特許 6916797 抗体ポリペプチド及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6916797

(24)【登録日】2021年7月20日

(45)【発行日】2021年8月11日

(54)【発明の名称】抗体ポリペプチド及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20210729BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20210729BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210729BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210729BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210729BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210729BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210729BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210729BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210729BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210729BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20210729BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20210729BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210729BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20210729BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20210729BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   C07K16/40

   C07K16/46

   C12N15/13

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 P

   A61K39/395 T

   A61K47/68

   A61K51/10 200

   A61K51/10 100

   A61P13/08

   A61P35/00

   A61P35/04

   G01N33/574 A

【請求項の数】26

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2018-536343(P2018-536343)

(86)(22)【出願日】2016年10月4日

(65)【公表番号】特表2018-531045(P2018-531045A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】EP2016073684

(87)【国際公開番号】WO2017060247

(87)【国際公開日】20170413

【審査請求日】2019年9月30日

(31)【優先権主張番号】1517550.8

(32)【優先日】2015年10月5日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1519105.9

(32)【優先日】2015年10月29日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】514107082

【氏名又は名称】フレダックス・アクチエボラーグ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】アマンダ・トゥイ・トラン

(72)【発明者】

【氏名】アンデシュ・アクセルソン

(72)【発明者】

【氏名】セシーリア・アン−クリスティン・マルムボリ・ハーガー

(72)【発明者】

【氏名】シェル・フェーストレーム

(72)【発明者】

【氏名】スヴェン−エリク・ストランド

(72)【発明者】

【氏名】ウルポ・ユハニ・ラミンメキ

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−００４８９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０９９３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５３０８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Almagro, J. C. et al.，Humanization of antibodies，Front. Biosci.，２００８年，Vol. 13，pp. 1619-1633

【文献】 Evans-Axelsson, S. et al.，Targeting free prostate-specific antigen for in vivo imaging of prostate cancer using a monoclonal antibody specific for unique epitopes accessible on free prostate-specific antigen alone，Cancer Biother. Radiopharm.，２０１２年，Vol. 27(4)，pp. 243-251

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対する結合特異性を有する抗体ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１及び配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）配列番号４及び配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、１つ以上のヒト抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列を含み、前記抗体ポリペプチドが、マウス５Ａ１０抗体と比較して、増強された腫瘍取り込みを呈する、前記抗体ポリペプチド。

【請求項2】

前記抗体ポリペプチドが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる、重鎖可変領域；及び／または
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる、軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項3】

無傷抗体；または
Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）₂断片）、ならびにドメイン抗体（例えば、単一Ｖ_H可変ドメインもしくはＶ_L可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合断片を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項4】

重鎖定常領域またはその一部を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項5】

軽鎖定常領域またはその一部を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項6】

配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる重鎖定常領域、及び／または、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる軽鎖定常領域、を含む、請求項４または５に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項7】

配列番号１２のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる重鎖、及び／または、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなる軽鎖、を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項8】

前記抗体ポリペプチドが、直接的または間接的に治療部分に連結される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項9】

前記治療部分が、１つ以上の放射性同位体を含むか、またはそれからなる細胞傷害性部分である、請求項８に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項10】

前記１つ以上の放射性同位体がそれぞれ独立して、ベータ放射体、オージェ放射体、転換電子放射体、アルファ放射体、及び低光子エネルギー放射体からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項11】

前記１つ以上の放射性同位体がそれぞれ独立して、長距離ベータ放射体（⁹⁰Ｙ、³²Ｐ、¹⁸⁶Ｒｅ／¹⁸⁸Ｒｅ；¹⁶⁶Ｈｏ、⁷⁶Ａｓ／⁷⁷Ａｓ、¹⁵³Ｓｍなど）、中距離ベータ放射体（¹³¹Ｉ、¹⁷⁷Ｌｕ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁶¹Ｔｂなど）、低エネルギーベータ放射体（⁴⁵Ｃａ、³⁵Ｓ、ま
たは¹⁴Ｃなど）、転換またはオージェ放射体（⁵¹Ｃｒ、⁶⁷Ｇａ、⁹⁹Ｔｃ^m、¹¹¹Ｉｎ、¹²³
Ｉ、¹²⁵Ｉ、²⁰¹Ｔｌ、¹³⁵Ｌａなど）、ならびにアルファ放射体（²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²²³Ａｃ、²²⁵Ａｃ、及び²²¹Ａｔなど）からなる群から選択される、請求項１０に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項12】

前記抗体ポリペプチドが、検出可能な部分を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項13】

前記検出可能な部分が、放射性同位体を含むか、またはそれからなる、請求項１２に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項14】

前記放射性同位体が、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、¹²³Ｉ、
及び²⁰¹Ｔｌからなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項15】

前記治療部分及び／または検出可能な部分が、連結部分を介して抗体ポリペプチドに間接的に接合される、請求項８〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチド。

【請求項16】

前記連結部分がキレート剤である、請求項１５に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項17】

前記キレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドセダン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択される、請求項１６に記載の抗体ポリペプチド。

【請求項18】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチドまたはその構成成分ポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子。

【請求項19】

配列番号１４及び／または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。

【請求項20】

請求項１８または１９に記載の核酸分子を含む、組み換え宿主細胞。

【請求項21】

請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項22】

医学において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項23】

前立腺癌の治療及び／または診断において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項24】

治療される前記前立腺癌が、転移性前立腺癌である、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

治療される前記転移性前立腺癌が、リンパ系の転移、骨の転移（脊椎、椎骨、骨盤、肋骨を含む）、骨盤、直腸、膀胱、尿道内の転移である、請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

治療される前記前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は一般に、特に前立腺癌の分野における、治療的及び診断的薬剤ならびに方法の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

前立腺癌は、現在のところ、男性において最も一般的な形態の癌である。前立腺は、精液の構成成分である体液を産生する、男性におけるクルミ程の大きさの腺である。前立腺は、組織の外層によって囲まれた２つ以上の葉または区分を有する。前立腺は、直腸の前かつ膀胱の直下に位置し、尿道を囲む。

【0003】

前立腺癌の発生率は、欧州の北西部分及び米国において最も高い。腫瘍の成長は通常、長期間かけて起こるプロセスである。前立腺癌は通常、軽度の形態の癌である。実際、前立腺癌と診断された大部分の男性は生存かつ回復し、少数の男性が早期段階に転移するより悪性度の高い形態の前立腺癌に遭遇するに過ぎない。この悪性度の高い形態の前立腺癌は、癌が関節外組織に伝播してしまう前に、それが早期段階に診断された場合にのみ治療可能であり得る。

【0004】

今日、前立腺癌の診断及び監視は典型的には、患者の血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の濃度を測定することによって実行される。異なる時点で実行されるいくつかの連続した測定においてＰＳＡの濃度が著しく高い場合、前立腺癌の可能性が存在するという評価となる。この時点で、前立腺癌を検証するために生検が実行され得る。

【0005】

ＰＳＡ（カリクレインＩＩＩとしても知られる）は、前立腺の分泌細胞内で産生される、２３７個のアミノ酸の一本鎖で構成されるタンパク質である。これらの分泌細胞は、前立腺全体において見出すことができる。ＰＳＡは、確立されかつ徹底的に研究された前立腺癌に関するマーカーである。健康な細胞と比較すると、ＰＳＡの産生は悪性細胞においてより低く、過形成性細胞においてより高い。実際、ＰＳＡの濃度が前立腺癌を患う男性からの血液中でより高いということは、むしろ矛盾している。しかしながら、１つの説明は、悪性細胞が変質した細胞構造を有し、それ故にＰＳＡに対してより透過性であることであり得る。

【0006】

前立腺癌の治療のための標的として好適である別の重要なセリンプロテアーゼは、ヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）である。ｈＫ２をコードする遺伝子は、ＰＳＡをコードする遺伝子とともに染色体１９上に位置する。ｈＫ２は、ＰＳＡと同様に主に前立腺組織中で発現される。前立腺において、ＰＳＡは不活性プロ形態として存在し、ｈＫ２のペプチダーゼ作用を通して活性化される。ｈＫ２に関する免疫組織化学的研究は、ｈＫ２が分化のレベルに関連して発現されることを示している。これは、ｈＫ２が低分化の組織（前立腺癌に供されている組織など）中でより高い収率で発現され、高分化の組織（別の一般的な前立腺の問題である前立腺肥大症（ＢＰＨ）に供されている組織など）中でより低い収率で発現されることを意味する。

【0007】

今日の前立腺癌の治療は、手術（例えば、前立腺全摘除術）、放射線療法（塩化ラジウム−２２３投与、密封小線源治療、及び外部照射放射線療法を含む）、高密度焦点式超音波法（ＨＩＦＵ）、化学療法、経口化学療法薬、凍結手術（腫瘍の凍結）、ホルモン療法（抗アンドロゲン療法など）、去勢、または前述のものの組み合わせである。

【0008】

しかしながら、これらの療法のうちのほとんど（手術及び外部放射線療法）は、原発腫瘍及び大型の転移の治療にのみ（または主にそれに）有用である。化学療法は播種性の癌に使用されるが、これらの患者のうちのほとんどにとって、それは対症効果及び／または生存延長である。したがって、他のまたは相補的治療様式は、特に微小転移の場合、播種性悪性疾患のかなりの改善を達成する必要がある。

【0009】

抗体及びそれらの断片などの標的分子を使用する免疫療法または放射免疫療法などの療法は、播種性疾患の治療の可能性をもたらし得る。

【0010】

したがって、前立腺癌を治療及び診断するための新たな治療剤及び方法に対する必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明は、当該技術分野における上記に特定された不足及び不利益のうちの１つ以上を、単独または任意の組み合わせで、軽減、緩和、または除去しようと努力し、添付の特許請求の範囲に従う治療剤及び方法を提供することによって、少なくとも前述の問題を解決する。

【0012】

本発明の第１の態様は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）に対する結合特異性を有する抗体ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１及び配列番号２及び配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
ＣＤＲＨ１： ＴＴＧＭＧＶＳ 配列番号１
ＣＤＲＨ２： ＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＳＴＳＬＫ 配列番号２
ＣＤＲＨ３： ＫＧＹＹＧＹＦＤＹ 配列番号３
ならびに／または
（ｂ）配列番号４及び配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
ＣＤＲＬ１： ＲＡＳＱＮＶＮＴＤＶＡ 配列番号４
ＣＤＲＬ２： ＳＴＳＹＬＱＳ 配列番号５
ＣＤＲＬ３： ＱＱＹＳＮＹＰＬＴ 配列番号６
を含み、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、１つ以上のヒト抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列を含む、抗体ポリペプチドを提供する。

【0013】

上記の６つのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に従って定義される、本発明の抗体ポリペプチドの相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。

【0014】

「抗体ポリペプチド」によって、我々は、無傷抗体分子、一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／または抗体軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、ならびに抗原結合断片及びその誘導体を実質的に含む。

【0015】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、標準的な２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸及び（天然「Ｌ」形態と比較して）「Ｄ」形態のそれらの対応する立体異性体、オメガ−アミノ酸、他の天然に存在するアミノ酸、非定型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸（以下を参照されたい）を含む。

【0016】

「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」などのように、アミノ酸が具体的に列挙されている場合、別段明示的に述べられない限り、この用語は、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指す。ポリペプチドが所望される機能的特性を保持する限り、他の非定型アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの好適な構成成分であり得る。示されるペプチドについて、必要に応じて、各コードされたアミノ酸残基は、従来のアミノ酸の慣用名に対応する１文字の表記によって表される。

【0017】

一実施形態において、本明細書で定義されるポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むか、またはそれからなる。

【0018】

本発明の抗体ポリペプチドは、ＰＳＡ、及び好ましくは成熟活性形態のヒトＰＳＡに対する特異性を呈する。

【0019】

ヒトＰＳＡのアミノ酸配列を以下に示す。

【化1】

（式中、成熟活性ＰＳＡタンパク質の配列に下線が引かれている。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ０７２８８もまた参照されたい）

【0020】

精漿に見出されるＰＳＡのほとんどは不活性であり、タンパク質Ｃ阻害剤（ＰＣＩ）と複合体化されている。ＰＳＡが、他の細胞外プロテアーゼ阻害剤と複合体を形成することもまた可能である。インビトロ研究は、ＰＳＡがα２−抗プラスミン（α２−ＡＰ）、ＡＣＴ、ＡＭＧ、抗−トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、Ｃ１−失活剤、及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）に結合し得ることを示している。

【0021】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、複合体化されたアイソフォームのＰＳＡと比較して、遊離（つまり、複合体化されていない）アイソフォームのＰＳＡに対する特異性を有する。遊離アイソフォームのＰＳＡに対する特異性を有する結合分子は、遊離アイソフォームのＰＳＡ上では曝露されているが、複合体化されたアイソフォームのＰＳＡ上では曝露されていないエピトープに対する結合特異性を有し得、これは、直鎖状または立体構造（つまり、非直鎖状）エピトープであり得る。例えば、抗体ポリペプチドは、遊離ＰＳＡでは曝露されており、複合体化されたアイソフォーム（ＰＳＡがＰＣＩに複合体化されている場合に精液に存在する形態など）では曝露されていないＰＳＡの触媒クレフトの一部である１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに対する特異性を有し得る。

【0022】

「特異性」によって、我々は、抗体ポリペプチドが、インビボで、すなわち、ＰＳＡがヒトの体内で存在する生理的条件下で、ＰＳＡに結合することができることを意味する。好ましくは、本抗体ポリペプチドは、インビボでいかなる他のタンパク質にも結合しない。

【0023】

そのような結合特異性は、ＰＳＡを発現するトランスフェクトされた細胞を使用する、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、及びフローサイトメトリー法などの当該技術分野において周知の方法によって決定され得る。有利に、本抗体ポリペプチドはＰＳＡに選択的に結合することができ、すなわち、それは別のタンパク質（特に、前立腺特異的抗原またはＰＳＡなどの他のカリクレイン）に結合するよりも少なくとも１０倍強力にＰＳＡに結合する。

【0024】

本発明の抗体ポリペプチドは、予想外の有利な特性を呈する、選択された５Ａ１０抗体のヒト化バージョンに基づく。

【0025】

特に、本発明のヒト化抗体は、それらのＣＤＲ配列が由来した親マウス５Ａ１０抗体（ｍ５Ａ１０）と比較して、腫瘍への増強された取り込みを呈する（実施例６を参照されたい）。

【0026】

「腫瘍への増強された取り込み」によって、我々は、本発明の抗体ポリペプチド（５Ａ１０抗体のヒト化形態）が、前立腺腫瘍を有する患者に投与されるときに、より少ない正常器官毒性をもって、親マウス５Ａ１０抗体よりも高い腫瘍吸収線量を提供し得ることを意味する。

【0027】

この予想外により良好な腫瘍蓄積は、本発明の抗体のより良好な治療プロファイルを提供する。転じて、それは、より高い放射線量（吸収線量）の使用を可能にし、健康な組織または器官に対する副作用または「付帯的損害」を増加させることなく、前立腺癌の治療においてより大きな有効性をもたらす。

【0028】

ヒト化（再成形またはＣＤＲグラフト化とも呼ばれる）は、異種源由来（一般的には、マウスなどの齧歯類由来）のモノクローナル抗体の免疫原性を低減するための、かつヒト免疫系のそれらの活性化を改善するための技術である（Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎ，２００８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３：１６１９−１６３３の概説（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。臨床治験において、いくつかのヒト化モノクローナル抗体が存在し、いくつかは薬物としての使用を承認されている。分子生物学の技術を使用して、操作されたモノクローナル抗体を産生する力学は比較的容易であるものの、ヒトフレームワークへの齧歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の単純なグラフト化は、元のモノクローナル抗体の結合親和性及び特異性を常に再構成するとは限らない。抗体をヒト化するために、ヒト化抗体の設計が、元の分子の機能を再生する上で重要なステップである。

【0029】

ヒト化抗体の設計は、使用されるＣＤＲの程度及び使用されるヒトフレームワークの程度を含む、いくつかの重要な選択を含む。しかしながら、親抗体の特異性を保持するために、齧歯類ｍＡｂに由来する１つ以上の残基を、ヒトフレームワーク領域へと置換すること（いわゆる、逆突然変異）もまた、重要であり得る。必要な逆突然変異の位置の特定は、詳細な配列／構造分析を必要とする。近年、選択された位置でアミノ酸を変化させるために、ファージライブラリが使用されている。同様に、齧歯類ＣＤＲをグラフトするのに最も適切なヒトフレームワークを選択するために、多くのアプローチが使用されている。初期の実験は、齧歯類モノクローナル抗体に対する配列同一性とは無関係に、（しばしばその構造が入手可能であった場合）良く特性評価されたヒトモノクローナル抗体の限られたサブセットを使用した（いわゆる、固定フレームワークアプローチ）。いくつかのグループは、齧歯類可変領域に対する高いアミノ酸配列同一性を有する可変領域を使用し（相同性マッチングまたは最良適合）、他のグループは、コンセンサスまたは生殖系列配列を使用する一方で、更に他のグループは、いくつかの異なるヒトモノクローナル抗体に由来する軽鎖または重鎖可変領域内のフレームワーク配列の断片を選択する。表面齧歯類残基を、ヒトモノクローナル抗体に見出される最も一般的な残基と置き換える（「リサーフェイシング」または「ベニアリング」）ヒト化に対するアプローチ、及び異なる定義の程度のＣＤＲを使用するアプローチもまた、開発されている。

【0030】

しかしながら、抗体ヒト化についての広範な研究にも関わらず、いくつかの齧歯類モノクローナル抗体は、ヒト化が困難だということが判明している。

【0031】

本発明の抗体ポリペプチドの開発は、フレームワーク領域内だけでなく、ＣＤＲのうちのいくつかにおける逆突然変異も必要とした（以下の実施例２を参照されたい）。したがって、上記に配列番号１〜６で表される６つのＣＤＲ配列は、マウス抗ＰＳＡ抗体５Ａ１０に由来するが、親マウス抗体と比較して、ＣＤＲＨ２（配列番号２）及びＣＤＲＬ１（配列番号４）における変異を含有する。ＣＤＲにおけるこれらの変異は、５Ａ１０のヒト化バージョンに最適な特異性及び安定性を与えるために行われた。

【0032】

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、０．１×１０^−９Ｍ超のＫ_ＤでＰＳＡに結合する。

【0033】

全体的親和性（Ｋ_Ｄ）、ならびにある相互作用（抗体とリガンドとの間の相互作用など）の会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。例示的なインビトロ方法を、以下の実施例３に記載する。フローサイトメトリーに基づく方法を使用することもまた、考えられる（Ｓｋｌａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ，３１：９７−１１９（この開示は参照により本明細書に組み込まれる））。

【0034】

有利に、本発明の抗体ポリペプチドは、１．０×１０^−１０Ｍ未満のＰＳＡへの親和性（Ｋ_Ｄ）、例えば、９．０×１０^−１１Ｍ未満、８．０×１０^−１１Ｍ未満、７．０×１０^−１１Ｍ未満、６．０×１０^−１１Ｍ未満、５．０×１０^−１１Ｍ未満、４．０×１０^−１１Ｍ未満、３．０×１０^−１１Ｍ未満、２．０×１０^−１１Ｍ未満、または１．０×１０^−１１Ｍ未満のＫ_Ｄを有する。

【0035】

当業者によって、本発明の抗体ポリペプチドが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／または抗体軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、ならびに抗原結合断片及びその誘導体を構成し得ることが理解されるだろう。

【0036】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ分子などの無傷（すなわち、完全）抗体を含むか、またはそれからなる。

【0037】

有利に、本抗体ポリペプチドは、無傷ＩｇＧ分子、または抗原結合断片もしくはその誘導体を含むか、またはそれからなる。

【0038】

ＩｇＧ分子は、任意の既知のサブタイプのもの、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。

【0039】

抗体の「抗原結合断片及び誘導体」によって、我々は、Ｆｖ断片（例えば、一本鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）_２断片）、ならびにドメイン抗体（例えば、単一Ｖ_Ｈ可変ドメインまたはＶ_Ｌ可変ドメイン）を含む。

【0040】

例えば、本抗体ポリペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片を含むか、またはそれからなり得る。

【0041】

本発明の抗体ポリペプチドの更なる特性評価的特徴は、重鎖及び軽鎖可変領域内の、１つ以上のヒト抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列の存在である。

【0042】

「フレームワーク配列」によって、我々は、ＣＤＲ以外の重鎖及び軽鎖可変ドメインの領域を含む。典型的には、各可変ドメインは、その中にＣＤＲ配列が位置する、ＦＲ１〜ＦＲ４と表記される４つのフレームワーク領域を含む。
ＦＲ１−−−−ＣＤＲ１−−−−ＦＲ２−−−−ＣＤＲ２−−−−ＦＲ３−−−−ＣＤＲ３−−−−ＦＲ４

【0043】

フレームワーク領域のアミノ酸配列は完全にヒトであっても、１つ以上の逆突然変異を含有してもよい（すなわち、ヒトフレームワーク内に存在するアミノ酸配列が、ＣＤＲが由来している親齧歯類可変ドメイン内の対応する位置に見出されるアミノ酸で置換されてもよい）ことが理解されるだろう。結果的に、本発明の抗体ポリペプチドの重鎖及び／または軽鎖可変ドメイン（複数可）のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び／またはＦＲ４の配列は、天然に存在しなくてもよい。

【0044】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドのフレームワーク配列は、１つ以上のヒト抗体に由来するフレームワーク領域と少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する。したがって、本抗体ポリペプチドは、ヒト抗体のＦＲ１領域と少なくとも７０％の配列同一性を共有する重鎖ＦＲ１領域を含み得る。しかしながら、本抗体ポリペプチドの重鎖及び軽鎖は、異なるヒト抗体のフレームワーク領域と配列同一性を共有し得ることが理解されるだろう。

【0045】

同一性パーセントは、例えば、パラメータとして、グローバルアラインメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティー−１４、エクステンディングギャップペナルティー−４を使用して、Ｅｘｐａｓｙファシリティサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）のＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７）によって決定され得る。あるいは、２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントは、配列が最適に整列されているポリペプチドに関連して計算されることが理解されるだろう。

【0046】

あるいは、整列は、（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載される）Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実行されてもよい。使用されるパラメータは、以下の通りであり得る。
−高速対整列パラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティー；３、上部対角の数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
−複数整列パラメータ：ギャップオープンペナルティー；１０、ギャップエクステンションペナルティー；０．０５。
−スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

【0047】

あるいは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、局在配列整列を決定することができる。

【0048】

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドの重可変ドメインのフレームワーク配列は、ヒト免疫グロブリンＶＨ４遺伝子ファミリーによってコードされる。

【0049】

例えば、フレームワーク配列は、少なくとも一部には、ＶＨ４−２８生殖系列遺伝子によってコードされ得る（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３はＶＨ４−２８によってコードされ得、ＦＲ４はＪＨ１によってコードされ得る）。

【0050】

したがって、一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、配列番号８（式中、ＣＤＲ配列は太字で下線が引かれている）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖可変領域を含むか、またはそれからなり得る。

【化2】

【0051】

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドの軽可変ドメインのフレームワーク配列は、ヒト免疫グロブリンカッパＶ４遺伝子ファミリーによってコードされる。

【0052】

例えば、フレームワーク配列は、少なくとも一部には、ＩｇｋＶ４−Ｂ３生殖系列遺伝子によってコードされ得る（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３はＩｇｋＶ４−Ｂ３によってコードされ得、ＦＲ４はＪＫ２によってコードされ得る）。

【0053】

したがって、一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、配列番号９（式中、ＣＤＲ配列は太字で下線が引かれている）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖可変領域を含むか、またはそれからなり得る。

【化3】

【0054】

「少なくとも一部には」によって、我々は、フレームワーク配列が、参照遺伝子によってコードされた少なくとも１０個の近接アミノ酸、例えば、少なくとも２０個の近接アミノ酸を含むことを含む。我々はまた、全てではないが１つ以上のＦＲ領域が参照遺伝子によってコードされる（例えば、ＦＲ１及びＦＲ２が参照遺伝子によってコードされ得、ＦＲ３はコードされない）ことも含む。

【0055】

好ましい一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖可変領域と、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖可変領域とを含む。

【0056】

任意で、本発明の抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域またはその一部を更に含む。

【0057】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖など）のＣＨ１、ＣＨ２、及び／またはＣＨ３領域を含む。したがって、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ１重鎖に由来する定常領域の一部または全てを含み得る。例えば、本抗体ポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬ定常領域を含むＦａｂ断片であり得る。

【0058】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を含み得る。当業者によって、Ｆｃ部分が、ＩｇＧ抗体または異なるクラスの抗体（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなど）に由来し得ることが理解されるだろう。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体に由来する。

【0059】

Ｆｃ領域は、天然に存在するもの（例えば、内因的に産生される抗体の一部）であっても、人工のもの（例えば、天然に存在するＦｃ領域と比較して、１つ以上の点変異及び／またはＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分に対する修飾を含むもの）であってもよい。ＦｃＲに結合するそれらの能力を改善する点変異を有するＦｃ領域は、例えば、血清半減期を変化させること、またはＡＤＣＣ及びＣＤＣを伴うＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を調節（すなわち、増強または低減）することによって、有利であり得る。

【0060】

有利に、本抗体ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列またはその一部を含み得る。

【化4】

【0061】

任意で、本発明の抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域またはその一部を更に含む。

【0062】

一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ軽鎖（カッパまたはラムダ軽鎖）のＣＬ領域を含む

【0063】

例えば、本抗体ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列またはその一部を含み得る。

【化5】

【0064】

有利に、本抗体ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖定常領域と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖定常領域とを含む。

【0065】

好ましい一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１２（式中、可変領域は太字であり、ＣＤＲ配列に下線が引かれている）
のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる重鎖

【化6】

ならびに／または
（ｂ）配列番号１３（式中、可変領域は太字であり、ＣＤＲ配列に下線が引かれている）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる軽鎖を含む。

【化7】

【0066】

例えば、本抗体ポリペプチドは、ジスルフィド架橋によってともに接合されて、典型的なＩｇＧ抗体構造を形成する、配列番号１２の２つの重鎖及び配列番号１３の２つの軽鎖を含むか、またはそれからなり得る。

【0067】

本発明の抗体ポリペプチドは、修飾または誘導体化されている１つ以上のアミノ酸を含むか、またはそれからなり得る。

【0068】

１つ以上のアミノ酸の化学的誘導体は、官能側基との反応によって達成され得る。そのような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルエステル及びエチルエステル、または他の種類のエステル及びヒドラジドを形成し得る。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。２０個の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドもまた、化学的誘導体に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンに対して置換され得、５−ヒドロキシリジンはリジンに対して置換され得、３−メチルヒスチジンはヒスチジンに対して置換され得、ホモセリンはセリンに対して置換され得、オルニチンはリジンに対して置換され得る。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含有するペプチドも含む。他の含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、（例えば、アンモニアまたはメチルアミンでの）末端カルボキシルアミド化、及び同様の末端修飾である。

【0069】

当業者によって、ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることが更に理解されるだろう。「ペプチド模倣物」という用語は、治療剤としての特定のペプチドの立体構造及び望ましい特徴を模倣する化合物を指す。

【0070】

例えば、該ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）連結によって接合されている分子だけでなく、ペプチド結合が逆転している分子も含む。そのようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、当該技術分野において既知の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載される方法を使用して作製され得る。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、主鎖に関与する変化を含有する偽ペプチドの作製を伴う。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してより一層抵抗性である。あるいは、該ポリペプチドは、アミノ酸残基のうちの１つ以上が、従来のアミド連結の代わりに−ｙ（ＣＨ_２ＮＨ）−結合によって連結されている、ペプチド模倣化合物であり得る。

【0071】

更なる一代替形態において、ペプチド結合は完全に省かれ得るが、但し、アミノ酸残基の炭素原子間のスペーシングを保持する適切なリンカー部分が使用されることを条件とし、リンカー部分がペプチド結合と実質的に同一の電荷分布及び実質的に同一の平面性を有することが有利であり得る。

【0072】

該ポリペプチドが、そのＮ末端またはＣ末端で、エキソタンパク質消化に対する感受性の低減を助けるように好都合に遮断され得ることが理解されるだろう。

【0073】

Ｄアミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの、様々なコードされていないアミノ酸または修飾されているアミノ酸もまた、哺乳動物ペプチドを修飾するために使用されている。加えて、推定される生理活性立体構造は、環化などの共有結合修飾によって、またはラクタムもしくは他の種類の架橋の組み込みによって安定化され得、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：２６３６及びＴｈｕｒｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照されたい。

【0074】

当業者によって、本発明の抗体ポリペプチドが、（例えば、インビボ撮像剤または治療剤としての）それらの意図される使用を促進するために、官能部分で増大され得ることが理解されるだろう。

【0075】

したがって、一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、直接的または間接的に治療部分に連結される。

【0076】

任意の好適な治療部分が使用され得る。好適な治療部分は、前立腺癌細胞の成長を低減もしくは阻害すること、または特にそれを死滅させることができる部分である。例えば、治療剤は細胞傷害性部分であり得る。細胞傷害性部分は、１つ以上の放射性同位体を含むか、またはそれからなり得る。例えば、１つ以上の放射性同位体はそれぞれ独立して、ベータ放射体、オージェ放射体、転換電子放射体、アルファ放射体、及び低光子エネルギー放射体からなる群から選択され得る。１つ以上の放射性同位体がそれぞれ独立して、薬剤の近傍で高線量吸収を創出する、局在的に吸収されたエネルギーの放射パターンを有することが所望され得る。例示的な放射性同位体としては、長距離ベータ放射体（^９０Ｙ、^３２Ｐ、^１８６Ｒｅ／^１８８Ｒｅ；^１６６Ｈｏ、^７６Ａｓ／^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^１５３Ｓｍなど）、中距離ベータ放射体（^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^６７Ｃｕ、^１６１Ｔｂ、^１０５Ｒｈなど）、低エネルギーベータ放射体（^４５Ｃａまたは^３５Ｓなど）、転換またはオージェ放射体（^５１Ｃｒ、^６７Ｇａ、^９９Ｔｃ^ｍ、^１１１Ｉｎ、^１１４ｍＩｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^２０１Ｔｌなど）、ならびにアルファ放射体（^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ａｃ、^２２５Ａｃ、^２１２Ｐｂ、^２５５Ｆｍ、^２２３Ｒａ、^１４９Ｔｂ、及び^２２１Ａｔなど）を挙げることができる。他の放射性核種が利用可能であり、治療に使用することができるだろう。

【0077】

別の実施形態において、治療部分または細胞傷害性部分が、ＷＯ２００６／０８７３７４Ａ１、特にその１１頁７〜１５行に「トレーサー」として開示される部分ではないことが所望され得る。

【0078】

好ましい一実施形態において、本抗体ポリペプチドは、放射性同位体^１７７Ｌｕに連結される（か、または別様に標識される）。

【0079】

あるいは、治療部分は、１つ以上の治療（細胞傷害性など）薬、例えば、細胞分裂阻害薬、抗アンドロゲン薬、コルチゾン及びその誘導体、ホスホネート、テストステロン−５−α−リダクターゼ阻害剤、ボロンアデンド、サイトカイン、タプシガルジン及びその代謝物、毒素（サポリンもしくはカリケアマイシンなど）、化学療法剤（代謝拮抗剤など）、または前立腺癌の治療において有用である任意の他の治療薬もしくは細胞傷害性薬を含むか、またはそれからなり得る。

【0080】

例示的な治療薬／細胞傷害性薬としては、例えば、
●シクロホサミド、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、ロムスチン、タキサン、リン酸エストラムスチン及び他のナイトロジェンマスタード、抗生物質（ドキソルビシン、カリケアマイシン、及びエスペラミシンを含む）、ビンカアルカロイド、アザリジン、白金含有化合物、エンドスタチン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、酵素、置換尿素、メチル−ヒドラジン誘導体、ダウノルビシン、両親媒性アミンを含むが、これらに限定されない、細胞分裂阻害、特に、用量制限副作用を有するもの、
●フルタミド及びビカルタミドならびにそれら代謝物などの抗アンドロゲン薬；
●コルチゾン及びその誘導体；
●ジホホネート（ｄｉｐｈｏｐｈｏｎａｔｅ）及びブホスホネート（ｂｕｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）などのホスホネート；
●テストステロン−５−α−リダクターゼ阻害剤；
●ボロンアデンド；
●サイトカイン；
●タプシガルジン及びその代謝物；
●前立腺癌の治療において使用される他の薬剤を挙げることができる。

【0081】

あるいは、細胞傷害性部分は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘起オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、または低エネルギーＸ線光子活性化療法などの活性化療法における使用に好適な１つ以上の部分を含むか、またはそれからなり得る。

【0082】

例えば、本発明の抗体ポリペプチドによって、癌組織中の外部Ｘ線照射からの局在エネルギー付与が、事前投与された高Ｚ腫瘍標的剤との相互作用によって増強される、いわゆる光活性化放射線療法（ＰＡＴ）に主に着目して、シンクロトロン放射線（または低エネルギーＸ線）を使用して、放射線療法を進歩させる潜在性が存在するだろう。

【0083】

ＰＡＴ治療様式は、ＧｒｅｎｏｂｌｅにあるＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＥＳＲＦ）のＩＤ１７生物医学的ビームラインによって提供されるものなどであり、新たなスウェーデンのシンクロトロン施設Ｍａｘ−ＩＶなどの他の施設でも将来入手可能であることが期待される、シンクロトロン源からの単色光Ｘ線を利用する。

【0084】

更なる潜在的な治療様式として、「誘起オージェ電子腫瘍療法」についての研究が、ＬｕｎｄのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｐａｌｌａｔｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＥＳＳ）で進んでおり、医学的実験ステーションとなることが期待されている。反応器で産生された熱中性子及び半熱中性子が、長期にわたって、ボロン−中性子−捕捉−療法（ＢＮＣＴ）に、前臨床実験のため、ならびに誘起アルファ−粒子及び高度の局在的に吸収されたエネルギー（吸収線量）をもたらす反跳核（^７Ｌｉ）による脳腫瘍の治療のための両方に使用されてきた。類似したアプローチは、中性子、及び中性子のための高断面積を有する安定した核で標識された、好適な腫瘍標的分子を使用することである。例えば、抗体またはペプチドは、安定したガドリニウム（^１５７Ｇｄ）で標識され、Ｇｄ核によって捕捉される中性子の標的分子として作用し得る（いわゆるガドリニウム中性子捕捉療法（ＧｄＮＣＴ））。Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏの技術によって、腫瘍中及び周辺組織の線量分布が計算され、これは、それがγ−光子、中性子、核反跳、ならびに特性評価的ｘ線、内部転換、及びガドリニウムまたは他の潜在的な原子からのオージェ−電子に起因するためである。

【0085】

上記に考察されるように、治療部分（放射性同位体または細胞傷害性部分など）は、直接的または間接的に結合部分（その抗体または断片）に連結され得る。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル−ベンゾエートの誘導体、ドデカボレート）、大環状キレート剤及び非環式キレート剤の両方のキレート部分（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドセダン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］−ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−（Ｓ）−（４−イソチオシアナト−ベンジル）−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）の誘導体、５−Ｓ−（４−アミノベンジル）−１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−トリス（酢酸）（ＤＯ３Ａ）の誘導体など）、ならびに他のキレート部分が挙げられる。そのようなリンカーの使用は、治療部分として、薬剤がリンカーを介して放射性同位体に連結された結合部分として抗体もしくはその断片を含むか、またはそれからなる状況において、特に適切であり得る。

【0086】

１つの好ましいリンカーは、例えば、^１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用される、ＤＴＰＡである。

【0087】

更なる好ましいリンカーは、例えば、好ましくは治療的使用のための、^８９Ｚｒ−ＤＦＯ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用される、デフェロキサミンＤＦＯである。

【0088】

任意で、本発明の抗体ポリペプチドは、検出可能な部分を更に含んでも、含まなくてもよい。例えば、検出可能な部分は、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ，^８９Ｚｒ、^１２３Ｉ、及び^２０１Ｔｌからなる群から選択される放射性同位体などの放射性同位体を含むか、またはそれからなり得る。任意で、薬剤は、^８６Ｙ／^９０Ｙま
たは^１２４Ｉ／^２１１Ａｔなどの一対の検出可能かつ細胞傷害性の放射性核種を含み得る。あるいは、薬剤は、検出可能な部分として、かつまた細胞傷害性部分としても多様式で同時に作用して、いわゆる「多様式治療診断剤」を提供することができる放射性同位体を含み得る。したがって、結合部分は、放射性核種または化学療法剤などの細胞傷害性薬を使用した治療能力とともに、複数撮像（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学、または超音波）能力を有するナノ粒子にカップリングされ得る。本発明には、高周波数交流磁場及び付随する超音波撮像を使用して、温熱療法によって治療する可能性もまた含まれる。

【0089】

あるいは、検出可能な部分は、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｃｒ、及び^５６Ｆｅからなる群から選択される常磁性同位体などの常磁性同位体を含むか、またはそれからなり得る。

【0090】

本抗体ポリペプチドが検出可能な部分を含む場合、検出可能な部分は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学、または超音波撮像などの撮像技術によって検出可能であり得る。

【0091】

治療部分及び検出可能な部分は、当該技術分野において周知である方法を使用して、抗体ポリペプチドとコンジュゲートされるか、または別様に組み合わされ得る（例えば、既存の免疫コンジュゲート療法、ゲムツズマブオゾガマイシン［商品名：Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）］は、細胞毒カリケアマイシンに連結されたモノクローナル抗体を含む）。

【0092】

更なる一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドを、抗体ポリペプチド分子の集団を含む製剤の形態で使用して、前立腺癌を治療することができる。１つの選択肢において、この集団中の抗体ポリペプチド分子の全て（または９０重量％、９５重量％、９９重量％、または９９．９重量％以上など、実質的に全て）が、同一の治療部分を含む。別の選択肢において、この集団は、他の薬剤と異なる治療部分との混合物を含む。この選択肢は、化学療法剤、ホルモン療法剤などの様々な薬剤を使用した標的放射性核種療法、または標的剤が治療活性放射性核種を腫瘍関連抗原に送達するだけでなく、細胞内シグナルカスケードを調節（例えば、誘因または遮断）することによって、標的腫瘍細胞も同時に放射線感作する、他の療法の組み合わせの効果を増強する可能性をもたらすだろう。この選択肢はまた、例えば、大型腫瘍、微小転移、及び単一腫瘍細胞の併用治療のために、アルファ放射体及び異なる射程のベータ放射体のカクテルまたは異なる射程を有する放射性核種のカクテル、ＬＥＴ（線エネルギー付与）、及びＲＢＥ（相対的生物学的効果）を使用した、細胞傷害性剤の混合物による前立腺癌の治療においても有用である。一実施形態において、長距離放射体は大型腫瘍の治療に使用され得、短距離放射体はより小さな腫瘍（微小転移など）及び単一腫瘍細胞の治療に使用され得る。

【0093】

任意で、本発明の抗体ポリペプチドは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分を更に含んでも、含まなくてもよい。薬剤のインビボ半減期を増加させるための例示的な部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸、及びデキストランを挙げることができる。ＰＥＧが特に企図され得る。

【0094】

本発明のポリペプチドは、例えば、フリーズドライ、スプレー乾燥、スプレー冷却を通して、または超臨界二酸化炭素による粒子形成（沈降）の使用を通して、保管のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中に再構成され得ることが理解されるだろう。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、フリーズドライ、スプレー乾燥、ケーキ乾燥）及び／または再構成技術を用いることができる。当業者によって、凍結乾燥及び再構成が異なる程度の活性喪失をもたらし得ること、ならびに使用レベルを上方調節して、補償する必要があることが理解されるだろう。好ましくは、凍結乾燥された（フリーズドライされた）ポリペプチドは、再水和させたとき、（凍結乾燥前の）その活性の約１％以下を喪失するか、または再水和させたとき、（凍結乾燥前の）その活性の約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％以下、もしくは約５０％以下を喪失する。

【0095】

本発明のポリペプチドの産生方法は、当該技術分野において周知である。

【0096】

好都合に、本ポリペプチドは、組み換えポリペプチドであるか、またはそれを含む。そのような組み換えポリペプチドの好適な産生方法は、原核生物または真核生物宿主細胞における発現のように、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（この文章の関連する開示は、参照により組み込まれる）を参照されたい）。

【0097】

本発明の抗体ポリペプチドはまた、ウサギ網状赤血球ライセートまたはコムギ胚芽ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）などの市販のインビトロ翻訳系を使用しても産生され得る。好ましくは、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球ライセートである。好都合に、翻訳系は、ＴＮＴ転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの転写系にカップリングされ得る。この系は、翻訳と同一の反応において、コードＤＮＡポリヌクレオチドから、好適なｍＲＮＡ転写物を産生するという利益を有する。

【0098】

当業者によって、代替的に、本発明のポリペプチドが、例えば、周知の液相または固相合成技術（ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成など）を使用して、人工的に合成され得ることが理解されるだろう。

【0099】

本発明の第２の態様は、本発明の抗体ポリペプチドまたはその構成成分ポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子を提供する。「核酸分子」によって、我々は、一本鎖または二本鎖であり得る、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ）及びｍＲＮＡ分子を含む。

【0100】

一実施形態において、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。

【0101】

当業者によって、核酸分子が、特定の宿主細胞内での抗体ポリペプチドの発現のために（例えば、ヒト細胞内での発現のために）コドン最適化され得ることが理解されるだろう（例えば、Ａｎｇｏｖ，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６（６）：６５０−６５９を参照されたい）。

【0102】

好ましい一実施形態において、本発明の核酸分子は、
（ａ）配列番号１４のヌクレオチド配列

【化8】

ならびに／または
（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。

【化9】

【0103】

したがって、本発明の核酸分子は、
（ａ）配列番号１６のヌクレオチド配列

【化10】

ならびに／または
（ｂ）配列番号１７のヌクレオチド配列を含み得る。

【化11】

【0104】

以下もまた、本発明の範囲内に含まれる。
（ａ）本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に従う核酸分子を含むベクター（発現ベクターなど）を提供する。
（ｂ）本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様に従う核酸分子または本発明の第３の態様に従うベクターを含む宿主細胞（哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など）を提供する。
（ｃ）本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドの作製方法であって、該ポリペプチドが発現される条件下で、本発明の第４の態様に従う宿主細胞の集団を培養することと、そこからポリペプチドを単離することとを含む、方法を提供する。

【0105】

本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様の薬学的に有効な量の抗体ポリペプチドと、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。

【0106】

ＥＤＴＡ、クエン酸、ＥＧＴＡ、またはグルタチオンなどのキレート剤を含む、追加の化合物もまた、薬学的組成物中に含まれ得る。

【0107】

薬学的組成物は、十分に保管安定性かつ人及び動物への投与に好適である、当該技術分野において既知の様式で調製され得る。例えば、薬学的組成物は、例えば、フリーズドライ、スプレー乾燥、スプレー冷却を通して、または超臨界粒子形成による粒子形成の使用を通して、凍結乾燥され得る。

【0108】

「薬学的に許容される」によって、我々は、本発明の薬剤のカリクレインタンパク質結合活性の有効性を低下させない非毒性材料を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝剤、担体、または賦形剤は、当該技術分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。

【0109】

「緩衝剤」という用語は、ｐＨを安定化する目的を有する酸系混合物を含有する水溶液を意味することが意図される。緩衝剤の例は、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、ホウ酸、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール酢酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、及びＴＥＳである。

【0110】

「希釈剤」という用語は、薬学的調製物中の薬剤を希釈する目的を有する水溶液または非水溶液を意味することが意図される。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナツ油、綿実油、もしくはゴマ油など）のうちの１つ以上であり得る。

【0111】

「アジュバント」という用語は、本発明の薬剤の生物学的効果を増加させるために製剤に添加される任意の化合物を意味することが意図される。アジュバントは、異なるアニオンを有する亜鉛塩、銅塩、または銀塩、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸（ｔｉｏｃｙａｎａｔｅ）、亜硫酸、水酸化物、リン酸、炭酸、乳酸、グリコール酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、及び異なるアシル組成物の酢酸などであるが、これらに限定されないもののうちの１つ以上であり得る。アジュバントは、カチオン性ポリマー（カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステルなど）、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー（ポリ（ビニルイミダゾール）など）、及びカチオン性ポリペプチド（ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニンなど）、ならびにこれらのアミノ酸を含有するペプチドでもあり得る。

【0112】

賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、及び鉱物のうちの１つ以上であり得る。炭水化物の例としては、例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加される、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが挙げられる。ポリマーの例は、全てが異なる分子量である、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる加水分解の程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンであり、これらは、例えば、粘度制御のため、生体接着の達成のため、または化学分解及びタンパク質分解からの脂質の保護のために組成物に添加される。脂質の例は、全てが異なるアシル鎖長及び飽和度である、脂肪酸、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、ならびに糖脂質；卵レシチン、ダイズレシチン、水素化卵レシチン、及び水素化ダイズレシチンであり、これらは、ポリマーの理由に類似した理由のために組成物に添加される。鉱物の例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンであり、これらは、脂質蓄積の低減または有利な顔料特性などの利益を得るために組成物に添加される。

【0113】

本発明の抗体ポリペプチドは、当該技術分野においてその送達が好適であることが既知である任意の種類の薬学的組成物に製剤化され得る。

【0114】

一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、抗体ポリペプチドが、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、及び液体結晶として凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性剤と組み合わされる、リポソームの形態であり得る。リポソーム製剤に好適な脂質としては、非限定的に、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、及び胆汁酸などが挙げられる。好適な脂質としてはまた、血流循環時間の延長のために、極性頭部基においてポリ（エチレングリコール）によって上記のように修飾された脂質も挙げられる。そのようなリポソーム製剤の調製は、例えば、ＵＳ４，２３５，８７１（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

【0115】

本発明の薬学的組成物はまた、生分解性小球体の形態でもあり得る。脂肪族ポリエステル（ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）など）、ＰＬＡとＰＧＡ（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）とのコポリマー、及びポリ無水物は、小球体の産生において生分解性ポリマーとして幅広く使用されている。そのような小球体の調製は、ＵＳ５，８５１，４５１及びＥＰ０ ２１３ ３０３（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。

【0116】

更なる一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる加水分解の程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、ならびにポリビニルピロリドンなどのポリマーが、薬剤を含有する溶液を増粘するために使用される、ポリマーゲルの形態で提供される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンも含み得る。

【0117】

あるいは、本抗体ポリペプチドは単に、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナツ油、綿実油、もしくはゴマ油など）、トラガカントゴム、及び／または様々な緩衝剤中に溶解され得る。

【0118】

本発明の薬学的組成物が、活性抗体ポリペプチドの作用を強化するために、イオン及び定義されたｐＨを含み得ることが理解されるだろう。更に、本組成物は、無菌化などの従来の薬学的操作に供されても、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの従来のアジュバントを含有してもよい。

【0119】

本発明に従う薬学的組成物は、当業者にとって既知である任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能性のある投与経路としては、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）、局所、眼内、経鼻、肺、口腔、経口、非経口、及び直腸が挙げられる。また、移植片からの投与も可能である。投与される薬剤の潜在的に高い細胞傷害性のため、注入が、所望される経路であり得る。

【0120】

一実施形態において、本薬学的組成物は、非経口、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、側脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下投与されるか、またはそれらは、注入技術によって投与され得る。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る、無菌水溶液の形態で好都合に使用される。水溶液は、必要に応じて、好適に（例えば、３〜９のｐＨに）緩衝されるべきである。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者にとって周知である標準的な薬学的技術によって容易に達成される。

【0121】

非経口投与に好適な製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る、水溶性及び非水溶性の無菌注射溶液、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水溶性及び非水溶性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプル及びバイアルで提示され得、無菌液体担体、例えば、注射に際して、使用直前に水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管され得る。即時注射溶液及び懸濁液は、既に記載した種類の無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。

【0122】

したがって、本発明の薬学的組成物は、患者における腫瘍への非経口、例えば、静脈内投与または局所投与（例えば、腫瘍内または腫瘍周囲）に特に好適なである。

【0123】

本薬学的組成物は、薬学的に有効な用量、すなわち、治療的に有効な吸収線量の治療放射性核種で患者に投与されるだろう。

【0124】

本発明の抗体ポリペプチドの治療使用の文脈において、本明細書で使用される場合、「薬学的に有効な量」、または「有効な量」、または「治療的に有効な」は、所与の条件及び投与レジメンで治療効果を提供する量を指す。これは、必要とされる添加剤及び希釈剤、すなわち、担体または投与ビヒクルに関連して、所望される治療効果を産生すると計算される所定の量の活性材料である。更に、それは、活性、機能、及び宿主の応答の臨床的に有意な欠如を低減及び／または予防するのに十分な量を意味することが意図される。あるいは、治療的に有効な量は、宿主の臨床的に有意な病態に改善を引き起こすのに十分な量である。当業者によって理解されるように、化合物の量は、その特異的活性に応じて変化し得る。好適な投薬量は、必要とされる希釈剤に関連して、所望される治療効果を産生すると計算される所定の量の活性組成物を含有し得る。本発明の組成物の製造のための方法及び使用において、治療的に有効な量の活性構成成分が、提供される。治療的に有効な量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、医学当業者によって決定され得る（以下の実施例６を参照されたい）。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または他のいくつかのより小さな用量単位の形態の単回投与、及び特定の間隔での細分化された用量の複数回投与の両方によって実行され得る。あるいは、用量は、長期間にわたる連続注入として提供され得る。

【0125】

本発明の抗体ポリペプチドの診断使用の文脈において、本明細書で使用される場合、「薬学的に有効な量」、または「有効な量」、または「診断的に有効な」は、インビボ撮像目的で検出可能なシグナルを提供する量を指す。

【0126】

本発明の抗体ポリペプチドは、使用される化合物の有効性／毒性に応じて様々な濃度で製剤化され得る。製剤は、０．１μＭ〜１ｍＭ、１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭ、及び約５００μＭの濃度のポリペプチドを含み得る。

【0127】

典型的には、ヒト患者における（治療部分を有するか、または有さない）治療用量の抗体ポリペプチドは、（７０ｋｇの体重に基づいて）１回の投与当たり１００μｇ〜７００ｍｇの範囲内であるだろう。例えば、最大治療用量は、１回の投与当たり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。そのような用量は、腫瘍学者／医師によって決定される異なる間隔で投与され得ることが理解され、例えば、用量は、１日１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回投与され得る。

【0128】

当業者によって、本発明の薬学的組成物が、単独もしくは前立腺癌の治療に使用される他の治療剤との組み合わせで、または前立腺癌の治療のための他の治療様式（他の治療抗体、手術（例えば、前立腺全摘除術）、放射性核種療法、密封小線源治療、外部照射放射線療法、高密度焦点式超音波法（ＨＩＦＵ）、化学療法、経口化学療法薬、凍結手術（腫瘍の凍結）、ホルモン療法（抗アンドロゲン療法など）、去勢、もしくは前述のものの組み合わせなど）による患者後治療の前、その後、もしくはそれと同時に、投与され得ることが理解されるだろう。

【0129】

本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドまたは本発明の第６の態様に従う薬学的組成物を、本明細書に記載されるその使用指示書とともに含む、キットを提供する。

【0130】

本発明の第８の態様は、医学において使用するための、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを提供する。

【0131】

本発明の第９の態様は、前立腺癌の治療及び／または診断において使用するための、本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを提供する。

【0132】

本発明の第１０の態様は、対象における前立腺癌を治療するための方法であって、対象に、本発明の第１の態様に従う治療的に有効な量の抗体ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。

【0133】

「治療」によって、我々は、患者の治療処置及び予防処置の両方を含む。「予防」という用語は、患者または対象における、前立腺癌の可能性、または局在化前立腺癌の伝播、播種、もしくは転移の予防または低減のいずれかを行う、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用を包含するように使用される。「予防」という用語はまた、以前に前立腺癌が治療されている患者における前立腺癌の再発を予防するための、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用も包含する。

【0134】

本発明の第１１の態様は、対象における前立腺癌を診断するための方法であって、対象に、本発明の第１の態様に従う診断的に有効な量の抗体ポリペプチドを投与することを含む、方法を提供する。

【0135】

「診断」によって、我々は、インビボ（すなわち、患者の体内）またはエキソビボ（すなわち、患者の体内から除去された組織もしくは細胞試料内）のいずれかでの前立腺癌細胞の検出を含む。

【0136】

治療または診断される前立腺癌は、前立腺に局在化されているものでも、非局在化（つまり、播種性）前立腺癌でもよい。前立腺に局在化されている前立腺癌は、例えば、ＴＮＭシステム（腫瘍／結節／転移の略称）に従って臨床Ｔ１またはＴ２癌と分類され得る一方で、非局在化／播種性前立腺癌は、例えば、臨床Ｔ３またはＴ４癌と分類され得る。

【0137】

治療または診断される前立腺癌は、転移性前立腺癌であり得る。転移は、その元の位置から体内の他の部位への癌の伝播を指す。例えば、治療または診断される転移性前立腺癌は、リンパ系内、骨内（脊椎、椎骨、骨盤、肋骨を含む）に存在する転移、骨盤、直腸、膀胱、または尿道内の転移であり得る。他のより一般的でない位置に存在する転移もまた、本発明によって治療することができる。転移は、微小転移であり得る。微小転移は、新たに形成される腫瘍が一般に小さすぎて検出できないか、または検出に困難を伴う転移の形態である。例えば、本発明は、当業者に、単一の癌細胞または細胞集団の存在が診断不可能であるが存在する場合（潜在播種性疾患など）にも、そのような細胞または集団を治療するための手段を提供する。

【0138】

したがって、先行技術の前立腺癌の治療と比較して、本発明によって提供される治療の特に重要な技術的利益は、播種性及び／または転移性（微小転移性を含む）前立腺癌の治療における増強された有効性であることが期待される。

【0139】

したがって、一実施形態において、本発明は、原発前立腺腫瘍の転移を予防または治療するための抗体ポリペプチド及び方法を提供する。

【0140】

前立腺癌は、５０歳超の年齢の男性において、より一般的には６０、６５、または７０歳超の男性において発症する傾向があり、それは男性において最も一般的な種類の癌の１つであるものの、多くは症状を有さず、治療を受けず、かつ最終的には他の原因で死亡する。これは、前立腺癌が、ほとんどの場合、成長が緩徐で無症状であり、かつ病態を有する男性がより高齢であるため、彼らが前立腺癌とは無関係の原因（心臓／循環疾患、肺炎、他の無関係の癌、または老齢など）で死亡するためである。前立腺癌の症例のうちの３分の２は成長が緩徐であり、他方の３分の１はより悪性度が高く、発達が急速である。

【0141】

したがって、前立腺癌を治療及び診断するための有効な方法の開発は、特により若年の患者における、悪性度が高く、発達が急速な形態の癌の管理にとって特に重要である。したがって、一実施形態において、本発明は、前立腺癌の診断時点及び／または治療時点で、９０歳未満、８５歳、８０歳、７５歳、７０歳、６５歳、６０歳、５５歳、５０歳、４５歳、４０歳以下の患者における前立腺癌の治療または診断に関する。

【0142】

家族歴を有さない男性と比較して、前立腺癌を有する第一度近親者（父親または兄弟）を１人有する男性は、前立腺癌を発症する２倍のリスクを有すると考えられ、罹患した第一度近親者を２人有する男性は、５倍のより大きなリスクを有すると考えられる。したがって、本発明は、１人または２人以上の家族、特に第一度家族（父親または兄弟など）が、以前に前立腺癌と診断されていることを特徴とする患者における前立腺癌の治療または診断に関し得る。

【0143】

本発明はまた、患者における前立腺癌の治療及び診断にも関し、治療される前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を有する。ＣＲＰＣは典型的には、１〜３年後にホルモン治療に対して難治性となり、ホルモン療法にも関わらず成長を再開することを特徴とし得る。

【0144】

本発明の医学的使用及び方法において、本抗体ポリペプチドは典型的には、患者の体内に注射または注入される。その後、インビボで、本抗体ポリペプチドは、標的抗原ＰＳＡを産生する組織、主に前立腺癌細胞及びそれらの転移に結合する。結合時、本抗体ポリペプチドは、治療効果（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣを介した、または放射性同位体もしくは他の細胞傷害性部分を担持することによる細胞死の誘導）を直接発揮し得る。あるいは、結合した本抗体ポリペプチドは、療法の選択を誘導するか、または癌細胞の外科的除去を援助し得る診断（撮像）ツールとしての役割を果たし得る。

【0145】

当業者によって、本発明の抗体ポリペプチドが、他の治療及び／または診断剤／処置（外部放射線療法、手術、細胞分裂阻害、及びアンドロゲン治療など）との組み合わせで使用され得ることが理解されるだろう。

【0146】

前述の記述は、前立腺癌を治療及び診断するための方法に適用可能な本発明の実施形態に着目する。しかしながら、本発明は、そのような用途に限定されず、手術後の検査、ならびに放射線、細胞分裂阻害、及びアンドロゲン治療中またはその後の検査に有用であり得ることが理解されるだろう。

【0147】

別の実施形態において、放射線誘導手術（ＲＧＳ）または画像誘導手術（ＩＧＳ）を使用して、手術中及び／またはその前にトレーサー標識された本発明の抗体ポリペプチドを特定することができる。したがって、上記に考察される検出可能な部分を有する抗体ポリペプチドは、手術中及び／またはその前に投与され得る。この実施形態において、本抗体ポリペプチドが、まず注入され得る。その後、ＲＧＳ／ＩＧＳを使用して、手術中またはその前に、検出可能な部分に対して感受性がある検出機器によってＰＳＡ産生組織を特定することができる。検出可能な部分は、例えば、放射線を放射するか、または磁気感受性の検出可能な部分であっても、それは、例えば、チェレンコフ放射線及び／または制動放射の放射体であっても、それは、蛍光標識及び／または磁気もしくは磁化可能標識であってもよい。したがって、本発明に従うＲＧＳ／ＩＧＳは、例えば、光学、チェレンコフ、制動放射、もしくはベータ放射線の検出、または放射性核種標識の検出に基づく方法であっても、かつ／あるいは磁気測定を伴ってもよい。ＲＧＳは、外科医が、検出可能な部分によって「マークされた」組織を特定することを可能にする外科的技術として、当業者にとって周知である。

【0148】

上記の方法に従って得られた可視化は、ＳＰＥＣＴ／ＰＥＴ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）、及び磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）などの他の放射線学的可視化方法と組み合わされ得る。

【0149】

したがって、更なる一態様において、本発明はまた、放射線誘導または画像誘導手術などの手術前または手術中に、前立腺癌を有する患者に投与することによって、医学において使用するための抗体ポリペプチドも提供する。

【0150】

本発明の依然更なる一態様は、対象の血液中の前立腺腫瘍細胞を検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）試験される対象からの血液試料を提供することと、
（ｂ）任意で、血液試料中に存在する細胞を抽出及び／または精製することと、
（ｃ）本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを、血液試料中に存在する細胞と接触させることと、
（ｄ）抗体ポリペプチドが、遊離（すなわち、複合体化されていない）ＰＳＡに結合するかどうかを（直接的または間接的に）判定することと、
を含み、遊離ＰＳＡへの抗体ポリペプチドの結合が、対象の血液中の前立腺腫瘍細胞の存在を示す、方法を提供する。

【0151】

したがって、本方法は、アッセイを実行して、血液試料が遊離ＰＳＡを含有するかどうかを判定することを含み、遊離ＰＳＡの存在は、対象の血液中の前立腺腫瘍細胞の存在を示す。

【0152】

当業者は、そのようなアッセイを実行するための多くの方法が存在することを理解するだろう。例えば、免疫アッセイは、均一、またはより好ましくは異種のいずれかであり得る。アッセイはまた、競合、またはより好ましくは非競合形式のいずれかでも実行され得る。

【0153】

異種非競合アッセイの場合、例示的なプロトコルは、
（ａ）試験される対象からの血液試料を提供することと、
（ｂ）任意で、血液試料中に存在する細胞を抽出及び／または精製することと、
（ｃ）本発明の第１の態様に従う固相固定化抗体ポリペプチドを、血液試料中に存在する細胞と接触させることと、
（ｄ）洗浄して、（固体表面に結合していない）可溶性構成成分を除去することと、
（ｅ）トレーサー、すなわち、レポーター分子／粒子で標識された別の抗ＰＳＡ特異的抗体を添加することと、
（ｆ）洗浄して、未結合のトレーサー抗体を除去することと、
（ｇ）トレーサー抗体からシグナルを検出することとであり得る

【0154】

ステップｂとｃとの間またはステップｃとｄとの間に、典型的には、細胞による可溶性ＰＳＡの産生、その後、その検出を可能にするためのインキュベーション期間が存在するべきである。

【0155】

本発明の追加の一態様は、対象の組織中の前立腺腫瘍細胞を検出するためのインビトロ方法であって、
（ａ）試験される対象からの組織試料（組織学的試料など）を提供することと、
（ｂ）任意で、組織試料中に存在する細胞を抽出及び／または精製することと、
（ｃ）本発明の第１の態様に従う抗体ポリペプチドを、組織試料中に存在する細胞と接触させることと、
（ｄ）抗体ポリペプチドが、遊離（すなわち、複合体化されていない）ＰＳＡに結合するかどうかを（直接的または間接的に）判定することと、
を含み、遊離ＰＳＡへの抗体ポリペプチドの結合が、対象の組織中の前立腺腫瘍細胞の存在を示す、方法を提供する。

【0156】

上記のインビトロ方法の一実施形態において、ステップ（ｄ）は、ＥＬＩＳＡによって実行される。しかしながら、インビトロでの抗体−抗原相互作用の検出に好適な任意のアッセイが、使用され得る。

【0157】

追加の一実施形態において、本方法は、試料中の前立腺腫瘍細胞の定量化を更に含む。

【0158】

上記のインビトロ方法の更なる一実施形態において、本方法は、対象における前立腺癌を診断するためのものである。

【0159】

特許請求の範囲及び／または明細書において、「を含む」という用語と組み合わせて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つの（ｏｎｅ）」を意味し得るが、それはまた、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つまたは１つ以上の」の意味とも一貫する。

【0160】

本発明のこれらの及び他の実施形態は、上記の記述及び添付の図面と組み合わせて考慮されるときに、より良く認識され、理解されるだろう。しかしながら、上記の記述は、本発明の様々な実施形態及びそれらの多数の具体的な詳細を示す一方で、限定ではなく例示のために与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内で、その趣旨を逸脱することなく、多くの代替、修正、追加、及び／または再編成がなされ得、本発明は、全てのそのような代替、修正、追加、及び／または再編成を含む。

【0161】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な記述と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、より良く理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0162】

【図1】^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０注射の最大７日後にスキャンした、ＬＮＣａＰ異種移植片のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を表す。

【図2】^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０注射の最大７日後にスキャンした、ＬＮＣａＰ異種移植片のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を表す。

【図3】ＬＮＣａＰ異種移植片マウスにおける、ｍ５Ａ１０及びｈ５Ａ１０の腫瘍対対側比の分析。

【図4】ＬＮＣａＰ異種移植片マウスにおける、ｍ５Ａ１０及びｈ５Ａ１０の肝臓対腫瘍比の分析。

【図5】ＬＮＣａＰ異種移植片マウスにおける、^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の体内分布分析。

【0163】

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含まれる。続く実施例に開示される技術は、本発明者が本発明の実施にあたって良好に機能することを発見した技術を表し、それ故に特定の様式を構成すると見なされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、同様のまたは類似した結果が得られることを理解するべきである。

【実施例】

【0164】

実施例１−マウス５Ａ１０モノクローナル抗体の、ＦＡｂ形式へのクローニング
試薬
制限酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｅｇａから、アルカリホスファターゼはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから、ｄＮＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼはＦｅｒｍｅｎｔａｓからのものであった。プライマーは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから、及びＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃからのものであった。Ｑｉａｇｅｎキットを、ＤＮＡ精製に使用した。

【0165】

ｍＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
製造者によって「Ｂｉｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）に記載される手順に従って、Ｄｙｎａｌ ｐｏｌｙ−ｄＴ磁気ビーズによって、５Ａ１０ＭＡｂ産生ハイブリドーマ細胞（２Ｅ６細胞、Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ，１９９１）からｍＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によって、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を実行した。まず、ｍＲＮＡと結合している磁性粒子を、１×反応緩衝剤、０．１ＭのＤＴＴ、２ｍＭのｄＮＴＰ、及びリボヌクレアーゼ阻害剤（５０μｌの全反応物体積中１．５μｌ）を含有する反応物中、４２℃で２分間インキュベートした。その後、１μｌのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（２００Ｕ）を添加し、４２℃で１時間反応を進めた。ｃＤＮＡ合成後、粒子及び反応混合物を磁性粒子回収機によって分離し、液体を除去し、粒子をＴＥ緩衝剤中に懸濁させ、９５℃で１分間インキュベートして、ｍＲＮＡを放出させた。インキュベーション後、粒子に結合したｃＤＮＡを回収し、ｍＲＮＡ含有緩衝剤を除去し、粒子をＴＥで洗浄し、最後に５０μｌのＴＥ中に懸濁して、保管した。

【0166】

ｃＤＮＡからの抗体遺伝子の増幅及びクローニング
軽鎖及び重鎖のＮ末端アミノ酸配列を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ，Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ配列決定サービスにおいて、エドマン分解法によって決定した。軽鎖及び重鎖から得られた配列はそれぞれ、ＤＩＶＭＴＱＳ［配列番号１８］及びＥＶＱＬＶＥＳＧ［配列番号１９］であった。Ｎ末端アミノ酸配列に基づいて、データベース検索（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）を実行して、マウスの免疫グロブリン生殖系列Ｖ遺伝子中の対応するヌクレオチド配列を特定した。重鎖及び軽鎖をクローニングするフォワードＰＣＲプライマーの相補性領域を、この検索に基づいて設計した。それぞれ、ＣＨ１及びＣＬに結合するリバースプライマーを設計した。プライマーはまた、クローニングに必要とされる制限酵素認識部位（後に強調する）も含有する。

【0167】

以下の条件（プライマー及び鋳型の変更を除く）でＰＣＲ反応を行った。１２５μＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのフォワード及びリバースプライマー、１×Ｐｆｕの反応緩衝剤、ならびに２．５Ｕ ＰｆｕのＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。９５℃を３０秒、５５℃を１分、及び７２℃を１分３０秒のサイクルを３０回行うことによって、増幅を行った。

【0168】

以下のプライマーによって、ｃＤＮＡから軽鎖を増幅した。
●５Ａ１０−Ｌ（５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡ−３’、ＮｃｏＩ［配列番号２０］）、及び
●ＷＯ２５２（５’−ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’、ＸｂａＩ［配列番号２１］）。
無関係のＦａｂの遺伝子を含有する軽鎖及びベクターｐＣｏｍｂ３（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩによって消化させ（ベクターの場合、ＮｃｏＩでは部分的消化）、アガロースゲルから精製し、ライゲーションした。ライゲーション産生物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換して、プラスミドｐ５Ａ１０−Ｌを得た。

【0169】

以下のプライマー対によって、Ｆｄ（ＶＨ＋ＣＨ１）鎖を増幅した。５Ａ１０−Ｈ（５’−ＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３’、ＮｃｏＩ［配列番号２２］）、及びＷＯ２６７（５’−ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣ−３’、ＳｐｅＩ［配列番号２３］）。Ｆｄ鎖をベクターｐＣｏｍｂ３にクローニングして、そのベクターによって担持される別のＦａｂのＦｄ遺伝子を置き換えた。ＰＣＲ産生物及びベクターを、ＮｃｏＩ（ベクター及び挿入断片の場合どちらも、ＮｃｏＩでは部分的消化）ならびにＳｐｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって消化させ、アガロースゲルから精製し、ライゲーションした。ライゲーション産生物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換して、ベクターｐ５Ａ１０−Ｈを産生した。

【0170】

ＳｐｅＩ及びＸｂａＩによって、プラスミドｐ５Ａ１０−Ｌから５Ａ１０軽鎖を消化させ、ゲル精製の後、ゲル精製したプラスミドｐ５Ａ１０−Ｈによってライゲーションし、対応する酵素によって消化も行った。ライゲーション産生物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換して、Ｆａｂ５Ａ１０の軽鎖及びＦｄ鎖の両方を含有するプラスミドｐＣｏｍｂ３−５Ａ１０を得た。Ｆｄ鎖に融合したファージコートタンパク質遺伝子ｇＩＩＩｐを除去するために、ｐＣｏｍｂ３−５Ａ１０をＳｐｅＩ及びＮｈｅＩによって更に消化させ、自己ライゲーションさせ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換した。プラスミドｐＣｏｍｂ３−５Ａ１０ＤＩＩＩは、可溶性官能Ｆａｂ５Ａ１０の発現を可能にした。

【0171】

参考文献
Ｂａｒｂａｓ ＣＦ３ｒｄ，Ｋａｎｇ ＡＳ，Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ，Ｂｅｎｋｏｖｉｃ ＳＪ．（１９９１）Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｐｈａｇｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅ
ＩＩＩ ｓｉｔｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．７９７８−７９８２
Ｂｉｏｍａｇｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５
Ｌｉｌｊａ Ｈ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ Ａ，Ｄａｈｌｅｎ Ｕ，Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ ＭＴ，Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｏ，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｋ，Ｌｏｖｇｒｅｎ Ｔ．（１９９１）Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ
ｏｃｃｕｒｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．３７（９）：１６１８−２５

【0172】

実施例２−ヒト化５Ａ１０抗体の発現及び精製
ＨＥＫ２９３細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２Ｌの懸濁液培養物に拡大した。トランスフェクションの日、細胞密度は、１×１０^６個の細胞／ｍｌであった。

【0173】

構成成分重鎖及び軽鎖（すなわち、それぞれ配列番号１６及び１７）をコードするヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内での発現のためにコドン最適化し、合成し、ＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。その後、重鎖及び軽鎖のヌクレオチド配列を含有するプラスミドＤＮＡ（発現ベクター）を、トランスフェクション剤と混合し、室温で１０分間インキュベートした。ＤＮＡトランスフェクション剤混合物を、フラスコを緩徐に回旋させながら、細胞培養物に緩徐に添加した。その後、トランスフェクトされた細胞培養物を、３７℃、８％のＣＯ_２、約１３５ｒｐｍで回転する軌道式振盪機プラットフォームで、７日間インキュベートした。

【0174】

培養培地を遠心分離によって収集し、５μｍ、０．６μＭ、及び０．２２μＭのフィルター系を通して濾過した。

【0175】

タンパク質Ｇクロマトグラフィーによって抗体を精製し、透析によって緩衝剤をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に変更し、その後、限外濾過によって抗体を濃縮した。

【0176】

吸光度によって濃度を測定した。
ＤＮＡ：
軽鎖： ｐ５Ａ１０ＶＬｈＤｈｋ（４３００塩基対）量： ０．３５ｍｇ
重鎖： ｐ５Ａ１０ＶＨｈＤｈＩｇＧ１（４９００塩基対）量： ０．６０ｍｇ
ＤＮＡ量は最適化されなかった。

【0177】

トランスフェクション剤：専売（しかしながら、Ｘｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、及びリン酸カルシウムなどの好適な市販のトランスフェクション剤は、容易に入手可能である）。
全体的収率：１５ｍｇ（７．５ｍｇ／Ｌ）。

【0178】

実施例３−ｈ５Ａ１０の特性評価：親和性
研究の目的
この研究の目的は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の技術を使用することによって、抗体５Ａ１０の８つのバリアントと、抗原ＰＳＡとの間の結合速度論を調査することであった。

【0179】

タンパク質試料（抗体及び抗原）の品質を調査するために、ＳＰＲ実験前にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動させた。

【0180】

事前研究において、異なるパラメータを調査して、この研究における実験の適切な条件を見出した。

【0181】

研究において、８つの抗体及び抗原について、複数の結合測定を実行した。回収されたデータから、会合及び解離速度定数（ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆ）ならびに解離定数（ＫＤ）を計算し、本明細書に報告した。

【0182】

試薬及び機器の情報
以下の８つの抗体及び１つの抗原の溶液は、Ｄｉａｐｒｏｓｔ ＡＢによって提供された。
●ＰＳＡ １６９μｇ／ｍｌ
●ｍ５Ａ１０（１４１２０３） １ｍｇ／ｍｌ
●ｍ５Ａ１０（１４０９０５） ４μＭ
●ｍ５Ａ１０−ＤＦＯ（１４０９０５） ４μＭ
●ｍ５Ａ１０−ＤＯＴＡ（１４０９０５） ４μＭ
●ｍ５Ａ１０−ＤＴＰＡ（１４０９０５） ４μＭ
●ｈ５Ａ１０（１４１２０３） １ｍｇ／ｍｌ
●ｈ５Ａ１０−ＤＦＯ（１４１２０３） ２ｍｇ／ｍｌ
●ｈ５Ａ１０−ＤＴＰＡ（１４１２０３） １ｍｇ／ｍｌ
●ｈ５Ａ１０−ＤＯＴＡ（１４１２１１） ２．５μＭ
全ての試料をアリコートに分け、分析前に−２０℃の冷凍庫内で保持した。

【0183】

全ての結合実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で、ＣＭ４チップ上で実行した。活性化、固定化、不活性化、結合、及び再生に必要とされたチップ及び全ての試薬は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入し、製造者のガイドラインに従って使用した。

【0184】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ａ）実験の記述
Ｄｉａｐｒｏｓｔ ＡＢによって提供された試薬を、製造者のガイドラインに従って、ＮｏｖｅｘからのＴＲＩＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅの１０〜２０％のアクリルアミドゲル上に泳動させた。

【0185】

２連のタンパク質試料（天然及び還元）を、標準試料とともに、同一のゲル上で同時に泳動させた。

【0186】

天然の連の各試料は、１〜１．３μｇのタンパク質、ＴＲＩＳ緩衝剤（ｐＨ７．４）、ＳＤＳ、及び充填緩衝剤を含有した。

【0187】

還元の連の各試料は、１〜１．３μｇのタンパク質、ＴＲＩＳ緩衝剤（ｐＨ７．４）、ＳＤＳ、充填緩衝剤、及び０．０４体積％のベータ２−メルカプトエタノール（還元剤）を含有した。

【0188】

ゲルの染色を、酢酸、エタノール、及び水（０．７、３．０、６．３の対応する割合）のクーマシーブリリアントブルー溶液中で実行した。

【0189】

ゲルの脱染を、酢酸、エタノール、及び水（０．７、３．０、６．３の対応する割合）の溶液中で実行した。

【0190】

（ｂ）結果及び結論
これらの結果から、抗体及び抗原試料は高品質かつ高純度のものであることが明らかである（結果示さず）。

【0191】

親和性研究
（ａ）以下に記載される条件を使用して、相互作用の親和性を決定するために、２つの実験を実行した。

【0192】

ＣＭ４上での抗原の固定化。

【0193】

ＥＤＣ及びＮＨＳ混合物を使用したアミンカップリングについての製造者のガイドラインに従って、チップＣＭ４−１の活性化を実行した。

【0194】

３．００μｇ／ｍｌの抗原ＰＳＡ（１０ｍＭのＮａＡｃ緩衝剤（ｐＨ３．８）中に希釈したＰＳＡストック溶液）を含有する溶液を、チップＣＭ４−１上のチャネルｆｃ２〜４に流動させて、抗原をチップに固定化した。流量：５μｌ／分、体積：２００μｌ。
標的ＲＵ≦Ｍ_Ｗ／１０ Ｍ_Ｗ（ＰＳＡ）＝３００００Ｄａ 標的ＲＵ（ＰＳＡ）≦３０００チャネルｆｃ１を、ブランクとして使用した。

【0195】

第１の実験において、以下の固定化を達成した。
ｆｃ２＝１４５０ＲＵ ｆｃ３＝８５０ＲＵ ｆｃ４＝９００ＲＵ
第２の実験において、以下の固定化を達成した。
ｆｃ２＝１３２５ＲＵ ｆｃ３＝８９０ＲＵ ｆｃ４＝１０６０ＲＵ
活性化及び固定化の後、全てのチャネル（ｆｃ１〜４）を、エタノールアミンによって遮断した。

【0196】

これらのデータは、３．００μｇ／ｍｌの抗原を使用して、適切な固定化が達成されたことを実証する。

【0197】

（ｂ）会合相の調査
各抗体の４つの異なる濃度の溶液（ＨＳＰ緩衝剤中に希釈したストック溶液）を、チップＣＭ４−１上のチャネルｆｃ２〜４に３０μｌ／分の流量で流動させた時、チップＣＭ４−１に対する８つの抗体の会合相を５分間続けた。

【0198】

調査した各抗体の濃度は、１００、５０、２５、及び１２．５ｎＭであった。

【0199】

更に、解離プロセスを８時間続けた実験から、会合データを得た。

【0200】

合計で、各抗体について、３〜９つの個々の会合実験を実行した。

【0201】

ブランクｆｃ１からのシグナルを、全てのデータから減算した。

【0202】

我々は、５分後、会合プロセスのデータを適合することができることを見出した。

【0203】

（ｃ）解離相の調査
抗体のそれぞれについて、解離相を８時間続けた。

【0204】

ブランクｆｃ１からのシグナルを、解離速度定数の計算に使用した全てのデータにおいて減算した。

【0205】

データは、解離プロセスが非常に緩徐であることを示す。

【0206】

（ｄ）解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）の推定
解離相データを適合し、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を推定した（表１を参照されたい）
。

【0207】

（ｅ）会合速度定数（ｋ_ｏｎ）の推定
会合速度定数を推定するために、解離速度定数（表１）を適合した等式において使用した。

【0208】

（ｆ）解離定数（ｋ_Ｄ）の推定
試験した抗体のそれぞれの解離定数（Ｋ_Ｄ）を、表１に示す。

【表1】

【0209】

８つ全ての抗体について、解離定数（Ｋ_Ｄ）は、１０^−１１Ｍ範囲内である。

【0210】

統計学的に有意ではないものの、ヒト化抗体の解離定数は、親マウス抗体の解離定数よりも高いようである。

【0211】

Ｋ_Ｄは有意には変化していないため、ヒト化抗体のコンジュゲーションは親和性には著しくは影響を与えないようである。

【0212】

要約
●全ての抗体について、会合プロセスは非常に高速であり、３〜９回の各抗体の実験に基づいて、会合速度定数（ｋ_ｏｎ）は全て１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の範囲内である。
●解離プロセスは非常に緩徐であり、ほぼＢｉａｃｏｒｅの技術的な限界の範囲内である。３〜９回の各抗体の実験に基づいて、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）は全て１０^−６ｓ^−１の範囲内である。
●全ての抗体について、解離定数（Ｋ_Ｄ）は１０^−１１Ｍの範囲内である。

【0213】

実施例４−ｈ５Ａ１０の特性評価：凝集
全体の要約
ＩｇＧの６つのバリアントに、動的光散乱（ＤＬＳ）研究を実行して、それらの凝集傾向を研究した。ＤＬＳ結果は、全ての構築物が妥当な大きさ（球状タンパク質想定して、２００ｋＤａまたはわずかに２００ｋＤａ超）を有し、凝集をほとんどまたは全く有さないことを示す。

【0214】

目的
動的光散乱を使用して、６つのＩｇＧ構築物をオリゴマー状態に関して特性評価すること。

【0215】

結果
動的光散乱
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＡＰＳ装置を使用して、２０℃、２連の試料で動的光散乱を測定した。各試料を３回測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤（顧客より）を対照として使用して、緩衝剤が粉塵及び凝集体を妥当に含まないことを確実にした。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝剤中の凝集体の信頼できる測定は行うことができず、これは良いことであった（緩衝剤は凝集体を含まないべきであるため）。数分布関数を使用して、全ての試料を確実に測定することができた。最も豊富な種の平均半径を、その種の多分散とともに計算した。その種の平均質量分布もまた計算した（表２を参照されたい）。

【表2】

【0216】

完全な球状の形状を有するタンパク質の場合、５．７ｎｍの半径は、約２００ｋＤａの分子量に対応する。完全な球状の形状を有するタンパク質の場合、６．１ｎｍの半径は、約２３０ｋＤａの分子量に対応する。これは、ＩｇＧ分子の１５０ｋＤａの分子量に妥当に近く、これは、試料のほとんどが主に単量体及び／または二量体ＩｇＧ分子からなることを意味する。二量体を排除しない理由は、光散乱が分子形状に基づいて大まかなサイズ推定をもたらし、これにより単量体と二量体との分離は困難となるが、単量体からの大きな凝集体の分離が容易となるためである。１ｋＤａ未満の小さな粒子は、全てのマウスＩｇＧ試料中に見出された。これらの粒子は、それらの小さなサイズのため、緩衝剤中に見出される構成成分に属することが想定されるため、それらは、表１では無視した。対照的に、より大きな凝集体の小画分は、全てのヒトＩｇＧにおいて見出されるが、マウスＩｇＧでは見出されなかった。

【0217】

結論
動的光散乱は、全ての構築物が妥当な大きさを有し、凝集をほとんどまたは全く有さないことを示す。６つ全ての構築物のサイズ分布は、重複している。驚くべきことに、緩衝剤様粒子（＜１ｋＤａ）は全てのマウスＩｇＧ試料において見出される一方で、より大きな凝集体はヒトＩｇＧ試料のみにおいて見出される。

【0218】

実施例５−ｈ５Ａ１０の特性評価：インビボ体内分布
この研究は、^１１１Ｉｎで標識した場合の、マウス５Ａ１０とヒト５Ａ１０とのインビボ体内分布を比較する。

【0219】

材料及び方法
ヒト化対応物の抗体ｈ５Ａ１０を、以下に記載されるように産生した。
●抗体：配列番号１２に従う重鎖及び配列番号１３に従う軽鎖を含む、例示的なヒト化モノクローナル抗体５Ａ１０（ＩｇＧ１／カッパ、ＨＥＫ２９３細胞内に一過性発現、実施例２を参照されたい）は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ，Ｌｕｎｄ（ロット番号９０４７５．３３、ＰＢＳ中濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）によって提供された。非特異的ＩｇＧ抗体を、アイソタイプ対照として利用した（マウス血清からのＩｇＧ抗体、Ｓｉｇｍａ Ｉ−８７６５）。

【0220】

コンジュゲーション及び放射性標識
ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡと５Ａ１０とのコンジュゲーション：ＰＢＳまたはＮａＣｌ中のマウス及びヒト化５Ａ１０ｍＡｂの溶液を、０．０７Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してｐＨ９．２に調節した。その後、タンパク質溶液を、３：１のキレート剤対抗体のモル比で、キレート剤ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，ＵＳＡ）と、４０℃で４時間コンジュゲートさせた。反応を終了させ、２０ｍｌの０．２Ｍの酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ５．５）で平衡化したＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ−１１Ｂ６（ＤＴＰＡ−１１Ｂ６）を遊離キレートから分離した。コンジュゲートされた５Ａ１０抗体を１ｍｌの酢酸アンモニウム緩衝剤で溶出させ、２００ｕＬのアリコートに分けた試料を−２０℃で保管した。

【0221】

ＤＴＰＡ−５Ａ１０の放射性標識：酢酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ５．５）中のマウス及びヒト化ＤＴＰＡ−５Ａ１０を、所定の量の^１１１ＩｎＣｌ_３（Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）と混合した。室温で２時間インキュベートした後、標識付けを終了させ、ＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−５カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で精製した。０．２Ｍのクエン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶出する即時薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）（Ｂｉｏｄｅｘ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）によって、標識付け効率及び速度論を監視した。このシステムにおいて、放射性標識されたコンジュゲートは、遊離^１１１Ｉｎの間、元の線に留まる。Ｏｐｔｉｑｕａｎｔ定量化ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を有するＣｙｃｌｏｎｅ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、放射線活性分布を決定した

【0222】

動物研究
インビボ研究について、ｈＫ２を発現する前立腺癌腫細胞株ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を使用した。細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの、１０％のウシ胎仔血清及びＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で補助したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。細胞を、５％のＣＯ_２を有する加湿インキュベーター内で３７℃で維持し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡ緩衝剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離した。ＬＮＣａＰ細胞の異種移植時には、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ−Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用した。

【0223】

実験動物の保護に関する国内法に従い、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌｕｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｗｅｄｅｎ）の承認を受けて、全ての動物実験を実行した

【0224】

生後６〜８週間の雄の免疫不全ヌードマウスＮＭＲＩ−Ｎｕ（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を、この研究に使用した。全てのマウスの左側腹部に、ＬＮＣａＰ細胞（１００μｌの成長培地及び１００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ中、５００〜６００万個の細胞）を皮下異種移植した。異種移植片を、６〜８週間成長させた。

【0225】

ＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像研究
^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０のＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像研究を実行した。撮像中、動物を、２％〜３％のイソフルランガス（Ｂａｘｔｅｒ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で麻酔した。皮下ＬＮＣａＰ異種移植片を有するＮＭＲＩ−ｎｕマウスの尾静脈に、約１３〜１５ＭＢｑ、１００ｕＬのＰＢＳ中５０ｕｇのｍＡｂで、^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０（ｎ＝４）または^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０（ｎ＝４）を静脈内注射した。ＮＳＰ−１０６マルチピンホールマウスコリメータを有する前臨床ＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナ（ＮａｎｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ Ｐｌｕｓ，Ｂｉｏｓｃａｎ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳＡ）を使用することによって、動物を１時間撮像した。注射の１、２、３、及び７日後に、撮像を実行した。ＨｉＳＰＥＣＴソフトウェア（ＳｃｉＶｉｓ；Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＳＰＥＣＴデータを再構築した。各全身ＳＰＥＣＴの前に、ＣＴ撮像を行った。ＩｎＶｉｖｏＳｃｏｐｅ２．０ソフトウェア（ｉｎｖｉＣＲＯ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を分析し、ＣＴ画像を解剖学的基準として使用して、対象領域ＲＯＩを引き出した。

【0226】

体内分布研究
^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０両方の体内分布研究を実行した。マウスの動物（ｎ＝１２）群に、^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０（約３〜４ＭＢｑ、１００ｕＬのＰＢＳ中５０ｕｇのｍＡｂ）または^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０（３〜４ＭＢｑ、１００ｕＬのＰＢＳ中５０ｕｇのｍＡｂ）を静脈内注射した。動物を注射の７日後に屠殺し、対象器官を回収し、３インチのＮａＩ（Ｔｌ）検出器（１４８０ＷＩＺＡＲＤ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を有する自動ＮａＩ（Ｔｌ）ウェル計数器で分析した。

【0227】

１グラムの組織当たりの注射用量パーセント（％ＩＡ／ｇ）として表される組織取り込み値を、以下のように計算した。
％ＩＡ／ｇ＝（組織放射線活性／注射放射線活性）／器官重量×１００
式中、静脈内注射の場合、
注射放射線活性＝ シリンジ中の放射線活性
−使用後のシリンジ中に残された放射線活性
−尾部の放射線活性
であった。器官はまた、解剖の後にも秤量した。バックグラウンド及び物理的減衰について、データを補正した。

【0228】

結果
ＳＰＥＣＴ／ＣＴ撮像
^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０注射の最大７日後にスキャンしたＬＮＣａＰ異種移植片の代表的なＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像を、図１及び２に示す。活性は、２４時間以内までにＬＮＣａＰ腫瘍内に急速に蓄積し、放射線活性は、注射の７日後、高いままである。活性の高い蓄積はまた、肝臓内でも検出された。ＲＯＩ分析は、対側脚の腫瘍対軟部組織の比率が、注射の７日後、^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０の場合は５．２±０．８４、及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の場合は６．４±１．３であることを示した。

【0229】

体内分布
異なる器官における活性蓄積をより徹底的に調査するために、より多くの数の動物（１つの抗体当たりｎ＝１２）においてエキソビボ体内分布を実行した。

【0230】

経時的な^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の腫瘍対対側比を、図３に示す。予想外に、この比率は、「親」マウス抗体の場合よりも、ヒト化抗体の場合で著しくより高いことが観察された。

【0231】

経時的な^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の腫瘍対肝臓比を、図４に示す。再び、予想外に、この比率は、「親」マウス抗体の場合よりも、ヒト化抗体の場合で著しくより高いことが観察された。

【0232】

^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０及び^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の体内分布データを、図５に示す。

【0233】

マウス、及びＬＮＣａＰ異種移植片を有するＮＭＲＩマウス内のヒト化５Ａ１０の体内分布は、７日目で高度の腫瘍蓄積を示した一方で、骨、筋肉などの他の器官における蓄積は、より一層低かった。

【0234】

ヒト化^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｈ５Ａ１０の体内分布データと、親マウス抗体（^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ｍ５Ａ１０）の体内分布データとの比較は、予想外かつ有利な差異を明らかにした。腫瘍蓄積は、マウスの場合よりもヒト化の場合で有意により一層高く、注射の７日後、ｍ５Ａ１０の２．７±０．７５％ＩＡ／ｇ（ｐ＜０．００１）と比較して、ｈ５Ａ１０の場合では７．４±１．４％ＩＡ／ｇであった（図６）。他の器官における放射線活性の蓄積は、両方の抗体の場合でおよそ同一のレベルであり、これにより、腫瘍対器官比は、親マウスｍ５Ａ１０よりもヒト化ｈ５Ａ１０でより一層高いものとなった（表３）。

【表3】

【0235】

結論及び考察
この研究の結果は、以下のことを実証する。
●ヒト化５Ａ１０抗体^１１１Ｉｎ−ｈ５Ａ１０が、インビボで前立腺腫瘍を効果的に標的とすること、
●ヒト化ｈ５Ａ１０抗体が、そのマウス抗体よりも予想外に良好な腫瘍蓄積を呈すること、及び
●ヒト化ｈ５Ａ１０抗体が、マウス抗体よりも（より高い腫瘍対器官比によって示される）良好な撮像対比を提供すること。

【0236】

まとめると、これらの発見は、診断におけるヒト化５Ａ１０抗体のより良好な標的特性、及び前立腺癌の治療におけるより良好な治療有効性の可能性についての説得力ある証拠を提供する。

【0237】

実施例６−放射性核種療法の線量測定計画及び患者における前立腺癌治療
放射性核種療法（ＲＮＴ）の場合、放射線源は全体的に分布しており、放射線活性は通常放射性医薬品として全身投与される。放射線活性分布は、経時的に異なる組織内に蓄積する放射性医薬品の量（患者間で異なるものである）に依存する（１）。

【0238】

ＲＮＴ治療は、処方された吸収線量に基づくべきである（２）。その後、まずトレーサー量の放射性医薬品を使用して、治療前研究を実行し、腫瘍及び器官吸収線量を決定するべきである。通常、この情報は、ｍＧｙ／ＭＢｑ；Ｄ^Ｐ_Ｔ（器官）の単位での、１投与活性単位当たりの器官吸収線量を記載する因子として表される。

【0239】

その後、類似した条件下で治療投与が与えられる場合、この因子を使用して、所与の器官、組織、または腫瘍に処方された吸収線量を送達するために投与の必要がある活性を決定することができる（４，６）。

【0240】

放射性標識ｈ５Ａ１０抗体による前立腺癌治療の場合、治療前研究は、^１１１Ｉｎ−ｈ５Ａ１０による^１１１Ｉｎ撮像に基づくべきである。^１１１Ｉｎは、その後、^１７７Ｌｕが治療放射性核種となる場合、定量的（平面／ＳＰＥＣＴ）撮像に最も好適である。その後、Ｄ^Ｐ_Ｔ（器官）が決定されると、処方された治療効果を与える治療活性Ａ_Ｔで治療が与えられ得る。治療中、活性分布及び対応する線量率は、撮像に基づいて計算して、治療の評価に必要な、腫瘍及び正常器官に与えられる実際の治療吸収線量を得るべきである。

【0241】

治療計画の結果として骨髄毒性レベルに達している治療の場合、骨髄支持が必要であり、その骨髄腔の線量測定計算に基づいて、幹細胞の再注入の時間が決定されなくてはならない。

【0242】

要約すると、以下の治療スキームがそれに合うように計画されるべきである。
治療前線量測定研究
１．^１１１Ｉｎ−標識ｈ５Ａ１０（２００〜３００ＭＢｑ）注射
２．採血−血液及び血漿中の活性濃度を第１週目に決定
３．少なくとも１週間にわたる撮像（ＳＰＥＣＴ／平面）（３〜５回）
４．ＬｕｎｄａＤｏｓｅスキーム（３）または同等のプログラムに基づく器官線量測定
５．骨髄（２〜３Ｇｙ）、腎臓（２０〜３０Ｇｙ）、及び肝臓（１２〜３６Ｇｙ）などの放射線感受性器官に対する特定の吸収線量によって限定される治療活性を決定。
治療内線量測定を含む治療
１．^１７７Ｌｕ−標識ｈ５Ａ１０を（治療前線量測定に基づいて）投与
２．採血−血液及び血漿中の活性濃度
３．少なくとも１週間にわたる撮像（３〜５回）
４．ＬｕｎｄａＤｏｓｅスキーム（３）または同等のプログラムに基づく器官線量測定＝＞処方された治療吸収線量の検証。

【0243】

線量測定についての具体的な解説
累積活性は、一定器官にわたって所与の領域内で発生する減衰の数である。単位は、Ｂｑ ｓまたはＢｑ ｈである。イオン化放射線が物質を通って移動するとき、それは相互作用し、エネルギーを付与する。与えられたエネルギーは、所与の体積における全てのエネルギー付与の合計である。吸収線量は、与えられたエネルギー対その体積の質量の比率である。吸収線量の単位はグレイ（Ｇｙ）であり、１Ｇｙは１Ｊ／ｋｇに等しい。

【0244】

異なる時間での組織内の活性の値から、積分によって累積活性が決定され、吸収線量が決定され得る。活性測定は、器官全体の線量測定の平面撮像を使用して行われる。定量的ＳＰＥＣＴ／ＣＴは、ボクセルに基づく方法を使用して、より小さな体積での線量測定を可能にする。

【0245】

活性濃度値の３Ｄ分布から、組織内に位置する点源周辺のエネルギー付与パターンを記載する、いわゆる点用量カーネルまたはボクセルＳ値を使用して、吸収線量率分布が計算され得る。この方法は、解剖学的領域（体躯内の軟部組織など）が密度に関して均一であることを想定する。肺内のように、密度が不均一である身体領域の場合、直接的Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ計算が好ましい。ここで、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴによる活性分布を、Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ用量計算コードへの入力として使用する。

【0246】

参考文献
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Ｇａｒｋａｖｉｊ Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｎｉｃｋｅｌ Ｍａｔｔｉａｓ，Ｓｊｏｇｒｅｅｎ−Ｇｌｅｉｓｎｅｒ Ｋａｔａｒｉｎａ，Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｏｈｌｓｓｏｎ Ｔｏｍａｓ，Ｗｉｎｇａｒｄｈ Ｋａｒｉｎ，Ｓｔｒａｎｄ Ｓｖｅｎ−Ｅｒｉｋ，Ｔｅｎｎｖａｌｌ Ｊａｎ．
Ｃａｎｃｅｒ２０１０：１１６（４Ｓｕｐｐｌ）：１０８４−９２．
６．Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ［（９０）Ｙ］ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ ｏｒ［（１３１）Ｉ］ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ Ｓｊｏｇｒｅｅｎ−Ｇｌｅｉｓｎｅｒ Ｋ．，Ｄｅｗａｒａｊａ ＹＫ．，Ｃｈｉｓｅａ Ｃ．，Ｔｅｎｎｖａｌｌ
Ｊ．，Ｌｉｎｄｅｎ Ｏ．，Ｓｔｒａｎｄ ＳＥ，Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ Ｍ．．Ｑ Ｊ
Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，２０１１Ａｐｒｉｌ；５５（２）：１２６−５４．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]