特許 6912903 細胞の生産方法及び細胞培養用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6912903

(24)【登録日】2021年7月13日

(45)【発行日】2021年8月4日

(54)【発明の名称】細胞の生産方法及び細胞培養用キット

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20210727BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20210727BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 AZNA

   C12N5/07

【請求項の数】9

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2017-44607(P2017-44607)

(22)【出願日】2017年3月9日

(65)【公開番号】特開2018-143211(P2018-143211A)

(43)【公開日】2018年9月20日

【審査請求日】2019年12月2日

(73)【特許権者】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(72)【発明者】

【氏名】小田嶋 浩

(72)【発明者】

【氏名】杣本 聡

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−１７４８２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２６３６３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０５１１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−１４８４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−３２１１５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１９２１３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Applied materials & interfaces，２０１３年，Vol.5, No.12，pp.5592-5600

【文献】 Journal of Biomedical Materials Research. Part A，２０１４年，Vol.103 No.6，pp.2045-2056

【文献】 Journal of Biomedical Materials Research. Part A，２００５年，Vol.75A No.3，pp.742-753

【文献】 Biomacromolecules，２０１２年，Vol.13, No.6，pp.1818-1827

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法であって、
細胞培養用基材が、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有し、
架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０^１０Ｐａであり、
細胞の生産方法が、細胞培養用基材上で細胞（Ｘ）を培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養用基材を分解する工程を含み、
分解剤（Ｅ）が多糖類分解酵素（Ｅ１）である細胞の生産方法。

【請求項2】

多糖類（Ａ）がセルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の細胞の生産方法。

【請求項3】

官能基（ｂ）がカルボキシル基、エポキシ基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２に記載の細胞の生産方法。

【請求項4】

細胞培養用基材の細胞培養表面における水（３７℃）に対する接触角が２０〜６０°である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞の生産方法。

【請求項5】

細胞培養用基材の細胞培養表面における表面粗さ（Ｒａ）が１μｍ以下である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の生産方法。

【請求項6】

細胞培養用基材が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及び下記最小アミノ酸配列（Ｘ）を有する細胞接着性ペプチド（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞の生産方法。
最小アミノ酸配列（Ｘ）：ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列（１）、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＰＤＳＧＲ配列（３）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（４）、ＬＧＴＩＰＧ配列（５）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（６）、ＩＫＶＡＶ配列（７）、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列（８）、ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ配列（９）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ配列（１０）、ＨＡＶ配列及びＹＫＬＮＶＮＤＳ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種。

【請求項7】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）が配列表において配列番号（８２）で表されるポリペプチド及び／又は配列番号（８２）で表されるペプチドを塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドを用いて化学修飾したポリペプチドである請求項６に記載の細胞の生産方法。

【請求項8】

細胞培養用基材の形状がシート状である請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞の生産方法。

【請求項9】

細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）を含む細胞培養用キットであって、
細胞培養用基材が、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有し、
架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０^１０Ｐａであり、
分解剤（Ｅ）が多糖類分解酵素（Ｅ１）である細胞培養用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養用基材、細胞の生産方法及び細胞培養用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、細胞培養は、ガラスの表面上又は種々の処理を施したポリスチレンの表面上で行なわれている。その一例として、例えば、プラズマ処理、コロナ処理等により表面処理されたポリスチレンに、コラーゲン、フィブロネクチン又はポリリジン等の細胞接着性タンパク質をコートしたポリスチレン等から構成される種々の形状の容器が細胞培養用基材として普及している。しかしながら、ポリスチレン等を用いて細胞培養した場合、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で細胞を処理する必要があり、細胞への毒性が高く、さらにその後の使用で有益である細胞外基質をも分解してしまう問題がある。

【0003】

これらの問題を解決するため、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）を表面グラフトした培養皿（特許文献１及び非特許文献１）、多糖類からなる培養皿（特許文献２〜４）が報告されている。ＰＮＩＰＡＭを表面グラフトした培養皿では、細胞を回収するために、２０℃で３０分程度細胞を処理するが、温度に対してセンシティビティが高い細胞に対して適用できないという問題点がある。
また、多糖類からなる培養皿は、親水性多糖類（アルギン酸等）を用いる方法と、難水溶性の多糖類（セルロース等）を用いる方法とがある。親水性多糖類を用いる方法においては、金属イオン等によりゲル化した親水性多糖類のゲル上で細胞を培養するものであるが、ポリスチレンのようなシャーレと異なり、ゲルの硬さが不十分であり、細胞接着の不良、接着細胞の形状不良を引き起こす問題がある。さらに、キレート剤によりゲルを硬くしたものが知られているが、ゲルを硬くするために用いられるキレート剤が細胞毒性の原因となっている。難水溶性の多糖類を用いる方法においては、糖分解酵素により細胞を剥離する方法及び変性セルロースをアミノ基含有化合物により分解する方法がある。糖分解酵素を用いる方法は難水溶性のため、基材が硬すぎるため、細胞を培養する水溶系では多糖類が分解されにくい問題がある。また、アミノ基含有化合物により分解する方法においては、細胞培養に必須のアミノ酸（アミノ基含有化合物）を培地に添加できない問題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特公平６−１０４０６１号公報

【特許文献2】特開２００７−２５９７３５号公報

【特許文献3】特開２０１５−４８４６７号公報

【特許文献4】特開２００５−１１０５３７号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】清水達也、岡野光夫、バイオサイエンスとバイオインダストリー、２０００年、５８（１２）、８５１〜８５４頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離可能な細胞培養用基材及び細胞培養用キット並びに細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
即ち、本発明は、細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法であって、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０^１０Ｐａであり、細胞の生産方法が、細胞培養用基材上で細胞（Ｘ）を培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養用基材を分解する工程を含み、分解剤（Ｅ）が多糖類分解酵素（Ｅ１）である細胞の生産方法；細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）を含む細胞培養用キットであって、細胞培養用基材が、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有し、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０^１０Ｐａであり、分解剤（Ｅ）が多糖類分解酵素（Ｅ１）である細胞培養用キット。

【発明の効果】

【0008】

本発明の細胞培養用基材及び細胞培養用キットは、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。また、本発明の細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法は、細胞の生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の細胞培養用基材は、多糖類（Ａ）の架橋剤（Ｂ）による架橋物（Ｃ）を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤（Ｂ）が活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａである細胞培養用基材である。

【0010】

多糖類（Ａ）としては、単糖（ａ）が１０個以上グリコシド結合により結合したもの及びこれらの誘導体が含まれる。
単糖（ａ）としては、炭素数３〜７の単糖（ａ１）又は前記（ａ１）が有するヒドロキシル基及び／若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルホオキシ基、メトキシカルボニル基及びカルボキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２）が含まれる。

【0011】

炭素数３〜７の単糖（ａ１）としては、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトース等が挙げられる。
トリオースとしては、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロースとしては、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトースとしては、セドヘプツロース等が挙げられる。

【0012】

単糖（ａ２）としては、１つ以上のヒドロキシメチル基（−ＣＨ₂ＯＨ）がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ２−１）、１つ以上のヒドロキシル基（−ＯＨ）がアミノ基（−ＮＨ₂）で置換された単糖（ａ２−２）、１つ以上のヒドロキシル基がＮ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ₃）で置換された単糖（ａ２−３）、１つ以上のヒドロキシル基がスルホオキシ基（−ＯＳＯ₃Ｈ）で置換された単糖（ａ２−４）、１つ以上のヒドロキシメチル基がメトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣＨ₃）で置換された単糖（ａ２−５）、１つ以上のヒドロキシメチル基がカルボキシメチル基（−ＣＨ₂ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ２−６）及び２つ以上のヒドロキシル基及び／又はヒドロキシメチル基が複数種類の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ２−７）等が挙げられる。

【0013】

前記（ａ２−１）としては、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−２）としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン及びムラミン酸等のアミノ糖等が挙げられる。
前記（ａ２−３）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチルムラミン酸等が挙げられる。
前記（ａ２−４）としては、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
前記（ａ２−５）としては、グルコースメチルエステル及び前記（ａ２−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
前記（ａ２−７）としては、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、ノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。

【0014】

多糖類（Ａ）として具体的には、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体（カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。
多糖類（Ａ）のうち、産業利用性及び分解性の観点から、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくはセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、キサンタン、アミロース、デキストラン及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましくはカルボキシメチルセルロースである。

【0015】

カルボキシメチルセルロースにおいて、ヒドロキシル基のカルボキシメチル基による置換率は、水溶性の観点から、０．０２〜３が好ましく、さらに好ましくは０．２〜２である。

【0016】

本発明において、架橋剤（Ｂ）は、活性水素基と反応し得る官能基（ｂ）を少なくとも２個有する有機化合物である。
官能基（ｂ）としては、カルボキシル基、エポキシ基、イソシアネート基、カルボジイミド基、オキサゾリン基及び酸ハライド基等が挙げられる。
これらのうち、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、カルボキシル基、エポキシ基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。

【0017】

架橋剤（Ｂ）は、官能基（ｂ）として１種を有しているものでもよく、２種以上を有しているものでもよい。

【0018】

架橋剤（Ｂ）において、カルボキシル基を有しているものとしては、ポリカルボン酸が含まれる。
ポリカルボン酸として、具体的には、２個のカルボキシル基を有しているもの｛炭素数２〜５０のアルカンジカルボン酸（シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、レパルギン酸及びセバシン酸等）及び炭素数８〜３６の芳香族ジカルボン酸（フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸及びナフタレンジカルボン酸等）、炭素数４〜５０の不飽和ジカルボン酸（マレイン酸、フマル酸及び炭素数１２〜４６のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸等）等｝、３個以上のカルボキシル基を有しているもの｛炭素数９〜２０の芳香族ポリカルボン酸（トリメリット酸及びピロメリット酸等）、炭素数６〜３６の脂肪族トリカルボン酸（ヘキサントリカルボン酸等）等が挙げられる。

【0019】

カルボキシル基を有しているものとして、これらのカルボン酸の無水物、低級アルキル（炭素数１〜４）エステル（メチルエステル、エチルエステル及びイソプロピルエステル等）化物を用いてもよく、無水物及び／又は低級アルキルエステル化物と上記カルボキシル基を有しているものと併用してもよい。

【0020】

また、架橋剤として不飽和モノカルボン酸を用いて、不飽和モノカルボン酸中のカルボキシル基を多糖類（Ａ）の活性水素と反応させて、さらに二重結合を反応させることにより架橋してもよい。
不飽和モノカルボン酸としては、炭素数２〜３０の不飽和モノカルボン酸が含まれ、具体的にはアクリル酸、メタクリル酸、プロピオル酸、２−ブチン酸、クロトン酸、イソクロトン酸、３−ブテン酸、アンゲリカ酸、チグリン酸、４−ペンテン酸、２−エチル−２−ブテン酸、１０−ウンデセン酸、２，４−ヘキサジエン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸及びネルボン酸等が挙げられる。

【0021】

カルボキシル基を有しているもののうち、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、好ましいものは、アジピン酸、炭素数１２〜４６のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸、テレフタル酸、イソフタル酸、マレイン酸、フマル酸、トリメリット酸、ピロメリット酸及びこれらの併用である。また、これらの酸の無水物や低級アルキルエステルも同様に好ましい。

【0022】

エポキシ基を有しているものとしては、具体的には、ポリグリシジルエーテル（エチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ビスフェノールＡジグリシジルエーテル、ビスフェノールＦジグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル及びフェノールノボラックグリシジルエーテル化物等）等が挙げられる。

【0023】

イソシアネート基を有しているものとしては、脂肪族ジイソシアネート化合物、脂環族ジイソシアネート及び芳香族ジイソシアネート化合物が含まれる。

【0024】

脂肪族ジイソシアネート化合物としては、例えば、トリメチレンジイソシアネート、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート（以下においてＨＤＩと略記する）、ペンタメチレンジイソシアネート，１，２−プロピレンジイソシアネート、１，３−ブチレンジイソシアネート、ドデカメチレンジイソシアネート及び２，４，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。

【0025】

脂環族ジイソシアネート化合物としては、例えば、１，３−シクロペンテンジイソシアネート，１，３−シクロへキサンジイソシアネート、１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート（以下においてＩＰＤＩと略記する）、水素添加ジフェニルメタンジイソシアネート（以下において水添ＭＤＩと略記する）、水素添加キシリレンジイソシアネート、水素添加トリレンジイソシアネート及び水素添加テトラメチルキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。

【0026】

芳香族ジイソシアネート化合物としては、例えば、フェニレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート（２，４−トリレンジイソシアネート及び２，６−トリレンジイソシアネート、以下においてＴＤＩと略記する）、２，２’一ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート（以下においてＭＤＩと略記する）、４，４’−トルイジンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルエーテルジイソシアネート、４，４’−ジフェニルジイソシアネート、１，５−ナフタレンジイソシアネート及びキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。

【0027】

イソシアネート基を有しているものとして、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、好ましいものは炭素数６〜１５の芳香族ジイソシアネート、炭素数４〜１２の脂肪族ジイソシアネート及び炭素数４〜１５の脂環式ジイソシアネートからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、特に好ましいものはＴＤＩ、ＭＤＩ、ＨＤＩ、水添ＭＤＩ及びＩＰＤＩからなる群より選ばれる少なくとも１種である。

【0028】

架橋剤（Ｂ）としては、反応性及び架橋物（Ｃ）の強度の観点から、エポキシ基を有しているものが好ましく、さらに好ましくはポリグリシジルエーテルである。

【0029】

本発明の細胞培養用基材は、架橋物（Ｃ）を含有するものであれば特に限定はないが、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及び下記最小アミノ酸配列（Ｘ）を有する細胞接着性ペプチド（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞接着因子を含有することが好ましい。
最小アミノ酸配列（Ｘ）：ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列（１）、ＹＩＧＳＲ配列（２）、ＰＤＳＧＲ配列（３）、ＲＹＶＶＬＰＲ配列（４）、ＬＧＴＩＰＧ配列（５）、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（６）、ＩＫＶＡＶ配列（７）、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列（８）、ＧＶＫＧＤＫＧＮＰＧＷＰＧＡＰ配列（９）、ＧＥＦＹＦＤＬＲＬＫＧＤＫ配列（１０）、ＨＡＶ配列及びＹＫＬＮＶＮＤＳ配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種。
なお、本発明において、「配列（１）」は「配列表における配列番号（１）」を意味し、配列（１）以外の配列についても同様である。

【0030】

フィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンは、細胞接着分子として一般的に知られているものである。
なお、本発明において、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。

【0031】

最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が知られており、細胞接着性の観点から、上記配列（１）〜（１１）が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列である。

【0032】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜５０個、つぎに好ましくは３〜３０個、特に好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個有するものである。なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。

【0033】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外に、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列（Ｙ）を有することが好ましい。

【0034】

補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列が使用でき、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の熱安定性の観点から、Ｇ（グリシン）及び／又はＡ（アラニン）を有する配列が好ましい。

【0035】

補助アミノ酸配列（Ｙ）としては、（ＧＡ）_a配列、（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列、（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列、（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列、｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（Ｇ）_i配列、（Ａ）_j配列、（ＧＧＡ）_k配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列、（ＧＰＰ）_n配列、（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ）_o配列、（ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ）_p配列及び／又は（ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ）_q配列を有する配列等が含まれる。
これらのうち、熱安定性の観点から、（ＧＡ）_a配列、（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列、（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列、（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列、｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列及び（ＧＰＰ）_n配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有するものが好ましく、さらに好ましくは（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列、（ＧＶＰＧＶ）_h配列、（ＧＶＧＶＰ）_m配列及び（ＧＰＰ）_n配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有するものであり、特に好ましくは（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列を有するものである。
なお、ａは５〜１００の整数、ｂは１〜３３の整数、ｃ、ｄ及びｅは２〜３３の整数、ｆは１〜１９４の整数、ｇは｛１｝〜｛２００／（６＋ｆ）｝の小数点以下を切り捨てした整数、ｈは２〜４０の整数、ｉ及びｊは１０〜２００の整数、ｋは３〜６６の整数、ｍは２〜４０の整数、ｎは３〜６６の整数、ｏは１〜２２の整数、ｐ及びｑは１〜１３の整数である。

【0036】

補助アミノ酸配列（Ｙ）は、Ｇ（グリシン）及び／又はＡ（アラニン）を含むことが好ましい。Ｇ（グリシン）及びＡ（アラニン）を含む場合、これらの合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
Ｇ（グリシン）及びＡ（アラニン）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Ｇ／Ａ）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。

【0037】

補助アミノ酸配列（Ｙ）には、以上の例示の他に、他のアミノ酸｛Ａ（アラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（トレオニン）、Ｖ（バリン）、Ｌ（ロイシン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｃ（システイン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｙ（チロシン）、Ｐ（プロリン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｑ（グルタミン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｒ（アルギニン）、Ｋ（リジン）及びＨ（ヒスチジン）等｝を含んでいてもよい。

【0038】

（ＧＡ）_a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１２）〜（１４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＳ）_b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１５）〜（１７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＡＧＹ）_c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（１８）〜（２０）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＶＧＹ）_d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２１）〜（２３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＧＹＧＶ）_e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２４）〜（２６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
｛ＤＧＧ（Ａ）_fＧＧＡ｝_g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（２７）〜（２９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＶＰＧＶ）_h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３０）〜（３３）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ｇ）_i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３４）〜（３６）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ａ）_j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（３７）〜（３９）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＧＡ）_k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４０）〜（４２）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＶＧＶＰ）_m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４３）〜（４５）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＰＰ）_n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４６）〜（４８）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＱＧＰＡＧＰＧ）_o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（４９）〜（５１）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＰＧＡＰＧＳＱＧＡＰＧＬＱ）_p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５２）〜（５４）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
（ＧＡＰＧＴＰＧＰＱＧＬＰＧＳＰ）_q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（５５）〜（５７）で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

【0039】

これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号（１２）、（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２１）、（２２）、（２４）、（２５）、（２７）、（２８）、（２９）、（３０）、（３１）、（３３）、（３４）、（３５）、（３７）、（３８）、（４０）、（４１）、（４３）、（４４）、（４６）、（４７）、（４９）、（５０）、（５２）、（５３）、（５５）又は（５６）で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１９）、（２２）、（２５）、（２９）、（３０）、（３１）、（３２）、（３３）、（３５）、（３８）、（４１）、（４４）、（４７）、（５０）、（５３）又は（５６）で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（１５）、（１６）又は（３３）で表されるアミノ酸配列である。

【0040】

補助アミノ酸配列（Ｙ）を含む場合、（Ｙ）の含有個数は、熱安定性の観点等から、細胞接着性ペプチド（Ｄ）１分子中に、２〜５０が好ましく、さらに好ましくは３〜３０、特に好ましくは４〜２０、最も好ましくは５〜１５である。また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）を含んでもよい。

【0041】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、必要により（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。

【0042】

また、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有してもよい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＮ末端には、細胞接着性の観点から、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５９）、ＧＰＡＶＴＧ配列（６０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（６１）、ＧＡＡＶＣＥＰＧ配列（６２）、ＧＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６３）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６４）、ＳＰＡＳＡＡＶＣＥＰＧ配列（６５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（６６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６７）、ＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（６８）、ＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（６９）及びＧＡＡＰＧＡＳ配列（７０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５９）、ＧＰＡＶＴＧ配列（６０）及びＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（６１）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、ＧＡＡＶＴＧ配列（５８）が特に好ましい。

【0043】

介在アミノ酸配列（Ｚ）としては、最小アミノ酸配列（Ｘ）のＣ末端には、細胞接着性の観点から、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（７２）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（７３）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（７４）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（７５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（７６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（７７）、ＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（７８）、ＣＤＡＧＹ配列（７９）、ＣＤＡＧＰＶＧＳＰ配列（８０）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（８１）からなる群より選ばれる少なくとも１種の介在アミノ酸配列（Ｚ）を結合していることが好ましく、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（７２）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（７３）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（７４）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（７５）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（７６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（７７）及びＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（７８）からなる群より選ばれる少なくとも１種がさらに好ましく、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（７１）が特に好ましい。

【0044】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。

【0045】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが、必要により（Ｘ）と（Ｙ）の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、（Ｘ）の両端に介在アミノ酸配列（Ｚ）を含むアミノ酸配列と（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）の数（個）は、細胞接着性の観点等から、１〜５０が好ましく、さらに好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。

【0046】

また、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より１個少ないことが好ましい｛この場合、補助アミノ酸配列（Ｙ）が少ないことが好ましい｝。細胞接着性ペプチド（Ｄ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との含有個数割合（Ｘ／Ｙ）は、０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは０．９〜１．４、特に好ましくは１〜１．３である。

【0047】

また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の末端部分（最小アミノ酸配列（Ｘ）又は補助アミノ酸配列（Ｙ）からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞接着性ペプチド（Ｄ）１個当たり、１〜１０００個が好ましく、さらに好ましくは３〜３００、特に好ましくは１０〜１００である。

【0048】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）の重量平均分子量（以下、Ｍｗ）は、１，０００〜１，０００，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜７００，０００、特に好ましくは３，０００〜４００，０００、最も好ましくは４，０００〜２００，０００である。

【0049】

なお、細胞接着性ペプチド（Ｄ）のＭｗは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ）。

【0050】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、化合物（ＡＭ）でさらに修飾されていてもよい。化合物（ＡＭ）としては、１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩（ＡＭ−１）、カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）、スルホ基を含有する化合物（ＡＭ−３）並びにヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）が含まれる。（ＡＭ）で修飾されていると、細胞増殖性がさらに良好となる。

【0051】

１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩を含有する化合物（ＡＭ−１）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらのハロゲン化水素塩及び４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。

【0052】

脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、並びにこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。

【0053】

脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。

【0054】

複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。

【0055】

芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。

【0056】

アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。

【0057】

アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリド、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチルブロミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルブロミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルクロリド及びＮ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。

【0058】

アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。

【0059】

アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【0060】

アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。

【0061】

アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。

【0062】

アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。

【0063】

アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。

【0064】

アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（（Ｂ１）は含まない。）等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、５００〜１００万が好ましく、さらに好ましくは１，０００〜８０万、特に好ましくは２，０００〜５０万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる｛基準物質：分子量４２０〜２０，６００，０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等｝。

【0065】

ハロゲン化水素塩としては、上記アミノ基含有化合物とハロゲン化物（フッ化水素、塩化水素、臭化水素及びヨウ化水素等）との塩が挙げられる。
具体的には、塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリド等が挙げられる。

【0066】

これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。

【0067】

これらの１〜３級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩（ＡＭ−１）のうち、細胞増殖性の観点から、塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルクロリドが好ましく、さらに好ましくは塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドである。

【0068】

カルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸であり、具体的には、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸及びフェニル酢酸等が挙げられる。また、これらカルボキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロ酢酸及びクロロぎ酸等が挙げられる。これらのカルボキシル基を含有する化合物（ＡＭ−２）のうち、細胞増殖性の観点からクロロ酢酸が好ましい。

【0069】

スルホ基を含有する化合物（ＡＭ−３）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸であり、具体的には、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸及びシクロヘキシルアミノスルホン酸等が挙げられる。また、これらスルホ基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロスルホン酸及びクロロエタンスルホン酸等が挙げられる。これらのスルホン基を含有する化合物（ＡＭ−３）のうち、細胞増殖性の観点からクロロエタンスルホン酸が好ましい。

【0070】

ヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられる。また、これらヒドロキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロエタノール及びクロロプロパノール等が挙げられる。これらのヒドロキシル基を含有する化合物（ＡＭ−４）のうち、細胞増殖性観点からクロロエタノールが好ましい。

【0071】

化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法が適用できる。
これらのうち、細胞増殖性の観点等から、（１）の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。

【0072】

（１）化合物（ＡＭ）と、修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法において、化学結合させるために、細胞接着性ペプチド（Ｄ）がアミノ酸残基として反応性基｛ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基、及び１級又は２級アミノ基等｝をもつアミノ酸を持っていることが好ましい。反応性基のうち、細胞増殖性の観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び１級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。また、細胞接着性ペプチド（Ｄ）の１分子中に反応性基を少なくとも１個有すればよいが、細胞増殖性の観点から、１分子中に２〜５０個有するものが好ましく、さらに好ましくは１分子中に３〜３０個、特に好ましくは１分子中に５〜２０個有するものである。

【0073】

化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。

【0074】

化合物（ＡＭ）と修飾前の細胞接着性ペプチド（Ｄ）とを共有結合させる具体例としては、細胞接着性ペプチド（Ｄ）中の側鎖にヒドロキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ及びＴｙｒ）を１〜３級のアミノ基、及び／又はアンモニウム塩、カルボキシル基、スルホン基、ヒドロキシル基を有するアルキルハロゲン化物でアルキルエーテル化する方法、及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）をアミノ基、及び／又はアンモニウム塩を有するアルコールでエステル化する方法が挙げられる。

【0075】

好ましい細胞接着性ペプチド（Ｄ）の一部を以下に例示する。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＲＧＤ配列（ｘ１）の場合
ＲＧＤ配列（ｘ１）の１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）₉配列（１６）（ｙ１）の１２個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１１万のポリペプチド（配列（８２））｛「プロネクチンＦ」、プロネクチンは三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
プロネクチンＦを化合物（ＡＭ）で修飾したタンパク質であり、具体的には、化合物（ＡＭ）として塩酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリドを用いて修飾したポリペプチド（「プロネクチンＦプラス」）；
（ｘ１）の５個と（ＧＡＧＡＧＳ）₃配列（１５）（ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約２万のポリペプチド（配列（８３））（「プロネクチンＦ２」）；（ｘ１）の３個と（ＧＶＰＧＶ）₂ＧＧ（ＧＡＧＡＧＳ）₃配列（３３）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｗ約１万のポリペプチド（配列（８４））（「プロネクチンＦ３」）等。

【0076】

（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＩＫＶＡＶ配列（ｘ２）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＲＧＤ配列（ｘ１）をＩＫＶＡＶ配列（７）（ｘ２）に変更した「プロネクチンＬ」、「プロネクチンＬ２」、又は「プロネクチンＬ３」等。

【0077】

（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）がＹＩＧＳＲ配列（ｘ３）の場合
プロネクチンＦ、プロネクチンＦ２又はプロネクチンＦ３のＲＧＤ配列（ｘ１）をＹＩＧＳＲ配列（ｘ３）に変更した「プロネクチンＹ」、「プロネクチンＹ２」、又は「プロネクチンＹ３」等。

【0078】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）は、人工的に合成されるもの（人工ポリペプチド）が含まれ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換え微生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって製造する。すなわち、細胞接着性ペプチド（Ｄ）としては、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。

【0079】

有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用いられる。細胞接着性ペプチド（Ｄ）を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。

【0080】

細胞接着因子としては、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、プロネクチンＦ及びプロネクチンＦプラスからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。

【0081】

本発明の細胞培養用基材において、細胞接着因子の含有量は、細胞接着性の観点から、細胞培養用基材の重量を基準として、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％である。

【0082】

本発明の細胞培養用基材の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、繊維状、ロッド状及び球状（ビーズ状等）等の形状が挙げられる。これらのうち、細胞培養に用いやすい観点から、シート状及び球状が好ましい。
シートである場合、シートの厚さとしては特に制限はないが、細胞培養のしやすさ及び分解性の観点から、０．５〜５００ｎｍのものが好ましく挙げられる。

【0083】

本発明の細胞培養用基材は、３７℃における貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａであり、好ましくは１×１０⁴〜１×１０⁸である。貯蔵弾性率Ｇ’が１０００Ｐａ未満であると、細胞の接着性低下、接着細胞の形状変化が起こる問題がある。また、１×１０¹⁰Ｐａを超えると、細胞培養用基材の作製が困難であり、また後述する分解剤（Ｅ）により分解されにくい問題がある。
貯蔵弾性率Ｇ’はレオメータにより測定した値である。

【0084】

本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における水（３７℃）に対する接触角は、細胞接着性の観点から、２０〜６０°が好ましく、さらに好ましくは３０〜５０°である。

【0085】

本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における表面粗さ（Ｒａ）は、細胞接着性の観点から、１μｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．５μｍ以下である。

【0086】

本発明の細胞培養用基材の製造方法としては、例えば、多糖類（Ａ）がカルボキシメチルセルロースであり、下記（１）〜（５）の工程を含むものが挙げられる。
（１）カルボキシメチルセルロース（以下において、ＣＭＣと略記する）を水に溶解させる工程。
（２）前記（１）で得られた基材に架橋剤（Ｂ）を添加し、架橋反応を進行させる工程。
（３）前記（２）で得られた基材をシート状、もしくはビーズ状に加工する工程。
（４）前記（３）で得られた基材を乾燥させ、水分を除去する工程。
（５）前記（４）で得られた基材に細胞接着性ペプチド（Ｄ）を修飾する工程。

【0087】

ＣＭＣを水に溶解させる方法としては、例えば攪拌機で水を撹拌しながら、ＣＭＣを添加する方法等が挙げられる。溶解液の均一さを確保するため、好ましくはＣＭＣを徐々に添加する方法が含まれる。

【0088】

ＣＭＣを水に溶解させる攪拌方法としては、例えば撹拌子をスターラーで回す方法、撹拌羽で撹拌する方法、前記２つの方法にさらに加熱をする方法等が挙げられる。
ＣＭＣ溶解液の粘度が高いため、撹拌羽で撹拌する方法が好ましく、さらに好ましくは加熱しながら撹拌羽で撹拌する方法である。

【0089】

架橋剤（Ｂ）の添加方法としては、例えば攪拌機でＣＭＣ溶解液を撹拌しながら、架橋剤（Ｂ）を添加する方法等が挙げられる。この場合、架橋剤（Ｂ）は一度に全量添加してもよく、ポンプ等を用いて徐々に添加してもよいが、架橋反応を均一に進行させる観点から、ポンプ等を用いて徐々に添加する方法が好ましい。

【0090】

架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液をシャーレ上に均一にシート状に加工する方法としては、例えば浸漬塗り、吹付、ローラー塗り及びスピンコート等が挙げられる。
生産性及びハンドリング性の観点から、浸漬塗りは好ましくなく、吹付、ローラー塗り及びスピンコートが好ましい。塗膜の均一性の観点から、より好ましくはローラー塗り、スピンコートである。塗布から乾燥までの効率の観点から、最も好ましくはスピンコートである。

【0091】

架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液をビーズ状に加工する方法としては、例えば、ＣＭＣ溶液を乾燥後に物理的に粉砕して粒子状にする粉砕法及び架橋剤添加後のＣＭＣ溶解液を疎水性有機溶剤中に分散させる分散法等が挙げられる。

【0092】

粉砕法としては、まず、乾燥物を粗粉砕し、次いで微粉砕することが好ましい。この際ジェット気流中で衝突板に衝突させて粉砕したり、ジェット気流中で粒子同士を衝突させて粉砕したり、機械的に回転するローターとステーターの狭いギャップで粉砕する方式が好ましく用いられる。

【0093】

分級工程では、前記粉砕工程にて得られた粉砕物を分級し、所定粒径の粒子に調整する。分級は、例えば、サイクロン、デカンター及び遠心分離等により、微粒子部分を取り除くことにより行うことができる。

【0094】

分散法において、架橋剤（Ｂ）添加後のＣＭＣ溶解液を有機溶剤中に分散させる方法としては、逆相懸濁法等が挙げられ、粒子径の均一性、粒子の円形度及び粒子表面形状の滑らかさの観点から、逆相懸濁法による分散が好ましい。
疎水性有機溶媒は公知（特許第３３６３０００号、特開２００３−１４７００５号公報記載）のものが使用でき、基本的に水に溶け難ければいかなるものも使用できる。その一例を挙げれば、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン及びｎ−オクタン等の脂肪族炭化水素、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサン等の脂環族炭化水素、ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素等が挙げられる。
分散剤としては、逆相懸濁重合分散剤として公知のものが使用でき、例えば、アニオン分散剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（特開平６−９３００８号公報記載）、モノアルキルリン酸塩（特開昭６１−２０９２０１号公報記載のもの等）等）、ノニオン分散剤（ショ糖脂肪酸エステル、ソルビトール脂肪酸エステル、脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物及びアルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物等）等が挙げられる。

【0095】

余分な水分を除去する方法としては特に限定されず、乾燥機を用いた乾燥方法があげられる。例えば、ディスクドライヤー、ターボドライヤー及びドラムドライヤー等の乾燥機を使用して乾燥する方法が挙げられる。
乾燥温度は、６０〜２３０℃が好ましく、さらに好ましくは１００〜２００℃である。乾燥温度が、６０℃以上であると、乾燥に長くの時間を必要とせずエネルギー消費量の点で経済的であり、一方、２３０℃以下であると、副反応や樹脂の分解などが起こらないので好ましい。乾燥雰囲気は常圧下でも減圧下（例えば５００ｍｍＨｇ以下）でもよい。

【0096】

乾燥後の含水率は、貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａになる水分量で規定される。貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００Ｐａ未満では、細胞培養用基材の形状がビーズ状の場合、粒子同士が合着する問題がある。また、細胞培養用基材の形状がシート状の場合は他の材料と触れたときに変形又は接着する問題がある。

【0097】

貯蔵弾性率Ｇ‘が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａになる水分量は、細胞培養用基材の重量を基準として、４０重量％以下が好ましく、貯蔵弾性率を向上させる観点から、さらに好ましくは３０重量％以下である。一方、水分量が減少しすぎると、体積収縮によって表面粗さＲａが大きくなるため、１０％重量以上がより好ましい。

【0098】

細胞接着性ペプチド（Ｄ）を細胞培養基材へ修飾する方法としては、（１）化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝させる方法、（２）細胞接着ペプチド（Ｄ）を物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）させる方法、並びに、（３）酵素修飾させる方法が挙げられる。

【0099】

化学結合する方法（１）としては、細胞接着性ペプチド（Ｄ）が有するの反応性基（−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−、−ＮＨ₂、−ＳＨ等）と多糖類（Ａ）が有する反応性基（−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ₂及び−ＳＨ等）を架橋することにより行われる方法等が挙げられる。
物理的吸着する方法（２）としては、所定濃度の細胞接着性ペプチド（Ｄ）を含有する溶液と細胞培養用基材とを所定時間共存させてることにより物理吸着させる方法等が挙げられる。
酵素修飾する方法（３）としては、グリコシドトランスフェラーゼ等の酵素を用いて細胞接着性ペプチド（Ｄ）に多糖類（Ａ）を結合させる方法等が挙げられる。

【0100】

本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養する細胞の生産方法である。

【0101】

細胞（Ｘ）としては細胞であれば制限がないが、本発明の細胞培養用基材を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。

【0102】

哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎臓細胞、腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞等｝、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。

【0103】

哺乳動物由来の株化細胞としては、ＣＲＦＫ細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５−８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ−６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５−１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ−３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡ ＰａＣＧ−２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ−１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ−３８細胞、ψ２細胞、及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。

【0104】

昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、２０００年）。

【0105】

これらの細胞（Ｘ）のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは腎臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、幹細胞及び前駆細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくはＣＲＦＫ細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞及びＷＩ−３８細胞、特に好ましくはＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞及びＶＥＲＯ細胞である。

【0106】

本発明の細胞の生産方法に用いられる培地（ＭＥ）としては、無血清培地（ＳＴＥＭＰＲＯ ｈＥＳＣ ＳＦＭ１７、ＴｅＳＲ ２、Ｅ８培地、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ−ＦＸ培地、ｈＥＳＦ９２ａｉ、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ^TM、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯ^TMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ^TMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＴＧ^TM培地及びこれらの混合培地等）；一般の培地（ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地）；及びこれらの混合培地等が挙げられる。

【0107】

また、これらの培地には、血清を添加することができる。
血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれる。
血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。

【0108】

血清を使用する場合、血清の使用量（重量％）は、培地の重量に基づいて、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．３〜３０、特に好ましくは１〜２０である。

【0109】

培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。

【0110】

細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。

【0111】

細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０^-16〜１０^-3が好ましく、さらに好ましくは１０^-14〜１０^-5、特に好ましくは１０^-12〜１０^-7である。

【0112】

これらの培地には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０^-6〜１０が好ましく、さらに好ましくは１０^-5〜１、特に好ましくは１０^-4〜０．１である。

【0113】

培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、培地１ｍＬ当たり、１００〜１億が好ましく、さらに好ましくは１０００〜１千万、特に好ましくは１万〜１００万である。

【0114】

細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、トリパンブルー又はクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
また、培地に投入する細胞培養用基材の乾燥重量（ｇ）は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地１Ｌ当たり、０．００５〜８００が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜２００、特に好ましくは０．１〜４０である。

【0115】

培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ₂）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ₂濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、１〜３日毎に培地交換しながら培養する条件である。

【0116】

本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞（Ｘ）を培養するものであれば特に制限はないが、産業利用性の観点から、細胞培養用基材上で細胞（Ｘ）を培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養用基材を分解する工程を含んでいることが好ましい。
分解剤（Ｅ）としては、多糖類分解酵素（Ｅ１）、有機酸（Ｅ２）及び無機酸（Ｅ３）等が挙げられる。
これらのうち、多糖類分解酵素（Ｅ１）が好ましい。
多糖類分解酵素（Ｅ１）としては、多糖を分解する酵素として知られているものを制限なく使用でき、具体的には、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられる。
細胞培養用基材を分解剤（Ｅ）で分解することにより、増殖した細胞の形状を壊さずに細胞を回収することができるので、例えば、シート状、球状及び組織状の細胞を得ることができる。

【0117】

好ましい多糖類分解酵素（Ｅ１）としては、細胞培養用基材の分解性の観点から、細胞培養用基材を構成する架橋物（Ｃ）に用いられている多糖（Ａ）により適宜選択されるが、具体的には下記の組み合わせが好ましい。
多糖（Ａ）｛セルロース、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛セルラーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛デキストリン及びデキストリン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛デキストラナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛カラギーナン及びカラギーナン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛カラギナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛アルギン酸及びアルギン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛アルギン酸リアーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛ヒアルロニダーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛キチン及びキチン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛キチナーゼ｝との組み合わせ。
多糖（Ａ）｛キトサン及びキトサン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種｝と分解剤（Ｅ）｛キトサナーゼ｝との組み合わせ。

【0118】

分解剤（Ｅ）は分解剤（Ｅ）溶液として用いることができる。
分解剤（Ｅ）溶液中の分解剤（Ｅ）の濃度は、使用する分解剤（Ｅ）の種類及び細胞培養用基材を構成する架橋物（Ｃ）に用いられている多糖（Ａ）の種類により適宜選択されるが、細胞毒性及び細胞培養用基材の分解性の観点から、分解剤（Ｅ）溶液の重量を基準として、０．１〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１重量％である。

【0119】

細胞の生産方法として、好ましい具体例を以下に示す。
（１）一般的な細胞培養による細胞の生産方法
接着性細胞（Ｘ−１）を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤（Ｅ）を用いて細胞培養基材から細胞を回収する。
（２）細胞シートの培養
接着性細胞（Ｘ−１）を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。細胞がコンフルエントになった後、分解剤（Ｅ）を用いて細胞培養基材から細胞シートを回収する。
（３）細胞構成物の培養
接着性細胞（Ｘ−１）を、望ましい構造に成形した上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤（Ｅ）により細胞培養基材を除去し、細胞構成物を得る。

【0120】

本発明の細胞培養用キットは、上記細胞培養用基材及び上記分解剤（Ｅ）を含むものである。
細胞培養用基材及び分解剤（Ｅ）として好ましいものは、上記と同様である。
また、分解剤（Ｅ）は上記分解剤（Ｅ）溶液としてキットに含まれていてもよい。

【実施例】

【0121】

以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、％は重量％を意味する。

【0122】

＜実施例１＞
撹拌装置を備えた容器に水８００部を入れ、ＣＭＣ（第一工業製薬（株）、「セロゲン Ｆ−ＳＣ」）を１００部、撹拌（５０ｒｐｍ）しながらダマにならないように徐々に添加し、ＣＭＣ溶解液を得た。その後、架橋剤（Ｂ）としてエポキシ基を有する化合物であるエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス（株）、「デナコールＥＸ−８１０」）１００部を撹拌しながら添加した。
得られた溶液を直径７０ｍｍの円形ガラス板上スピンコーター（（株）井元製作所製、「スピンコーター７０９４」）を用いて塗布し、１００℃の乾燥機で架橋反応を進行させながら３時間乾燥させ、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（１）を得た。得られた基材（１）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁸Ｐａであった。

【0123】

＜実施例２＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「６７部」とする以外は、実施例１と同様にして、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（２）を得た。得られた基材（２）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁶Ｐａであった。

【0124】

＜実施例３＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「５０部」とする以外は、実施例１と同様にして、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（３）を得た。得られた基材（３）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１０⁴Ｐａであった。

【0125】

＜実施例４＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、細胞接着性ペプチド（Ｄ）であるプロネクチンＦ（配列番号（８２）の配列を有するＭｗ約１１万のポリペプチド、三洋化成工業（株）製）を０．００１重量％含有するＰｒｏｎｅｃｔｉｎＦ溶液（３７℃）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりＰｒｏｎｅｃｔｉｎＦを表面に修飾した細胞培養用基材（４）を得た。

【0126】

＜実施例５＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、フィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を０．００１重量％含有するフィブロネクチン溶液（３７℃）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりフィブロネクチンを表面に修飾した細胞培養用基材（５）を得た。

【0127】

＜実施例６＞
実施例２で得られた細胞培養用基材（２）を、コラーゲン（新田ゼラチン（株）製、「Ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ−Ａ」）を０．３重量％含有するコラーゲン溶液（３７℃、ｐＨ３）中に２時間浸漬し、物理的吸着によりコラーゲンを表面に修飾した細胞培養用基材（６）を得た。

【0128】

＜比較例１＞
架橋剤（Ｂ）を加えない以外は、実施例１と同様にして含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の比較用の細胞培養用基材（１’）を得た。得られた基材（１’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は８００Ｐａであった。

【0129】

＜比較例２＞
架橋剤（Ｂ）の添加量を「１００部」に代えて「２００部」とする以外は、実施例１と同様にして含水率２０重量％の比較用の細胞培養用基材（２’）を得た。得られた基材（２’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は１×１０¹¹Ｐａであった。なお、スピンコーターで成形する前にダマ状になってしまい、シート状に成形することができなかった。

【0130】

＜比較例３＞
細胞培養用９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を比較用の細胞培養用基材（３’）として用いた。

【0131】

＜比較例４＞
撹拌装置を備えた容器に、水８００部を入れ、アルギン酸（和光純薬工業（株）製、「アルギン酸ナトリウム３００〜４００」）を２．４部、撹拌（８００ｒｐｍ）しながらダマにならないように徐々に添加し、アルギン酸溶解液を得た。得られた溶液を直径７０ｍｍの円形ガラス板上スピンコーター（株式会社 井元製作所製、「スピンコーター７０９４」）を用いて塗布し、１Ｍ塩化カルシウム溶液へ３時間浸漬させアルギン酸を架橋した。１Ｍ塩化カルシウム溶液から取り出し、１００℃の乾燥機で１時間乾燥し、含水率２０重量％のシート状（直径７０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ）の細胞培養用基材（４’）を得た。得られた基材（４’）の貯蔵弾性率Ｇ‘は９００Ｐａであった。

【0132】

＜比較例５＞
特開２００１−３２１１５７の記載に準じてセルロースフィルム（Ｗｈａｔｍａｎ社製、「純セルロースペーパー」）にフィブロネクチン（和光純薬工業（株）製、「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ」）を修飾し、比較用の細胞培養用基材（５’）を得た。

【0133】

＜細胞培養用基材の物性評価＞
貯蔵弾性率Ｇ’：ＪＩＳ Ｋ７２４４−１０「プラスチック―動的機械特性の試験方法―第１０部：平行平板振動レオメータによる複素せん断粘度」に準じて、粘弾性測定装置［機器名「ＡＲＥＳ−２４Ａ」、レオメトリック（株）製］を用いて、３７℃での貯蔵弾性率を測定した。
水（３７℃）に対する接触角：ＪＩＳ Ｒ３２５７に準拠して測定した。
表面粗さ（Ｒａ）：市販のカンチレバー及び原子間力顕微鏡［機器名「Ｅ−ｓｗｅｅｐ」、エスアイアイ・ナノテクノロジー（株）製］を用いて表面粗さを測定した。測定範囲を４μｍとして、一定速度（０．３Ｈｚから１．２Ｈｚ）で走査させ、高さ像（立体像）を計測した。ＪＩＳ Ｂ０６０１に定義された方法に準じて、計測結果より表面粗さ（Ｒａ）を算出した。

【0134】

＜細胞毒性の評価：細胞生存率＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。２４時間後、ＤＭＥＭ培地を除去し、分解剤（Ｅ）としてセルラーゼ（エンドラーゼ ５０００Ｌ、ノボザイムズ社製）１００倍希釈液を０．１ｍｌ添加し２時間、３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。２時間後、培養液に生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク（株）製）を１０μｌ／１００μｌとＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）を１００μｌ添加し、１時間後４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ）を測定した。細胞生存率は分解剤（Ｅ）未添加のもの（ブランク）を細胞生存率１００％として算出した。
また、比較例３の細胞培養基材（３）においては、「セルラーゼを０．１ｍｌ」に代えて「トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ製）を０．１ｍｌ」用いる以外は同様にして細胞生存率を評価した。
細胞生存率（％）＝［サンプルの吸光度−ブランクの吸光度］／［未添加の吸光度−ブランクの吸光度］×１００

【0135】

＜細胞培養の評価：接着率＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。
２時間培養後、非接着の細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄して除去した。ＰＢＳを除去後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク（株）製）を１０μｌ／１００μｌとＤＭＥＭ培地（１０重量％ＦＢＳを含有）を１００μｌを添加し、１時間後４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ）を測定した。非接着細胞の除去処理を行わなかったものを１００％として細胞接着率を算出した。

【0136】

＜細胞培養の評価：剥離時間＞
細胞培養用基材（１）〜（６）及び（１’）〜（５’）に３×１０⁵個／ｃｍ²でＶＥＲＯ細胞を播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中で３７℃、５体積％ＣＯ₂、湿潤条件（湿度１００％ＲＨ）で培養した。
２４時間後、細胞培養液に分解剤（Ｅ）としてセルラーゼ（エンドラーゼ ５０００Ｌ、ノボザイムズ社製）１００倍希釈液を添加し、経時的な細胞の剥離具合を確認し、細胞が完全に剥離した時間（分）を計測した。

【0137】

【表1】

【0138】

表１から、貯蔵弾性率Ｇ’が１０００〜１×１０¹⁰Ｐａの範囲内である実施例１〜６の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形しやすいことがわかる。一方、貯蔵弾性率Ｇ’が１０¹¹である比較例２の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形できなかった。
また、実施例１〜６の細胞培養用基材は、細胞生存率及び細胞接着率が極めて高く、分解剤により分解されやすく、細胞の剥離時間が短いことから、細胞培養に極めて適していることがわかる。特に、実施例４〜６の細胞培養用基材の結果から、細胞接着因子を含有することで、細胞接着率を向上させることができることがわかる。一方、比較例１（架橋していないもの）及び４（金属架橋であるもの）の細胞培養用基材では、細胞生存率及び分解性は高いものの、細胞接着性が低く、細胞培養に適していないことがわかる。また、比較例３の細胞剥離にタンパク質分解酵素を使用する必要がある細胞培養用基材では、細胞毒性が高く、細胞生存率が低いことがわかる。また、比較例５（セルロース）の細胞培養用基材は、貯蔵弾性率が５×１０¹⁰と高すぎるため、分解剤により分解されにくく、細胞を剥離するのに長時間かかることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0139】

本発明の細胞培養用基材は、優れた細胞生存率及び細胞接着性を発揮し、短時間で細胞を剥離することがでるので、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]