特許 6916188 プロトプラストからの全植物体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6916188

(24)【登録日】2021年7月19日

(45)【発行日】2021年8月11日

(54)【発明の名称】プロトプラストからの全植物体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20210729BHJP

   A01H 6/14 20180101ALI20210729BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210729BHJP

【ＦＩ】

   A01H5/00 AZNA

   A01H6/14

   !C12N15/09 110

【請求項の数】13

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2018-538510(P2018-538510)

(86)(22)【出願日】2016年10月6日

(65)【公表番号】特表2018-530350(P2018-530350A)

(43)【公表日】2018年10月18日

(86)【国際出願番号】KR2016011217

(87)【国際公開番号】WO2017061806

(87)【国際公開日】20170413

【審査請求日】2018年6月5日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0140314

(32)【優先日】2015年10月6日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515312760

【氏名又は名称】インスティチュート フォー ベーシック サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】513246872

【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(73)【特許権者】

【識別番号】518120005

【氏名又は名称】エーアイシーティー

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】キム ジンス

(72)【発明者】

【氏名】キム ジョンウン

(72)【発明者】

【氏名】チェ ソンファ

(72)【発明者】

【氏名】ウ ジェウク

(72)【発明者】

【氏名】クォン スンイル

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１９９３５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００１３４３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Annu. Rev. Plant Biol.，２０１３年，vol.64，p.327-350

【文献】 Plant Methods，２０１３年，vol.9, no.1，article:39

【文献】 J. Integr. Plant Biol.，２０１１年，vol.53, no.6，p.455-468

【文献】 佐賀大学農学部彙報，１９８９年，67号，p.109-118

【文献】 育種學雑誌，１９８８年，vol.38(別冊2)，p.52-53

【文献】 Genetics，２０１３年，vol.195，p.1177-1180

【文献】 Genome Res.，２０１４年，vol.24，p.1012-1019

【文献】 Phytochemistry，２００４年，vol.65，p.801-811

【文献】 光合成研究，２００８年，vol.18，p.16-23

【文献】 化学と生物，１９９９年，vol.37，p.128-134

【文献】 Mol. Cells，２０１４年，vol.37，p.833-840

【文献】 Nature Biotechnology，２０１５年１０月，vol.33，p.1162-1165

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

予め組み立てられたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を導入することにより、植物プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）の一つ以上の内在的遺伝子をノックアウトする段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法であって、前記ガイドＲＮＡはＰＨＹＢ、ＢＲＩ１またはＢＩＮ２に特異的に結合し、前記ガイドＲＮＡは、配列番号８５、８９、９０、または９１の配列を含む、前記方法。

【請求項2】

前記ガイドＲＮＡはベクターにコードされており、前記ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチド（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を認識する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）に接続されている、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の微生物由来のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ストレプトコッカス属の微生物はストレプトコッカスピヨジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記植物プロトプラストはレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）由来のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記導入は、微細注入法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、ナノパーティクル−媒介性形質導入、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、およびＰＥＧ−媒介形質導入からなる群から選択される方法で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを再生させる段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記再生させる段階は、１つ以上の遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを、アガロースを含む培地中で培養してカルス（ｃａｌｌｕｓ）を形成させる段階、及び前記カルスを再生培地で培養する段階を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって調製されたゲノム編集された植物プロトプラストから再生された植物。

【請求項12】

植物プロトプラストのＰＨＹＢ、ＢＲＩ１またはＢＩＮ２遺伝子をノックアウトする段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法に用いるための組成物であって、予め組み立てられたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含有し、前記ガイドＲＮＡは、ＰＨＹＢ、ＢＲＩ１またはＢＩＮ２遺伝子に特異的に結合し、前記ガイドＲＮＡは、配列番号８５、８９、９０、または９１の配列を含む、前記組成物。

【請求項13】

植物細胞で標的変異（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導する、請求項１２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、植物プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）から１つ以上の植物の内在的遺伝子をノックアウトまたはノックインさせる段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法、及び前記方法で製造された遺伝体が編集された植物プロトプラストから再生された植物体にに関するものである。

【背景技術】

【0002】

ＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）とＲＧＥＮｓ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）などの人工ヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は細菌、藻類などのＣＲＩＳＰＲＣａｓ（ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ、ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔ−ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）獲得免疫システムから目的に合わせて作られた、様々な植物種から由来した細胞および有機体の誘電体校正に使用されており、生物医薬研究、医薬品、バイオテクノロジーの分野で新規な活用方法として認識されている（Ｋｉｍ、Ｈ． ｅｔｃ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２０１４、１５：３２１−３３４）。

【0003】

上述した人工ヌクレアーゼの中でも、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮｓは最近開発されたものであり、プログラミングの容易さのためにＺＦＮｓ、ＴＡＬＥＮｓを急速に置き換えられている。ストレプトコッカスピヨジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から由来したＣａｓ９タンパク質とガイド−ＲＮＡｓ（ｇＲＮＡｓ）で構成されたＲＧＥＮｓは、ＲＮＡの構成要素だけ交換するように設計されて、新しいＴＡＬＥＮｓとＺＦＮｓの製造に必要な労働集約的で、多くの時間かかるタンパク質工学を必要しなくなった。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはニュークラアゼをコードするプラスミドの形質導入を介して植物細胞に伝達される人工ヌクレアーゼは、序列依存的な方法で染色体標的の位置を切断して、位置−特異的ＤＮＡの二重−らせん切断（ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ； ＤＳＢｓ）を生成する。これらの内在システムを通じたＤＳＢｓの修理は標的化遺伝体校正に使用することができる。

【0004】

遺伝体編集植物がヨーロッパとその他の国でＧＭＯ（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ）に規定されて規制されるかどうかは、現在までに不明確な状態である（Ｊｏｎｅｓ、Ｈ．Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｌａｎｔｓ、２０１５、１：１４０１１）。人工ヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、遺伝体の標的位置から自然に発生する変異と区別することができない小さな規模の挿入と結実（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ、ｉｎｄｅｌ）、または置換を誘導する。このような遺伝体校正植物はいくつかの国でＧＭＯと規定されることがあり、植物バイオテクノロジーと農業分野での人工ヌクレアーゼの使用を制限する。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用している場合は、これにより、製造された遺伝体校正植物は、遺伝体上に人工ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む外来ＤＮＡ配列を持つようになる。これらのアグロバクテリウム由来ＤＮＡ配列を育種を介して除去することはブドウ、ジャガイモとバナナのような無性生殖をする植物では不可能である。

【0005】

代わりに、人工ヌクレアーゼをコーディングする非 − 挿入性プラスミドは、プロトプラストのような植物細胞に形質導入させることができる。しかし、本発明者らは、ヒト細胞で見られたように、形質導入されたプラスミドが細胞内で内因性ヌクレアーゼによって分解され、そこから生成された小さなＤＮＡ断片がＣａｓ９の標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）および非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）の位置に挿入されることができるという事実に注目した（Ｋｉｍ、Ｓ、ｅｔｃ．、Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４、２４：１０１２−１０１９）。

【0006】

Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡをコーディングするプラスミドを植物細胞に導入する方法に比べて、予め組み立てられたＣａｓ９タンパク質−ｇＲＮＡ ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を利用する場合、宿主細胞の遺伝体に組換えＤＮＡを挿入する可能性を減らすことができる。さらに、ヒト細胞で確認されたように、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）ＲＮＰは形質導入後すぐに染色体標的の位置を切断し、細胞内で内因的タンパク質分解酵素によって急速に分解されるので、再生された植物体でモザイク現象（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）および非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）の可能性を減少させることができる。予め組み立てられたＲＧＥＮ ＲＮＰは、事前コドン最適化プロセスと各植物種からＣａｓ９とｇＲＮＡを発現させるためのプロモーターがなくても広範囲の植物種に使用することができる。さらに、ＲＧＥＮ ＲＮＰは高度の活性を有するｇＲＮＡを試験管内で予めにスクリーニングすることができ、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を介して変異クローンの遺伝形質を確認することができる。私たちが知っている限りでは、ＲＧＥＮ ＲＮＰｓはどのような植物種でも使用されたことがない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の一つの目的は、植物プロトプラストから１つ以上の植物の内在的遺伝子をノックアウトまたはノックインさせる段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法を提供すことである。

【0008】

本発明の他の一つの目的は、植物プロトプラストから植物体を製造する上記の方法で製造された、遺伝体が編集された植物プロトプラストから再生された植物体を提供することである。

【0009】

本発明の他の一つの目的は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；とＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物細胞でＢＩＮ２遺伝子をコードするＤＮＡを切断するための組成物を提供することである。

【0010】

本発明の他の一つの目的は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；とＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物プロトプラストから植物体を製造するための組成物を提供することである。

【0011】

本発明の他の一つの目的は、植物プロトプラストから植物体を製造する組成物を含んでいる、植物プロトプラストから植物体を製造するキットを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは精製されたＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡｓを、様々な植物プロトプラストに形質導入し、上記プロトプラストから再生された植物体で標的化された変異の発生頻度は、最大４６％であることを確認した。また、プロトプラストにＣａｓ９リボヌクレオシドタンパク質を伝達することは宿主ゲノムに外来ＤＮＡが挿入される可能性を避けることができた。前記再生された植物体は、自然に生じた変異とは区別されない、生殖細胞系列に伝達可能な小さな導入または削除を標的化された場所から持っていた。これは、本発明の方法は、アグロバクテリウムまたはプラスミドを使用する方法に関する調節要件を必要としないことを示唆しているものである。

【発明の効果】

【0013】

本発明では、ＲＧＥＮ ＲＮＰｓは、様々な植物種に由来した植物プロトプラストに伝達されることができ、また、上記プロトプラストから再生された植物体で標的化されたゲノム変異を誘導することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】様々な植物のプロトプラストでＲＧＥＮ ＲＮＰ−媒介遺伝子ノックアウトを確認したものである。（ａ）Ｔ７Ｅ１アッセイおよび標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で測定された変異の頻度、（ｂ）植物細胞でＲＧＥＮ ＲＮＰによって誘導された変異ＤＮＡ配列。ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列は、赤で表示し、挿入されたヌクレオチドは、青色で表示した。ＷＴ、野生型。（ｃ）シロイヌナズナプロトプラストで誘電体校正の時間経過に伴う分析。（上部）Ｔ７Ｅ１分析。（下段）野生型（ＷＴ）と変異配列のＤＮＡ配列。

【図2】大規模な集団でＲＧＥＮ ＲＮＰ−媒介遺伝子ノックアウトを確認したものである。（ａ）ＢＩＮ２遺伝子の標的配列。ＰＡＭ配列は赤で表示した。（ｂ）大規模な集団でＴ７Ｅ１分析と標的化ディープシーケンシングを介して測定した変異の頻度。（ｃ）植物細胞でＣａｓ９タンパク質 − ガイドＲＮＡ ＲＮＰに誘導された変異ＤＮＡ配列。ＰＡＭ配列は赤で表示し、挿入されたヌクレオチドは、青色で表示した。ＷＴ、野生型。

【図3】ＲＮＡ ＲＮＰで処理した単一のプロトプラスト由来のマイクロカリ（ｍｉｃｒｏｃａｌｌｉ）の遺伝型を分析した結果である。（ａ）マイクロカリの遺伝子型。（上部）ＲＧＥＮ ＲＦＬＰ分析、（下段）マイクロカリで変異ＤＮＡ配列。（ｂ）Ｔ０世代でＢＩＮ２遺伝子の遺伝子型変異をまとめた表。

【図4】レタスで、ＲＮＡ ＲＮＰを利用した標的遺伝子の削除を示す。（ａ）ＢＩＮ２遺伝子の標的配列。ＰＡＭ配列は赤で表示した。（ｂ）マイクロカリの遺伝子型。（上部）ＲＧＥＮ ＲＦＬＰ分析、（下段）マイクロカリで変異ＤＮＡ配列。（ｃ）ＲＮＡ ＲＮＰ−形質導入されたプロトプラストから再生された植物体。

【図5】非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）効果を分析したものである。ＰＨＹＢとＢＲＩ１遺伝子−特異的ｓｇＲＮＡｓのターゲットと潜在比較的位置で変異の頻度を標的化ディープシーケンシングで測定した。インデル頻度（ｉｎｄｅｌ ｒａｔｅ）を計算するために位置当たり弱〜８０，０００組の末端の断片（ｒｅａｄｓ）を獲得した。

【図6】ＬｓＢＩＮ２の部分ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対するものである。下線とボックスに表示された文字は、それぞれプライマーとｓｇＲＮＡに対応する配列を示す。

【図7】ＲＮＡ ＲＮＰ−媒介形質導入されたレタスのプロトプラストから植物体の再生過程を示すものである。ＲＮＡ ＲＮＰ−媒介形質導入されたレタスのプロトプラストからプロトプラスト分裂、カルス形成およびシュート（ｓｈｏｏｔ）の再生過程を示す。（ａ）プロトプラスト培養５日後、細胞分裂（スケールバー＝ １００μm）。（ｂ）プロトプラストの多細胞コロニー（スケールバー＝ １００μm）。（ｃ）プロトプラスト培養４週間後アガロースにちりばめられたコロニー。（ｄ）プロトプラスト−由来コロニーからカルス形成。（ｅ、ｆ）プロトプラスト−由来カルスからの器官形成、再生された芽（スケールバー＝ ５μm）。

【図8】変異カルスの標的化ディープシーケンシング結果に関するものである。変異カルスの遺伝型は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで確認した。各アレルの配列及びシーケンスの断片の数を分析した。（Ａ１）、アレル１．（Ａ２）、アレル２。

【図9】ＲＮＡ ＲＮＰ−媒介形質導入されたレタスのプロトプラストから植物体の再生を示す。（ａ−ｃ）プロトプラスト−由来カルスからの器官および芽の形成を示す。；野生型（ＷＴ）（＃２８）は、両アレル（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）／異形接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）（＃２４）は、両アレル／同型接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）（＃３０）。（ｄ）インビトロ芽分裂と開発。（ｅ）ＰＧＲ−フリーＭＳ培地でシュートの伸長と成長。（ｆ）身長されたシュートから根の誘導。（ｇ）苗（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）の適応。（ｈ、ｉ）再生された植物体。

【図10】ＢＩＮ２変異アレル（ａｌｌｅｌｅｓ）の生殖細胞伝達に関するものである。（ａ）再生された植物体の抽臺と開花。（ｂ）Ｔ０−１２と名付けた同型接合体両アレル変異から来した種子のＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析のための遺伝型。（ｃ）野生型、Ｔ０−１変異、およびＴ０−１２ラインから由来したＴ１の変異のＤＮＡ配列。赤い三角形は、挿入されたヌクレオチドを指す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の一つの様態として、植物プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）から１つ以上の植物の内在的遺伝子をノックアウトまたはノックインさせる段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法を提供する。

【0016】

一つの実施例において、上記植物の内在的遺伝子は、遺伝子のノックアウトまたはノックインによりストレス抵抗性を増加させる遺伝子であり得る。

【0017】

もう一つの実施例において、上記植物の内在的遺伝子は、植物のブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ）シグナル伝達に関与する遺伝子であり得る。

【0018】

もう一つの実施例において、（ｉ）上記ノックアウトの段階において、内在的遺伝子はＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上のものであり、（ｉＩ）上記ノックインの段階において、内在的遺伝子は、ＢＲＩ１遺伝子、ＢＳＵ遺伝子、ＢＺＲ１遺伝子、ＤＷＦ４遺伝子、ＣＹＰ８５Ａ１、およびこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上であり得る。

【0019】

もう一つの実施例において、上記の遺伝子のノックアウトはＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子のアレルのいずれか一つまたは二つをノックアウトすることができる。

【0020】

もう一つの実施例において、上記の遺伝子のノックアウトは、遺伝子ノックアウト（ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）を介して実行されるものであり、上記の遺伝子のノックインは、遺伝子ノックイン（ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）を介して実行されることができる。

【0021】

もう一つの実施例において、上記の遺伝子ノックアウトはＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子に特異的な人工ヌクレアーゼ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して実行することができる。

【0022】

もう一つの実施例において、上記の人工ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡガイド人工ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）からなる群から選択することができる。

【0023】

もう一つの実施例において、上記のＲＧＥＮはＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の特定配列に特異的に結合するガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含んでいるものであり得る。

【0024】

もう一つの実施例において、上記の遺伝子のノックアウトはＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の特定配列に特異的に結合するガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を植物プロトプラストに導入して実行することができる。

【0025】

もう一つの実施例において、上記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態であり得る。

【0026】

もう一つの実施例において、上記単一鎖ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの部分を含むことができる。

【0027】

もう一つの実施例において、上記単一鎖ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態であり得る。

【0028】

もう一つの実施例において、上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターにコードされており、上記ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターであることができる。

【0029】

もう一つの実施例において、上記のＣａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質またはそれらの変異体であることができる。

【0030】

もう一つの実施例において、上記のＣａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチド（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を認識することができる。

【0031】

もう一つの実施例において、上記のＣａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）に接続されていることができる。

【0032】

もう一つの実施例において、上記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基が他のアミノ酸に置換されたＣａｓ９の変異形であることができる。

【0033】

もう一つの実施例において、上記のアミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であることができる。

【0034】

もう一つの実施例において、上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質は、ストレプトコッカス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来であることができる。

【0035】

もう一つの実施例において、上記ストレプトコッカス属はストレプトコッカスピヨジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であることができる。

【0036】

もう一つの実施例において、上記植物プロトプラストはレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）由来であることができる。

【0037】

もう一つの実施例において、上記の導入はＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質、及び前記ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを植物プロトプラストに同時形質導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）または連続形質導入（ｓｅｒｉａｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）することができる。

【0038】

もう一つの実施例において、上記連続形質導入はＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を、まず形質導入し、ネイキッドガイドＲＮＡ（ｎａｋｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を二番目に形質導入して行うことができる。

【0039】

もう一つの実施例において、上記の導入は、微細注入法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、ナノパーティクル媒介形質導入、タンパク質伝達ドメイン媒介形質導入、ウイルス−媒介遺伝子伝達、およびＰＥＧ−媒介形質導入で構成された群から選択された方法で行うことができる。

【0040】

もう一つの実施例において、上記方法は、遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを再生させる段階をさらに含むことができる。

【0041】

もう一つの実施例において、前記再生させる段階は、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを、アガロースを含む培地で培養させてカルス（ｃａｌｌｕｓ）を形成させる段階、及び前記カルスを再生培地で培養する段階を含むことができる。

【0042】

本発明の他の一つの様態として、上記の方法によって製造された誘電体が編集された植物プロトプラストから再生された植物体を提供する。

【0043】

本発明のもう一つの様態として、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物細胞でＢＩＮ２遺伝子をコードするＤＮＡを切断するための組成物を提供する。

【0044】

別の実施例において、前記組成物は、植物細胞で標的変異（ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導することができる。

【0045】

本発明のもう一つの様態として、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは上記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物プロトプラストから植物体を製造するための組成物を提供する。

【0046】

本発明のもう一つの様態として、前記組成物を含む、植物プロトプラストから植物体を製造するためのキットを提供する。
[発明を実施するための形態]

【0047】

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0048】

方法

【0049】

Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡｓ。
核位置信号が接続されてＣａｓ９タンパク質はＴｏｏｌＧｅｎ、Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）から購入した。Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（表１−４）を使用したオリゴ−延長（ｏｌｉｇｏ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を介してガイドＲＮＡ転写の鋳型を製造した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したラン−オフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）反応でガイドＲＮＡｓを試験管内で転写した。反応混合物は、１Ｘ ＤＮａｓｅ Ｉ反応バッファーに含まれているＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。転写されたｓｇＲＮＡｓの品質を評価するためにＳＹＢＲ ｇｏｌｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）された８％変性尿素−ポリアクリルアミドゲル（ｕｒｅａ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌ ａｍｉｄｅ ｇｅｌ）でｓｇＲＮＡｓを確認した。転写されたｓｇＲＮＡｓをＭＧ^ＴＭ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＳＶ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）で精製し、分光光度計でｓｇＲＮＡｓの量を測定した。

【0050】

【表1】

【0051】

【表2】

【0052】

【表3】

【0053】

【表4】

【0054】

プロトプラスト培養。既存の公知の方法に基づいてシロイヌナズナ、イネ、およびレタスからプロトプラストを分離した。まず、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０、稲（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｃｖ。ドンジン、およびレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｃｖ。チョンチマの種子を７０％エタノール、０．４％次亜塩素酸（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ）溶液で１５分間滅菌した後、蒸留水で３回洗浄し、２％スクロースを含有する１／２Ｘ ＭＳ固形培地で培養した。培養は、成長室で１６時間明条件（１５０μｍｏｌ／ｍ^２ｓ）、８時間暗条件で２５℃で行った。プロトプラストを分離するために、１４日目になるシロイヌナズナの苗（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）、１４日目になる稲の苗由来幹と葉、７日目になるレタス苗の子葉を暗条件で２５℃で１２時間酵素溶液（１．０％セルラーゼＲ１０、０．５％マセロザイム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）Ｒ１０、０．４５Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＭＥＳ［ｐＨ ５．７］、ＣＰＷ溶液）と一緒に４０ｒｐｍで攪拌しながらインキュベーションして分解し、同量のＷ５溶液で希釈した。上記混合物を濾過し、丸底チューブで１００ｇで５分間遠心分離してプロトプラストを回収した。再懸濁されたプロトプラストをＣＰＷ ２１Ｓ溶液（２１％［ｗ／ｖ］スクロース含有ＣＰＷ液、ｐＨ５．８）に浮かべ精製し、８０ｇで７分間遠心分離した。精製されたプロトプラストをＷ５溶液で洗浄した後、７０ｇで５分間遠心分離してペレットを形成した。最後に、プロトプラストをＷ５溶液に再懸濁して、ヘマサイトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して顕微鏡で数を数えた。プロトプラストを１ｘ１０^６プロトプラスト／１ｍｌ ＭＭＧ溶液（０．４Ｍマンニトールおよび１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４ｍＭ ＭＥＳ［ｐＨ５．７］）の密度に希釈した。

【0055】

プロトプラスト形質導入。従来の方法に基づいてＰＥＧ−媒介ＲＮＰ形質導入を行った。ＲＮＰ複合体を利用したＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を誘導するために、１ｘ１０^５個のプロトプラスト細胞をインビトロ転写されたｓｇＲＮＡ（２０−１２０μg）と事前に混合されたＣａｓ９タンパク質（１０−６０μg）で形質導入した。形質導入を行う前に、保存溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロール）に含まれているＣａｓ９を１Ｘ ＮＥＢバッファー３に含まれているｓｇＲＮＡと混合し、室温で１０分間インキュベーションした。上記１ｘ１０^５個（またはレタスの場合は、５ｘ１０^５個）のプロトプラスト混合物を２００μlＭＭＧ溶液に再懸濁させ、５−２０μlＲＮＰ複合体と２１０μlの新た製造したＰＥＧ溶液（４０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ４０００；Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．９５９０４、０．２Ｍマンニトールと０．１Ｍ ＣａＣｌ_２）を慎重に混合した後、暗条件の２５℃で１０分間インキュベーションした。次に、９５０μlのＷ５溶液（２ｍＭ ＭＥＳ［ｐＨ５．７］、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭＣａＣｌ_２および５ｍＭ ＫＣｌ）をゆっくりと添加して、慎重に混合した。１００ｇで３分間遠心分離してプロトプラストペレットを得ており、これをＷ１溶液（０．５Ｍマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、および４ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．７）１ｍｌに再懸濁させた。以後、プロトプラストをマルチ−ウェルに移し、暗条件の２５℃で２４−４８時間インキュベーションした。上記細胞は、形質導入の一日後に分析した。

【0056】

プロトプラスト再生。ＲＮＰで形質浸透させたプロトプラストを３７５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１８．３５ｍｇ／Ｌ ＮａＦｅ−ＥＤＴＡ、２７０ｍｇ／Ｌ ナトリウムソクシネイト（ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１０３ｇ／Ｌ スクロース、０．２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．３ｍｇ／Ｌ ６−ＢＡＰ（ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）、および０．１ｇ／ＬのＭＥＳを含有する１／２Ｘ Ｂ５培地に再懸濁させた。その次のプロトプラストを１／２Ｘ Ｂ５培地と２．４％アガロースの１：１溶液と一緒に混合して、２．５Ｘ１０^５プロトプラスト／ｍｌの密度で培養した。アガロースに囲まれたプロトプラストを６ウェルプレートに移し、２ｍｌの１／２Ｘ Ｂ５培地で２５℃の暗条件で培養した。７日後、上記培地を新しい培地に交換し、２５℃の明条件（１６時間明［３０μｍｏｌ／ｍ^２ｓ］と８時間暗条件）で培養した。培養３週間後、マイクロカリを直径数ｍｍまで育て、３０ｇ／Ｌ スクロース、０．６％ プラントアガ、０．１ｍｇ／Ｌ α−ＮＡＡ（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、０．５ｍｇ／Ｌ ＢＡＰを含有するＭＳ再生培地で移し培養した。再生培地で約４週間経過後、多数のレタス芽（ｓｈｏｏｔ）が誘導されたことを確認した。

【0057】

レタスの根誘導と土壌からの成長。植物体を再生するために、分裂と伸長された芽を新鮮な再生培地に移した後、２５℃の明条件（１６時間人［３０μｍｏｌ／ｍ２ｓ］と８時間暗条件）で培養した。根誘導のために、約３−５ｃｍの長さの苗（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）を摘出してマゼンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）容器に入れられた固体ホルモン−フリー１／２Ｘ培地に移した。芽から由来した苗を土壌に移植し、２５℃の成長チャンバー（１００−１５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１の白色蛍光灯の下で６時間の光州期条件）に維持して、新しい環境に順応させた。

【0058】

Ｔ７Ｅ１分析。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロトプラストまたはカルスから誘電体ＤＮＡを分離した。標的ＤＮＡ領域を増幅させてＴ７Ｅ１分析を行った。具体的には、ＰＣＲ産物を９５℃で変性させ、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）を用いて常温まで温度をゆっくりと下げた。アニールされたＰＣＲ産物を３７℃で２０分間Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＴｏｏｌＧｅｎ、Ｉｎｃ．）とインキュベーションし、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。

【0059】

ＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析。従来の方法に基づいてＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析を行った。１Ｘ ＮＥＢ緩衝液３でＰＣＲ産物（３００−４００ｎｇ）とＣａｓ９タンパク質（１μg）とｓｇＲＮＡ（７５０ｎｇ）を反応体積１０μlで、３７℃で６０分間インキュベーションした。その後、前記反応混合物にＲＮａｓｅ Ａ（４μg）を添加し、３７℃で３０分間インキュベーションしてｓｇＲＮＡを除去した。その次の６Ｘ停止溶液（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、および２５０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して反応を停止させた。２．５％アガロースゲルを用いてＤＮＡ産物を電気泳動した。

【0060】

標的化ディープシーケンシング。遺伝体ＤＮＡから標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）を増幅させた。インデックスとシーケンスアダプターを追加のＰＣＲを介して付加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（ｖ２、３００−ｃｙｃｌｅ）を利用して、高スループットシーケンシング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

【0061】

結果

【0062】

前に組み立てられたＲＮＰを形成するために、三つの植物種から４つの遺伝子を標的するｇＲＮＡの１０倍モル過剰の精製されたＣａｓ９タンパク質とインビトロで混合した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が存在する条件では、ＲＧＥＮ ＲＮＰｓを、シロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）、野生型タバコ（Ｎ． ａｔｔｅｎｕａｔｅ）と稲（Ｏ． ｓａｔｉｖａ）に由来したプロトプラストとインキュベーションした。形質導入細胞の変異頻度を測定するためにＴ７Ｅ１分析と標的化ディープシーケンシングを使用した（図１ａ、ｂ）。インデル（ｉｎｄｅｌｓ）は予想された位置、すなわち、ＰＡＭ（ＮＧＧ ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）の３ヌクレオチド（ｎｔ）上流から８．４〜４４％の範囲の頻度で検出された。

【0063】

ヒト細胞から確認したように、同時に生じた二つのＤＳＢｓを編集することが挿入された配列の標的化結実を生じさせることができるかどうかを調査しようと、シロイヌナズナの他の遺伝子から２０１ｂｐｓで分離されたところを目標する二つのｇＲＮＡを同時形質導入した。サンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果を使用して、プロトプラストで２２３ｂｐのＤＮＡ配列が結実されることを確認した（図１ｃ）。ＲＧＥＮ−媒介変化は、形質導入２４時間後に観察された。これにより、ＲＧＥＮｓは形質導入後すぐに標的位置を切断し、細胞分裂の全体サイクルの前に変異を誘導することが確認された。

【0064】

次に、本発明者らはＲＧＥＮ ＲＮＰｓが標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）と高い相同性を有する位置での非標的（ｏｆｆｔａｒｇｅｔ）の変異を誘導するかどうか分析した。シロイヌナズナの遺伝体でピトクロムＢ（ＰＨＹＴＯＣＨＲＯＭＥ Ｂ； ＰＨＹＢ）とブラシノステロイド感受性１（ＢＲＡＳＳＩＮＯＳＴＥＲＯＩＤ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ １； ＢＲＩ１）遺伝子特異的なｓｇＲＮＡｓの潜在的な非標的の位置を調査し、変異の頻度を測定するためにＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒプログラムと標的化ディープシーケンシングを使用した（図５）。２〜５ヌクレオチドによる標的位置とは異なってインデルはどの位置でも発見されなかったが、これはヒトの細胞に対する本発明者の既存の研究内容と一致することを確認した。

【0065】

本発明者らは、ブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ； ＢＲ）シグナル伝達経路の負のレギュレータをコードするＢＩＮ２（ＢＲＡＳＳＩＮＯＳＴＥＲＯＩＤ ＩＮＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ２）遺伝子をノックアウトするために、ＲＧＥＮ標的位置（配列番号９３）を設計した（図２ａ）。ＰＥＧが存在する条件でＲＧＥＮ ＲＮＰを形質導入し、ＲＧＥＮによって誘導された標的遺伝子の変異の効率を測定するために、Ｔ７Ｅ１分析および標的化ディープシーケンシングを用いた。インデルは予想された位置、すなわち、ＰＡＭ（ＮＧＧ ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）の３ｎｔ上流で検出され、Ｔ７Ｅ１分析時８．３〜１１％（平均９．０％）の範囲の変化率とＮＧＳ解析時３．２〜５．７％（平均４．３％）の範囲の変化率を示した（図２ｂ、ｃ）。

【0066】

本発明者らは、上記ＲＧＥＮ−ＲＮＰを処理したレタスのプロトプラストからＢＩＮ２変異アレルを持つ植物体を製造した。その結果、上記プロトプラストのごく一部（＜０．５％）だけがカルスを経て完全な植物体に培養されることを確認した。これらのなか、３５個のプロトプラストのラインに対して追加的な分析を行った（図３）。具体的には、本発明者らは、レタス、マイクロカリの遺伝子型についてＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析と標的化ディープシーケンシングを行った。ＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析は、ヘテロ接合両アレル（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）変異クローン（非切断）と単一アレル変異クローン（５０％カット）を区別することができたし、野生型クローン（１００％切断）と同型接合両アレル（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）変異クローン（非切断）を区別することができた。分析の結果、上記の３５個の中２個のカルス（５．７％）の標的位置が、単一アレル変異であり、１４個のカルス４０％の標的位置が両アレル変異であることを確認した。これにより、再生されたカルスの変化頻度は４２．９％（＝３０変異アレル／７０アレル）であり、プロトプラストでの変異頻度よりも１０倍高いことを確認した。上記の結果は、どのような選別過程なしに４３％の頻度で遺伝体編集レタスを得たことで、大規模な集団でのＲＧＥＮ−ＲＮＰを利用した変異頻度を考慮したとき、極めて高い頻度である。上記の結果を通じて、再生過程でＲＧＥＮで誘導される変異が安定的に維持されて蓄積されうことがわかった。

【0067】

ＢＩＮ２遺伝子ノックアウトは、他の形態的な変化を示さなかったが、いくつかの稲からストレス耐性を示した。本発明者らは、ＢＩＮ２遺伝子ノックアウトによるＢＲシグナル伝達の上方調節は、全体的な細胞分裂と成長率を促進し、これはカルスが再生される過程で受けるストレスに対して肯定的な反応を示すことができるような利点を提供することを提案する。

【0068】

最後に、本発明者らはブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ； ＢＲ）シグナル伝達経路の負のレギュレータをコードするシロイヌナズナＢＩＮ２遺伝子のレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）同形体をノックアウトするために、レタスのプロトプラストにＲＧＥＮ ＲＮＰを形質導入し、ＲＮＰ−形質導入された細胞から再生されたマイクロカリを得た（図６）。本発明者らは、レタス、マイクロカリの遺伝型を分析するためにＲＦＬＰ分析で同じＲＧＥＮ ＲＮＰを使用した（図２〜４、および図７）。Ｔ７Ｅ１分析とは異なり、ＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析は、ヘテロ接合両アレル（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）変異クローン（非切断）と単一アレル変異クローン（５０％切断）を区別することができたし、野生型クローン（１００％切断）と同形接合両アレル（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）変異クローン（非切断）を区別することができた。また、ＲＧＥＮ−ＲＦＬＰ分析は、レタス、遺伝体に存在するヌクレアーゼ標的位置の近くで配列ポリモーフィズムによる制限がないことを確認した。分析の結果、上記の３５個のうち２個のカルス（５．７％）の標的位置が、単一アレル変異であり、１４個のカルス（４０％）の標的位置が両アレル変異であることを確認した（図３、図４ｂ）。上記の結果を通じ、ＲＧＥＮ−誘導変異は、再生後も安定的に維持されることがわかった。このとき、再生されたカルスの変に頻度は４６％であった。１６個の変異カルスから遺伝型を確認したい標的化ディープシーケンシングを行った結果、標的位置で欠失または挿入された塩基対の数は−９〜＋１の範囲に存在しており、これはヒト細胞で観察された変異パターンと一致することを確認した。上記クローンにおいてモザイク現象（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）は観察されなかったし（図８）、ＲＧＥＮ ＲＮＰは形質導入後すぐに標的位置を切断し、細胞分裂の前にインデルを誘導することを確認した。

【0069】

以後、本発明者らはＢＩＮ２−特異的ＲＧＥＮがレタス遺伝体で付随的な損傷を誘導かを高スループットシーケンシング（ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を利用して分析した。その結果、９１個の相同の位置での非標的変異は誘導されず、ＢＩＮ２−変異された３つの苗の標的位置から１〜５個のヌクレオチドが相違することを確認し（表５〜８）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮｓによって誘導された非標的変異は、単一−細胞クローンではほとんど検出されないという、ヒト細胞で確認した本発明者らの従来の研究内容と一致することを知ることができた。

【0070】

【表5】

【0071】

【表6】

【0072】

【表7】

【0073】

【表8】

【0074】

続いて、遺伝体編集カルスから植物体が再生され、これは土壌でもよく成長していることを確認した（図４ｃ及び図９）。十分に成長した同型接合両アレル変異体から種子を得た（図１０）。本発明を通じ、ＢＩＮ２−ノックアウトレタスは、向上されたＢＲ信号を示すことを確認した。

【0075】

要約すると、ＲＧＥＮ ＲＮＰｓは、植物プロトプラストに正常に配信され、４つの異なる植物種の６つの遺伝子の標的化誘電体の変化を誘導する。また、ＲＧＥＮ−誘導変化はプロトプラストから再生された植物体で安定的に維持され、生殖細胞に伝達される。このコースでは、組換えＤＮＡが使用されていないので、本発明の遺伝体校正植物体は、現在のＧＭＯ規定に該当しないことがあります。これは、ＲＮＡ−ガイド遺伝体校正は、植物バイオテクノロジーと農業分野で広く活用されることができることを示唆するものである。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
植物プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）の一つ以上の内在的遺伝子をノックアウトまたはノックインする段階を含む、植物プロトプラストから植物体を製造する方法。
[項目２]
前記植物の内在的遺伝子は、前記ノックアウトまたはノックインによりストレス抵抗性を増加させる遺伝子である、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記植物の内在的遺伝子は、植物のブラシノステロイド（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ）シグナル伝達に関与する遺伝子である、項目１に記載の方法。
[項目４]
（ｉ）前記ノックアウトの段階において、内在的遺伝子はＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上であり、
（ｉｉ）前記ノックインの段階において、内在的遺伝子はＢＲＩ１遺伝子、ＢＳＵ遺伝子、ＢＺＲ１遺伝子、ＤＷＦ４遺伝子、ＣＹＰ８５Ａ１、およびこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上である、項目１に記載の方法。
[項目５]
前記遺伝子のノックアウトは、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子のアレルの中いずれか一つまたは二つをノックアウトすることである、項目１に記載の方法。
[項目６]
前記遺伝子のノックアウトは、遺伝子ノックアウトにより実行され、前記遺伝子のノックインは、遺伝子ノックインにより実行される、項目１に記載の方法。
[項目７]
前記遺伝子のノックアウトは、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子に特異的な人工ヌクレアーゼ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して実行される、項目１に記載の方法。
[項目８]
前記人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡガイド人工ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
[項目９]
前記ＲＧＥＮは、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の特定配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、項目８に記載の方法。
[項目１０]
前記遺伝子のノックアウトは、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらの同族体ホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の特定配列に特異的に結合するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を、植物プロトプラストに導入することで実行される、項目１に記載の方法。
[項目１１]
前記ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌ ＲＮＡ）または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態である、項目１０に記載の方法。
[項目１２]
前記単一鎖ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの一部を含む、項目１１に記載の方法。
[項目１３]
前記単一鎖ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態である、項目１０に記載の方法。
[項目１４]
前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡはベクターにコードされており、前記ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはアグロバクテリウムベクターである、項目１０に記載の方法。
[項目１５]
前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質またはその変異体である、項目１０に記載の方法。
[項目１６]
前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチド（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を認識する、項目１０に記載の方法。
[項目１７]
前記Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）に接続されている、項目１０に記載の方法。
[項目１８]
前記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基が他のアミノ酸に置換されたＣａｓ９の変異体である、項目１５に記載の方法。
[項目１９]
前記アミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）である、項目１８に記載の方法。
[項目２０]
前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質は、ストレプトコッカス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のものである、項目１０に記載の方法。
[項目２１]
前記ストレプトコッカス属はストレプトコッカスピヨジェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である、項目２０に記載の方法。
[項目２２]
前記植物プロトプラストはレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）由来のものである、項目１に記載の方法。
[項目２３]
前記導入はＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質、及び前記ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、植物プロトプラストに同時形質導入する（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）または連続形質導入（ｓｅｒｉａｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）するものである、項目１０に記載の方法。
[項目２４]
前記連続形質導入は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を初めに形質導入した後、ネイキッドガイドＲＮＡ（ｎａｋｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を二番目に形質導入することで実行される、項目２３に記載の方法。
[項目２５]
前記導入は、微細注入法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、ナノパーティクル−媒介性形質導入、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、およびＰＥＧ−媒介形質導入からなる群から選択される方法で実行される、項目１０に記載の方法。
[項目２６]
遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを再生させる段階をさらに含む、項目１に記載の方法。
[項目２７]
前記再生させる段階は、ＢＩＮ２遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子、及びこれらのホモログ遺伝子からなる群から選択される１つ以上の遺伝子がノックアウトされた植物プロトプラストを、アガロースを含む培地中で培養してカルス（ｃａｌｌｕｓ）を形成させる段階、及び前記カルスを再生培地で培養する段階を含む、項目２６に記載の方法。
[項目２８]
項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法によって調製されたゲノム編集された植物プロトプラストから再生された植物。
[項目２９]
ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物細胞においてＢＩＮ２遺伝子をコードするＤＮＡを切断するための組成物。
[項目３０]
植物細胞で標的変異（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導する、項目２９に記載の組成物。
[項目３１]
ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ Ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ２）遺伝子、ＢＫＩ１遺伝子またはこれらのホモログをコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ；並びにＣａｓタンパク質をコードする核酸またはＣａｓタンパク質を含む、植物プロトプラストから植物体を製造するための組成物。
[項目３２]
項目２９〜３０のいずれか一項に記載の組成物を含む、植物プロトプラストから植物体を製造するためのキット。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]