特許 6918320 増殖方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6918320

(24)【登録日】2021年7月27日

(45)【発行日】2021年8月11日

(54)【発明の名称】増殖方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/00 20060101AFI20210729BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20210729BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20210729BHJP

   A61K 39/145 20060101ALN20210729BHJP

   A61P 31/16 20060101ALN20210729BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/00ZNA

   C12N7/02

   !C07K7/06

   !A61K39/145

   !A61P31/16

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-19900(P2020-19900)

(22)【出願日】2020年2月7日

(65)【公開番号】特開2021-94007(P2021-94007A)

(43)【公開日】2021年6月24日

【審査請求日】2020年7月2日

(31)【優先権主張番号】特願2019-24777(P2019-24777)

(32)【優先日】2019年2月14日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2019-226747(P2019-226747)

(32)【優先日】2019年12月16日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大西 慎太郎

(72)【発明者】

【氏名】森 卓也

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 隆

(72)【発明者】

【氏名】紅林 佑希

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−３２０２７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２２５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Cell Death and Differentiation，２００９年，Vol. 16，pp. 312-320

【文献】 International Journal of Molecular Sciences，２０１８年，Vol. 19，Article No. 712

【文献】 Journal of Virology，２００９年，Vol.83, No.16，pp.8233-8246

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ｃ０７Ｋ ７／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含み、宿主が培養細胞又は発育鶏卵であり、Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程がＫｕ７０タンパク質とＢａｘとの結合を阻害するＢａｘ阻害剤を前記宿主に添加する工程である、方法。

【請求項2】

Ｂａｘ阻害剤がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、請求項１記載の方法。

【請求項3】

請求項１又は２記載の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、宿主からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。

【請求項4】

前記ウイルス粒子がインフルエンザワクチン調製に用いられるものである、請求項３記載の方法。

【請求項5】

Ｂａｘ阻害剤を有効成分とするインフルエンザウイルス増殖促進剤であって、Ｂａｘ阻害剤がＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号４）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号８）から選ばれるペプチドである、インフルエンザウイルス増殖促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は宿主におけるインフルエンザウイルスの増殖方法に関する。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症であり、飛沫感染や接触感染等により感染し、高熱、頭痛、筋肉痛、関節痛等の強い全身症状を伴う呼吸器感染症である。インフルエンザワクチンの接種はインフルエンザの重症化の防御に最良の手段となっている。

【0003】

インフルエンザワクチンは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵の尿膜腔内に接種して培養増殖させ、漿尿液から遠心にて濃縮精製し、ウイルス粒子を界面活性剤等で処理し、ホルマリンで不活化した全粒子ワクチン又はウイルス粒子をエーテルや界面活性剤で破砕後更に精製を行ったスプリットワクチン又はサブユニットワクチンである。しかしながらインフルエンザワクチンを、宿主として胚を有する鶏卵を用いて製造する場合、時間、労働及び費用を要し、急な大量生産ができないという供給安定性の面で問題がある。

【0004】

これに替わるウイルス生産方法として、インフルエンザウイルスの宿主として培養細胞を用いて複製する手法が研究され、ＭＤＣＫ細胞がインフルエンザウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製のための適切な細胞であることが報告されている（非特許文献１）。また、特許文献１には、ＭＤＣＫ細胞の培養液中に分泌されるトリプシンインヒビターを除去又は低減した後に、細胞にインフルエンザウイルスを接種して、インフルエンザウイルス接種細胞を培養することによりウイルス生産量を増加できることが開示されている。

【0005】

また、非特許文献２には、トリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７））が、生体防御機能（アポトーシス）を利用して核外へ輸送され、効率的に増えることが開示され、インフルエンザウイルスの増殖には、培養細胞のアポトーシスが関与することが示唆されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２００７／１３２７６３号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Med Microbiol Immunol (1975)162,9-14

【非特許文献2】THE EMBO Journal(2003)22,2717-2728

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明はワクチンの材料となるインフルエンザウイルスを、宿主中でより効率よく増殖させる方法を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、インフルエンザウイルスを感染させる宿主において、アポトーシス促進タンパク質として知られるＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制してアポトーシスを抑制した場合に、既報とは異なり、ウイルスの増殖性が向上し、ウイルスの産生量が増加することを見出した。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）宿主においてインフルエンザウイルスを増殖する方法であって、宿主細胞のＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程を含む、方法。
２）１）の方法によってインフルエンザウイルスを増殖させ、宿主からウイルス粒子を回収する、インフルエンザウイルス粒子の調製方法。
３）Ｂａｘ阻害剤を有効成分とするインフルエンザウイルス増殖促進剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを効率よく増殖でき、ワクチン調製のためのインフルエンザウイルスを大量生産することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】様々なＢａｘ阻害剤濃度条件におけるインフルエンザウイルスＨＡ価。

【図2】Ｂａｘ阻害条件における時間依存的なインフルエンザウイルスＨＡ価。

【図3】Ｂａｘ阻害条件におけるインフルエンザウイルス増殖性亢進効果。

【図4】Ｂａｘ阻害剤低濃度条件におけるインフルエンザウイルスＨＡ価。

【図5】Ｂａｘ阻害剤低濃度条件におけるインフルエンザウイルス増殖促進効果。

【図6】Ｂａｘ阻害剤濃度条件におけるＢ型インフルエンザウイルスＨＡ価。

【図7】Ｂａｘ阻害剤濃度条件におけるＢ型インフルエンザウイルス増殖促進効果。

【図8】Ｂａｘ阻害条件におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果（発育鶏卵）。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明において、インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型のいずれでも良いが、Ａ型及びＢ型を好適に例示することができる。
また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（赤血球凝集素 ＨＡ：ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の型（ＨＡ型）とノイラミニダーゼの型（ＮＡ型）も特に制限されない。例えば、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ５Ｎ２株、Ｈ７Ｎ７株、Ｈ７Ｎ９株、Ｈ９Ｎ２株等の現在知られている亜型の他、将来単離・同定される亜型も包含される。

【0014】

また対象となるウイルスは、ヒトに感染できるものであればよく、他にブタやトリ、ウマ、ウシへの感染能力を有するウイルスでもよい。

【0015】

また、本発明のインフルエンザウイルスは、感染動物や患者等の感染個体から単離された株であってもよく、遺伝子工学的に培養細胞で樹立された組換えウイルスであってもよい。

【0016】

本発明において、「Ｂａｘ」とは、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するアポトーシス促進タンパク質を指す。Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質はＢＨ（Ｂｃｌ−２ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインと呼ばれるアミノ酸配列を１つ以上有している。また、Ｃ末端側に疎水性の高いＴＭ（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）領域を有しているため、ミトコンドリア膜上に移行し、アポトーシスを制御することが可能となる。

【0017】

Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の主要機能は、ミトコンドリアの透過性を調節することによるアポトーシスの制御である。抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬはミトコンドリアの外壁に存在し、シトクロムｃの放出を阻害する。アポトーシス促進性のタンパク質であるＢａｄ、Ｂｉｄ、Ｂａｘ及びＢｉｍは細胞質に存在し、細胞死のシグナルによりミトコンドリア内膜へと移動し、そこでシトクロムｃの放出を促進する。細胞外へ流出したシトクロムｃはＡｐａｆ−１と複合体を形成し、カスパーゼ９を活性化、さらにカスパーゼ３、６、７を活性化することでアポトーシスが起こると考えられている（Annu Rev Genet (2009)43:95-118）。

【0018】

本発明において、「Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行の抑制」とは、ウイルス感染から放出の過程で細胞内に生じるシグナル伝達に起因する、Ｂａｘの細胞質からミトコンドリア内膜への移行を抑制することを意味する。

【0019】

抑制手段としては、宿主の細胞質に存在するＢａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制可能であれば、特に限定されない。例えばＢａｘと相互作用してＢａｘのミトコンドリア移行を抑制する分子（「Ｂａｘ阻害剤」と称する）を当該細胞に適用すること、細胞質内に存在するＢａｘを遺伝子工学的に低減すること等が挙げられるが、好適には、Ｂａｘ阻害剤の使用である。すなわち、本発明において、Ｂａｘ阻害剤は、宿主の培養によってインフルエンザウイルスを増殖させるためのインフルエンザウイルス増殖促進剤であると云え、宿主の培養によってインフルエンザウイルスを増殖させるために使用できる。また、Ｂａｘ阻害剤はインフルエンザウイルス増殖促進剤を製造するために使用することができるとも云える。

【0020】

Ｂａｘ阻害剤としては、好適には、Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行に必要なＫｕ７０タンパク質とＢａｘとの結合を阻害するペプチドや化合物が挙げられ、例えばBiochem Biophys Res Commun (2004)321:961-966）やNat Cell Biol (2003)5:352-357）に記載のペプチドが挙げられる。
具体的には、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号３）、及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号４）が挙げられるが、この他にもＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号５）、Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号６）、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号７）、及びＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ（配列番号８）等が挙げられる。

【0021】

斯かるＢａｘ阻害剤におけるＢａｘ阻害効果は、例えば、ＢａｘとＫｕ７０タンパク質との結合阻害活性を測定することにより評価できる。また、Ｂａｘ阻害剤を添加した条件において、当該細胞へアポトーシスを誘導し、そのアポトーシス細胞の割合を評価することにより評価できる。

【0022】

Ｂａｘ阻害剤は、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型）を増殖させるための宿主に対して、濃度１μＭ以上、好ましくは５μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上で、且つ１０００μＭ以下、好ましくは５００μＭ以下、より好ましくは２００μＭ以下、また、１〜１０００μＭ、好ましくは５〜５００μＭ、より好ましくは１０〜２００μＭで使用される。

【0023】

インフルエンザウイルスの増殖は、具体的には、宿主中にインフルエンザウイルスを感染させる工程、及び当該感染宿主をウイルスが複製可能な条件下で培養する工程により行われるが、本発明においては、Ｂａｘのミトコンドリア内膜への移行を抑制する工程が、例えばウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に行われる。好適には、Ｂａｘ阻害剤をウイルス感染前、ウイルス感染後、又はウイルス感染と同時に宿主に添加することが挙げられる。

【0024】

インフルエンザウイルスの増殖に用いられる宿主としては、培養細胞又は発育鶏卵の何れでもよいが、供給安定性の面から培養細胞を用いるのが好ましい。
培養細胞としては、インフルエンザウイルスに感受性であれば如何なる細胞も使用できる。このような細胞として、例えば、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６（ヒト網膜細胞由来の株化細胞）、ＳＫ−ＮＥＰ−１細胞（ヒト腎臓由来の株化細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、Ｄｕｃｋ ｅｍｂｒｙｏ細胞（アヒル胚細胞）が挙げられる。これらの細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれＣＣＬ−３４、ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−１０７、ＨＴＢ−４８、ＣＣＬ−１８５、ＣＣＬ−１４１等として登録されており、また、市販で購入することができる。また、インフルエンザウイルスに感受性を示すニワトリ由来の細胞として、ＣＥＦ細胞（Ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ： ニワトリ胚由来線維芽細胞）が使用できる。なお、ＣＥＦ細胞には単離された細胞以外に発育鶏卵中に存在する細胞も含まれる。この他、インフルエンザウイルスの増殖には、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させるために開発された細胞株を用いることもできる。斯かる細胞株としては、例えばＥＢ６６（登録商標）、ＤｕｃｋＣｅｌｔ−Ｔ１７（登録商標）、ＥＢｘ（登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0025】

宿主として培養細胞を用いる場合、細胞を培養するための培地としては、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）、無血清培地（Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）等が挙げられるが何れを使用しても良い。

【0026】

当該培地には、細胞の増殖効率を上げるために、非必須アミノ酸やＬ−グルタミンを添加することができる。また、インフルエンザウイルスの培養においては、ヘマグルチニンの開裂を促す目的でトリプシンやアセチル化トリプシン等のプロテアーゼを添加することができる。また、微生物のコンタミネーションを避けるために、ペニシリンやストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の細胞培養に一般的に使用される抗生物質を添加してもよい。培地のｐＨは、適当な緩衝液（例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ）で動物細胞の増殖に適した６．５〜８、好ましくは、６．８〜７．３に調整される。

【0027】

細胞培養の方法としては、培養器の底に細胞を付着させた静止培養、細胞を培地中に浮遊させて培養する浮遊培養が挙げられるが、工業生産レベルで行なうときは、浮遊培養が好ましい。浮遊培養の方法としては、マイクロキャリアなどの担体に細胞を付着させてこれを浮遊させて培養する方法又は担体を用いずに細胞を浮遊させて培養する方法等が挙げられるが、何れの方法を用いても良い。

【0028】

細胞培養物（培養した細胞と培地の混液）は、そのままインフルエンザウイルスの接種に使用することできるが、インフルエンザウイルスの接種に際しては、新鮮な培地又は適当な緩衝液、例えば、ＰＢＳ、トリス緩衝液により細胞の洗浄が行なわれることが好ましい。
具体的には、スピナ−フラスコ等で培養増殖した細胞を低速遠心又は膜ろ過し、細胞と培養上清に分離し、遠心沈渣又は膜ろ過濃縮液の細胞に新鮮培地を加え、細胞を懸濁することにより培地交換が行われる。

【0029】

斯くして得られる細胞培養物に、インフルエンザウイルス液が添加され、一定条件下で培養が行なわれる。ウイルス培養開始時の初期細胞密度は０．００１〜１００×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬを用いることができるが、好ましくは０．０１〜１０×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜１０×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。なお、細胞密度の測定は、血球計算盤等による一般的な方法に従って行えばよい。細胞培養物に添加されるインフルエンザウイルス液は、感染価ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．００００１〜１０となるように添加できるが、好ましくは０．０００１〜０．１、より好ましくは０．０００１〜０．０１で添加することができる。

【0030】

また、宿主として発育鶏卵を用いる場合、３３℃〜３８℃、好ましくは３５〜３７℃、湿度条件は４０〜６０％、好ましくは４５〜５５％の条件で孵卵し、１日に１〜２４回、好ましくは４〜１２回の転卵を行うことで発育させた鶏卵を用いることができる。発育８−１３日目の鶏卵を用いインフルエンザウイルスを感染させることができるが、好ましくは１０−１２日目の鶏卵に感染させることができる。感染させるウイルス量は、５０％鶏卵感染用量（５０％Ｅｇｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｄｏｓｅ; ＥＩＤ_５０）で１〜１×１０^６ ＥＩＤ_５０／Ｅｇｇを感染させることができるが、好ましくは１×１０^２〜１×１０^５ＥＩＤ_５０／Ｅｇｇ、より好ましくは１×１０^３〜１×１０^４ ＥＩＤ_５０／Ｅｇｇを感染させることができる。感染部位は鶏卵の漿尿膜内（尿膜腔液中）が望まれるが、羊膜内（羊水中）であっても良く、鶏卵中でインフルエンザウイルスが増殖する部位であれば限定されない。

【0031】

培養条件は、宿主内でインフルエンザウイルスが増殖可能な条件であればいかなる条件であってもよい。細胞の種類、ウイルス接種量及び培養スケール・方法等の組み合わせにより適切に調節される。例えば、宿主として培養細胞を用いる場合、培養温度は、３３℃〜３９℃、好ましくは３４〜３８℃、培養期間は、１〜１０日間、好ましくは３〜７日間、炭酸ガス濃度は３〜８％、好ましくは４〜５％、酸素濃度は、１７〜２５％、好ましくは２０〜２２％が使用される。
また、宿主として発育鶏卵を用いる場合、感染後は３３℃〜３８℃、好ましくは３４〜３６℃、培養期間は１〜５日間、好ましくは２〜４日間、湿度条件は４０〜６０％、好ましくは４５〜５５％の条件で培養されるが、ウイルス株によって増殖性が最も高まる条件は異なるため、培養期間、培養温度、湿度等は適切に組み合わせることができる。

【0032】

本発明の方法によれば、インフルエンザウイルスを効率的に増殖させることができる。なお、宿主中のウイルス含量は、モルモット等の赤血球を用いた赤血球凝集法（希釈倍数）やヘマグルチニンに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（μｇ／ｍＬ）、ウイルス感染価を測定するプラークアッセイやＴＣＩＤ_５０、ウイルスＲＮＡ量を測定できるリアルタイムＰＣＲ等により測定することができる。

【0033】

インフルエンザウイルスは、宿主が発育鶏卵の場合は尿膜腔液（漿尿液）または羊水中に含まれており、宿主が培養細胞の場合は培養上清に含まれる。培養終了後、宿主中のウイルス浮遊液からウイルス粒子が回収され、濃縮、精製及び不活化することにより、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチン用のウイルス粒子を調製することができる。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、濃縮及び精製後にインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製することができる。

【0034】

ウイルス粒子の回収は、ウイルス浮遊液を清澄化すること、具体的には遠心分離又は濾過することにより行われ、次いで、濃縮のために、限外濾過が行われる。ウイルスの精製は、ショ糖密度勾配遠心分離等の超遠心分離や液体クロマトグラフィー等の手段を用いて行うことができる。精製ウイルス液は、不活化全粒ワクチンや不活化スプリットワクチンの場合、ホルマリン処理、紫外線照射、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン等により、不活化処理される。生ワクチンや弱毒化生ワクチンとして用いる場合は、上記精製ウイルス液をインフルエンザワクチン用のウイルス粒子として調製される。

【0035】

斯かるインフルエンザウイルス粒子に、適宜医薬として許容され得る担体（緩衝剤、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムゲル）等を添加し、各種剤型のワクチンを調製することができる。

【実施例】

【0036】

実施例１ イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞）を用いたウイルスの増殖性評価試験
（１）ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来細胞株、ＤＳファーマバイオケミカル社より入手）を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製）にて３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。上記ＭＤＣＫ細胞を２４ウェルプレートに播種し、コンフルエントの状態で試験に用いた。上述の２４ウェルプレートに播種したＭＤＣＫ細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏ社製）を４００μＬ／ウェルで添加し、１時間馴化させた。

【0037】

（２）上記細胞にＡ型インフルエンザウイルスであるＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／１９７１）、及びＨ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザウイルス株（Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３０／２００９）を感染価ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした。その後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）；ＴＯＣＲＩＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を０−２００μＭ濃度で添加した２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭ培養培地を５００μＬ／ウェル量加え、２３時間培養した。感染２４時間後に培養上清を回収し、後述のＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図１）。なお、以降の実験においてインフルエンザウイルスの増殖性を評価する試験では、２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン含有ＳＦＭ培養培地をインフルエンザウイルスの培養に用いた。

【0038】

（３）ＨＡアッセイ
Ｕ底９６ウェルプレートを用い、インフルエンザウイルス培養上清５０μＬを２−１０２４倍まで２倍ずつ、希釈系列を作製した。そこへ、０．７％モルモット赤血球含有ＰＢＳ ５０μＬを加え、４℃で２時間静置した。その後、赤血球の凝集を確認し、凝集が認められない希釈濃度をＨＡ価とした。

【0039】

（４）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。

【0040】

実施例２ Ｂａｘ阻害剤添加による様々なタイムポイントにおけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例1と同様に、ＭＤＣＫ細胞をＳＦＭで１時間馴化させた後、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザウイルス株を感染価ＭＯＩ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５））を１００μＭ濃度で添加し、２０−４７時間培養した。感染後２１時間、２４時間、４８時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図２）。
本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は培養の早い段階から、インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。

【0041】

（２）また、感染後２１又は２４時間の培養上清を用い、培養液中のインフルエンザウイルス量を、後述するフォーカスアッセイにより定量した（図３）。
１）フォーカスアッセイ
１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。感染後２１又は２４時間で回収したインフルエンザウイルス培養上清を１００−１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養しているＭＤＣＫ細胞に１ｍＬ／ウェルで添加し１時間インキュベートすることで、インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、１．２％−セオラス（旭化成ケミカルズ，ＲＣ５９１）及び２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、３０時間培養した。培養後、ウェルを４℃に冷やしたＰＢＳで３回洗浄後、−２０℃に冷やした１００％メタノール（Ｗａｋｏ社製）を加え、細胞を固定化した。固定化細胞は一次抗体：Ａｎｔｉ−ＮＰ ａｎｔｉｂｏｄｙ（マウスハイブリドーマ（4E6）細胞培養上清：Journal of Virology（2008）82：5940−5950）及び二次抗体：ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ社製）にて反応させ、ＤＥＰＤＡ反応を用いＨＲＰと反応させ、染色されたフォーカス数をカウントした。フォーカスアッセイは独立した三重測定で行い、統計学的な解析はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ（図３及び図５）又は一元配置分散分析（Ｔｕｋｅｙによるその後の検定、図７）を用い、危険率５％を有意水準（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１）とした。

【0042】

２）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のウイルス増殖性亢進効果を示すことが明らかとなった。

【0043】

実施例３ Ｂａｘ阻害剤（２種類）の低濃度条件におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例1と同様に、ＭＤＣＫ細胞をＳＦＭで１時間馴化させた後、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株を感染価Ｍｏｉ＝０．００１となるように感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を１．０ μＭ濃度で添加し、２３時間培養した。感染後２４時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図４）。
本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加は実施例２と比較して低濃度条件においてもＨ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。加えて、配列番号２においてもインフルエンザウイルスのＨＡ価の増加が認められた。

【0044】

（２）また、配列番号２を添加した感染後２４時間の培養上清を用い、実施例２（２）と同様にインフルエンザウイルス量をフォーカスアッセイにより定量した（図５）。
本検討の結果、配列番号２のＢａｘ阻害剤を添加することで、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１ｐｄｍ、Ｈ１Ｎ１（実験株）インフルエンザウイルス株のウイルス増殖性が亢進することが明らかとなった。

【0045】

実施例４ Ｂａｘ阻害剤（２種類）のＢ型インフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）実施例３と同様に、使用するウイルス株をＢ型インフルエンザウイルス株（Ｂ／Ｌｅｅ／１９４０）に変更しウイルスの増殖性を評価した。Ｍｏｉ＝０．０１となるようにＢ型インフルエンザウイルスを感染させ、１時間インキュベートした後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、Ｂａｘ阻害剤（Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｖ５）（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号１）及び（Ｐ５）（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号２）；ＴＯＣＲＩＳ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））を０〜１００μＭ濃度で添加し、４７時間培養した。感染後４８時間に培養上清を回収し、ＨＡアッセイにより、インフルエンザウイルスのＨＡ価を測定した（図６）。
本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加はＢ型インフルエンザウイルス株のＨＡ価を増加させることが明らかとなった。

【0046】

（２）また、感染後４８時間の培養上清を用い、培養液中のインフルエンザウイルス量を後述するプラークアッセイにより定量した（図７）。
１）プラークアッセイ
１２ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞をコンフルエントとなるように培養し、ＰＢＳで洗浄後、ＳＦＭに１時間馴化させた。感染後４８時間で回収したＢ型インフルエンザウイルス培養上清を１００−１０００００倍に希釈し、上記１２ウェルプレートにて培養しているＭＤＣＫ細胞に１ｍＬ／ウェルで添加し１時間インキュベートすることで、Ｂ型インフルエンザウイルスを感染させた。本試験は三重測定にて行った。感染後、ＳＦＭによる洗浄操作を行い、０．８％−アガロース（ロンザジャパン株式会社 ＳｅａＫｅｍ（登録商標）Ｇｏｌｄ Ａｇａｌｏｓｅ）及び２．０μｇ／ｍＬ−アセチル化トリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）含有ＳＦＭを２．０ｍＬ／ウェルとなるように加え、４７時間培養した。培養後、エタノール：酢酸＝５：１で混合した溶液を各ウェルに１ｍＬ添加し、４℃で一晩以上静置することで細胞を固定化した。固定化細胞を１％（ｗ／ｖ）濃度のクリスタルバイオレッド溶液で染色し、ＰＢＳで洗浄後に、ウイルス感染に伴い細胞が脱落している部分（プラーク）の数をカウントした。

【0047】

２）本検討の結果、配列番号１及び配列番号２のＢａｘ阻害剤は、Ｂ型インフルエンザウイルス株に対してもウイルス増殖性亢進効果を示すことが明らかとなった。

【0048】

実施例５ Ｂａｘ阻害剤の発育鶏卵におけるインフルエンザウイルスの増殖促進効果の検討
（１）発生１１日目の発育鶏卵を用いＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株（Ａ/Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ/８/１９３４）の増殖性を評価した。対照群にはＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを５０％鶏卵感染用量（５０％Ｅｇｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｄｏｓｅ; ＥＩＤ_５０）が５×１０^２ ＥＩＤ_５０/鶏卵となるように感染させ、対照―１０倍量群には５×１０^３ＥＩＤ_５０/鶏卵となるように感染させた。Ｂａｘ阻害剤群（Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（配列番号７）を添加する群）には鶏卵の漿尿液量を５ｍＬとしたときにＢａｘ阻害剤の終濃度が１０μＭとなるように上記ペプチドをウイルス溶液に添加し感染操作を行った。感染液量はいずれの群も２００μＬ/鶏卵とした。感染後４８時間に発育鶏卵より漿尿液を回収し、実施例２（２）と同様にインフルエンザウイルス量をフォーカスアッセイにより定量した（図８）。エラーバーは標準誤差を示した。

【0049】

（２）本検討の結果、Ｂａｘ阻害剤の添加はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス株のウイルス価を１．２７倍に増加させることが明らかとなった。加えて、Ｂａｘ阻害剤の添加により１０倍量のウイルスを感染させた発育鶏卵よりも得られるウイルス価が高まることが明らかとなった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]