピー・アイ ラブズ インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＰＩ ＬＡＢＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002147

【氏名又は名称】特許業務法人酒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コワルチュク，イゴール

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２８６５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０９００６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１０９０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nat. Chem. Biol.，２０１０年，Vol. 6，p. 273-275

【文献】 Nat. Biotechnol.，２００４年，Vol. 22，p. 1559-1566

【文献】 Plant Biotechnol. J.，２００８年，Vol. 6，p. 22-30

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ａ０１Ｈ １／００ − １／０８

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｐ １７／１８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケシ（ｏｐｉｕｍ ｐｏｐｐｙ）植物またはその植物細胞にてテバインの蓄積を増やす方法であって、前記方法が、前記植物または植物細胞のゲノムを遺伝的に改変して、前記植物または植物細胞にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の活性を同時に低下させるヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子を含むようにすることを含み、前記核酸分子が、配列番号７を含む、上記方法。

【請求項2】

Ｔ６ＯＤＭが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＣＯＤＭが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

Ｔ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの前記活性を同時に低下させることが、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

Ｔ６ＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号１５の配列を含むｍＲＮＡをコードする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ＣＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号１６の配列を含むｍＲＮＡをコードする、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

野生型植物または植物細胞と比べてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の低下した活性を有する遺伝子改変したケシ植物またはその植物細胞の遺伝子が、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子及びＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子を含み、前記核酸分子が、配列番号７を含む、前記ケシ植物または植物細胞。

【請求項8】

Ｔ６ＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号１５の配列を含むｍＲＮＡをコードする、請求項７に記載の植物または植物細胞。

【請求項9】

Ｔ６ＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号１の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項７または８に記載の植物または植物細胞。

【請求項10】

ＣＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号１６の配列を含むｍＲＮＡをコードする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。

【請求項11】

ＣＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子が、配列番号３の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の植物または植物細胞。

【請求項12】

テバイン含量が増加したケシ植物またはその植物細胞を生産する方法であって、
前記方法が、
（ａ）前記植物または植物細胞にて内在性のテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること；および
（ｂ）前記植物または植物細胞にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を減少させること
を含み、
Ｔ６ＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子及びＣＯＤＭをコードする前記内在性遺伝子の前記発現を減少させることが、前記植物または植物細胞のゲノムを遺伝的に改変して、前記植物または植物細胞にてＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの活性を同時に低下させるヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子を含むようにすることを含み、前記核酸分子が、配列番号７を含む、
上記方法。

【請求項13】

前記Ｔ６ＯＤＭが配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつ前記ＣＯＤＭが配列番号３に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

テバインを生産する方法であって、前記方法が、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の植物またはその植物細胞から回収される乳状液またはケシ殻からテバインを単離することを含む、上記方法。

【請求項15】

単離された核酸分子であって、配列番号７の配列を含むポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドに操作可能に連結される異種プロモーターを含む、前記核酸分子。

【請求項16】

ケシ植物またはその植物細胞にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための発現ベクターであって、前記発現ベクターが請求項１５に記載の単離された核酸を含む、前記発現ベクター。

【請求項17】

ケシ植物またはその植物細胞にて安定な遺伝子改変を生成して、ケシ植物または植物細胞にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための、配列番号７を含む配列を有するポリヌクレオチド分子の使用。

【請求項18】

テバインの生産のための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の植物または植物細胞の使用。

【請求項19】

請求項７〜１１のいずれか一項に記載の植物または植物細胞に由来するケシ殻。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は高レベルのテバインを有するケシ（ｏｐｉｕｍ ｐｏｐｐｙ）の生産に関する。さらに詳しくは、本開示は、テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の発現／活性を同時に低下させることによって高レベルのテバインを有するケシの生産に関する。

【背景技術】

【0002】

オピオイドはケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）またはその合成類似体に由来する精神活性物質である。オピオイドは、オピオイドを服用する強い欲求、オピオイド使用に対する制御の損傷、有害な結果にもかかわらず持続するオピオイド使用、他の活動および義務に勝るオピオイド使用のより高い優先性、耐性の増大およびオピオイドを中止した際の身体的な離脱反応を特徴とする物質依存性を引き起こす可能性を有する。２０１４年時点では、オピオイド依存性（すなわち、オピオイド中毒）を患った推定１７００万人の人々がいた。オピオイド依存性の人々の大半は不正に栽培され、製造されたヘロインを使用する。その薬理学的な効果のせいで、高用量のオピオイドは呼吸抑制および死亡の原因となり得る。２０１４年時点では、世界中で毎年６９０００人がオピオイドの過剰用量で死亡している。

【0003】

世界薬物報告２０１６では、国連薬物犯罪オフィスはアヘン生産の最近の減少がそれまで数年間の高レベルのアヘン生産があった世界中のヘロイン市場での主要な不足に繋がっていないことを指摘した。従って、ヘロイン市場で反響が感じられるにはアヘン生産での持続した減少の時間がかかり得る。その分野にて精神活性のあるアルカロイドの生産に必要なポピー（ｐｏｐｐｙ）植物遺伝子を遮断することによってアヘン生産を崩壊させる方法を有することが望ましい。

【0004】

たとえば、オキシコドン、ナロキソン、ナルトレキソン、ナルブフィンおよびナルメフェンのようなヒドロキシモルフィナンは、強力な鎮静剤および／または麻薬拮抗剤としてのその有用性のゆえに重要な鎮痛剤誘導体である。これら医薬剤の調製までの最も実践的な合成経路は出発物質としてアルカロイドであるテバインを使用する。たとえば、環Ｃ架橋した化合物であるブプレノルフィンおよびエトルフィンのような他の重要な鎮痛剤誘導体もテバインから最も実践的に調製される。

【0005】

残念ながら、テバインはその限定された可用性のせいで高価である。合成全体は困難であり、ポピー植物にてテバインは通常、ケシの全アルカロイドのたった０．５〜２％の低レベルにしか蓄積しない。図１を参照して、テバインは、モルヒネ生合成の分岐点に存在し、２つの競合酵素についての基質である。テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）はテバインをオリパビンに変換し、コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）はテバインをネオピノンに変換する。

【0006】

化学的突然変異誘発を介して導出されたＴＯＰ１バラエティを含む、モルヒネおよびコデインではなくテバインおよびオリパビンを蓄積するケシの突然変異体が報告されている（Ｍｉｌｌｇａｔｅ，ｅｔ ａｌ．２００４）。ＴＯＰ１における代謝阻害は、テバインおよびオリパビンの６−Ｏ−脱メチル化を触媒する酵素における欠損から生じると示唆されたが、表現型についての生化学的な基礎は決定されなかった。さらに、マイクロアレイを用いてＴＯＰ１にて過小発現される１０の遺伝子を特定したが、そのリストにはＯ−脱メチル化が理論的に可能である酵素は含まれなかった。ＴＯＰ１突然変異を含有する植物株はブタペスト条約のもと、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−９１１０のもとで２００８年３月２０日、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された。ＷＯ２００９／１０９０１２は、高レベルのテバインを蓄積するさらなる株を生産するＰＴＡ−９１１０と名付けられた株の突然変異誘発を開示しており、それはブタペスト条約のもと、ＡＴＣＣ特許寄託指定ＰＴＡ−９１０９のもとで２００８年３月２０日、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された。しかしながら、表現型についての生化学的な基礎は探索されなかった。

【0007】

研究者らは数年間、ケシを操作して選択したオピオイドを生産する分子アプローチを使用することに興味を持っていたが、結果は折りにふれ予想外であり、苛立たしかった。たとえば、Ａｌｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：１５５９−１５５６）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、モルヒネ生合成の最後から２番目の酵素であるコデイノン還元酵素（ＣＯＲ）をコードする遺伝子をサイレンシングした。ＣＯＲはコデイノンをコデインに変換する。しかしながら、コデイノンの蓄積を生じるのではなく、ＣＯＲ活性の排除はレチクリン、すなわち、ＣＯＲの前の７つの酵素工程の蓄積を生じた。レチクリンの驚くべき蓄積は、モルヒネ専用の分岐に入っていく一般的なベンジルイソキノリン合成からの中間体を妨害するフィードバック機構を示唆している。

【発明の概要】

【0008】

本開示は高レベルのテバインを有するケシ（ｏｐｉｕｍ ｐｏｐｐｙ）の生産に関する。さらに詳しくは、本開示はテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の発現／活性を同時に低下させることによって高レベルのテバインを有するケシの生産に関する。

【0009】

本開示の種々の態様は、ケシ植物にてテバインの蓄積を増やす方法に関するものであり、該方法は、ポピー（ｐｏｐｐｙ）植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の活性を同時に低下させるように植物を遺伝的に改変することを含む。野生型Ｔ６ＯＤＭは配列番号１のアミノ酸配列を有してもよい。野生型ＣＯＤＭは配列番号３のアミノ酸配列を有してもよい。

【0010】

ある場合には、Ｔ６ＯＤＭの活性を同時に低下させるように植物を遺伝的に改変することは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を減らすために発現構築物を導入することを含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させる発現構築物の配列は配列番号２または配列番号４の一部を含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭの活性を同時に低下させるように植物を遺伝的に改変することは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子に機能喪失突然変異を導入することを含む。

【0011】

ある場合には、ＣＯＤＭの活性を同時に低下させるように植物を遺伝的に改変することは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を減らすための発現構築物を導入することを含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の蓄積を低下させるための発現構築物の配列は配列番号２または配列番号４の一部を含む。ある場合には、ＣＯＤＭの活性を同時に低下させるように植物を遺伝的に改変することは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子に機能喪失突然変異を導入することを含む。

【0012】

本開示の種々の態様は、野生型植物に比べてテバインのレベルが増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの機能喪失対立遺伝子を有する第１の親を、コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの機能喪失対立遺伝子を有する第２の親と交配することと、テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の機能喪失対立遺伝子およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の機能喪失対立遺伝子の双方を有する子孫を自家受粉させてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の機能喪失変異対立遺伝子についてホモ接合型であり、かつコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素をコードする遺伝子の機能喪失対立遺伝子についてホモ接合型である植物を生産することとを含む。

【0013】

本開示の種々の態様は、テバイン含量が増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、植物にて内在性テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることと、植物にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとを含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を導入するまたは作製することを含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を導入するまたは作製することを含む。

【0014】

ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の一部に対して相同な第１の異種核酸分子を発現させることを含み、その際、第１の異種核酸分子はＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するまたは作製することを含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の一部に対して相同な第２の異種核酸分子を発現させることを含み、その際、第２の異種核酸分子はＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0015】

ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の一部に対して相同な異種核酸分子を発現させることを含み、その際、異種核酸分子はＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭの活性を低下させることはＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するまたは作製することを含む。

【0016】

ある場合には、機能喪失対立遺伝子は遺伝子における破壊または点突然変異を含む。破壊は欠失または挿入であってもよい。挿入は、Ｔ−ＤＮＡまたは転位因子であってもよい。

【0017】

ある場合には、第１の異種核酸分子がＲＮＡ干渉によってＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0018】

ある場合には、第２の異種核酸分子がＲＮＡ干渉によってＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0019】

ある場合には、異種核酸分子がＲＮＡ干渉によってＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0020】

ある場合には、異種核酸分子は配列番号２または配列番号４の一部を含む。ある場合には、異種核酸分子は配列番号７の一部を含む。ある場合には、異種核酸分子は配列番号８の一部を含む。

【0021】

ある場合には、Ｔ６ＯＤＭは配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、かつＣＯＤＭは配列番号３に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。

【0022】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べてテバイン含量が増加したケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を使用して、コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第１の植物を特定することと；（ｉｉ）前記第１の植物の、テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物との交配を確立することと、（ｉｉｉ）交配に由来する子孫を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方についてホモ接合型である植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0023】

ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物は分子法を用いて特定される。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子は第２の植物またはその祖先の遺伝子改変によって生成される。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物はＡＴＣＣ ＰＴＡ−９１１０として寄託されている株の植物である。

【0024】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べてテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第１の植物を特定することと、（ｉｉ）前記第１の植物の、コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物との交配を確立することと、（ｉｉｉ）交配に由来する子孫を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコード内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方についてホモ接合型である植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物は分子法を用いて特定される。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子は第２の植物またはその祖先の遺伝子改変によって生成される。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物はＡＴＣＣ ＰＴＡ−９１０９として寄託されている株の植物である。

【0025】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方についてホモ接合型である植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0026】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）遺伝子改変によって植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子を導入するように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方についてホモ接合型である植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0027】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子についてホモ接合型であり、かつＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させている植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子を標的とするヘアピンＲＮＡを発現させるための発現構築物を導入することを含む。

【0028】

本開示の種々の態様は、野生型のケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子についてホモ接合型であり、かつＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させている植物について自家受粉した植物に由来する子孫をスクリーニングすることとを含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子を標的とするヘアピンＲＮＡを発現させるための発現構築物を導入することを含む。

【0029】

ある場合には、分子法はゲノム中の標的化誘発局所的損傷（ＴＩＬＬＩＮＧ）の方法論を含む。

【0030】

本開示の種々の態様は上記に記載されているような方法にによって生産されるケシ植物に関する。

【0031】

本開示の種々の態様は、野生型の植物に比べてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の低下した活性を有する遺伝子改変したケシ植物またはケシ植物細胞に関するものであり、ケシ植物はＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭまたは双方の低下した発現を有するように遺伝子改変される。

【0032】

ある場合には、植物はＴ６ＯＤＭの発現を低下させるための第１の発現構築物とＣＯＤＭの発現を低下させるための第２の発現構築物とを含む。ある場合には、第１の発現構築物はＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第１のヘアピンＲＮＡをコードする第１の核酸分子を含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性の遺伝子は配列番号１５の配列を含み、有するｍＲＮＡをコードする。ある場合には、第１のヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子は配列番号２の一部を含む。

【0033】

ある場合には、第２の発現構築物はＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第２のヘアピンＲＮＡをコードする第２の核酸分子を含む。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性の遺伝子は配列番号１６の配列を含み、有するｍＲＮＡをコードする。ある場合には、第２のヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子は配列番号４の一部を含む。

【0034】

ある場合には、植物または植物細胞はＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの発現を低下させるための核酸分子を含む発現構築物を含む。ある場合には、核酸分子は、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるためのヘアピンＲＮＡをコードする。ある場合には、核酸分子は、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるためのヘアピンＲＮＡをコードする。ある場合には、核酸分子は、Ｔ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるのに十分な単一のヘアピンＲＮＡをコードする。ある場合には、核酸分子は配列番号２、配列番号４または双方の一部を含む。

【0035】

ある場合には、発現構築物は、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第１のヘアピンＲＮＡをコードする第１の核酸分子と、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための第２のヘアピンＲＮＡをコードする第２の核酸分子とを含む。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子は配列番号１５の配列を含み、有するｍＲＮＡをコードする。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子は配列番号１の配列を有するポリペプチドをコードする。ある場合には、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子は配列番号１６の配列を含み、有するｍＲＮＡをコードする。ある場合には、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子は配列番号３の配列を有するポリペプチドをコードする。ある場合には、第１の核酸分子および第２の核酸分子のそれぞれは、配列番号２、配列番号４、または双方の一部を含む。

【0036】

ある場合には、ヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子は配列番号８の一部を含む。ある場合には、ヘアピンＲＮＡをコードする核酸分子は配列番号７の一部を含む。

【0037】

ある場合には、第１の核酸分子は配列番号８の一部を含む。ある場合には、第１の核酸分子は配列番号７の一部を含む。

【0038】

ある場合には、第２の核酸分子は配列番号８の一部を含む。ある場合には、第２の核酸分子は配列番号７の一部を含む。

【0039】

ある場合には、植物または植物細胞は、Ｔ６ＯＤＭの低下した活性を有するように遺伝子改変され、ＣＯＤＭの低下した活性は植物または植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における突然変異によって付与される。ある場合には、植物または植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における突然変異は、特許寄託指定ＰＴＡ−９１０９のもとで寄託された植物の種子に存在する突然変異である。

【0040】

ある場合には、植物はＣＯＤＭの低下した活性を有するように遺伝子改変され、Ｔ６ＯＤＭの低下した活性は植物または植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における突然変異によって付与される。ある場合には、植物または植物細胞の遺伝子改変によって導入されなかったＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における突然変異は、特許寄託指定ＰＴＡ−９１０９のもとで寄託された植物の種子に存在する突然変異である。

【0041】

本開示の種々の態様は、６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の低下した発現を有する遺伝子改変したポピー植物またはポピー植物細胞に関するものであり、遺伝子改変した植物は、植物または植物細胞にてＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるトランスジェニック発現構築物と、植物または植物細胞にてＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるトランスジェニック発現構築物とを含む。

【0042】

本開示の種々の態様は上記に記載されているようなケシ植物の種子に関する。

【0043】

本開示の種々の態様はテバインの生産のための上記に記載されているような植物の使用に関する。

【0044】

本開示の種々の態様は上記に記載されているような植物に由来するケシ殻に関する。

【0045】

本開示の種々の態様は上記に定義されているような植物から単離された乳状液に関する。

【0046】

本開示の種々の態様はテバインを生産する方法に関するものであり、前記方法は、上記に記載されているような植物から回収される乳状液またはケシ殻からテバインを単離することを含む。

【0047】

本開示の種々の態様は単離された核酸分子に関するものであり、核酸分子の配列は配列番号７の一部を含む。

【0048】

本開示の種々の態様は、ケシ植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための発現ベクターに関するものであり、発現ベクターは配列番号７の一部を含む核酸分子を含む。

【0049】

本開示の種々の態様は、ケシ植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるために配列番号２または配列番号４の一部を含む配列を有するポリヌクレオチド分子の一部の使用に関する。

【0050】

本発明の他の態様および特徴は、添付の図面と併せて本発明の具体的な実施形態の以下の説明の評価の際に当業者に明らかになるであろう。

【0051】

本明細書で開示されている方法は、テバイン：モルヒネの増加した比率を有するポピー植物を生産するのに有用であってもよい。

【0052】

本開示の特定の態様はケシ植物またはケシ植物細胞にてテバインの蓄積を増やす方法に関するものであり、該方法は、１以上の安定な遺伝子改変を含んでポピー植物またはポピー植物細胞にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の活性を同時に低下させるように植物または植物細胞のゲノムを遺伝的に改変することを含む。

【0053】

本開示の特定の態様は、野生型の植物または植物細胞に比べてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の低下した活性を有する遺伝子改変したケシ植物またはケシ植物細胞に関するものであり、その際、遺伝子改変したケシ植物またはケシ植物細胞はＴ６ＯＤＭ、ＣＯＤＭまたは双方の発現を低下させるための１以上の安定な遺伝子改変を含む。

【0054】

本開示の特定の態様は、テバイン含量の増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）植物にて内在性のテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることと、（ｂ）植物にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとを含み、その際、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように植物を遺伝的に改変することを含む。

【0055】

本開示の特定の態様は、テバイン含量の増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）植物にて内在性のテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることと、（ｂ）植物にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとを含み、その際、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとは、Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の一部に相同性である異種核酸分子を発現させることを含み、異種核酸分子の発現がＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0056】

本開示の特定の態様は、テバイン含量の増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）植物にて内在性のテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることと、（ｂ）植物にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとを含み、その際、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有するように植物を遺伝的に改変することを含む。

【0057】

本開示の特定の態様は、テバイン含量の増加したケシ植物を生産する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）植物にて内在性のテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることと、（ｂ）植物にてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させることとを含み、その際、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させることは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の一部に相同性である異種核酸分子を発現させることを含み、異種核酸分子の発現がＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させる。

【0058】

本開示の特定の態様は、６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の低下した発現を有する遺伝子改変したポピー植物またはポピー植物細胞に関するものであり、該遺伝子改変した植物は、植物または植物細胞にてＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための安定して遺伝するトランスジェニック発現構築物と、植物または植物細胞にてＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を低下させるための安定して遺伝するトランスジェニック発現構築物とを含む。

【0059】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第１の植物を特定することと、（ｉｉ）前記第１の植物の、テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物との交配を確立することと、（ｉｉｉ）交配に由来する子孫を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0060】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして第１の植物を特定することと、（ｉｉ）前記第１の植物の、コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を有する第２の植物との交配を確立することと、（ｉｉｉ）交配に由来する子孫を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0061】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0062】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）遺伝子改変によって植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子に機能喪失対立遺伝子を導入するように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子の双方に関してホモ接合型である植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0063】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）コデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）Ｔ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子に関してホモ接合型であり、かつＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の低下した発現を有する植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0064】

本開示の特定の態様は、野生型ケシ植物に比べて増加したテバイン含量を有するケシ植物を生成する方法に関するものであり、該方法は、（ｉ）分子法を用いてコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子にて機能喪失対立遺伝子を含むとして植物を特定することと、（ｉｉ）テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を低下させるように植物を遺伝的に改変することと、（ｉｉｉ）植物を自家受粉させることと、（ｉｖ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失対立遺伝子に関してホモ接合型であり、かつＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の低下した発現を有する植物について自家受粉した植物の子孫をスクリーニングすることとを含む。

【0065】

本開示の特定の態様は、単離された核酸分子に関するものであり、核酸分子の配列は配列番号７を含む。

【0066】

本開示の特定の態様は、ケシ植物にてテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の発現を同時に低下させるための配列番号２または配列番号４の一部を含む配列を有するポリヌクレオチド分子の使用に関する。

【0067】

本開示の特定の態様は、請求されているような植物または植物細胞から回収されるケシ殻に関する。

【0068】

本開示の特定の態様は、請求されているような植物または植物細胞から回収される乳状液に関する。

【図面の簡単な説明】

【0069】

本発明の実施形態を説明する以下の図面では、

【図1】図１は、テバインからモルヒネまでの２つの経路を示すケシにおけるモルヒネの生合成経路の模式図である。

【図2】図２は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子の発現の同時低下のためにＴ６ＯＤＭ配列を含むヘアピンＲＮＡを発現するためのヘアピンＲＮＡ発現カセットの模式図である。

【図3】図３は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードするｃＤＮＡ配列の配列比較を示す図である。下線部は、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子およびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子双方の発現を低下させるためのヘアピンＲＮＡ発現構築物を作り出すのに使用されたＴ６ＯＤＭの配列を特定する。下線部内でのＴ６ＯＤＭとＣＯＤＭのコーディング配列間の差異は黒色で強調する。

【図4】図４は、発現構築物の一時的な発現の後のＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を示すヒストグラムである。

【図5】図５は、トランスジェニック株ＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３における発現構築物の発現を示すヒストグラムである。

【図6】図６は、株ＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３における（Ａ）Ｔ６ＯＤＭおよび（Ｂ）ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の低下した発現を示すヒストグラムである。

【図7】図７は、株（Ａ）ＡＭ１、（Ｂ）ＡＭ２および（Ｃ）ＡＭ３における、発現構築物を有さない株（Ｄ）ＡＭ１０と比べたテバインの蓄積を示すクロマト図である。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本開示は、遺伝子改変したケシの植物、その種子、細胞、殻、子孫、または生産されるその乳状液に関するものであり、遺伝子改変した植物は、鎮痛剤生合成の間での酵素テバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）およびコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）の活性の合わせた低下のせいで野生型の植物と比べて増加したレベルのテバインを有する乳状液を産生する。本開示はまた、そのような遺伝子改変したケシ植物を得る方法にも関する。

【0071】

定義
「ケシ（ｏｐｉｕｍ ｐｏｐｐｙ）植物」または「ポピー（ｐｏｐｐｙ）植物」は本明細書で使用されるとき、種Ｐａｐａｖｅｒ Ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍの植物を指す。

【0072】

植物の「畑」は本明細書で使用されるとき、極めて近傍で一緒に栽培される複数のケシを指す。

【0073】

「活性」は本明細書で使用されるとき、植物細胞における特定の酵素機能のレベルを指す。本開示の文脈では、低下したＴ６ＯＤＭ活性は６位でのＯ−脱メチル化活性の低下を指すのに対して、低下したＣＯＤＭ活性は３位でのＯ−脱メチル化活性の低下を指す。活性の低下は、たとえば、突然変異のせいでのタンパク質の低下した機能性の結果、または、たとえば、低下した翻訳のせいでのタンパク質の低下した発現の結果であることができる。

【0074】

「遺伝子改変」は本明細書で使用されるとき、現代バイオテクノロジーの技法によって得られる遺伝物質の新規の組み合わせを指す。遺伝子改変には、遺伝物質が外来性の遺伝物質の挿入によって変化させられている「導入遺伝子」が含まれるが、これらに限定されない。しかしながら、遺伝子改変には、以下で議論されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ９、ＴＡＬＥＮＳ等のような技法により標的指向化法で導入される内在性遺伝子における変化（たとえば、挿入、欠失または置換）も含まれる。しかしながら、本開示の目的では、「遺伝子改変」は、無作為変異誘発の従来の手段によって生成される突然変異とそれに続く従来の育種手段から生じる遺伝物質の新規の組み合わせを含むようには意図されない。

【0075】

「導入遺伝子」は本明細書で使用されるとき、遺伝子改変法によって植物細胞に伝達されている組換え遺伝子または遺伝物質を指す。「トランスジェニック植物」または「形質転換された植物」は本明細書で使用されるとき、外来性の核酸配列またはＤＮＡ断片を植物細胞に組み込んでいるまたは統合している植物を指す。導入遺伝子は、対象とするＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に操作可能に連結される同種または異種のプロモーターを含んでもよい。

【0076】

「操作可能に連結される」はプロモーターと第２のＤＮＡ配列との間での機能的な結合を指し、その際、プロモーター配列は第２のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始し、それに介在する。一般に、操作可能に連結されるは連結されている核酸配列が連続的であることを意味する。

【0077】

「遺伝子改変した」植物または植物細胞は本明細書で使用されるとき、本明細書で定義されているような遺伝子改変を保有する植物または植物細胞を広く指す。

【0078】

本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、長さ（たとえば、少なくとも５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００以上のアミノ酸）または翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化またはリン酸化）または、たとえば、ペプチドに共有結合した１以上の非アミノアシル基（たとえば、糖、脂質等）の存在にかかわらず、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸（Ｄ−またはＬ−アミノ酸のいずれか）の任意の鎖を包含し、それには、たとえば、天然のタンパク質、合成または組換えのポリペプチドまたはペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド、ペプチド模倣体、等が挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は相互交換可能に使用されてもよい。

【0079】

「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」または「核酸分子」は本明細書で使用されるとき、一本鎖または二本鎖であることができ、任意で、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーへの組み込みが可能である合成の、非天然のまたは変化したヌクレオチド塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」または「核酸分子」は遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるＲＮＡを包含する。核酸、核酸配列、ポリヌクレオチド配列および核酸分子は少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００のヌクレオチドまたは塩基対を含んでもよい。

【0080】

「断片」、「その断片」、「遺伝子断片」または「その遺伝子断片」は本明細書で使用されるとき、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子の発現をそれでもやはり低下させてもよい「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸」または「核酸分子」の一部を指す。一実施形態では、断片は、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも１５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含む。

【0081】

「非天然の変異体」は本明細書で使用されるとき、生物に対してネイティブであるが、変異誘発によって導入されるそのヌクレオチド配列の１以上に対する修飾を含む核酸配列を指す。

【0082】

「対立遺伝子」または「対立遺伝子変異体」は本明細書で使用されるとき、ゲノムの特定の位置での同一遺伝子の代替形式を指す。

【0083】

「野生型」は本明細書で使用されるとき、核酸分子または構築物で形質転換されなかった、遺伝子改変されなかった、またはさもなければ本明細書に記載されているように変異させなかった植物または植物物質を指す。「野生型」はまた、Ｔ６ＯＤＭ活性およびＣＯＤＭ活性を低下させなかった植物または植物物質を指してもよい。

【0084】

用語「同一性」は本明細書で使用されるとき、２つのポリペプチド分子間または２つのポリヌクレオチド分子間での配列類似性を指す。同一性は並べた配列における各位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間または核酸配列間の同一性の程度は、配列によって共有される、たとえば、特定された領域にわたって共有される位置での同一のまたは一致するアミノ酸または核酸の数の関数である。同一性の比較のための配列の最適な配列比較は、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐで入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（商標）プログラム、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性配列比較アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４の類似法についての検索，ならびにこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（たとえば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む、当該技術で既知のような種々のアルゴリズムを用いて行われてもよい。配列同一性はまた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（公開された初期設定を用いて）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズム（たとえば、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ）を用いて決定されてもよい。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でのインターネットを介して）を介して利用可能である。たとえば、２つの核酸配列間の配列同一性は、以下の初期設定：期待閾値１０；ワードサイズ１１；マッチ／ミスマッチのスコア２、−３；ギャップコストの存在５、伸長２でのＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いて決定することができる。２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、以下の初期設定：期待閾値１０；ワードサイズ３；マトリクスＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコストの存在１１、伸長１でのＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを用いて決定することができる。別の実施形態では、当業者は所与の配列を容易にかつ適正に並べることができ、単なる目視検査によって配列の同一性／相同性を推定することができる。

【0085】

本明細書で使用されるとき、「異種の」、「外来性の」および「外因性の」ＤＮＡおよびＲＮＡは相互交換可能に使用され、それが存在する植物ゲノムの一部として天然には存在しない、またはそれが自然界で存在するものとは異なるゲノムにおける位置（単数）もしくは位置（複数）にて見いだされるＤＮＡまたはＲＮＡを指す。従って、異種のまたは外来性のＤＮＡまたはＲＮＡは、同一の背景（すなわち、同一の５’および３’配列に連結される）での宿主ゲノムで普通見いだされない核酸である。態様の１つでは、異種のＤＮＡは宿主ＤＮＡと同一であってもよいが、宿主ゲノムにおける異なる位置に導入されてもよく、および／または当該技術で既知の方法によって修飾されており、その際、修飾には、ベクターにおける挿入、外来性のプロモーターおよび／または他の調節要素に連結されること、または複数のコピーで反復されることが挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、異種ＤＮＡは宿主ＤＮＡとは、異なる生物、異なる種、異なる属、または異なる生物界に由来してもよい。さらに、異種ＤＮＡは導入遺伝子であってもよい。本明細書で使用されるとき、「導入遺伝子」は、生物の１つから単離され、異なる生物に導入されている遺伝子配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。本開示の文脈では、核酸分子はＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性を低下させる植物に対して異種である核酸を含んでもよい。

【0086】

「発現」または「発現すること」は本明細書で使用されるとき、遺伝子からの情報が機能的な遺伝子産物の合成で使用される過程を指し、遺伝子によってコードされる産物の検出可能なレベルの生産、または産物の活性に関係してもよい。遺伝子発現は、転写、ＲＮＡのプロセッシング、翻訳、翻訳後修飾、タンパク質分解を誘導する多数のレベルで調節されてもよい（すなわち、開始され、増やされ、減らされ、終結され、維持され、または起きないようにされる）。遺伝子発現はまた、遺伝子産物の活性、たとえば、基質を変換する遺伝子産物の能力に影響を及ぼす突然変異の導入によっても調節することができる。本開示の文脈では、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の低下した発現、またはＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭポリペプチドの低下した発現は、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の低下した転写によって、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードするｍＲＮＡ転写物の低下した翻訳によって、または機能的ポリペプチドの翻訳を妨害する、もしくは基質を変換する能力が低下したポリペプチドの翻訳を生じる突然変異の導入によって達成することができる。内在性遺伝子のそのような低下した発現は、内在性遺伝子の発現を低下させるように設計された発現構築物を含む導入遺伝子の発現から生じてもよい。

【0087】

「ケシ殻」は本明細書で使用されるとき、種子を取り出すための成熟ケシさく果およびケシさく果の茎の脱殻の結果生じる殻物質を指す。

【0088】

「乳状液」は本明細書で使用されるとき、切開した熟していないケシさく果に由来する風乾した乳状の滲出液を指す。

【0089】

用語「上昇したテバイン含量」または「上昇したレベルのテバイン」は本明細書で使用されるとき、相当する野生型植物におけるテバインのレベルと比べて１以上の組織での有意に上昇したレベルのテバインを指す。用語「上昇した」はまた、野生型植物の１以上の組織と比べて同じ組織で有意に上昇しているテバインのレベルも包含する一方で、テバインの野生型のレベルは植物の他のどこかで持続する。

【0090】

用語「低下したモルヒネ含量」は本明細書で使用されるとき、相当する野生型植物におけるモルヒネのレベルと比べて１以上の組織で有意に低下したレベルのモルヒネを指す。用語「低下した」はまた、野生型植物の１以上の組織と比べて同じ組織で有意に低下しているモルヒネのレベルも包含する一方で、モルヒネの野生型のレベルは植物の他のどこかで持続する。

【0091】

「発現を減らすこと」、「活性を減らすこと」、「発現を低下させること」および「活性を低下させること」は、たとえば、「阻害すること」、「下方調節すること」、「ノックアウトすること」、「サイレンシングすること」のような発現および活性に関する周知の同等の用語を包含するように意図される。

【0092】

アルカロイド含量を参照して「実質的にない」は、特定のアルカロイドまたはアルカロイドの組み合わせが、ケシ殻、ケシ殻の濃縮物またはアヘンのアルカロイドの組み合わせの０．６重量％未満、好ましくは０．５重量％未満、さらに好ましくは０．４重量％未満、または０．２重量％未満を構成することを意味する。

【0093】

「発現構築物」は本明細書で使用されるとき、核酸がコードする配列の一部または全部が転写されるのが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含有する遺伝子構築物の任意の種類を指す。転写物はタンパク質に翻訳されてもよいが、翻訳される必要はない。特定の実施形態では、発現には、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の双方が含まれる。他の実施形態では、発現は対象とする遺伝子をコードする核酸の、たとえば、ｓｉＲＮＡへの転写のみを含む。

【0094】

本開示の核酸分子の発現構築物はさらに、プロモーター、および他の調節要素、たとえば、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター、選択可能なマーカーまたはスクリーニング可能なマーカーを含んでもよい。

【0095】

本明細書で使用されるとき、「ベクター」または「構築物」は、たとえば、任意の供給源に由来するプラスミド、コスミド、ウイルス、ベクター、自己複製するポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡのポリヌクレオチド分子のような任意の組換えポリヌクレオチド分子を指してもよい。「ベクター」または「構築物」は、対象とする遺伝子または遺伝子断片をコードするヌクレオチド配列に加えて、プロモーター、ポリアデニル化部位、エンハンサーまたはサイレンサー、および転写ターミネーターを含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「形質転換ベクター」は、細胞、植物または植物物質の形質転換、またはＤＮＡの細胞、植物または植物物質への導入に使用されるベクターを指してもよい。

【0096】

本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、コーディング配列の転写の開始および速度を指示するヌクレオチド配列を指す（Ｒｏｅｄｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ，１６：４０２，１９９１にて概説されている）。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼが結合する部位を含有し、他の調節要素（たとえば、転写因子）の結合のための部位も含有する。プロモーターは天然に存在してもよいし、合成であってもよい（植物プロモーターの概説についてはＤａｔｌａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．３：２６９，１９９７を参照のこと）。さらに、プロモーターは、種特異的（たとえば、Ｂ．ｎａｐｕｓのみで活性）、組織特異的（たとえば、ナピン、ファセオリン、ゼイン、グロブリン、ｄｌｅｃ２、γ-カフィリン種子特異的プロモーター)；発生特異的 (たとえば、胚形成の間のみ活性)；構成的（たとえば、トウモロコシユビキチン、コメユビキチン、コメアクチン、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアクチン、サトウキビ桿菌状ウイルス、ＣｓＶＭＶおよびＣａＭＶ ３５Ｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓポリユビキチン、Ｓｏｌａｎｕｍ ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍポリユビキチン、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−由来のノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、およびマンノピンシンターゼの遺伝子のプロモーター）または誘導性（たとえば、スチルベンシンターゼのプロモーターおよび光、熱、低温、乾燥、創傷、ホルモン、ストレスおよび化学物質によって誘導されるプロモーター）であってもよい。プロモーターには、ＴＡＴＡボックスまたはＩｎｒ要素で構成される短いＤＮＡ配列である最小プロモーターおよび発現の制御のために調節要素が付加される転写開始の部位を特定するのに役立つ他の配列が含まれる。プロモーターはまた、最小プロモーターに加えてコーディング配列の発現を調節するＤＮＡ要素、たとえば、エンハンサーおよびサイレンサーを含むヌクレオチド配列も指してもよい。従って、態様の１つでは、本開示の構築物の発現は、種特異的な、組織特異的な、発生特異的な、または誘導性のプロモーターを選択することによって調節されてもよい。

【0097】

「構成的プロモーター」は本明細書で使用されるとき、環境因子または発生因子にかかわらず、複数の組織またはすべての組織で下流に位置するコーディング配列の発現を主導するプロモーターを指す。

【0098】

当業者は、テバインが合成されている組織にて構築物の発現を効果的に指示するプロモーターを使用することが重要であることを理解するであろう。たとえば、内在性のＴ６ＯＤＭまたはＣＯＤＭのプロモーターが使用されてもよい。或いは、オピオイド生合成の間に導入される発現構築物の高レベルの発現を指示する適当な条件下で有用な構成的な、組織特異的な、または誘導性のプロモーターを採用することができる。

【0099】

エンハンサーおよびサイレンサーは、それぞれ活発にまたは否定的に連結されたプロモーターの転写に影響を及ぼすＤＮＡ要素である（ＢｌａｃｋｗｏｏｄおよびＫａｄｏｎａｇａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：６１，１９９８にて概説された）。

【0100】

ポリアデニル化部位は、ポリアデニル化部位から約３０ｂｐ下流で一連のヌクレオチドＡを付加するようにＲＮＡ転写機構に信号を送るＤＮＡ配列を指す。

【0101】

転写ターミネーターは転写の終結に信号を送るＤＮＡ配列を指す。転写ターミネーターは当該技術で既知である。たとえば、ノパリンシンターゼ、マンノピンシンターゼ、オクトピンシンターゼの遺伝子から単離されるものおよびＴｉプラスミドに由来する他のオープンリーディングフレームのような転写ターミネーターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに由来してもよい。他のターミネーターには限定しないで、ＣａＭＶおよび他のＤＮＡウイルス、ｄｌｅｃ２、ゼイン、ファセオリン、リパーゼ、オスモチン、ペルオキシダーゼ、たとえば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来するＰｉｎＩＩおよびユビキチン遺伝子から単離されるものが挙げられてもよい。

【0102】

本開示の文脈では、核酸構築物はさらに選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは外来性の遺伝物質を含有する植物または植物細胞について選択するのに使用されてもよい。外来性の遺伝物質には、除草剤または抗生剤のような作用物質に対して耐性を付与する酵素、または構築物の存在を報告するタンパク質が挙げられてもよいが、これらに限定されない。

【0103】

多数の植物の選択可能なマーカー系が当該技術で既知であり、本発明と調和している。以下の総説はこれら周知の系を説明している：ＭｉｋｉおよびＭｃＨｕｇｈ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０７：１９３−２３２； Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ（２００４）。

【0104】

選択可能なマーカーの例には、カナマイシン耐性をコードし、カナマイシンを用いて選択することができるｎｅｏ遺伝子、ＮｐｔＩＩ、Ｇ４１８、ｈｐｔ等；抗生剤アンピシリンによる選択のためのａｍｐ耐性遺伝子；ハイグロマイシン耐性のためのハイグロマイシンＲ遺伝子；ＷＯ／２００８／０７０８４５に記載されているものを含むビアラホス耐性をコードするＢＡＲ遺伝子（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする）；突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、グリホサート耐性をコードするａａｄＡ、ブロモキシニルに対する耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノンまたはスルホニルウレア耐性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）、ＡＬＳ、およびメソトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0105】

さらに、本発明の文脈で使用されてもよいスクリーニング可能なマーカーには、その種々の発色性基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびルシフェラーゼ（ＬＵＸ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0106】

Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍにおけるアルカロイド産生
図１はテバインからのモルヒネの生合成の２つの経路を描いている模式図である。６位（環Ｃ）でのテバインのＯ−脱メチル化はテバイン６−Ｏ−脱メチル化酵素（Ｔ６ＯＤＭ）によって触媒されるのに対して、３位（環Ａ）でのＯ−脱メチル化はコデイン３−Ｏ−脱メチル化酵素（ＣＯＤＭ）によって触媒される。従って、テバインは６位または３位で脱メチル化を受けてそれぞれ、ネオピノンまたはオリパビンを生じる。ネオピノンは自然にコデイノンに変換し、それは次いでコデイノン還元酵素（ＣＯＲ）によってコデインに還元される。コデインはＣＯＤＭによって３位で脱メチル化されてモルヒネを生じる。Ｔ６ＯＤＭによる６位でのオリパビンの脱メチル化はモルフィノンを生じ、それは次いでＣＯＲによってモルヒネに還元される。

【0107】

本発明者は、Ｔ６ＯＤＭ酵素およびＣＯＤＭ酵素の活性を同時に低下させることによって親植物と比べて増加したレベルのテバインと低いレベルのコデインおよびモルヒネとを含有する植物を生産することが可能であってもよいという仮説を立てた。

【0108】

Ｔ６ＯＤＭ酵素およびＣＯＤＭ酵素の野生型アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および３にて提示されている。Ｔ６ＯＤＭ酵素をコードする内在性遺伝子に相当するｃＤＮＡ配列は配列番号２として提示され、ＣＯＤＭ酵素をコードする内在性遺伝子に相当するｃＤＮＡ配列は配列番号４として提示されている。しかしながら、当業者は、Ｔ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの遺伝子における天然に存在する変異は、同じ機能的タンパク質をコードするやや異なる核酸配列を伴って変種植物の間に存在してもよいことを容易に理解するであろう。

【0109】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性または発現の低下
本発明の遺伝子改変した植物におけるＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの発現および／または活性は、植物にてこれら酵素の活性の低下を生じる方法によって低下させてもよい。これは、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルでＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性を変化させることによって達成されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「活性」は酵素のその同族の基質との生化学的な反応を指す。本発明の文脈では、低下したＴ６ＯＤＭ（またはＣＯＤＭ）の活性はＴ６ＯＤＭ（またはＣＯＤＭ）酵素のタンパク質レベルの低下および／またはＴ６ＯＤＭ（またはＣＯＤＭ）酵素がテバインとの反応を触媒する速度の低下から生じてもよい。

【0110】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子を変異させること
態様の１つでは、本発明は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子を標的としてＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの発現および／または活性を変える遺伝子改変に関する。内在性のＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの遺伝子は、限定しないで、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの遺伝子をノックアウトすること；またはＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの遺伝子を崩壊させる異種ＤＮＡをノックインすることによって変化させてもよい。当業者は、これらのアプローチがコーディング配列、プロモーター、または遺伝子の転写に必要な他の調節要素に適用されてもよいことを理解する。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮＳのような技術を使用して、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子双方に機能喪失突然変異を導入することができる。次いで、そのような機能喪失突然変異を含む各遺伝子の少なくとも一方の対立遺伝子を有する植物を自家受粉させて、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子における機能喪失対立遺伝子についてホモ接合型の子孫を作り出すことができる。一部の実施形態では、ＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）をコードする内在性遺伝子の遺伝子改変は、１以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって配列が異なり、かつ低下したＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）活性を有するまたはＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）活性を有さないポリペプチドを生じる。

【0111】

欠失には内在性タンパク質の１以上の残基の欠如が関与する。本開示の目的では、欠失変異体には、内在性タンパク質のアミノ酸が翻訳されない実施形態、たとえば、最初の「開始」メチオニンが置換されるまたは欠失する場合が含まれる。

【0112】

挿入突然変異には通常、ポリペプチドの末端ではない点での物質の付加が関与するが、アミノ末端およびカルボキシ末端の付加を含む融合タンパク質が含まれてもよい。置換変異体には通常、タンパク質内の１以上の部位での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換が関与し、ポリペプチドの１以上の特性を調節するように設計されてもよい。この種の置換は一部の実施形態では、保存的であってもよく、すなわち、１つのアミノ酸が類似の形状、サイズ、電荷、疎水性、親水性等もので置き換えられる。保存的置換は当該技術で周知であり、それには、たとえば、アラニンからセリン；アラニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。

【0113】

従って、ＣＯＤＭ酵素は配列番号１に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有してもよい。従って、Ｔ６ＯＤＭ酵素は配列番号２に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有してもよい。

【0114】

内在性遺伝子を標的とする導入遺伝子の発現
別の態様では、本開示はそれらの各ｍＲＮＡ転写物を標的とすることによってＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの発現および／または活性を低下させることに関する。この点で、同時抑制、アンチセンスの発現、小型ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）の発現、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）の発現、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）の発現、逆向き反復ｄｓＲＮＡの発現、マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、センス配列およびアンチセンス配列の同時発現、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法によってＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭのＴ ｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させてもよい。

【0115】

一実施形態では、本開示は、配列番号２または配列番号４に記述されている分子の少なくとも一部に相補性であるまたは本質的に相補性である核酸分子の使用に関する。「相補性」である核酸分子は、標準のＷａｔｓｏｎ・Ｃｒｉｃｋ相補性規則に従って塩基対合が可能であるものである。本明細書で使用されるとき、用語「相補性配列」は、上述の同じヌクレオチド比較によって評価されてもよいとき、または本明細書に記載されているもののような相対的にストリンジェントな条件下で配列番号２または配列番号４のアミノ酸セグメントとハイブリッド形成することができると定義されるとき、実質的に相補性である核酸配列を意味する。中程度にストリンジェントな、好ましくはストリンジェントな条件下で２つの配列が互いにハイブリッド形成するならば、核酸分子は実質的に相補性（または相同性／同一性を有する）であってもよい。フィルター結合する配列への中程度にストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成は、６５℃での０．５ＭのＮａＨＰＯ_４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、および４２℃での０．２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳでの洗浄にて実施されてもよい（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ａｔ ｐ．２．１０．３を参照のこと）。或いは、フィルター結合する配列へのストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成は、６５℃での０．５ＭのＮａＨＰＯ_４、７％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳでの洗浄にて実施されてもよい（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８９，上記を参照のこと）。ハイブリッド形成の条件は対象とする配列に応じて既知の方法に従って改変されてもよい（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．）。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融点より約５℃低いように選択される。

【0116】

植物における同時抑制の現象は、内在性遺伝子と同様に導入遺伝子の発現の低下を生じる遺伝子のトランスジェニックコピーの導入に関係する。観察された効果は、導入遺伝子と内在性遺伝子の間での配列同一性に左右される。

【0117】

用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は宿主植物における天然に存在する遺伝子の発現を下方調節するまたはサイレンシングする周知の方法を指す。ＲＮＡｉは二本鎖ＲＮＡ分子または小型ヘアピンＲＮＡを用いて、それらが実質的な相同性または全相同性を共有する核酸配列の発現を変化させる。概説については、Ａｇｒａｗａｌ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，（２００３），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６７（４）：６５７−６８５を参照のこと。ＲＮＡはその過程では開始剤および標的の双方である。このメカニズムはウイルス由来のＲＮＡおよびトランスポゾンを標的とし、発生を調節することおよびゲノムの維持でも役割を担っている。手短には、二本鎖ＲＮＡが酵素ダイサーによって切断され、２１〜２３ｂｐの短い断片（ｓｉＲＮＡ）を生じる。各断片の二本鎖の一方がＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ＲＩＳＣが会合したＲＮＡ鎖がｍＲＮＡと対合し、ｍＲＮＡの切断を誘導する。或いは、ＲＩＳＣが会合したＲＮＡ鎖がゲノムＤＮＡと対合し、遺伝子の転写に影響を及ぼす後成的な変化を生じる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はゲノム自体から転写されるＲＮＡの型であり、類似の方法で機能する。同様に、ｓｈＲＮＡはダイサーによって切断され、ＲＩＳＣと会合してｍＲＮＡの切断を生じてもよい。

【0118】

ポピーにおける遺伝子サイレンシングの具体例はＲＮＡｉのアプローチを用いて報告されている。２００８年、Ａｌｌｅｎらは、ケシにおけるモルフィナン経路の酵素、サルタリジノール７−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＳａｌＡＴ）をコードする遺伝子の抑制を報告した。ヘアピンＲＮＡが介在するＳａｌＡＴの抑制は全アルカロイドの２３％までのサルタリジンの蓄積を生じた。関連技術の記載にて上記で議論されたように、Ａｌｌｅｎら（２００４）はＲＮＡｉを介して多重遺伝子ＣＯＲファミリーのメンバーすべてをサイレンシングするように設計されたキメラヘアピンＲＮＡ構築物を用いてケシにてコデイノン還元酵素（ＣＯＲ）をサイレンシングした。

【0119】

遺伝子発現のアンチセンス抑制にはｍＲＮＡ分解の触媒は関与しないが、代わりにｍＲＮＡに結合し、タンパク質翻訳を阻止する一本鎖ＲＮＡ断片が関与する。

【0120】

アンチセンスおよびセンス双方の抑制は、センス・アンチセンスハイブリッド、またはＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼによって生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から作られるＲＮＡをサイレンシングすること（ｓＲＮＡ）が介在する。ｓＲＮＡの主要なクラスには、その生合成で異なる小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。

【0121】

ダイサー様の複合体によるｄｓＲＮＡ前駆体のプロセッシングによって、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡと、ＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内からの標的転写物のｍｉＲＮＡ主導の切断が得られる。

【0122】

Ｔ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの発現は、Ｔ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭについての内在性コーディング配列に対する高い相同性（好ましくは１００％の相同性）の約２１ｂｐ以上の長さの領域を含有する合成遺伝子または無関係の遺伝子を用いて抑制されてもよい。

【0123】

たとえば、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ａ.，Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｎ.，Ｍｕｌｌｅｒ，Ａ.，Ｑｕｅ，Ｑ.，Ｇｅｎｄｌｅｒ，ＫおよびＮａｐｏｌｉ，Ｃ.Ａ.（２００６），Ａ ｐａｒａｇｅｎｅｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．７１：４８１−４８５．を参照のこと。さらなる概説については、たとえば、Ｏｓｓｏｗｓｋｉ，Ｓ.，Ｓｃｈｗａｂ，ＲおよびＷｅｉｇｅｌ，Ｄ．，（２００８），Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，５３：６７４−６９０を参照のこと。

【0124】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭについての内在性のコーディング配列の一部に対して実質的に同一である核酸分子も本開示の文脈で使用されてもよい。本明細書で使用されるとき、２つの分子が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８２．５％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するのであれば、一方の核酸分子はもう１つの核酸分子と「実質的に同一」であってもよい。従って、配列番号２または配列番号４に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む核酸配列は本開示の文脈での使用に好適であってもよい。一実施形態では、２つの核酸分子はそれぞれ、少なくとも２０の同一の連続するヌクレオチドを含む。

【0125】

ＣＯＤＭまたはＴ６ＯＤＭをコードする核酸配列の断片が使用されてもよい。そのような断片は、場合によっては、ＣＯＤＭまたはＴ６ＯＤＭをコードする核酸配列の少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、または少なくとも４００の連続するヌクレオチドの長さを有してもよい。或いは、そのような断片は、場合によっては、ＣＯＤＭまたはＴ６ＯＤＭをコードする核酸配列の少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の連続するヌクレオチドの最短長さ、および３０００未満、２０００未満、１７５０未満、１５００未満、１２５０未満、１０００未満、７５０未満、または５００未満の連続するヌクレオチドの最長長さ、またはそのような最短長さと最長長さの組み合わせを有してもよい。

【0126】

一実施形態では、本開示の遺伝子改変したケシ植物は、ゲノムに安定的に統合された、植物に対して異種である第１の核酸分子を含む。第１の核酸分子は、ＣＯＤＭ酵素の発現を低下させるためにＲＮＡ、たとえば、ヘアピンＲＮＡをコードする。遺伝子改変したケシ植物はさらに、植物に対して異種である第２の核酸分子を含む。第２の核酸分子はＴ６ＯＤＭ酵素の発現を低下させるためにＲＮＡ、たとえば、ヘアピンＲＮＡをコードする。

【0127】

第１と第２の核酸分子は単一の遺伝子構築物または複数の構築物に存在してもよい。一実施形態では、第１および／または第２の核酸分子はプロモーターに対してセンス方向で配置されてもよい。別の実施形態では、第１および／または第２の核酸分子はプロモーターに対してアンチセンス方向で配置されてもよい。さらなる実施形態では、遺伝子構築物はプロモーターに対してセンスおよびアンチセンス双方の方向での少なくとも２つの核酸分子を含んでもよい。センスおよびアンチセンス双方の方向で核酸分子を含む遺伝子構築物はステム・ループ（ヘアピン）構造を形成することができるｍＲＮＡ転写物を生じてもよい。

【0128】

核酸分子の一方または双方は同一プロモーターの転写制御下にあってもよい。

【0129】

様々な事例では、第１と第２の異種核酸分子はそれぞれ、
配列番号４に記述されている核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を持っている核酸配列の少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、または少なくとも４００の連続するヌクレオチド；
配列番号２に記述されている核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を持っている核酸配列の少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、または少なくとも４００の連続するヌクレオチド
を含む。

【0130】

様々な事例では、第１および第２の核酸分子はそれぞれ
配列番号４に記述されている核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を持っている核酸配列のうち、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の連続するヌクレオチドの最短長さおよび１７５０未満、１５００未満、１２５０未満、１０００未満、７５０未満または５００未満の連続するヌクレオチドの最長長さを持つ、またはそのような最短と最長の長さの組み合わせを持つ核酸分子および
配列番号２に記述されている核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を持っている核酸配列のうち、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０の連続するヌクレオチドの最短長さおよび１７５０未満、１５００未満、１２５０未満、１０００未満、７５０未満または５００未満の連続するヌクレオチドの最長長さを持つ、またはそのような最短と最長の長さの組み合わせを持つ核酸分子
を含む。

【0131】

当業者は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性の低下が植物または植物細胞に導入される異なる核酸分子の数によって限定されなくてもよいことも十分に理解するであろう。一実施形態では、１つの核酸分子が酵素をコードする内在性遺伝子の一方または双方を標的としてもよい。従って、別の実施形態では、本開示の遺伝子改変したケシ植物は、ゲノムに安定して統合された、植物に対して異種の核酸分子を含む。核酸分子は、ＣＯＤＭ酵素の発現を低下させるためのＲＮＡ（たとえば、ヘアピンＲＮＡ）と、Ｔ６ＯＤＭ酵素の発現を低下させるためのＲＮＡ（たとえば、ヘアピンＲＮＡ）とを含む単一の転写物をコードする。本開示で具体的に例示されている機能する実施形態では、核酸分子は、ＣＯＤＭ酵素とＴ６ＯＤＭ酵素の双方の発現を低下させるための単一のヘアピンＲＮＡを含む単一の転写物をコードする。

【0132】

態様の１つでは、核酸分子は、ＣＯＤＭ（配列番号４）；Ｔ６ＯＤＭ（配列番号２）；それらの対立遺伝子変異体；それらの非天然の変異体；それらの断片のコーディング配列の一部またはそれらの組み合わせを含んでもよい。

【0133】

一実施形態では、Ｔ６ＯＤＭ（配列番号２）のコーディング配列の断片は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭ双方の内在性コーディング配列の発現を標的とするＲＮＡｉヘアピンをコードする発現構築物の作製に好適である。本開示で具体的に例示されている機能する実施形態では、そのような断片は配列番号７を含む。本開示で具体的に例示されている機能する実施形態では、そのような発現構築物は配列番号５を含む。本開示で具体的に例示されている機能する実施形態では、ＲＮＡｉヘアピンは配列番号６を含む核酸によってコードされる。

【0134】

プロモーターに対して双方の方向で核酸を含む発現構築物はさらにスペーサーを含んでセンス方向における核酸分子とアンチセンス方向における核酸分子を分離してもよい。本明細書で使用されるとき、「スペーサー」は少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００のヌクレオチドを含んでもよい。

【0135】

当業者は、前述の説明例では、部分的なＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭのコーディング配列がＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの構築物を構築するために提案されたが、完全なＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭのコーディング配列、代替のＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭのコーディング配列、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、またはこれらの配列の変異させた誘導体も使用することができることも容易に理解するであろう。本発明の文脈で使用されてもよい核酸分子の最大数は所与の形質転換法を用いて標的の植物または植物細胞に送達されてもよい構築物の最大サイズによってのみ限定されてもよい。

【0136】

種々の実施形態では、本開示の遺伝子改変した植物はさらに、植物に対して異種の第３の核酸分子を含んでもよい。第３の核酸分子はＣｙｐ８０Ｂ３の発現を高めてモルフィナンの合計レベルを高めるためである。

【0137】

内在性のＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭポリペプチドを標的とする導入遺伝子の発現
さらなる態様では、本開示はタンパク質レベルでＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭを標的とすることによってＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性を低下させることに関する。たとえば、ＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）の活性は酵素の翻訳後修飾に影響を及ぼすことによって、または異種タンパク質の導入によって低下させてもよい（たとえば、ＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）の変異させた形態は、それが野生型酵素と会合し、その活性を変えるように、または基質を変換できずに基質に対する野生型酵素を打ち負かすもしくはＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）酵素に特異的に結合する抗体を打ち負かすように発現させてもよい）。

【0138】

当業者は、ＣＯＤＭまたはＴ６ＯＤＭ遺伝子のプロモーターおよび／または他の調節要素の配列を含む核酸分子が本発明の文脈で使用されてもよいことも十分に理解する。実施形態では、ＣＯＤＭ（または場合によってはＴ６ＯＤＭ）遺伝子のプロモーターおよび／または調節要素の配列を含む異種核酸分子を用いて内在性ＣＯＤＭ（または場合によってはＴ６ＯＤＭ）遺伝子のプロモーターから離れて細胞機構にバイアスをかけるので、結果的にＣＯＤＭ（またはＴ６ＯＤＭ）の発現を低下させてもよい。

【0139】

核酸構築物またはその要素のサイズまたは長さは本明細書に記載されている具体的な実施形態に限定されない。たとえば、当業者は、導入遺伝子の要素のサイズは代わりに導入遺伝子の要素の機能によって定義されてもよく、プロモーターの要素は代わりに、十分なレベルでかつ所望の組織で転写を主導することができたものとして決定されてもよいことを十分に理解する。同様に、本発明の核酸構築物によって転写されたｍＲＮＡにより形成されるステムループ構造は長さが異なってもよい多数の遺伝子セグメントを含んでもよい。たとえば、ステムループはイントロンのようなスペーサーに加えて各およそ２１〜３０塩基対の３つの遺伝子セグメントを含んでもよい（１２６ｂｐに加えてイントロン）。

【0140】

当業者は、遺伝子セグメントのサイズは組み合わせた要素サイズの合計によって確立されてもよく、標的生物に導入遺伝子を送達するのに使用される形質転換法に左右されてもよいことを十分に理解する。たとえば、各形質転換法（アグロバクテリウム、遺伝子銃、ＶＩＧＳに基づく送達系）は理論的な最大導入遺伝子サイズに限定されてもよい。

【0141】

植物の形質転換
アグロバクテリウムが介在する導入による植物細胞へのＤＮＡの導入は当業者に周知である。たとえば、植物細胞の形質転換にＴｉまたはＲｉプラスミドが使用されるのであれば、ＴｉまたはＲｉプラスミドに含有されるＴ−ＤＮＡの左右の境界双方が使用されることが多いが、少なくとも右境界が隣接領域として挿入される遺伝子に連結されなければならない。アグロバクテリウムが形質転換に使用されるのであれば、統合されるＤＮＡは特定のプラスミドおよび具体的には中間ベクターまたはバイナリーベクターにクローニングされなければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡにおける配列に相同性である配列による相同組換えによってアグロバクテリウムのＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込まれてもよい。これはまたＴ−ＤＮＡの導入に必要とされるｖｉｒ領域も含有する。中間ベクターはアグロバクテリウムにて複製することができない。中間ベクターはヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに移すことができる。バイナリーベクターはアグロバクテリウムと同様にＥ．ｃｏｌｉにて複製することができる。それらは選択マーカー遺伝子と、左右のＴ−ＤＮＡ境界配列によって囲まれたリンカーまたはポリリンカーとを含有する。それらはアグロバクテリウムで直接形質転換することができる。宿主細胞として作用するアグロバクテリウムはｖｉｒ領域を運ぶプラスミドを含有すべきである。ｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡの植物細胞への導入に必要とされる。追加のＴ−ＤＮＡが存在してもよい。そのような形質転換されたアグロバクテリウムを植物細胞の形質転換に使用する。植物細胞の形質転換へのＴ−ＤＮＡの使用は広範に研究されており、植物の形質転換に関する標準の総説および説明書に適宜記載されている。この目的でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓと共に培養された植物外植片を植物細胞へのＤＮＡの導入に使用することができる。

【0142】

アグロバクテリウムの形質転換を用いてケシ植物を形質転換することができる（Ｃｈｉｔｔｙ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ，３４４：３８３−３９１； Ｃｈｉｔｔｙ，ｅｔ ａｌ．（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ，３０：１０４５−１０５８）；Ｆａｃｃｈｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，２７（４）：７１９−７２７））。Ｆａｃｃｈｉｎｉら（２００８）は、稔性で除草剤耐性のケシ植物の生産のための体細胞胚形成を介したＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが介在する遺伝子形質転換プロトコールを開示した。形質転換は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが主導するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）遺伝子とＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが主導するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を内部に持つ形質転換ベクターであるｐＣＡＭＢＩＡ３３０１が介在した。５０ｍＭのＡＴＰおよび５０ｍＭのＭｇＣｌ_２の存在下で外植片をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共に共培養した。次いで、カルス誘導培地で予備培養した根部外植片を形質転換に使用した。２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４−Ｄ）および６−ベンジルアデニン（ＢＡ）の双方を含有する培地での外植片から除草剤耐性で増殖するカルスが得られた。培地からのＢＡの除去によって球形の胚様カルスが誘導され、それをホルモンを含まない培地に入れ、体細胞胚を形成させた。特定の培養条件下で体細胞胚を小植物に変換し、土壌に移した。植物を成熟させ、種子を播いた。調べたトランスジェニック株でＰＡＴおよびＧＵＳの転写物および酵素活性を検出した。

【0143】

それにもかかわらず、本発明は植物細胞を形質転換する特定の方法に限定されず、当業者は、植物へのＤＮＡ導入の他の好適な方法が使用されてもよいことを容易に理解するであろう。核酸を細胞に導入する（本明細書では「形質転換」とも呼ぶ）方法は当該技術で既知であり、それらには、ウイルス法（Ｃｌａｐｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ，２０：１５５−１６８，１９９３；Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１７８：２０８９−２０９６，１９９３；ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６０８−６１４，１９８８；Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ，２４１：１９−２７，１９８８）；微量注入のような物理的方法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ．Ｃｅｌｌ，２２：４７９−４８８，１９８０）、エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１０７：５８４−５８７，１９８２；Ｆｒｏｍｍ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８，１９８５；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３８４，２５３）および遺伝子銃（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＴａｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，４３：３５３−３６５，１９９４；Ｆｙｎａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１１４７８−１１４８２，１９９３）；化学法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５４：５３６−５３９，１９７３；Ｚａｔｌｏｕｋａｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，６６０：１３６−１５３，１９９２）；および受容体介在法（Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８５０−８８５４，１９９１；Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ，３：１４７−１５４，１９９２；Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０９９−６１０３，１９９２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0144】

ＤＮＡを植物細胞に導入する別の方法は遺伝子銃による。この方法には、ＤＮＡで被覆された顕微鏡的粒子（たとえば、金またはタングステンの粒子）による植物細胞の衝撃が関与する。粒子は、通常、気体または放電によって細胞壁および細胞膜を通って迅速に加速され、それによってＤＮＡが細胞内に放出され、細胞のゲノムに組み込まれる。この方法は、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、木質の樹木種等を含む多数の作物の形質転換に使用されている。遺伝子銃の衝撃は、真核性および原核性双方の微生物、ミトコンドリア、および微生物や植物の葉緑体におけると同様に多種多様な動物組織に形質移入するのに有効であることが証明されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，３４６：７７６−７７７，１９９０；Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ，１０：２８６−２９１，１９９２；ＰｅｃｏｒｉｎｏおよびＬｏ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ，２：３０−３２，１９９２；Ｊｉａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ，１１：４９７−５０２，１９９３）。

【0145】

ＤＮＡを植物細胞に導入する別の方法はエレクトロポレーションによる。この方法には、プロトプラスト／細胞／組織に適用される高電圧のパルスが関与し、外来性ＤＮＡの取り込みを促す原形質膜に一時的な孔を生じる。外来性のＤＮＡは孔を通って細胞質に入り、次いで核に入る。

【0146】

植物細胞はリポソームが介在する遺伝子導入によって形質転換されてもよい。この方法は、核酸を細胞に送達するための、水性内部を伴う環状脂質分子であるリポソームの使用を指す。リポソームはＤＮＡ断片を被包し、次いで細胞膜に付着し、それと融合してＤＮＡ断片を導入する。従って、ＤＮＡは細胞に入り、次いで核に入る。

【0147】

本発明と矛盾しない植物細胞を形質転換するための他の周知の方法には、花粉形質転換（Ｔｏｌｅｄｏ大学、１９９３年、米国特許第５，１７７，０１０号を参照のこと）；Ｗｈｉｓｋｅｒｓ技術（米国特許第５，４６４，７６５号および同第５，３０２，５２３号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0148】

本発明の核酸構築物は植物のプロトプラストに導入されてもよい。植物のプロトプラストは機械的手段または酵素的手段を用いて細胞壁が完全にまたは部分的に取り除かれている細胞であり、リン酸カルシウムに基づく沈殿、ポリエチレングリコール処理およびエレクトロポレーションを含む既知の方法で形質転換されてもよい（たとえば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３，１９８５；Ｍａｒｃｏｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４，１９８８を参照のこと）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は酸化エチレンのポリマーである。それは植物のプロトプラストへのＤＮＡの取り込みを誘導する高分子遺伝子キャリアとして広く使用されている。ＰＥＧを二価のカチオンと組み合わせて使用してＤＮＡを沈殿させ、細胞の取り込みを達成してもよい。或いは、ＰＥＧを、たとえば、ポリ（エチレンイミン）およびポリＬ−リシンのような他のポリマーと複合体化してもよい。

【0149】

標的指向化組換え、相同組換えおよび部位特異的組換え（植物における部位特異的組換え系の概説については、概説Ｂａｓｚｃｙｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，１５７：１５７−１７８，２００３を参照のこと）を含むが、これらに限定されない多数の方法によって本発明の核酸分子が植物細胞のゲノム内に向けられてもよい。植物における（Ｒｅｉｓｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，２２８：８５−１３９，２００３にて概説された）および動物細胞における（ＳｏｒｒｅｌｌおよびＫｏｌｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ，２３：４３１−４６９，２００５にて概説された）相同組換えおよび遺伝子標的指向化は当該技術で既知である。

【0150】

本明細書で使用されるとき、「標的化組換え」はゲノムの部位への核酸構築物の組込みを指し、その際、組込みは組込みの部位に相当する配列を含む構築物によって促される。

【0151】

相同組換えは、細胞に導入されるＤＮＡの小片と細胞のゲノムの間での配列同一性に頼る。相同組換えは高等真核生物では極端に稀な事象である。しかしながら、相同組換えの頻度は、ＤＮＡ二本鎖切断、三本鎖形成オリゴヌクレオチドまたはアデノ随伴ウイルスの導入を含む戦略によって増やされてもよい。

【0152】

本明細書で使用されるとき、「部位特異的組換え」は酵素の存在下で少なくとも２つの別個の配列が相互作用して単一の核酸配列に結合する場合に生じる酵素的組換えを指す。部位特異的組換えは、限られた配列相同性しか有さないＤＮＡ分子間でのＤＮＡ鎖の交換を触媒する、たとえば、リコンビナーゼ、トランスポザーゼおよびインテグラーゼのような酵素に頼る。部位特異的組換えのメカニズムは当該技術で既知である（Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，７５：５６７−６０５，２００６にて概説された）。部位特異的組換えの認識部位（たとえば、Ｃｒｅおよびａｔｔの部位）は普通３０〜５０ｂｐである。その間で組換えが起きる部位のペアは普通同一であるが、例外、たとえば、λインテグラーゼのａｔｔＰおよびａｔｔＢがある（Ｌａｎｄｙ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，５８：９１３−９４９，１９８９）。

【0153】

追加の方法は、部位特異的ヌクレアーゼ、たとえば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様のエフェクターヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳおよび操作されたｃｒＲＮＡ／トレーサーＲＮＡを伴うクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ−関連ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）によってゲノムＤＮＡを標的とし、切断して、標的化された変異誘発を誘導する、細胞性ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導する、および所定のゲノム遺伝子座内での外来性ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの標的化組換えを促す方法および組成物の近年の開発から選択されてもよい。外来性ＤＮＡの標的化された挿入のための現在の方法には通常、少なくとも１つの導入遺伝子と、活発に転写されるコーディング配列の特定のゲノム遺伝子座を結合し、切断するように設計されている部位特異的ヌクレアーゼ、たとえば、ＺＥＮとを含有するドナーＤＮＡポリヌクレオチドによる植物組織の同時形質転換が関与する。これによってドナーＤＮＡポリヌクレオチドが切断されたゲノム遺伝子座内に安定して挿入され、活発に転写されるコーディング配列を含む特定のゲノム遺伝子座での標的化された遺伝子付加を生じる。

【0154】

本明細書で使用されるとき、用語「亜鉛フィンガー」は、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されるＤＮＡ結合タンパク質結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域を定義する。

【0155】

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１以上の亜鉛フィンガーを介して配列特異的にＤＮＡを結合する、大型タンパク質内のタンパク質またはドメインである。用語、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質は亜鉛フィンガータンパク質またはＺＦＰと略記されることが多い。亜鉛フィンガー結合ドメインを「操作して」所定のヌクレオチド配列に結合することができる。亜鉛フィンガータンパク質を操作する方法の非限定例は設計および選択である。設計された亜鉛フィンガータンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準から生じる、自然界に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準には、置換規則の適用、および既存のＺＦＰの設計や結合データの情報を保存しているデータベースにて情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムが挙げられる（米国特許第６，４５３，２４２号；ＷＯ９８／５３０５８も参照のこと）。

【0156】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は１以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインはその同族標的ＤＮＡ配列とのＴＡＬＥの結合に含まれる。単一の「反復単位」も「反復」と呼ばれ、通常長さ３３〜３５のアミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内での他のＴＡＬＥ反復配列との少なくとも若干の配列相同性を示す（米国特許公開番号２０１１／０３０１０７３）。

【0157】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連の）ヌクレアーゼ系。手短には、「ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＣＡＳ酵素と協調した作用がゲノムＤＮＡを選択的に認識し、結合し、切断することができる短い鎖のＲＮＡ分子である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を操作してゲノムにおける所望の標的で二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出すことができ、修復阻害剤の使用によってＤＳＢの修復に影響を与えてエラーを起こし易い修復を増やすことができる（Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ，（２０１２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，ｐ．８１６−８２１）。

【0158】

亜鉛フィンガー、ＣＲＩＳＰＲおよびＴＡＬＥ結合ドメインを「操作して」、たとえば、天然に存在する亜鉛フィンガーの認識らせん領域の操作（１以上のアミノ酸を変えること）を介して所定のヌクレオチド配列に結合することができる。同様に、たとえば、ＤＮＡ結合に含まれるアミノ酸（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）を操作することによってＴＡＬＥを「操作して」、所定のヌクレオチド配列に結合することができる。従って、操作したＤＮＡ結合タンパク質（亜鉛フィンガーまたはＴＡＬＥ）は天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定例は設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主として合理的な基準から生じる、自然界に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準には、置換規則の適用、および既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥの設計や結合データの情報を保存しているデータベースにて情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムが挙げられる（米国特許第６，４５３，２４２号；ＷＯ９８／５３０５８および米国公開番号２０１１／０３０１０７３も参照のこと）。

【0159】

「選択された」亜鉛フィンガー、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥは、その生産が主として、たとえば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択のような経験的な過程から生じる、自然界に見いだされないタンパク質である。

【0160】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｔ６ＯＤＭまたはＣＯＤＭのポリペプチドをコードする遺伝子に結合する亜鉛フィンガータンパク質をコードし、その遺伝子の発現の低下を生じる。特定の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質はＴ６ＯＤＭまたはＣＯＤＭをコードする遺伝子の調節性領域に結合する。他の実施形態では、亜鉛フィンガータンパク質は、Ｔ６ＯＤＭまたはＣＯＤＭのポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡに結合し、その翻訳を妨げる。亜鉛フィンガータンパク質によって標的化するための部位を選択する方法は、たとえば、ＵＳ６，４５３，４２４に記載されており、亜鉛フィンガータンパク質を用いて植物にて遺伝子の発現を阻害する方法は、たとえば、ＵＳ２００３／００３７３５５に記載されており、そのそれぞれが参照によって本明細書に組み入れられる。ＴＡＬＥタンパク質によって標的化するための部位を選択する方法は、たとえば、Ｍｏｓｃｏｕ，ＭＪ.，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，ＡＪ.，２００９，Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：１５０１に記載されている。

【0161】

核酸分子は、植物細胞の代々の世代がＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの低下した発現を有するためにそれが嬢細胞に遺伝性であるように植物ゲノムに安定して組み込まれるようになる。これには、植物細胞ゲノムに統合する、たとえば、無作為に統合する本発明の核酸分子が関与してもよい。或いは、本発明の核酸分子は、嬢細胞に対して遺伝性である外来性の自己複製するＤＮＡのままであってもよい。本明細書で使用されるとき、嬢細胞に対して遺伝性である外来性の自己複製するＤＮＡもまた、「植物ゲノムに安定して組み込まれる」と見なされる。

【0162】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの活性または発現の低下についての試験
ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の破壊、その発現、またはＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの酵素活性は、分子生物学の当該技術で既知の方法によって確認されてもよい。たとえば、内在性遺伝子の破壊はＰＣＲとその後のサザンブロット解析によって評価されてもよい。ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭのｍＲＮＡレベルは、たとえば、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、マイクロアレイ遺伝子解析、およびＲＮＡ分解酵素保護によって測定されてもよい。ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭのタンパク質レベルは、限定しないで、酵素活性アッセイ、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析によって測定されてもよい。ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの発現またはその欠如はテバインの増加した蓄積の予測因子として使用されてもよい。ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの酵素活性は生化学的にまたは機能的に評価されてもよい。

【0163】

たとえば、ＣＯＤＭ（および／またはＴ６ＯＤＭ）の活性は、幾つもの異種基質、たとえば、テバインの存在下、酵素によって形成される生成物の検出を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の方法によって生化学的に測定されてもよい。ＣＯＤＭ（および／またはＴ６ＯＤＭ）の活性は、機能的に、たとえば、ポピー組織におけるテバインのレベルを評価することによっても測定されてもよい。

【0164】

本開示の遺伝子改変したケシ植物は、前記植物またはその種子、苗木、殻、さく果、またはその子孫にて、野生型の種子、苗木、殻、さく果、またはその子孫と比べて少なくとも５７％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭの活性の低下を生じてもよい。

【0165】

ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭにおける機能喪失突然変異についての標的化スクリーニング
本開示はさらに、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における機能喪失突然変異についての標的化スクリーニングと、突然変異を組み合わせて双方の遺伝子座で機能喪失突然変異についてホモ接合型である植物を得るためのその後の植物の育種が関与する、テバインのレベルが増加したケシ植物を生成する方法に関する。ケシの育種家は改善された品種の育成のために種々の選択法を使用している。しかしながら、種々の異なる所望の特徴を持つ親のハイブリッド形成が関与する最も上手く行った育種法。そのようなアプローチを上手く用いて、さく果の数、種子やケシの収量、モルヒネ含量、および耐倒伏性を高めている。

【0166】

用語「Ｔ−ＤＮＡ挿入」は、挿入変異誘発を介して遺伝子を破壊するために転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）を利用する方法を指す。従って、ケシ植物にてＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を下方調節することまたはサイレンシングすることはＴ−ＤＮＡ変異誘発によって達成することができ、その際、Ｔ−ＤＮＡは変異を導入するために植物ゲノムでの無作為挿入に使用される。その後、Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマー１つとＣＯＤＭ（または場合によってはＴ６ＯＤＭ）をコードする遺伝子に特異的なプライマー１つとを含むプライマーペアを用いたＰＣＲによって、または他の高処理能力技術によって、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子におけるＴ−ＤＮＡの挿入について植物をスクリーニングすることができる。挿入変異原としてのＴ−ＤＮＡの概説については、たとえば、Ｋｒｙｓａｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１１：２２８３−２２９０を参照のこと。トランスポゾンを用いた挿入変異誘発も採用されてもよい。

【0167】

種々の形態の変異誘発によって突然変異（欠失、挿入および点突然変異を含む）を植物細胞のゲノムに無作為に導入して非天然の変異体を作り出すことができる。種子を含む植物素材の変異誘発の方法および所望の表現型についてのその後のスクリーニングまたは選択は、ＷＯ２００９１０９０１２に記載されているように周知である。突然変異を起こした植物および植物細胞も、たとえば、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷）によって、ＣＯＤＭおよび／またはＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子における突然変異について具体的にスクリーニングすることができる。天然の植物集団に存在する機能喪失突然変異はＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧによって特定することができる。

【0168】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて機能喪失突然変異がいったん特定されると、従来の育種法を介してそれらを組み合わせ、双方の遺伝子座にて機能喪失突然変異についてホモ接合型である植物を生産することができる。或いは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて特定された機能喪失突然変異を、遺伝子改変によって導入されるＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子における突然変異と組み合わせることができ、逆もまた同様である。或いは、ＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子にて特定された機能喪失突然変異を、上記に記載されているようにＴ６ＯＤＭの発現を低下させるように設計された発現構築物を含む遺伝子改変と組み合わせることができ、逆もまた同様である。

【0169】

アルカロイドの回収および分析
ケシの栽培およびアヘンの回収には従来、種子鞘を手動で切開し、乳状液を回収する工程が関与した。しかしながら、モルヒネおよび関連化合物をケシ殻から抽出する方法は従来の技法を回避したが、高品質の種子および薬学上価値のある原料を同時に入手することを可能にする。ケシ植物のケシ殻または乳状液からテバインを回収することはＷＯ２００９１０９０１２に記載されているように当該技術で周知である。以下に記載されている特定の方法に加えて、ケシ殻または乳状液からのアルカロイド抽出物を分析する方法もＷＯ２００９１０９０１２にて議論されている。

【実施例】

【0170】

図２を参照して本発明者は、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする遺伝子を標的とする単一のヘアピン構築物を使用して、親植物に比べて高レベルのテバイン（および低レベルのコデインとモルヒネ）を含有する植物はＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭ酵素の活性を同時に低下させることによって作製することができるという仮説を調べた。

【0171】

図３を参照して、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの遺伝子のコーディング配列は非常に増加したレベルの同一性を有する。従って、本発明者はＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子とＴ６ＯＤＭのコーディング配列の一部に由来するＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子との双方をＲＮＡｉによって標的とするための単一の発現構築物を作り出した。図２で示したＲＮＡｉ遺伝子構築物のセンスおよびアンチセンスの部分に使用したＴ６ＯＤＭのコーディング配列の一部に図３で下線を引く。プライマーＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＡＴおよびＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣを用いてケシ植物材料から単離されたｃＤＮＡから３４２塩基対のセンス断片を増幅した。プライマー（ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＡＴ）、ＯＰＰ０２６（ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣ）を用いてケシ植物材料から単離されたｃＤＮＡから３４２塩基対のアンチセンス断片を増幅した。これら２つの断片を用いてβ−グルクロニダーゼに由来する配列を間に挟んだこれら２つの断片を伴うヌクレオチド分子を作り出した。

【0172】

転写されてヘアピンＲＮＡを作る核酸分子の配列は配列番号６として提供されている。Ｔ６ＯＤＭの配列には下線を引くのに対してＴ６ＯＤＭの配列間に介在する「ヘアピン」配列はβ−グルクロニダーゼのコーディング配列に由来する。

【0173】

カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびオクトピンシンターゼに由来する転写終結配列および翻訳終結配列と共に配列番号６を含む完全な発現構築物をＴＤＮＡ転移ベクターにクローニングした。ベクターの左境界と右境界の間の配列は配列番号５として提供されるように提供されている。第１の下線領域（すなわち、「センス」Ｔ６ＯＤＭに特異的な配列）に対して５’の配列は３５Ｓプロモーター配列を含むのに対して、第２の下線領域（すなわち、「アンチセンス」Ｔ６ＯＤＭに特異的な配列）に対して３’の配列はオクトピンシンターゼに由来する転写終結配列および翻訳終結配列を含む。

【0174】

この発現構築物は従来のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびクローニング法（たとえば、制限酵素とライゲーションによる）の組み合わせを用いて生成された一方で、当業者は、重複伸長ＰＣＲクローニングまたは直接合成を含む種々の従来の技法を用いて構築物を作製してもよいことを理解するであろう。

【0175】

配列番号６を含む、右境界から左境界までのＴ−ＤＮＡ全体の配列は配列番号４として提供されている。

【0176】

ウイルスが誘導する遺伝子のサイレンシング（ＶＩＧＳ）を用いてＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子をサイレンシングする遺伝子カセットの能力を一時的に調べた。ＶＩＧＳは、対象とする遺伝子の断片を運ぶウイルスベクターを用いて、標的遺伝子のサイレンシングを開始させる二本鎖ＲＮＡを生成する植物ＲＮＡのサイレンシング法である。発現構築物を発現させるためにのＴＲＶ１（ヘルパープラスミド）およびｐＴＲＶ２（バイナリーベクター）ＴＲＶ系のＶＩＧＳベクター。浸潤後４８時間、７２時間、５日間、７日間および２週間で組織を採取した。図４ａおよび図４ｂで示すように、発現構築物の一時的な発現は、形質転換の４８時間後、ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子からの転写物の実質的な下方調節を生じた（上記図３ａおよび図３ｂの双方における右から最初の棒）。

【0177】

次いで、発現構築物によって安定して形質転換された植物を以下のプロトコールに従って生成した。

【0178】

形質転換プロトコール
ケシの胚軸／根の形質転換
必要な培地
ＬＢ
アグロバクテリウム浮遊培地
２０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＢ５塩およびビタミン、ｐＨ５．６〜５．８±０．２

【0179】

新芽発芽培地
２０ｇ／Ｌのスクロース、８ｇ／Ｌの寒天で補完された、半分に薄めたＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地

【0180】

一次カルス誘導培地
3０ｇ／Ｌのスクロース、２．０ｍｇ／ＬのＮＡＡおよび０．１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、８ｇ／Ｌの寒天を含有するＢ５培地

【0181】

体細胞胚誘導培地
１．０ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５０ｍｇ／Ｌのパロモマイシン、３００ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび８ｇ／Ｌの寒天を含有するＢ５培地

【0182】

胚誘導培地
３０ｇ／Ｌのスクロース、０．２５ｇ／ＬのＭＥＳ、０．２ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、２．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、８ｇ／Ｌの寒天で補完したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地。ｐＨは５．６±０．２。（に加えて抗生剤−チメンチン３００ｍｇ／Ｌ）

【0183】

胚の成熟および発芽
３０ｇ／Ｌのスクロース、０．２５ｇ／ＬのＭＥＳ、０．２ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、１ｍｇ／Ｌのベンジルアデニン、１ｍｇ／Ｌのゼアチン、２．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、８ｇ／Ｌの寒天で補完したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地。ｐＨは５．６±０．２。（に加えて抗生剤−チメンチン３００ｍｇ／Ｌ）

【0184】

植物ホルモンを含まない植物再生培地
５０ｍｇ／Ｌのパロモマイシン、３００ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび８ｇ／Ｌの寒天を含有するＢ５培地

【0185】

新芽伸長培地
３０ｇ／Ｌのスクロース、０．２５ｇ／ＬのＭＥＳ、０．２ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、０．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニン、２．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、８ｇ／Ｌの寒天で補完したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地。ｐＨは５．６±０．２。（に加えて抗生剤−チメンチン３００ｍｇ／Ｌ）

【0186】

発根培地
３０ｇ／Ｌのスクロース、０．２５ｇ／ＬのＭＥＳ、０．２ｇ／Ｌのミオ−イノシトール、２．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ_３、８ｇ／Ｌの寒天で補完したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地。ｐＨは５．６±０．２。（に加えて抗生剤−チメンチン３００ｍｇ／Ｌ）

【0187】

種子の滅菌および発芽
７０％（ｖｖ^−１）エタノールで３０秒間および１％（ｖｖ^−１）次亜塩素酸ナトリウム溶液で２分間をそれぞれ３回で種子の表面を滅菌し、次いで無菌水で５回すすいだ。およそ５０個の種子を瓶における２５ｍＬの寒天固化培地に載せた。基礎培地は、３０ｇ／Ｌのスクロースで補完し（Ｇａｍｂｏｒｇ，ｅｔ ａｌ．１９６８）、０．８％（ｗｖ^−１）の寒天で固化した１／２ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの基礎培地から成った。寒天を加える前に培地をｐＨ５．６〜５．８に合わせ、次いでオートクレーブによって滅菌した。標準の白色蛍光灯および１６時間の明期のもとで２５℃での生長室にて種子を発芽させた。

【0188】

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
バイナリーベクターｐＯＲＥ：：ＡＬＭ−ＭＩＲＭＡＣをエレクトロポレーションによってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５にて動員した。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび１００ｍｇ／Ｌのリファムピシンを含有する液状Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地［１％トリプトン、０．５％酵母抽出物、および１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０］にて１８０ｒｐｍでの旋回振盪器において２８℃でＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの培養物をＡ_６００＝０．８まで増殖させた。４０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって細菌細胞を回収し、液状植菌培地（２０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＢ５塩およびビタミン）にてＡ_６００＝０．５の細胞密度で再浮遊させた。

【0189】

トランスジェニック植物の生産
１２日齢の苗に由来する切り取られた子葉、ライン１１８を胚軸の長手二分によって単離した。液状植菌培地におけるＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの培養物に胚軸を１５分間浸け、無菌の濾紙上で乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地上で２５℃にて暗所でインキュベートした。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの共培養の２日後、５０ｍｇ／Ｌのパロモマイシンと３００ｍｇ／Ｌのチメンチンを含有する新しい一次カルス誘導培地に胚軸を移した。インキュベートの４〜５週間後、体細胞胚誘導培地にて一次カルスを継代した。誘導培地での培養の３週間後、体細胞胚を植物ホルモンを含まない植物再生培地に移した。成熟胚を植物ホルモンを含まない培地に入れ、未成熟胚を胚成熟および発芽の培地に移した。次いで最初の子葉が出現したら、それを新芽伸長培地に移植した。最終的に、新芽が約０．５〜１ｃｍであれば、それらを発根培地に入れた。再生された推定上のトランスジェニック小植物を標準の白色蛍光灯および１６時間の明期のもとで２５℃での生長室にて生長させた。次いで、発根した小植物を加熱滅菌した土壌を含有するポットに移し、ポリエチレン袋で１週間覆って高湿度を持続させ、２５℃で１〜２週間、生長室で維持し、その後、植物を温室に移した。

【0190】

方法
（１）アグロバクテリウムにおける所望の構築物の単一コロニーを摘み取り、適当な抗生剤を含有する２ｍＬのＬＢ液体培地にそれを植菌し、２８℃で一晩培養して始動培養物を調製する。
（２）始動培養物と共に適当な抗生剤を含有する１００ｍＬのＬＢ液体培地を植菌し、２８℃で一晩培養する。所望のＯＤ_６００＝０．５〜０．８が達成されるまで細胞をインキュベートする。
（３）４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞をペレットにする。
（４）最終ＯＤ_６００＝０．５までアグロバクテリウム浮遊培地にて細胞を再浮遊させる。
（５）アグロバクテリウム浮遊液に浸しながら、１２日齢の苗に由来する根および胚軸のセグメントを約５ｍｍのセグメントに切断する。
（６）時折回転させながら、アグロバクテリウム浮遊液にてペトリ皿で１５分間、根および胚軸のセグメントをインキュベートする。
（７）無菌の濾紙上で根および胚軸のセグメントを乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地を含有するプレートに移す。暗下（アルミホイルで覆った）での生長キャビネットにて２２±２℃で２日間インキュベートする。
（８）共培養の２日後、無菌蒸留水で根および胚軸のセグメントを洗浄し、無菌の濾紙上で乾燥ブロットし、一次カルス誘導培地（抗生剤パロモマイシンを加えた）を含有するプレートに移す。
（９）暗所（アルミホイルで覆った）での標準の条件（１６／８時間明期）の生長室にて植物をおよそ４〜５週間インキュベートする。
（１０）インキュベートの４〜５週間後、一次カルスを体細胞胚誘導培地（抗生剤パロモマイシンを加えた）で継代した。
（１１）誘導培地における培養の３週間後、成熟体細胞胚を植物ホルモンを含まない培地（抗生剤なし）に移した。未成熟の胚を胚成熟および発芽の培地（抗生剤なし）での別の回の選択に配置し、胚が成熟し、発芽し始めるまで１６／８時間明期のもとでの生長キャビネットにて２２±２℃でインキュベートした。
（１２）発芽している胚を、新芽伸長培地を含有するプレートに新芽が出現するまで移し、その後、発根培地に移す。
（１３）約０．５〜１．０ｃｍの新芽を発根培地に移す。
（１４）発根した小植物を水道水のもとで洗浄し、付着している寒天全体を取り除き、次いで小ポットにおける無菌土壌に移し、サランラップ（登録商標）で覆い、順化のために生長キャビネットにてインキュベートした。
（１５）得られた推定上の形質転換体を導入遺伝子の存在および発現について分析する。
注：発根培地には抗生剤は含まれない。

【0191】

化学薬品
（１）５０ｍｇ／ｍＬのパロモマイシン硫酸塩のストック：粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（２）５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンのストック：粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（３）１００ｍｇ／ｍＬのリファムピシンのストック：粉末をＤＭＳＯに溶解することによって調製し、等分し、−２０℃で保存する。
（４）３００ｍｇ／ｍＬのチメンチンのストック：粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（５）２．０ｍｇ／ｍＬのＮＡＡのストック：粉末を１ＮのＮａＯＨに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（６）２．０ｍｇ／ｍＬのＢＡＰのストック：粉末を１ＮのＮａＯＨに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（７）５ｍｇ／ｍＬのＡｇＮＯ_３のストック：粉末を水に溶解することによって調製し、濾過によって滅菌し、＋４℃で保存する。
（８）１．０ｍｇ／ｍＬのゼアチンのストック：粉末を１ＮのＮａＯＨに溶解することによって調製し、水で容量を調整し、濾過によって滅菌し、等分し、−２０℃で保存する。
（９）培地に使用する化学薬品はすべて、約５０℃に冷却した時点で加熱滅菌した培地に加える。９０×２５ｍｍのペトリ皿に注ぐ前に回転して培地を十分に混合する。

【0192】

再生したトランスジェニック植物の特徴付け
発現構築物を含むＴ−ＤＮＡは、パロマイシンへの耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子を含んだ。６つの小植物（ＡＭ１〜ＡＭ６）がパロモマイシンに耐性として特定されたということは、これらの植物が発現構築物で形質転換されたことを示唆している。ヘアピン発現構築物に特異的なプライマー（配列番号９，ＴＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ；配列番号１０，ＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧ）を用いたこれらの小植物から単離されたゲノムＤＮＡでのポリメラーゼ鎖反応は、植物ＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３がゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを含有することを示した。アクチン用のプライマー（配列番号１１，ＣＧＴＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＴ；配列番号１２，ＴＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴ）を陽性対照として用いて試料がＰａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍに由来するゲノムＤＮＡを含有することを確認した。

【0193】

図４を参照して、ヘアピンに特異的なプライマー（配列番号９，ＴＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＣＴＧＣＣＣＣＧＡ；配列番号１０，ＡＡＡＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧ）を用いて植物ＡＭ１〜ＡＭ６からのＲＮＡ抽出物で逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、発現構築物が植物ＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３で発現されていることを実証した。

【0194】

ＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭをコードする内在性の転写物に特異的なプライマーを用いて植物ＡＭ１〜ＡＭ６からのＲＮＡ抽出物でＲＴ−ＰＣＲを行った。図５を参照して、発現構築物の発現は、発現構築物を発現していない植物と比べてＴ６ＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を下方調節するのに十分であると思われた。図６を参照して、発現構築物の発現は、発現構築物を発現していない植物と比べてＣＯＤＭをコードする内在性遺伝子の発現を下方調節するのに十分であると思われた。

【0195】

アルカロイドの分析
酸性抽出：０．１００ｇの粉砕したさく果または茎（ポピーに由来する）を１０％酢酸、１０％水および８０％メタノールの溶液５ｍＬと混合し、その後３０分間撹拌し、次いで濾過した。濾液を直接ＨＰＬＣに注入した。

【0196】

２８０ｎｍ、４５℃の温度および０．８ｍＬ／分の流速で操作する２μＬの注入容量でのＫｉｎｅｔｅｘ２．６μｍのＣ１８、５０×２．０ｍｍのカラムを有するＨＰＬＣ勾配システムで試料すべてを流した。溶離液Ａは１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．５であったのに対して溶離液Ｂはアセトニトリル（１００％）だった。勾配プロファイルは以下のとおりである。
工程番号 時間（分） パーセントＡ パーセントＢ
１ ０ ９５ ５
２ ０．２５ ８５ １５
３ ２．００ ６０ ４０
４ ２．０１ ９５ ５
５ ３．００ ２０ ８０
６ ４．００ １０ ９０
７ ５．００ ０ １００
報告された数字は乾燥出発物質の重量パーセントである。

【0197】

図７Ａ〜図７Ｄを参照して、ＡＭ１のさく果およびＡＭ２およびＡＭ３の葉におけるアルカロイドの分析は、発現構築物が存在せず、野生型レベルのＴ６ＯＤＭおよびＣＯＤＭの発現を有する植物と比べてテバインの増加した蓄積およびモルヒネの低い蓄積を示した。ＡＭ２およびＡＭ３植物のさく果におけるアルカロイドのその後の分析は、テバインがＡＭ２のさく果にてアルカロイドの４．８２％まで蓄積し、ＡＭ３のさく果にて全アルカロイドの３．１３％まで蓄積することを示した。ＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３の植物ではモルヒネは実質的に検出されなかった。

【0198】

【表1】

【0199】

自家受粉したＡＭ１、ＡＭ２およびＡＭ３の形質転換体の子孫が３：１に分離すると思われることは、導入遺伝子が安定して組み込まれ、遺伝することを示している。

【0200】

発現構築物を運び、内在性のＣＯＤＭおよびＴ６ＯＤＭの転写物が検出され得ない６つの追加の個々の形質転換体を単離した（ＡＭ１２、ＡＭ１３、ＡＭ１６、ＡＭ１７およびＡＭ１９）。これらの追加の植物のさく果における分析は、テバインがさく果にてアルカロイドの８．２８％まで多く蓄積することを示した（表２を参照のこと）。

【0201】

【表2】

【0202】

発現構築物を含有するＡＭ１の子孫種子から植物を生長させた。発現構築物を運んでいる６つのＡＭ１の子孫に由来するケシ殻におけるモルヒネ、オリパビン、コデインおよびモルヒネの濃度を表３にて提供する。

【0203】

【表3】

【0204】

操作
本発明の特定の実施形態が記載され、説明されてきた一方で、そのような実施形態は本発明の説明のみと見なされるべきであり、添付のクレームに従って解釈されるような本発明を限定すると見なされるべきではない。

【0205】

本記載はＡＳＣＩＩテキスト形式での電子形態で配列表を含有する。配列表における配列は以下のテーブルで再現される。

【0206】

【化1】

【0207】

【化2】

【0208】

【化3】

【0209】

【化4】

【0210】

【化5】

【0211】

【化6】

【0212】

【化7】

【0213】

【化8】

【0214】

【化9】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]