特許 6918782 培養培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6918782

(24)【登録日】2021年7月27日

(45)【発行日】2021年8月11日

(54)【発明の名称】培養培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/073 20100101AFI20210729BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20210729BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20210729BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210729BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/073

   C12N5/0735

   C12N5/074

   C12N5/10

【請求項の数】21

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2018-510051(P2018-510051)

(86)(22)【出願日】2016年8月24日

(65)【公表番号】特表2018-525008(P2018-525008A)

(43)【公表日】2018年9月6日

(86)【国際出願番号】EP2016070005

(87)【国際公開番号】WO2017032811

(87)【国際公開日】20170302

【審査請求日】2019年6月11日

(31)【優先権主張番号】1515015.4

(32)【優先日】2015年8月24日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1603407.6

(32)【優先日】2016年2月26日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1607414.8

(32)【優先日】2016年4月28日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】509303785

【氏名又は名称】ヴィトロライフ スウェーデン アクチボラゲット

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チュオン， ティ

(72)【発明者】

【氏名】ガードナー， デイビッド

【審査官】 林 康子

(56)【参考文献】

【文献】 REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT，２０１５年 ３月 ５日，VOL:27, NR:6, SP. ISS. SI，PAGE(S):975 - 983，ＵＲＬ，https://www.researchgate.net/publication/273149599

【文献】 REPRODUCTION FERTILITY AND DEVELOPMENT，２００５年１２月１４日，VOL:18, NR:2，PAGE(S):280 - 281，Abstract No. 346，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1071/RDV18N2AB346

【文献】 Diabetologia，２００８年，51，165-174

【文献】 J Cell Biochem.，２００８年，104（4），1232-43

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００〜５／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；および
ｂ）約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体
を含む、胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地であって、ここで、前記誘導体は、リポ酸と本質的に同等の生理学的特性を有する生物学的に活性な両親媒性ジスルフィド／チオール分子である、培地。

【請求項2】

約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインをさらに含む、請求項１に記載の培地。

【請求項3】

前記アセチル−カルニチンの濃度が約５μＭ〜約２０μＭ、例えば約１０μＭである、請求項１または２のいずれか一項に記載の培地。

【請求項4】

前記アセチル−システインの濃度が約５μＭ〜約２０μＭ、例えば約１０μＭである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の培地。

【請求項5】

前記リポ酸またはその誘導体の濃度が約５μＭ〜約１０μＭ、例えば約５μＭである、請求項１〜４のいずれかに記載の培地。

【請求項6】

無機塩、エネルギー源、アミノ酸、タンパク質、サイトカイン、キレート剤、抗生物質、ヒアルロナン、成長因子、ホルモン、ビタミンおよびＧＭ−ＣＳＦの１つまたはそれよりも多くをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の培地。

【請求項7】

胚、配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養するための方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の培養培地中で、前記胚または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む、方法。

【請求項8】

酸化ストレスおよび／もしくはフリーラジカル形成、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）形成を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚、配偶子もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生を改善し、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善し、または配偶子の健康および生存度を改善する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の培地中で、前記胚および／または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む、方法。

【請求項9】

胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地中における、アセチル−カルニチンと、リポ酸またはその誘導体との組み合わせの使用であって、ここで、前記誘導体は、リポ酸と本質的に同等の生理学的特性を有する生物学的に活性な両親媒性ジスルフィド／チオール分子である、使用。

【請求項10】

前記組み合わせがアセチル−システインをさらに含む、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記アセチル−カルニチンが約５〜約５０μＭの濃度であり、前記リポ酸またはその誘導体が約２．５〜約４０μＭの濃度である、請求項９または１０に記載の使用。

【請求項12】

前記アセチル−システインが約５〜約５０μＭの濃度である、請求項１０に記載の使用。

【請求項13】

酸化ストレスおよび／もしくはフリーラジカル形成、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）形成を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生を改善し、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善するための、請求項１〜６のいずれかに記載の胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地の使用。

【請求項14】

前記胚の発生の改善が、
ａ）栄養外胚葉細胞数、内細胞塊および／もしくは胚盤胞期の胚における総細胞数の増加；
ｂ）拡張胚盤胞および孵化発生に達するまでの時間の減少；
ｃ）胚移植後の胎児の体重、胎児の頭殿長および／もしくは胎盤の重量の増加；
ｄ）良質な胚盤胞の増加；ならびに／または
ｅ）胚盤胞利用率の増加
を含む、請求項８に記載の方法または請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

前記胚が哺乳動物胚、例えばヒト胚である、請求項７〜１４のいずれかに記載の方法または使用。

【請求項16】

前記胚を個別培養する、請求項７〜１５のいずれかに記載の方法または使用。

【請求項17】

前記胚を胚盤胞期まで培養する、請求項７〜１６のいずれかに記載の方法または使用。

【請求項18】

前記幹細胞が、以下の胚性幹細胞、成体幹細胞および誘導多能性幹細胞の１つまたはそれよりも多くから選択される、請求項７〜１４のいずれかに記載の方法または使用。

【請求項19】

前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項７〜１４または請求項１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

５〜２０％の酸素含有量の環境で、前記胚、配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養し、例えば、雰囲気酸素条件、例えば約２０％酸素下で、または低酸素条件、例えば約５％酸素下で、前記胚または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養する、請求項７〜１９のいずれかに記載の方法または使用。

【請求項21】

胚、配偶子または幹細胞の培養において使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、胚、配偶子または幹細胞のための培養培地に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
不妊症は、世界中で８０００万人超に影響を与えている。すべてのカップルの１０％が、一次不妊症または二次不妊症を経験すると推定されている。補助生殖処置（ＡＲＴ）は、他の方法では妊娠することができなかったカップルに妊娠成立の機会を提供し得る選択的医学的処置である。それは、女性の卵巣から卵（卵母細胞）を採取し、次いで実験室で精子と受精させるプロセスである。次いで、このプロセスで作られた胚は、可能性のある着床のために子宮に置かれる。

【0003】

ＡＲＴの進歩にもかかわらず、成功率は依然として低く、着床当たりの生児出生は約３０％である。特に、胚のインビトロ培養は、インビボの生理学的条件を正確にシミュレートすることができないので、多くの要因がＡＲＴの成功に影響を及ぼす。例えば、インビトロ環境における配偶子の取扱い、操作および培養によって産生される活性酸素種（ＲＯＳ）は、胚の質および生存度の低下に悪影響を与え得る酸化ストレスの発生をもたらし得る。インビトロにおけるＲＯＳの主な寄与因子は、胚を培養する酸素濃度である。大気酸素（約２０％）における胚の収集および培養は高酸素環境条件を作り出し、これが外因性ＲＯＳの産生増加に関与し、続いて酸化ストレスをもたらす。２０％酸素で収集および培養された胚に対する酸化ストレスの効果は、遺伝子発現に悪影響を与え、得られるプロテオームを変化させ、代謝を混乱させることが示されている。大気酸素への短時間の曝露でさえ胚発生に悪影響を及ぼし、卵割の遅延をもたらし得る。しかしながら、高い酸素濃度が胚の発生および生存度に有害であるという証拠の増加にもかかわらず、世界中で相当数のＩＶＦサイクルは依然として、大気酸素で実施されている。

【0004】

５％酸素で実施された胚培養は、酸化ストレスの損傷効果の一部を緩和し得るが、５％酸素濃度は依然として酸化ストレスにつながる。さらに、配偶子はすべて、それらの収集および処理の間に大気酸素に曝露される。高い酸素濃度がヒト胚の発生および生存度に有害であるという証拠にもかかわらず、専ら５％酸素で実施されているＩＶＦサイクルは世界中でわずか２５％であり、診療所の３４％は、特定の胚培養段階で５％酸素を使用しており、残りの診療所は、専ら２０％酸素を用いていると報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、２０１４ Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．３１：１０２９−１０３６）。

【0005】

また、インビトロ培養では、ＲＯＳレベルの厳密な調節を維持するために必要な生理学的機構が決定的に欠如しているので、高いレベルの外因性ＲＯＳによって引き起こされる胚に対する酸化ストレスの効果が悪化し得る。確かに、内因性ＲＯＳは、配偶子および胚によってインビボで産生され、配偶子の機能および発生の適切な調節のためには、低いレベルが必要である。しかしながら、インビトロ条件とは異なり、インビボにおける過剰なＲＯＳは、酸化的損傷に対する修復および保護を提供する優れた抗酸化防御系によってクエンチされる。したがって、生理学的条件下では、全身ＲＯＳと抗酸化能力との間で、精緻な平衡／恒常性が維持される。インビトロではこのバランスが破壊され、２０％酸素で胚を培養する場合のように、外因性ＲＯＳの蓄積および保護機構の欠如は、必然的に酸化ストレスにつながる。

【0006】

インビボにおけるＲＯＳは、酵素および非酵素を含む自然抗酸化系によって中和される。カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ／レダクターゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を含む酵素性抗酸化物質は、細胞質、子宮内膜腺細胞およびミトコンドリアにおいて見られ、ＲＯＳを捕捉することによって保護を付与する。ビタミン（Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ）、ピルビン酸塩、グルタチオン（ＧＳＨ）およびヒポタウリンなどの非酵素性抗酸化物質は、卵巣、精漿、子宮内膜上皮および濾胞および卵管液に見られ、酸化的連鎖反応を終了させることによってＲＯＳ形成を防止する。インビトロ培養はこれらの自然抗酸化物質を欠くので、配偶子および胚への酸化的損傷のチェックおよび防止においてＲＯＳレベルを維持するための処置として、培養培地への様々な抗酸化物質の補充が使用されている。

【0007】

幹細胞培養における酸化ストレスもまた、確認されている問題である。

【0008】

胚発生に対する個々の抗酸化物質の効果が報告されているが、培地中に集団として存在する抗酸化物質の胚発生に対する効果に関する研究は、比較的限られている。培養培地中の抗酸化物質の有益効果に関して、矛盾する報告がある（Ｌｅｇｇｅ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｎｓ，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９１；６：８６７−８７１；Ｎａｓｒ−Ｅｓｆａｈａｎｉ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９２；７：１２８１−１２９０；Ｎｏｄａら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ １９９１；２８：３５６−３６０；Ｐａｙｎｅら、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ １９９２；４：１６７−１７４）。
胚の発生ならびに幹細胞の増殖および分化を増強する培養培地、または配偶子の生存度を維持もしくは増強するための培養培地の発見は困難であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、２０１４ Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．３１：１０２９−１０３６

【非特許文献2】Ｌｅｇｇｅ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｎｓ，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９１；６：８６７−８７１

【非特許文献3】Ｎａｓｒ−Ｅｓｆａｈａｎｉ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９２；７：１２８１−１２９０

【非特許文献4】Ｎｏｄａら、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ １９９１；２８：３５６−３６０

【非特許文献5】Ｐａｙｎｅら、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖｅｌｏｐ １９９２；４：１６７−１７４）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の要旨
第１の態様によれば、本発明は、
ａ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；および
ｂ）約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体
を含む胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地を提供する。
別の態様では、本発明は、
ａ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；
ｂ）約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体；および
ｃ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システイン
を含む胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地を提供する。

【0011】

さらなる態様では、本発明は、胚および／または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養するための方法であって、本発明の培養培地中で、前記胚および／または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む方法を提供する。

【0012】

別の態様では、本発明は、酸化ストレスを軽減もしくは防止し、ならびに／またはフリーラジカル形成（例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）形成）を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚および／もしくは配偶子もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生を改善し、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善し、または配偶子の健康および／もしくは生存度を改善する方法であって、本発明の培地中で、前記胚および／または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む方法を提供する。

【0013】

別の態様では、本発明は、体外受精の方法であって、配偶子を培養すること、卵母細胞を精子と受精させること、および／または本発明の培地中で胚を培養することを含む方法を提供する。一実施形態では、好ましくは、前記体外受精の方法は、ヒトまたは動物の体内における胚の着床を包含しない。

【0014】

本発明はまたさらに、胚培養培地および／または配偶子培養培地または幹細胞培養培地中における、アセチル−カルニチンと、リポ酸またはその誘導体との組み合わせの使用を提供する。

【0015】

別の態様では、本発明は、胚培養培地および／または配偶子培養培地または幹細胞培養培地中における、アセチル−カルニチンと、リポ酸またはその誘導体と、アセチル−システインとの組み合わせの使用を提供する。

【0016】

本発明はまた、酸化ストレスおよび／もしくはフリーラジカル形成を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生、もしくはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善し、または配偶子の健康および／もしくは生存度を改善するための、本発明の胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地の使用を提供する。

【0017】

本発明のまたさらなる態様では、体外受精の成功率を改善するための、本発明の胚培養培地および／または配偶子培養培地の使用が提供される。一実施形態では、体外受精の成功率を改善するための、本発明の胚培養培地および／または配偶子培養培地の使用は、ヒトまたは動物の体内における胚の着床を包含しない。

【0018】

さらなる態様では、本発明は、胚、配偶子または幹細胞の培養において使用するための、本発明の培養培地を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ａ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；および
ｂ）約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体
を含む、胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地。
（項目２）
約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインをさらに含む、項目１に記載の培地。
（項目３）
前記アセチル−カルニチンの濃度が約５μＭ〜約２０μＭ、例えば約１０μＭである、項目１または２のいずれか一項に記載の培地。
（項目４）
前記アセチル−システインの濃度が約５μＭ〜約２０μＭ、例えば約１０μＭである、項目２〜４のいずれか一項に記載の培地。
（項目５）
前記リポ酸またはその誘導体の濃度が約５μＭ〜約１０μＭ、例えば約５μＭである、上記項目のいずれかに記載の培地。
（項目６）
無機塩、エネルギー源、アミノ酸、タンパク質、サイトカイン、キレート剤、抗生物質、ヒアルロナン、成長因子、ホルモン、ビタミンおよびＧＭ−ＣＳＦの１つまたはそれよりも多くをさらに含む、上記項目のいずれかに記載の培地。
（項目７）
胚、配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養するための方法であって、項目１〜６のいずれかに記載の培養培地中で、前記胚または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む、方法。
（項目８）
酸化ストレスおよび／もしくはフリーラジカル形成、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）形成を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚、配偶子もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生を改善し、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善し、または配偶子の健康および生存度を改善し、または精子による卵母細胞の受精を改善する方法であって、項目１〜６のいずれかに記載の培地中で、前記胚および／または配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む、方法。
（項目９）
体外受精の方法であって、項目１〜６のいずれかに記載の培地中で、配偶子および／または胚を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む、方法。
（項目１０）
胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地中における、アセチル−カルニチンと、リポ酸またはその誘導体との組み合わせの使用。
（項目１１）
前記組み合わせがアセチル−システインをさらに含む、項目１０に記載の使用。
（項目１２）
前記アセチル−カルニチンが約５〜約５０μＭの濃度であり、前記リポ酸またはその誘導体が約２．５〜約４０μＭの濃度である、項目１０または１１に記載の使用。
（項目１３）
前記アセチル−システインが約５〜約５０μＭの濃度である、項目１１に記載の使用。
（項目１４）
酸化ストレスおよび／もしくはフリーラジカル形成、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）形成を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された胚もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させ、ならびに／またはインビトロで培養された胚の発生を改善し、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善するための、項目１〜６のいずれかに記載の胚培養培地、配偶子培養培地または幹細胞培養培地の使用。
（項目１５）
前記胚の発生の改善が、
ａ）栄養外胚葉細胞数、内細胞塊および／もしくは胚盤胞期の胚における総細胞数の増加；
ｂ）拡張胚盤胞および孵化発生に達するまでの時間の減少；
ｃ）胚移植後の胎児の体重、胎児の頭殿長および／もしくは胎盤の重量の増加；
ｄ）良質な胚盤胞の増加；ならびに／または
ｅ）胚盤胞利用率の増加
を含む、項目８に記載の方法または項目１４に記載の使用。
（項目１６）
体外受精の成功率を改善するための、項目１〜６のいずれかに記載の培養培地の使用。
（項目１７）
前記胚が哺乳動物胚、例えばヒト胚である、項目７〜１６のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１８）
前記胚を個別培養する、項目７〜１７のいずれかに記載の方法または使用。
（項目１９）
前記胚を胚盤胞期まで培養する、項目７〜１８のいずれかに記載の方法または使用。
（項目２０）
前記幹細胞が、以下の胚性幹細胞、成体幹細胞および誘導多能性幹細胞の１つまたはそれよりも多くから選択される、項目７〜１６のいずれかに記載の方法または使用。
（項目２１）
前記幹細胞がヒト幹細胞である、項目７〜１６または項目２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
５〜２０％の酸素含有量の環境で、前記胚、配偶子または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養し、例えば、雰囲気酸素条件、例えば約２０％酸素下で、または低酸素条件、例えば約５％酸素下で、前記胚または幹細胞を取扱いおよび／または操作および／または培養する、項目７〜２１のいずれかに記載の方法または使用。
（項目２３）
胚、配偶子または幹細胞の培養において使用するための、項目１〜６のいずれか一項に記載の培養培地。

【図面の簡単な説明】

【0019】

添付の図面を参照して、単なる例として、本発明の実施形態を説明する。

【図1A】図１ａは、異なる投与量のアセチルカルニチンを用いた、２０％酸素における集団胚発生を示す；

【図1B】図１ｂは、異なる投与量のアセチルシステインを用いた、２０％酸素における集団胚発生を示す；

【図1C】図１ｃは、異なる投与量のリポ酸を用いた、２０％酸素における集団胚発生を示す；

【図2】図２は、２０％Ｏ２で培養した胚の細胞系統配分を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。淡色および濃色のバー部分は、それぞれ平均ＴＥおよびＩＣＭ細胞を表す。対照（ｎ＝３５）、１０μＭカルニチン−１０ｕＭシステイン（ｎ＝４２）、１０μＭカルニチン−５ｕＭリポ酸（ｎ＝５３）、１０μＭシステイン−５ｕＭリポ酸（ｎ＝４８）、三重（１０μＭカルニチン−１０μＭシステイン−５μＭリポ酸）（ｎ＝４４）。３回の生物学的反復。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；

【図3】図３は、５％Ｏ２で集団培養した胚の細胞系統配分を示す。１０μＭカルニチン、１０μＭシステインおよび５μＭリポ酸を含むカクテル。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。淡色および濃色のバー部分は、それぞれ平均ＴＥおよびＩＣＭ細胞を表す。３回の生物学的反復。対照（ｎ＝１５４）、カクテル（ｎ＝１６８）。^＊＊＊Ｐ＜０．００５、^＊Ｐ＜０．０５；

【図4】図４は、２０％Ｏ２で個別培養した胚の細胞系統配分を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。淡色および濃色のバー部分は、それぞれ平均ＴＥおよびＩＣＭ細胞を表す。６回の生物学的反復。対照（ｎ＝１１６）、カクテル（ｎ＝１４５）。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、^＊＊＊Ｐ＜０．００５；

【図5】図５は、ｈＣＧ注射後の時間で表される主な発生事象のタイミングを示す。ｔＰＮＢ＝前核崩壊のタイミング、ｔ２＝２細胞分裂のタイミング、ｔ３＝３細胞のタイミング、ｔ４＝４細胞分裂のタイミング、ｔ５＝５細胞のタイミング、ｔ６＝６細胞分裂のタイミング、ｔ８＝８細胞分裂のタイミング、ｔＣＡ＝キャビテーションの（胞胚腔が形成を開始する）時、ｔＢ＝胚盤胞が形成する時、ｔＥ＝胚盤胞が完全に拡張する時、ｔＨ＝胚盤胞が孵化する時。実線のバーは対照を示し、斜線灰色のバーは三重カクテル処置群を示す。^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００５。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。

【図6】図６は、２０％酸素で集団培養した胚の細胞系統配分に対する、三重カクテルへの曝露時間の効果を示す。カクテルは、１０μＭカルニチン、１０μＭシステインおよび５μＭリポ酸を含み、最初の２日間（Ｇ１）もしくは最後の３日間（Ｇ２）で培地に、またはその両方で培地（Ｇ１およびＧ２）に補充した。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。淡色および濃色のバー部分は、それぞれ平均ＴＥおよびＩＣＭ細胞を表す。３回の生物学的反復。対照（ｎ＝９２）、Ｇ１（ｎ＝８４）、Ｇ２（ｎ＝９７）、Ｇ１およびＧ２（ｎ＝８０）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１；

【図7】図７は、ＭＣＢ蛍光に対するＢＳＯの効果を示す−３回の生物学的反復（ｎ＝６〜１２）。^＊＊Ｐ＝０．００４、^＊Ｐ＝０．０１１；

【図8】図８は、１０ｕＭ ＭＣＢによる胚の蛍光標識を示す。カクテルは、１０μＭカルニチン、１０μＭシステインおよび５μＭリポ酸を含む。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。６回の生物学的反復（ｎ＝６０）。蛍光値は、任意単位で示されている。^＊＊Ｐ＜０．０１；

【図9】図９は、２０％酸素で個別培養したＩＶＦ胚の胚盤胞細胞数に対する組み合わせ抗酸化物質の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。淡色および濃色のバー部分は、それぞれ平均ＴＥおよびＩＣＭ細胞を表す。２０％酸素で個別培養した胚の細胞系統配分。抗酸化物質（Ａ３）は、配偶子取扱い／収集培地および／または培養培地中にあった。対照（Ｃｏｎ）は、抗酸化物質を含まない配偶子および／または培養培地中にあった：４回の生物学的反復。Ｃｏｎ／Ｃｏｎ（ｎ＝３４）、Ｃｏｎ／Ａ３（ｎ＝３４）、Ａ３／Ｃｏｎ（ｎ＝３８）、Ａ３／Ａ３（ｎ＝４８）。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；

【図10】図１０は、２０％酸素で個別培養したＩＶＦ由来胚盤胞に対する組み合わせ抗酸化物質の効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。抗酸化物質（Ａ３）は、配偶子取扱い／収集培地および／または培養培地中にあった。対照（Ｃｏｎ）は、抗酸化物質を含まない配偶子取扱い培地および／または培養培地中にあった。３回の生物学的反復。Ｃｏｎ／Ｃｏｎ（ｎ＝３４）、Ｃｏｎ／Ａ３（ｎ＝３４）、Ａ３／Ｃｏｎ（ｎ＝３８）、Ａ３／Ａ３（ｎ＝４８）。^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図11】図１１は、受精卵母細胞の総数に対するヒト胚盤胞利用率をパーセントで示す。対照群では、さらなる臨床用途のために、４４個の受精卵母細胞のうちの１２個を選択し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、さらなる臨床治療用途のために、４９個のうちの２６個を選択した。質の要件を満たさない胚盤胞は選択せずに廃棄した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の差異は、０．０１１２のｐ値で有意であった。

【図12】図１２は、胚盤胞の総数に対するヒト胚盤胞利用率をパーセントで示す。対照群では、さらなる臨床用途のために、２８個の胚盤胞のうちの１２個を選択し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、さらなる臨床治療用途のために、３６個のうちの２６個を選択した。質の要件を満たさない胚盤胞は選択せずに廃棄した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の差異は、０．０１７３のｐ値で有意であった。

【図13】図１３は、良質な胚盤胞（ＧＱＢ）のスコア（これは、ガードナー胚盤胞評価方式による３ＡＢまたはそれを超えるスコア）に達したヒト胚盤胞の胚盤胞の総数あたりの割合をパーセントで示す。対照群では、３０個の胚盤胞のうちの８個をＧＱＢと評価し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、３６個のうちの１８個をＧＱＢと評価した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の大きい差異は、０．０５４５のｐ値で示されている。

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
本発明は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチンと約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体との特定の組み合わせが、特に約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインと組み合わせた場合に、インビトロで培養された胚の発生、またはインビトロで培養された幹細胞の増殖および分化、または配偶子の健康および生存度、ならびに／または精子による卵母細胞の受精を有意に改善したという驚くべき知見に基づくものである。

【0021】

本発明は、
ａ）約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；および
ｂ）約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体
を含む配偶子培養培地、胚培養培地または幹細胞培養培地に関する。

【0022】

一実施形態では、本発明の配偶子培養培地、胚培養培地または幹細胞培養培地は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインをさらに含む。

【0023】

一実施形態では、アセチル−カルニチンは、約５μＭ〜約２０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0024】

別の実施形態では、アセチル−カルニチンは、約５μＭ〜約１５μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0025】

好ましい実施形態では、アセチル−カルニチンは、約１０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0026】

一実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、約２．５μＭ〜約２０μＭ、例えば５μＭ〜約２０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0027】

別の実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、約２．５μＭ〜約１０μＭ、例えば５μＭ〜約１０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0028】

好ましい実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、約５μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0029】

一実施形態では、アセチル−システインは、約５〜約２０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0030】

別の実施形態では、アセチル−システインは、約５μＭ〜約１５μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0031】

好ましい実施形態では、アセチル−システインは、約１０μＭの濃度で本発明の培養培地中に存在する。

【0032】

適切には、本発明の培地は、１つまたはそれを超えるさらなる化合物、例えば無機塩、エネルギー源、アミノ酸、タンパク質源、サイトカイン、キレート剤、抗生物質、ヒアルロナン、成長因子、ホルモン、ビタミンおよび／または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をさらに含み得る。

【0033】

一実施形態では、培養培地は、無機塩を含み得る。一実施形態では、無機塩は、水溶液中で無機イオンに解離するものであり得る。適切には、無機塩は、以下の無機イオン：Ｎａ（＋）、Ｋ（＋）、Ｃｌ（−）、Ｃａ（２＋）、Ｍｇ（２＋）、ＳＯ（４）（２−）またはＰＯ（４）（２−）の１つまたはそれよりも多くを含むものであり得る。

【0034】

一実施形態では、培養培地は、エネルギー源を含み得る。エネルギー源は、胚の発生段階に応じて、ピルビン酸塩、乳酸塩またはグルコースであり得る。エネルギー源の要件は、ピルビン酸塩−乳酸塩選好性（８細胞期までの胚が母性遺伝制御下にある間）から、グルコースベースの代謝（８細胞期から胚盤胞への発生を支援する胚性ゲノムの活性化後）に進化する。

【0035】

適切には、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、エネルギー源として乳酸炭水化物およびピルビン酸炭水化物であり得るか、またはこれらを含み得る。

【0036】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、ヒアルロン酸であり得る。一実施形態では、培養培地は、アミノ酸を含み得る。アミノ酸は、必須アミノ酸であり得る。適切には、必須アミノ酸としては、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニンおよび／またはトリプトファンが挙げられる。代替的な実施形態では、アミノ酸は、非必須アミノ酸、例えばプロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンおよび／またはグルタミン酸であり得る。８細胞までの接合子の発生を支援する培地は、典型的には、非必須アミノ酸、例えばプロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンおよび／またはグルタミン酸が補充され得る。胚盤胞期までの８細胞胚の発生を支援する培地は、典型的には、必須アミノ酸、例えばシステイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニンおよび／またはトリプトファンが補充される。

【0037】

一実施形態では、培養培地は、タンパク質源を含み得る。タンパク質源は、（例えば、それぞれ５〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度の）アルブミンまたは合成血清であり得る。適切なタンパク質補充源としては、ヒト血清、ヒト臍帯血清（ＨＣＳ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。

【0038】

一実施形態では、培養培地は、成長因子を含み得る。

【0039】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、胚、配偶子または幹細胞の培養に適切な培地中に存在する任意の化合物であり得る。

【0040】

適切には、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質源を含む。

【0041】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、水を含み得る。

【0042】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、緩衝液を含み得る。適切な緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。

【0043】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、水、無機塩および少なくとも１つのエネルギー源を含み得る。

【0044】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、水、無機塩、少なくとも１つのエネルギー源および１つまたはそれを超えるアミノ酸を含み得る。

【0045】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、少なくとも１つのエネルギー源（例えば、乳酸塩、ピルビン酸塩などの炭水化物）、タンパク質源（例えば、ヒト血清アルブミン）および水または緩衝液であり得るか、またはこれらを含み得る。

【0046】

一実施形態では、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、エネルギー源（例えば、乳酸塩、ピルビン酸塩などの炭水化物）、アミノ酸、ヒアルロナンおよび水または緩衝液であり得るか、またはこれらを含み得る。

【0047】

１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、配偶子、胚または幹細胞の培養に適切な培地（この培地は、バックグラウンド培地と称され得る）の形態であり得る。

【0048】

本明細書で使用される「培養培地」という用語は、培養のための培地（例えば、成長に適切な条件）に限定されず、配偶子、胚および／または幹細胞の取扱いまたは収集または操作を使用する培地を包含する。
適切には、１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、緩衝培地（例えば、重炭酸塩緩衝化培地）を形成し得る。

【0049】

１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、４細胞期までの胚（例えば、哺乳動物胚）を支援するように設計された培地（この培地は、バックグラウンド培地と称され得る）の形態であり得る。

【0050】

１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、８細胞期までの胚（例えば、哺乳動物胚）を支援するように設計された培地（この培地は、バックグラウンド培地と称され得る）の形態であり得る。

【0051】

１つまたはそれを超えるさらなる化合物は、胚盤胞期までの胚（例えば、哺乳動物胚）を支援するように設計された培地（この培地は、バックグラウンド培地と称され得る）の形態であり得る。

【0052】

（バックグラウンド）培地は、胚、配偶子または幹細胞の培養に適切な任意の培地であり得る。

【0053】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、胚移植専用の培地であり得る。

【0054】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、配偶子取扱い培地（配偶子収集培地を含む）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）用の培地、受精培地、一段階胚培養培地、胚移植培地、卵母細胞成熟培地、精子調製培地および受精培地、または配偶子もしくは胚のために使用される任意の他の適切な培地からなる群の１つまたはそれよりも多くであり得る。

【0055】

一実施形態では、本発明の胚培養培地または配偶子培養培地は、配偶子取扱い培地（配偶子収集培地を含む）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）用の培地、受精培地、一段階胚培養培地、胚移植培地、卵母細胞成熟培地、精子調製培地および受精培地、または配偶子もしくは胚のために使用される任意の他の適切な培地からなる群の１つまたはそれよりも多くであり得る。

【0056】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、市販の単純培養培地、例えばヒト卵管液（ＨＴＦ）、Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ’ｓ Ｔ６培地およびＥａｒｌｅ’ｓ平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）であり得る。

【0057】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、基本培地、例えばＶｉｔｒｏｌｉｆｅのＩＶＦ（商標）であり得る。ＩＶＦ（商標）は、受精培地と考えられ得る。

【0058】

一実施形態では、ＩＶＦ培地は、受精培地であると考えられる。

【0059】

あるいはまたは加えて、培地は、以下の培地Ｇ−１（商標）、Ｇ−２（商標）、ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）、Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）Ｐｌｕｓ、Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）、ＥｍｂｒｙｏＧｌｕｅ（商標）、ＩＣＳＩ（商標）もしくはＧ−ＴＬ（商標）の１つもしくはそれよりも多くまたはそれらの組み合わせであり得る。これらの製品は、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能である。これらは、バックグラウンド培地と称され得る。

【0060】

一実施形態では、適切な取扱い培地（例えば、配偶子取扱い培地）は、Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）であり得る。

【0061】

一実施形態では、適切な一段階培養培地は、Ｇ−ＴＬ（商標）であり得る。

【0062】

一実施形態では、胚移植培地は、ＥｍｂｒｙｏＧｌｕｅ（商標）であり得る。いくつかの実施形態では、胚移植培地は、着床促進移植培地と称され得る。

【0063】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、卵母細胞成熟培地または精子調製培地および受精培地またはそれらの組み合わせなどの培地であり得る。

【0064】

卵母細胞成熟培地は、培養卵母細胞の改善された発生および生存度を提供するように設計されている。適切な卵母細胞成熟培地の完全な処方は、以下の表に提供されている：

【表A-1】

【表A-2】

特に指示がない限り、この表中の濃度は、ｍＭ単位で提供されている；培地は水性である。

【0065】

適切な精子調製培地および受精培地の完全な処方は、以下の表に提供されている：

【表B】

特に指示がない限り、この表中の濃度は、ｍＭ単位で提供されている；培地は水性である。

【0066】

卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）用の培地、例えばＩＣＳＩ（商標）は、精子の取扱いを助け、受精における精子の不動化および卵母細胞への注射を容易にするように設計されている。ＩＣＳＩ用の適切な培地の完全な処方は、以下の表に提供されている：

【表C】

【0067】

Ｇ−１（商標）培地は、ほぼ８細胞期への卵割期胚の発生を支援するように設計されている。早期胚を支援するために、このような培地は、炭水化物、アミノ酸およびキレート剤を含有する。Ｇ−１（商標）培地の完全な処方は、以下の表に提供されている：

【表D】

特に指示がない限り、この表中の濃度は、ｍＭ単位で提供されている。

【0068】

あるいは、（バックグラウンド）培地は、３日目以降（８細胞期）の胚を支援することができる市販のＩＶＦ培養培地であり得る。これらの培養培地は、着床前に胚を胚盤胞期にするように設計（ｓｉｇｎｅｄ）されている。一例としては、Ｄｅｓａｉら、（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．１２：３２８−３３５（１９９７））に記載されているα改変必須培地（αＭＥＭ）が挙げられる。第２の例としては、ＨＥＣＭ−６培地＋パントテン酸塩（ＭｃＫｉｅｒｎａｎ ＳＨ＆Ｂａｖｉｓｔｅｒ ＢＤ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．１５：１５７−１６４（２０００）が挙げられる。他の例としては、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅから入手可能なＧ−２（商標）が挙げられる。Ｇ−２（商標）培地は、ほぼ８細胞期（３日目）から胚盤胞期への胚の発生を支援するように設計されている。後期胚を支援するために、このような培地は、炭水化物、アミノ酸およびビタミンを含有する。

【0069】

Ｇ−２（商標）培地の完全な処方は、以下の表に提供されている：

【表E】

特に指示がない限り、上記表中の濃度は、ｍＭ単位で提供されている。

【0070】

一実施形態では、８細胞期胚は、本発明にしたがって補充された初期成長（すなわち、８細胞期まで）を支援するように最適化された胚培養培地から、後期成長（すなわち、胚盤胞期まで）を支援するように最適化された胚培養培地（これは、本発明にしたがってさらに補充され得る）に移される。

【0071】

培養培地中の各化合物の濃度は、培地が最適化される胚発生の段階に応じて変動し得る。培養培地中の無機塩の典型的な濃度は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭまたは約１１０ｍＭ〜約１４０ｍＭであり得る。

【0072】

培地中のエネルギー源の典型的な濃度は、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば約５ｍＭ〜約３０ｍＭまたは約５ｍＭ〜約１５ｍＭであり得る。

【0073】

培養培地中のアミノ酸の総量の典型的な濃度は、約０．１ｍＭ〜約１５ｍＭまたは約０．５ｍＭ〜約１２ｍＭまたは約０．５ｍＭ〜約６ｍＭであり得る。

【0074】

培養培地中のビタミン、成長因子、ホルモンおよび他の各種成分は、かなり低い濃度、例えば１ｍＭもしくはそれ未満、０．５ｍＭもしくはそれ未満またはさらに０．１ｍＭもしくはそれ未満で追加される傾向にある。

【0075】

好ましくは、胚、配偶子または幹細胞は、パラフィン油下で培養される。これは、培地の蒸発を防止して一定のオスモル濃度を保持し得る。加えて、前記油は、ｐＨおよび温度の変動を最小化し得る。

【0076】

一実施形態では、本発明の培養培地は、抗生物質を含み得る。適切な抗生物質のいくつかの例としては、ペニシリンおよびストレプトマイシンが挙げられる。

【0077】

一実施形態では、本発明は、胚および配偶子を取扱いおよび／または操作および／または培養するための方法であって、本発明の培養培地中で、前記胚および配偶子を取扱いおよび／または操作および／または培養することを含む方法を提供する。

【0078】

本発明は、（例えば、配偶子取扱い培地（配偶子収集培地を含む）中における、精子調製培地中における、卵母細胞成熟培地中における、または配偶子のために使用される任意の他の適切な培地中における）配偶子の取扱いおよび（例えば、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）用の培地、受精培地、一段階胚培養培地、胚移植培地、または胚のために使用される任意の他の適切な培地中における）胚の操作の両方において、（例えば、５〜５０μＭの濃度の）アセチル−カルニチンと、（例えば、約２．５〜約４０μＭの濃度の）リポ酸またはその誘導体と、場合により（例えば、約５〜約５０μＭの濃度の）アセチル−システインとの組み合わせを使用することを含む。

【0079】

一実施形態では、本発明は、（例えば、配偶子収集培地中における）配偶子の取扱いおよび（例えば、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）用の培地中における、または受精培地もしくは胚移植培地中における）胚の操作（例えば、ＩＣＳＩまたは受精または胚移植）の両方における、（例えば、５〜５０μＭの濃度の）アセチル−カルニチンと、（例えば、約２．５〜約４０μＭの濃度の）リポ酸またはその誘導体と、場合により（例えば、約５〜約５０μＭの濃度の）アセチル−システインとの組み合わせの使用に関する。

【0080】

一実施形態では、本発明は、胚培養培地中における、（例えば、５〜５０μＭの濃度の）アセチル−カルニチンと、（例えば、約２．５〜約４０μＭの濃度の）リポ酸またはその誘導体と、場合により（例えば、約５〜約５０μＭの濃度の）アセチル−システインとの組み合わせの使用に関する。

【0081】

いくつかの実施形態では、本発明において使用するための化合物は、配偶子の取扱い中に、および／または胚の操作中に、および／または胚の培養中に追加される。換言すれば、本発明において使用するための化合物は、ＩＶＦ／ＩＣＳＩプロセス中に複数の段階で追加され得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、本発明において使用するための化合物は、配偶子取扱い培地および／または胚操作培地および／または胚培養培地に追加される。本明細書で使用される「取扱い」という用語は、例えば、配偶子、胚または幹細胞の任意の保持または移動を含み得る。例えば、これは、着床のために、胚の収集または移植の間およびその後の配偶子の移植を含み得る。

【0083】

本明細書で使用される「操作」という用語は、配偶子および／または胚および／または幹細胞の任意の操作を含み得る。例えば、これは、（例えば、精子を卵子と受精させることによる）ＩＣＳＩまたは受精を含み得る。

【0084】

本明細書で使用される「培養」という用語は、成長または成熟に適切な条件で維持することを意味し得る。

【0085】

好ましくは、培養培地のｐＨは、（培養の間に）７．２〜７．４である（に維持される）。

【0086】

驚くべきことに、本発明の培養培地は、酸化ストレスを軽減もしくは防止し、ならびに／またはフリーラジカル形成（例えば、活性酸素種（ＲＯＳ）形成）を軽減もしくは防止し、ならびに／またはインビトロで培養された配偶子、胚もしくは幹細胞の抗酸化能力のレベルを増加させることが見出された。

【0087】

酸化ストレスは、活性酸素種の全身発現と、反応性中間体を容易に解毒し、または生じる損傷を修復する胚または幹細胞の能力との間の不均衡を反映する。細胞の正常なレドックス状態の異常は、タンパク質、脂質およびＤＮＡを含む細胞のすべての成分を損傷する過酸化物およびフリーラジカルの産生を介して毒性効果を引き起こし得る。酸化的代謝による酸化ストレスは、塩基損傷およびＤＮＡの鎖切断を引き起こす。塩基損傷は主に間接的であり、生成された活性酸素種（ＲＯＳ）、例えばＯ２−（スーパーオキシドラジカル）、ＯＨ（ヒドロキシルラジカル）およびＨ２Ｏ２（過酸化水素）によって引き起こされる。さらに、いくつかの活性酸素種は、レドックスシグナル伝達において細胞メッセンジャーとして作用する。したがって、酸化ストレスは、細胞シグナル伝達の正常な機構の破壊を引き起こし得る。

【0088】

本明細書で使用される「抗酸化能力」という用語は、胚または幹細胞の酸化ストレス耐性能力を意味する。胚の抗酸化能力は、（以下の方法および材料のセクションで詳述されているように）胚の成長速度を測定することによって、および／または細胞内グルタチオン（ＧＳＨ）を測定することによって間接的に測定され得る。

【0089】

一実施形態では、本発明の培養培地は、インビトロで培養された胚におけるＧＳＨのレベルを、インビボで発生した胚のものと実質的に同じレベルに維持する。換言すれば、本発明の培養培地中における本明細書で教示されるアセチル−カルニチンと、リポ酸と、（場合により）アセチル−システインとの特定の組み合わせは、化合物のこの組み合わせを含まない培養培地中でインビトロで培養された胚と比較して、インビトロで培養された胚におけるＧＳＨレベルを増加させる。

【0090】

理論に縛られるものではないが、ＧＳＨは、酸化的損傷からの細胞の保護において重要な役割を果たすスルフィドリルチオールペプチドである。胚発生におけるその役割は、胚発生中の細胞増殖および進行において実証されている。ＧＳＨ合成はシステインのアベイラビリティに依存し、フィードバック阻害により、システインの細胞内レベルは、細胞ＧＳＨの上限濃度を決定する。したがって、ＧＳＨの増加は、より大きい抗酸化能力により、酸化ストレスから細胞を保護して、胚の質の改善を促進し得る。

【0091】

成長速度は、例えば、本発明の培養培地中で２日間培養した時点において、もしくは胚盤胞期において、例えば適切には本発明の培養培地中で５日間培養した時点において測定した場合に、栄養外胚葉細胞数、内細胞塊数もしくは総細胞数を測定することによって；拡張胚盤胞に達するまでの時間を測定することによって；および／または孵化胚盤胞に達するまでの時間を測定することによって測定され得る。

【0092】

加えてまたはあるいは、驚くべきことに、本発明の培養培地は、インビトロで培養された胚の発生を改善することが見出された。

【0093】

胚との関連で本明細書で使用される「発生を改善する」という用語は、以下の１つまたはそれよりも多くを含み得る：
ａ）例えば、本発明の培養培地中で５〜６日間培養した時点において測定した場合に、胚盤胞期の胚における栄養外胚葉細胞数を増加させること）；
ｂ）例えば、本発明の培養培地中で５〜６日間培養した時点において測定した場合に、胚盤胞期の胚における内細胞塊を増加させること；
ｃ）例えば、本発明の培養培地中で５〜６日間培養した時点において測定した場合に、胚盤胞期の胚における総細胞数を増加させること；
ｄ）拡張胚盤胞に達するまでの時間の減少；
ｅ）孵化胚盤胞に達するまでの時間の減少；
ｆ）胚移植後の胎児の体重の増加；
ｇ）胚移植後の胎児の頭殿長の増加；
ｈ）胚移植後の胎盤の重量の増加；
ｉ）良質な胚盤胞（ＧＱＢ）（すなわち、抗酸化物質を含まない同程度の培地中で培養された胚と比較した、ガードナー胚盤胞評価方式（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９９９を参照のこと）による３ＡＢまたはそれを超えるスコアに達した胚盤胞の胚盤胞の総数に対する割合）の増加；ならびに／または
ｊ）胚盤胞利用率（すなわち、例えば、受精卵母細胞の総数に対するパーセントでの、または胚盤胞の総数に対するパーセントでの、移植のために新鮮状態で使用される胚盤胞、または患者へのその後の移植のために凍結保存される胚盤胞の割合）の増加。

【0094】

「内細胞塊（ＩＣＭ）」という用語は、本明細書では、胚の内部の細胞の塊であって、胎児の最終的な構造を最終的に生じさせる塊と定義される。内細胞塊は、胚結節または多能性細胞集団（ｐｌｕｒｉｂｌａｓｔ）としても公知であり得る。

【0095】

「栄養外胚葉（ＴＥ）」という用語は、本明細書では、例えば栄養素を胚に供給し、胎盤の大部分に発達する胚盤胞の外層を形成する細胞として定義される。

【0096】

本明細書で使用される「拡張胚盤胞」という用語は、胞胚腔が胚よりも大きい発生段階を意味する。典型的には、これは、胚盤胞の外郭構造（透明帯）の薄化との組み合わせである。

【0097】

「孵化胚盤胞」という用語は、本明細書では、外被の透明帯から胚それ自体が解放される時点を意味する。一連の伸縮サイクルを通して、胚は、この被膜を破裂させる。これは、非胚側極で透明帯を溶解する酵素によって支援される。律動的な伸縮は、堅固な糖タンパク質コート（透明帯）からの胚の脱出および出現をもたらす。

【0098】

（例えば、発生および／または増殖および／または分化との関連で）「改善する」という用語は、対照（例えば、本発明で定義されるアセチル−カルニチンとリポ酸またはその誘導体との組み合わせまたはアセチル−カルニチンとリポ酸またはその誘導体とアセチル−システインとの組み合わせを含まない以外は同様の培養培地中における成長）と比較して改善することを意味する。

【0099】

好ましい実施形態では、胚は、哺乳動物胚、例えばヒト胚である。

【0100】

一実施形態では、胚は、ヒト胚である。

【0101】

胚発生の着床前期間は、哺乳動物種によって異なる。しかしながら、ヒトおよびマウスの胚は、最も類似の発生期間（約４〜５日間）を共有し、さらには極めて類似の着床を示す。両種の胚盤胞は類似のサイズに達し、ヒトおよびマウスの胚間では、栄養素の利用パターンが非常に類似する（例えば、Ｇｏｔｔ ＡＬ，Ｈａｒｄｙ Ｋ，Ｗｉｎｓｔｏｎ ＲＭ，Ｌｅｅｓｅ ＨＪ．Ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｌａｃｔａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ．１９９０；５（１）：１０４−８；Ｌｅｅｓｅ ＨＪ，Ｂａｒｔｏｎ ＡＭ．Ｐｙｒｕｖａｔｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｍｏｕｓｅ ｏｖａ ａｎｄ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ．１９８４；７２（１）：９−１３；およびＧａｒｄｎｅｒ ＤＫ，Ｗａｌｅ ＰＬ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｖｉａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．２０１３；９９（４）：１０６２−７２を参照のこと）。ヒトおよびマウスの発生間で共有される類似性は、マウスの系で実施された実験からヒトの発生を評価することを可能にするようなものである（Ｃｓａｂａ Ｐｒｉｂｅｎｓｋｙら、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｏｎｌｉｎｅ（２０１０）２０，３７１−３７９を参照のこと）。その結果、マウスは、ヒト着床前胚の最も適切なモデルになると考えられる。

【0102】

本明細書で使用される「配偶子」という用語は、卵母細胞および／または精子細胞を指し得る。

【0103】

本明細書で使用される「胚」という用語は、前期胚子段階（ｐｒｅ−ｅｍｂｒｙｏ ｐｈａｓｅ）を含む広範な定義を有し得る。本明細書で使用される「胚」という用語は、卵母細胞の受精から緊密化、桑実胚、胚盤胞期、孵化および着床までのすべての発生段階を包含し得る。

【0104】

いくつかの場合では、「胚」という用語は、受精後８週間（ヒトでは、それはこの段階で胎児になる）までの子宮内着床後の受精卵母細胞を記載するために使用される。この定義によれば、受精卵母細胞は、着床が起こるまで前期胚子と称されることが多い。しかしながら、上記のように、本明細書で使用される「胚」という用語は、前期胚段階を含み得る。

【0105】

胚はほぼ球状であり、透明帯として公知の無細胞マトリックスによって囲まれた１つまたはそれを超える細胞（割球）から構成される。透明帯は、胚が孵化するまで様々な機能を果たし、胚評価のための優れたランドマークである。透明帯は球状かつ半透明であり、細胞残屑と明確に区別可能であるはずである。

【0106】

受精は、精子細胞が卵母細胞によって認識および受容される時点である。卵母細胞の減数分裂サイクルが第２減数分裂の中期に中断された後、精子細胞は、卵の活性化をトリガーする。これは、第二極体の生成および成形をもたらす。これは、本明細書では第二極体の排除と称される時点である（基準値ｉｉを参照のこと）。精子および卵子の融合の数時間後、ＤＮＡ合成が開始する。雄性前核および雌性前核（ＰＮ）が出現する。これは、前核（ＰＮ）が出現すると称される時点である（基準値ｉｉｉを参照のこと）。ＰＮが卵の中心に移動し、膜が崩壊し、ＰＮが消失する。これは、本明細書では、前核が消失した（または薄れた）時点と称される時点である（基準値ｉを参照のこと）。２つのゲノムのこの合体は、配偶子融合と称される。その後、細胞分裂が開始する。

【0107】

胚発生の間、割球数は、幾何級数的に増加する（１−２−４−８−１６−など）。同調的な細胞分裂は、一般に、ヒト胚では８細胞期まで維持される。その後、細胞分裂は非同調的になり、最終的には、個々の細胞は独自の細胞周期を有する。不妊処置中に産生されるヒト胚は、通常、８胚盤胞期前にレシピエントに移植される。いくつかの場合では、ヒト胚はまた、移植前に胚盤胞期まで培養される。これは、好ましくは、多くの良質な胚が利用可能であるか、または着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）の結果を待つために長期間のインキュベーションが必要な場合に行われる。しかしながら、インキュベーション技術が改善するにつれて、インキュベーションが長期間になる傾向がある。

【0108】

したがって、胚という用語は、以下では、受精卵母細胞、接合子、２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞、緊密化、桑実胚、胚盤胞、拡張胚盤胞および孵化胚盤胞の各段階、ならびにそれらの間のすべての段階（例えば、３細胞または５細胞）を示すために使用される。

【0109】

胚は、精子細胞（精子）の融合または注射によって卵母細胞が受精した場合に形成される。この用語はまた、伝統的には、孵化（すなわち、透明帯の破裂）およびその後の着床の後に使用される。ヒトの場合、最初の８週間には、受精卵母細胞は、伝統的には、接合子または胚と称される。その後（すなわち、８週間後およびすべての主要器官の形成後）、それは胎児と称される。しかしながら、接合子と胚と胎児との間の区別は、一般に、十分に定義されていない。胚および接合子という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0110】

一実施形態では、胚は、個別培養され得る。

【0111】

さらに別の実施形態では、胚は、胚盤胞期、拡張胚盤胞期または孵化胚盤胞期まで、本発明の培養培地中で培養される。

【0112】

加えてまたはあるいは、驚くべきことに、本発明の培養培地は、インビトロで培養された幹細胞の増殖および分化を改善することが見出された。

【0113】

（例えば、幹細胞発生との関連で）本明細書で使用される「分化」という用語は、細胞がある細胞型から別の細胞型に変化するプロセスを意味する。この用語は、例えば細胞成長中により特殊な細胞型になるあまり特殊ではない細胞型を包含し得る。

【0114】

（例えば、幹細胞発生との関連で）本明細書で使用される「増殖」という用語は、例えば幹細胞集団のエクスパンションをもたらす幹細胞の増大を意味する。

【0115】

本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、特殊な細胞に分化し得る未分化生物細胞であって、（有糸分裂を介して）分裂して、より多くの幹細胞を生じさせ得る未分化生物細胞を意味する。「幹細胞」という用語は、胚性幹細胞（これは、胚盤胞の内細胞塊から単離され得る）および成体幹細胞（これは、様々な組織に見られ得る）の両方を包含する。加えてまたはあるいは、本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を意味する。ｉＰＳＣは、成体細胞から直接生成される多能性幹細胞の一種である。

【0116】

一実施形態では、幹細胞という用語は、胚性幹細胞を意味する。

【0117】

特に、胚性幹細胞は、胚の内細胞塊に由来する。本発明の発明者らは、本発明の培養培地が内細胞塊の発生を保護および／または改善することを示した。したがって、本発明の培養培地は、内細胞塊由来の胚性幹細胞を保護する。

【0118】

一実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞であり得る。

【0119】

一実施形態では、（バックグラウンド）培地は、幹細胞培養専用の培地であり得る。任意の公知の幹細胞培養培地は、バックグラウンド培地として使用され得る。

【0120】

一実施形態では、幹細胞（バックグラウンド）培地は、多能性幹細胞の培養のための培地であり得る。

【0121】

一実施形態では、幹細胞（バックグラウンド）培地は、ヒト胚性幹細胞および／またはｉＰＳ細胞の培養のための培地であり得る。

【0122】

一実施形態では、幹細胞（バックグラウンド）培地は、ｍＴｅＳＲ（商標）１として公知の市販の培地、例えば、（ＳｔｅｍＣｅｌｌ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫから入手可能な）ヒト胚性幹細胞およびｉＰＳ細胞のための規定のフィーダフリー維持培地であり得る。

【0123】

胚または幹細胞は、５〜２０％ｖ／ｖの酸素含有量の環境で培養され得る。

【0124】

一実施形態では、胚、配偶子または幹細胞は、雰囲気酸素条件下で培養される。本明細書で使用される雰囲気酸素条件は、約１８〜２２％ｖ／ｖまたは約１９〜２１％ｖ／ｖであり得る。一実施形態では、雰囲気酸素条件は、約２０％ｖ／ｖである。

【0125】

別の実施形態では、胚、配偶子または幹細胞は、低酸素条件下で培養される。本明細書で使用される低酸素条件は、約３％（ｖ／ｖ）〜約７％（ｖ／ｖ）または約４％（ｖ／ｖ）〜約６％（ｖ／ｖ）の酸素濃度であり得る。一実施形態では、低酸素条件は、約５％（ｖ／ｖ）である。

【0126】

本発明は、リポ酸またはその誘導体の使用に関する。リポ酸という用語は、α−リポ酸を意味し得る。この化合物は、任意のラセミ体、例えば（±）−１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、（Ｒ）−５−（１，２−ジチオラン−３−イル）ペンタン酸または（Ｓ）−１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸であり得る。リポ酸またはその誘導体は、エナンチオマー形態の混合物として、または単一のエナンチオマーとして追加され得る。後者の場合、Ｒ−エナンチオマーは、より生物学的に活性であることが見出されている。本発明において使用するためのリポ酸の１つの誘導体は、リポエートである。リポエートは、リポ酸の塩またはエステル誘導体である。リポ酸のさらなる誘導体としては、メチル化リポ酸が挙げられる。リポ酸との関連で本明細書で使用される「誘導体」という用語は、リポ酸と本質的に同等の生理学的特性を有する生物学的に活性な両親媒性ジスルフィド／チオール分子を意味する。

【0127】

本明細書で使用される「アセチル−システイン」という用語は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（例えば、非改変ＮＡＣ）またはその誘導体、例えばＮ−アセチルシステイン−アミド（ＮＡＣＡ）であり得る。

【0128】

好ましい実施形態では、本明細書で使用される「アセチル−システイン」という用語は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（例えば、非改変ＮＡＣ）を意味する。

【0129】

アセチル−カルニチンという用語は、アセチル−Ｌ−カルニチンと称され得る。

【0130】

一実施形態では、胚または幹細胞は、本発明の培地中、約３５℃〜約３９℃の温度で培養され得る。

【0131】

好ましい実施形態では、胚または幹細胞は、本発明の培地中、約３６．５℃〜約３７．５℃の温度で培養され得る。

【0132】

最も好ましい実施形態では、胚または幹細胞は、本発明の培地中、約３７℃の温度で培養され得る。

【0133】

一実施形態では、本発明の培養培地は、補酵素Ｑまたはユビキノンを含まない。

【0134】

一実施形態では、本発明の培養培地は、最終組成において０．０００１重量％〜０．００５重量％の範囲の補酵素Ｑまたはユビキノンを含まない。

【0135】

一実施形態では、本発明の培養培地は、ポリソルベート界面活性剤を含まない。ポリソルベート界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）またはＳｐａｎ（商標）であり得る。

【0136】

本明細書で言及される場合、配偶子への言及は、単数の配偶子および複数の配偶子の両方を含む。換言すれば、配偶子は、「１つの配偶子または複数の配偶子」を意味する。

【0137】

本明細書で言及される場合、胚への言及は、単数の胚および複数の胚の両方を含む。換言すれば、胚は、「１つの胚または複数の胚」を意味する。

【0138】

本明細書で言及される場合、幹細胞への言及は、単数の幹細胞および複数の幹細胞の両方を含む。換言すれば、幹細胞は、「１つの幹細胞または複数の幹細胞」を意味する。

【0139】

特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２０ ＥＤ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本開示において使用される用語の多くに関する一般辞書を当業者に提供する。

【0140】

本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料は、本開示の実施形態の実施または試験において使用され得る。

【0141】

一定範囲の値が提供される場合、文脈上特に明確な指定がない限り、その範囲の上限と下限との間に介在する各値もまた、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されていると理解される。任意の指定値または指定範囲内に介在する値と、任意の他の指定値またはその指定範囲内に介在する値との間のより小さい各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、前記範囲内に包含または除外され得、より小さい範囲にいずれかの限度、両方の限度が包含されるかまたはいずれの限度も包含されない各範囲もまた、本開示（すなわち、指定範囲内の任意の具体的に除外された限度に関する主題）内に包含される。指定範囲が限度の一方または両方を包含する場合、その包含される限度のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本開示に包含される。

【0142】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「胚」への言及は、複数のこのような候補胚を含む、など。

【0143】

本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。このような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲の先行技術を構成することを認めると解釈されるものは、本明細書には存在しない。

【0144】

出願または本出願で引用されるすべての特許文献および非特許文献もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

以下の図面および実施例を参照して、単なる例として、本発明を説明する。

【実施例】

【0146】

方法および材料
胚の収集
５ＩＵの妊馬血清ゴナドトロピンを３〜４週齢のＦ１未経産ハイブリッド雌性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）に腹腔内注射した。４８時間後、５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピンを投与し、雌性マウスを１２週齢超のＦ１雄性マウスと交配させた。翌朝、膣粘液栓の存在によって、交配の成功を確認した。ｈＣＧ注射の２２時間後に、５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミンを補充した予熱取扱い培地（Ｇ−ＭＯＰＳ）中で、前核卵母細胞を収集した。３００ＩＵ／ｍｌヒアルロニダーゼを含有するＧＭＯＰＳを用いて、卵母細胞から卵丘細胞を剥離した。培養のために配分前に、すべての胚をＧ−ＭＯＰＳ培地で２回洗浄し、Ｇ−１（商標）培地で１回洗浄した。飼料および水を不断給餌して、光日１２時間の光周期で動物を飼育した。すべてのマウス実験は、施設内動物倫理委員会によって承認された。

【0147】

胚の培養
加湿マルチガスインキュベーター（Ｓａｎｙｏ ＭＣＯＫ−５Ｍ［ＲＣ］，Ｊａｐａｎ）内において、６％ＣＯ_２空気（大気酸素約２０％）または６％ＣＯ_２５％酸素、パラフィン油下、２０ｕｌの培地滴中で、胚を１群１０個で３７℃で培養した。Ｇ−１（商標）培地（ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−１（商標）、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）中で胚を４８時間培養し、次いで、Ｇ−２（商標）培地（ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−２（商標）、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）中でさらに４８時間培養した。４日目の子宮移植のために選択した胚盤胞を、移植前にＧ２培地中で２４時間培養した。３５ｍｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、すべての培養を実施した。

【0148】

胚の移植
偽妊娠を樹立するために、８〜１２週齢のＦ１雌性マウスを精管切除雄と交配させた。翌朝、膣栓の存在によって、交配の成功を確認した。４日目の胚盤胞（受精後９６時間）を４日目の偽妊娠雌性マウスの子宮に外科移植した（レシピエント雌の生殖管に同調）。レシピエント雌性マウスをイソフルランガスで麻酔した。背部切開を介してガラスピペットによって、５個の胚を各子宮角の内腔に移植し、各レシピエント雌は、対照群および処置群から胚を受けた。いかなる優先的着床バイアスも回避するために、代替群をレシピエント１匹当たり左右両方の角に移植した。胚移植の後、滅菌外科用クリップで皮膚創傷を密封した。１０日後、妊娠雌を屠殺し、胎児発生または再吸収部位を記録した。測定を行って、Ｗａｈｌｓｔｅｎ ａｎｄ Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ（１９７７）（Ｊ．ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ４２：７９−９２）（これは、参照により本明細書に組み込まれる）によって考案されたように、頭殿長、胎児の体重および胎盤の重量、ならびに胎児の耳、眼および四肢の発達の形態学的評価を決定した。

【0149】

胚細胞数の決定
当技術分野で一般に公知の技術によって胚の鑑別染色を実施して、５日目（例えば、胚盤胞）における内細胞塊（ＩＣＭ）および栄養外胚葉（ＴＥ）への細胞の配分を決定した。簡潔に言えば、プロナーゼを使用して透明帯を除去した後、補体反応（これは、ヨウ化プロピジウムでＴＥ核を標識し、ＩＣＭはインタクトな未標識状態のままである）で胚を処置した。ビスベンズイミド処置の後、すべての核を染色した。胚をグリセロールにホールマウンティングし、デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ ｄｉｇｉｔａｌ ｓｉｇｈｔ ＤＳ−Ｆｉ１）を備える倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００）を使用してイメージングし、イメージングソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して核をカウントした。

【0150】

ＭＣＢおよびＢＳＯ処置のための胚培養
加湿マルチガスインキュベーター（Ｓａｎｙｏ ＭＣＯＫ−５Ｍ［ＲＣ］，Ｊａｐａｎ）内において、６％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２７４％Ｎ_２、パラフィン油（Ｏｖｏｉｌ，Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）下、２０ｕｌの培地滴中で、胚を１群１０個で３７℃で培養した。胚の半分を対照群に割り当て、残りの半分を処置群に割り当てた。Ｇ−１（商標）培地（ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−１（商標）、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）中で、対照群の胚を４時間培養した。同様に、（実施例２で決定した）最適な三重抗酸化物質用量を補充したＧ−１（商標）培地中で、処置群の胚を培養した。

【0151】

ＢＳＯ投与量の最適化
収集の直後に、０、５０、１００、２００、４００、８００、１６００μＭの用量のＢＳＯでスパイクしたＧ−１（商標）培地中、６％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２７４％Ｎ_２で、前核対照胚を３７℃で４時間インキュベートした。ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−１（商標）培地で胚を十分にリンスし、ガラスボトムディッシュ（Ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ，Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）上に作った２μｌ滴のＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有ＧＭＯＰＳ（Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）Ｐｌｕｓ，Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）中に個別に置き、蛍光イメージングのためにパラフィン油（Ｏｖｏｉｌ，Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）でオーバーレイした。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＳ１００）下で３６０±４０ｎｍ／４６０±４０ｎｍの励起／発光波長の蛍光を記録することによって、最適投与量を決定した。記録した蛍光からブランク（ＢＳＯ曝露なしの胚）および培養培地の基礎レベルの値を差し引くことによって、結果を計算した。使用したすべての培地および油を、６％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２７４％Ｎ_２で予め一晩平衡化した。

【0152】

ＭＣＢ投与量の最適化
前述のようにＢＳＯの最適化と同様に、０、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０μＭの用量のＭＣＢを補充したＧ−１（商標）培地中で１５分間インキュベートした胚を用いて、ＭＣＢ蛍光プローブの最適化を行った。

【0153】

グルタチオン（ＧＳＨ）に対するＭＣＢ特異性の検証
２００μＭ ＢＳＯおよび１０μＭ ＭＣＢの最適用量を使用して、ＧＳＨに対するＭＣＢの特異性を検証した。前述のようにプローブ投与量の最適化と同じ方法で、検証を行った。収集の直後に、２００μＭ ＢＳＯを補充したＧ−１（商標）培地中で、前核胚を４時間インキュベートした。ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−１（商標）培地で十分にリンスした後、１０μＭ ＭＣＢ中で胚をさらに１５分間インキュベートした。ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−１（商標）で最後に十分にリンスした後、パラフィン油下、２μｌ滴のＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）含有Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）中に胚を個別に置き、蛍光画像を撮影した。

【0154】

グルタチオンレベルの決定
卵母細胞の収集およびインキュベーションの４時間後、同じ培養条件下で、対照群および処置群の両方の胚を１０μＭ ＭＣＢで１５分間処置した。胚をリンスし、２ｕｌのＧ−１（商標）培地滴に個別に置いた後、前述のように蛍光をキャプチャした。ＭＣＢの時間経過を評価するために、画像を１０分ごとに撮影した。

【0155】

統計分析
対照と比較したすべての処置の細胞数データを一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に供し、続いて、ボンフェローニ多重比較試験に供した。３×２分割表を使用して、比率データを比較した。単回投与の場合、スチューデントｔ検定を使用して、データ平均を対照と比較した。分析前に、バートレット検定を使用して、正常性についてすべての群を試験した。差異は、０．０５のＰ値で生物学的に有意であるとみなした。（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅから入手可能な）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０４を使用して、すべての分析を実施した。

【0156】

実施例１：単一の化合物を用いた２０％Ｏ_２における集団胚発生
ＨＳＡ５ｍｇ／ｍｌ（ＨＳＡ，Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を補充したＧ−（商標）１およびＧ−２（商標）培地中で、対照群で培養した胚を成長させた。同様に、１、１０および１００μＭの用量のアセチルカルニチン、アセチルシステインまたはα−リポ酸Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を補充し、対照群と同様にＨＳＡを補充したＧ−１（商標）およびＧ−２（商標）培地中で、処置群の胚を培養した。胚を培養し、得られた胚盤胞細胞系統の数を分析することによって、カルニチン（図１ａおよび表１ａは、２回の独立した実験を表す）、システイン（図１ｂおよび表１ｂは、２回の独立した実験を表す）およびリポ酸（図１ｃおよび表１ｃ）の最適用量を決定した。「総平均」は、５日目の胚（内細胞塊および栄養外胚葉を含む）の平均総細胞数を意味する。有意に多い細胞数をもたらした用量を最適用量とみなした。アセチル−カルニチンの最適用量は１０μＭであり、栄養外胚葉細胞を有意に増加させて、胚盤胞細胞数の増加をもたらすことが見出された。同様に、アセチル−システインの最適用量は１０μＭであり、胚盤胞の内部細胞数を有意に増加させた。５μＭはリポ酸の最適用量であることが見出され、有意に多い栄養外胚葉および内部細胞数を示して、胚盤胞細胞数の増加をもたらした。対照と比較して、いかなる処置も胚盤胞形成に悪影響はなかった（データは示さず）。

【表1A】

【表1B】

【表1C】

【0157】

加えて、これらのデータは、単一の化合物の濃度を上昇させるだけでは、本発明の組み合わせに関連する利益が得られないことを示している。

【0158】

実施例２：胚盤胞細胞数に対する組み合わせ抗酸化物質の効果。
ＨＳＡ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）５ｍｇ／ｍｌを補充したＧ−１（商標）およびＧ−２（商標）培地中で、対照群で培養した胚を成長させた。同様に、１０μＭアセチルカルニチン−１０μＭアセチルシステイン、１０μＭアセチルカルニチン−５μＭリポ酸、１０μＭアセチルシステイン−５μＭリポ酸、１０μＭアセチルカルニチン−１０μＭアセチルシステイン５μＭリポ酸の三重カクテルを補充し、ＨＳＡを補充したＧ−１（商標）およびＧ−２（商標）培地中で、処置群の胚を培養した。三重抗酸化物質カクテルで処置した胚では、５日間インキュベートした後の胚盤胞細胞数は、二重抗酸化物質処置よりも有意に多かった。１０ｕＭカルニチン−５ｕＭリポ酸群においても、総細胞数は、対照と比較して有意に多かったが、三重カクテルでは、ＴＥ細胞も有意に増加しており、これがより多くの総細胞数に寄与していた（図２）。

【0159】

実施例３：組み合わせ化合物を用いた５％Ｏ_２における集団胚発生
加湿マルチガスインキュベーター（Ｓａｎｙｏ ＭＣＯＫ−５Ｍ［ＲＣ］，Ｊａｐａｎ）内において、６％ＣＯ_２、５％Ｏ_２８９％Ｎ_２、パラフィン油（Ｏｖｏｉｌ，Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）下、２０μｌの培地滴中で、胚を１群１０個で３７℃で培養した。胚の半分を対照群に割り当て、残りの半分を処置群に割り当てた。先に決定したように、最適な抗酸化物質用量を補充した培地中で、処置群の胚を培養した。５％Ｏ_２で培養した場合、三重カクテルで個別培養した胚では、ＩＣＭおよび栄養外胚葉細胞が有意に増加しており、胚盤胞の総細胞数が増加した（図３）。

【0160】

実施例４：組み合わせ化合物を用いた２０％Ｏ２における個別胚培養
加湿マルチガスインキュベーター（Ｓａｎｙｏ ＭＣＯＫ−５Ｍ［ＲＣ］，Ｊａｐａｎ）内において、６％ＣＯ２空気（大気酸素約２０％）、パラフィン油下、２０μｌの培地滴中で、胚を３７℃で個別培養した。胚の半分を対照群に割り当て、残りの半分を処置群に割り当てた。三重カクテルで個別培養した胚では、ＩＣＭおよび栄養外胚葉細胞が有意に増加しており、胚盤胞の総細胞数が増加した（図４）。これらの結果は、胚発生の改善が個別培養中にも観察されることを示している。個別培養した胚では、総細胞数が少なかったが、集団培養とは対照的に、個別培養した胚では、抗酸化物質を組み合わせる効果が大きく、ＩＣＭ、ＴＥおよび総細胞数が増加した（図４対図２）。

【0161】

実施例５：三重カクテルで培養した個々の胚の分裂および発生時間。
明視野光学を備えるデュアルガスサーモスタットインキュベーター（ＭＣＯＫ−５Ｍ［ＲＣ］，Ｓａｎｙｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）およびＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（商標）（Ｕｎｉｓｅｎｓｅ ＦｅｒｔｉｌｉＴｅｃｈ）タイムラプスイメージングシステムを使用したＰｒｉｍｏＶｉｓｏｎ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を使用して、胚発生動態を取得した。対照群および処置群において、最適な抗酸化物質用量で胚を個別培養し、培養期間を通して１５分間隔でタイムラプス画像を作成した。ｈＣＧ投与後の時間として、形態動態事象のタイミングを記録した。１０μＭカルニチン、１０μＭシステインおよび５μＭリポ酸１０μＭを含む抗酸化物質カクテルを補充した培地中、または抗酸化物質を含まない対照培地中、２０％Ｏ２で個別培養した胚の細胞分裂および発生時間（図５）。発生動態の分析により、三重カクテル群で培養した胚では、拡張（９９．８±０．５時間対１０２．８±０．７時間；Ｐ＜０．０５）および孵化胚盤胞（１０２．６±０．８時間対１０４．９±１．１時間；Ｐ＜０．０１）までの時間が、対照群で培養した胚よりも有意に短縮されたことが明らかになったが（図５）、これは、胚盤胞が発達するにつれて発生の後期に、抗酸化物質への曝露の利益が見られ得ることを示している。

【0162】

実施例６：化合物への曝露時間の効果
抗酸化物質への曝露時間の効果
最大５日間の培養期間全体を通して、カクテルを補充した培地（Ｇ１およびＧ２）中で成長させた胚では、対照と比較して、胚盤胞の内細胞塊数が有意に増加し、総細胞数が有意に増加した。補充培地では、Ｇ−１（商標）培地中で成長させた胚においてのみ、胚盤胞の総細胞数も有意に増加したが（図６）、これは、緊密化前の利益を示している。

【0163】

実施例７：ＢＳＯ特異性に起因する相関ＧＳＨ喪失
最適なプローブ用量は、２００μＭブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）および１０μＭ／ｍｌモノクロロビマン（ＭＣＢ）であることが見出された。ＢＳＯは、グルタチオン合成酵素の阻害剤である。ＭＣＢは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）に結合し、細胞内のＧＳＨを測定するために使用されるＧＳＨの蛍光マーカーである。

【0164】

２００μＭ ＢＳＯで前処置し、続いて１０μＭ／ｍｌまたは４０μｍｏｌ／ｍｌ ＭＣＢで処置した胚は、ＭＣＢのみで処置した群と比較して有意に減少した蛍光を示した（図７）。これらの結果は、グルタチオン合成酵素に対するＢＳＯの高い特異性結合がＧＳＨの内因性濃度を減少させて、より低い蛍光レベルをもたらすことを示している。この図は、２００μＭ ＢＳＯと１０μＭまたは４０μＭ ＭＣＢのいずれかとの組み合わせで処置した胚では、ＭＣＢのみで処置した胚と比較して、蛍光が有意に減少していることを示している。１０μＭ ＭＣＢは、４０μＭ（Ｐ＝０．０１１）と比較して蛍光を大きく減少させたので（Ｐ＝０．００４）、その後の実験では、この濃度（４０μＭ）を使用した。興味深いことに、８０μＭ ＭＣＢでは、ＢＳＯ処置群と非ＢＳＯ処置群との間で蛍光に有意差はなかったが、これは、より高いＭＣＢ濃度では、ＭＣＢ蛍光レベルが高いので、ＢＳＯ封鎖による蛍光の減少を検出することができなかったことを示している。

【0165】

実施例８：胚ＧＳＨレベルに対する抗酸化物質の効果
材料および方法のセクションにしたがって胚を培養し（「ＭＣＢおよびＢＳＯ処置のための胚培養」を参照のこと）、上記材料および方法のセクションの「グルタチオンレベルの決定」の間でグルタチオン（ＧＳＨ）レベルを決定した。化合物（例えば、抗酸化物質）の非存在下で培養した対照群の胚では、インビボでフラッシュした胚と比較して、ＧＳＨのレベルが有意に低かった（Ｐ＜０．０１）（図８）。しかしながら、胚を三重抗酸化カクテルと共に培養した場合、ＧＳＨのレベルは、インビボで発生した胚のものと同様であり、これは、抗酸化物質が、インビトロで培養した胚内のＧＳＨのレベルを維持したことを示している。

【0166】

実施例９：胎児発生および妊娠に対する化合物の効果（２０％Ｏ_２）、
胚盤胞を偽妊娠レシピエントに移植した後、抗酸化物質の存在下で培養した胚では、対照と比較して、有意に頭殿長が長く（１１．６±０．１ｍｍ対１１．３±０．１ｍｍ；Ｐ＜０．０１）、胎児が重く（２０９．８±１１．８ｍｇ対１８３．９±５．９ｍｇ；Ｐ＜０．０５）、胎盤が重かった（１０３．５±３．１ｍｇ対９３．６±２．７ｍｇ；Ｐ＜０．０１）（表２）。対照と三重抗酸化物質培養胚との間で着床率に有意差はなかった。同様に、四肢、眼および耳の形態学的評価ならびに性決定パラメータは、２つの群間で有意差を示さなかった。

【表2】

データは、％平均±ＳＥＭとして表されている。ｎ＝移植した胚盤胞９５個／群
Ｆ、雌；Ｍ、雄；ｎ／ａ、未決定；Ｅｘ、外脳
行内の文字は、群間の有意差を表す。
^ａＰ＜０．０５、^ｂＰ＜０．０１。

【0167】

実施例１０：インビボでフラッシュした４日目の胚と比較した、５％酸素で培養した胚の胎児発生および妊娠に対する化合物の効果
胚盤胞を偽妊娠レシピエントに移植した後、インビボでフラッシュした胚では、対照群および三重抗酸化物質群の胚と比較して、胎児が有意に重かった（Ｐ＜０．０００１）（表３）。加えて、インビボでフラッシュした群の胎児では、対照群と比較して、頭殿長が有意に長かったが（Ｐ＜０．０１）、しかしながら、三重群と比較して差異はなかった。さらに、３つの群間で着床率、四肢、眼および耳の形態学的評価ならびに性別パラメータに有意差はなかった。

【表3】

データは、％平均±ＳＥＭとして表されている。移植した胚盤胞／群：対照（ｎ＝６０）、三重（ｎ＝５５）、
Ｆ、雌；Ｍ、雄；Ｅｘ、外脳
インビボと有意に異なる；^＊＊＊Ｐ＜０．０００１、
対照は、インビボと有意に異なる；^＊＊Ｐ＜０．０１、

【0168】

実施例１１：ＩＶＦのための抗酸化物質の組み合わせの効果は、胚発生を有意に改善する
酸化ストレスは、ヒトＡＲＴのすべての段階で生じ、配偶子は、酸化的損傷に特に感受性である。本発明者らは、培養培地中における抗酸化物質リポエートとカルニチンと（場合によりシステインと）の組み合わせが、胚発生に非常に有益であったことを示した。

【0169】

本実験研究では、本発明者らは、ＩＶＦ中の抗酸化物質の存在も有益であったことを示す。したがって、本発明者らは、卵母細胞および精子の収集ならびにＩＶＦ中のこの抗酸化物質群の効果を調査した。

【0170】

材料および方法：１０μＭアセチル−Ｌ−カルニチン／１０μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン／５μＭ α−リポ酸の存在下または非存在下、２０％酸素で、Ｆ１マウスからの配偶子収集およびＩＶＦを行った。４つの群を作って、抗酸化物質を含むまたは含まないＧ−１（商標）およびＧ−２（商標）培地中で、得られた胚を個別培養した。タイムラプス顕微鏡検査とそれに続く鑑別核染色とによって胚発生を分析して、胚盤胞への細胞配分を決定した。

【0171】

対照の総細胞数および内細胞塊（ＩＣＭ）数は、それぞれ３２．９±２．１および７．７±２．１であった。抗酸化物質をＩＶＦ用の培地にのみ追加すると、総数が有意に増加した（４８．７±２．８；Ｐ＜０．０１）。抗酸化物質が胚培養培地中にのみ存在すると、総細胞数が有意に増加した（５０．４±３．２；Ｐ＜０．００１）。しかしながら、抗酸化物質がＩＶＦ培地および胚培養培地の両方に存在すると、総胚盤胞およびＩＣＭ細胞数の両方が有意に増加した（５９．８±３．４、１５．３±１．１；Ｐ＜０．０１）。ＩＶＦ由来胚に対するその後のタイムラプス分析により、ＩＶＦ中および培養中における抗酸化物質処置は、５細胞分裂までの発生時間の短縮に関連しており（５１．８±０．６時間対５４．１±０．７時間）、これが拡張胚盤胞期まで継続したことが明らかになった。

【0172】

結論として、ＩＶＦおよび胚培養の間の抗酸化物質の存在は、胚発生速度ならびにその後の細胞数および配分に対して有意な有益効果を与える。これらの知見は、ＩＶＦ培地および胚培養への抗酸化物質の補充が、おそらくは酸化ストレスの減少を介して、ＡＲＴにおけるヒト胚の生存度を維持するのをさらに助けることを示している。

【0173】

別の研究では、配偶子取扱い培地（すなわちＧ−ＭＯＰＳ（商標））中における抗酸化物質の存在下または非存在下で前核胚を収集し、抗酸化物質を含まない対照培地中で培養した。ＩＶＦに使用した受精培地はＧ−ＩＶＦ（商標）であり、１細胞から胚盤胞までの胚の培養に使用した胚培養培地は、Ｇ−１（商標）および次いでＧ−２（商標）培地であった（Ｇ−１（商標）は１日目に４８時間であり、Ｇ−２（商標）は３日目に４８時間であった）。鑑別細胞染色によって、胚発生を分析した。

【0174】

結果：抗酸化物質をＩＶＦ用の配偶子取扱い培地にのみ追加すると、対照と比較して有意に増加した胚盤胞細胞数を有する胚が得られた（４８．９±３．３対３３．６±２．１；Ｐ＜０．００１）（図９を参照のこと）。同様に、抗酸化物質が胚培養培地中にのみ存在すると、対照と比較して、胚盤胞細胞数が有意に増加した（５９．３±３．１対３３．６±２．１；Ｐ＜０．００１））（図９を参照のこと）。また、配偶子収集中および胚培養中の両方において抗酸化物質が存在すると、対照と比較して、胚盤胞細胞数がさらに有意に増加した（６１．０±３．９対３３．６±２．１；Ｐ＜０．００１）（図９を参照のこと）。ＩＶＦ由来胚に対するその後のタイムラプス分析により、収集中および培養中の両方における抗酸化物質処置は、５細胞分裂までの発生時間の短縮に関連しており（５１．８±０．６時間対５４．１±０．７時間）、これが胚盤胞期まで継続したことが明らかになった（図１０を参照のこと）。独立した研究では、胚収集中に抗酸化物質で前核卵母細胞を２０分間処置すると、対照と比較して、胚盤胞内細胞塊数が有意に増加した（１９．３±１．２対１６．２±１．１；Ｐ＜０．０５）。

【0175】

結論：配偶子調製およびＩＶＦ中に、さらには培養期間を通して、抗酸化物質を含めると、胚細胞数および発生速度に対して有益な結果となる。これらの知見は、卵母細胞および精子調製／取扱い培地およびＩＶＦ培地ならびに胚培養への抗酸化物質の補充が、酸化ストレスを減少させることによって、ＡＲＴにおけるヒト胚の発生および生存度をさらに助けることを示している。

【0176】

実施例１２：抗酸化物質の組み合わせの効果は、インビトロにおけるヒト胚発生を有意に改善する
本実験研究では、本発明者らは、抗酸化物質の存在が、インビトロにおけるヒト胚発生に有益であったことを示す。本発明者らは、インビトロにおける胚発生中に、抗酸化物質群（すなわち、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸）の組み合わせの効果を調査した。

【0177】

材料および方法
実験群では、抗酸化物質（１０μＭアセチル−Ｌ−カルニチン／１０μＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン／５μＭ α−リポ酸）をＶｉｔｒｏｌｉｆｅ培地Ｇ−ＩＶＦ（これは、ヒト卵母細胞の採取および受精に使用した）ならびに（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅから入手可能な）タンパク質補充Ｇ１およびＧ２培地（これらは、ヒト胚培養に使用し、３日目に培地をＧ−１からＧ−２に交換した）に追加した。

【0178】

５％酸素で胚を培養した。

【0179】

タイムラプス顕微鏡検査によって胚発生を評価し、５日目に、規定の胚盤胞採点方式によって胚の質を測定した（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９９９ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｉｎ Ｊａｎｓｅｎ Ｒ ａｎｄ Ｍｏｒｔｉｍｅｒ Ｄ（ｅｄｓ）Ｔｏｗａｒｄｓ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｅｒｔａｉｎｔｙ：ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｂｅｙｏｎｄ １９９９．Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃａｒｎｆｏｒｔｈ，ＵＫ，ｐｐ．３７８−３８８）を参照のこと）。最終結果のパラメータは、胚盤胞期における利用率および胚の質であった。

【0180】

結果：抗酸化物質を胚培養培地に追加すると、抗酸化物質を含まない同程度の培地中で培養した胚と比較して多くの良質な胚盤胞（すなわち、ガードナー評価方式（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９９９を参照のこと）による３ＡＢまたはそれを超える質スコアに達した胚盤胞の割合）が得られた（図１３を参照のこと）。図１３は、ガードナー胚盤胞評価方式による良質な胚盤胞（ＧＱＢ）のスコアに達した胚盤胞の胚盤胞の総数に対する割合をパーセントで示す。対照群では、３０個の胚盤胞のうちの８個をＧＱＢと評価し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、３６個のうちの１８個をＧＱＢと評価した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の大きい差異は、０．０５４５のｐ値で示されている。

【0181】

加えて、抗酸化物質は、胚盤胞利用率（すなわち、移植のために新鮮状態で使用される胚盤胞、または患者へのその後の移植のために凍結保存される胚盤胞の割合）を有意に増加させた（図１１および図１２を参照のこと）。図１１は、受精卵母細胞の総数に対する胚盤胞利用率をパーセントで示す。対照群では、さらなる臨床用途のために、４４個の受精卵母細胞のうちの１２個を選択し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、さらなる臨床治療用途のために、４９個のうちの２６個を選択した。質の要件を満たさない胚盤胞は選択せずに廃棄した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の差異は、０．０１１２のｐ値で有意であった。

【0182】

図１２は、胚盤胞の総数に対する胚盤胞利用率をパーセントで示す。対照群では、さらなる臨床用途のために、２８個の胚盤胞のうちの１２個を選択し、１０μＭアセチルカルニチン、１０μＭアセチルシステインおよび５μＭリポ酸を補充した培地中で培養した群では、さらなる臨床治療用途のために、３６個のうちの２６個を選択した。質の要件を満たさない胚盤胞は選択せずに廃棄した。市販のソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用して両側ｔ検定を適用したところ、２つの群間の差異は、０．０１７３のｐ値で有意であった。

【0183】

結論：インビトロにおける卵母細胞回収、受精および胚培養中に抗酸化物質を含めると、胚盤胞の質に対して有益な結果となる。特に、抗酸化物質を使用すると、治療に使用され得るより良質なより多くの胚盤胞が得られた。

【0184】

上記本明細書で言及されているすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。記載されている本発明の方法およびシステムの様々な改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関連して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、本発明を行うための記載されている様式の様々な改変であって、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかな改変は、以下の特許請求の範囲内であることを意図する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】