特許 6907477 細胞培養方法及び細胞培養装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6907477

(24)【登録日】2021年7月5日

(45)【発行日】2021年7月21日

(54)【発明の名称】細胞培養方法及び細胞培養装置

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20210708BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20210708BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20210708BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/07

   C12M3/00 A

   C12M1/00 A

【請求項の数】13

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2016-145823(P2016-145823)

(22)【出願日】2016年7月25日

(65)【公開番号】特開2018-14898(P2018-14898A)

(43)【公開日】2018年2月1日

【審査請求日】2019年5月23日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000206

【氏名又は名称】宇部興産株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100128495

【弁理士】

【氏名又は名称】出野 知

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100144417

【弁理士】

【氏名又は名称】堂垣 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】萩原 昌彦

(72)【発明者】

【氏名】布施 新作

【審査官】 林 康子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０１２４１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１６−０５４７３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１７０９３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０４１９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３８６１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０３６８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Heterocyclic Chemistry，１９９５年，Vol.32, No.4，pp.1117-24

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が載置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部が収容された筐体と、
前記筐体の内部に配置された液滴化培地供給部と、
前記液滴化培地供給部と連通した培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに連通した培地貯留部と、
前記培地供給ラインの一部に設けられたポンプと、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜であり、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えた、
細胞培養装置。

【請求項2】

前記液滴化培地供給部が、前記ポリマー多孔質膜載置部の上部、下部及び／又は側部に１以上配置された、請求項１に記載の細胞培養装置。

【請求項3】

前記ポリマー多孔質膜載置部が２段以上である、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。

【請求項4】

前記培地貯留部が、前記筐体の内部であって、前記ポリマー多孔質膜載置部の下部に配置され、培地が循環することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項5】

前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれた、
ｉｉ）ロール状に巻き込こまれた、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結された、
ｉｖ）縄状に結まれた、及び／又は
ｖ）２以上が積層された
ポリマー多孔質膜である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項6】

前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記ケーシングが２以上の細胞培地流出入口を有し、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項7】

前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項8】

前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項9】

前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項10】

前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項11】

前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項12】

前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリマー多孔質膜を用いた細胞の培養方法に関する。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術はコストが高く、それが医療費を引き上げていた。そのため、大幅なコスト削減を目指して、高密度に細胞を培養する技術や、タンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。

【0003】

タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それがコストを増大させる要因となっていた。

【0004】

培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがコストを増大させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。

【0005】

＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。

【0006】

細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００３／０５４１７４号

【特許文献2】国際公開第２０１０／０３８８７３号

【特許文献3】特開２０１１−２１９５８５号公報

【特許文献4】特開２０１１−２１９５８６号公報

【特許文献5】国際公開第２０１５／０１２４１５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、ポリマー多孔質膜を使用した細胞の培養方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、乾燥に強い湿潤環境を提供することを見出し、液滴化培地を適用することで酸素を効率的に供給しながら大量の細胞を培養する方法及び装置を完成させた。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。

【0010】

［１］ 細胞の培養方法であって、
（１）細胞をポリマー多孔質膜に適用することと、
（２）細胞を適用したポリマー多孔質膜に、液滴化培地供給手段によって液滴化された培地を適用しながら気相中で培養すること、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、
方法。
［２］ 前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれた、
ｉｉ）ロール状に巻き込こまれた、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結された、
ｉｖ）縄状に結まれた、及び／又は
ｖ）２以上が積層された
ポリマー多孔質膜である、［１］に記載の方法。
［３］ 前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記ケーシングが２以上の細胞培地流出入口を有し、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、［１］に記載の方法。
［４］ 前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［６］ 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］ 前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］ 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。

【0011】

［１２］ ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が載置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部が収容された筐体と、
前記筐体の内部に配置された液滴化培地供給部と、
前記液滴化培地供給部と連通した培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに連通した培地貯留部と、
前記培地供給ラインの一部に設けられたポンプと、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えた、細胞培養装置。
［１３］ 前記液滴化培地供給部が、前記ポリマー多孔質膜載置部の上部、下部及び／又は側部に１以上配置された、［１２］に記載の細胞培養装置。
［１４］ 前記ポリマー多孔質膜載置部が２段以上である、［１２］又は［１３］に記載の細胞培養装置。
［１５］ 前記培地貯留部が、前記筐体の内部であって、前記ポリマー多孔質膜載置部の下部に配置され、培地が循環することを特徴とする、［１２］〜［１４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１６］ 前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれた、
ｉｉ）ロール状に巻き込こまれた、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結された、
ｉｖ）縄状に結まれた、及び／又は
ｖ）２以上が積層された
ポリマー多孔質膜である、［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１７］ 前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記ケーシングが２以上の細胞培地流出入口を有し、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものである、［１２］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１８］ 前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１２］〜［１７］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１９］ 前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１２］〜［１８］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［２０］ 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１２］〜［１９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［２１］ 前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１２］〜［２０］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［２２］ 前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１２］〜［２１］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［２３］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［２２］に記載の細胞培養装置。
［２４］ 前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［２２］又は［２３］に記載の細胞培養装置。
［２５］ 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１２］〜［２１］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。

【0012】

［２６］ ［１２］〜［２４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明で使用するポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境を提供する。そのため、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても、担持した細胞が乾燥することなく、培養することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜に液滴化された培地を適用しながら培養することによって、用いる培地の量が極めて少なくなる。さらに、液滴化された培地を適用しながら培養することで、酸素を効率的に供給しながら大量の細胞を培養することが可能となる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。また、小さな液滴を使用する事により、多数の方向から任意の方向に培地を供給可能となる為、各箇所に存在する細胞を含んだポリマー多孔膜やモジュール化ポリマー多孔質膜に対し、均質に培地を供給出来る事となる。（図１及び２）

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。

【図2】図２は、実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。

【図3】図３は、ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。

【図4】図４は、実施例で使用した細胞培養装置を示す図である。（Ａ）全体図、（Ｂ）（Ａ）の筐体部分の拡大図

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。

【0016】

１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。

【0017】

本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。

【0018】

ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。

【数1】

（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）

【0019】

表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。

【0020】

ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。

【0021】

本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。

【0022】

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。

【0023】

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。

【0024】

本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。

【数2】

（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ^３とする。）

【0025】

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。

【0026】

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。

【0027】

本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。

【0028】

１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。

【0029】

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。

【0030】

一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。

【0031】

ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。

【0032】

ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。

【0033】

ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。

【0034】

本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。

【0035】

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。

【0036】

着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。

【0037】

炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。

【0038】

また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。

【0039】

着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。

【0040】

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0041】

これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。

【0042】

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。

【0043】

これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。

【0044】

これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。

【0045】

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。

【0046】

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。

【0047】

本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。

【0048】

例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。

【0049】

１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。

【0050】

アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。

【0051】

二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。

【0052】

ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学（株）製）等が挙げられる。

【0053】

ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。

【0054】

また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。

【0055】

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。

【0056】

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。

【0057】

２．細胞の培養方法

【0058】

本発明の一態様は、
細胞の培養方法であって、
（１）細胞をポリマー多孔質膜に適用することと、
（２）細胞を適用したポリマー多孔質膜に、液滴化培地供給手段によって液滴化された培地を適用しながら気相中で培養すること、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、方法に関する。本発明の細胞の培養方法を、以下で、「本発明の細胞の培養方法」とも呼ぶ。

【0059】

本発明に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いた培養方法と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、液滴化した培地を適用することによって、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができる培養方法を提供する。

【0060】

本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。

【0061】

本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。

【0062】

本明細書において、「液滴化培地」とは、ミスト状化又は水滴化された培地をいい、本発明に用いられるポリマー多孔質膜に噴射又は噴霧可能な状態の培地をいう。液滴化培地の径は限定されないが、例えば、重力によって自由落下せず、空気中に浮遊可能な程度に小さいミスト状の液滴化培地であってもよい。ミスト状の液滴化培地の径は、例えば、１μｍ〜１００μｍ程度であってもよく、さらに小さい径であってもよい。また、液滴化培地は、例えば、重力によって自由落下する水滴状の培地であってもよく、例えば、１００μｍ以上であってもよい。培地を液滴化する方法については、公知の手段により液滴化する方法を用いればよく、例えば、ミスト状ノズルやシャワーノズル等を用いて液滴化させればよい。ただし、液滴化方法は、培地の成分を変化させない方法によって液滴化されなければならず、例えば、液滴化させる方法からは、蒸発させる方法は除かれる。

【0063】

本発明の実施態様において、液滴化培地は、細胞を担持したポリマー多孔質膜へ適用される。液滴化した培地は、ポリマー多孔質膜へ到達するまでの間に気相を通過し、培地中に酸素が溶け込むことになる。これにより、十分な量の酸素を有する培地が、継続的に供給されることとなり、細胞が虚血に陥ることなく、培養することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜が常に気相に暴露されているため、ポリマー多孔質膜に付着している培地も常に酸素を取り込むことが可能となり、酸素を効率的に供給できる培養が可能となる。

【0064】

本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳まれた、ｉｉ）ロール状に巻き込こまれた、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結された、ｉｖ）縄状に結まれた、及び／又は、ｖ）２以上が積層された、ポリマー多孔質膜であってもよい。ｉ）〜ｖ）の形状のポリマー多孔質膜を使用することにより、一定空間に多くの細胞を培養可能となる。

【0065】

本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜（以下、「モジュール化ポリマー多孔質膜」という。）が使用されてもよい。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜をいう。

【0066】

本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜が備えるケーシングは、２以上の細胞培地流出入口を有し、該細胞培地流出入口によって培地がケーシングの内外へ流出入する。該ケーシングの細胞培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、細胞培地流出入口の径が、該細胞培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該細胞培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。細胞培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に細胞培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。

【0067】

本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜のケーシングは、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。

【0068】

本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
該ケーシング内に収容されたものであって、該モジュール化ポリマー多孔質膜を適用することが可能である。

【0069】

本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうる。

【0070】

本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。

【0071】

本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。

【0072】

３．細胞培養装置

【0073】

本発明の一態様は、
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が載置されたポリマー多孔質膜載置部と、
前記ポリマー多孔質膜載置部が収容された筐体と、
前記筐体の内部に配置された液滴化培地供給部と、
前記液滴化培地供給部と連通した培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに連通した培地貯留部と、
前記培地供給ラインの一部に設けられたポンプと、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えた、細胞培養装置に関する。

【0074】

本発明に用いられる、ポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いた培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、液滴化した培地を適用することによって、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができる培養装置を提供する。該細胞培養装置を、以下で、「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。

【0075】

図１は、本発明の細胞培養装置の構成例を示す図である。ポリマー多孔質膜載置部には、ポリマー多孔質膜が載置されている。ポリマー多孔質膜載置部に適用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳まれた、ｉｉ）ロール状に巻き込こまれた、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結された、ｉｖ）縄状に結まれた、及び／又は、ｖ）２以上が積層された、ポリマー多孔質膜であってもよい。ｉ）〜ｖ）の形状のポリマー多孔質膜を使用することにより、一定空間で多くの細胞を培養可能となる。ポリマー多孔質膜載置部は、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えている。培地排出口を備えていることによって、液滴化培地供給部から供給された培地を、下部へ排出することが可能となる。培地排出口の形状や大きさ、数は、載置するポリマー多孔質膜が落下しないように適宜選択すればよい。

【0076】

本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、上述と同様、モジュール化ポリマー多孔質膜が使用されてもよい。

【0077】

本実施形態において、細胞培養装置は、ポリマー多孔質膜載置部を収容する筐体を備えており、該筐体の内部には、培地を液滴化してポリマー多孔質膜へ供給するための液滴化培地供給部を備えている。液滴化培地供給部は、例えば、公知のミスト状ノズルやシャワーノズルを採用することが可能である。筐体を備えていることで、液滴化培地供給部から供給される液滴化培地が、筐体内部に充満し、効率的にポリマー多孔質膜へ供給されることとなる。筐体の形状、大きさについては、培養する細胞の量や適用するポリマー多孔質膜の量などに応じて適宜選択すればよい。

【0078】

液滴化培地供給部には、培地供給ラインが連通しており、該培地供給ラインには、培地貯留部が連通している。また、培地供給ラインの一部には、液滴化培地供給部へ培地を送るためのポンプが設けられている。培地貯留部は液滴化培地供給部から放出される培地が貯留されている。図示されるにように、培地貯留部は、ポリマー多孔質膜載置部の直下に配置され、ポリマー多孔質膜に適用された後に落下してきた培地を貯留する構成であって、培地が細胞培養装置中で循環する構成であってもよい。また、培地貯留部は、図のようにポリマー多孔質膜載置部の位置とは関係なく、別途独立して設けてもよい。この場合、ポリマー多孔質膜載置部の直下には、ポリマー多孔質膜に適用された後に落下してきた培地を貯留する容器等を別途設ける必要がある。ポンプによって液滴化培地供給部に送られる培地の速度は、適宜選択することが可能である。

【0079】

図２は、本発明の細胞培養装置の他の構成例を示す図である。ポリマー多孔質膜載置部は、図のように、２段以上設けられてもよい。これによって、単位体積あたりの培養細胞数を増大させることが可能となる。また、液滴化培地供給部は、ポリマー多孔質膜載置部の上部、下部及び／又は側部に１以上、好ましくは２以上配置されてもよい。これにより、ポリマー多孔質膜に効率的に培地が供給されることとなり、大量の細胞培養が可能となる。液滴化培地供給部の配置は、細胞培養装置の大きさ、ポリマー多孔質載置部の配置などによって適宜最適化することが可能である。

【0080】

４．細胞培養装置を使用した細胞培養方法

【0081】

＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。

【0082】

（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。

【0083】

（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。

【0084】

ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。

【0085】

（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。

【0086】

あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。

【0087】

例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。

【0088】

（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。

【0089】

（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。

【0090】

限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。

【0091】

態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、（＋）及び（−）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ 、（＋）及び（−）Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。

【0092】

【表1】

【0093】

さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。

【0094】

上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置１における、細胞培養部２へ適用して、培養することが可能である。

【0095】

その他、予め、ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部２に、懸濁された細胞が含まれる培地を、細胞供給手段３より滴下して播種してもよい。

【0096】

本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。

【0097】

本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。

【0098】

本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。

【0099】

本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。

【0100】

「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。

【0101】

「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。

【0102】

「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。

【0103】

細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。

【0104】

本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。

【0105】

ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。

【0106】

本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図３参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図３参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。

【0107】

本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。

【0108】

つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。

【0109】

本発明の細胞の培養方法において、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０^５個以上、１．０×１０^６個以上、２．０×１０^６個以上、５．０×１０^６個以上、１．０×１０^７個以上、２．０×１０^７個以上、５．０×１０^７個以上、１．０×１０^８個以上、２．０×１０^８個以上、５．０×１０^８個以上、１．０×１０^９個以上、２．０×１０^９個以上、または５．０×１０^９個以上となるまで培養することをいう。

【0110】

なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。

【0111】

また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０５個以上、２．０×１０^５個以上、１．０×１０^６個以上、２．０×１０^６個以上、５．０×１０^６個以上、１．０×１０^７個以上、２．０×１０^７個以上、５．０×１０^７個以上、１．０×１０^８個以上、２．０×１０^８個以上、または５．０×１０^８個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。

【実施例】

【0112】

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

【0113】

以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。

【0114】

（実施例１）
ミスト及びシャワー型リアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法

【0115】

抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標） ＣＨＯ ＧＲＯＷＴＨ Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、３．９×１０^６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ１枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ^２）加えて封じたモジュール１２個を同シャーレに加えた。モジュールを細胞懸濁液で湿潤した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した。

【0116】

翌日、モジュールを取り出し、図４に示すミスト及びシャワー型リアクターの内部にモジュール１２個を設置し、培地貯留部には、２００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。２日後に培養を終了した所、細胞密度３．４×１０^４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で総細胞数８．２×１０^６個の細胞が観察された。

【0117】

（実施例２）
ミスト及びシャワー型リアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法

【0118】

抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標） ＣＨＯ ＧＲＯＷＴＨ Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０^６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。

【0119】

翌日、振盪バッグよりモジュールを取り出し、実施例１と同様の条件で、ミスト及びシャワー型リアクターによる細胞培養を行った。液溜めには、２００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度８．８×１０^４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で総細胞数１．８×１０^７個の細胞が観察された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】