特許 6908710 ケモカイン受容体ＣＣＲ４を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6908710

(24)【登録日】2021年7月5日

(45)【発行日】2021年7月28日

(54)【発明の名称】ケモカイン受容体ＣＣＲ４を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20210715BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210715BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210715BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20210715BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210715BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210715BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20210715BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210715BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K16/28

   C07K14/725

   C12N15/62 Z

   C12N15/13

   C12N15/12

   C12N15/86 Z

   C12N15/867 Z

   C12N5/10

   C12N5/0783

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K35/17 A

   A61K35/76

【請求項の数】51

【全頁数】81

(21)【出願番号】特願2019-537030(P2019-537030)

(86)(22)【出願日】2017年9月20日

(65)【公表番号】特表2019-536469(P2019-536469A)

(43)【公表日】2019年12月19日

(86)【国際出願番号】US2017052437

(87)【国際公開番号】WO2018057585

(87)【国際公開日】20180329

【審査請求日】2020年9月17日

(31)【優先権主張番号】62/397,810

(32)【優先日】2016年9月21日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】508285606

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(73)【特許権者】

【識別番号】513171172

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ レプリゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ペレラ， リヤナーゲ パラクラーマ

(72)【発明者】

【氏名】ウォルドマン， トーマス アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ペレラ， ピン−ユー

(72)【発明者】

【氏名】コンロン， ケビン チャールズ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／１００９８５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１５−５１７４７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１３３９４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む細胞外ｓｃＦｖであって、ＣＣＲ４に特異的に結合し、前記重鎖可変ドメインが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸２６〜３３からなり、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１のアミノ酸５１〜５８からなり、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７からなり、前記軽鎖可変ドメインが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２のアミノ酸２７〜３８からなり、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸５６〜６１からなり、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２からなる、細胞外ｓｃＦｖ；
（ｂ）ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン；
（ｃ）細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン；ならびに
（ｄ）細胞内ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含むキメラ抗原受容体であって、（ａ）〜（ｄ）が、Ｎ末端からＣ末端の順である、キメラ抗原受容体。

【請求項2】

ＣＤ８由来の前記ヒンジおよび前記膜貫通ドメインが、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメインが、配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号９として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸分子。

【請求項7】

前記Ｖ_Ｌをコードする核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも９５％同一であり、コードされたＬＣＤＲ１が、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。

【請求項8】

前記Ｖ_Ｈをコードする核酸配列が、配列番号１３に対して少なくとも９５％同一であり、コードされたＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。

【請求項9】

前記Ｖ_Ｈが、配列番号１３の核酸配列によってコードされ、かつ／または前記Ｖ_Ｌが、配列番号１２の核酸配列によってコードされる、請求項７または請求項８に記載の単離された核酸分子。

【請求項10】

ｓｃＦｖがリンカーを含み、前記リンカーが、配列番号１４の核酸配列によってコードされる、請求項６から９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項11】

前記キメラ抗原受容体が、免疫グロブリンシグナル配列を含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項12】

前記免疫グロブリンシグナル配列が、配列番号１１に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、シグナル配列として機能する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。

【請求項13】

配列番号１１の核酸配列を含む、請求項１２に記載の単離された核酸分子。

【請求項14】

前記ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジが、配列番号１５に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジとして機能する、請求項７から１３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項15】

配列番号１５の核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離された核酸分子。

【請求項16】

前記４−１ＢＢシグナル伝達分子が、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、４−１ＢＢシグナル伝達分子として機能する、請求項７から１５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項17】

配列番号１６の核酸配列を含む、請求項１６に記載の単離された核酸分子。

【請求項18】

前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子が、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子として機能する、請求項７から１７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項19】

配列番号１７の核酸配列を含む、請求項１８に記載の単離された核酸分子。

【請求項20】

ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項７から１９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。

【請求項21】

配列番号１８の核酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された核酸分子。

【請求項22】

請求項７から２１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項23】

ウイルスベクターである、請求項２２に記載の発現ベクター。

【請求項24】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。

【請求項25】

請求項２２から２４のいずれか一項に記載のベクターを形質導入された、ＣＤ３^＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞。

【請求項26】

前記ＣＤ３^＋Ｔ細胞が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項２５に記載のＣＤ３^＋Ｔ細胞。

【請求項27】

ヒトＴ細胞である、請求項２５または２６に記載のＣＤ３^＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞。

【請求項28】

請求項２２から２４のいずれか一項に記載のベクターの有効量または請求項２５から２７のいずれか一項に記載のＣＤ３＋Ｔ細胞および／もしくはナチュラルキラー細胞の治療有効量、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項29】

ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍を有する対象を処置するための、請求項２８に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物の治療有効量が前記対象に投与されることを特徴とする、医薬組成物。

【請求項30】

前記医薬組成物が前記Ｔ細胞を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記Ｔ細胞が、前記対象にとって自家である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記医薬組成物が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、請求項３０または請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記成人Ｔ細胞白血病が慢性成人Ｔ細胞白血病である、請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記医薬組成物が、前記対象においてＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞の数を低減させる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項36】

ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍を有する対象を処置するための方法における使用のための、キメラ抗原受容体を発現する自家の形質導入された細胞を含む組成物であって、前記方法が、
前記対象由来のＣＤ３＋Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞に、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の発現ベクターを形質導入して、前記キメラ抗原受容体を発現する自家の形質導入された細胞を産生するステップ；ならびに
前記組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって、前記対象においてＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する前記悪性腫瘍を処置するステップ
を含む、組成物。

【請求項37】

前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

前記成人Ｔ細胞白血病が、慢性成人Ｔ細胞白血病、急性成人Ｔ細胞白血病、くすぶり型Ｔ細胞白血病またはリンパ腫型Ｔ細胞白血病である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記対象がヒトである、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

前記悪性腫瘍がリンパ系悪性腫瘍である、請求項２９から３２、３５または３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、請求項２９から３２、３５または３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

前記固形腫瘍が、乳、卵巣、胃または食道がんである、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

対象において悪性腫瘍を処置するための、請求項２８に記載の医薬組成物であって、前記悪性腫瘍がＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する、医薬組成物。

【請求項44】

前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

前記成人Ｔ細胞白血病が、慢性成人Ｔ細胞白血病、急性成人Ｔ細胞白血病、くすぶり型Ｔ細胞白血病またはリンパ腫型Ｔ細胞白血病である、請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項47】

前記固形腫瘍が、乳、卵巣、胃または食道がんである、請求項４６に記載の医薬組成物。

【請求項48】

前記対象がヒトである、請求項４３から４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項49】

前記医薬組成物が前記Ｔ細胞を含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項50】

前記Ｔ細胞が、前記対象にとって自家である、請求項４９に記載の医薬組成物。

【請求項51】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、請求項４９または５０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月２１日に出願された米国仮出願番号第６２／３９７，８１０号の利益を主張しており、この仮出願はその全体が本明細書中に参考として援用される。

【0002】

開示の分野
本発明は、悪性腫瘍の分野、特に、ＣＣＲ４に特異的に結合するキメラ抗原受容体、および対象において悪性腫瘍を処置するなどの処置のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
Ｃ−Ｃモチーフケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）は、造血系の細胞上で選択的に発現される７回膜貫通Ｇタンパク質共役細胞表面受容体分子（あるいは、ＣＤ１９４と呼ばれる）である（YoshieおよびMatsushima、Int Immunol.２０１５年；２７巻（１号）：１１〜２０頁；SolariおよびPease、Eur J Pharmacol.２０１５年；. pii: S0014-2999(15)30011）。健康な個体の末梢血では、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、Ｔ_Ｈ２およびＴ_Ｈ１７Ｔ細胞ならびに血小板は、ＣＣＲ４発現の優勢を示す（Hiraharaら、J Immunol.２００６年；１７７巻（７号）：４４８８〜４４９４頁；D'Ambrosioら、J Immunol.１９９８年；１６１巻（１０号）：５１１１〜５１１５頁；Annunziatoら、J Exp Med.２００７年；２０４巻（８号）：１８４９〜１８６１頁；Clemetsonら、Blood.２０００年；９６巻（１３号）：４０４６〜４０５４頁；Abi-Younesら、Thromb Res.２００１年；１０１巻（４号）：２７９〜２８９頁）。他のケモカイン受容体で見られるように、ＣＣＲ４は、そのリガンド特異性においていくらかのレベルの混乱を示すが、Ｃ−ＣケモカインＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２は、この受容体の主要な高親和性リガンドであり、一方ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１およびＲＡＮＴＥＳもまた、顕著なリガンド活性を示す（Andrewら、J Immunol.１９９８年；１６１巻（９号）：５０２７〜５０３５頁；Imaiら、J Biol Chem.１９９８年；２７３巻（３号）：１７６４〜１７６８頁；Zlotnikら、Immunity.２０００年；１２巻（２号）：１２１〜１２７頁）。特にストロマ細胞によるＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２の異常な過剰発現は、乳、卵巣、胃および食道がんを含む種々の新生物において、ならびにホジキン病などのリンパ系悪性腫瘍において見られる（Gobertら、Cancer Res.２００９年；６９巻（５号）：２０００〜２００９頁；Fialova Aら、Int J Cancer.２０１３年；１３２巻（５号）：１０７０〜１０７９頁；Curielら、Nat Med.２００４年；１０巻（９号）：９４２〜９４９頁；Yangら、PLoS One.２０１５年；１０巻（３号）：ｅ０１２００５９頁；Maruyamaら、Dis Esophagus ２０１０年；２３巻（５号）：４２２〜４２９頁；Ishidaら、Cancer Res.２００６年；６６巻（１１号）：５７１６〜５７２２頁）。これは、有効な抗腫瘍免疫応答を妨害するだけでなく、腫瘍の輸送および転移も促進する、かかる悪性腫瘍の腫瘍微小環境中へのＣＣＲ４保有Ｔｒｅｇの大々的な流入の主要な駆動因子である（Tsujikawaら、Int J Cancer.２０１３年；１３２巻（１２号）：２７５５〜２７６６頁）。

【0004】

成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）では、ＨＴＬＶ−１関連Ｔ細胞悪性腫瘍は、ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ障害とみなされる場合が多く、白血病性細胞上でのＣＣＲ４の細胞表面発現は、ほぼ普遍的である（Yoshieら、Blood.２００２年；９９巻（５号）：１５０５〜１５１１頁；Ishidaら、Clin Cancer Res.２００３年；９巻（１０号１部）：３６２５〜３６３４頁）。さらに、皮膚Ｔ細胞リンパ腫［末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）／皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、菌状息肉症（ＭＦ）／セザリー症候群（ＳＳ）］の大部分では、皮膚への悪性細胞のホーミングは、細胞表面発現されるＣＣＲ４によって主に指示される（Hristovら、Am J Clin Pathol.２０１１年；１３６巻（６号）：９４４〜９５３頁；Kakinumaら、J Am Acad Dermatol.２００３年；４８巻（１号）：２３〜３０頁）。顕著な割合の未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、および他の末梢性Ｔ細胞リンパ腫もまた、おそらくは、これらの腫瘍におけるＴ_Ｈ２マスター転写調節因子ＧＡＴＡ−３の異常な発現の結果として、ＣＣＲ４受容体を発現する。これらの腫瘍におけるＣＣＲ４の存在は、多変量分析によって、末梢性Ｔ細胞リンパ腫−非特定型（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）および未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性ＡＬＣＬの両方における不十分な生存の独立した予後因子であることが示されている（Vermeerら、Mod Pathol.２００２年８月；１５巻（８号）：８３８〜８４４頁；Wangら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：３００７〜３０１５頁；Iqbalら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：２９１５〜２９２３頁；Percyら、International Classification of Diseases for Oncology (ICD-O-3)第３版、Geneva、Switzerland：World Health Organization；２０００年）。

【0005】

モガムリズマブは、ＣＣＲ４を標的化する増強された抗体依存的細胞傷害性を発揮するように操作された脱フコシル化ヒト化抗体であり、再発性または不応性成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫の処置のために日本で承認されており（Subramaniamら、Drugs.２０１２年；７２巻（９号）：１２９３〜１２９８頁）、蓄積しつつある証拠により、厳しく事前処置された患者においてであっても、このモダリティーのかなりの有効性が明らかになっている（Orugaら、J Clin Oncol.２０１４年；３２巻（１１号）：１１５７〜１１６３頁）。観察された有害事象は主に、管理可能なだけでなく可逆的でもある発熱および皮膚障害に加えて、血液学的な性質のものである（Oguraら、J Clin Oncol.２０１４年；３２巻（１１号）：１１５７〜１１６３頁；Duvicら、Blood.２０１５年；１２５巻（１２号）：１８８３〜１８８９頁）。同様に重要なモガムリズマブ治療はまた、エフェクター型Ｆｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇを選択的に枯渇させて、処置された患者における向上した抗腫瘍応答の誘導を生じる（Sugiyamaら、Proc Natl Acad Sci U S A ２０１３年；１１０巻（４４号）：１７９４５〜１７９５０頁；Niら、Clin Cancer Res.２０１５年；２１巻（２号）：２７４〜２８５頁）。したがって、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、およびＣＣＲ４を発現する他のリンパ腫の処置などのための、ＣＣＲ４を標的化する他の治療剤が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】YoshieおよびMatsushima、Int Immunol.２０１５年；２７巻（１号）：１１〜２０頁

【非特許文献2】SolariおよびPease、Eur J Pharmacol.２０１５年；. pii: S0014-2999(15)30011）

【非特許文献3】Hiraharaら、J Immunol.２００６年；１７７巻（７号）：４４８８〜４４９４頁

【非特許文献4】D'Ambrosioら、J Immunol.１９９８年；１６１巻（１０号）：５１１１〜５１１５頁

【非特許文献5】Annunziatoら、J Exp Med.２００７年；２０４巻（８号）：１８４９〜１８６１頁

【非特許文献6】Clemetsonら、Blood.２０００年；９６巻（１３号）：４０４６〜４０５４頁

【非特許文献7】Abi-Younesら、Thromb Res.２００１年；１０１巻（４号）：２７９〜２８９頁

【非特許文献8】Andrewら、J Immunol.１９９８年；１６１巻（９号）：５０２７〜５０３５頁

【非特許文献9】Imaiら、J Biol Chem.１９９８年；２７３巻（３号）：１７６４〜１７６８頁

【非特許文献10】Zlotnikら、Immunity.２０００年；１２巻（２号）：１２１〜１２７頁

【非特許文献11】Gobertら、Cancer Res.２００９年；６９巻（５号）：２０００〜２００９頁

【非特許文献12】Fialova Aら、Int J Cancer.２０１３年；１３２巻（５号）：１０７０〜１０７９頁

【非特許文献13】Curielら、Nat Med.２００４年；１０巻（９号）：９４２〜９４９頁

【非特許文献14】Yangら、PLoS One.２０１５年；１０巻（３号）：ｅ０１２００５９頁

【非特許文献15】Maruyamaら、Dis Esophagus ２０１０年；２３巻（５号）：４２２〜４２９頁

【非特許文献16】Ishidaら、Cancer Res.２００６年；６６巻（１１号）：５７１６〜５７２２頁

【非特許文献17】Tsujikawaら、Int J Cancer.２０１３年；１３２巻（１２号）：２７５５〜２７６６頁

【非特許文献18】Yoshieら、Blood.２００２年；９９巻（５号）：１５０５〜１５１１頁

【非特許文献19】Ishidaら、Clin Cancer Res.２００３年；９巻（１０号１部）：３６２５〜３６３４頁

【非特許文献20】Hristovら、Am J Clin Pathol.２０１１年；１３６巻（６号）：９４４〜９５３頁

【非特許文献21】Kakinumaら、J Am Acad Dermatol.２００３年；４８巻（１号）：２３〜３０頁

【非特許文献22】Vermeerら、Mod Pathol.２００２年８月；１５巻（８号）：８３８〜８４４頁

【非特許文献23】Wangら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：３００７〜３０１５頁

【非特許文献24】Iqbalら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：２９１５〜２９２３頁

【非特許文献25】Percyら、International Classification of Diseases for Oncology (ICD-O-3)第３版、Geneva、Switzerland：World Health Organization；２０００年

【非特許文献26】Subramaniamら、Drugs.２０１２年；７２巻（９号）：１２９３〜１２９８頁

【非特許文献27】Orugaら、J Clin Oncol.２０１４年；３２巻（１１号）：１１５７〜１１６３頁

【非特許文献28】Oguraら、J Clin Oncol.２０１４年；３２巻（１１号）：１１５７〜１１６３頁

【非特許文献29】Duvicら、Blood.２０１５年；１２５巻（１２号）：１８８３〜１８８９頁

【非特許文献30】Sugiyamaら、Proc Natl Acad Sci U S A ２０１３年；１１０巻（４４号）：１７９４５〜１７９５０頁

【非特許文献31】Niら、Clin Cancer Res.２０１５年；２１巻（２号）：２７４〜２８５頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

開示の要旨
一部の実施形態では、（ａ）ｍＡＢ２−３抗体の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含むｓｃＦｖであって、ＣＣＲ４に特異的に結合する、ｓｃＦｖ；（ｂ）ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｃ）細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン；ならびに（ｄ）細胞内ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、（ａ）〜（ｄ）が、Ｎ末端からＣ末端の順である、キメラ抗原受容体が開示される。一部の実施形態では、例えば、マウス免疫グロブリンシグナル配列であるがこれに限定されないシグナル配列が、ｓｃＦｖに対してＮ末端側に含まれる。具体的な非限定的な例では、重鎖可変ドメインは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含み、軽鎖可変ドメインは、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む。

【0008】

一部の実施形態では、これらのＣＡＲをコードする核酸分子および発現ベクターが開示される。具体的な非限定的な例では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターであり得る。あるいは、これはまた、ＲＮＡトランスフェクションによる、ＣＡＲをコードする完全ｍＲＮＡ分子であり得る。これらのベクターで形質転換された宿主細胞、例えば、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞もまた開示される。

【0009】

さらなる実施形態では、ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生するリンパ系悪性腫瘍（lymphoid）を有する対象を処置するための方法が開示される。一部の非限定的な例では、方法は、ＣＤ３＋Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に、ＣＡＲをコードする発現ベクターを形質導入して、キメラ抗原受容体を発現する形質導入されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を産生するステップを含む。キメラ抗原受容体を発現する形質導入された細胞の治療有効量は、悪性腫瘍を処置するために対象に投与される。具体的な非限定的な例では、悪性腫瘍はリンパ系悪性腫瘍である。他の具体的な非限定的な例では、細胞は自家である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む細胞外ｓｃＦｖであって、ＣＣＲ４に特異的に結合する、細胞外ｓｃＦｖ；
（ｂ）ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン；
（ｃ）細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン；ならびに
（ｄ）細胞内ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン
を含むキメラ抗原受容体であって、（ａ）〜（ｄ）が、Ｎ末端からＣ末端の順である、キメラ抗原受容体。
（項目２）
前記重鎖可変ドメインが、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含み、前記軽鎖可変ドメインが、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む、項目１に記載のキメラ抗原受容体。
（項目３）
ＣＤ８由来の前記ヒンジおよび前記膜貫通ドメインが、配列番号７として示されるアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載のキメラ抗原受容体。
（項目４）
前記細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメインが、配列番号８として示されるアミノ酸配列を含む、項目１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（項目５）
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号９として示される核酸配列を含む、項目１から４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（項目６）
配列番号１０として示されるアミノ酸配列を含む、項目１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
（項目７）
項目１から６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸分子。
（項目８）
前記Ｖ_Ｌをコードする核酸配列が、配列番号１２に対して少なくとも９５％同一であり、コードされたＬＣＤＲ１が、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、前記ＬＣＤＲ２が、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、前記ＬＣＤＲ３が、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む、項目７に記載の単離された核酸分子。
（項目９）
前記Ｖ_Ｌをコードする核酸配列が、配列番号１３に対して少なくとも９５％同一であり、コードされたＨＣＤＲ１が、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、前記ＨＣＤＲ２が、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、前記ＨＣＤＲ３が、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含む、項目７に記載の単離された核酸分子。
（項目１０）
前記Ｖ_Ｈが、配列番号１３の核酸配列によってコードされ、かつ／または前記Ｖ_Ｌが、配列番号１２の核酸配列によってコードされる、項目８または項目９に記載の単離された核酸分子。
（項目１１）
ｓｃＦｖがリンカーを含み、前記リンカーが、配列番号１４の核酸配列によってコードされる、項目７から１０のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目１２）
前記キメラ抗原受容体が、免疫グロブリンシグナル配列を含み、前記免疫グロブリンシグナル配列が、配列番号１１に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、シグナル配列として機能する、項目７から１１のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目１３）
配列番号１１の核酸配列を含む、項目１２に記載の単離された核酸分子。
（項目１４）
前記ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジが、配列番号１５に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、ＣＤ８膜貫通ドメインおよびヒンジとして機能する、項目７から１３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目１５）
配列番号１５の核酸配列を含む、項目１４に記載の単離された核酸分子。
（項目１６）
前記４−１ＢＢシグナル伝達分子が、配列番号１６に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、４−１ＢＢシグナル伝達分子として機能する、項目７から１５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目１７）
配列番号１６の核酸配列を含む、項目１６に記載の単離された核酸分子。
（項目１８）
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子が、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一な核酸配列によってコードされ、コードされたタンパク質が、ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子として機能する、項目７から１７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目１９）
配列番号１７の核酸配列を含む、項目１８に記載の単離された核酸分子。
（項目２０）
ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、項目７から１９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
（項目２１）
配列番号１８の核酸配列を含む、項目２０に記載の単離された核酸分子。
（項目２２）
項目７から２１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２３）
ウイルスベクターである、項目２２に記載の発現ベクター。
（項目２４）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、項目２３に記載のベクター。
（項目２５）
項目２２から２４のいずれか一項に記載のベクターを形質導入された、ＣＤ３^＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞。
（項目２６）
前記ＣＤ３^＋Ｔ細胞が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、項目２５に記載のＣＤ３^＋Ｔ細胞。
（項目２７）
ヒトＴ細胞である、項目２５または２６に記載のＣＤ３^＋Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞。
（項目２８）
項目２２から２４のいずれか一項に記載のベクターの有効量または項目２５から２７のいずれか一項に記載のＣＤ３＋Ｔ細胞および／もしくはナチュラルキラー細胞の治療有効量、ならびに薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目２９）
ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、項目２８に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって、前記対象においてＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する前記悪性腫瘍を処置するステップを含む、方法。
（項目３０）
前記医薬組成物が前記Ｔ細胞を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｔ細胞が、前記対象にとって自家である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記医薬組成物が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、項目２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記成人Ｔ細胞白血病が慢性成人Ｔ細胞白血病である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記対象においてＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞の数を低減させる、項目２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する悪性腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、
前記対象由来のＣＤ３＋Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞に、項目２２から２４のいずれか一項に記載の発現ベクターを形質導入して、前記キメラ抗原受容体を発現する自家の形質導入された細胞を産生するステップ；ならびに
前記キメラ抗原受容体を発現する前記自家の形質導入された細胞の治療有効量を前記対象に投与し、それによって、前記対象においてＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する前記悪性腫瘍を処置するステップ
を含む、方法。
（項目３７）
前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記成人Ｔ細胞白血病が、慢性成人Ｔ細胞白血病、急性成人Ｔ細胞白血病、くすぶり型Ｔ細胞白血病またはリンパ腫型Ｔ細胞白血病である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記対象がヒトである、項目２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記悪性腫瘍がリンパ系悪性腫瘍である、項目２９から３２、３５または３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、項目２９から３２、３５または３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記固形腫瘍が、乳、卵巣、胃または食道がんである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
対象において悪性腫瘍を処置するための、項目２８に記載の医薬組成物の使用であって、前記悪性腫瘍がＣＣＲ４ ｍＲＮＡを産生する、使用。
（項目４４）
前記悪性腫瘍が、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、項目４３に記載の使用。
（項目４５）
前記成人Ｔ細胞白血病が、慢性成人Ｔ細胞白血病、急性成人Ｔ細胞白血病、くすぶり型Ｔ細胞白血病またはリンパ腫型Ｔ細胞白血病である、項目４４に記載の使用。
（項目４６）
前記悪性腫瘍が固形腫瘍である、項目４３に記載の使用。
（項目４７）
前記固形腫瘍が、乳、卵巣、胃または食道がんである、項目４６に記載の使用。
（項目４８）
前記対象がヒトである、項目４３から４７のいずれか一項に記載の使用。
（項目４９）
前記医薬組成物が前記Ｔ細胞を含む、項目４３から４８のいずれか一項に記載の使用。
（項目５０）
前記Ｔ細胞が、前記対象にとって自家である、項目４９に記載の使用。
（項目５１）
前記Ｔ細胞が、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である、項目４９または５０に記載の使用。

【0010】

本発明の上述および他の特色および利点は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Ａ〜１Ｅは、ＣＣＲ４ ＣＡＲの構築および特徴付けを示す。（Ａ）ＣＣＲ４ ＣＡＲポリペプチドのドメイン配置の模式図。（Ｂ）ＣＣＲ４ ＣＡＲレンチウイルスベクターの形質導入効率を、ＧＦＰ陽性Ｔ細胞の百分率を測定することによって、ドナー由来のｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化したヒトＣＤ３^＋Ｔリンパ球の単一の形質導入事象後のフローサイトメトリーによって評価した。（Ｃ）形質導入されたＣＤ３^＋Ｔ細胞上でのＣＣＲ４ ＣＡＲの細胞表面発現を、フローサイトメトリーによって、プロテインＬの結合およびＧＦＰ発現との一致によって検出した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＣＤ３^＋ドナー由来のリンパ球のレンチウイルス形質導入の７２時間後の、ＣＣＲ４ ＣＡＲを発現する（Ｄ）ＣＤ４^＋Ｔ細胞の百分率および（Ｅ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の百分率。百分率は、右上象限に示される。

【0012】

【図2A】図２Ａ〜２Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞溶解活性の動態、効力および耐久性を示す。細胞株ＡＴＬ４１２１４は、ＨＴＬＶ−１関連慢性成人Ｔ細胞白血病を有する患者に由来し、ＹＴ−１細胞株は、ＥＢＶ関連ＮＫリンパ腫を有する患者に由来する。これら２つの細胞株上でのＣＣＲ４の表面発現を、赤色で示される抗ヒトＣＣＲ４−ＡＰＣ抗体（ＥＢＩＯＳＣＥＮＣＥ（登録商標）のクローンＤ８ＳＥＥ）または青色で示されるアイソタイプが一致した対照抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定した（パネルＡ）。ＩＬ−２の存在下でレンチウイルス形質導入後１２日間にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを、示された持続時間にわたって示されたエフェクター：標的比で三連で、ルシフェラーゼでタグ化したＡＴＬ４１２１４細胞（ＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ）と共に共培養した。細胞溶解の百分率を、方法のセクションに示されるように、Ｄ−ルシフェリンを添加しマイクロプレートカウンター／ルミノメーターを使用して生物発光を測定した後に計算した（パネルＢ）。溶解活性の長期保持を、方法のセクションに記載されるように、８週間の期間にわたってＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで、ｘ軸上に示される示されたエフェクター：標的比で２０時間の期間にわたってＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ標的細胞と共に共培養することによって決定した（パネルＣ）。パネルＤでは、パネルＢの実験を、同一の様式でルシフェラーゼでタグ化したＹＴ−１細胞を用いて反復した。

【図2BC】図２Ａ〜２Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞溶解活性の動態、効力および耐久性を示す。細胞株ＡＴＬ４１２１４は、ＨＴＬＶ−１関連慢性成人Ｔ細胞白血病を有する患者に由来し、ＹＴ−１細胞株は、ＥＢＶ関連ＮＫリンパ腫を有する患者に由来する。これら２つの細胞株上でのＣＣＲ４の表面発現を、赤色で示される抗ヒトＣＣＲ４−ＡＰＣ抗体（ＥＢＩＯＳＣＥＮＣＥ（登録商標）のクローンＤ８ＳＥＥ）または青色で示されるアイソタイプが一致した対照抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定した（パネルＡ）。ＩＬ−２の存在下でレンチウイルス形質導入後１２日間にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを、示された持続時間にわたって示されたエフェクター：標的比で三連で、ルシフェラーゼでタグ化したＡＴＬ４１２１４細胞（ＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ）と共に共培養した。細胞溶解の百分率を、方法のセクションに示されるように、Ｄ−ルシフェリンを添加しマイクロプレートカウンター／ルミノメーターを使用して生物発光を測定した後に計算した（パネルＢ）。溶解活性の長期保持を、方法のセクションに記載されるように、８週間の期間にわたってＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで、ｘ軸上に示される示されたエフェクター：標的比で２０時間の期間にわたってＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ標的細胞と共に共培養することによって決定した（パネルＣ）。パネルＤでは、パネルＢの実験を、同一の様式でルシフェラーゼでタグ化したＹＴ−１細胞を用いて反復した。

【図2D】図２Ａ〜２Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞溶解活性の動態、効力および耐久性を示す。細胞株ＡＴＬ４１２１４は、ＨＴＬＶ−１関連慢性成人Ｔ細胞白血病を有する患者に由来し、ＹＴ−１細胞株は、ＥＢＶ関連ＮＫリンパ腫を有する患者に由来する。これら２つの細胞株上でのＣＣＲ４の表面発現を、赤色で示される抗ヒトＣＣＲ４−ＡＰＣ抗体（ＥＢＩＯＳＣＥＮＣＥ（登録商標）のクローンＤ８ＳＥＥ）または青色で示されるアイソタイプが一致した対照抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定した（パネルＡ）。ＩＬ−２の存在下でレンチウイルス形質導入後１２日間にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞、およびＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズを、示された持続時間にわたって示されたエフェクター：標的比で三連で、ルシフェラーゼでタグ化したＡＴＬ４１２１４細胞（ＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ）と共に共培養した。細胞溶解の百分率を、方法のセクションに示されるように、Ｄ−ルシフェリンを添加しマイクロプレートカウンター／ルミノメーターを使用して生物発光を測定した後に計算した（パネルＢ）。溶解活性の長期保持を、方法のセクションに記載されるように、８週間の期間にわたってＣＡＲ Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖し、次いで、ｘ軸上に示される示されたエフェクター：標的比で２０時間の期間にわたってＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ標的細胞と共に共培養することによって決定した（パネルＣ）。パネルＤでは、パネルＢの実験を、同一の様式でルシフェラーゼでタグ化したＹＴ−１細胞を用いて反復した。

【0013】

【図3AB】図３Ａ〜３Ｅは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、あるスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞に対して強力な活性を示すことを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞（１２日間の拡大増殖）を、（Ａ）急性ＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２依存的ＡＴＬ細胞株と共に共培養した。（Ｂ）慢性／くすぶり型形態のＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２非依存的ＡＴＬ細胞株。（Ｃ）セザリー病および菌状息肉症を含む皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。（Ｄ）ＡＬＫ陽性（ＪＢ−６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＲ−７８６、ＳＵＰ−Ｍ２およびＤＥＬ）またはＡＬＫ陰性（Ｍａｃ−１、Ｍａｃ２−Ａ、Ｍａｃ２Ｂ）サブタイプのいずれかを有する、未分化大細胞型リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に由来するＳＵＤＨＬ−４細胞株も同様に含めた。（Ｅ）ホジキンリンパ腫を有する患者に由来する細胞株。パーセント細胞溶解を、三連で実施した標準的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（Phillipsら、Cancer Res.２０００年；６０巻（２４号）：６９７７〜６９８４頁）。

【図3CD】図３Ａ〜３Ｅは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、あるスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞に対して強力な活性を示すことを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞（１２日間の拡大増殖）を、（Ａ）急性ＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２依存的ＡＴＬ細胞株と共に共培養した。（Ｂ）慢性／くすぶり型形態のＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２非依存的ＡＴＬ細胞株。（Ｃ）セザリー病および菌状息肉症を含む皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。（Ｄ）ＡＬＫ陽性（ＪＢ−６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＲ−７８６、ＳＵＰ−Ｍ２およびＤＥＬ）またはＡＬＫ陰性（Ｍａｃ−１、Ｍａｃ２−Ａ、Ｍａｃ２Ｂ）サブタイプのいずれかを有する、未分化大細胞型リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に由来するＳＵＤＨＬ−４細胞株も同様に含めた。（Ｅ）ホジキンリンパ腫を有する患者に由来する細胞株。パーセント細胞溶解を、三連で実施した標準的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（Phillipsら、Cancer Res.２０００年；６０巻（２４号）：６９７７〜６９８４頁）。

【図3E】図３Ａ〜３Ｅは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、あるスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞に対して強力な活性を示すことを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで拡大増殖させたＣＡＲ Ｔ細胞（１２日間の拡大増殖）を、（Ａ）急性ＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２依存的ＡＴＬ細胞株と共に共培養した。（Ｂ）慢性／くすぶり型形態のＡＴＬを有する患者に由来するＩＬ−２非依存的ＡＴＬ細胞株。（Ｃ）セザリー病および菌状息肉症を含む皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。（Ｄ）ＡＬＫ陽性（ＪＢ−６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＲ−７８６、ＳＵＰ−Ｍ２およびＤＥＬ）またはＡＬＫ陰性（Ｍａｃ−１、Ｍａｃ２−Ａ、Ｍａｃ２Ｂ）サブタイプのいずれかを有する、未分化大細胞型リンパ腫を有する患者に由来する細胞株。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に由来するＳＵＤＨＬ−４細胞株も同様に含めた。（Ｅ）ホジキンリンパ腫を有する患者に由来する細胞株。パーセント細胞溶解を、三連で実施した標準的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して決定した（Phillipsら、Cancer Res.２０００年；６０巻（２４号）：６９７７〜６９８４頁）。

【0014】

【図4】図４は、フローサイトメトリーによる患者由来の新生物性細胞株のパネルにおけるＣＣＲ４の細胞表面発現を示す。各細胞株を、青色で示される抗ヒトＣＣＲ４−ＡＰＣ抗体（ＥＢＩＯＳＣＥＮＣＥ（登録商標）のクローンＤ８ＳＥＥ）または赤色で示されるアイソタイプが一致した対照抗体コンジュゲートＡＰＣで表面染色した。染色された細胞を、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）（ＢＤ）で分析した。

【0015】

【図5】図５Ａ〜５Ｂは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性および増殖活性が、標的腫瘍細胞におけるＣＣＲ４発現と相関することを示す。（Ａ）ＣＣＲ４のｍＲＮＡ転写物レベルを、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性死滅に対して不応性であった２つの細胞株ＳＵＤＨＬ−４およびＥＤ−４０５１５（−）を含む図３で使用した腫瘍細胞株の選択されたセットから総細胞ＲＮＡを単離した後に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定した。発現倍数を、ハウスキーピングＨＰＲＴ１遺伝子発現に対して標準化して計算した。（Ｂ）増殖シグナルを伝達する際のＣＣＲ４ ＣＡＲの機能的能力の尺度として、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を、照射した後のＣＣＲ４を発現するＡＴＬ５５Ｔ（＋）細胞またはＣＣＲ４を欠くＳＵＤＨＬ−４細胞のいずれかと共に共培養した。２４時間の共培養期間の後、［^３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。

【0016】

【図6】図６Ａ〜６Ｂは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示すことを示す。ＮＳＧマウスのコホートに、１０００万個のＡＴＬ４１２１４／Ｌｕｃ細胞を腹腔内投与した。３日後、コホートの半分（ｎ＝５）に、ＧＦＰを発現するレンチベクターを形質導入された１０００万個のドナーＴ細胞を腹腔内投与し（Ａ）、残り半分は、ＣＣＲ４ ＣＡＲレンチベクターでｅｘ ｖｉｖｏ改変されたドナーＴ細胞を腹腔内で受けた（Ｂ）。ドナーＴ細胞の投与後、マウスに、７日間の期間にわたって６００ＩＵのヒトＩＬ−２を毎日腹腔内注射した。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を、生物発光画像化によって評価して、ドナーＴ細胞の投与の４週間後の腫瘍成長の程度を測定した。

【0017】

【図7】図７Ａ〜７Ｂは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、より速い動態でＡＴＬ ４１２１４／Ｌｕｃ細胞を死滅させることを示す：ＡＴＬ ４１２１４／Ｌｕｃ細胞株を、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＤ３０ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかをこれらの細胞を死滅させる能力について評価した共培養実験において、標的細胞として使用した。標的細胞およびエフェクター細胞を、１：１の比で混合し、示された長さの時間にわたって共培養した。パーセント細胞死滅を、生物発光アッセイによって、実施例１に示されるように計算した（パネルＡ）。ＡＴＬ ４１２１４／Ｌｕｃ上でのＣＤ３０およびＣＣＲ４の表面発現レベルを、フローサイトメトリーによって測定した（パネルＢ）。パネル中、アイソタイプ対照抗体による染色は青色で示され、ＣＤ３０抗体またはＣＣＲ４抗体の染色は赤色で示される。

【0018】

【図8A】図８Ａ〜８Ｂは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＤＬ−１／ＰＤ−１相互作用を介したＣＡＲ Ｔ細胞の機能性を弱体化させることによって腫瘍がＣＡＲ Ｔ細胞活性を免れることができる機構として示されるＰＤＬ−１阻害性分子を高レベルで発現する標的を含む、ＣＣＲ４を発現する標的を死滅させることができることを示す。未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）は、高レベルの表面ＰＤＬ−１を普遍的に発現し（Ａ）、同時に、より悪性度が高いＡＬＫ陰性サブタイプのＡＬＣＬは、高レベルのＣＣＲ４もまた発現する（Ｂ）。ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬ系統は、予測されたように高レベルのＰＤＬ−１を発現するが、同じ細胞株は、上の図３Ｄに示されるように、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞による死滅に対して高度に感受性であった。

【図8B】図８Ａ〜８Ｂは、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＰＤＬ−１／ＰＤ−１相互作用を介したＣＡＲ Ｔ細胞の機能性を弱体化させることによって腫瘍がＣＡＲ Ｔ細胞活性を免れることができる機構として示されるＰＤＬ−１阻害性分子を高レベルで発現する標的を含む、ＣＣＲ４を発現する標的を死滅させることができることを示す。未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）は、高レベルの表面ＰＤＬ−１を普遍的に発現し（Ａ）、同時に、より悪性度が高いＡＬＫ陰性サブタイプのＡＬＣＬは、高レベルのＣＣＲ４もまた発現する（Ｂ）。ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬ系統は、予測されたように高レベルのＰＤＬ−１を発現するが、同じ細胞株は、上の図３Ｄに示されるように、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞による死滅に対して高度に感受性であった。

【0019】

【図9】図９は、腫瘍保有マウスにおける発光の定量的実証を示す。これは、図６Ａ〜６Ｂに示されるデータの別の提示である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

配列
核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許施行規則第１．８２２条において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準的な文字略号、およびアミノ酸については１文字コードを使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、示される鎖への任意の言及によって相補鎖が含まれると理解される。配列表は、２０１７年９月１９日に作成された１８．２ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：

【0021】

配列番号１は、ヒト化親和性成熟ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｈのアミノ酸配列である。

【0022】

配列番号２は、ヒト化親和性成熟ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｌのアミノ酸配列である。

【0023】

配列番号３は、リンカーのアミノ酸配列である。

【0024】

配列番号４〜５は、シグナル配列のアミノ酸配列である。

【0025】

配列番号６は、スペーサーとして使用され得る免疫グロブリンドメインのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。

【0026】

配列番号８は、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。

【0027】

配列番号９は、ＣＤ３ゼータドメインのアミノ酸配列である。

【0028】

配列番号１０は、例示的なＣＡＲのアミノ酸配列である。

【0029】

配列番号１１は、シグナル配列をコードする核酸配列である。

【0030】

配列番号１２は、ヒト化親和性成熟ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｌをコードする核酸配列である。

【0031】

配列番号１３は、ヒト化親和性成熟ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｈをコードする核酸配列である。

【0032】

配列番号１４は、リンカーをコードする核酸配列である。

【0033】

配列番号１５は、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする核酸配列である。

【0034】

配列番号１６は、４−１ＢＢシグナル伝達分子をコードする核酸配列である。

【0035】

配列番号１７は、ＣＤ３ゼータドメインをコードする核酸配列である。

【0036】

配列番号１８は、ＣＡＲをコードする核酸配列である。

【0037】

配列番号１９は、例示的なＣＤ２８膜貫通ドメインである。

【0038】

いくつかの実施形態の詳細な説明
抗ＣＣＲ４抗体に由来するヒト化可変重（ＶＨ）鎖およびカッパ軽（ＶＬ）鎖部分を使用するＣＣＲ４を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように自家Ｔ細胞を遺伝子操作するために、遺伝子移入系を産生および使用した。ＣＡＲを、いくつかの悪性腫瘍、具体的にはリンパ系悪性腫瘍の細胞を標的化することが報告されたＴ細胞中に導入した。ＣＣＲ４標的化ＣＡＲによってｅｘ ｖｉｖｏ改変されたドナーＴ細胞は、抗原特異的様式で、ＣＣＲ４を発現する患者由来腫瘍細胞株を効率的に溶解させることが示され、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性が、成人Ｔ細胞白血病のモデルにおいて実証された。

【0039】

用語
特記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes X、Jones & Bartlett Publishersによる出版、２００９年；およびMeyersら（編）、The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine、Wiley-VCHによる出版、全１６巻、２００８年；ならびに他の類似の参考文献において見出され得る。

【0040】

本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形ならびに複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの（ａｎ）抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値はおおよそであり、特記しない限り、説明目的のために提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特定の適切な方法および材料が本明細書に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は例示にすぎず、限定とは解釈されない。種々の実施形態の検討を促進するために、以下の用語の説明が提供される：

【0041】

投与：選択された経路による対象中への組成物の導入。投与は、局所的または全身的であり得る。例えば、選択された経路が静脈内である場合、組成物は、対象の静脈中に組成物を導入することによって投与される。投与の例示的な経路には、経口、注射（例えば、皮下、筋肉内、真皮内、腹腔内および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、外用）、鼻腔内、腟および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。

【0042】

成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）：ＡＴＬは通常、拡散パターンおよび成熟Ｔ細胞表現型を除いて特徴的な組織学的外観を有さない、非常に悪性度が高い非ホジキンリンパ腫である。変則的な核の輪郭を有する循環リンパ球（白血病性細胞）が頻繁に見られる。いくつかの系統の証拠は、ＨＴＬＶ−１がＡＴＬを引き起こすことを示唆している。ＡＴＬには、内臓合併症、高カルシウム血症、皮膚病変および溶解性骨病変が頻繁に付随する。特色の１つは、骨病変が、関連する造骨活性をほとんど有さず、優勢に溶骨性であることである。ＡＴＬの４つの形態、慢性、急性、くすぶり型およびリンパ腫型が存在する。

【0043】

アミノ酸置換：ペプチド中の１つのアミノ酸の、異なるアミノ酸による置き換え。

【0044】

未分化大細胞型リンパ腫：異常なＴ細胞が関与する非ホジキンリンパ腫の型。４つのサブタイプが存在し、それらは全て、ＣＤ３０およびＴ細胞マーカーを発現する大きい多形性細胞の存在を含む。２つの型のＡＬＣＬが全身性疾患として現れ、悪性度が高いリンパ腫とみなされるが、２つの型は限局性の疾患として現れ、局所的に進行し得る。皮膚ＡＬＣＬは、持続し得るまたは時折自発的に退行し一般に再発し得る潰瘍として皮膚中に現れる腫瘍である。この型のＡＬＣＬは通常、身体の異なる領域において顕在化し、ＡＬＣＬが腕に現れる場合には、所属リンパ節、即ち、腋窩リンパ節に拡大し得る。

【0045】

抗体：ＩＬ−７Ｒαなどの分析物（抗原）を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン、抗原結合性断片、またはそれらの誘導体。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。

【0046】

抗体の非限定的な例には、例えば、インタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持する当該分野で公知のそのバリアントおよび断片が含まれる。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生されるまたは組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成される抗原結合性断片が含まれる（例えば、KontermannおよびDubel（編）、Antibody Engineering、第１〜２巻、第２版、Springer Press、２０１０年を参照のこと）。

【0047】

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって遺伝的に融合された単鎖分子として連結された１つまたは複数の抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Birdら、Science、２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci.、８５巻：５８７９〜５８８３頁、１９８８年；Ahmadら、Clin. Dev. Immunol.、２０１２年、doi:10.1155/2012/980250；Marbry、IDrugs、１３巻：５４３〜５４９頁、２０１０年を参照のこと）。ｓｃＦｖ中のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインの分子内配向は、典型的には、ｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（Ｖ_Ｈドメイン−リンカードメイン−Ｖ_Ｌドメイン；Ｖ_Ｌドメイン−リンカードメイン−Ｖ_Ｈドメイン）を有するｓｃＦｖが使用され得る。

【0048】

ｄｓＦｖでは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、鎖の会合を安定化するためにジスルフィド結合を導入するように変異されている。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異性抗体であるダイアボディもまた含まれる（例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９０巻：６４４４〜６４４８頁、１９９３年；Poljakら、Structure、２巻：１１２１〜１１２３頁、１９９４年を参照のこと）。

【0049】

抗体には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態もまた含まれる。Pierce Catalog and Handbook、１９９４年〜１９９５年（Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）；Kuby, J.、Immunology、第３版、W.H. Freeman & Co.、New York、１９９７年もまた参照のこと。

【0050】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照抗体の結合を５０％またはそれよりも大きく遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原に対するこの抗体の結合を５０％またはそれよりも大きく遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。

【0051】

抗体は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。１つよりも多い結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であっても異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有するが、二重特異性または二重機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。

【0052】

典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重鎖および軽鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（即ち、アイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。

【0053】

各重鎖および軽鎖は、１つの定常領域（即ち、定常ドメイン）および１つの可変領域（即ち、可変ドメイン；例えば、Kindtら、Kuby Immunology、第６版、W.H. Freeman and Co.、９１頁（２００７年）を参照のこと）を含有する。いくつかの実施形態では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、Ｖ_Ｈのみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である（例えば、Hamers-Castermanら、Nature、３６３巻：４４６〜４４８頁、１９９３年；Sheriffら、Nat. Struct. Biol.、３巻：７３３〜７３６頁、１９９６年を参照のこと）。「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」に対する言及は、抗原結合性断片、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。

【0054】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域に割り込まれた「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services、１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間でＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。

【0055】

ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Kabatら（「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第５版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら（JMB ２７３巻、９２７〜９４８頁、１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）およびLefrancら（「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」、Dev. Comp. Immunol.、２７巻：５５〜７７頁、２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）によって記載されたものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体のＶ_Ｈ由来のＣＤＲ３であり、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体のＶ_Ｌ由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合がある。重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれる場合がある。

【0056】

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含有するまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能なバリアント抗体を除いて、同一であるおよび／または同じエピトープに結合し、かかるバリアントは一般に、微量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるとして抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得、かかる方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を有さない保存的アミノ酸置換を有し得る（例えば、HarlowおよびLane、Antibodies, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Publications、New York（２０１３年）を参照のこと）。

【0057】

「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域、および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性断片由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ヒト化免疫グロブリン中の全てのＣＤＲが、ドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合には、これらは、ヒト免疫グロブリン定常領域に対して実質的に同一、例えば、少なくとも約８５〜９０％、例えば、約９５％またはそれよりも高く同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分に対して実質的に同一である。

【0058】

「キメラ抗体」は、２つの異なる抗体に由来する、典型的には異なる種のものである配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域、ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。他の実施形態では、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体（例えば、４Ａ１０または２Ｂ８抗体）のＶＨおよびＶＬ領域、ならびにヒトＩｇＧ１領域などのヒト定常領域を含み得る。

【0059】

「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはそれに由来する）配列を含み、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはそれに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによってまたはトランスジェニック動物を使用して、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて抗体を創出するためのテクノロジーを使用して、同定および単離され得る（例えば、Barbasら、Phage display: A Laboratory Manuel.第１版、New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００４年出版；Lonberg、Nat. Biotech.、２３巻：１１１７〜１１２５頁、２００５年；Lonenberg、Curr. Opin. Immunol.、２０巻：４５０〜４５９頁、２００８年を参照のこと）。

【0060】

生物学的試料：対象から得られる試料。生物学的試料には、対象における疾患（例えば、リンパ系悪性腫瘍）の検出に有用な全ての臨床的試料が含まれ、細胞、組織および体液、例えば、血液、血液の誘導体および画分（例えば、血清）、脳脊髄液；ならびに生検されたまたは外科的に取り出された組織、例えば、未固定の、凍結された、またはホルマリンもしくはパラフィン中で固定された組織が含まれるがこれらに限定されない。特定の例では、生物学的試料は、リンパ系悪性腫瘍を有するまたは有すると疑われる対象から得られる。

【0061】

ＣＣ−ケモカイン受容体型４（ＣＣＲ４）：ＣＤ１９４としても公知であり、ＣＣＲ４は、ＣＣ−ケモカイン受容体の１つである。ヒトＣＣＲ４の例示的なｍＲＮＡ核酸配列およびコードされるタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００５５０８、２０１６年３月１８日である。マウスＣＣＲ４の例示的なｍＲＮＡ核酸配列およびコードされるタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００９９１６、２０１５年７月１９日である。

【0062】

ＣＤ３（表面抗原分類３ Ｔ細胞共受容体）：Ｔ細胞の表面上のＴ細胞受容体と非共有結合的に会合する、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む特異的タンパク質複合体。４つのポリペプチド鎖には、２つのＣＤ３−イプシロン鎖、１つのＣＤ３−デルタ鎖および１つのＣＤ３−ガンマ鎖が含まれる。ＣＤ３は、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方上に存在する。

【0063】

化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置において治療的有用性を有する任意の化学的薬剤。例えば、化学療法剤は、Ｔ−ＡＬＬまたはＢ−ＡＬＬなどのがんの処置のために有用であり得る。使用され得る化学療法剤の特定の例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子、ならびに血管形成阻害剤が含まれる。一実施形態では、化学療法剤は、放射活性化合物である。当業者は、使用される化学療法剤を容易に同定できる（例えば、SlapakおよびKufe、Principles of Cancer Therapy、第８６章、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１４版；Perryら、Chemotherapy、第１７章、Abeloff、Clinical Oncology 第２版、（著作権）２０００年、Churchill Livingstone, Inc；Baltzer, L.、Berkery, R.（編）：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy、第２版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９５年；Fischer, D.S.、Knobf, M.F.、Durivage, H.J.（編）：The Cancer Chemotherapy Handbook、第４版、St. Louis、Mosby-Year Book、１９９３年；ChabnerおよびLongo、Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice（第４版）、Philadelphia：Lippincott Willians & Wilkins、２００５年；Skeel、Handbook of Cancer Chemotherapy（第６版）、Lippincott Williams & Wilkins、２００３年を参照のこと）。組合せ化学療法は、がんを処置するための１種よりも多い薬剤の投与である。

【0064】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：Ｔ細胞受容体の１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインに連結された細胞外抗体由来標的化ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を有する操作されたＴ細胞受容体。「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞であり、ＣＡＲの抗体由来標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。ＣＡＲを作製する方法は利用可能である（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Parkら、Trends Biotechnol.、２９巻：５５０〜５５７頁、２０１１年；Gruppら、N Engl J Med.、３６８巻：１５０９〜１５１８頁、２０１３年；Hanら、J. Hematol Oncol.、６巻：４７頁、２０１３年；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０７９０００号、同第ＷＯ２０１３／０５９５９３号；および米国公開第２０１２／０２１３７８３号を参照のこと）。

【0065】

コドン最適化された：タンパク質をコードする核酸分子は、アミノ酸配列と共に、特定のアミノ酸をコードする可能性が最も高いコドンを含めることによって、特定の生物におけるタンパク質の発現のためにコドン最適化され得る。コドン用法バイアスは、コードＤＮＡ中の同義のコドン（同じアミノ酸をコードする）の存在の頻度における差異である。コドンは、ポリペプチド鎖中の特定のアミノ酸残基をコードする、または翻訳の終結のための、一連の３ヌクレオチド（三つ組）である。２０の異なる天然に存在するアミノ酸が存在するが、６４の異なるコドン（アミノ酸をコードする６１のコドン＋３つの終止コドン）が存在する。したがって、１つのアミノ酸が１つよりも多いコドンによってコードされ得るので、縮重が存在する。核酸配列は、特定の生物（例えば、ヒト）におけるコドン用法バイアスを評価し、特定のアミノ酸をコードする可能性が最も高いコドンを選択することによって、その生物における発現のために最適化され得る。多変量の統計的方法、例えば、対応分析および主成分分析が、コドン用法におけるバリエーションを分析するために広く使用される。Ｃｏｄｏｎ Ｗ、ＧＣＵＡおよびＩＮＣＡなどのコンピュータープログラムが、コドン用法に関する統計的分析を実行するために利用可能である。

【0066】

免疫複合体を形成するのに十分な条件：実質的に全ての他のエピトープへの結合よりも検出可能により高い程度まで、および／または実質的に全ての他のエピトープへの結合の実質的な排除まで、抗体またはその抗原結合性断片がその同族エピトープに結合するのを可能にする条件。免疫複合体を形成するのに十分な条件は、結合反応の形式に依存し、典型的には、イムノアッセイプロトコールで利用される条件、またはｉｎ ｖｉｖｏで遭遇する条件である。イムノアッセイ形式および条件の説明については、HarlowおよびLane（Antibodies, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Publications、New York、２０１３年）を参照のこと。方法で使用される条件は、生きた哺乳動物または哺乳動物細胞の内側で典型的な条件（例えば、温度、モル浸透圧濃度、ｐＨ）への言及を含む「生理的条件」である。一部の臓器が極端な条件に供されることは認識されるが、生物内および細胞内環境は通常、およそｐＨ７（例えば、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、より典型的にはｐＨ６．５〜７．５）であり、優勢な溶媒として水を含有し、０℃よりも上で５０℃よりも下の温度で存在する。モル浸透圧濃度は、細胞の生存度および増殖を支持する範囲内である。

【0067】

免疫複合体の形成は、当業者に公知の従来の方法、例えば、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、磁気共鳴画像化、ＣＴスキャン、Ｘ線およびアフィニティークロマトグラフィーを介して検出され得る。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化され得る。

【0068】

保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、タンパク質の機能、例えば、タンパク質が標的タンパク質と相互作用する能力に実質的に影響を与えることもそれを減少させることもない置換である。例えば、ＩＬ−７Ｒα特異的抗体は、参照抗体配列と比較して最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または最大で１０の保存的置換を含み得、ＩＬ−７Ｒαに対する特異的結合活性を保持し得る。保存的バリエーションという用語は、未置換の親アミノ酸の代わりの、置換されたアミノ酸の使用もまた含む。

【0069】

さらに、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸または小さい百分率のアミノ酸（例えば、５％未満、一部の実施形態では１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、変更が、１つのアミノ酸の、化学的に類似のアミノ酸による置換を生じる場合、保存的バリエーションであることを認識する。

【0070】

機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換とみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0071】

非保存的置換は、ＩＬ−７Ｒα特異的抗体の活性または機能、例えば、ＩＬ−７Ｒαに特異的に結合する能力を低減させる置換である。例えば、アミノ酸残基がタンパク質の機能にとって必須である場合、他の場合には保存的である置換であっても、その活性を破壊し得る。したがって、保存的置換は、目的のタンパク質の基本的機能を変更させない。

【0072】

接触：ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかとして起こり得る、固体形態および液体形態の両方を含む、直接的な物理的会合状態にある配置。接触には、１つの分子と別の分子との間の接触、例えば、抗体などの別のポリペプチドと接触する、抗原などの１つのポリペプチドの表面上のアミノ酸が含まれる。接触には、例えば、抗体を細胞との直接的な物理的会合状態に置くことによる、細胞との接触も含まれ得る。

【0073】

対照：参照標準。一部の実施形態では、対照は、陰性対照、例えば、特定の悪性腫瘍を有さない健康な患者から得られた試料である。他の実施形態では、対照は、陽性対照、例えば、悪性腫瘍と診断された患者から得られた組織試料である。なお他の実施形態では、対照は、歴史的対照または標準参照値もしくは値の範囲（例えば、以前に試験された対照試料、例えば、既知の予後もしくは転帰を有する患者の群、またはベースラインもしくは正常値を示す試料の群）である。

【0074】

試験試料と対照との間の差異は、増加または逆に減少であり得る。差異は、質的差異または量的差異、例えば、統計的有意差であり得る。一部の例では、差異は、対照と比較して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％または少なくとも約５００％の増加または減少である。

【0075】

皮膚Ｔ細胞リンパ腫：Ｔ細胞によって引き起こされる非ホジキンリンパ腫のクラス。悪性Ｔ細胞は、最初に皮膚に移動して、種々の病変を出現させる。これらの病変は、疾患の進行に伴って形状を変化させ、典型的には、発疹のように見えるものから始まって、最終的にはプラークおよび腫瘍を形成し、その後、身体の他の部分に転移する。皮膚Ｔ細胞リンパ腫には、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０−皮膚大細胞型Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下型Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫および芽球型ＮＫ細胞リンパ腫が含まれる。

【0076】

縮重バリアント：本開示に関して、「縮重バリアント」とは、遺伝コードの結果として縮重である配列を含むタンパク質（例えば、ＣＣＲ４を特異的に認識するＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを指す。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどは、１つよりも多いコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＣＡＲのアミノ酸配列が変化しない限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。

【0077】

検出可能なマーカー：第２の分子の検出を促進するために抗体などの第２の分子に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な分子（標識としても公知）。例えば、検出可能なマーカーは、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡検査または診断的画像化技術（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能であり得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。一例では、「標識された抗体」とは、抗体における別の分子の取り込みを指す。例えば、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射能標識されたアミノ酸の取り込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的または比色的方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分の、ポリペプチドへの結合である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：放射性同位体もしくは放射性核種（例えば、^３５Ｓまたは^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、または磁性薬剤、例えばガドリニウムキレート。一部の実施形態では、標識には、潜在的な立体障害を低減させるために、種々の長さのスペーサーアームが結合される。検出可能なマーカーを使用するための方法、および種々の目的のために適切な検出可能なマーカーの選択におけるガイダンスは、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版、Cold Spring Harbor、New York、２０１２年）およびAusubelら（In Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、補遺１０４まで、２０１３年）で議論されている。

【0078】

検出：何かの存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）、存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）または事実、例えば、リンパ系悪性腫瘍などの悪性腫瘍、またはＨＩＶ感染の存在を同定すること。検出の一般的な方法は、当業者に公知であり、これには、本明細書で開示されるプロトコールおよび試薬が追加され得る。

【0079】

びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫：成人における非ホジキンリンパ腫の最も一般的な型。この病気の最初の徴候は、典型的には、発熱、体重減少および寝汗と時折関連する、迅速に成長する塊の観察である。細胞形態学の中で、３つの亜型が最も一般的に見られる：中心芽球型、免疫芽球型および未分化。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のほとんどの症例は、乏しい細胞質を伴う中間から大きいサイズのリンパ球の出現を有する、中心芽球型である。各核内に２〜４つの核小体を有する、細密なクロマチンを含有する卵形または円形の核が顕著に目に見える。時折、腫瘍は、中心芽球からほぼ完全に構成される単形性であり得る。しかし、ほとんどの症例は、中心芽球型細胞および免疫芽球型細胞の混合物を伴う多形性である。免疫芽細胞は、顕著な好塩基球性細胞質および中心核小体を有する。腫瘍は、その細胞の９０％よりも多くが免疫芽細胞である場合、免疫芽球型と分類され得る。未分化リンパ腫は、それらの正常なＢ細胞対応物とは非常に異なる外観の腫瘍細胞からなる。細胞は一般に、円形、卵形または多角形の形状および多形性核を伴って非常に大きく、リード・シュテルンベルグ細胞と類似し得る。

【0080】

薬物：対象における疾患または状態を処置、寛解または予防するために使用される任意の化合物。本明細書の一部の実施形態では、薬物は化学療法剤である。

【0081】

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である、即ち、特異的免疫応答を惹起する、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。一部の例では、開示された抗体は、ＣＣＲ４上のエピトープに特異的に結合する。

【0082】

発現：核酸配列の転写または翻訳。例えば、遺伝子は、そのＤＮＡが、一部の例ではプロセシングされてｍＲＮＡになるＲＮＡまたはＲＮＡ断片へと転写される場合、発現され得る。遺伝子は、そのｍＲＮＡがアミノ酸配列、例えば、タンパク質またはタンパク質断片へと翻訳される場合にも、発現され得る。特定の例では、異種遺伝子は、それがＲＮＡへと転写される場合、発現される。別の例では、異種遺伝子は、そのＲＮＡがアミノ酸配列へと翻訳される場合、発現される。発現の調節には、転写、翻訳、ＲＮＡの輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する制御、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解を介した制御が含まれ得る。

【0083】

発現制御配列：動作可能に連結した異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写を制御および調節し、必要に応じて核酸配列の翻訳を制御および調節する場合、その核酸配列に動作可能に連結している。したがって、発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および終止コドンが含まれ得る。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現に影響し得る構成成分を含むことが意図され、その存在が有利であるさらなる構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列もまた含み得る。発現制御配列には、プロモーターが含まれ得る。

【0084】

プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小配列である。プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞型特異的、組織特異的、または外部シグナルもしくは薬剤によって誘導性なように制御可能なものにするのに十分であるプロモーターエレメントもまた含まれる；かかるエレメントは、遺伝子の５’または３’領域中に位置し得る。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Bitterら、Methods in Enzymology １５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照のこと）。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などが使用され得る。一実施形態では、哺乳動物細胞系においてクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルス長鎖末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る。組換えＤＮＡまたは合成技術によって産生されるプロモーターもまた、核酸配列の転写を提供するために使用され得る。

【0085】

ポリヌクレオチドは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を促進する、プロモーター配列を含有する発現ベクター中に挿入され得る。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の核酸配列を含有する。

【0086】

発現ベクター：発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系中で供給され得る。発現ベクターには、当該分野で公知のもの全て、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド、またはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。

【0087】

Ｆｃポリペプチド：第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド。Ｆｃ領域とは、一般に、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指す。Ｆｃ領域は、これらのドメインに対してＮ末端側の可撓性ヒンジの一部または全てもまた含み得る。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃ領域は、尾部を含んでも含まなくてもよく、Ｊ鎖によって結合されていてもいなくてもよい。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣγ２との間のヒンジの下の部分を含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、この番号付けは、Ｋａｂａｔと同様、ＥＵインデックスに従う。ＩｇＡについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣアルファ２およびＣアルファ３（Ｃα２およびＣα３）、ならびにＣアルファ１（Ｃα１）とＣα２との間のヒンジの下の部分を含む。

【0088】

ホジキンリンパ腫：その約半分がエプスタイン・バーウイルス感染に起因するＢ細胞リンパ腫の型。２つの主要な型のホジキンリンパ腫が存在する：古典的ホジキンリンパ腫および結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫。診断は、リンパ節中に多核化したリード・シュテルンベルグ細胞（ＲＳ細胞）などのホジキン細胞を見出すことによる。古典的ホジキンリンパ腫は、リンパ節生検標本において見られるリード・シュテルンベルグ細胞の形態学および反応性細胞浸潤物の組成（リード・シュテルンベルグ細胞（単数または複数）の周囲の細胞組成）に基づいて、４つの病理的サブタイプ（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型およびリンパ球減少型）に下位分類され得る。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫はＣＤ２０を発現するが、古典的ホジキンリンパ腫はＣＤ２０を発現しない。

【0089】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）：ＨＩＶ感染を引き起こし、時間と共に後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレンチウイルス。ＡＩＤＳは、免疫系の進行性の不全が、生命を脅かす日和見感染およびがんを繁栄させる、ヒトにおける状態である。処置しない場合、ＨＩＶによる感染後の平均生存時間は、ＨＩＶのサブタイプに依存して、９〜１１年であると推定される。２つの型のＨＩＶが特徴付けられている：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２。ＨＩＶ−１は、最初に発見されたウイルスであり、ＬＡＶおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩの両方で呼ばれ、より毒性が高くより感染性が高いサブタイプである。ＨＩＶは、他のレトロウイルスとは構造が異なる。ウイルス粒子は、大まかに球状であり、約１２０ｎｍの直径を有する。これは、２，０００コピーのウイルスタンパク質ｐ２４から構成される円錐体カプシドによって封入されたウイルスの９つの遺伝子をコードする２コピーのプラス鎖一本鎖ＲＮＡから構成される。一本鎖ＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質、ｐ７、ならびにビリオンの発達のために必要な酵素、例えば、逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼおよびインテグラーゼに緊密に結合される。ウイルスタンパク質ｐ１７から構成されるマトリックスは、カプシドを取り囲み、ビリオン粒子の完全性を確実にする。ＨＩＶは、種々の免疫細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、マクロファージおよびミクログリア細胞に感染できる。

【0090】

単離された：構成成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的構成成分、即ち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離された、それらとは別に産生された、またはそれらと別に精製された、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、例えば抗体）。したがって、単離された核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学合成された核酸もまた包含する。単離された核酸、ペプチドまたはタンパク質、例えば抗体は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋であり得る。

【0091】

リンカー：２つの分子を１つの連続した分子へと連結させるため、例えば、エフェクター分子を抗体に連結させるために使用され得る二重機能性分子。一部の実施形態では、提供されるコンジュゲートは、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体との間にリンカーを含む。一部の場合には、リンカーは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌを間接的に結合させるように機能する、抗原結合性断片（例えば、Ｆｖ断片）内のペプチドである。

【0092】

用語「コンジュゲートする」、「連結させる（ｊｏｉｎｉｎｇ）」、「結合させる」または「連結させる（ｌｉｎｋｉｎｇ）」とは、２つの分子を１つの連続した分子にすること；例えば、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチドへと連結させること、またはエフェクター分子もしくは検出可能なマーカー放射性核種もしくは他の分子を、ｓｃＦｖなどのポリペプチドに共有結合させることを指し得る。具体的な文脈では、これらの用語は、抗体部分などのリガンドをエフェクター分子に連結させることに対する言及を含む。連結は、化学的手段または組換え手段のいずれかにより得る。「化学的手段」とは、抗体部分とエフェクター分子との間で共有結合が形成されて１つの分子を形成するような、これら２つの分子間での反応を指す。

【0093】

リンパ系悪性腫瘍：リンパ腫および白血病。血液学的悪性腫瘍は、２つの主要な血液細胞系譜：骨髄系細胞株およびリンパ系細胞株のいずれかに由来し得る。骨髄系細胞株には、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞が含まれる；リンパ系細胞株は、Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を生じる。リンパ腫、リンパ性白血病および骨髄腫は、リンパ系系統由来である。

【0094】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：ＮＫ細胞は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、共通のリンパ系前駆体生成性ＢおよびＴリンパ球から分化する、自然リンパ系細胞である。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺および胸腺において分化および成熟することが公知である。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）も汎ＴマーカーＣＤ３も表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体も発現しないが、通常、ヒトでは表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６を発現し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではＮＫ１．１またはＮＫ１．２を発現する。ＮＫｐ４６細胞表面マーカーは、ヒト、いくつかの系統のマウス、およびサル種において発現される。

【0095】

核酸：ホスホジエステル結合、関連する天然に存在する構造的バリアント、およびそれらの合成の天然に存在しないアナログを介して連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造的バリアント、およびそれらの合成の天然に存在しないアナログ）から構成されるポリマー。したがって、この用語は、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などであるがこれらに限定されない天然に存在しない合成アナログを含む、ヌクレオチドポリマーを含む。かかるポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して合成され得る。用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には、短いポリヌクレオチド、一般に、約５０ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって示される場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（即ち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた含むと理解される。

【0096】

従来の表示法が、ヌクレオチド配列を記述するために本明細書で使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；二本鎖ヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’の方向での付加は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と呼ばれる；そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれる；ＲＮＡと同じ配列を有し、コードするＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。

【0097】

「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかの、ｍＲＮＡに対して相補的または同一なＤＮＡを指す。

【0098】

「コードする」とは、規定された配列のヌクレオチド（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定された配列のアミノ酸のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能するような、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ中のヌクレオチドの具体的配列の固有の特性、ならびにそれらから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に対して同一であり、配列表中に通常提供されるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると言われ得る。特記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。

【0099】

ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの改変形態であり得る。この用語は、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡを含む。

【0100】

作動可能に連結した：第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係して配置される場合、第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続しており、必要に応じて、同じリーディングフレームで２つのタンパク質コード領域を連結する。

【0101】

薬学的に許容される担体：使用される薬学的に許容される担体は、従来のものである。E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１９版、１９９５年は、開示された薬剤の薬学的送達に適切な組成物および製剤を記載している。

【0102】

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、ビヒクルとして、通常、薬学的および生理的に許容される流体、例えば、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤形態）について、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、添加された防腐剤（例えば、非天然防腐剤）、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。特定の例では、薬学的に許容される担体は、無菌であり、例えば注射による対象への非経口投与に適切である。一部の実施形態では、活性薬剤および薬学的に許容される担体は、丸剤などの単位投薬形態で、またはバイアル中に選択された量で、提供される。単位投薬形態は、（例えば、薬剤の計量された投薬量が選択的に分配され得るバイアル中に）１つの投薬量または複数の投薬量を含み得る。

【0103】

ポリペプチド：モノマーが、アミド結合を介して一緒に連結されるアミノ酸残基である、ポリマー。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体の異性体のいずれかが使用され得、Ｌ−異性体が好ましい。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの改変配列を含むことが意図される。ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびに組換えまたは合成により産生されたタンパク質の両方を含む。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、開示された抗体またはその断片である。

【0104】

ポリペプチド改変：ポリペプチドは、未改変のペプチドと本質的に同じ活性およびコンフォメーションを有し、任意選択で他の望ましい特性を有する誘導体を産生するために、種々の化学的技術によって改変され得る。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端であれ側鎖であれ、薬学的に許容されるカチオンの塩の形態で提供され得る、またはＣ_１〜Ｃ_１６エステルを形成するようにエステル化され得る、または式ＮＲ_１Ｒ_２のアミドに変換され得、式中、Ｒ_１およびＲ_２は各々独立してＨもしくはＣ_１〜Ｃ_１６アルキルであり、または５員環もしくは６員環などの複素環式環を形成するように組み合わされ得る。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端であれ側鎖であれ、薬学的に許容される酸付加塩、例えば、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩および他の有機塩の形態であり得、あるいはＣ_１〜Ｃ_１６アルキルもしくはジアルキルアミノに改変され得、またはアミドにさらに変換され得る。

【0105】

ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、十分認識された技術を使用して、Ｃ_１〜Ｃ_１６アルコキシまたはＣ_１〜Ｃ_１６エステルに変換され得る。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、１つもしくは複数のハロゲン原子、例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩで、またはＣ_１〜Ｃ_１６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１６アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはかかるカルボン酸のアミドで置換され得る。ペプチド側鎖のメチレン基は、対応するＣ_２〜Ｃ_４アルキレンへと伸長され得る。チオールは、いくつかの十分認識された保護基のうちいずれか１つ、例えば、アセトアミド基で保護され得る。

【0106】

組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する核酸、またはさもなければ分離されていた２つのセグメントの配列の人工的組合せによって作製された配列を有する核酸である。この人工的組合せは、化学合成によって、またはより一般的には、例えば遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって、達成され得る。組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するタンパク質、またはさもなければ分離されていた２つのセグメントの配列の人工的組合せによって作製された配列を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、宿主細胞、例えば、細菌または真核生物細胞中に導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。核酸は、例えば、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現させることが可能なシグナルを有する発現ベクター上で導入され得、または核酸は、宿主細胞染色体中に組み込まれ得る。

【0107】

配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性の観点から表現され、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性は、百分率同一性（または類似性もしくは相同性）の観点で頻繁に測定される；百分率が高くなるほど、２つの配列はより類似である。ポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインした場合、比較的高い程度の配列同一性を有する。

【0108】

比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、以下に記載されている：SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.２巻：４８２頁、１９８１年；NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.４８巻：４４３頁、１９７０年；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８５巻：２４４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、Gene ７３巻：２３７頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、CABIOS ５巻：１５１頁、１９８９年；Corpetら、Nucleic Acids Research １６巻：１０８８１頁、１９８８年；ならびにPearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８５巻：２４４４頁、１９８８年。Altschulら、Nature Genet.６巻：１１９頁、１９９４年は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な留意事項を示している。

【0109】

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：４０３頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと併せた使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定するための方法の記載は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。

【0110】

ポリペプチドに特異的に結合する抗体のＶ_ＬまたはＶ_Ｈのホモログおよびバリアントは、典型的には、目的のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数した、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性の保有によって特徴付けられる。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、漸増する百分率同一性、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。配列全体未満が配列同一性について比較されている場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を保有し、参照配列に対するそれらの類似性に依存して、少なくとも８５％または少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を保有し得る。かかる短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が、ガイダンスとしてのみ提供されることを理解する；提供された範囲の外側に入る強く顕著なホモログを得ることが完全に可能である。

【0111】

２つまたはそれよりも多くのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の配列の関係性を記述するために使用される用語には、「参照配列」、「〜から選択される」、「比較ウインドウ」、「同一」、「配列同一性の百分率」、「実質的に同一」、「相補的」および「実質的に相補的」が含まれる。

【0112】

核酸配列の配列比較のために、典型的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列は、コンピューターに入力され、必要に応じて、下位配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが使用される。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.２巻：４８２頁、１９８１年の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.４８巻：４４３頁、１９７０年の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman、Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA ８５巻：２４４４頁、１９８８年の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピューター実行によって、または手動アラインメントおよび目視検査によって、実施され得る（例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版、Cold Spring Harbor、New York、２０１２年）およびAusubelら（In Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、補遺１０４まで、２０１３年）を参照のこと）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、FengおよびDoolittle、J. Mol. Evol.３５巻：３５１〜３６０頁、１９８７年の累進アラインメント方法の単純化を使用する。使用される方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS ５巻：１５１〜１５３頁、１９８９年によって記載される方法と類似している。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列は、以下のパラメーターを使用してパーセント配列同一性関係を決定するために、他の試験配列と比較される：デフォルトギャップウェイト（３．００）、デフォルトギャップ長ウェイト（０．１０）および重み付けエンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０から得ることができる（Devereauxら、Nuc. Acids Res.１２巻：３８７〜３９５頁、１９８４年）。

【0113】

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの別の例は、Altschulら、J. Mol. Biol.２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年およびAltschulら、Nucleic Acids Res.２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９７７年に記載されるＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を介して公に入手可能である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列について）は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスをデフォルトとして使用する（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻：１０９１５頁、１９８９年を参照のこと）。オリゴヌクレオチドは、最大で約１００ヌクレオチド塩基長の直鎖ポリヌクレオチド配列である。

【0114】

特異的に結合する：抗体または抗原結合性断片に言及する場合、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団の存在下で標的タンパク質、ペプチドまたは多糖の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、抗体は、特定の標的タンパク質、ペプチドまたは多糖（例えば、ＣＣＲ４）に優先的に結合し、試料または対象中に存在する他のタンパク質または多糖には、顕著な量で結合しない。特異的結合は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。抗体−抗原複合体に関して、抗原と抗体との特異的結合は、約１０^−７モル濃度未満、例えば、約１０^−８モル濃度、１０^−９未満、またはさらには約１０^−１０モル濃度未満のＫ_Ｄを有する。

【0115】

Ｋ_Ｄとは、所与の相互作用、例えば、ポリペプチドリガンド相互作用または抗体抗原相互作用についての解離定数を指す。例えば、抗体または抗原結合性断片と抗原との二分子相互作用について、Ｋ_Ｄは、複合体の濃度によって除算した、二分子相互作用の個々の構成成分の濃度である。

【0116】

本明細書で開示される抗体は、規定された標的（または二重特異性抗体の場合、複数の標的）に特異的に結合する。したがって、ＣＲ４上のエピトープに特異的に結合する抗体は、ＣＣＲ４が結合するＣＣＲ４基質を発現する細胞もしくは組織、または生物学的標本中のＣＣＲ４を含むＣＣＲ４に実質的に結合する抗体である。もちろん、ある程度の非特異的相互作用が、抗体、または抗体を含むコンジュゲート（例えば、ＣＣＲ４を特異的に結合する抗体、またはかかる抗体を含むコンジュゲート）と非標的（例えば、ＣＣＲ４を発現しない細胞）との間で生じ得ることが認識される。典型的には、特異的結合は、抗体とタンパク質または抗原を欠く細胞との間よりも、抗体とタンパク質または抗原を保有する細胞との間で、かなり強い会合を生じる。特異的結合は、典型的には、タンパク質またはこのエピトープを欠く細胞もしくは組織と比較して、エピトープを含むタンパク質または標的エピトープを発現する細胞もしくは組織に結合した抗体の量（単位時間当たり）における、２倍よりも大きい、例えば、５倍よりも大きい、１０倍よりも大きい、または１００倍よりも大きい増加を生じる。かかる条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体または他のリガンドを選択するために適切である。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載については、HarlowおよびLane、Antibodies, A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Publications、New York（２０１３年）を参照のこと。

【0117】

対象：生きた多細胞の脊椎動物生物。ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー。ある例では、対象はヒトである。特定の例では、対象は、小児科対象、例えば、２〜５歳のヒト小児である。さらなる例では、リンパ系悪性腫瘍を有するまたはリンパ系悪性腫瘍を有するリスクがある対象が選択される。さらなる例では、固形腫瘍を有するまたは固形腫瘍を有するリスクがある対象が選択される。

【0118】

Ｔ細胞：細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の型。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって、他のリンパ球、例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞から識別され得る。これらは、胸腺において胸腺細胞から成熟するので、Ｔ細胞と呼ばれる。一般に、成熟Ｔ細胞は、ＣＤ３を発現する。

【0119】

治療有効量：単独で、または１つもしくは複数のさらなる薬剤と一緒になって、所望の応答、例えば、対象におけるＣＣＲ４陽性がんの処置などを誘導する、薬剤（例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の量。対象に投与される場合、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示されている標的組織濃度を達成する投薬量が一般に使用される。理想的には、治療有効量は、対象において実質的な細胞傷害効果を引き起こすことなく、治療効果を提供する。

【0120】

一例では、所望の応答は、対象におけるＣＣＲ４陽性がん細胞のサイズ、体積もしくは数（例えば、転移）、および／または対象における新生物性病変、もしくは血液中の白血病細胞の数を減少させることである。例えば、薬剤は、その薬剤の非存在下での応答と比較して、ＣＣＲ４陽性がん細胞のサイズ、体積もしくは数、および／または新生物性病変、もしくは血液中の白血病細胞の数を、所望の量、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、減少させ得る。

【0121】

本明細書で開示されるいくつかの調製物は、治療有効量で投与される。ヒトまたは獣医学対象に投与される治療有効量は、対象と関連するいくつかの因子、例えば、対象の健康全般に依存して変動する。治療有効量は、投薬量を変動させ、生じた治療応答、例えば、ＣＣＲ４陽性リンパ系悪性腫瘍の退縮を測定することによって決定され得る。治療有効量は、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイを介して決定することもできる。開示された薬剤は、所望の応答を得るために必要に応じて、単一の用量でまたはいくつかの用量で投与され得る。しかし、治療有効量は、適用される供給源、処置される対象、処置される状態の重症度および型、ならびに投与様式に依存し得る。

【0122】

治療有効量は、以前の投与または引き続く投与と組み合わせて治療応答の達成に寄与する、部分用量を包含する。例えば、治療有効量の薬剤は、例えば、数日間または数週間持続する処置の過程の間に毎日、単一の用量でまたはいくつかの用量で投与され得る。しかし、治療有効量は、処置される対象、処置される状態の重症度および型、ならびに投与様式に依存し得る。単位投薬形態の薬剤は、例えば、無菌構成成分を有するバイアル（例えば、突き刺し可能な蓋を有する）またはシリンジ中に、１つの治療的量でまたは複数の治療的量で包装され得る。

【0123】

形質導入および形質転換された：形質転換された細胞は、核酸分子が分子生物学の技術によって導入された細胞である。本明細書で使用する場合、形質導入および形質転換という用語は、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、プラスミドベクターの使用、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクションおよびパーティクルガン加速によるＤＮＡの導入を含む、核酸分子がかかる細胞中に導入され得る全ての技術を包含する。

【0124】

疾患を処置するまたは予防する：疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発達を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病態が発達し始めた後の、その徴候または症状の寛解、例えば、腫瘍負荷における低減または転移の数もしくはサイズにおける減少をもたらす治療的介入を指す。「寛解させる」とは、悪性腫瘍などの疾患の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。

【0125】

腫瘍：良性または悪性（悪性腫瘍）であり得る、細胞の異常な成長。がんは、異常なまたは制御されない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）（悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ））である。悪性腫瘍と関連する場合が多い他の特色には、転移、隣接細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、および炎症または免疫学的応答の抑制または増悪、周囲または遠位の組織または臓器、例えばリンパ節の浸潤などが含まれる。「転移性疾患」とは、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流またはリンパ系を介して身体の他の部分に移動するがん細胞を指す。

【0126】

個体中の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲の組織に侵襲するおよび／または転移できる腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。

【0127】

血液学的腫瘍の例には、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（低悪性度および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常症が含まれる。具体的な非限定的な例では、リンパ系悪性腫瘍は、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であり得る。

【0128】

肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん（基底乳癌（ｂａｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳管癌および小葉乳癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィスムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyrgioma）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽細胞腫）が含まれる。いくつかの例では、腫瘍は、乳、卵巣、胃または食道がんである。

【0129】

ベクター：宿主細胞中に導入され、それによって、形質転換された宿主細胞を生成する核酸分子。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、宿主細胞中でそれが複製するのを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターは、当該分野で公知の１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントもまた含み得る。ウイルスベクターは、１種または複数のウイルスに由来する少なくともいくらかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。複製欠損ウイルスベクターは、複製に重要な少なくとも１つの遺伝子機能における欠損に起因して、複製に必要なウイルスゲノムの１つまたは複数の領域の補完を必要とするベクターである。例えば、典型的な宿主細胞、特に、治療方法の過程においてウイルスベクターが感染し得るヒト患者中の宿主細胞中でウイルスベクターが複製しないように。
キメラ抗原受容体

【0130】

膜貫通ドメインに連結され、１つまたは複数の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された、ＣＣＲ４に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む、人工的に構築されたキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が開示される。開示されたＣＡＲの特徴には、ＭＨＣ拘束されない様式で、ＣＣＲ４発現細胞、例えば、ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを発現する細胞に対してＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。ＭＨＣ拘束されないＣＣＲ４認識は、開示されたＣＡＲを発現するＴ細胞（またはＮＫ細胞）に、抗原プロセシング非依存的に抗原を認識する能力を与える。

【0131】

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメインまたはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分を含むＣＡＲの部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子、例えば４−１ＢＢの細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。ＣＡＲは、以下にさらに詳細に開示される。

【0132】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）ｍＡＢ２−３抗体の軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む細胞外ｓｃＦｖであって、ＣＣＲ４に特異的に結合する、ｓｃＦｖ；（ｂ）ＣＤ８由来のヒンジおよび膜貫通ドメイン；（ｃ）細胞内４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン；ならびに（ｄ）細胞内ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、（ａ）〜（ｄ）は、Ｎ末端からＣ末端の順である。一部の実施形態では、例えば、マウス免疫グロブリンシグナル配列であるがこれに限定されないシグナル配列が、ｓｃＦｖに対してＮ末端側に含まれる。

【0133】

Ａ．細胞外領域
開示されたＣＡＲは、ＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＣＲ４に特異的に結合するｍＡｂ１５６７が、本明細書で開示されるキメラ抗原結合受容体において使用され得る。ｍＡｂ２−３と呼ばれる、この抗体の親和性成熟したヒト化形態（参照により本明細書に組み込まれる、Changら、Mol Cancer Ther.２０１２年；１１巻（１１号）：２４５１〜２４６１頁を参照のこと）もまた、ＣＡＲ中に含まれ得る。ＣＣＲ４に特異的に結合する他のモノクローナル抗体は、市販されており、当該分野で公知である。例えば、ＰＬＯＳ ｏｎｅのウェブサイト（ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ＿ｐｌｏｓｏｎｅ＿ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１０３７７６）上でオンラインで入手可能な、Hagemannら、PLOS One、２０１４年を参照のこと。ＣＣＲ４に特異的に結合する任意の抗体またはその抗原結合性断片が、キメラ抗原受容体中に含まれ得る。

【0134】

一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ｍＡｂ１５６７またはｍＡｂ２−３抗体（ｍＡｂ１５６７の親和性成熟形態）のそれぞれＶ_ＨおよびＶ_ＬのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含み得る。これらの抗体についてのＨＣＤＲおよびＬＣＤＲの位置は、Changらの図３に提供されている。ヒト化ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｈのアミノ酸配列は、

【化1】

であり、配列中、ＣＤＲ配列は、太字かつ下線である。

【0135】

したがって、一部の実施形態では、モノクローナル抗体の抗原結合性断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含む。

【0136】

ヒト化ｍＡｂ１５６７のＶ_Ｌのアミノ酸配列は、

【化2】

であり、配列中、ＬＣＤＲ配列は、太字かつ下線である。

【0137】

一部の実施形態では、モノクローナル抗体の抗原結合ドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む。

【0138】

さらなる実施形態では、抗原結合ドメインの重鎖ドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ２を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含み、モノクローナル抗体の抗原結合ドメインの軽鎖ドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含む。具体的な非限定的な例では、抗原結合ドメインは、配列番号１および２として示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり得る。ｓｃＦｖを創出するために、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ配列が連続した単鎖タンパク質として発現され得、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインが可撓性リンカーによって連結されるように、Ｖ_ＬコードＤＮＡ断片およびＶ_ＨコードＤＮＡ断片は、可撓性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ）_３をコードする別の断片に動作可能に連結され得る（例えば、Birdら、Science ２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：５８７９〜５８８３頁、１９８８年；McCaffertyら、Nature ３４８巻：５５２〜５５４頁、１９９０年；KontermannおよびDubel（編）、Antibody Engineering、第１〜２巻、第２版、Springer Press、２０１０年；HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、２０１３年を参照のこと）。任意選択で、フューリン切断部位などの切断部位が、リンカー中に含まれ得る。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）として示されるアミノ酸配列を含むリンカーなどのペプチドリンカーによって連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含む。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、Ｖ_ＬまたはＶ_ＨのいずれかがｓｃＦｖのＮ末端にあるように、任意の順序であり得る。具体的な非限定的な一例では、Ｖ_ＬがＮ末端にある。

【0140】

ＣＡＲは、例えば、抗原結合ドメインに対してＮ末端側に、シグナルペプチド配列を含み得る。シグナルペプチド配列は、任意の適切なシグナルペプチド配列を含み得る。ある実施形態では、シグナルペプチド配列は、マウス免疫グロブリン軽鎖カッパシグナル配列、例えば、ＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ（配列番号４）を含むまたはこれからなるアミノ酸配列である。しかし、当該分野で公知の他のシグナル配列が利用され得る。別の例では、シグナルペプチド配列は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体配列、例えば、ＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＤＴ（配列番号５）を含むまたはこれからなるアミノ酸配列である。さらなる例では、シグナルペプチド配列は、ＩＬ−２シグナルペプチドである。シグナルペプチド配列は、細胞の表面上でのＣＡＲの発現を促進し得るが、発現されたＣＡＲ中のシグナルペプチド配列の存在は、ＣＡＲが機能するために必要ではない。細胞表面上でのＣＡＲの発現の際に、シグナルペプチド配列は、ＣＡＲから切断されて除かれ得る。したがって、一部の実施形態では、ＣＡＲはシグナルペプチド配列を欠く。

【0141】

ＣＡＲの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ポリペプチド配列を含むスペーサードメインが存在し得る。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、例えば、１０〜１００アミノ酸、例えば、２５〜５０アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、スペーサードメインは、免疫グロブリンドメイン、例えば、ヒト免疫グロブリン配列を含み得る。ある実施形態では、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ_ｌ）ドメイン配列（ＣＨ２ＣＨ３）を含む。これに関して、スペーサードメインは、
配列番号６：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK
として示されるアミノ酸配列を含むまたはこれからなる免疫グロブリンドメインを含み得る。

【0142】

特定の理論に束縛されないが、ＣＨ２ＣＨ３ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の膜から離れてＣＡＲの抗原結合ドメインを伸長させ、ネイティブＴＣＲのサイズおよびドメイン構造をより正確に模倣し得ると考えられる。しかし、ＣＨ２ＣＨ３ドメインは必要とされない場合がある。一部の実施形態では、スペーサーは省略され、その結果存在しない。

【0143】

Ｂ．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計され得る。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質由来であり得る。開示されたＣＡＲにおける使用のための例示的な膜貫通ドメインには、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域（単数または複数）を少なくとも含み得る。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、この場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの優勢に疎水性の残基を含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。

【0144】

任意選択で、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインおよび／またはＴ細胞共刺激ドメインとの間に連結を形成し得る。例示的なリンカー配列は、１つまたは複数のグリシン−セリン二つ組を含む。例えば、リンカーは、ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３）を含み得るまたはこれからなり得る。

【0145】

一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。したがって、ＣＡＲは、
ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQP LSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFAC DIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHR（配列番号７）
を含むまたはこれからなるＣＤ８膜貫通ドメインを含み得る。

【0146】

他の実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ１３７またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。例示的なＣＤ２８膜貫通ドメインは、
配列番号１９：IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVR
を含むまたはこれからなる。

【0147】

Ｃ．細胞内領域
ＣＡＲの細胞内領域は、ＣＡＲが発現または配置されるＴ細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う１つまたは複数の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。例示的なＴ細胞シグナル伝達ドメインは、本明細書で提供され、当業者に公知である。

【0148】

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン全体がＣＡＲにおいて使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、それが適切なＴ細胞エフェクター機能シグナルを伝達する限り、かかるトランケートされた部分が、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。ＣＡＲにおける使用のための細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの例には、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共刺激分子の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。

【0149】

ＣＡＲにおける使用のための細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの例には、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共刺激分子の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアントおよび同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。

【0150】

Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、Ｔ細胞受容体複合体の一次的な活性化を調節する。開示されたＣＡＲは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る、刺激性の様式で作用する主要細胞質シグナル伝達配列を含み得る。開示されたＣＡＲ中に含まれ得るＩＴＡＭ含有主要細胞質シグナル伝達配列の例には、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄタンパク質由来のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ由来の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。

【0151】

ＣＡＲの細胞内領域は、ＩＴＡＭ含有主要細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ）を、単独で、またはＣＡＲに関連して有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（単数または複数）と組み合わせて含み得る。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分、および例えば４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）ドメインであるがこれに限定されない細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２ＣおよびＢ７−Ｈ３が含まれる。

【0152】

かかるＴ細胞シグナル伝達ドメインの例示的なアミノ酸配列が提供される。例えば、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG CSCRFPEEEEGGCEL（配列番号８）
として示されるアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。

【0153】

さらに、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELN LGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKD KMAEAYSEIGMKGERRRGKG HDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR（配列番号９）
として示されるアミノ酸配列を含み得るまたはこれからなり得る。

【0154】

ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムに、または特定の順序で互いに連結され得る。非限定的な一例では、４−１ＢＢドメインは、ＣＤ３ゼータドメインのアミノ末端に含まれる。任意選択で、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間の短いポリペプチドリンカーが、これら２つのドメイン間に連結を形成し得る。グリシン−セリン二つ組が、特に適切なリンカーを提供する。さらに、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ポリペプチド配列を含むスペーサードメインが存在し得る。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、例えば、１０〜１００アミノ酸、例えば、２５〜５０アミノ酸を含み得る。
Ｄ．ＣＡＲのさらなる記載

【0155】

一部の実施形態では、ドメインの順序は、Ｎ末端、シグナル配列、ＶＬ−リンカー−ＶＨ（またはＶＨ−リンカー−ＶＬ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ヒト４−１ＢＢシグナル伝達分子、ヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達分子、Ｃ末端である。本開示の例示的なＣＡＲは、

【化3】

として示されるアミノ酸配列を含むまたはこれからなる。

【0156】

配列番号１０中、シグナル配列は太字で示され、Ｖ_Ｌは下線で示され、リンカーはイタリックで示され、Ｖ_Ｈは、太字／下線の組合せで示され、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインは強調され、ヒト４−１ＢＢシグナル伝達分子は、イタリックおよび下線の組合せで示され、ヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達分子は、紫色（およびプレーンなテキスト）で示される。

【0157】

本明細書に記載されるＣＡＲのいずれかの機能的部分もまた提供される。用語「機能的部分」は、ＣＡＲに関して使用する場合、ＣＡＲの任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それが一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持し、したがって、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞をＣＣＲ４に標的化するために使用され得る。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度まで、同じ程度まで、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持するＣＡＲの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも多くを含み得る。

【0158】

ＣＡＲまたはその機能的部分は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、または両方の末端においてさらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。一部の例では、さらなるアミノ酸は、ＣＡＲまたは機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防などを妨害しない。他の例では、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。

【0159】

親ＣＡＲに対する実質的なまたは顕著な配列同一性または類似性を有する、本明細書に記載されるＣＡＲの機能的バリアントもまた提供され、この機能的バリアントは、それがバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度まで、同じ程度まで、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、アミノ酸配列において少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれよりも高く同一であり得る。

【0160】

機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいはまたはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合には、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしない。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性が親ＣＡＲと比較して増加されるように、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得る。ＣＡＲは、分子の活性が変化しない限り、最大で１０の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の保存的置換を含み得る。置換は、例えば、リンカー領域、スペーサーおよび／またはシグナル配列においてなされ得る。

【0161】

ＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、ａ−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−およびトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α（oc）−アミノシクロヘプタンカルボン酸、−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、ならびにα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが含まれる。ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化され得、アミド化され得、カルボキシル化され得、リン酸化され得、エステル化され得、Ｎ−アシル化され得、例えばジスルフィド架橋を介して環化され得、または酸付加塩へと変換され得、および／あるいは任意選択で二量体化もしくは重合され得、またはコンジュゲートされ得る。

【0162】

キメラ抗原受容体を生成する方法、かかる受容体を含む免疫細胞およびそれらの使用（例えば、がんの処置のため）は、当該分野で公知であり、本明細書にさらに記載されている（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brentjensら、２０１０年、Molecular Therapy、１８巻：４号、６６６〜６６８頁；Morganら、２０１０年、Molecular Therapy、２０１０年２月２３日にオンライン出版、１〜９頁；Tillら、２００８年、Blood、１１２巻：２２６１〜２２７１頁；Parkら、Trends Biotechnol.、２９巻：５５０〜５５７頁、２０１１年；Gruppら、N Engl J Med.、３６８巻：１５０９〜１５１８頁、２０１３年；Hanら、J. Hematol Oncol.、６巻：４７頁、２０１３年；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０７９０００号、同第ＷＯ２０１３／１２６７２６号；および米国公開第２０１２／０２１３７８３号を参照のこと）。例えば、開示されたキメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子は、開示されたＣＡＲを作製するために、Ｔ細胞などの宿主細胞における発現のために発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）中に含まれ得る。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を使用する方法は、対象からＴ細胞を単離するステップ、Ｔ細胞にキメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）を形質転換するステップ、および処置のため、例えば、対象におけるＣＣＲ４陽性がんの処置のために、キメラ抗原受容体を発現する操作されたＴ細胞を対象に投与するステップを含む。
ポリヌクレオチドおよび発現

【0163】

ＣＣＲ４に特異的に結合するＣＡＲのアミノ酸配列をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）が、本明細書で提供される。これらの分子をコードする核酸は、本明細書で提供されるアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列ならびにＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列）、当該分野で利用可能な配列（例えば、フレームワークまたは定常領域配列）、および遺伝コードを使用して、当業者によって容易に産生され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、例えば、ｍＡｂ２−３モノクローナル抗体、ｍＡｂ１５６７モノクローナル抗体またはそれらの抗原結合性断片であるがこれらに限定されない、ＣＣＲ４に特異的に結合するモノクローナル抗体のＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、またはＶ_ＨおよびＶ_Ｌの両方を含むＣＡＲをコードし得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＣＡＲを産生するために、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、Ｔ細胞）において発現され得る。

【0164】

一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする完全核酸配列は、ヒトＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。さらなる実施形態では、ＣＡＲの１つまたは複数の構成成分（Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、シグナル配列、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、ヒト４−１ＢＢシグナル伝達分子、ヒトＣＤ３ゼータシグナル伝達分子）をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得るが、ＣＡＲの構成成分をコードする核酸配列の全てが、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。したがって、一部の実施形態では、核酸配列は、１つまたは複数のコドン最適化された核酸配列を含む。

【0165】

一部の実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖カッパシグナル配列などのシグナル配列をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。したがって、シグナル配列をコードする核酸分子は、
ATGGACTTTCAAGTGCAGATCTTTAGTTTCCTGCTCATAAGCGCTAGTGTGATCATGTCCAGAGGA（配列番号１１）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0166】

他の実施形態では、ＣＡＲ中のシグナル配列をコードする核酸分子は、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、シグナル配列をコードする核酸を含み、この配列は、ヒトＴ細胞および／またはＮＫ細胞などのヒト細胞において、シグナル配列として機能する。

【0167】

さらなる実施形態では、Ｖ_Ｌをコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。したがって、ＣＡＲのＶ_Ｌをコードする核酸は、
GATATTGTGATGACTCAAAGCCCCGACAGTCTGGCCGTGTCTTTGGGCGAGAGAGCCACAATCAACTGCAAGTCCTCACAGAGTATCCTTTATTCCTCTAATCAGAAGAATTACCTCGCATGGTATCAACAAAAACCCGGACAGAGCCCTAAGCTTTTGATCTATTGGGCATCTACCCGAGAATCAGGAGTGCCGGACCGCTTCAGTGGATCAGGATCAGGCACAGACTTTACGCTGACAATATCCTCTCTTCAGGCCGAAGACGTTGCCGTGTACTACTGCCATCAATATATGTCAAGCTACACATTCGGCCAGGGCACCAAACTCGAGATTAAG（配列番号１２）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0168】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１２に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、Ｖ_Ｌをコードする核酸配列を含み、コードされた抗原結合ドメインは、ＣＣＲ４に特異的に結合する。具体的な非限定的な例では、核酸は、ＬＣＤＲ１が配列番号２のアミノ酸２７〜３８を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸５６〜６１を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号２のアミノ酸９５〜１０２を含むＶ_Ｌをコードする。

【0169】

さらに他の実施形態では、Ｖ_Ｈをコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。したがって、ＣＡＲのＶ_Ｈをコードする核酸は、
CAGGTTCAGCTCGTGCAATCAGGGGCAGAGGTCAAGAAGCCGGGTGCCTCTGTGAAGGTGTCATGTAAGGCCTCCGGGTATACTTTTGCCAGCGCCTGGATGCATTGGATGAGGCAGGCGCCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATTGGTTGGATTAATCCCGGAAACGTGAATACTAAGTATAACGAGAAGTTTAAGGGCAGGGCCACACTCACAGTCGACACAAGCACCAATACCGCGTACATGGAACTTTCCAGCCTCCGGTCCGAGGACACTGCGGTGTATTACTGCGCACGCTCCACCTATTACAGACCACTTGATTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTGACCGTGTCTAGC（配列番号１３）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0170】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、Ｖ_Ｈをコードする核酸配列を含み、コードされた抗原結合ドメインは、ＣＣＲ４に特異的に結合する。具体的な非限定的な例では、核酸配列は、ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸２６〜３３を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１のアミノ酸５１〜５８を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１のアミノ酸９９〜１０７を含むＶ_Ｈをコードする。

【0171】

さらなる実施形態では、リンカー配列（Ｖ_Ｈをコードする核酸配列とＶ_Ｌをコードする核酸配列との間に位置する）をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。したがって、ＣＡＲ中のリンカーをコードする核酸は、
TCTAGTGGTGGCGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGCGGAGGGTCC（配列番号１４）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0172】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な、Ｖ_Ｈをコードする核酸配列を含む。

【0173】

より多くの実施形態では、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。したがって、ＣＡＲ中のＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする核酸は、
GCACTCAGCAATTCCATCATGTACTTCTCTCATTTCGTGCCAGTATTTCTGCCTGCCAAGCCAACTACCACACCTGCGCCACGCCCTCCCACGCCCGCACCCACAATTGCTTCACAGCCTCTTTCTCTGCGGCCTGAGGCTTGTCGCCCAGCAGCCGGAGGCGCCGTGCATACGCGCGGCCTTGACTTCGCATGTGACATCTACATTTGGGCTCCTTTGGCTGGAACCTGCGGGGTGTTGTTGCTTAGTCTGGTGATTACCCTCTACTGCAATCATAGA（配列番号１５）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0174】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含み、コードされたタンパク質は、膜貫通ドメインとして機能する。

【0175】

一部の実施形態では、ヒト４−１ＢＢシグナル伝達分子をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。したがって、ＣＡＲ中の４−１ＢＢシグナル伝達分子をコードする核酸は、
AAGCGGGGGCGAAAGAAACTTCTCTATATCTTCAAACAGCCTTTCATGCGACCAGTGCAGACAACCCAAGAGGAAGACGGATGCAGCTGTCGCTTTCCAGAGGAGGAAGAAGGGGGCTGCGAGCTG（配列番号１６）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0176】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、４−１ＢＢシグナル伝達分子をコードする核酸配列を含み、コードされたタンパク質は、シグナル伝達分子として機能する。

【0177】

さらなる実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインをコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。したがって、ＣＡＲ中のＣＤ３ゼータドメインをコードする核酸は、

【0178】

AGAGTGAAATTCTCTCGCTCCGCTGACGCCCCCGCGTATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAACTTAACCTTGGGCGGAGAGAAGAATACGATGTTCTCGACAAGCGCAGGGGGAGAGACCCTGAGATGGGCGGGAAACCGCGCCGCAAGAACCCCCAAGAAGGGTTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAAATGGCTGAAGCCTACTCAGAGATAGGTATGAAGGGCGAGCGCCGCAGAGGGAAGGGACACGATGGTCTGTACCAAGGCCTTTCAACCGCCACCAAGGATACCTATGAT（配列番号１７）
を含み得るまたはこれからなり得る。

【0179】

他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子をコードする核酸配列を含み、コードされたタンパク質は、ＣＤ３ゼータシグナル伝達分子として機能する。

【0180】

具体的な非限定的な一例では、ＣＡＲをコードする核酸配列全体が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され、これは、
GCGGCCGCATGGACTTTCAAGTGCAGATCTTTAGTTTCCTGCTCATAAGCGCTAGTGTGATCATGTCCAGAGGAGATATTGTGATGACTCAAAGCCCCGACAGTCTGGCCGTGTCTTTGGGCGAGAGAGCCACAATCAACTGCAAGTCCTCACAGAGTATCCTTTATTCCTCTAATCAGAAGAATTACCTCGCATGGTATCAACAAAAACCCGGACAGAGCCCTAAGCTTTTGATCTATTGGGCATCTACCCGAGAATCAGGAGTGCCGGACCGCTTCAGTGGATCAGGATCAGGCACAGACTTTACGCTGACAATATCCTCTCTTCAGGCCGAAGACGTTGCCGTGTACTACTGCCATCAATATATGTCAAGCTACACATTCGGCCAGGGCACCAAACTCGAGATTAAGTCTAGTGGTGGCGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGCGGAGGGTCCCAGGTTCAGCTCGTGCAATCAGGGGCAGAGGTCAAGAAGCCGGGTGCCTCTGTGAAGGTGTCATGTAAGGCCTCCGGGTATACTTTTGCCAGCGCCTGGATGCATTGGATGAGGCAGGCGCCCGGCCAGGGTCTGGAGTGGATTGGTTGGATTAATCCCGGAAACGTGAATACTAAGTATAACGAGAAGTTTAAGGGCAGGGCCACACTCACAGTCGACACAAGCACCAATACCGCGTACATGGAACTTTCCAGCCTCCGGTCCGAGGACACTGCGGTGTATTACTGCGCACGCTCCACCTATTACAGACCACTTGATTACTGGGGCCAAGGGACCCTGGTGACCGTGTCTAGCGCACTCAGCAATTCCATCATGTACTTCTCTCATTTCGTGCCAGTATTTCTGCCTGCCAAGCCAACTACCACACCTGCGCCACGCCCTCCCACGCCCGCACCCACAATTGCTTCACAGCCTCTTTCTCTGCGGCCTGAGGCTTGTCGCCCAGCAGCCGGAGGCGCCGTGCATACGCGCGGCCTTGACTTCGCATGTGACATCTACATTTGGGCTCCTTTGGCTGGAACCTGCGGGGTGTTGTTGCTTAGTCTGGTGATTACCCTCTACTGCAATCATAGAAAGCGGGGGCGAAAGAAACTTCTCTATATCTTCAAACAGCCTTTCATGCGACCAGTGCAGACAACCCAAGAGGAAGACGGATGCAGCTGTCGCTTTCCAGAGGAGGAAGAAGGGGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAATTCTCTCGCTCCGCTGACGCCCCCGCGTATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAACTTAACCTTGGGCGGAGAGAAGAATACGATGTTCTCGACAAGCGCAGGGGGAGAGACCCTGAGATGGGCGGGAAACCGCGCCGCAAGAACCCCCAAGAAGGGTTGTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAAATGGCTGAAGCCTACTCAGAGATAGGTATGAAGGGCGAGCGCCGCAGAGGGAAGGGACACGATGGTCTGTACCAAGGCCTTTCAACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCACTGCACATGCAAGCCCTGCCTCCTCGCTAAGGATCC（配列番号１８）
を含むまたはこれからなる。

【0181】

ＣＣＲ４に特異的に結合する抗体、抗体結合性断片、ＣＡＲおよびコンジュゲートをコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な方法によって、またはNarangら、Meth. Enzymol.６８巻：９０〜９９頁、１９７９年のホスホトリエステル方法；Brownら、Meth. Enzymol.６８巻：１０９〜１５１頁、１９７９年のホスホジエステル方法；Beaucageら、Tetra. Lett.２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年のジエチルホスホロアミダイト方法；例えば、Needham-VanDevanterら、Nucl. Acids Res.１２巻：６１５９〜６１６８頁、１９８４年などに記載される自動合成機を使用する、BeaucageおよびCaruthers、Tetra. Letts.２２巻（２０号）：１８５９〜１８６２頁、１９８１年によって記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル方法などの方法による直接的化学合成；ならびに米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法によって、調製され得る。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型として単一の鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡへと変換され得る。

【0182】

例示的な核酸は、クローニング技術によって調製され得る。適切なクローニングおよび配列決定技術、ならびに多くのクローニング訓練を介して当業者を導くのに十分な指示の例は、公知である（例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版、Cold Spring Harbor、New York、２０１２年）およびAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、補遺１０４まで、２０１３年）を参照のこと）。生物学的試薬および実験機器の製造業者からの製品情報も、有用な情報を提供する。かかる製造業者には、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が含まれる。

【0183】

核酸は、増幅方法によっても調製され得る。増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅法（ＴＡＳ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）が含まれる。広範な種々のクローニング方法、宿主細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法論は、当業者に周知である。改変は、その生物学的活性を弱めることなしに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸に対してなされ得る。一部の改変は、クローニング、発現、または融合タンパク質中への標的化分子の取り込みを促進するためになされ得る。かかる改変は、当業者に周知であり、これには、例えば、終結コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端において付加されるメチオニン、好都合に位置付けられた制限部位を創出するためにいずれかの末端に配置されるさらなるアミノ酸、または精製ステップにおいて補助するためのさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）が含まれる。組換え方法に加えて、本開示のＣＡＲはまた、当該分野で周知の標準的なペプチド合成を使用して、全部または一部が構築され得る。

【0184】

キメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結され得る。ＣＡＲをコードする核酸分子は、宿主細胞における発現のために、ベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）中に含まれ得る。例示的な細胞は哺乳動物細胞であり、これには、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）または調節性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。具体的な非限定的な例では、細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である。ＣＤ３^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得る。他の具体的な非限定的な例では、細胞はＮＫ細胞である。キメラ抗原受容体をコードする核酸分子、およびかかる受容体を含むＴ細胞（またはＮＫ細胞）を生成する方法は、当該分野で公知である（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brentjensら、２０１０年、Molecular Therapy、１８巻：４号、６６６〜６６８頁；Morganら、２０１０年、Molecular Therapy、２０１０年２月２３日にオンライン出版、１〜９頁；Tillら、２００８年、Blood、１１２巻：２２６１〜２２７１頁；Parkら、Trends Biotechnol.、２９巻：５５０〜５５７頁、２０１１年；Gruppら、N Engl J Med.、３６８巻：１５０９〜１５１８頁、２０１３年；Hanら、J. Hematol Oncol.、６巻：４７頁、２０１３年；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０７９０００号、同第ＷＯ２０１３／１２６７２６号；および米国公開第２０１２／０２１３７８３号を参照のこと）。

【0185】

興味がもたれる場合、いったん発現されると、ＣＡＲは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当該分野の標準的な手順に従って精製され得る（一般に、Simpson編、Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual、Cold Harbor Press、２００８年を参照のこと）。抗体、抗原結合性断片およびコンジュゲートは、１００％純粋である必要はない。必要に応じて、部分的にまたは均一になるまで精製されると、治療的に使用する場合、ポリペプチドは、内毒素を実質的に含んではならない。発現および精製のためのさらなる方法は、当該分野で公知である。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、２０１３年、Simpson編、Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual、Cold Harbor Press、２００８年、ならびにWardら、Nature ３４１巻：５４４頁、１９８９年を参照のこと。

【0186】

核酸分子は、組換え的に操作された細胞、例えば、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞においても発現され得る。ＣＡＲは、融合タンパク質として発現され得る。抗体および抗原結合性断片を発現および精製する方法は、公知であり、本明細書にさらに記載されている（例えば、Al-Rubeai（編）、Antibody Expression and Production、Springer Press、２０１１年を参照のこと）。当業者は、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、ならびに種々の高等真核生物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株を含む、タンパク質の発現のために利用可能な多数の発現系に通じている。用語「宿主細胞」は、対象宿主細胞の任意の子孫もまた含む。複製の間に変異が生じ得るので、全ての子孫が親細胞と同一であるわけではないことが理解される。外来ＤＮＡが宿主において持続的に維持されることを意味する安定な移入の方法は、当該分野で公知である。本明細書で開示されるように、本開示の具体的な実施形態は、ＣＡＲを発現するＴ細胞、例えば、ヒトＴ細胞およびヒトＮＫ細胞を含む。これらのＴ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得る。興味がもたれる場合、いったん発現されると、ＣＡＲは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当該分野の標準的な手順に従って精製され得る（一般に、Simpson編、Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual、Cold Harbor Press、２００８年を参照のこと）。抗体、抗原結合性断片およびコンジュゲートは、１００％純粋である必要はない。必要に応じて、部分的にまたは均一になるまで精製されると、治療的に使用する場合、ポリペプチドは、内毒素を実質的に含んではならない。発現および精製のためのさらなる方法は、当該分野で公知である。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、２０１３年、Simpson編、Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual、Cold Harbor Press、２００８年、ならびにWardら、Nature ３４１巻：５４４頁、１９８９年を参照のこと。

【0187】

本明細書に記載される抗体および抗原結合性断片をコードする核酸の発現は、ＣＡＲをコードするＤＮＡを、プロモーター（これは、構成的または誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、その後発現カセット中に取り込むことによって、達成され得る。プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターおよびヒトＴ細胞リンパ向性ウイルスプロモーター（ＨＴＬＶ）−１を含む、目的の任意のプロモーターであり得る。任意選択で、エンハンサー、例えば、サイトメガロウイルスエンハンサーが、構築物中に含まれる。カセットは、原核生物または真核生物のいずれかにおける複製および組み込みに適切であり得る。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用な特定の配列を含有する。例えば、発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持のための配列、ならびに終止コドンを含み得る。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、薬物耐性（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）をコードするマーカーをコードし得る。

【0188】

クローニングされた遺伝子の高レベル発現を得るために、最低でも、転写を指示するための強いプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現カセットを構築することが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉについて、これは、プロモーター、例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはラムダプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを含み得る。真核生物細胞について、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み得、スプライスドナーおよび／またはアクセプター配列（例えば、ＣＭＶおよび／またはＨＴＬＶのスプライスアクセプターおよびドナー配列）をさらに含み得る。カセットは、Ｅ．ｃｏｌｉについては形質転換またはエレクトロポレーション、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞中に移入され得る。カセットによって形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子などの、カセット中に含有される遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択され得る。

【0189】

宿主が真核生物である場合、ＤＮＡのトランスフェクションの方法、例えば、リン酸カルシウム共沈、従来の機械的手順、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム中に包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターが使用され得る。真核生物細胞はまた、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子で共形質転換され得る。別の方法は、真核生物細胞を一過的に感染または形質転換し、タンパク質を発現させるために、真核生物ウイルスベクター、例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、レンチウイルスまたはウシパピローマウイルスを使用することである（例えば、Viral Expression Vectors、Springer press、Muzyczka編、２０１１年を参照のこと）。当業者は、高等真核生物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株を含む細胞においてタンパク質を産生する際に使用されるプラスミドおよびベクターなどの発現系を容易に使用できる。

【0190】

一部の実施形態では、ウイルスベクターが、ＣＡＲの発現のために利用される。ウイルスベクターには、サルウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルス、例えば、ガンマレトロウイルスが含まれるがこれらに限定されない。レトロウイルスベクターは、真核生物細胞中への遺伝子移入のための高度に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組み込みは、制御された様式で起こり、細胞１つ当たり１または数コピーの新たな遺伝子情報の安定な組み込みを生じる。理論に束縛されないが、レンチウイルスベクターは、それらが非増殖性細胞、例えば、肝細胞に形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ−レトロウイルスに由来するベクターを超える利点を有する。これらは、低い免疫原性というさらなる利点もまた有する。ＣＡＲを発現させるためのレンチウイルスベクターの使用は、当該分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願第２０１４／００５０７０８号に開示されている。

【0191】

一部の実施形態では、宿主細胞は、目的の対象中への導入のために産生される。宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）もしくは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、精製されたＴ細胞、または精製されたＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど、または哺乳動物（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞が後に投与されるヒト患者）から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物対象、例えば、ヒト対象から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液が含まれるがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、富化または精製もされ得る。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であり得、ＣＤ３^＋細胞、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ_１およびＴｈ_２細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などが含まれるがこれらに限定されない、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞であり得る。代替的な実施形態では、細胞は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞が後に投与される同じ対象から得られたＮＫ細胞などのＮＫ細胞であり得る。

【0192】

本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、ＣＡＲをコードする組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、それから本質的になる）、実質的に均一な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細胞が、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞がこの組換え発現ベクターを含む、細胞のクローン性集団であり得る。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞であり得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、エプスタイン・バーウイルスで形質転換される。参照により本明細書に組み込まれる、Savoldoら、Blood １１０巻：２６２０〜２６３０頁、２００７年を参照のこと。他の実施形態では、細胞は、レシピエントにとって異種であり（以下を参照のこと）、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＴ細胞受容体が欠失しており、したがって、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）も宿主対移植片反応も惹起しない。細胞はまた、ＮＫ細胞であり得る。細胞は、レシピエントにとって自家、または同種であり得る。これらの集団は、本明細書で開示される方法のいずれかで使用される。

【0193】

処置の方法および医薬組成物
腫瘍を処置するための方法が本明細書で開示され、腫瘍の細胞は、ＣＣＲ４を発現し、具体的には、ＣＣＲ４をコードするｍＲＮＡおよび／またはＣＣＲ４タンパク質を産生する。一部の実施形態では、腫瘍は、リンパ系悪性腫瘍などの悪性腫瘍である。リンパ系悪性腫瘍は、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であり得る。成人Ｔ細胞白血病は、慢性、急性、くすぶり型またはリンパ腫型のタイプであり得る。皮膚Ｔ細胞リンパ腫は、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、続発性皮膚ＣＤ３０＋大細胞型リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０−皮膚大細胞型Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下型Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫または芽球型ＮＫ細胞リンパ腫であり得る。具体的な非限定的な例では、皮膚Ｔ細胞リンパ腫は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）／皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）または菌状息肉症（ＭＦ）／セザリー症候群（ＳＳ）である。他の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍であり、腫瘍の細胞は、ＣＣＲ４を発現し、具体的には、ＣＣＲ４をコードするｍＲＮＡおよび／またはＣＣＲ４タンパク質を産生する。固形悪性腫瘍などの固形腫瘍の具体的な非限定的な例は、乳、卵巣、胃または食道がんである。理論に束縛されないが、微小環境中のＴｒｅｇは、本明細書で開示されるＣＡＲを使用して標的化され得る。

【0194】

方法は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターなどのベクターを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップ、ならびに／またはＣＡＲを発現するＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞などの細胞を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。

【0195】

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染およびその結果生じる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、抗ＨＩＶ治療剤を開発するための大規模な努力にもかかわらず、世界の公衆衛生にとって依然として脅威である。抑制的な組合せ抗レトロウイルス処置（ｃＡＲＴ）にもかかわらず持続するウイルスは、ＨＩＶ感染の根治的処置にとって依然として障壁である。二次リンパ系組織のＢ細胞濾胞の免疫特権部位中に避難した感染Ｔ濾胞性ヘルパー細胞（Ｔｆｈ）は、かかる残留ウイルスの重要な供給源を示し、これは、少なくとも一部は、他の部位から感染細胞を除去できるエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｂ細胞濾胞に効率的にアクセスできないからである。ＨＩＶ感染を有する対象などの対象を処置するための方法が、本明細書で開示される。方法は、ＣＡＲを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞の治療有効量を対象に投与するステップを含む。

【0196】

一部の実施形態では、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターなどのベクターを含む医薬組成物の治療有効量を対象に投与すること、ならびに／またはＣＡＲを発現するＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞などの細胞を含む医薬組成物の治療有効量を投与することによって、ＨＩＶ感染を処置する方法が開示される。それを必要とする対象は、化学療法もしくは手術（がんについて）または抗ウイルス剤（ＨＩＶ感染について）による標準的な処置を引き続いて受けてもよい。対象においてＨＩＶに対する免疫系を増強するためなどの、免疫応答を増加させるための方法が、本明細書で開示される。本明細書で開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞の投与は、残留ＨＩＶを排除する、例えばＢ細胞濾胞において、残留ウイルスを低減させるまたは排除する、対象の能力を増加させる。

【0197】

医薬組成物は、１種または複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を含み得る。ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋および／もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞、ならびに／またはＮＫ細胞であり得る。かかる組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。

【0198】

細胞は、レシピエントにとって自家であり得る。しかし、細胞は、異種（同種）でもあり得る。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、例えば、エプスタイン・バーウイルスで形質転換されたＴ細胞である。参照により本明細書に組み込まれる、Savoldoら、Blood １１０巻：２６２０〜２６３０頁、２００７年を参照のこと。他の実施形態では、細胞は、レシピエントにとって異種（同種）であり（以下を参照のこと）、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＴ細胞受容体が欠失しており、したがって、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）も宿主対移植片反応も惹起しない。

【0199】

細胞に関して、例えば、緩衝食塩水などの種々の水性担体が、細胞を導入するために使用され得る。これらの溶液は、無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理的条件に近づけるために必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中の濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、流体体積、粘度、体重などに主に基づいて選択される。

【0200】

一実施形態では、医薬組成物は、混入物、例えば、内毒素、マイコプラズマ、複製コンピテントなレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングされたビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地構成成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド構成成分、細菌および真菌を実質的に含まない、例えば、検出可能なレベルのそれらは存在しない。

【0201】

投与される組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、転移の程度、および患者（対象）の状態における個々の差異を考慮して、医師によって決定され得る。本明細書に記載されるＴ細胞（および／またはＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、その範囲内の全ての整数値を含む、１０^４〜１０^９細胞／ｋｇ体重、例えば、１０^５〜１０^６細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与され得ると一般に言うことができる。例示的な用量は、１０^６細胞／ｋｇ〜約１×１０^８細胞／ｋｇ、例えば、約５×１０^６細胞／ｋｇ〜約７．５×１０^７細胞／ｋｇ、例えば、約２．５×１０^７細胞／ｋｇ、または約５．０×１０^７細胞／ｋｇである。

【0202】

組成物は、これらの投薬量において１回または複数回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回投与され得る。組成物は、免疫療法において一般に公知の注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Rosenbergら、New Eng. J. of Med.３１９巻：１６７６頁、１９８８年を参照のこと）。組成物は、毎日、毎週、１ヶ月に２回（ｂｉｍｏｎｔｈｌｙ）または毎月投与され得る。一部の非限定的な例では、組成物は、静脈内投与のために製剤化され、複数回投与される。投与の量および頻度は、対象の状態、ならびに対象の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定され得る。

【0203】

一実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞中に導入され、対象は、細胞の初回投与および細胞の１または複数回の引き続く投与を受け、１または複数回の引き続く投与は、以前の投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日後に投与される。一実施形態では、１週間当たり、ＣＡＲ細胞の１回よりも多い投与が対象（例えば、ヒト）に投与され、例えば、１週間当たり、本発明のＣＡＲ細胞の２、３または４回の投与が投与される。一実施形態では、対象は、１週間当たり、ＣＡＲ Ｔ細胞の１回よりも多い投与（例えば、１週間当たり２、３または４回の投与）を受け（サイクルとも呼ばれる）、その後、ＣＡＲ細胞投与なしの１週間が続き、次いで、ＣＡＲ細胞の１または複数回のさらなる投与（例えば、１週間当たりＣＡＲ Ｔ細胞の１回よりも多い投与）が対象に投与される。別の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）は、１回よりも多いサイクルのＣＡＲ細胞を受け、各サイクル間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４または３日未満である。一実施形態では、ＣＡＲ細胞は、１週間当たり３回の投与にわたって、１日おきに投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれよりも長い週にわたって投与される。患者に投与される上記処置の投薬量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変動する。ヒト投与のための投薬量の縮小拡大は、当該分野で受容された実務に従って実施され得る。

【0204】

一部の実施形態では、ＣＡＲ改変されたＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製でき、持続性の腫瘍制御をもたらし得る長期持続を生じる。種々の態様では、対象に投与されるＴ細胞、またはこれらの細胞の子孫は、対象へのＴ細胞の投与後、少なくとも４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間または数年間にわたって、対象において持続する。他の実施形態では、細胞およびそれらの子孫は、対象へのＴ細胞の投与後、６ヶ月間、５ヶ月間、４ヶ月間、３ヶ月間、２ヶ月間または１ヶ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたって存在する。

【0205】

対象組成物の投与は、注射、摂取、輸注、インプランテーションまたは移植によるものを含む、任意の簡便な様式で実施され得る。開示された組成物は、経動脈で、皮下で、真皮内で、腫瘍内で、リンパ節内で、髄内で、筋肉内で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で、患者に投与され得る。一部の実施形態では、組成物は、真皮内または皮下注射によって患者に投与される。他の実施形態では、本発明の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍またはリンパ節中に直接注射され得る。

【0206】

一部の実施形態では、対象は、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞およびまたはＮＫ細胞を選択および／または単離するために、白血球がｅｘ ｖｉｖｏで収集、富化または枯渇される、白血球アフェレーシスを受け得る。これらの細胞単離体は、当該分野で公知の方法によって拡大増殖され得、１つまたは複数のＣＡＲ構築物が導入され、それによって、ＣＡＲを発現する自家細胞を創出できるように、処置され得る。一態様では、ＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスウイルスベクターを使用して生成される。

【0207】

一部の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は自家である。他の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は同種である。次いで、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、上に開示されたように、対象中に導入される。一実施形態では、細胞は、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間にわたって、ベクターを一過的に発現する。非限定的な一例では、ベクターは、エレクトロポレーションによってＴ細胞中に形質導入される。

【0208】

一部の実施形態では、対象には、開示されたＣＡＲを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞の治療有効量が投与される。特定の実施形態（参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第ＵＳ２０１４０２７１６３５号Ａ１を参照のこと）では、拡大増殖および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源が、対象から得られる。

【0209】

用語「対象」は、免疫応答が惹起され得る生きた生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ（および他の獣医学対象）および非ヒト霊長類が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含むいくつかの供給源から得ることができる。他の実施形態では、当該分野で入手可能ないくつものＴ細胞株が使用され得る。一部の非限定的な例では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、当業者に公知のいくつもの技術、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離を使用して対象から収集された血液の単位から得ることができ、または細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球細胞、赤血球細胞および血小板を含有する。一部の具体的な非限定的な例では、細胞は自家である。

【0210】

アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するため、および引き続くプロセシングステップに適切な緩衝液または培地中に細胞を配置するために、洗浄され得る。一部の非限定的な例では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替的な例では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、または全てではないにしろ多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウムの非存在下での初回活性化ステップは、拡大された活性化をもたらし得る。洗浄ステップは、例えば、製造業者の指示に従って半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣＹＴＯＭＡＴＥ（登録商標）またはＨＡＥＭＯＮＥＴＩＣＳ ＣＥＬＬ ＳＡＶＥＲ ５（登録商標））を使用することによって、当該分野で公知の方法によって達成され得る。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、緩衝液ありまたはなしの食塩水溶液中に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない構成成分が除去され得、細胞が、培養培地中で直接再懸濁され得る。

【0211】

一部の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、または向流遠心水簸によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の下位集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、陽性または陰性選択技術によってさらに単離され得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたる、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとのインキュベーションによって単離され得る。米国出願公開第ＵＳ２０１４０２７１６３５号Ａ１を参照のこと。非限定的な例では、期間は約３０分間である。他の非限定的な例では、期間は、３０分間から３６時間またはそれよりも長い期間までの範囲、およびそれらの間の全ての整数値である。さらなる非限定的な例では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６時間、１０〜２４時間、２４時間またはそれよりも長い期間である。より長いインキュベーション時間が、免疫無防備状態の個体からの単離などにおいて、他の細胞型と比較して少ないＴ細胞が存在する任意の状況においてＴ細胞を単離するために使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させ得る。したがって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単純に短縮もしくは延長すること、および／またはビーズのＴ細胞に対する比を増加もしくは減少させることによって（本明細書にさらに記載される）、Ｔ細胞の下位集団は、培養の開始時に、またはプロセスの間の他の時点において、それについてまたはそれに対して優先的に選択され得る。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、Ｔ細胞の下位集団は、培養の開始時に、または他の所望の時点において、それについてまたはそれに対して優先的に選択され得る。複数ラウンドの選択も使用され得る。

【0212】

陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、陰性選択された細胞に独自の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成され得る。１つの方法は、細胞選別および／または陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁性免疫付着もしくはフローサイトメトリーを介した選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。１種または複数のサイトカインを発現するＴ細胞集団が選択され得る。細胞発現についてスクリーニングするための方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に開示されている。

【0213】

陽性または陰性選択による細胞の所望の集団の単離について、細胞とビーズとの最大の接触を確実にするために、細胞および表面（例えば、粒子、例えばビーズ）の濃度は変動され得る。一部の実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態では、１億細胞／ｍｌよりも高い濃度が使用される。他の実施形態では、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００×１００万細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。理論に束縛されないが、高い濃度を使用することは、増加した細胞収量、細胞活性化および細胞拡大増殖を生じ得る。より低い濃度の細胞も使用され得る。理論に束縛されないが、Ｔ細胞および表面（例えば、粒子、例えばビーズ）の混合物を顕著に希釈することで、粒子と細胞との間の相互作用は最小化される。これは、粒子に結合される所望の抗原を高い量で発現する細胞について選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希薄な濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一部の実施形態では、使用される細胞の濃度は、５×１０^６／ｍｌである。他の実施形態では、使用される濃度は、約１×１０^５／ｍｌ〜１×１０^６／ｍｌ、およびそれらの間の任意の整数値であり得る。

【0214】

細胞は、２〜１０℃または室温のいずれかにおいて変動する速度で変動する長さの時間にわたってローテーター上でインキュベートされ得る。刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄ステップの後に凍結もされ得る。理論に束縛されないが、凍結および引き続く解凍のステップは、細胞集団中の顆粒球、およびある程度までは単球を除去することによって、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液およびパラメーターが当該分野で公知であり、これに関して有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、１分当たり１度の速度で−８０℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で貯蔵される。制御された凍結の他の方法、ならびに−２０℃でまたは液体窒素中で即座の制御されない凍結が使用され得る。米国公開第ＵＳ−２０１４−０２７１６３５号Ａ１を参照のこと。

【0215】

血液試料またはアフェレーシス産物は、本明細書に記載される拡大増殖された細胞が必要とされ得る前の期間において、対象から収集され得る。このように、拡大増殖される細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集され得、所望の細胞、例えばＴ細胞は、本明細書に記載されるものなどの、Ｔ細胞治療から利益を得るいくつもの疾患または状態に対するＴ細胞治療における後の使用のために単離および凍結され得る。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発達させるリスクがあるが疾患をまだ発達させていない概して健康な対象から採取され、目的の細胞は、後の使用のために単離および凍結される。ある特定の態様では、Ｔ細胞は、後の時点において拡大増殖、凍結および使用され得る。ある特定の態様では、試料は、本明細書に記載される特定の疾患の診断の直後であるが任意の処置の前に、患者から収集される。さらなる態様では、細胞は、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、ｃｙｔｏｘａｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射による処置が含まれるがこれらに限定されない、いくつもの適切な処置モダリティーの前に、対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。ある特定の態様では、凍結保存された細胞は、本明細書に記載されるように解凍および洗浄され、使用前に室温で１時間静置される。血液試料またはアフェレーシス産物は、必要に応じて対象から収集され得、凍結されなくてもよい。

【0216】

Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載される方法を一般に使用して、活性化および拡大増殖され得る。

【0217】

Ｔ細胞は、それに結合したＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する因子およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを有する表面との接触によって、拡大増殖され得る。一部の非限定的な例では、Ｔ細胞集団は、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと併せた、タンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、本明細書に記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例には、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が含まれ、これらは、当該分野で一般に公知の他の方法と同様に使用され得る（Bergら、Transplant Proc.３０巻（８号）：３９７５〜３９７７頁、１９９８年；Haanenら、J. Exp. Med.１９０巻（９号）：１３１９１３２８頁、１９９９年；Garlandら、J. Immunol. Meth.２２７巻（１〜２号）：５３〜６３頁、１９９９年）。

【0218】

ＣＣＲ４ ＣＡＲがいったん構築されると、種々のアッセイが、例えば、抗原刺激後にＴ細胞を拡大増殖させる能力、再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大増殖を持続する能力、ならびに適切なｉｎ ｖｉｔｒｏおよび動物モデルにおける抗がん活性であるがこれらに限定されない分子の活性を評価するために使用され得る。

【0219】

ＣＡＲを発現する単離された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋および／もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞、ならびに／またはＮＫ細胞は、対象への投与に適切な薬学的に許容される担体、例えば、緩衝食塩水または別の媒体中で投与され得る。細胞は、他の細胞と併せて、または他の細胞の非存在下で投与され得る。一実施形態では、細胞の単離された集団を含有する組成物は、１種または複数のさらなる医薬剤、例えば、１種または複数の抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、または非ステロイド性抗炎症剤、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンもしくはナプロキセンナトリウム）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２）、またはワクチンもまた含有し得る。多くの化学療法剤が、現在当該分野で公知である。一実施形態では、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、インターカレート抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答改変因子、抗ホルモン薬、例えば抗アンドロゲン薬および抗血管形成剤からなる群から選択される。

【0220】

他の実施形態では、対象には、ｉｎ ｖｉｖｏ産生を提供するために、ＣＡＲをコードするＤＮＡが投与される。核酸構築物による免疫化は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第５，６４３，５７８号および米国特許第５，５９３，９７２号および米国特許第５，８１７，６３７号に教示されている。米国特許第５，８８０，１０３号は、コードする核酸の生物への送達のいくつかの方法を記載している。これらの方法には、核酸のリポソーム送達が含まれる。かかる方法は、当業者によって、抗体またはその抗体結合性断片の産生に適用され得る。

【0221】

核酸の投与のための１つのアプローチは、プラスミドＤＮＡ、例えば、哺乳動物発現プラスミドを用いた直接的投与である。開示された抗体またはその抗体結合性断片をコードするヌクレオチド配列は、発現を増加させるために、プロモーターの制御下に配置され得る。

【0222】

核酸を使用するための別のアプローチでは、開示されたＣＡＲは、弱毒化ウイルス宿主もしくはベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルスまたは他のウイルスベクターが、抗体を発現させるために使用され得る。例えば、ワクシニアベクターおよび方法有用なプロトコールは、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）は、開示された抗体の発現のための別のベクターを提供する（Stover、Nature ３５１巻：４５６〜４６０頁、１９９１年を参照のこと）。具体的な非限定的な例では、ベクターはレンチウイルスベクターである。

【0223】

一実施形態では、開示されたＣＡＲをコードする核酸は、細胞中に直接導入される。例えば、核酸は、標準的な方法によって金ミクロスフェア上に負荷され得、Ｂｉｏ−ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎなどのデバイスによって導入され得る。核酸は、強いプロモーターの制御下にあるプラスミドからなる「ネイキッド」であり得る。核酸は、ＲＮＡであり得る；ＣＡＲをコードするＲＮＡは、細胞に直接投与され得る。一部の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。

【0224】

悪性腫瘍の処置のために、方法は、さらなる化学療法剤、手術または放射線の治療有効量を対象に投与するステップもまた含み得る。一部の実施形態では、悪性腫瘍は、リンパ系悪性腫瘍、例えば、成人Ｔ細胞白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、ホジキンリンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。対象は、例えば、乳がん、卵巣がん、胃がんまたは食道がんであるがこれらに限定されない固形腫瘍もまた有し得る。

【0225】

化学療法剤は、抗体であり得る。抗体は、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌の水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液でも提供される。次いで、抗体溶液は、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、典型的には、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の承認以来、米国で市販されている抗体薬物の投与におけるかなりの経験が、当該分野において利用可能である。抗体は、プログラム死（ＰＤ）−１またはプログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合し得る（以下を参照のこと）。抗体は、静脈内プッシュまたはボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が投与され、引き続いて、維持用量が、より低いレベルで投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量が、約９０分間の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に耐容された場合、４〜８週間にわたる、３０分間の期間にわたって注入される２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が続き得る。

【0226】

悪性腫瘍の処置のためのさらなる実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療、ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせた処置レジメンにおいて使用され得る。Izumotoら、２００８年J Neurosurg １０８巻：９６３〜９７１頁に記載されるものなどのペプチドワクチン。例示的な化学療法剤には、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン（decarbazine）、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ（alemtuzamab）、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ）、免疫調節薬、例えば、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）が含まれる。

【0227】

組合せ治療における使用のために検討される一般的な化学療法剤には、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、ブスルファン注射（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチン（ＢＩＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、クラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）またはＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤＥＰＯＣＹＴ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エトポシド（ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、リン酸フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、テザシチビン（ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、６−メルカプトプリン（ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、メトトレキサート（ＦＯＬＥＸ（登録商標））、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ｍｙｌｏｔａｒｇ、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、フェニックス（ｐｈｏｅｎｉｘ）（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロサン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０カルムスチンインプラント（ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、テニポシド（ＶＵＭＯＮ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（ＴＩＲＡＺＯＮＥ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（ＨＹＣＡＭＰＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））が含まれる。例示的なアルキル化剤には、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼン）：ウラシルマスタード（ＡＭＩＮＯＵＲＡＣＩＬ ＭＵＳＴＡＲＤ（登録商標）、ＣＨＬＯＲＥＴＨＡＭＩＮＡＣＩＬ（登録商標）、ＤＥＭＥＴＨＹＬＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＤＥＳＭＥＴＨＹＬＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＨＡＥＭＡＮＴＨＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＮＯＲＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＭＵＳＴＡＲＤ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬＬＯＳＴ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬＭＯＳＴＡＺＡ（登録商標）、ＵＲＡＭＵＳＴＩＮ（登録商標）、ＵＲＡＭＵＳＴＩＮＥ（登録商標））、クロルメチン（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＬＡＦＥＮ（登録商標）、ＥＮＤＯＸＡＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＹＴＯＸ（登録商標）、ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ（商標））、イホスファミド（ＭＩＴＯＸＡＮＡ（登録商標））、メルファラン（ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、ピポブロマン（ＡＭＥＤＥＬ（登録商標）、ＶＥＲＣＹＴＥ（登録商標））、トリエチレンメラミン（ＨＥＭＥＬ（登録商標）、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標）、ＨＥＸＡＳＴＡＴ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｎｅ）、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、チオテパ（ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＩＬＶＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣＥＥＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））が含まれるがこれらに限定されない。さらなる例示的なアルキル化剤には、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））；テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）およびＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても公知、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン（ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎ）およびフェニルアラニンマスタードとしても公知、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標））；カルムスチン（ＢＩＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））；ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）およびＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））；カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても公知、ＣＥＥＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても公知、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）およびＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）およびＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても公知、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標））；イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；プレドニムスチン（Prednumustine）；プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン（ｍｕｓｔｉｎｅ）および塩酸メクロレタミン（mechloroethamine）としても公知、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））；ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））；シクロホスファミド（ＥＮＤＯＸＡＮ（登録商標）、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）、ＰＲＯＣＹＴＯＸ（登録商標）、ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ（登録商標））；およびベンダムスチンＨＣｌ（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））が含まれるがこれらに限定されない。例示的なｍＴＯＲ阻害剤には、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（以前にはデフェロリムス（ｄｅｆｅｒｏｌｉｍｕｓ）として公知、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０^４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４３８３号に記載される）；エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ（登録商標））；シマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；テムシロリムス（emsirolimus）、（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；ならびにＮ^２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）およびＸＬ７６５が含まれる。例示的な免疫調節薬には、例えば、アフツズマブ（ＲＯＣＨＥ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））、アクチミド（ａｃｔｉｍｉｄ）（ＣＣ４０４７）；およびＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、およびインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）が含まれる。例示的なアントラサイクリンには、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲＵＢＥＸ（登録商標））；ブレオマイシン（ＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））；ダウノルビシン（塩酸ダウノルビシン（dauorubicin）、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン（ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ）、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））；エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））；イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＩＤＡＭＹＣＩＮ ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン（ｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）；およびデスアセチルラビドマイシン（ｄｅｓａｃｅｔｙｌｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）が含まれる。例示的なビンカアルカロイドには、例えば、酒石酸ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））およびビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても公知、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）およびＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；ならびにビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））が含まれる。例示的なプロテオソーム阻害剤には、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；およびＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンア

ミド（ＯＮＸ−０９１２）が含まれる。例示的なＧＩＴＲアゴニストには、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９０５０５号Ｂ１、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００３１１８号および同第２０１１／０９０７５４号に記載されるＧＩＴＲ融合タンパク質、または例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３号Ｂ１、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載される抗ＧＩＴＲ抗体などが含まれる。

【0228】

ＨＩＶ感染の処置のために、対象には、抗レトロウイルス剤が投与され得る。抗レトロウイルス薬は、その薬物が阻害するレトロウイルス生活環の相によって大まかに分類される。開示された抗体は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、侵入阻害剤（または融合阻害剤）、成熟化阻害剤、または広いスペクトルの阻害剤、例えば、天然抗ウイルス薬と併せて投与され得る。例示的な薬剤には、ロピナビル、リトナビル、ジドブジン、ラミブジン、テノホビル、エムトリシタビンおよびエファビレンツが含まれる。

【0229】

一部の実施形態では、対象には、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤が投与され得る。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤であり得る。阻害性分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ−１）は、一部の実施形態では、免疫エフェクター応答を開始させるＣＡＲ発現細胞の能力を減少させ得る。阻害性分子の例には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲ−ベータが含まれる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による、阻害性分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化できる。実施形態では、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞における阻害性分子の発現を阻害するために使用され得る。ある実施形態では、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、阻害性分子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、阻害性分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの構成成分、例えば、全ての構成成分をコードする核酸に連結される。一実施形態では、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害性分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも呼ばれ、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として市販されている；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前にはチシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）として公知、ＣＰ−６７５，２０６））であり得る。ある実施形態では、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。

【0230】

プログラム死（ＰＤ）−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含むＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄系細胞上で発現される（Agataら、１９９６年、Int. Immunol ８巻：７６５〜７５頁）。ＰＤ−１に対する２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１への結合の際にＴ細胞活性化を下方調節することが示されている（Freemanら、２０００年、J Exp Med １９２巻：１０２７〜３４頁；Latchmanら、２００１年、Nat Immunol ２巻：２６１〜８頁；Carterら、２００２年、Eur J Immunol ３２巻：６３４〜４３頁）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトがん中で豊富である（Dongら、２００３年、J Mol Med ８１巻：２８１〜７頁；Blankら、２００５年、Cancer Immunol. Immunother ５４巻：３０７〜３１４頁；Konishiら、２００４年、Clin Cancer Res １０巻：５０９４頁）。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転され得る。抗体、抗体断片、ならびにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の他の阻害剤は、当該分野で入手可能であり、本明細書に記載されるＣＣＲ４ ＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ−１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ−１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１２１１６８号に開示されている。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１０１６１１号に開示されている。ランブロリズマブ（ＭＫ０３４７５とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ_４モノクローナル抗体である。ランブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、米国特許第８，３５４，５０９号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１１４３３５号に開示されている。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ_１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ−Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国公開第２０１２／００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤には、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖および軽鎖可変領域は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０７７６３４号において配列番号２０および２１に示される）およびＭＤＸ−１ １０５（ＢＭＳ−９３６５５９とも呼ばれる、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／００５８７４号に開示される抗ＰＤ−Ｌ１結合剤）が含まれる。ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示されている）は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体には、とりわけ、ＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号、米国公開第２０１０／０２８３３０号および／または米国公開第２０１２／０１１４６４９号に開示された抗ＰＤ−１抗体が含まれる。
キット

【0231】

キットもまた提供される。例えば、ＣＣＲ４を発現するがんを有する対象を処置するための、またはＨＩＶに対するキット。キットは、典型的には、ＣＡＲをコードする開示された核酸、ＣＡを発現するＴ細胞、またはかかる分子を含む組成物を含む。

【0232】

キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連するラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックで形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子または組成物のうち１つまたは複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって突き刺し可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。

【0233】

ラベルまたは添付文書は、典型的には、キット中に含まれる抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子または組成物の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、かかる治療製品の使用に関する適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む治療製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。指示資料は、電子的形態（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクまたはコンパクトディスク）で書かれ得る、または視覚的であり得る（例えば、ビデオファイル）。キットは、キットがそれに対して設計される特定の適用を促進するために、さらなる構成成分もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次標識、例えば二次抗体など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。

【実施例】

【0234】

ＣＤ１９指向性のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するｅｘ ｖｉｖｏ改変された自家Ｔ細胞を用いて、ＣＤ１９発現Ｂ細胞悪性腫瘍を処置することが、新たに成功している。このテクノロジーは、固形腫瘍を含む他の悪性腫瘍を処置するのに有効なモダリティーを開発するために拡張され得る。レンチウイルスベースのＣＡＲ遺伝子移入系を生成して、あるスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍において、ならびに抗腫瘍免疫に対する障壁を構成する腫瘍微小環境中に蓄積するＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋調節性Ｔ細胞において過剰発現されるケモカイン受容体ＣＣＲ４を標的化した。ＣＣＲ４指向性ＣＡＲを発現したｅｘ ｖｉｖｏ改変されたドナー由来Ｔ細胞が、ＡＴＬ、ＣＴＣＬ、ＡＬＣＬ、およびＨＤＬのサブセットを代表する患者由来細胞株に対して、抗原依存的な強力な細胞傷害性を示したことが、本明細書で開示される。さらに、これらのＣＡＲ Ｔ細胞はまた、ＡＴＬのマウス異種移植モデルにおいて白血病を根絶し、これは、広いスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍の処置におけるこのモダリティーの潜在的有用性を示している。
（実施例１）
材料および方法

【0235】

ＣＣＲ４キメラ抗原受容体の構築およびレンチウイルスストック調製：抗ヒトＣＣＲ４モノクローナル抗体１５６７およびその親和性成熟したバリアントｍＡｂ２−３のヒト化は、ｍＡｂ２−３の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）カッパドメインのアミノ酸配列と共に報告されており（参照により本明細書に組み込まれる、Changら、Mol Cancer Ther.２０１２年；１１巻（１１号）：２４５１〜２４６１頁）、これらの配列を、本発明者らのＣＣＲ４ ＣＡＲ構築物の構築において利用した。その分子配置は図１Ａに示される。ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達モジュールならびにＣＤ３ζシグナル伝達モジュールのアミノ酸配列は、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１７６８、Ｕ０３３９７．１およびＮＭ＿００７３４に由来した。個々のドメイン配列を、１つの転写／翻訳単位へとアセンブルし、機能的単位のコドン最適化されたＤＮＡ配列を、ｄｅ ｎｏｖｏで合成した。次いで、合成ＤＮＡ断片を、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−Ｖｅｎｕｓプラスミド中にクローニングした。次いで、得られた発現プラスミドに、ヒト胎児由来腎臓細胞ＨＥＫ ２９３Ｔ中に、レンチウイルスパッケージングヘルパープラスミドｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ（ＣＡＧプロモーター、ＨＩＶ−１ ｇａｇおよびｐｏｌ発現プラスミド）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇを共トランスフェクトして、ＣＣＲ４ ＣＡＲコードレンチウイルス粒子のストックを生成した（第二世代非複製性）。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後、培養物上清を、４８時間後に回収し、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．４５ミクロンフィルターを通過させることによって清澄化した。次いで、清澄化した上清を、２４０００ｒｐｍで４℃で２時間の超遠心分離に供した。次いで、ＣＣＲ４ ＣＡＲレンチウイルスペレットを、一定体積のＰＢＳ中に溶解させて１０００倍濃度を達成し、使用まで−８０℃で貯蔵した。

【0236】

細胞および培養条件：ＡＴＬ細胞株ＥＤ−４０５１５（＋）、ＡＴＬ５５Ｔ（＋）、ＫＯＢ、ＬＭ−Ｙ１、ＫＫ１、ＡＴＬ−４３Ｔ（＋）およびＥＤ−４１２１４（＋）の成長は、ＩＬ−２依存的であるが、ＥＤ−４０５１５（−）、ＳＴ１、ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）、Ｓｕ９Ｔ０１、ＡＴＮ１、ＥＤ−４１２１４Ｃ（−）およびＭＴ１は、ＩＬ−２非依存的であり、これらは記載されている（Nakagawaら、J Exp Med.２０１４年；２１１巻（１３号）：２４９７〜２５０５頁）。皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株ＨＨ、ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨｕＴ１０２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。Ｍａｃ−１、Ｍａｃ−２ＡおよびＭａｃ２−Ｂ細胞株は、ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬに由来するが、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＲ−７８６、ＳＵＰ−Ｍ２およびＤＥＬは、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬに由来する。検出可能なＣＣＲ４ ｍＲＮＡを欠く、ホジキン細胞株Ｌ４２８、ＨＤＬＭ−２、ＫＭ−Ｈ２およびＬ１２３６、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に由来するＳＵＤＨＬ−４も使用した。細胞株ＡＴＬ４１２１４は、ＣＭＶプロモーターから駆動される組み込まれたルシフェラーゼ遺伝子を有する、ＥＤ−４１２１４Ｃ（−）の誘導体である。上記細胞株を、１０％ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ中で培養した。健康なボランティアドナー由来の末梢血単核球を、インフォームドコンセントを得て、承認されたプロトコール下で得た。ヒトリンパ球を培養するために、１０％ヒトＡＢ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３００ＩＵ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を補充したＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を使用した。

【0237】

Ｔ細胞形質導入：汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核球から手つかずのＴ細胞を精製し、次いで、細胞を、４８時間にわたって、１細胞当たり３個のビーズの比でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｔ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによって、３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で活性化した。ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎコーティングされたディッシュ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を、ＣＣＲ４ ＣＡＲレンチウイルス粒子を添加した後に、２０００ｇで２時間最初に事前遠心分離して、３２〜３５℃でプレート表面にレンチウイルス粒子を吸着させ、次いで、活性化されたＴ細胞（１×１０^６）を、ディッシュに添加した。次いで、培養培地中のＩＬ−２濃度を３００ＩＵ／ｍｌまで増加させ、細胞を、およそ１〜３×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度を維持しつつ、２日毎に新鮮な培地を供給することによって、３７℃で拡大増殖させた。

【0238】

フローサイトメトリー：ＣＣＲ４ ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞を免疫表現型決定するために、１００万個の細胞を、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８−ＡＰＣまたはプロテインＬ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した（Zhengら、J Transl Med.２０１２年；１０巻：２９頁）。細胞表面結合したプロテインＬの存在を、ＳＡ−ＰｅｒＣＰを用いて検出した。

【0239】

細胞傷害性：ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性エフェクター活性を、ＡＴＬ４１２１４細胞株を使用して標準的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイ（Phillipsら、Cancer Res.２０００年；６０巻（２４号）：６９７７〜６９８４頁）またはバイオフォトニック（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）細胞傷害性アッセイ（Brownら、J Immunol Methods.２００５年；２９７巻（１〜２号）：３９〜５２頁）のいずれかを使用し、マイクロプレートカウンター／ルミノメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して示された時点におけるＤ−ルシフェリン（１ウェル当たり０．１４ｍｇ／ｍｌの最終濃度、Ｘｅｎｏｇｅｎ製）の添加による生物発光を測定して決定した。以下の式を使用して計算したパーセント特異的溶解：
％溶解＝［１−（ＣＰＳ_実験−ＣＰＳ_最小）］×１００
（ＣＰＳ_最大−ＣＰＳ_最小）

【0240】

細胞増殖アッセイ：ＣＣＲ４ ＣＡＲ改変されたＴ細胞（０．５×１０^５）を、３０００ラドの線量で７２時間照射した１×１０^４のＡＴＬ５５Ｔ（＋）（ＣＣＲ４陽性）またはＳＵＤＨＬ−４細胞（ＣＣＲ４陰性）のいずれかと共に三連で共培養した。含んだ対照は、単独で培養したＣＡＲ改変されたＴ細胞、単独で培養したＡＴＬ５５Ｔ（＋）細胞、および単独で培養したＳＵＤＨＬ−４細胞であった。共培養期間の最後の６時間の間に、細胞に、１μＣｉの［^３Ｈ］チミジンをパルスした。［^３Ｈ］チミジンの取り込みを、β−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。

【0241】

サイトカイン測定：ＣＣＲ４ ＣＡＲ改変されたＴ細胞（０．５×１０^５）を、３０００ラドの線量で２４時間照射したＡＴＬ５５Ｔ（＋）またはＳＵＤＨＬ−４細胞（１×１０^４）のいずれかと共に三連で共培養した。含んだ対照は、単独で培養したＣＡＲ改変されたＴ細胞、単独で培養したＡＴＬ５５Ｔ（＋）細胞、および単独で培養したＳＵＤＨＬ−４細胞であった。培養物上清を回収し、サイトカインを、製造業者が提供した指示書に従ってＶ−ＰＬＥＸヒトサイトカイン３０−Ｐｌｅｘキットを使用して測定し、変化倍数を、単独で培養したＣＡＲ改変された細胞について得られた値対ＡＴＬ５５Ｔ細胞と共に共培養した場合に基づいて計算した。

【0242】

Ｔａｑｍａｎリアルタイム定量的ＰＣＲによるＣＣＲ４ ｍＲＮＡ転写物の検出：総細胞ＲＮＡを、市販のキット（ＱｉａｇｅｎのＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキット）を使用して単離した。逆転写（ＲＴ）反応を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して各試料（６０ｎｇ）について実施した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ヒトＣＣＲ４プライマー／プローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００７４７６１５＿ｓ１）およびＨＰＲＴ１プライマー／プローブ（カタログ番号４３３３７６８Ｆ）を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。ヒトＣＣＲ４およびＨＰＲＴ１の相対的定量化を、製造業者の指示に従ってＡＢＩ７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。標的遺伝子発現を、ハウスキーピングＨＰＲＴ１遺伝子発現に対して標準化した相対量についての比較方法を使用して計算した。

【0243】

ｉｎ ｖｉｖｏ研究：１０００万個のＡＴＬ４１２１４ ＡＴＬ細胞を、ＮＳＧマウス（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ ＪＡＸ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群中に、１００マイクロリットルの体積で腹腔内接種した。３日間の生着期間後、処置群のマウスに、ＣＡＲ改変されたＴ細胞（１×１０^７細胞／動物）を腹腔内注射し、その後７日間にわたってヒトＩＬ−２（６００ＩＵ）の毎日の腹腔内注射を受けさせた。腫瘍負荷を、３ｍｇのＤ−ルシフェリン／マウスを腹腔内注射した後、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像化システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して毎週測定した。ソフトウェアＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅバージョン４．１を使用して、生物発光シグナルを光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして分析した。
（実施例２）
キメラ抗原受容体で改変されたＴ細胞の産生および使用

【0244】

ＣＡＲ分子の構造的配置は、図１Ａ中に示され、このＣＡＲ分子は、ヒト化抗ＣＣＲ４抗体に由来する細胞外ＣＣＲ４結合ドメインに加えて、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＣＤ３ζに由来する２つの細胞内シグナル伝達モジュールと共に、ヒトＣＤ８分子に由来する膜貫通モジュールを含む。ドナー由来の活性化されたＣＤ３^＋Ｔ細胞に１回形質導入したところ、８０％を超える形質導入効率が、フローサイトメトリーによるＧＦＰ陽性およびプロテインＬ結合活性によって決定される通り、常に達成された（図１、パネルＢおよびＣ）。培養物中での形質導入後７２時間の期間の後の、形質導入された細胞集団中のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋サブセットの表示は、図１のパネルＤおよびＥに示される。形質導入されたＴ細胞におけるＣＣＲ４標的化ＣＡＲのロバストな発現を確認し、次いで、これらのＣＣＲ４指向性のＣＡＲ形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞の機能的活性を評価した。細胞株ＡＴＬ ４１２１４は、ＨＴＬＶ−１関連慢性成人Ｔ細胞白血病を有する患者に由来し、細胞表面ＣＣＲ４を発現するが、ＥＢＶ関連ＮＫリンパ腫を有する患者に由来したＹＴ−１細胞株は、ＣＣＲ４を発現しない（図２、パネルＡを参照のこと）。以前に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するこれらの２つの細胞株の安定な誘導体を創出したが、これらのルシフェラーゼタグ化細胞株の利用能は、高感度の生物発光ベースの細胞溶解アッセイを使用することを可能にした。図２Ｂに示されるように、細胞溶解活性は、標的およびエフェクター細胞の１２０分間の共培養によって明らかであり、２０時間の観察期間を通じて増加し続けた。さらに、複数ラウンドの死滅に関与するこれらのＣＡＲ Ｔ細胞の能力は、特に、低いエフェクター：標的比における死滅活性の百分率を考慮する場合、経時的に増加し続けるデータによって明らかであり、したがって、このＣＡＲのロバストな機能性が検証された。

【0245】

今日までに報告された全てではないがほとんどの臨床試験では、最小のテロメア分解を伴った分化の最適な状態、および注入されている細胞の可能な老化または消耗の回避を確実にするために、ｅｘ ｖｉｖｏのＣＤ２８ベースの拡大増殖相を１０〜１２日間の期間に限定することに重点が置かれた。この問題をさらに探求する場合、最初の１２日間のＣＤ２８ベースの拡大増殖の後に、ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大増殖を、ＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で、照射されたＥＤ−４１２１４Ｃ（−）細胞を用いて継続した。驚くべきことに、ＣＡＲ Ｔ細胞は、実に最大で８週間ロバストに拡大増殖し続け、ＣＣＲ４を保有する標的細胞を溶解することにおいて等しい効力をなおも保持した（図２Ｃ）。対照的に、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をＹＴ−１細胞と共に共培養した場合、細胞溶解活性は観察されず、したがって、このＣＣＲ４ ＣＡＲのロバストな機能性および特異性が検証された（図２Ｄ）。

【0246】

ＣＣＲ４指向性のＣＡＲアプローチのより広い有用性を評価するために、あるスペクトルのリンパ系悪性腫瘍を提示する患者由来の悪性細胞株のパネルを使用して、ＣＣＲ４ ＣＡＲ形質導入されたドナー由来ＣＤ３＋Ｔ細胞に対するそれらの感受性を評価した（図３）。細胞株ＥＤ−４０５１５（＋）、ＡＴＬ５５Ｔ（＋）、ＫＯＢ、ＬＭ−Ｙ１、ＫＫ１、ＡＴＬ−４３Ｔ（＋）およびＥＤ−４１２１４（＋）は、慢性／くすぶり型成人Ｔ細胞白血病を代表し、それらの成長についてＩＬ−２依存的であるが（パネルＡ）、ＥＤ−４０５１５（−）、ＳＴ１、ＡＴＬ−４３Ｔｂ（−）、Ｓｕ９Ｔ０１、ＡＴＮ１、ＥＤ−４１２１４Ｃ（−）およびＭＴ１は、急性成人Ｔ細胞白血病患者由来であり、成長についてＩＬ−２に依存しない（パネルＢ）。細胞株ＨＨ、ＨｕＴ７８、ＭＪ、ＨｕＴ１０２は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を代表する（パネルＣ）。細胞株Ｍａｃ−１、Ｍａｃ−２ＡおよびＭａｃ２−Ｂ細胞株は、染色体ｔ（２；５）転座なしの未分化大細胞型リンパ腫に由来し、したがって、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）陰性であるが、Ｋａｒｐａｓ２９９、ＳＵＤＨＬ−１、ＳＲ−７８６、ＳＵＰ−Ｍ２およびＤＥＬは、ＡＬＫ陽性ＡＬＣＬに由来した（パネルＤ）。ホジキン細胞株Ｌ４２８、ＨＤＬＭ−２、ＫＭ−Ｈ２およびＬ１２３６もまた、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に由来するＳＵＤＨＬ−４と同様、分析に含めた（パネルＥ）。

【0247】

Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するほぼ全ての細胞株が、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞による溶解に対して感受性であったが、感受性のレベルは、試験した細胞株間でいくらか変動した。試験したＡＬＣＬ細胞株のパネルにおいて、ＡＬＫ陰性細胞株（Ｍａｃ−１、Ｍａｃ−２ＡおよびＭａｃ−２Ｂ）の明確な分離が、ＡＬＫ陽性細胞株よりも高感度の群として存在した。ＨＤＬ細胞株を用いると、Ｔ細胞起源のＨＤＬＭ−２およびＢ細胞起源のＬ４２８は共に、顕著な感受性を示したが、他のＨＤＬ細胞株は、ＤＬＢＣＬ由来細胞株ＳＵＤＨＬ−４と同様、不応性であった。

【0248】

全てのＣＴＣＬおよびＡＴＬ細胞株はかなり高感度であったが、例外は、不応性であったＥＤ（−）４０５１５であり、このことは、感受性における差異を説明する方法としての、ＡＴＬ細胞株における細胞表面ＣＣＲ４レベルの探索を促進する。ＣＣＲ４の表面発現を、フローサイトメトリーによってこれらの細胞株上で決定したところ、それらのほとんどは、細胞表面上に検出可能なレベルのＣＣＲ４を有することが見出された（図４を参照のこと）。フローサイトメトリーによって検出したＣＣＲ４の細胞表面発現は、定量的分析のための非常に高感度の尺度ではないようであったが、細胞表面ＣＣＲ４レベルの傾向は、一般に、ＣＣＲ４ ＣＡＲ媒介性細胞溶解に対するそれらの感受性と対応した。しかし、ある特定の細胞株、例えば、ＳＵＤＨＬ−１、Ｋａｒｐａｓ２９９およびＤＥＬは、フローサイトメトリーによってＣＣＲ４発現について陰性であるにもかかわらず、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞に対して完全には不応性でなかった。したがって、ＣＣＲ４ ｍＲＮＡレベルを、定量的ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によってこれらの細胞株において測定し（図５Ａおよび以下の表２を参照のこと）、細胞表面ＣＣＲ４発現よりも、ＣＣＲ４ ｍＲＮＡレベル間でのより良い相関が、溶解感受性と共に、フローサイトメトリーによって観察された（図５を参照のこと）。例えば、ＣＣＲ４ ｍＲＮＡを欠くＳＵＤＨＬ−４およびＥＤ−４０５１５もまた、ＹＴ−１細胞に加えて、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性細胞溶解に対して不応性であった。図２Ｄを参照のこと。ＣＣＲ４ ＣＡＲの機能性をさらに記述して、増殖シグナルの強さを、ＣＡＲ Ｔ細胞と照射したＣＣＲ４保有標的細胞との共培養によって測定した。Ｈ^３チミジン取り込みにおける３倍を超える増加が、７２時間の期間内に見出された（図５Ｂ）。

【0249】

並行実験において、標的細胞とＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養によって誘発されたサイトカイン／ケモカインを、２４時間の期間にわたって測定した（表１）。

【表1】

【表2】

【0250】

ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータおよびＩＦＮ−ガンマなどのいくつかの炎症性サイトカインの誘導にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞治療と関連する場合が多い、サイトカイン放出症候群の主要な駆動因子であるサイトカインＩＬ−６は誘導されず、これは、サイトカイン放出症候群において見られるＩＬ−６の供給源がＣＡＲ Ｔ細胞ではないことを示している。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β発現の基底レベルはかなり高く（それぞれ、１９ｎｇ／ｍｌおよび３１ｎｇ／ｍｌ）、これらのレベルは、標的細胞との共培養によってさらにいくらか増加した（それぞれ、３６％および２５％）。さらに、以下のサイトカインの意味のある誘導は検出されなかった：ＩＬ−１２／２３ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１０、エオタキシン、エオタキシン−３、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＴＡＲＣおよびＩＬ−１７。

【0251】

最後に、ＣＣＲ４ ＣＡＲのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、成人Ｔ細胞白血病のマウス異種移植モデルにおいて試験した。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を注入したマウスは、腫瘍細胞を完全に根絶し、研究の終局において腫瘍を有さないままであったが（図６のパネルＢ）、対照マウスは全て、ＡＴＬ細胞移植の１２週間後に、腫瘍細胞の継続的な成長を示した（図６Ａ）。腫瘍成長を、白血病性腫瘍負荷の代理測定値として生物発光イメージングフラックス（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｌｕｘ）（光子／秒）を使用して定量化した（図９）。

【0252】

Ｔ細胞悪性腫瘍は、臨床転帰不良を伴う場合が多いリンパ系新生物の不均一な群を示す（Fossら、Blood.２０１１年；１１７巻（２５号）：６７５６〜６７６７頁）。ｔ（２；５）を有するＡＬＫ（＋）ＡＬＣＬをおそらくは除いて、十分に規定された遺伝的異常の相対的な欠如は、根治的診断マーカーの欠如と共に、病理発生を解明し、ほとんどのＴ細胞悪性腫瘍に対する新規の有効な治療戦略を考案する際の主要な障害であった（Fossら、２０１１年、上記）。遺伝子発現プロファイリングを用いると、ＰＴＣＬの約５０％を占める多様な群であるＰＴＣＬ−ＮＯＳのほぼ半分が、任意の分類可能なマーカーを欠くが、Ｔ_Ｈ２マスター転写調節因子ＧＡＴＡ−３を過剰発現し、予後不良を有する場合が多いことが、最近証明された（Wangら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：３００７〜３０１５頁；Iqbalら、Blood.２０１４年；１２３巻（１９号）：２９１５〜２９２３頁）。正常なＴ_Ｈ２ ＣＤ４^＋Ｔリンパ球中と同様、ＧＡＴＡ−３は、これらのＰＴＣＬ−ＮＯＳにおいてＣＣＲ４の転写を駆動し、結果として、細胞表面ＣＣＲ４を過剰発現する（Sundrudら、J Immunol.２００３年；１７１巻（７号）：３５４２〜３５４９頁）。ほぼ全てのＣＴＣＬおよびＡＴＬ、ならびに大きい百分率のＡＬＣＬ、特に、より悪性度が高いＡＬＫ（−）サブタイプもまたＣＣＲ４を過剰発現するので、表面ＣＣＲ４の過剰発現は、Ｔ細胞悪性腫瘍の処置においてより広い適用可能性を有する治療戦略を開発するために利用できる標的と思われる。理論に束縛されないが、Ｔｒｅｇ細胞はＣＣＲ４を豊富に発現するので（Hiraharaら、J Immunol.２００６年；１７７巻（７号）：４４８８〜４４９４頁）、ＣＣＲ４指向性の治療は、腫瘍微小環境中で、腫瘍を根絶する宿主免疫応答に対する恐るべき障壁を構成するＴｒｅｇを排除する可能性が高い。

【0253】

標的細胞上での共阻害性リガンドの発現は、ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性にも影響を与え得る。ＰＤＬ−１の発現をＡＴＬ細胞株のパネルにおいて評価した場合、ＳＴ１のみが、認識できる量のＰＤＬ−１を示した。対照的に、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞媒介性細胞溶解に対して高度に感受性であるＡＬＫ陰性のＭａｃ−１、Ｍａｃ−２ＡおよびＭａｃ−２Ｂ細胞株を含む全てのＡＬＣＬ細胞株が、ＰＤＬ−１の豊富な細胞表面発現を示した（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。したがって、ＰＤＬ−１自体の発現は、ＣＣＲ４発現と細胞溶解の有効性との間のいずれの食い違いも説明しない可能性が高い。

【0254】

したがって、本明細書で開示されるＣＣＲ４ ＣＡＲは、患者におけるあるスペクトルの新生物性Ｔ細胞疾患を除去するためにｅｘ ｖｉｖｏ操作されたＴ細胞が利用される、Ｔ細胞悪性腫瘍に対する新規養子細胞治療アプローチを示す。モガムリズマブを用いた蓄積しつつある臨床経験およびＣＣＲ４遺伝子破壊マウスの報告された平凡な表現型特色は心強く（Oguraら、J Clin Oncol.２０１４年；３２巻（１１号）：１１５７〜１１６３頁；Duvicら、Blood.２０１５年；１２５巻（１２号）：１８８３〜１８８９頁；Chvatchkoら、J Exp Med.２０００年；１９１巻（１０号）：１７５５〜１７６４頁）、ＣＣＲ４標的化ＣＡＲ Ｔ細胞治療の毒性プロファイルが生成され得る。Ｂ細胞の長期または恒久的な形成不全を生じるＣＤ１９指向性ＣＡＲ治療（Karlosら、Sci Transl Med.２０１１年；３巻（９５号）：９５ｒａ７３頁）とは異なり、ＣＣＲ４指向性ＣＡＲ治療は、処置された個体においてＴ細胞サブセットの主要な混乱を引き起こす可能性が低い。図１Ａのデータでわかるように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方が、開示されたＣＡＲを発現でき、培養物中での自己除去も兄弟殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄａｌ ｄｅａｔｈ）も受けることなく、長期生存し続けることが明らかである。アカゲザルＣＣＲ４の細胞外ドメインは、ヒトＣＣＲ４の細胞外ドメインに対して１００％同一であり（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２５２９４９およびＰ５１６７９）、ＣＣＲ４ ＣＡＲが由来する抗体は、アカゲザルＣＣＲ４と反応する。したがって、安全性評価研究を、ＣＣＲ４ ＣＡＲによるサルＣＤ３^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ操作、および自家改変Ｔ細胞の動物中への戻し再注入を用いて、アカゲザルにおいて実施できる。

【0255】

したがって、既存の処置レジメンがほとんど不適切であり、長期生存を付与しないあるスペクトルのＴ細胞悪性腫瘍を処置するために使用できるケモカイン受容体ＣＣＲ４指向性ＣＡＲが、本明細書で開示される。
（実施例３）
マカク研究

【0256】

以下は、毒性研究のための例示的なプロトコールである。アカゲザルは、抗ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を評価するのに適切な非ヒト霊長類種である。ヒトおよびアカゲザルのＣＣＲ４は、臨床試験において使用されるＣＡＲ Ｔ受容体によって標的化される領域中で、ほぼ完全に相同である。ヒトおよびアカゲザルの４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達分子は、高度に保存されており（９５％）、ＣＤ３ζの免疫受容体チロシン活性化モチーフには１００％の同一性が存在する。したがって、任意のプロトコールの安全性は、アカゲザルにおいて確認できる。

【0257】

単離されたＴ細胞を、ｒｈＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）を補充した培地中でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞受容体をコードする複製インコンピテントなレンチウイルスベクターにそれらを曝露させることによって形質導入する。細胞を−８０℃で貯蔵する。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ３およびプロテインＬの両方について染色される細胞として定義される。細胞を、十分な数の細胞が産生されるまで、少なくとも７日間にわたって培養物中で拡大増殖させる（初回注入および潜在的な使用のための１つの完全バックアップ）。

【0258】

Ｃｙｔｏｘａｎ（２時間かけて４０ｍｇ／ｋｇ）およびフルダラビン（２時間かけて４０ｍｇ／ｍ^２）を、プレコンディショニングレジメンとして、１日１回×２（−７日目および−６日目）にＩＶで与える。生理食塩水（ＮＳ）およびＭｅｓｎａ（１０ｍｇ／ｋｇ）による静脈内水分補給を、Ｃｙｔｏｘａｎの３０分前、その４、６および８時間後に与えて、尿収集系毒性を予防する。例示的なプロトコールでは、白血球アフェレーシスを、−２８日目〜−８日目に実施し、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を上記のように産生する。−７日目および−６日目に、動物をリンパ枯渇させる。１日目に、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与する。

【0259】

２つの処置群（各々３匹のマカク）が存在し、１つの群は、プレコンディショニングレジメン単独によるものであり、２番目の群は、１日目に１×１０^７の形質導入された細胞／ｋｇで投与されるＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞によるものである。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ＣＡＲ Ｔ細胞を選択し、１：１の比で与える。

【表A】

【0260】

試験動物を、バイタルサイン（少なくとも１２時間毎、ＣＲＳの徴候が存在する場合にはより頻繁に）、尿検査によって臨床的にモニタリングし、ＣＲＳまたは神経毒性の徴候について観察する。完全化学パネル＋アミラーゼおよびリパーゼ、ＣＢＣならびに凝固試験を含む日常的な臨床検査を、定期的に評価する。
（実施例４）
臨床試験

【0261】

例示的な臨床試験を以下に開示する。この研究の目的は、Ｔ細胞白血病／リンパ腫上で広く発現される抗原を標的化する対象自身の形質導入されたＴ細胞を使用することによって、有効な養子細胞治療を樹立することである。

【0262】

組み入れ基準：皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、セザリー症候群（ＳＳ）または慢性、リンパ腫型もしくは急性のサブタイプの成人Ｔ細胞白血病を含む、病理学的に確認された再発性／不応性ＣＣＲ４^＋リンパ系悪性腫瘍を有する成人対象。対象は、測定可能または評価可能な疾患を有さなければならない。循環ＡＴＬ細胞についての特徴的な異常な（即ち、ＣＤ３^ｄｉｍ、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋発現）ＦＡＣＳプロファイルを有する＞１０％のＰＢＭＣを有するＡＴＬ対象を、評価可能な疾患を有するとみなす。対象は、適切な生理的パラメーターを有さなければならない：
ａ）絶対的顆粒球計数≧１０００Ｋ／ｕＬ、血小板計数≧７５，０００Ｋ／ｕＬおよびヘモグロビン≧９ｇ／ｄＬ。
ｂ）ビリルビンおよびクレアチニン≦１．５×施設のＵＬＮ。
ｃ）ＡＳＴ、ＡＬＴ≦３．０×施設のＵＬＮ。
ｄ）心エコー図によって決定される正常心駆出率
ｅ）カルノフスキーパフォーマンススコア≧７０％またはＥＣＯＧ≦１；ならびに
ｆ）ＦＥＶ１およびＤＬｃｏ＞予測の６０％。

【0263】

除外基準
１．症候性白血病性髄膜炎、中枢神経系（ＣＮＳ）転移、＞１００，０００細胞／ｍｍ^３を有する白血病性合併症、ＧＩ管合併症、血清カルシウムまたはＬＤＨ＞１．５×正常値の上限を有する対象は除外する。しかし、ＡＴＬおよび別のＨＴＬＶ−１関連疾患、例えば熱帯性痙性不全対麻痺症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）の両方を有する対象は、それらの症状の重症度に依存して、プロトコールに登録してもよい。

【0264】

２．以前に同種幹細胞移植片を受けた対象。

【0265】

３．治療の開始前４週間以内にＡＴＬの処置のために高用量の全身コルチコステロイドを受けた対象。

【0266】

４．研究の開始前４週間に、任意の細胞傷害性治療、免疫療法、抗腫瘍ワクチンまたはモノクローナル抗体を受けた対象。

【0267】

５．３ヶ月未満の平均余命。

【0268】

６．報告された活動性細菌感染、活動性または慢性のＢ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＨＴＬＶ−ＩＩ感染。

【0269】

７．Ｂ型またはＣ型肝炎（Ｈｅｐ）の既知の病歴を有する対象は、前処置化学療法と関連する肝炎の再活性化のリスクに起因して、適格でない。対象は、抗原陰性でない場合、Ｈｅｐ ＢおよびＣについて血清陰性でなければならない。Ｂ型またはＣ型肝炎抗体試験が陽性である場合、対象を、定量的ＨＢＶ ＤＮＡまたはＨＣＶ ＲＮＡによってこれらのウイルスの存在について試験しなければならない。

【0270】

８．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する対象は、その免疫応答が欠損していて日和見感染のリスクがかなり高い状態に置かれているという定義によって、この研究には適格でない。

【0271】

９．妊娠中および授乳中の対象は、発生中の胎児に対するＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の影響は未知であるので、研究には適格でない。

【0272】

１０．治療の間有効な避妊を実施できないことまたは実施を拒否すること。出産可能な潜在力を有する男性および女性は、処置の間および処置の完了後４ヶ月間にわたって、受胎調節または禁欲の有効な方法を使用しなければならない。

【0273】

１１．治験責任者の判断によって、ベースライン来診の時点で、対象の登録または研究手順の順守を危険にさらす顕著なおよび／または制御されない心、腎、肝もしくは他の全身障害または顕著な心理学的状態を有する対象。

【0274】

概要：対象の適格性を確立した後、対象は、十分な数の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を得るために白血球アフェレーシスを受け、活性化されたリンパ球を、レンチウイルスＣＣＲ４−ＣＡＲ．ＢＢζベクターを含有する上清に曝露させることによって、ＣＣＲ４に対して特異的なキメラ抗原受容体を発現するように形質導入するために、ＣＤ８^＋末梢血リンパ球について選択される。形質導入された細胞を、７〜１０日間拡大増殖させ、対象への投与の前に、抗腫瘍活性および無菌性について試験する。これらのエフェクター細胞は、産生の直後に使用すること、または凍結保存し、後日の使用の前に解凍することができる。これらのエフェクター細胞の計画した再注入の５日前に、対象は、シクロホスファミドおよびフルダラビンの標準的な３日間前処置レジメンを開始し、その後、ＣＣＲ４−ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入と事後処置を行う。

【0275】

用量制限毒性：用量制限毒性は以下のように定義される：
・ グレード４の好中球減少症が、細胞移入の日から２１日間よりも長く持続する
・ グレード４の血小板減少症が、細胞移入の日から３５日間よりも長く持続する
・ 以下を除く、グレード３および４の全ての毒性：
・ ３日以内に適切な医学的介入に応答し、≦グレード２まで回復する、グレード３のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）。
・ 敗血症グレード４の感染または出血の非存在下で７日未満持続する、グレード４の好中球減少症（ＡＮＣ＜５００／ｍｍ^３）またはグレード４の血小板減少症（血小板計数＜２５，０００／ｍｍ^３）。
・ 無併発性のグレード３の感染
・ 適切な医学的治療によって８時間以内に≦グレード２まで可逆的である、細胞注入後２４時間以内に（細胞注入に関連して）起きる毒性。
・ ７２時間またはそれ未満にわたる昇圧剤（＞２ｍｃｇ／分または等価なノルエピネフリン用量、２ｍｃｇ／分未満またはそれと等しい用量は、ＤＬＴではない）による処置を必要とする低血圧。７２時間は、昇圧剤が一時的に中断されその後再開される場合であっても、昇圧剤の最初の開始から測定する。
・ ７日以内にベースラインまたはグレード１に回復する、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼまたはビリルビンにおけるグレード４の上昇。
・ ３日未満持続するグレード３の悪心、嘔吐または下痢。

【0276】

用量漸増：用量漸増は、対象の実際の体重に基づいて投与されるＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞−Ｔ細胞［これは正しいでしょうか？Ｔ細胞を繰り返しますか？］の数を用いて、３〜６人の対象のコホートで進行する。最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で６人の対象のうち１人以下が処置の間に用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験する用量レベル、および（≦６人のうち）少なくとも２人の対象が薬物に起因するＤＬＴを有する用量を下回る用量である。評価不能な対象の代わりの最大で３人の交代要員を含む、合計２１〜３３人の対象を登録する。対象がＤＬＴを経験しなかったが、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞注入を受けなかった場合、その対象は、毒性について評価可能ではなく、その用量レベルで交代させる。

【表3】

【0277】

各用量レベルは、最低３人の対象を含み、細胞用量を、新鮮に培養したＣＡＲ Ｔ細胞または注入の直前に解凍した凍結保存されたＣＡＲ Ｔ細胞の計数によって決定する。同じ用量レベルで順次処置される対象間には、ＣＡＲ Ｔ細胞注入において少なくとも１４日間の遅延が存在する。

【0278】

用量漸増は、以下の表４に概説した規則に従う。

【表4】

【0279】

処置投与：

【0280】

白血球アフェレーシス：対象は、およそ６〜１０×１０^９の単核細胞の標的収量を得るために、１５リットルの白血球アフェレーシスを受ける。この手順は、二重静脈アクセスを必要とし、完了までおよそ３〜４時間かかる。末梢静脈アクセスが十分でない場合、中心ラインを置く。

【0281】

細胞産物の調製：末梢血ＣＤ８リンパ球を、ＣＤ８マイクロビーズを使用して単離する。単離されたＴ細胞を、ｒｈＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍＬ）を補充した培地中でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、抗ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞をコードする複製インコンピテントなレンチウイルスベクターにそれらを曝露させることによって形質導入する。細胞を、十分な数のエフェクター細胞が産生されるまで、少なくとも７日間にわたって培養物中で維持する。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞は、フローサイトメトリーアッセイにおいて、ＣＤ３およびプロテインＬの両方について染色される細胞として定義され（Zhengら、.J Transl Med ２０１２年；１０巻：２９〜３５頁）、フローサイトメトリーによって定量化され、ＣＣＲ４発現ＥＤ（−）４１２１４細胞株標的に対する溶解能について評価される。十分な細胞が、対象への投与のための初回細胞注入用に産生され、潜在的な後の使用のための１つの完全バックアップ細胞産物が産生される。

【0282】

細胞産物の検証：細胞産物を、以下の表５に列挙する手順を実施することによって、生存度、および感染性因子の混入について評価する。

【表5】

【0283】

コンディショニング化学療法および抗ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞投与：
処置計画の全体的概要

【表6】

【0284】

−４、−３、−２および−１日目の詳細な化学療法処置。対象は、毎日の２００または３００ｍｇの経口アロプリノールを開始する。対象は、１〜３時間にわたる１０００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムＩＶによる事前水分補給を受ける。対象は、化学療法（ＩＶオンダンセトロンを置換できる）の１時間前に始まって、−４、−３および−２日目に１６〜２４ｍｇの経口オンダンセトロンを受ける。ロラゼパムおよびプロクロルペラジンなどのさらなる制吐薬もまた、突出性悪心のために与えられ得る。３００ｍｇ／ｍ^２ ＩＶの用量のシクロホスファミドを、１００ｍｌの５％デキストロース溶液中に希釈し、３０分間にわたって注入する。シクロホスファミド注入が完了した後、対象は、３０分間にわたって、１００ｍＬの０．９％塩化ナトリウム中のフルダラビン３０ｍｇ／ｍ^２ ＩＶを受ける。ＣＫＤ−ＥＰＩ方程式によって計算した８０ｍｌ／分未満のクレアチニンクリアランスを有する対象では、フルダラビンの１日用量を２０％低減させる。フルダラビン注入の完了後、対象は、１〜２時間にわたって１０００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムＩＶを受ける。必要に応じてフロセミドを与える。

【0285】

−１日目：必要に応じた制吐薬などの一般的な支持的ケア以外、介入なし。膀胱毒性を最小化するために、対象は、通常の経口流体摂取を少なくとも２Ｌ／日まで増加させるべきである。
１日目の詳細な処置計画：

【0286】

１．対象が血行力学的に安定であり、呼吸不全、顕著な生化学的実験室異常を発生させていない、または新たな感染性プロセスの徴候を有し、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与を耐容できることを確認する。細胞産物の投与を複雑化する健著な問題を対象が発生させている場合、ＣＡＲ Ｔ細胞の投与は、最大で７２時間遅延され得る。ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞注入のおよそ３０〜４５分前に、対象に、６５０ｍｇの経口アセトアミノフェンおよび２５〜５０ｍｇの経口または２５ｍｇのＩＶジフェンヒドラミンを事前薬物適用する。

【0287】

２．ＣＡＲ Ｔ細胞が凍結保存されている場合、細胞産物を解凍し、室温（約２５℃）にする。抗ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞がその放出基準を満たしたことを確認した後、細胞産物を送達する。

【0288】

３．ＣＡＲ Ｔ細胞の凝集を防止するために注入バッグを穏やかにかき混ぜながら、ＣＣＲ４ ＣＡＲ Ｔ細胞を、非濾過チュービングを介して自由流動性中心静脈カテーテルを通じて２０分間にわたって静脈内注入する。

【0289】

４．対象のバイタルサイン（心拍数、呼吸数、温度、血圧および酸素飽和度）を、細胞注入の開始直前、細胞注入の開始後最初の１時間にわたって１５分毎（±５分）、次の１時間わたって３０分毎（±１０分）、およびさらなる２時間にわたって１時間毎（±１０分）に評価する。対象が臨床的に示されるような細胞注入に関連する急性毒性を有する場合、バイタルサインを、安定するまでより頻繁に実施する。細胞産物の注入は、必要に応じて緩徐化しても中断してもよい。

【0290】

５．適切な呼吸器治療、さらなるＩＶＦ、利尿薬、さらなる抗ヒスタミン薬、抗不整脈薬、昇圧剤、利尿薬および酸素治療を、急性または亜急性の注入毒性に対処するために必要に応じて投与する。

【0291】

６．そのベースライン血圧（ＢＰ）の＜８０％または＜１００ｍｍＨｇの収縮期ＢＰを有する対象は、２〜３分間にわたって１ＬのＮＳを受ける。この最初の１Ｌの生理食塩水（ＮＳ）に応答しない対象は、１０分間にわたってさらに１ＬのＮＳを受け、ＩＣＵに移送すべきである。＜８５ｍｍＨｇの収縮期ＢＰを有する対象は、ＩＣＵに移送すべきである。３時間離れて２回、＞１２５拍／分の頻脈を有する対象は、ＩＣＵに移送すべきである。経鼻カニューレによる４Ｌまたはそれよりも多くの追加の酸素を必要とする対象は、ＩＣＵに移送すべきである。
２〜７日目の詳細な処置計画：

【0292】

１．必要に応じた、観察および処置のための義務的入院。対象から、４時間毎、および臨床的に示された場合にはより頻繁に、慣用のバイタルサインを得る。対象が入院中に、慣用の化学および血液学のパネルを、ＣＡＲ Ｔ細胞注入期間の直後に毎日評価する。低血圧、頻脈、低酸素または顕著な（＞グレード２の）神経機能障害を経験する対象も、同様にＩＣＵに移送すべきである。

【0293】

２．フィルグラスチム（約５ｍｃｇ／ｋｇ／日）ＳＣを、２日目に開始し、対象の絶対的好中球計数（ＡＮＣ）が５００細胞／ｍｍ^３に達するまで継続して投与する。

【0294】

３．好中球減少性（ＡＮＣ＜５００／ｍｍ^３）でありながら熱性である対象、または局在症状もしくは感染が疑われる知見と共に発熱を有する対象は、適切な経験的抗生物質で処置し、適切な微生物学的培養物を得る。臨床知見および／または培養結果は、抗微生物治療におけるさらなるＸ線検査手順または変化を指示する。

【0295】

４．ＣＡＲ Ｔ細胞注入後最初の数日以内に一般に発生するサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を有する対象を処置する
応答基準：
１．悪性リンパ腫についての応答の基準

【0296】

ａ．完全奏効：完全奏効（ＣＲ）の指定は、以下の全てを必要とする：（１）存在する場合には治療前の疾患および疾患関連症状の全ての検出可能な臨床的証拠の完全な消失；（２）ＰＥＴ陰性である限り、処置後の残留塊が許容される。処置前ＰＥＴスキャンが陰性であった場合、全てのリンパ節および結節塊は、ＣＴ上で正常サイズまで退縮していなければならない（治療前に＞１．５ｃｍであった節について、その最大横径で＜１．５ｃｍ）；（３）処置前にその長軸が１．１〜１．５ｃｍでありその短軸が１．０ｃｍよりも大きかった以前に侵されていた節は、処置後にその短軸が＜１．０ｃｍまで減少していなければならない；（４）身体検査またはＣＴスキャンに基づいて治療前に肥大したとみなされる場合、脾臓および／または肝臓は、身体検査で触知可能であってはならず、画像化研究によって正常サイズとみなされなければならない、ならびに（５）骨髄が処置前にリンパ腫によって侵されていた場合、浸潤物は、反復する骨髄生検で取り除かれていなければならない。

【0297】

ｂ．部分奏効：部分奏効（ＰＲ）の指定は、以下の全てを必要とする：（１）最大の優位な節または結節塊のうち最大で６つの直径の積和における、少なくとも５０％の低減。これらの節または塊は、以下の全てに従って選択すべきである：これらは、少なくとも２つの垂直寸法で明らかに測定可能でなければならない；可能な場合、これらは、身体の異なる領域からでなければならない；これらは、これらの部位が侵されている場合は常に、疾患の縦隔および後腹膜領域を含むべきである；（２）他の節、肝臓または脾臓のサイズに増加がないこと；（３）脾臓および肝臓の小結節は、そのＳＰＤにおいて、または単一の小結節については最大横径において、＞５０％退縮しなければならない；（４）脾臓および肝臓の小結節を除いて、他の臓器の合併症が通常評価可能であり、測定可能な疾患は存在すべきではない。骨髄評価は、試料が処置前に陽性であった場合、ＰＲの決定には無関係である。上記基準によってＣＲを達成するが、持続性の形態的骨髄合併症を有する対象は、部分奏効者とみなす；（５）疾患の新たな部位が存在しないこと；（６）処置前ＰＥＴスキャンが陽性であった場合、処置後ＰＥＴは、少なくとも１つの以前に侵された部位において陽性でなければならない；ならびに（７）処置前ＰＥＴが陰性であった場合、ＣＴ基準を使用すべきである。

【0298】

ｃ．安定疾患：対象は、ＣＲまたはＰＲに必要な基準を達成できないが、進行性疾患の基準を満たさない場合、安定疾患（ＳＤ）を有するとみなされる。ＰＥＴは、疾患の以前の部位において陽性でなければならないが、処置後ＣＴまたはＰＥＴで合併症の新たな領域は存在しない。処置前ＰＥＴが陰性であった場合、処置後ＣＴスキャン上で以前の病変のサイズに変化があってはならない。

【0299】

ｄ．進行性疾患：リンパ節は、短軸にかかわらず長軸が１．５ｃｍよりも大きい場合、異常とみなされる。リンパ節が１．１〜１．５ｃｍの長軸を有する場合、その短軸が１．０ｃｍよりも大きい場合にのみ、異常とみなされる。＜１．０×＜１．０ｃｍのリンパ節は、再発性または進行性疾患について異常とはみなされない。進行性疾患についての他の基準には、以下が含まれる：（１）他の病変のサイズが減少している場合であっても、治療の間または治療の最後の時点での、いずれかの軸における１．５ｃｍよりも大きい任意の新たな病変の出現。以前に影響されなかった部位における増加したＦＤＧ取り込みは、他のモダリティーを用いた確認後にのみ、再発性または進行性疾患とみなされる。（２）任意の以前に侵された節の直径の積和、または単一の侵された節、または他の病変のサイズにおける、最下点からの少なくとも５０％の増加。１．０ｃｍ未満の短軸の直径を有するリンパ節は、＞５０％、および１．５×１．５ｃｍのサイズまで、または長軸が１．５ｃｍよりも大きくなるまで、増加しなければならない。（３）その短軸が１ｃｍよりも大きい任意の単一の以前に同定された節の最長直径における、少なくとも５０％の増加；（４）病変がＰＥＴによって検出するには小さすぎる場合を除き、病変が治療前にＰＥＴ陽性であった場合には、病変はＰＥＴ陽性でなければならない；（５）測定可能な節外性疾患は、結節性疾患と同様の様式で評価すべきである。これらの推奨について、脾臓は、結節性疾患とみなされる。画像化研究または身体検査によって異常がなおも認められるが、組織学的に陰性であることが見出される場合を除き、評価しかできない疾患は、存在または非存在とのみ記録する。
２．ＡＴＬについての応答の基準

【0300】

ａ．完全奏効：完全奏効（ＣＲ）は、疾患の全ての臨床的、顕微鏡的およびＸ線検査的証拠の消失として定義される。全ての節は、正常サイズ（その最大横径が１．５ｃｍ）まで退縮していなければならず、１．１〜１．５ｃｍであった以前に侵された節は、１．０ｃｍまで減少していなければならない。ＨＴＬＶ−１キャリアは、末梢血中に、小さい百分率の多葉（ｐｏｌｙｌｏｂａｔｅｄ）核を有する異常なリンパ球、いわゆる花細胞を頻繁に有するので、５％未満のかかる細胞が残存し、花細胞を含む絶対的リンパ球計数が４×１０^９／Ｌ未満であった場合に限り、ＣＲが達成される。

【0301】

ｂ．不確定完全奏効：不確定完全奏効（ＣＲｕ）の指定は、処置後の、残留塊を伴う、腫瘍サイズにおける７５％の低減を必要とする。

【0302】

ｃ．部分奏効：部分奏効（ＰＲ）は、新たな病変の出現を伴わない、測定可能な疾患の最大直径の積和における５０％の低減として定義される。さらに、末梢血中の絶対的異常なリンパ球計数における５０％またはそれよりも大きい低減が、ＰＲを達成するために必要とされる。

【0303】

ｄ．進行性疾患：末梢血中の進行性疾患（ＰＤ）は、４×１０^９／Ｌの花細胞を含む、花細胞の計数および絶対的リンパ球計数における最下点からの５０％の増加によって定義される。他の病変におけるＰＤまたは再発性疾患は、測定可能な疾患の積和における最下点からの５０％の増加、または皮膚を除く新たな病変の出現として定義される。

【0304】

ｅ．安定疾患：安定疾患は、ＣＲ／ＰＲもＰＤも達成できないこととして定義される。

【0305】

本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態が本発明の例にすぎず、本発明の範囲に対する限定と解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神内に入る全てのものを本発明者らの発明として主張する。

【図1】

【図2A】

【図2BC】

【図2D】

【図3AB】

【図3CD】

【図3E】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]