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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】6923780
(24)【登録日】2021年8月3日
(45)【発行日】2021年8月25日
(54)【発明の名称】防除真菌の殺虫毒力を増強する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/80 20060101AFI20210812BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20210812BHJP
A01N 63/30 20200101ALI20210812BHJP
A01P 7/00 20060101ALI20210812BHJP
A01P 7/04 20060101ALI20210812BHJP
C07K 14/435 20060101ALN20210812BHJP
【ＦＩ】
C12N15/80 ZZNA
C12N15/12
A01N63/30
A01P7/00
A01P7/04
!C07K14/435
【請求項の数】2
【全頁数】14
(21)【出願番号】特願2021-17929(P2021-17929)
(22)【出願日】2021年2月8日
【審査請求日】2021年2月8日
(31)【優先権主張番号】202011372999.4
(32)【優先日】2020年11月30日
(33)【優先権主張国】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】520022540
【氏名又は名称】中国計量大学
(74)【代理人】
【識別番号】100088063
【弁理士】
【氏名又は名称】坪内 康治
(72)【発明者】
【氏名】王正亮
(72)【発明者】
【氏名】兪暁平
(72)【発明者】
【氏名】付賢樹
【審査官】
上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１５−５１４１１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
中国特許出願公開第１０５８６１５０１（ＣＮ，Ａ）
【文献】
中国特許出願公開第１０４３８７４６０（ＣＮ，Ａ）
【文献】
韓国公開特許第１０−２０１９−００５１４１０（ＫＲ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮｌＦＡＦ１遺伝子を含む発現カセットを真菌ゲノム中に有効的発現のために導入するこ
とを含み、前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子はトビイロウンカに対し免疫負制御作用を有し、前記
ＮｌＦＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、前記ＮｌＦ
ＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示さ
れることを特徴とする防除真菌の殺虫毒力を増強する方法。
とを含み、前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子はトビイロウンカに対し免疫負制御作用を有し、前記
ＮｌＦＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、前記ＮｌＦ
ＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示さ
れることを特徴とする防除真菌の殺虫毒力を増強する方法。
【請求項2】
前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子を含む発現カセットをコガネムシの緑僵病菌ゲノム中に有効的発
現のために導入することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
現のために導入することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物防除の分野に関するものであり、具体的には、防除真菌の殺虫毒力を増強する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
水稲は、重要な食糧作物であり、世界の諸国では、農業生産と国民生活の中で重要な地位を占めている。稲生産を確保するためには、害虫の予防法と対処法が第１である。ところ
で、ビイロウンカ（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔaｌ）は、特にアジア
諸国では、最も主要な水稻害虫の１つであり、稲汁を吸い、卵を産み、稲組織を破壊し、
乾かせ倒伏させ、それだけでなく、水稲ウイルス病を蔓延させ、稲収量を大きく失うこと
がある。
【0003】
現在、ビイロウンカの防除は、抗虫稲種の開発と化学殺虫剤の応用という２つの重要な手段が用いられている。その中、抗虫種の利用は、往々にしてビイロウンカの快速破壊性と
ハイレベルの変異がために、耐用年数が短縮され、長時間的サイクル、高コストであると
いう欠陥がある。化学殺虫剤の持続的かつ大量の使用は、ビロウカノンの耐薬性をレベル
アップさせるだけでなく、環境や非標的生物に対して深刻な危害も及ぼすことがある。一
方では、微生物農薬は、賞味期間が長く、分解されやすく、環境にやさしく、害虫に薬剤
耐性を発生させ難いなどの利点を踏まえ、害虫の生物学的防除において広く使われている
。この中では、生物防除緑僵病菌は、ビイロウンカの防除に潜在能力を持つものであると
、確認されている。ところが、ビイロウンカの発病力は、環境や、宿主昆虫自身の防御メ
カニズムなどの多くの要素に影響されるので、その殺虫速率が遅い。このようなタイムラ
グ効果が故に、ビイロウンカの生物防御能力上で大幅に割引き、大規模な応用普及におい
て重要な制限要因である。そのため、化学殺虫剤の使用を効果的に減らし、抗虫稲類の使
用年限を遅らせ、また微生物農薬の応用規模を拡大できる新たな防除法を求め得ることは
、ビイロウンカコントロールの事業展開において肝心なところである。
【0004】
生物防除真菌の発病メカニズムおよび分子生物学の深遠な研究にともなって、遺伝子工学上で生物防除真菌を遺伝子改造することによって、菌株毒性を強めたエンジニア菌の構築
では大きな進展を遂げた。これによって、新たな適用可能な遺伝子資源、特に菌虫相互作
用への関与で宿主免疫制御を可能にさせる遺伝子の発掘は、真菌制剤の改良において新た
な研究方向を提供している。
【発明の概要】
【0005】
本発明の目的は従来の技術における欠陥を克服するために、防除真菌の殺虫毒力を増強する方法を提供することである。
【0006】
ＮｌＦＡＦ１遺伝子を含む発現カセットを真菌ゲノム中に有効的発現のために導入することを含み、前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子はビイロウンカに対し免疫負制御作用を有し、前記Ｎ
ｌＦＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、前記ＮｌＦＡ
Ｆ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示され
ることを特徴とする防除真菌の殺虫毒力を増強する方法である。
【0007】
好ましくは、前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子を含む発現カセットをコガネムシの緑僵病菌ゲノム中に有効的発現のために導入することを含む。
【0008】
好ましくは、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化されたＮｌＦＡＦ１遺伝子フラグメントを真菌発現ベクターｐＡＮ５２−１Ｎ中にクローンし、アスペルギルス・ニデュランスのグリセ
ルアルデヒド−３−りん酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータＰｇｐｄＡとターミネー
タＴｔｒｐＣの間に位置させてｐＡＮ５２−ＮｌＦＡＦ１を構成し、ｐＥＴ２９ｂ−Ｂａ
ｒプラスミドをＸｂａＩ単一酵素により切断し、切断したグルホシネート耐性遺伝子ｂａ
ｒの発現エレメントＰｇｐｄＡ−ｂａｒ−ＴｔｒｐＣを同じくＸｂａＩ単一酵素により切
断し且つ脱リン酸化されたｐＡＮ５２−ＮｌＦＡＦ１中に導入し、スクリーンしてＮｌＦ
ＡＦ１とｂａｒ遺伝子の両発現フレーム方向相同のバイナリーベクタープラスミドｐＡＮ
５２−ＮｌＦＡＦ１−Ｂａｒを獲得し、前記バイナリーベクタープラスミドをＨｉｎｄＩ
ＩＩにより線形化し、その後、ＰＥＧ媒介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネム
シ緑僵病菌野生株中に導入することを含む。
【0009】
好ましくは、前記ＮｌＦＡＦ１遺伝子は、コガネムシ緑僵病菌のビイロウンカに対する毒性を顕著に増強可能である。
【0010】
本発明は、従来の技術に比べて、以下の技術効果を有する。１）本研究は、ビイロウンカの免疫負制御のファクターであるＮｌＦＡＦ１遺伝子を研究
対象とし、クローン鑑定および生物学的情報の分析を行うのであった。ｑＲＴ−ＰＣＲに
よってその時空的発現規律および病原性真菌の誘導発現モードを分析し、真菌発現ベクタ
ーを構築し、ＰＥＧ媒介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネムシ緑僵病菌を導入
することによって、ビイロウンカ毒性を著しく強めた超発現ＮｌＦＡＦ１の遺伝子組換え
菌株を獲得した。
２）汚染ゼロである。従来で使用される化学的防除法は、害虫に一定の抑制効果があるが
、ひと、畜、はたけや水田などの生態系に汚染をもたらし、生態系を破壊し、汚染物が残
されてしまうことがある。本発明の害虫抑制機構及びその方法は、この不都合を克服する
ことができる。
３）本発明はビイロウンカの免疫負制御のファクターであるＮｌＦＡＦ１遺伝子を研究対
象とし、クローン鑑定と生物学的情報分析を行って、殺虫真菌の遺伝改良に新らな策略と
遺伝子資源を提供している。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】コガネムシ緑僵病菌野生株によりビイロウンカ成虫を汚染した後におけるＮｌＦＡＦ１の誘導発現モードを示す図である（横軸は接種時間であり、縦軸は相対発現量である）。
【図3】野生株と超発現株ＭａＴ３の菌糸成長（Ａ）と胞子形成量（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下、図面とともに本発明をさらに詳細に説明する。
【0013】
本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示したタンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び／断片（タンパク質全体に比べ内
部及び／又は末端が欠失した）、変異体、突然変異体、置換物（アミノ酸を置換するタン
パク質）、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタ
ンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディング
するヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一
又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。
【0014】
本発明に記載の「抗虫」は、標的昆虫成長発育繁殖に対し抑制作用を持つことである。具体的には、標的昆虫はビイロウンカである。
【0015】
本発明に記載の「超発現株」、「超発現株ＭａＴ３」「ＭａＴ３」はみな同一真菌株を指す。
【0016】
本発明に記載の「野生株」は、好ましくは、コガネムシ緑僵病菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）野生株Ｍａ４５６を指す。
【0017】
本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示したタンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び／断片（タンパク質全体に比べ内
部及び／又は末端が欠失した）、変異体、突然変異体、置換物（アミノ酸を置換するタン
パク質）、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタ
ンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディング
するヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一
又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。
【0018】
本発明に記載のＤＮＡ分子またはタンパク配列の「フラグメント」若しくは「短化切断」は、元ＤＮＡまたはタンパク配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の一部やその人為的改
造形態（例えば植物発現に適合な配列）をさし、前記配列の長度は変化することがあるが
、抗虫活性を有し得るタンパクまたはポリペプチドを確保（コード）できる十分な長度で
ある。
【0019】
ＦＡＦ １（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ １）は、広く動物の体内に存在している１種の構造保守、機能が多様なタンパク質であり、主にユビキチン関連ドメ
イン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｏｍａｉｎ，ＵＢＡ）とユビキチ
ン調節性Ｘドメイン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｘ ｄｏｍａｉｎ，
ＵＢＸ）によってユビキチン化プロテナーゼ体の媒介標的タンパクの汎素化分解を形成す
る。昆虫免疫信号路における転写制御因子の生物学的活性を調節することにより、核内転
写因子の発現と翻訳を抑制し、宿主の外来侵入物に対する防御レスポンスを低減し、体内
の免疫安定状態を維持することができる。
【0020】
実施例１受験ビイロウンカコロニーは、本試験室で保存し構築したものであった。人工気候室内（
温度２４±１℃、光のサイクル１６Ｌ：８Ｄ、相対湿度７０％±５％）でＴＮ１水稻苗を
持って飼育し維持されたコロニーであった。コガネムシ緑僵病（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ
ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）野生株はＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天培地）斜面上
で４℃にて保存、２５℃で培養、世代をこえて継承とした。
ビイロウンカＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成した。具体的には、ビイロウンカ５歳若虫１
０個を取ってすり鉢中に置いて液体窒素で研磨し均質にさせた。Ｔｒｉｚｏｌ法によって
ビイロウンカ全ＲＮＡを抽出し、微量紫外分光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−２０００
（米））と寒天ゲル電気泳動でＲＮＡの質量と濃度を測定した。検査合格したＲＮＡをモ
ジュールとし、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ(ＴＭ)１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ（ＪＰ））試験キットを用いて、手順書に従って
ｃＤＮＡを合成し、−２０℃で保存した。
蚕免疫負制御因子ＢｍＦＡＦ１遺伝子のタンパク配列を検索源とし、ビイロウンカゲノム
データベース中でローカールＢｌａｓｔによってホモロジー配列検索を行い、１つの予測
タンパクを取得し、ＮｌＦＡＦ１と名付けた。ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５によってＮ
ｌＦＡＦ１増幅プライマーを下記のように設計した。
実施例１に記載のビイロウンカｃＤＮＡをモジュールとし、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ
増幅系は、ｃＤＮＡモジュールは１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）は２μＬ、順
逆方向のプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）はそれぞれ０．５μＬ、１０×バッファー（Ｍ
ｇ２＋を含む）は２．５μＬ、ＬＡＴａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬま
で補充とした。増幅工程は、９４℃で５ｍｉｎ予め変性、９４℃で３０ｓ変性、６０℃３
０ｓアニーリング、７２℃で１．５ｍｉｎ伸長、３５サイクル、そして７２℃で７ｍｉｎ
伸長とした。ＰＣＲ反応が終わったら、１．５％のアガロースゲルで反応産出物の数と分
子量を電気泳動で検出した。
目標増幅産出物を割りゴムで回収し、ｐＭＤ１８−Ｔベクター（ＴａＫａＲａ（ＪＰ））
に接種し、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＤＨ５α感受性細胞中に転化し、陽
性トゥランスフォーメイションを上海生物工程有限公司に送ってシーケンシングを頼んだ
。ビイロウンカｃＤＮＡをモジュールとして増幅した産出物は、シーケンシングと配列分
析を行った。その結果、ビイロウンカＮｌＦＡＦ１遺伝子ｃＤＮＡ配列全長は１９２０ｂ
ｐ（配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される）、コードを含む６３９個のアミ
ノ酸のタンパク（配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される）、前記タンパク分
子量は１５７．２２ｋ、等電点は４．９５であった。
【0021】
実施例２コガネムシ緑僵病菌野生株（以下、野生株と称される）の分生子胞子懸濁液スプレー法に
よりビイロウンカ成虫に接種し、異なる時間で誘導したビイロウンカＮｌＦＡＦ１の発現
量を検出した。具体的には、野生株分生子胞子を０．０２％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８
０水溶液により５×１０７個／ｍＬ濃度の懸濁液を調製し、スプレー法によりビイロウン
カ若虫に接種した（接種体積は１ｍＬ、３ロット、かつロットごとは１００個）。相同体
積で接種した０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０水溶液を対照とした。それぞれ０時間（未接種
）、接種後６、１２、２４と４８時間の後に虫体を収集し、７５％のアルコールで虫体表
面を３回消毒し、毎回は３分時間とし、そして無菌蒸留水により５回洗浄し、虫体を干さ
せて予備用とした。ＮｌＦＡＦ１遺伝子ｃＤＮＡ配列によって一対の定量ＰＣＲプライマ
ーを下記のように設計した。
析はＳＹＢＲR ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭＩＩ試験キットを用いた。反応系は、２×
ＳＹＢＲR Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭＩＩ１０μＬ、上下流プライマー（１０μ
ｍｏｌ／Ｌ）はそれぞれ１μＬ、適量希釈したｃＤＮＡ２μＬとｄｄＨ２Ｏ６μＬとし、
２０μＬ反応系であった。増幅工程は、９５℃で３０ｓ予め変性、そして４０増幅サイク
ルに（９５℃で５ｓ変性、６０℃で３４ｓアニーニング）進入とした。融解グラフは、９
５℃１５ｓ、６０℃１ｍｉｎ、９５℃１５ｓとした。ビイロウンカβ−Ａｃｔｉｎ遺伝子
を内部標準をとした。増幅プライマーは下記のとおりであった。
行った。ＮｌＦＡＦ１遺伝子の病原性真菌に接種した異なる時間誘導後における相対発現
量は２−ΔΔＣｔとし計算され、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０接種グループの発現量を基
数とし、その値は１とした。対照グループ（未接種）と対比すると、４８時間内で野生株
誘導ＮｌＦＡＦ１発現量はいずれも顕著な降下トレントを呈した（Ｐ＜０．０５）。野生
株接種の６時間後に、ＮｌＦＡＦ１発現量が最低であり、ただ対照の５１．８％となった
。誘導からの２４時間と４８時間後に、その発現量が対照の７２．４％と８３．５％とな
り、いずれも対照グループとの相違が顕著なレベルになった（Ｐ＜０．０５）。具体的結
果は図１に示される。
【0022】
実施例３ＮｌＦＡＦ１発現ベクターを構築した。具体的には、以降発現ベクターの構築のためにＮ
ｌＦＡＦ１配列中におけるＸｂａＩ限制切断酵素サイトを除去した。融合ＰＣＲ技術によ
り、ビイロウンカのｃＤＮＡをモジュールとし、２回のＰＣＲ増幅を行ってＮｌＦＡＦ１
全長を取得した。第１回は２回ＰＣＲを含んだ。それぞれＮｌＦＡＦ１の２段ＡとＢの増
幅であった。第２回ＰＣＲは第１回の産出物ＡとＢの混合物をモジュールとし、増幅して
ＸｂａＩを含まなかった限制切断酵素サイトの全長ＮｌＦＡＦ１配列を取得した。
第１回ＰＣＲ増幅系は、ｃＤＮＡモジュールは１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）
は２μＬ、順逆方向のプライマー（Ａ段プライマーはＡ−Ｆ／Ａ−Ｒ、Ｂ段プライマーは
Ｂ−Ｆ／Ｂ−Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ））はそれぞれ０．５μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍ
ｇ２＋を含む）は２．５μＬ、ＬａＴａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬま
で補充とした。増幅工程は、９４℃で予め５ｍｉｎ変性、９４℃で３０ｓ変性、６０℃で
３０ｓアニーリング、７２℃で３０ｓ（Ａ段）および１．５ｍｉｎ（Ｂ段）伸長、３５サ
イクル、そして７２℃で７ｍｉｎ伸長とした。
第１回増幅Ａ段のプライマー：
１０ｍｍｏｌ／Ｌ）は２μＬ、順逆方向のプライマーＡ−Ｆ／Ｂ−Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ
）はそれぞれ０．５μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋を含む）は２．５μＬ、ＬａＴ
ａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬまで補充とした。増幅工程は、９４℃で
予め５ｍｉｎ変性、９４℃で３０ｓ変性、６０℃で３０ｓアニーリング、７２℃で２．０
ｍｉｎ伸長、３５サイクル、そして７２℃で７ｍｉｎ伸長とした。
ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化されたＮｌＦＡＦ１遺伝子フラグメントを真菌発現ベクター
ｐＡＮ５２−１Ｎ中にクローンし、アスペルギルス・ニデュランスのグリセルアルデヒド
−３−りん酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータＰｇｐｄＡとターミネータＴｔｒｐＣ
の間に位置させてｐＡＮ５２−ＮｌＦＡＦ１を構成し、ｐＥＴ２９ｂ−Ｂａｒプラスミド
をＸｂａＩ単一酵素により切断し、切断したグルホシネート耐性遺伝子ｂａｒの発現エレ
メントＰｇｐｄＡ−ｂａｒ−ＴｔｒｐＣを同じくＸｂａＩ単一酵素により切断し且つ脱リ
ン酸化されたｐＡＮ５２−ＮｌＦＡＦ１中に導入し、スクリーンしてＮｌＦＡＦ１とｂａ
ｒ遺伝子の両発現フレーム方向相同のバイナリーベクタープラスミドｐＡＮ５２−ＮｌＦ
ＡＦ１−Ｂａｒを獲得し、前記バイナリーベクタープラスミドをＨｉｎｄＩＩＩにより線
形化し、その後、ＰＥＧ媒介融合のプロトプラスト形質転換によりコガネムシ緑僵病菌野
生株中に導入することを含む。
【0023】
実施例４選択的プレート上で８個の成長および胞子形成が良かったトゥランスフォーメイションを
ランダムにピックアップして、ガラスペーパーを敷いたＰＤＡプレート上に分生子胞子を
均一に塗布し、２５℃で３日培養した後、ＣＡＴＢ法により菌糸体ゲノムＤＮＡを抽出し
、ＰＣＲ鑑定を行なった。２回のＰＣＲによりそれぞれＮｌＦＡＦ１とｂａｒ遺伝子の存
在鑑定を行なった。具体的には、各トゥランスフォーメイションのゲノムＤＮＡをモジュ
ールとし、まずｂａｒ遺伝子のプライマー：
伝子陽性のトゥランスフォーメイションゲノムをモジュールとし、ＮｌＦＡＦ１遺伝子に
よりプライマー：
子の存在鑑定をした。上記ｂａｒ遺伝子とＮｌＦＡＦ１遺伝子ＰＣＲ増幅系は、ｃＤＮＡ
モジュールは１μＬ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）は２μＬ、順逆方向のプライマー
（１０μｍｏｌ／Ｌ）はそれぞれ０．５μＬ、１０×バッファー（Ｍｇ２＋を含む）は２
．５μＬ、ＬＡＴａｑ酵素は０．２５μＬ、ｄｄＨ２Ｏは２５μＬまで補充とした。増幅
反応工程は、９４℃で予め５ｍｉｎ変性、そして３５増幅サイクル（毎サイクルは順次に
９４℃で３０ｓ変性、６０℃で３０ｓアニーリング、７２℃で４５ｓ伸長）に進入、サイ
クルが終わったら再び７２℃で７ｍｉｎ伸長とした。野生菌株を対照とした。ともに遺伝
子が陽性信号となった２つトゥランスフォーメイションを選出し、次の鑑定用とした。
ＴＲＩｚｏｌ法により上記ＰＣＲにおいて双陽性トゥランスフォーメイションと鑑定した
ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ試験キット
によってｃＤＮＡに逆転写した。逆転写系は、４μＬ２×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR緩衝
液、１μＬ・５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬ・１００μＭのＲａｎ
ｄｏｍ ６ ｍｅｒｓ Ｐｒｉｍｅｒ、１μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔR ＲＴ Ｅｎ
ｚｙｍｅ ＭｉｘＩの逆転写酵素、および２μＬの全ＲＮＡ、そして再蒸留水で２０μＬ
まで補充とした。逆転写反応工程は、まず３７℃で１５ｍｉｎ反応、再び８５℃で５ｓ逆
転写酵素失活とした。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析はＳＹＢＲR Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴ
ＭＩＩ試験キットを用いた。反応はリアルタイムで定量ＰＣＲすなわちＭａｓｔｅｒｃｙ
ｃｌｅｒR ｅｐｒｅａｌｐｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）上でなされた。ｑＲＴ−ＰＣＲ系は、２×ＳＹＢＲR Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａ
ｑＴＭＩＩ１０μＬ、１０μＭの上下流検測プライマーはそれぞれ１μＬ（実施例２のｑ
Ｓ１Ｆ／ｑＳ１Ｒと同様）、および２μＬ適量希釈したｃＤＮＡ、そして再蒸留水で２０
μＬまで補充とした。増幅工程は、９５℃で３０ｓ予め変性、そして４０増幅サイクル（
９５℃で５ｓ変性、６０℃で３４ｓアニーリング）に進入とした。融解グラフは９５℃１
５ｓ、６０℃１ｍｉｎ、９５℃１５ｓであった。１８ＳｒＲＮＡを内部標準とし、反応系
と工程は上記と同様であった。２−ΔΔＣｔ法により異なるトゥランスフォーメイション
中におけるＮｌＦＡＦ１遺伝子の相対発現量を算出し、ＮｌＦＡＦ１遺伝子転写発現レベ
ルが最高の陽性トゥランスフォーメイションをピックアップして次の試験用とした。その
結果は図２に示される。
図２（Ａ）は、超発現トゥランスフォーメイションＴ１−Ｔ８中におけるＮｌＦＡＦ１と
ｂａｒ遺伝子のＰＣＲ鑑定を示す（ただしＭは１００ｂｐ分子量のＭａｒｋｅｒ）。図２
（Ｂ）は、超発現陽性トゥランスフォーメイションにおけるＮｌＦＡＦ１遺伝子の転写発
現レベルを示す（コラム図における異なる小文字は値間差異の顕著さ（Ｐ＜０．０５）が
示される）。図２によれば、遺伝子ｂａｒとＮｌＦＡＦ１遺伝子は４個のトゥランスフォ
ーメイション中で検出できていて、得られた４個の陽性トゥランスフォーメイションの全
ＲＮＡは逆転写をし、ｑＲＴ−ＰＣＲ法によりＮｌＦＡＦ１遺伝子の相対転写発現レベル
の測定をした。その結果、４個の陽性トゥランスフォーメイションがＰＤＡプレート上で
３日培養し、その菌糸中でいずれもＮｌＦＡＦ１発現があった。またその中、Ｔ３トゥラ
ンスフォーメイション中におけるＮｌＦＡＦ１の転写発現量が最高であった。該菌株はＭ
ａＴ３と名付け、以降試験におけるＮｌＦＡＦ１超発現工程菌株とした。
【0024】
実施例５＜菌落成長速率の測定＞
具体的には、超発現株と野生株の分生子胞子懸濁液（１×１０７個／ｍＬ）をＰＤＡプレ
ートのガラスペーパー上に接種し、２５℃で３日培養し、その後パンチャーにより５ｍｍ
直径の菌コロニーブロックを切り取り、それぞれＰＤＡ培地プレート上に接種し、２５℃
で持続的に８日培養した。毎日、十字法（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により菌コ
ロニー直径を測定し撮影した。
＜胞子形成潜在性の測定＞
具体的には、野生株と超発現株の分生子胞子を０．０２％ツイーン８０によりそれぞれ１
×１０７個／ｍＬの胞子懸濁液を調製し、２００μＬを取ってそれぞれＰＤＡプレート上
に塗布し、２５℃で７日培養し、パンチャーにより０．６ｍｍ直径の菌糸円片を切り取っ
て、１ｍＬの０．０２％ツイーン８０中に入れ、渦振動して均一に混合させた後、顕微鏡
で胞子濃度の計算を行った。
その結果は、ＰＤＡプレート上で成長していた時は、ＭａＴ３と野生株の菌コロニー直径
は大きな差異がなかった。ＰＤＡプレート上で８日培養した後は、ＭａＴ３の胞子形成量
は３．０２×１０８個／ｃｍ２であり、野生株の胞子形成量（３．０７×１０８個／ｃｍ
２）に比べて顕著な変化がなかった（図３に示される）。
【0025】
実施例６＜毒性測定＞
野生株と超発現株の分生子胞子懸濁液（１×１０７個／ｍＬ）をそれぞれＰＤＡプレート
上に塗布し、持続的に７日培養した後、分生子胞子粉を掻き取って２０ｍＬ０．０２％ツ
イーン８０溶液が入れたバッフルドフラスコ中に移し、充分に振動させ、シェークして分
生子胞子を均一に配布させるようにした。顕微鏡によって血球数板で観察し、胞子数と濃
度を計数し、０．０２％ツイーン８０溶液によってそれぞれを濃度１×１０６、１×１０
７と１×１０８個／ｍＬの胞子懸濁液に調製した。
予め用意した稲苗を取って、毎カップの稲苗にビイロウンカ成虫４０個を接種し、１ｍＬ
の各濃度胞子液を吸い取って、スプレー法によって成虫を処理し、スプレー後に試験虫の
逃しを防止するためにカップエッジに穴を刺してあるプラスティック蓋を覆った。各濃度
ごとに３回繰り返しとして、１ｍＬ０．０２％ツイーン８０溶液を対照とした。２５℃、
１４Ｌ：１０Ｄ条件下で飼育し、１日ずつ定時的に観察し、死亡率を記録し、持続的に１
０日観察しながら、適時に虫死体を移出して２５℃温度で置いて保湿培養し、虫死体の表
面で生み出した菌コロニーの特徴によって真菌致死の発病率を確知した。実際の接種剤分
は稲苗旁らに置かれるカバーガラス（２０×２０ｍｍ）によって胞子を収集し、メダン染
色した後、顕微鏡で胞子数を観察した。これによって、ビイロウンカ及び水稲の葉上に沈
んだ胞子付着量を胞子数として標準化できた。
超発現菌株ＭａＴ３と野生株Ｍａ４５６のビイロウンカに関するパラレル生物測定の結果
は、ＭａＴ３のビイロウンカ成虫に対する毒性は、野生菌株Ｍａ４５６より著しく高かっ
た。ビイロウンカ成虫の、ＭａＴ３とＭａ４５６分生子胞子（１×１０８個胞子／ｍＬ）
が接種した後におけるデス率と接種後の時間は正の相関を呈し、菌スプレー後の時間の増
加につれて累計デス率が増加するようであった。ＭａＴ３の７日目に引き起こした累計デ
ス率はそれぞれ７９．７％であったが、対照菌株は約５９．２％であった。虫死体は保湿
培養された後、全部典型的な感染による致死的症状が発見した。
ＭａＴ３およびＭａ４５６のビイロウンカ成虫に対する毒性測定データの確率分析によれ
ば、受け取られ得るタイム−デス率のモーデルを模擬した。野生株Ｍａ４５６と超発現株
ＭａＴ３のビイロウンカに対する毒性のタイム−デス率模擬グラフおよび致死時間ＬＴ５
０は、具体的に図４に示される。ここで、ＣＫは空白対照グループ（０．０２％ツイーン
８０処理）。分析の結果は、ＭａＴ３のビイロウンカ成虫に対する毒性が顕著に上昇し、
半分致死時間ＬＴ５０は３．４日であり、対照菌株（〜５．１日）と比べて１．７日早か
った、とわかった。
【0026】
配列表<110> 中国計量大学
<120> 防除真菌の殺虫毒力を増強する方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1920
<212> DNA
<213> Nilaparvata lugens
<400> 1
atgtccgaaa atagagaaga aattctagca aattttcagg cctgcactga cattgatgat 60
ctgggcatag cattggatca cttggagcaa tctaaatgga accttctgga agcaatccag 120
agagcgatgc cacaggactc gcagacgctg ccttcggagc agacgcccga cgttgagatc 180
atagacgtgc gtccggctcc tgtagtgaat ggcgtcggcg tcggggtgcc cgtcatactc 240
agtcccgaca tggcgcatgc gccttcgacc tcgttcggcg ccaccactcg cctccttcat 300
ttccacatcc actacgtcga caacatgatc actctgcaaa tcaacgacca caatcgtgtt 360
ggtgatttga aaatgttgat atttgcaaaa acacaaatcc cgatttgtca acaaattcta 420
gatggatggg aaaatgcacc ttcttcagat tcagtattgc tgtcatctct caacctgcct 480
cacgaaaatc tattattctt aacagttcca gaacagaata atctttcggt caattcctca 540
tcaagtgaca ccttatcgca aaaatataat ctagtaatat ttgatgagaa aaaatgtaag 600
gagcacagac tagaagtttt aggatcaaaa actattggtg aagtcaaagc agaagttcgt 660
ctacttatag atataactgt gaaaaatcaa gtttggactg gatggcctat cgaagatgac 720
agatgtacgc tgtcacgcgc tcgcctcgaa attcctgagc ataagttgag cgtgcggcca 780
aaaagggagt acaagaggcc agttattgtc gaccaagtga tggatagtga tagttctgtt 840
gaagaatttg aagatgcttc ggaatctttc actggagaag acgaaatgtt cgttgaagaa 900
attggttcaa ggaaattgca gccattgatt ccagataatg tggaagatga aacggctggt 960
tgtatccatt tcaacgacga attcacaaac agatatggcg atttgcatcc ttacttcttc 1020
ccaggcacat tagaggatgc aatcaaagac tcgtgtctaa aacctgctag agagagaagg 1080
cctttagcag tgtatctaca tcacgatggc agcgtgttgt ccaatgtatt ctgcactgag 1140
ctgctttgct ttgaatcggt gatgcagtac ttgaacagca acttcttggt ttggggctgg 1200
gatctcacgt tcgattccaa caaaactaag ttcctgaatt ccgtgtcaaa aagccttggg 1260
aacatggcag ctgttactgt gagaagcatc gaccttgaaa gactgccagc gttgataatc 1320
atcatgagaa tgcgttctaa cactgaaatt ttctcagtaa taaatggtaa catcggtgtg 1380
agtgagcttt tgacgagcct tattcaagcg gtggatgtgt tcagcgacca gcaaagactc 1440
gaagtgcaag aggaagacga acgagccgcc agagaaatga tcaaaatcga acaggatcaa 1500
gcatatcaag catctctcga aatagaccaa gccaaagagg aagcgaaaaa acaacaaatc 1560
atgattgaaa cgcaagaaaa aaggaggata gaagaagaaa aacaacaaga agaagccaga 1620
aaagaggcgg aaaggcggtt gttggaatcg cagttacctg acgagccgga tgagactagt 1680
gaaggtattt ccaaaattcg tttcagactt ccaagtggtg atttcctcga aagacgcttc 1740
tcaatcttga atagtttaca ggtggtcttg cactatcttg ttgtcaaagg ttatcataca 1800
gaaaattaca aagtgattag tagttggcca aggagagatt tgaccacact tgacgtccac 1860
tcaaccatcc aagatttgaa gctgtatcca caagaaacac tgatattgga agaacgatag 1920
<210> 2
<211> 639
<212> PRT
<213> Nilaparvata lugens
<400> 2
Met Ser Glu Asn Arg Glu Glu Ile Leu Ala Asn Phe Gln Ala Cys Thr
1 5 10 15
Asp Ile Asp Asp Leu Gly Ile Ala Leu Asp His Leu Glu Gln Ser Lys
20 25 30
Trp Asn Leu Leu Glu Ala Ile Gln Arg Ala Met Pro Gln Asp Ser Gln
35 40 45
Thr Leu Pro Ser Glu Gln Thr Pro Asp Val Glu Ile Ile Asp Val Arg
50 55 60
Pro Ala Pro Val Val Asn Gly Val Gly Val Gly Val Pro Val Ile Leu
65 70 75 80
Ser Pro Asp Met Ala His Ala Pro Ser Thr Ser Phe Gly Ala Thr Thr
85 90 95
Arg Leu Leu His Phe His Ile His Tyr Val Asp Asn Met Ile Thr Leu
100 105 110
Gln Ile Asn Asp His Asn Arg Val Gly Asp Leu Lys Met Leu Ile Phe
115 120 125
Ala Lys Thr Gln Ile Pro Ile Cys Gln Gln Ile Leu Asp Gly Trp Glu
130 135 140
Asn Ala Pro Ser Ser Asp Ser Val Leu Leu Ser Ser Leu Asn Leu Pro
145 150 155 160
His Glu Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Pro Glu Gln Asn Asn Leu Ser
165 170 175
Val Asn Ser Ser Ser Ser Asp Thr Leu Ser Gln Lys Tyr Asn Leu Val
180 185 190
Ile Phe Asp Glu Lys Lys Cys Lys Glu His Arg Leu Glu Val Leu Gly
195 200 205
Ser Lys Thr Ile Gly Glu Val Lys Ala Glu Val Arg Leu Leu Ile Asp
210 215 220
Ile Thr Val Lys Asn Gln Val Trp Thr Gly Trp Pro Ile Glu Asp Asp
225 230 235 240
Arg Cys Thr Leu Ser Arg Ala Arg Leu Asn Ile Pro Glu His Lys Leu
245 250 255
Ser Val Arg Pro Arg Arg Glu Tyr Lys Arg Pro Val Ile Val Asp Gln
260 265 270
Val Met Asp Ser Asp Ser Ser Val Glu Glu Phe Glu Asp Ala Ser Glu
275 280 285
Ser Phe Thr Gly Glu Asp Glu Met Phe Val Glu Glu Ile Gly Ser Arg
290 295 300
Lys Leu Gln Pro Leu Ile Pro Asp Asn Val Glu Asp Glu Thr Ala Gly
305 310 315 320
Cys Ile His Phe Asn Asp Glu Phe Thr Asn Arg Tyr Gly Asp Leu His
325 330 335
Pro Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Leu Glu Asp Ala Ile Lys Asp Ser Cys
340 345 350
Leu Lys Pro Ala Arg Glu Arg Arg Pro Leu Ala Val Tyr Leu His His
355 360 365
Asp Gly Ser Val Leu Ser Asn Val Phe Cys Thr Glu Leu Leu Cys Phe
370 375 380
Glu Ser Val Met Gln Tyr Leu Asn Ser Asn Phe Leu Val Trp Gly Trp
385 390 395 400
Asp Leu Thr Phe Asp Ser Asn Lys Thr Lys Phe Leu Asn Ser Val Ser
405 410 415
Lys Ser Leu Gly Asn Met Ala Ala Val Thr Val Arg Ser Ile Asp Leu
420 425 430
Glu Arg Leu Pro Ala Leu Ile Ile Ile Met Arg Met Arg Ser Asn Thr
435 440 445
Glu Ile Phe Ser Val Ile Asn Gly Asn Ile Gly Val Ser Glu Leu Leu
450 455 460
Thr Ser Leu Ile Gln Ala Val Asp Val Phe Ser Asp Gln Gln Arg Leu
465 470 475 480
Glu Val Gln Glu Glu Asp Glu Arg Ala Ala Arg Glu Met Ile Lys Ile
485 490 495
Glu Gln Asp Gln Ala Tyr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Gln Ala Lys
500 505 510
Glu Glu Ala Lys Lys Gln Gln Ile Met Ile Glu Thr Gln Glu Lys Arg
515 520 525
Arg Ile Glu Glu Glu Lys Gln Gln Glu Glu Ala Arg Lys Glu Ala Glu
530 535 540
Arg Arg Leu Leu Glu Ser Gln Leu Pro Asp Glu Pro Asp Glu Thr Ser
545 550 555 560
Glu Gly Ile Ser Lys Ile Arg Phe Arg Leu Pro Ser Gly Asp Phe Leu
565 570 575
Glu Arg Arg Phe Ser Ile Leu Asn Ser Leu Gln Val Val Leu His Tyr
580 585 590
Leu Val Val Lys Gly Tyr His Thr Glu Asn Tyr Lys Val Ile Ser Ser
595 600 605
Trp Pro Arg Arg Asp Leu Thr Thr Leu Asp Val His Ser Thr Ile Gln
610 615 620
Asp Leu Lys Leu Tyr Pro Gln Glu Thr Leu Ile Leu Glu Glu Arg
625 630 635
【要約】 （修正有）
【課題】防除真菌の殺虫毒力を増強する方法を提供する。【解決手段】ＮｌＦＡＦ１遺伝子を含む発現カセットを真菌ゲノム中に有効的発現のために導入することを含み、ＮｌＦＡＦ１遺伝子はビイロウンカに対し免疫負制御作用を有し、ＮｌＦＡＦ１遺伝子は特定のヌクレオチド配列で示され、ＮｌＦＡＦ１遺伝子のヌクレオチド配列コードのアミノ酸配列は特定の配列で示されることを特徴とする防除真菌の殺虫毒力を増強する方法である。
【選択図】なし