特許 6925344 細菌感染症の治療に有用な双性イオンプロパルギル結合抗葉酸剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6925344

(24)【登録日】2021年8月5日

(45)【発行日】2021年8月25日

(54)【発明の名称】細菌感染症の治療に有用な双性イオンプロパルギル結合抗葉酸剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 239/49 20060101AFI20210812BHJP

   A61K 31/505 20060101ALI20210812BHJP

   C07D 405/06 20060101ALI20210812BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20210812BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210812BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20210812BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20210812BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20210812BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210812BHJP

【ＦＩ】

   C07D239/49CSP

   A61K31/505

   C07D405/06

   A61K31/506

   A61P43/00 111

   A61P31/04

   A61P31/10

   A61P33/00

   A61K45/00

   A61P43/00 121

【請求項の数】13

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2018-535383(P2018-535383)

(86)(22)【出願日】2017年1月9日

(65)【公表番号】特表2019-504834(P2019-504834A)

(43)【公表日】2019年2月21日

(86)【国際出願番号】US2017012702

(87)【国際公開番号】WO2017120575

(87)【国際公開日】20170713

【審査請求日】2020年1月9日

(31)【優先権主張番号】62/276,494

(32)【優先日】2016年1月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501315876

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ コネチカット

(74)【代理人】

【識別番号】110001210

【氏名又は名称】特許業務法人ＹＫＩ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ライト デニス

(72)【発明者】

【氏名】アンダーソン エイミー シー

(72)【発明者】

【氏名】スコッケラ エリック

(72)【発明者】

【氏名】ガミューディプーンディ ダヤナン ナレンドラン

(72)【発明者】

【氏名】ケシペディー サントシュ

(72)【発明者】

【氏名】リーブ ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】ロンバード マイケル エヌ

【審査官】 前田 憲彦

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５３２７２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／０２２５３５３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ２３９／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ｃ０７Ｄ ４０５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの化合物

【化1】

（Ｉ）
（式中、
Ｒは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、それぞれＨであり、
ＡおよびＢは、Ｈ、およびＣ_１〜Ｃ_６アルキルから独立して選択され、
ＶおよびＷのうちの一方がメトキシであり、他方はＨ、およびＣ_１〜Ｃ_６アルコキシから選択され、
ＪおよびＭは、それぞれＨであり、
ＷおよびＭは一緒になって、２個の酸素原子を含む５員の複素環式環を形成していてもよく、
Ａｒ環は、メタ位またはパラ位に１つの−ＣＯＯＨ基または−ＣＨ_２ＣＯＯＨ基で置換されているフェニル環である）
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
Ｒがメチルまたはエチルであり、
Ａが水素であり、
Ｂが水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
ＶおよびＷのうちの一方がメトキシであり、他方はＨであることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項3】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
Ｒがメチルまたはエチルであり、
Ａが水素であり、
Ｂが水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、
ＷおよびＭが一緒になって、２個の酸素原子を含む５員複素環式環を形成していることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物または塩であって、
ＡがＨであり、Ｂがメチルであることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項5】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
前記化合物が、式

【化2】

の化合物であり、
前記化合物が、
化合物１４：Ａ＝Ｈ、Ｖ＝ＯＣＨ_３、Ｗ＝Ｈ、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｍ−ＣＯＯＨフェニル
化合物１５：Ａ＝Ｈ、Ｖ＝ＯＣＨ_３、Ｗ＝Ｈ、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物１６：Ａ＝Ｈ、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＣＨ_３、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物２９：Ａ＝Ｓ−ＣＨ_３、Ｖ＝ＯＣＨ_３、Ｗ＝Ｈ、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物３０：Ａ＝Ｒ−ＣＨ_３、Ｖ＝ＯＣＨ_３、Ｗ＝Ｈ、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物３１：Ａ＝Ｒ−ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＣＨ_３、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物３２：Ａ＝Ｓ−ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＣＨ_３、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物３５：Ａ＝ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ，Ｍ＝−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、Ａｒ＝

【化3】

化合物４１：Ａ＝Ｓ−ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ，Ｍ＝−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物４２：Ａ＝Ｒ−ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ，Ｍ＝−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物５２：Ａ＝Ｈ、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＭｅ、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝

【化4】

化合物５８：Ａ＝Ｒ−ＣＨ_３、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＣＨ_３、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
化合物５９：Ａ＝Ｈ、Ｖ＝Ｈ、Ｗ＝ＯＣＨ_３、Ｍ＝Ｈ、Ａｒ＝ｐ−ＣＯＯＨフェニル
に列挙されている化合物から選択されることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項6】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
前記化合物が、

【化5】

であることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項7】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
前記化合物が、

【化6】

であることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項8】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
前記化合物が、

【化7】

であることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項9】

請求項１に記載の化合物または塩であって、
前記化合物が、

【化8】

であることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。

【請求項11】

患者における細菌感染症を治療するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物または塩。

【請求項12】

請求項１１に記載の化合物または塩であって、
前記細菌感染症がグラム陰性菌感染症であることを特徴とする、化合物または塩。

【請求項13】

請求項１１に記載の化合物または塩であって、
前記細菌感染症が黄色ブドウ球菌感染症であることを特徴とする、化合物または塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細菌感染症の治療に有用な双性イオンプロパルギル結合抗葉酸剤に関する。

【背景技術】

【0002】

必須代謝酵素のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）は、腫瘍学および感染症徴候の両方のために首尾よくかつ広範にわたって標的にされているタンパク質であり、メトトレキサート（ＭＴＸ）、トリメトプリム（ＴＭＰ）およびペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）（ＰＭＸ）などの有効な薬物がもたらされている。その天然基質である葉酸またはジヒドロ葉酸は、弱塩基性プテリン環と負に荷電したグルタミン酸伸長部とを有し、これらは酵素の結合に重要である。異なる種のＤＨＦＲとのいくつかの結晶構造から、メトトレキサート（図１）およびペメトレキセドなどの古典的抗葉酸剤が、活性部位において酸性残基と強い接触を形成する塩基性窒素環と、塩基性アミノ酸（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＨＦＲ中のＡｒｇ５７）と広範なイオン相互作用を形成するグルタミン酸部分とを有し、これらの基質のモチーフを模倣していることが明らかである。基質模倣物として、古典的抗葉酸剤は、多くの場合、ＤＨＦＲに対して非常に高い親和性を有する。例えば、メトトレキサートは、ヒト、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲを、それぞれ３．４ｐＭ、１ｐＭおよび１ｎＭのＫ_ｉ値で阻害する。

【0003】

しかし、これらの古典的抗葉酸剤は、生理的ｐＨでは高度に負に荷電しているので、受動的に拡散しないと思われ、能動輸送によりヒト細胞膜を通過させて生理的濃度を得る必要がある。さらに、それらは、その後、最適な細胞保持および酵素親和性のために、細胞内でポリグルタミル化される。現在、承認されている全ての抗癌ＤＨＦＲ阻害剤は、古典的抗葉酸剤として分類されている。対照的に、細菌は、葉酸補因子のデノボ合成に依存しているので、葉酸輸送体を有しない。したがって、古典的抗葉酸剤は、受動拡散によってのみ細胞膜を通過して抗菌効果を達成することができ、したがって、非常に強力な酵素阻害剤であるＭＴＸの野生型グラム陰性大腸菌に対するＭＩＣ値は、１ｍＭを超える。排出ポンプが遺伝子的に削除されても、ＭＩＣ値は６４〜２５６μＭであり、その化合物が排出基質であることに加えて、限られた透過性しか有しないことが示されている。同様に、グラム陽性メチシリン耐性（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対して、メトトレキサートは、２０μｇ／ｍＬのＭＩＣ_５０または１００μｇ／ｍＬのＭＩＣ_９０を有する。対照的に、より弱いＤＨＦＲ阻害（ＩＣ_５０値２３ｎＭおよび２０ｎＭ）を有する、弱塩基性の非古典的抗葉酸剤トリメトプリム（図１）は、実際にはＭＲＳＡおよび大腸菌の両方に対する強力な抗菌剤であり（ＭＩＣ値０．３１２５μｇ／ｍＬ）、スルファメトキサゾールと共に、グラム陰性感染症およびグラム陽性感染症の両方に対する第一選択薬である。

【0004】

細菌ジャイレースを標的とするフルオロキノロン（図１）または微生物リボソームを標的とするテトラサイクリンなどの、単一の酸性官能基を有する双性イオン化合物は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対して有用性を示すことが認識されている。これらの化合物の活性は、それらのより低いｃｌｏｇＤ_７．４値（オフロキサシンについては−１．３５）、および中性条件下での極性の増加へのより大きな寄与に関連している可能性がある。

【0005】

プロパルギル結合抗葉酸剤（ＰＬＡ）は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対し、ＤＨＦＲ阻害剤として作用する。発明者ら他は、ＭＲＳＡおよび化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に対する非常に強力なＭＩＣ値を有するＰＬＡ（フレイ，Ｋ．Ｍ．（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．）ら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１２）５６（７）：３５５６〜３５６２、ケシペディ，Ｓ．（Ｋｅｓｈｉｐｅｄｄｙ，Ｓ．）ら、Ｓｙｎｆａｃｔｓ（２０１５）１１（１０）：１０２６；ヴィスワナサン，Ｋ．（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｋ．）ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２９４３４）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の良好な阻害を有するＰＬＡ（ラム，Ｋ．Ｍ．（Ｌａｍｂ，Ｋ．Ｍ．）ら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１４）５８（１２）７４８４〜７４９１）を、以前に報告している。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】フレイ，Ｋ．Ｍ．（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．）ら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１２）５６（７）：３５５６〜３５６２

【非特許文献2】ケシペディ，Ｓ．（Ｋｅｓｈｉｐｅｄｄｙ，Ｓ．）ら、Ｓｙｎｆａｃｔｓ（２０１５）１１（１０）：１０２６

【非特許文献3】ヴィスワナサン，Ｋ．（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｋ．）ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２９４３４）

【非特許文献4】ラム，Ｋ．Ｍ．（Ｌａｍｂ，Ｋ．Ｍ．）ら、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１４）５８（１２）７４８４〜７４９１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対する高い効力を有するＤＨＦＲ阻害剤の必要性が存在する。本開示は、このような阻害剤および追加の利点を提供し、これらについて以下で論じる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、式Ｉ

【化1】

（Ｉ）
の化合物およびその薬学的に許容される塩を提供する。

【0009】

式Ｉにおいて、変数、例えば、Ｒ、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ａ、Ｂ、Ｊ、Ｍ、Ｖ、ＷおよびＡｒは、以下の定義を有する。

【0010】

Ｒは、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、またはＣ_１〜Ｃ_６アルコキシである。

【0011】

Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルおよびシクロアルキルから独立して選択される。

【0012】

ＡおよびＢは、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、およびＣ_１〜Ｃ_６アルコキシから独立して選択される。

【0013】

ＶおよびＷのうちの一方がメトキシであり、他方はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、およびＣ_１〜Ｃ_６アルコキシから選択される。
ＪおよびＭは、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＮＨ_２、シクロアルキル、またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルから独立して選択され、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルでは任意のメチレン（−ＣＨ_２）がＯ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル）、Ｓ、ＳＯ_２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）と任意に置き換えられており、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルはヒドロキシル、アミノ、またはハロゲンで任意に置換されている。

【0014】

ＷおよびＭは一緒になって、５員もしくは６員の炭素環式環、または、Ｎ、Ｏ、およびＳから独立して選択される１、２もしくは３個のヘテロ原子を含む５員もしくは６員の複素環式環を形成していてもよい。

【0015】

Ａｒ環は、少なくとも１つの−ＣＯＯＨ基または−ＣＨ_２ＣＯＯＨ基で置換されていて、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_２ハロアルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２ハロアルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている、フェニル、ピリジルまたはピリミジニル環である。

【0016】

本開示は、式Ｉの化合物またはその塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0017】

本開示は、ＤＨＦＲを式Ｉの化合物またはその塩と接触させることを含む、インビトロまたはインビボでジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を阻害する方法を提供する。

【0018】

本開示はまた、治療有効量の式Ｉの化合物またはその塩を患者に投与することを含む、患者における細菌感染症、真菌感染症または原生動物感染症を治療する方法を提供する。

【0019】

本開示は、式Ｉの化合物またはその塩が第１の活性薬剤であり、式Ｉの化合物または塩ではない第２の活性薬剤と組み合わせられるか、または共に投与される、組合せ製剤および治療方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】関連する生理的特性を有する、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に対して有効な抗菌剤を示す図である。従来のＰＬＡであるＵＣＰ１０２１を、ＣＯＯＨ−ＰＬＡと比較している。

【図2A】ＮＡＤＰＨおよび化合物１５または化合物１６のいずれかと結晶化した黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲの図である。図２Ａは化合物１５に結合した黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲを示す図である。

【図2B】図２Ｂは化合物１６に結合した黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲを示す図である。

【図2C】図２Ｃは化合物１５に結合した黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲの複合体の溶媒曝露された表面を示す図である。

【図2D】図２Ｄは化合物１６に結合した黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲの複合体の溶媒曝露された表面を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

［用語］
化合物は、標準的命名法を用いて記載する。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。文脈と明らかに矛盾しない限り、各化合物名は、化合物の遊離酸または遊離塩基形態ならびに化合物の全ての薬学的に許容される塩、溶媒和物および水和物を含む。

【0022】

「式Ｉ」という用語は、あらゆるエナンチオマ、ラセミ体および立体異性体、ならびにそのような化合物の全ての薬学的に許容される塩、溶媒和物および水和物を含む、式Ｉを満たす、全ての化合物を包含する。「式Ｉ」には、この語句を使用する文脈と明らかに矛盾しない限り、式Ｉの全ての亜属群（ｓｕｂｇｅｎｅｒｉｃ ｇｒｏｕｐ）が含まれる。

【0023】

「ａ」および「ａｎ」という用語は、量の限定を表すのではなく、参照された項目のうちの少なくとも１つの存在を表す。「または」という用語は、「および／または」を意味する。非限定移行句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、中間的な移行句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および限定移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含する。これらの３つの移行句の１つを記載している、または「含有する」または「含む」などの代替的移行句を用いる請求項は、文脈または技術によって明らかに排除されない限り、任意の他の移行句を用いて記述することができる。値の範囲の列挙は、本明細書で特に明記しない限り、単にその範囲内に含まれるそれぞれの別個の値を個々に示すのを省略した方法としての役割を果たすに過ぎず、それぞれの別個の値は、あたかも本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。全ての範囲は、その範囲内に端点を含み、これらの端点は独立して組み合わせることができる。本明細書において特に指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本明細書で記載されている全ての方法は、好適な順序で実施することができる。あらゆる例、または例示語（例えば、「など」）の使用は、単に説明のためのものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいずれの文言も、特許請求の範囲に記載されていない要素が、本明細書で使用する本発明の実施に不可欠であることを示すものと解釈するべきではない。他に定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0024】

式Ｉの化合物は、任意の位置に同位体置換を有する式Ｉの全ての化合物を含む。同位体には、原子番号は同じであるが質量数が異なる原子が含まれる。一般的な例として、水素の同位体としては、トリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては、^１１Ｃ、^１３Ｃ、および^１４Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、任意の１つ以上の水素原子が重水素原子により置き換えられる。

【0025】

「活性薬剤」とは、単独で、または別の化合物、元素、もしくは混合物と組み合わせて患者に投与された場合に、直接的または間接的に対象に生理学的効果を与える、化合物（本明細書にて開示された化合物を含む）、元素、または混合物を意味する。間接的な生理学的効果は、代謝産物または他の間接的なメカニズムを介して起こり得る。「活性薬剤」はまた、他の活性薬剤を増強するか、またはより活性にすることがある。例えば、式Ｉの化合物は、他の抗菌化合物と組み合わせて投与される場合、例えば他の抗菌化合物のＭＩＣを低下させることによって、細菌を死滅させるかまたは細菌増殖を阻害するために直接作用するか、または他の抗菌化合物の活性を増強することがある。

【0026】

２つの文字または記号の間にないダッシュ（「−」）は、置換基の結合点を示すために使用する。例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２は、ケトＣ（Ｏ）基の炭素を介して結合している。

【0027】

「アルキル」は、特定の数の炭素原子、一般に１〜約８個の炭素原子を有する分枝鎖または直鎖の飽和脂肪族炭化水素基である。本明細書で使用するＣ_１〜Ｃ_６アルキルという用語は、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキル基を示す。他の実施形態には、１〜６個の炭素原子、１〜４個の炭素原子、または１または２個の炭素原子を有するアルキル基、例えば、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２アルキルが含まれる。アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、３−メチルブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびｓｅｃ−ペンチルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

「シクロアルキル」は、特定の数の炭素原子を有する飽和炭化水素環基である。単環式シクロアルキル基は、典型的には３〜約８個の炭素環原子または３〜６個（３、４、５または６個）の炭素環原子を有する。シクロアルキル置換基は、置換窒素原子、酸素原子もしくは炭素原子のペンダントであってもよく、または２つの置換基を有してもよい置換炭素原子は、スピロ基として結合したシクロアルキル基を有してもよい。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。

【0029】

「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードのいずれかを示す。

【0030】

「ハロアルキル」は、特定の数の炭素原子を有し、ハロゲン原子の最大許容数までの、１個以上のハロゲン原子で置換された、分枝鎖および直鎖の両方のアルキル基を示す。ハロアルキルの例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチルおよびペンタ−フルオロエチルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0031】

「ハロアルコキシ」は、酸素架橋（アルコール基の酸素）を介して結合した、本明細書で定義されるハロアルキル基を示す。

【0032】

本明細書で使用する「置換された」という用語は、特定の原子または基上の任意の１つ以上の水素が、特定の原子の通常の原子価を超えない限り、示された基から選択されたもので置き換えられることを意味する。置換基がオキソ（すなわち＝Ｏ）である場合、原子上の２個の水素が置き換えられる。オキソ基がヘテロ芳香族部分を置換する場合、得られる分子は、時には互変異性形態をとることができる。例えば、２−または４−位でオキソにより置換されたピリジル基は、ピリジンまたはヒドロキシピリジンとして記載されることがある。置換基および／または変数の組合せは、そのような組合せが安定な化合物または有用な合成中間体をもたらす場合にのみ許容される。安定な化合物または安定な構造とは、反応混合物からの単離およびその後の有効な治療剤への処方に耐える、十分に頑強な化合物を示すことを意味する。特に明記しない限り、置換基はコア構造に対し命名される。例えば、アミノアルキルは、この置換基のコア構造への結合点がアルキル部分にあることを意味し、アルキルアミノは、結合点がアミノ基の窒素への結合であることを意味する。

【0033】

「剤形」とは、活性薬剤の投与単位を意味する。剤形の例としては、錠剤、カプセル、注射剤、懸濁液、液体、エマルジョン、クリーム、軟膏、座薬、吸入形態、経皮形態などが挙げられる。

【0034】

「医薬組成物」とは、式（Ｉ）の化合物またはその塩、溶媒和物または水和物、またはプロドラッグなどの少なくとも１つの活性薬剤と、担体などの少なくとも１つの他の物質とを含む組成物である。薬学的組成物は、１つ以上の、追加の活性薬剤を任意に含有する。指定される場合、医薬組成物は、ヒトまたは非ヒト用薬物の米国ＦＤＡのＧＭＰ（適正製造基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ））基準を満たす。「薬学的組合せ」とは、単一の剤形に組み合わせるか、またはグラム陰性菌感染症などの障害を治療するために、活性薬剤が一緒に使用されるべきであるという説明書と共に別々の剤形で一緒に提供することができる、少なくとも２つの活性薬剤の組合せである。

【0035】

「薬学的に許容される塩」には、開示される化合物の誘導体が含まれ、誘導体は、親化合物の無機および有機の非毒性の酸付加塩または塩基付加塩を生成することによって親化合物を修飾したものである。本発明の化合物の塩は、従来の化学的方法によって塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、遊離酸形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩など）と反応させるか、または遊離塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の適切な酸と反応させることにより調製することができる。そのような反応は、典型的には、水中または有機溶媒中、またはその２つの混合物中で実施する。本発明の化合物の塩には、化合物の溶媒和物および化合物塩の溶媒和物がさらに含まれる。

【0036】

薬学的に許容される塩の例としては、アミンまたは窒素含有ヘテロアリール環（例えば、ピリジン、キノリン、イソキノリン）などの塩基性残基の無機酸塩（ｍｉｎｅｒａｌ ａｃｉｄ）または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩としては、従来の非毒性塩および例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の第４級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、従来の非毒性酸塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの、および、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ＨＯ_２Ｃ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯ_２Ｈ（式中、ｎは０〜４）などの有機酸から調製される塩が挙げられる。追加の好適な塩のリストは、例えばＧ．ステッフェン ポーレクーン（Ｇ．Ｓｔｅｆｆｅｎ Ｐａｕｌｅｋｕｈｎ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７、５０、６６６５、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．ハインリッヒ スタール（Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｈｌ）およびカミール Ｇ．ワームース（Ｃａｍｉｌｌｅ Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２に見出すことができる。

【0037】

本開示の医薬組成物／組合せに適用される「担体」という用語は、活性化合物が提供される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。

【0038】

「患者」は、医学的治療を必要とするヒトまたはヒト以外の動物である。いくつかの実施形態では、患者はヒト患者である。

【0039】

「提供する」とは、供与、投与、販売、頒布、譲渡（営利目的または非営利目的）、製造、調合、または調剤することを意味する。

【0040】

本明細書で使用される「治療」には、式Ｉの化合物などの本開示の化合物を、唯一の活性薬剤として提供するか、または（ａ）疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止するのに十分である、ならびに（ｂ）疾患を軽減する、すなわち、疾患の退行を引き起こす、および細菌感染症の場合には、対象における感染の病原性を排除または減少させるのに十分である、少なくとも１つの追加の活性薬剤と共に提供するかのいずれかで提供することが含まれる。「治療する」および「治療」とはまた、本開示の化合物の治療有効量を、唯一の活性薬剤として、または少なくとも１つの追加の活性薬剤と共に、細菌感染を有するかまたは細菌感染しやすい対象に提供することを意味する。「予防的治療」には、疾患の素因があるかもしれないが疾患を有しない対象における疾患の発生の可能性を有意に減少させるのに十分な量の、本開示の化合物を投与することが含まれる。

【0041】

医薬組成物／組合せの「治療有効量」とは、対象に投与された場合に、細菌感染症に関連する罹患率および死亡率を減少させるおよび／または治癒をもたらすなど、治療効果を提供するのに有効な量である。特定の状況において、微生物感染症に罹患している対象は、感染の症状を示さないことがある。したがって、化合物の治療有効量はまた、対象の血液、血清、他の体液または組織中の微生物の検出可能なレベルを有意に低下させるのに十分な量である。本開示はまた、特定の実施形態において、予防的治療および治療的処置において本開示の化合物を使用することを含む。予防的治療または防御的治療の文脈において、「治療有効量」は、細菌感染症の発生率または細菌感染症に関連する罹患率および死亡率を有意に減少させるのに十分な量である。例えば、嚢胞性線維症または人工呼吸器患者のように、対象が細菌感染のリスクが高まっていることが知られている場合には、予防的治療を施してもよい。有意な減少とは、スチューデントのＴ検定などの統計的有意性の標準パラメトリック検定において統計的に有意である（ｐ＜０．０５）、任意の検出可能な負の変化である。

【0042】

［化合物についての説明］
本開示は、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方のＤＨＦＲの阻害剤として、プロパルギル結合抗葉酸剤（ＰＬＡ）を提供する。ＰＬＡは、受動的に拡散して膜を通過し、ＤＨＦＲ酵素を強力に阻害する弱塩基性非古典的抗葉酸剤として特徴付けられ、多くの場合、サブマイクロモルのＭＩＣ値により細菌細胞の増殖を阻害する。本発明者ら他は、ＭＲＳＡおよび化膿レンサ球菌に対する非常に強力なＭＩＣ値および肺炎桿菌の良好な阻害を以前に達成している。本開示は本発明者らが設計した、細菌細胞透過性を維持または増加させながら、負に荷電したグルタミン酸尾部により典型的に接触が行われる、双性イオンＰＬＡおよびエナンチオマ的に純粋な化合物を提供する。黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲ酵素についての酵素阻害および高分解能結晶構造の評価は、カルボン酸部分が活性部位でアルギニン残基と重要な相互作用を形成することを明らかにしている。この新規な高親和性接触の組み込みはまた、既知の耐性を付与する変異の効果を相殺するための代償的相互作用を提供し得る。この開示の特定の化合物は、ＭＲＳＡを強力に阻害する。例えば、本開示の特定の化合物は、これらのＭＲＳＡに対しておよそ１ｎｇ／ｍＬのＭＩＣ値を示す。本開示の特定の化合物はまた、１０μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値で大腸菌を阻害する。本開示の特定の化合物はまた、優れた薬物様特性を有する。これらの特性としては、例えば、ヒト細胞株の増殖を阻害しないこと、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｄ６などの重要なＣＹＰ酵素を阻害しないこと、およびミクロソーム安定性アッセイにおいて長い半減期を有することを挙げることができる。

【0043】

中性ｐＨでは、本開示の双性イオンＰＬＡは、２つの主要種に分配される：両者は、カルボキシレート基で脱プロトン化される。ピリミジン環は、種の３５％においてプロトン化され、双性イオン阻害剤を形成する、残りは中性のピリミジン環を有し、負に荷電した分子を生じる。特定の実施形態では、カルボン酸は、活性部位において、保持された酸性残基（黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲ［ＳａＤＨＦＲ］中のＡｓｐ２７）およびアルギニン（ＳａＤＨＦＲ中のＡｒｇ５７）とそれぞれ水素結合を形成する。本開示は、ＣＯＯＨ−ＰＬＡに、プロパルギル位置で非置換またはメチル置換のＣ_６−エチルジアミノピリミジン環を、およびビフェニル系に２’または３’−メトキシ置換基のいずれかを提供する。プロパルギル置換で合成したいずれの阻害剤も、エナンチオマ的に純粋な成分として調製した。

【0044】

カルボン酸基の配置の構造−活性分析は、オルトおよびメタ配置がヒト酵素に対して最大の選択性を生じたが、パラ位に配置すると病原体酵素に対して最も高い親和性を生じることを示している。ＳａＤＨＦＲでは、ＣＯＯＨをパラからメタまたはオルトに移動すると、活性がそれぞれ５分の１および１２分の１に低下する。ＥｃＤＨＦＲに対する活性は、カルボン酸がパラ位からメタ位に移動すると、６分の１に減少するが、オルト位に移動した場合には、２．２分の１に減少する。

【0045】

ＭＩＣ値は、野生型株とポーリンノックアウト株（ΔｏｍｐＦおよびΔｏｍｐＣ）との間で維持され、化合物が受動的に細胞内に拡散していることを示していた。グラム陽性菌における異常な活性は、メトトレキサートの場合と同様に、負に荷電した官能基を分子に組み込んで、細胞浸透を損なうことなく酵素との重要な接触を作り出すことを示している。あるいは、グラム陰性菌において、高度に陰性のリポ多糖バリアは、静電反発により、ＰＬＡの負に荷電した集団の浸透を軽減し得る。

【0046】

本開示の特定のＰＬＡは、ヒト結核菌（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）ＤＨＦＲに対して活性である。ＤＨＦＲは現在、結核治療のために用いられていない。臨床的に承認された抗葉酸剤であるメトトレキサート、ピリメタミンおよびトリメトレキサートは、ＭｔｂＤＨＦＲ酵素の強力な阻害剤であるが、おそらく脂質が豊富な細胞壁に浸透できないため、Ｍｔｂの増殖を阻害しない。この開示の特定のＰＬＡは、ＭｔｂＤＨＦＲ酵素活性を阻害し、また生存しているＭｔｂの増殖を阻害する。いくつかの化合物は、１μｇ／ｍＬ未満のＭＩＣ値で、Ｍｔｂの増殖を強力に阻害する。本開示の特定の化合物は、ＭＤＲ−およびＸＤＲ−ＴＢ株の増殖の非常に強力な阻害剤であり、他の知られているメカニズムとの交差耐性を受けない。

【0047】

本開示の特定のＰＬＡは、トリメトプリム−スルファメトキサゾール耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染、特に市中感染型ＭＲＳＡに関連するものに対して活性である。

【0048】

トリメトプリムはジヒドロ葉酸還元酵素を阻害するが、スルファメトキサゾールはジヒドロ葉酸合成酵素を阻害する。これらの両必須酵素は、代謝における一炭素供与体の生成に重要な葉酸生合成経路に関与する。この組合せは非常に成功している一方で、耐性株が一般的になっている。ｄｆｒＢ染色体遺伝子の変異は、トリメトプリム耐性の主要様式である。追加の耐性メカニズムとしては、Ｓ１ ＤＨＦＲとも呼ばれる遺伝子ｄｆｒＡ、ｄｆｒＧおよびｄｆｒＫによってコードされるプラスミドコードトリメトプリム耐性ＤＨＦＲの獲得が挙げられる。ｄｆｒＢにおける点変異により、ＭＩＣ値≦２５６μｇ／ｍＬで耐性を付与し、Ｓ１ ＤＨＦＲの獲得により、ＭＩＣ値≧５１２μｇ／ｍで、より高いレベルの耐性を付与する。

【0049】

いくつかの耐性臨床分離株の分析は、変異Ｆ９８Ｙは、特に二次変異Ｈ１４９ＲまたはＨ３０Ｎと組み合わされて、非常に一般的であることを示している。ＴＭＰのＩＣ_５０値は、Ｓａ（Ｆ９８Ｙ）酵素で約４００倍に増加し、補因子であるＮＡＤＰＨ、および基質であるジヒドロ葉酸に結合したＦ９８Ｙ変異を有するＳａＤＨＦＲ酵素の結晶構造が報告されている。Ｓ１ ＤＨＦＲタンパク質は、ＴＭＰ感受性の表皮ブドウ球菌と比較して、９８位のチロシン、ならびに２つの他の重要な変異：Ｇ４３ＡおよびＶ３１Ｉを生来的に含む。Ｇ４３ＡおよびＦ９８Ｙの組み込みは、ＴＭＰ耐性を付与することを示している。全体として、耐性株の研究は、黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲを標的とする新世代の抗葉酸剤が、野生型酵素に加えて、染色体変異体およびプラスミドコード耐性形態を含む酵素の変異形態を阻害しなければならないことを確証している。

【0050】

黄色ブドウ球菌のＰＬＡ耐性の一段階変異体および二段階変異体の完全な特性評価は、重要な臨床変異であるＦ９８Ｙ、Ｈ３０Ｎ、Ｈ１４９Ｒ、Ｆ９８Ｙ／Ｈ３０ＮおよびＦ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒの獲得により、より低い変異頻度ではあるが、またＴＭＰに耐性を付与することを示す。本明細書に開示した特定のＰＬＡ化合物は、単一および二重変異型酵素ならびに野生型および変異型黄色ブドウ球菌株の両方を非常に強力に阻害する。

【0051】

まとめると、この一連の新規な化合物は、古典的抗葉酸剤に共通する重要な相互作用のうちの１つを模倣するカルボキシレート部分の使用を、標的酵素であるＤＨＦＲにアクセスする能力を損なうことなくプロパルギル結合抗葉酸剤の構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）にどのように組み込むことができるかを示す。８つの阻害剤の調製および評価は、これらの化合物が、以前のＰＬＡと比較して、高い酵素親和性を有し、ＭＲＳＡおよび大腸菌に対する抗菌活性を増加させることを示している。黄色ブドウ球菌ＤＨＦＲを用いた２つの化合物の高分解能結晶構造は、活性部位におけるカルボキシレートとＡｒｇ５７との間の水媒介接触によって、親和性が増強することを明らかにしている。追加のプロファイリングは、抗菌候補物としてのこれらの化合物の開発を支援する。

【0052】

本開示は、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩を提供する。

【化2】

（Ｉ）

【0053】

式Ｉ中の変数（例えば、ｒ、Ｒ^１〜Ｒ^４、Ａ、Ｂ、Ｗ、ＭおよびＪ）は、発明の概要のセクションに記載の定義を有することができる。さらに、これらの変数は、以下に記載の定義のいずれかを有することができる。

【0054】

本開示は、安定な化合物が形成される限りにおいて、本明細書に記載される変更可能な定義の全ての組合せを含む。本開示は、以下の実施形態を含む。

【0055】

（１）Ｒはメチルまたはエチルであり、Ａは水素であり、Ｂは水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、ＶおよびＷのうちの一方はメトキシであり、他方はＨである。

【0056】

（２）Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈである。

【0057】

（３）ＪおよびＭは、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_２ハロアルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２ハロアルコキシから独立して選択される。

【0058】

（４）ＡはＨであり、Ｂはメチルである。

【0059】

（５）ＪおよびＭは共にＨである。

【0060】

（６）Ａｒ環は、パラ位において１つの−ＣＯＯＨ置換基で置換されており、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_２ハロアルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２ハロアルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0061】

（７）Ａｒ環は、メタ位において１つの−ＣＯＯＨ置換基で置換されており、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_２ハロアルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２ハロアルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0062】

（８）Ａｒ環は、オルト位において１つの−ＣＯＯＨ置換基で置換されており、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_２ハロアルキルおよびＣ_１〜Ｃ_２ハロアルコキシから独立して選択される１つ以上の置換基で任意に置換されている。

【0063】

（９）Ａｒ環は置換フェニル環である。置換フェニル環は、他の実施形態に列挙されているＡｒ環の置換基のいずれかを有してもよい。

【0064】

（１０）Ｒはメチルまたはエチルであり、Ａは水素であり、Ｂは水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルであり、ＷおよびＭは一緒になって、２個の酸素原子を含む５員複素環式環を形成している。

【0065】

（１１）本開示は、以下の式Ｉの化合物およびそれらの薬学的に許容される塩を含む。

【0066】

（１２）本開示は、式Ｉ−Ａの化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、この化合物は、表１に列挙されている化合物から選択される。

【化3】

（Ｉ−Ａ）

【0067】

【表1】

【0068】

【表2】

【0069】

［医薬組成物］
本開示は、活性薬剤として少なくとも１つの式Ｉの化合物を、薬学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物を含む。

【0070】

本開示の医薬組成物としては、眼用製剤、経口製剤、経鼻製剤、経皮製剤、密封有りまたは無しの局所製剤、静脈内製剤（ボーラスおよび注入の両方）、吸入製剤、および注射剤（腹腔内、皮下、筋肉内または非経口）が挙げられる。この組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、リポソーム、滅菌眼用溶液、非経口用溶液または懸濁液、計量エアロゾルまたは液体スプレ、滴下、アンプル、自動注入デバイス、または座薬などの投与単位で、眼に、経口的に、鼻腔内に、舌下に、非経口的に、または直腸に、または吸入もしくは吹送によって投与するためのものであってもよい。

【0071】

本開示の組成物を含有する剤形は、選択された投与経路により、治療効果をもたらすのに必要な有効量の活性薬剤を含有する。組成物は、本開示の化合物またはその塩形態を約５，０００ｍｇ〜約０．５ｍｇ（好ましくは約１，０００ｍｇ〜約０．５ｍｇ）含んでもよく、選択された投与方法に好適な任意の形態に構成することができる。剤形は、遅延放出または持続放出を含む即時放出または制御放出用に、処方することができる。医薬組成物は、式Ｉの化合物を唯一の活性薬剤として含んでいてもよく、または１つ以上の追加の活性薬剤と組み合わせてもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、式Ｉの化合物および少なくとも１つの直接作用性抗生物質（インビボで病原菌を死滅させるのに有効な化合物）を含む。

【0072】

［治療方法］
本開示は、本開示の１つ以上の有効量の化合物を、細菌感染のリスクがある対象または細菌感染症に罹患している対象に投与することによって、対象における細菌感染症を治療する方法を含む。本開示は、式Ｉの化合物を、細菌感染症を治療するために使用する治療方法、および化合物を使用して、細菌を抗菌剤に感作させる方法を含む。この実施形態では、式Ｉの化合物は、細菌感染症を有する患者に、治療有効量の抗菌剤と同時にまたは連続して投与する。式Ｉの化合物は、多くの場合、ＭＩＣを低下させることによって、他の抗菌剤の有効性を高める。

【0073】

ヒト患者の治療が特に企図されている。しかし、非ヒト対象の治療は、本開示の範囲内である。本開示は、魚類、両生類、爬虫類または鳥類における微生物感染症の治療または予防を含むが、本開示の好ましい実施形態は、哺乳動物の治療を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、細菌感染症または抗生物質耐性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）もしくは抗生物質耐性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）感染症は、グラム陽性菌によって引き起こされる。

【0075】

いくつかの実施形態では、細菌感染症または抗生物質耐性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）もしくは抗生物質耐性（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）感染症は、グラム陰性菌によって引き起こされる。

【0076】

いくつかの実施形態では、細菌感染症はヒト型結核菌（Ｍｔｂ）である。いくつかの実施形態では、ヒト型結核菌は、多剤耐性株、例えば、アミカシン、カナマイシンおよび／またはカプレオマイシン耐性株である。本明細書に開示する特定の化合物は、１μｇ／ｍＬ未満のＭＩＣ値でＭｔｂを阻害する。

【0077】

本開示の方法のいずれかの実施形態では、微生物感染は、病原菌感染の結果である。病原菌の例としては、エアロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）内の細菌が挙げられるが、これらに限定されない。このような細菌の具体例としては、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、シュードモナス・ホスホレウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、大腸菌、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌、肺炎桿菌、ブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、および黄色ブドウ球菌が挙げられる。

【0078】

いくつかの実施形態では、感染はカンジダ・アルビカンスなどの酵母感染である。

【0079】

いくつかの実施形態では、感染は、多微生物感染、例えば、２つ以上の微生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）を含む感染である。いくつかの実施形態では、感染は、上記に列挙した微生物の少なくとも１つ、例えば、シュードモナス、例えば、緑膿菌、クレブシエラ、例えば、肺炎桿菌、および／またはアシネトバクター、例えば、Ａ．バウマンニのうちの１つ以上を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、方法はさらに、本開示の化合物と組み合わせて、これらに限定されるものではないが、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバクタムなどのβ−ラクタム、フルオロキノロンを含むキノロンおよび類似のＤＮＡ合成阻害剤、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、糖ペプチド、クロラムフェニコール、グリシルシクリン、リンコサミド、リポペプチド、ダプトマイシンなどのリポデプシペプチド、およびオキサゾリジノンからなる群から選択される抗生物質などの、追加の活性薬剤を投与するステップを含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、細菌感染症は、上気道および下気道感染症、肺炎、菌血症、全身感染症、敗血症および敗血症性ショック、尿路感染症、胃腸感染症、心内膜炎、骨感染症、髄膜炎などの中枢神経系感染症、または皮膚および軟部組織の感染症である。

【0082】

いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の細胞、例えば培養皿中の細胞を処理することを含む。

【0083】

一態様では、本開示は、対象におけるグラム陰性感染症の治療方法であって、本明細書に記載の化合物の治療有効量を、そのような治療を必要とする前記対象に投与することを含む、方法を特徴とする。

【0084】

いくつかの実施形態では、グラム陰性感染症は、緑膿菌によって引き起こされる。

【0085】

他の実施形態では、本開示は、表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌によって引き起こされる感染症の治療を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、対象は、外傷患者または火傷または皮膚創傷に罹患した熱傷患者である。

【0087】

さらなる態様では、本開示は、対象における細菌の耐性を低減させる方法であって、本明細書に記載の化合物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、方法を特徴とする。

【0088】

いくつかの実施形態では、この方法は、抗菌剤治療に耐性のある細菌による感染症に罹患している前記対象を同定することをさらに含む。

【0089】

本開示は、本開示の化合物または組成物が、経口的に、局所的に、静脈内に、または非経口的に投与されるか、または吸入される治療方法を含む。

【0090】

本開示の化合物は、１日当たり約１〜約５回投与してもよい。毎日の投与または定期的投与を行うことができる。投与頻度はまた、使用する化合物、治療する特定の疾患およびその疾患を引き起こす細菌により変化してもよい。しかし、任意の特定の対象の具体的な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、および排泄率、薬物の組合せおよび治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することが理解されるであろう。

【0091】

［ＰＬＡ ＤＨＦＲ阻害剤の抗結核効果］
発明者らは、細胞増殖阻害のためのメカニズムとして、ＤＨＦＲ阻害を確立している。本開示の特定の化合物についてはまた、２つの異なるプロモータの制御下でＤＨＦＲを過剰発現する２つのＭ．スメグマチス（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）株における抗菌活性について試験した。ＵＣＰ１０６６を除く全ての化合物は、両菌株において少なくとも３２μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有意に増加させ、これは抗菌活性がおそらくＤＨＦＲ阻害に起因すると思われることを示している。この化合物は過剰発現株において４μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を有し、この値は、エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）株に対するその値と同じである。

【0092】

発明者らは、結核菌ＤＨＦＲ（ＭｔｂＤＨＦＲ）タンパク質を発現させ、精製し、３４０ｎｍで補因子ＮＡＤＰＨの酸化を分光的にモニタする標準的な手順を用いて、酵素阻害を測定した（表６、実施例１０を参照）。実験は３連で実施し、２つの異なる日に検証した。アッセイで試験した阻害剤の多くは、ＭｔｂＤＨＦＲ酵素に対して適度に強力であり、７０〜６００ｎＭの範囲のＩＣ_５０値を有する。ＩＣ_５０値の範囲は、ＭＩＣ値の範囲よりも比較的狭く、これは酵素に対する活性が、抗菌効力を引き起こす要因の１つに過ぎないことを、ここでもまた示唆している。表６は、ほとんどの化合物がヒト酵素に対して非常に類似したＩＣ_５０値を有することを示す。潜在的なヒト細胞毒性を調べるために、これらの有力な化合物の細胞毒性効果を、ヒト皮膚線維芽細胞であるＨｅｐＧ２およびＭＣＦ−１０細胞において評価した。全ての場合において、細胞の増殖は、５００μＭ未満の化合物濃度で阻害されない。

【0093】

本開示のＰＬＡはまた、５つの多剤耐性株であるＴＢ株、Ｍｔｂ３６５株、Ｍｔｂ２７６株、ＭＴｂ３５２株、Ｍｔｂ５６株およびＭｔｂＣ−３１株、ならびに１つの超多剤耐性（ＸＤＲ）株であるＭｔｂ５を評価した。表７の実施例１０を参照されたい。全体的に、各菌株は、０．２５〜４μｇ／ｍＬの間のＭＩＣ値で、ＩＮＨに耐性である。菌株のうちの３つ、Ｍｔｂ５、Ｍｔｂ３６５およびＭｔｂ５６もまた、それぞれ８、６４および３２μｇ／ｍＬのＭＩＣ値で、リファンピンに高度に耐性である。これらの菌株は、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびモキシフロキサシンを含む様々な他の薬剤に対しても耐性である。ＰＬＡは、わずかに低下したレベルであるが、大多数のＭＤＲ株に対して活性である。この化合物は、Ｃ−３１株に対して活性を示さなかった。興味深いことに、化合物５８および５９は、ＭＤＲ株（Ｍｔｂ３５２）およびＸＤＲ株（Ｍｔｂ５）に対して非常に活性であり、それぞれＭｔｂ３５２に対して０．０６または０．５μｇ／ｍＬのＭＩＣ値、Ｍｔｂ５に対して０．２５および２μｇ／ｍＬのＭＩＣ値である。

【0094】

［略称］

【表3】

【実施例1】

【0095】

［一般的方法］
^１Ｈおよび^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚでＢｒｕｋｅｒ機器にて記録した。化学シフトはｐｐｍ単位で報告し、ＤＭＳＯ残留溶媒を基準とする、^１Ｈおよび^１３Ｃについてはそれぞれ、２．５０および３９．５１ｐｐｍであった。高分解能質量分析は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが、ＤＡＲＴ源を備えるＡｃｃｕＴＯＦ質量分析計を用いて行った。旋光度は、５８９ｎｍのＪａｓｃｏＰ−２０００偏光計で測定した。ＴＬＣ分析は、Ｓｏｒｂｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓシリカゲルＨＬ ＴＬＣプレートで行った。全てのガラス器具をオーブン乾燥し、アルゴン雰囲気下で冷却した。無水ジクロロメタン、エーテル、およびテトラヒドロフランを、Ｂａｋｅｒ Ｃｙｃｌｅ−Ｔａｉｎｅｒｓから直接入手して使用した。無水ジメチルホルムアミドをＡｃｒｏｓから購入し、アルゴンでパージすることによって脱気した。全ての試薬は、特に明記しない限り、商業的供給元から直接入手して使用した。Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２中のＣｕＩ（１０％／ｗ）−（Ｐｄ／Ｃｕ）の予混合不均一混合物を、薗頭カップリング用に使用した。

【0096】

＜実施例１＞
［双性イオンＰＬＡの合成］
本開示の化合物は、鈴木反応により、ｔ−ブチルベンゾエートを好適なＢ環ベンズアルデヒド１にカップリングさせ、続いて鎖延長およびジアミノピリミジン頭部基を用いて薗頭カップリングを行うことによって調製した。強酸性条件下でのｔ−ブチルエステルの最終脱保護は、スムーズかつ良好な収率で進行した（スキーム１）。

【0097】

スキーム１．双性イオンＰＬＡの合成

【化4】

【0098】

（ａ）Ａｒ−Ｂ（ＯＨ）_２またはＡｒ−Ｂｒ、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４、Ｃｓ_２ＣＯ_３、ジオキサン：Ｈ_２Ｏ、９０℃、（ｂ）メトキシメチルトリフェニルホスホニウムクロリド、ＮａＯ^ｔＢｕ、ＴＨＦ、０℃、（ｃ）ＮａＩ、ＴＭＳＣｌ、ＭｅＣＮ、−２０℃、（ｄ）ジメチル（１−ジアゾ−２−オキソプロピル）ホスホネート、Ｋ_２ＣＯ_３、ＭｅＯＨ（ｅ）ヨードエチルジアミノピリミジン、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２、ＣｕＩ、ＫＯＡｃ、ＤＭＦ、５０℃、（ｆ）ＴＦＡ、ＤＣＭ。

【0099】

＜実施例２＞
［メチル分枝鎖同族体の合成］
既知の方法を用いて、１５および１６のメチル分枝鎖同族体を調製した。（ヴィスワナサン，Ｋ．（Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ，Ｋ．）ら、ＰｌｏＳＯｎｅ（２０１２）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２９４３４））ＰＬＡエナンチオマの合成は、先に報告した、鈴木カップリングにより４−メチルベンゾエートボロン酸にカップリングされた非対称チオエステル（１７〜２０）から開始した。ラセミ合成と同様に、最後の合成工程としてメチルエステル開裂を達成することができ、化合物２９〜３４を得ることができた。

【0100】

スキーム２．双性イオンＰＬＡの不斉合成

【化5】

【0101】

（ａ）ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２、４−メトキシカルボニルフェニルボロン酸、ジオキサン：Ｈ_２Ｏ、９０℃、（ｂ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｅｔ_３ＳｉＨ、ＤＣＭ、（ｃ）ノナフリルフルオリド、Ｐ_１−ｔ−Ｂｕ−トリス（テトラメチレン）ホスファゼン塩基、ＤＭＦ、−１５℃〜室温、（ｄ）ヨードエチルジアミノピリミジン、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_２Ｃｌ_２、ＣｕＩ、ＫＯＡｃ、ＤＭＦ、５０℃、（ｅ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ：Ｈ_２Ｏ、３２℃。

【0102】

＜実施例３＞
［（Ｓ）−４−（６−（４−（２，４−ジアミノ−６−エチルピリミジン−５−イル）ブタ−３−イン−２−イル）ベンゾ［Ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）安息香酸の合成：（化合物４１）］

【化6】

【0103】

撹拌子を備えた２０ｍＬのスクリューキャップバイアルに、エチル−ヨードジアミノピリミジン（０．５７ｍｍｏｌ、０．１５ｇ、１当量）、Ｐｄ／Ｃｕ（０．０５ｍｍｏｌ、０．０３ｇ、０．０８当量）、およびＫＯＡｃ（５．７ｍｍｏｌ、０．５５ｇ、１０当量）を添加した。アルゴンでパージした無水ＤＭＦ（０．０５Ｍ、１１．３ｍＬ）を加え、次いでアルキン（０．７３ｍｍｏｌ、０．２５ｇ、１．３当量）を加えた。反応混合物をアルゴン下で１５分間撹拌し、凍結脱気法により１回脱気した。バイアルをアルゴン下で密閉し、６０℃に加熱し、反応をＴＬＣでモニタした。反応の最後に暗赤褐色の溶液を濃縮し、生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（粗混合物（１０％／ｗのシステイン中のＳｉＯ_２−１．５ｇ、ＮＨ２末端保護されたＳｉＯ_２−１．５ｇ）の予備吸着、カラム用ＳｉＯ_２ １３ｇ、２％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製し、カップリングしたピリミジンを淡褐色の固体として得た（０．２ｇ、収率７２％）。ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）。０℃に冷却したｄ−ＣＨＣｌ_３（０．０２Ｍ、２ｍＬ）中のピリミジンカップリングｔ−ブチルエステル生成物（０．０４１１ｍｍｏｌ、０．０２ｇ、１当量）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（８．２２ｍｍｏｌ、２００当量、０．６３ｍＬ）を用いて脱保護した。滴加後、反応混合物を室温にした。反応の終わりに、ＮＭＲによりモニタし、反応混合物を２０℃で回転蒸発させ、真空下に１５分間保持して過剰のＴＦＡを除去した。少量のＴＦＡを含有する生成混合物に、シリカゲル（１ｇ）に予備吸着させるために無水ＣＨ２Ｃｌ２を添加した。フラッシュカラムクロマトグラフィを最初に１００％ＥｔＯＡｃ、続いてＥｔＯＡｃ中の０．０１％ＴＦＡで行った（５ｇシリカゲル）；ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３（０．０１％ＴＦＡを含む１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）。清浄な画分を２０℃で回転蒸発させ、溶媒が確実に完全除去されるようにした。油性ＴＦＡ塩をｐＨ７のリン酸緩衝液で中和した。得られた白色沈殿物を緩衝溶液と共にエッペンドルフチューブに移し、遠心分離して水を沈殿物から分離した。水層をデカントした後、白色沈殿物をジエチルエーテルおよびメタノールですすぎ、水を除去した。ピンク色を帯びた乾燥した白色固体（０．０１ｇ、収率５７％）を特性評価および生物学的評価に付した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d) δ 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.09 (s, 1H),6.28 (広幅, 2H), 6.18 (s, 2H), 6.12 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7 Hz, 1H), 2.55 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.54 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.11 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d) δ171.5, 167.1, 164.2, 161.1, 148.1, 143.4, 139.5, 138.4, 129.8, 129.7, 127.5, 120.2, 118.8, 107.3, 101.2, 100.5, 87.8, 76.0, 32.0, 28.8, 24.6, 12.4; HRMS (DART, M+ + H) m/z 431.1708 (C24H23N4O4の計算値, 431.1719); [α]24 +3.3o (c, 0.146, DMSO).

【0104】

＜実施例４＞
［（Ｒ）−４−（６−（４−（２，４−ジアミノ−６−エチルピリミジン−５−イル）ブタ−３−イン−２−イル）ベンゾ［Ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）安息香酸の合成］

【化7】

【0105】

撹拌子を備えた２０ｍＬのスクリューキャップバイアルに、エチル−ヨードジアミノピリミジン（０．４５ｍｍｏｌ、０．１２ｇ、１当量）、Ｐｄ／Ｃｕ（０．０４ｍｍｏｌ、０．０２５ｇ、０．０８当量）、およびＫＯＡｃ（４．４７ｍｍｏｌ、０．４４ｇ、１０当量）を添加した。アルゴンでパージした無水ＤＭＦ（０．０５Ｍ、８．９ｍＬ）を加え、次いでアルキン（０．５８ｍｍｏｌ、０．２０ｇ、１．３当量）を加えた。（Ｓ）エナンチオマと同じ処理後、（Ｒ）エナンチオマを淡褐色固体として得た（０．１６４ｇ、収率７５％）。ＴＬＣ Ｒｆ＝０．４（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）；０℃に冷却したｄ−ＣＨＣｌ_３（０．０２Ｍ、３ｍＬ）中のピリミジンカップリングｔ−ブチルエステル生成物（０．０６２ｍｍｏｌ、０．０３ｇ、１当量）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１８．５０ｍｍｏｌ、３００当量、１．４２ｍＬ）を用いて脱保護した。上記と同じ脱保護処理を繰り返し、（Ｒ）カルボン酸を、ピンク色を帯びた白色固体として得た（０．０１５ｇ、収率５６％）。ＴＬＣ Ｒｆ＝０．３（０．０１％ＴＦＡを含む１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d) δ 8.03 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.09 (s, 1H),6.26 (広幅, 2H), 6.15 (s, 2H), 6.12 (s, 2H), 4.11 (q, J = 7 Hz, 1H), 2.56 (m, 2H), 1.53 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.11 (t, J = 7.5 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d) δ171.6, 167.0, 164.2, 161.1, 148.1, 143.4, 139.5, 138.4, 129.8, 129.7, 127.5, 120.2, 118.8, 107.3, 101.2, 100.5, 87.8, 76.0, 32.0, 28.8, 24.6, 12.4; HRMS (DART, M+ + H) m/z 431.1708 (C24H23N4O4の計算値, 431.1719); [α]24 -5.2o (c, 0.143, DMSO).

【0106】

＜実施例５＞
［ＤＨＦＲ阻害アッセイ］
ＰＥＴ−４１ａ（＋）中の組換えＳａＤＨＦＲおよびＥｃＤＨＦＲを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞で過剰発現させ、ニッケルアフィニティークロマトグラフィ（５Ｐｒｉｍｅ）を用いて精製した。タンパク質を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、２０％グリセロール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中で脱塩し、分注して−８０℃で保存した。

【0107】

（黄色ブドウ球菌ＭＩＣ）
最小阻害濃度は、Ｉｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ）中の５×１０５ＣＦＵ／ｍＬのＡＴＣＣ株４３３００の最終接種物を用いて、標準微量希釈ブロスアッセイのためのＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインに従って測定した。ＭＩＣは、増殖を視覚的に阻害する阻害剤の最低濃度として定義した。３７℃で１８時間培養した後、Ａ６００で増殖をモニタした。Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて比色分析によりＭＩＣを確認した。

【0108】

（大腸菌）
最小阻害濃度を、大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）およびＩｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ）中の１×１０５ＣＦＵ／ｍＬの接種物を用いた微量希釈ブロスアッセイを用いて測定した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイを用いて、Ａ６００で増殖をモニタし、ＭＩＣは、増殖を完全に阻害する阻害剤の最低濃度として定義する。

【0109】

黄色ブドウ球菌（Ｓａ）、大腸菌（Ｅｃ）およびヒト（Ｈｕ）ＤＨＦＲ酵素の阻害（（ＩＣ５０値）について化合物１３〜１６および２９〜３４を評価し、データを表１に示す。３４０ｎＭの吸光度でＤＨＦＲによるＮＡＤＰＨ酸化速度をモニタすることにより、酵素阻害アッセイを行って、両ＳａおよびＥｃＤＨＦＲ酵素のＩＣ５０値を測定した。反応は、２０ｍＭ ＴＥＳ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭＥおよび１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび２μｇ／ｍＬ酵素を含有する緩衝液中で、室温にて行った。ＤＭＳＯ中の阻害剤を酵素／ＮＡＤＰＨ混合物に添加し、５分間インキュベートした後、５０ｍＭ ＴＥＳ中の０．１ｍＭジヒドロ葉酸を添加した。ＳａＤＨＦＲおよびＥｃＤＨＦＲ ＩＣ５０カラムの括弧内の数字は、ヒトＤＨＦＲ酵素の阻害に対する倍選択性を表す。

【0110】

黄色ブドウ球菌（Ｓａ）、大腸菌（Ｅｃ）およびヒト（Ｈｕ）ＤＨＦＲ酵素の化合物阻害（表２および表３）を示す。

【0111】

【表4】

【0112】

【表5】

【0113】

＜実施例６＞
［構造研究］
双性イオン化合物１５および１６に結合したＳａＤＨＦＲの構造を、Ｘ線結晶学によって測定した。

【0114】

（ＳａＤＨＦＲ：ＮＡＤＰＨ：１５）
１８ｍｇ／ｍＬタンパク質の精製ＳａＤＨＦＲを、ハンギングドロップ法により、ＤＭＳＯ中の２ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび１ｍＭ阻害剤１５と共結晶化した。タンパク質と補因子との混合物を、氷上で３時間インキュベートした。等体積のタンパク質溶液を、０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．５、０．２Ｍ酢酸ナトリウム、１７％ＰＥＧ １０，０００および１２．５％γ−ブチラクトンを含有する最適化された緩衝溶液に添加した。４℃で保存すると、通常は７日以内に結晶が形成される。結晶を採取し、２５％グリセロールを含有する抗凍結（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）緩衝液中で凍結した。データは、ＳＬＡＣ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅにてビームライン７−１で遠隔収集した。ＨＫＬ２０００を使用してデータを指数付けし、スケーリングした。プローブとしてＰＤＢ ＩＤ：３Ｆ０Ｑを使用して、Ｐｈａｓｅｒ結晶学ソフトウェア（マッコイ Ａ．Ｊ．（ＭｃＣｏｙ、Ａ．Ｊ．）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．、（２００７）４０：６５８〜６７４）を使用して分子置換溶液を同定した。ＣｏｏｔおよびＰｈｅｎｉｘを使用して、許容されるＲ_ＷｏｒｋおよびＲ_Ｆｒｅｅが達成されるまで、構造を精密化した。

【0115】

（ＳａＤＨＦＲ：ＮＡＤＰＨ：１６）
精製ＳａＤＨＦＲを、ハンギングドロップ法により、ＤＭＳＯ中の２ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび１ｍＭの１６と共結晶化した。結晶化の詳細は、緩衝液を０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．０に変更したことを除いて上記で使用したものと同様であった。Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ大学のＰｒｏｔｅｉｎ Ｘ−Ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＦａｃｉｌｉｔｙのＲｉｇａｋｕ Ｈｉｇｈｆｌｕｘ Ｈｏｍｅｌａｂシステムで、データを収集した。Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｔｕｄｉｏ（ｄ^＊Ｔｒｅｋ）を使用してデータを指数付けし、スケーリングした。上記と同様に、Ｐｈａｓｅｒを使用して分子置換を行い、Ｃｏｏｔ（エムズリー，Ｐ．（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．）およびコウタン，Ｋ．（Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．）、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａ．、（２００４）Ｄ５０：２１２６〜２１３２）およびＰｈｅｎｉｘ（アダムス，Ｐ．Ｄ．（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．）、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．、（２０１０）Ｄ６６：２１３〜２２１）を使用して、構造精密化を行った。

【0116】

ＮＡＤＰＨおよび阻害剤１５または１６と複合体を形成したＳａＤＨＦＲの結晶は、それぞれ２．２４Åまたは１．８１Åまでの回折振幅を生じた。構造は、モデルとしてＰＤＢ ３Ｆ０Ｑ（フレイ，Ｋ．Ｍ．（Ｆｒｅｙ，Ｋ．Ｍ．）ら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）１７０（１）：９３〜９７）に基づいて、分子置換法を用いて解明した。両方の構造は、結合した抗葉酸剤および、β−ＮＡＤＰＨとその代替のα−アノマ（化合物１５を有する構造は閉環した互変異性体状態のα−アノマを示す）との二重占有（フォックス，Ｋ．Ｍ．（Ｆｏｘ，Ｋ．Ｍ．）およびカープラス，Ｐ．Ａ．（Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｐ．Ａ．）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９４）２（１１）：１０８９〜１１０５）、またはα−アノマ（化合物１６を用いた構造）の全占有のいずれかを特徴とする。化合物１５に結合した構造は、カルボン酸とＡｒｇ ５７の側鎖との間の水分子の配位を示す（図２Ａ）。化合物１６（図２Ｂ）を用いた構造は、１６のカルボン酸と、Ａｒｇ５７上のアミノ基およびＬｅｕ２８のカルボニル酸素との間で配位した、少なくとも４つの水分子を含む広範な水ネットワークを示す。水ネットワークは、Ａｓｎ５６およびＴｈｒ３６の側鎖とのさらなる水素結合相互作用を含むように拡大する（図２Ｂ）。阻害剤の結合様式は、阻害剤１５および１６を有する結晶構造における有意差を示す。化合物１５のＲ_１位におけるメトキシ置換はビアリール系１．２Åを溶媒曝露表面にシフトさせ、これは化合物１５と１６との間の観察される水ネットワークの差異の原因となるようである（図２Ｃ）。

【0117】

両方の構造は、補因子結合部位においてＮＡＤＰＨのα−アノマを特徴とする。ＳａＤＨＦＲ：ＮＡＤＰＨ：１５の構造は４０％の占有率を示し、ＳａＤＨＦＲ：ＮＡＤＰＨ：１６の構造は１００％占有率を示す。α−アノマは、β−ＮＡＤＰＨのニコチンアミドホスフェートと、α−ＮＡＤＰＨの環化リボース部分が占有するようになる、Ａｓｎ１８の側鎖との間で配位した水分子を置換する。α−ＮＡＤＰＨ構造では、３つの水分子が、ニコチンアミドアミドと、Ｐｈｅ９２、Ｉｌｅ１４およびＡｌａ７の骨格との間で配位される。

【0118】

ＮＡＤＰＨおよび化合物１５、またはＮＡＤＰＨおよび化合物１６を用いた、ＳａＤＨＦＲの結晶についてのＸ線結晶学的測定およびデータ収集および精密化統計を、表４に示す。

【0119】

【表6】

【0120】

＜実施例７＞
［ＣＯＯＨ−ＰＬＡの細胞活性］
ｐ−ＣＯＯＨ ＰＬＡは、大部分のＭＩＣ値が０．００９８〜０．６２５の範囲のＳａＤＨＦＲ酵素および黄色ブドウ球菌に対して、高いレベルの活性を示す（表１）。この化合物は野生型大腸菌に対して活性が低下し、化合物３１および３２は１０μｇ／ｍＬのＭＩＣ値を示した。グラム陰性菌に対する活性に対しての主なバリアのうちの２つは、外膜を通過する透過性および排出による阻害剤の能動的除去である。固有耐性の手段としての透過性を精査するために、外膜アセンブリに必須のタンパク質をコードするｉｍｐ遺伝子にインフレーム欠失を含む、操作された株であるＮＲ６９８に対するＭＩＣ値を測定した。化合物１５、１６、および２９〜３２を用いたＮＲ６９８株に対する阻害濃度は、およそ２，０００分の１〜４，０００分の１の減少を示し、これは、外膜を通過する浸透の減少が、大腸菌におけるＰＬＡ活性を制限することを示している。

【0121】

ＣＯＯＨ−ＰＬＡが共通のＡｃｒＢ排出ポンプによって排出されるかどうかを調べるために、我々は、親大腸菌株のＭＩＣ値を、ＡｃｒＢが欠失した菌株（ＪＷ０４５１）のＭＩＣ値と比較した。ＪＷ０４５１株に対するＭＩＣ値は、ＮＲ６９８株ではなく、親株と類似であるので（表５）、化合物は、ＡｃｒＢによる排出の影響を受けない可能性が高い。

【0122】

【表7】

【0123】

ＭＩＣ値は、ΔａｃｒＢ株、ΔｍａｃＢ株、ΔｅｍｒＢ株、またはΔａｃｒＦ株においてもシフトされなかったので、ＡｃｒＢは生じない可能性が高く、主要ポンプＡｃｒＢに対する排出活性が生じない可能性が高いことが、さらに実証された。

【0124】

＜実施例８＞
［ヒト細胞に対する開示の化合物の効果］
（ＣＯＯＨ−ＰＬＡは、優れた薬物様特性を有する）
本開示のＣＯＯＨ−ＰＬＡ化合物の薬物様ポテンシャル（ｄｒｕｇ−ｌｉｋｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を調べるために、一連のインビトロアッセイにより、ヒト細胞に対するそれらの効果、重要なＣＹＰアイソフォームのそれらの阻害およびミクロソーム安定性アッセイにおけるそれらの寿命を精査した。ＣＯＯＨ−ＰＬＡは、ＨｅｐＧ２およびＭＣＦ−１０および細胞に対して測定可能な細胞毒性（ＩＣ_５０＞５００μＭ）を有しない。低い細胞毒性を有するグラム陽性菌細胞に対する強力な活性を結合することにより、高い治療指数（＞５００，０００）が得られる。

【0125】

＜実施例９＞
［ＣＹＰ酵素に対する開示の化合物の効果］
出願人は、本開示の特定の化合物について、シトクロムＰ４５０阻害も測定した。最も一般的なアイソフォームのうちの２つである、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｄ６に対する化合物１５の活性を測定した。両酵素の阻害は、５０μＭを超える濃度を必要とし、このことは、化合物が、他の同時投与される治療剤の代謝を妨げないと予測され得ることを示す。

【0126】

＜実施例１０＞
［ミクロソーム安定性］
ミクロソーム安定性アッセイにおける化合物１５の寿命を測定した。化合物の半減期は、ＵＰＬＣを用いて親化合物を追跡することによって測定した。フェーズＩの半減期は９９分であり、フェーズＩＩの半減期はおよそ８７分である。これらのインビトロ実験の結果は、ＣＯＯＨ−ＰＬＡの優れた薬物様プロファイルを示す。

【0127】

＜実施例１１＞
［ヒト結核菌ＤＨＦＲおよびヒトＤＨＦＲに対する化合物の阻害効果］
（薬物）
イソニアジド（ＩＮＨ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．から購入し、このイソニアジドを−２０℃で凍結する前に、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＤＨＦＲ阻害剤を、１００％ＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。

【0128】

（分離株）
結核菌ＡＴＣＣ ３５８０１エルドマン（Ｅｒｄｍａｎ）株は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓａｓ、ＶＡ．から入手した。臨床分離株は、ＳＵＮＹ Ｕｐｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ（Ｂｅｔｚ Ｆｏｒｂｅｓ提供）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｅｌｌｅｎｂｏｓｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａ（Ｔｏｍｍｙ Ｖｉｃｔｏｒ提供）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｔｂｉｌｉｓｉ、Ｇｅｏｒｇｉａ（Ｎａｔａｌｉａ Ｓｈｕｂｌａｄｚｅ提供）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ（Ｌｅｏｎｉｄ Ｈｅｉｆｅｔｓ提供）から入手した。

【0129】

マイコバクテリア分離株を、改変ミドルブルック７Ｈ１０ブロス（Ｍｉｄｄｌｅ ｂｒｏｏｋ ７Ｈ１０ ｂｒｏｔｈ）（ｐＨ６．６、寒天を有し、マラカイトグリーンを省いた７Ｈ１０寒天配合物）中で、１０％ミドルブルックオレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ濃縮物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ＭＩ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を補充して、回転シェーカー上において３７℃で５〜１０日間、増殖させた。この微生物を、７Ｈ１０ブロスで１クレット単位（約５×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ当量）に希釈して、光電比色計（Ｍａｎｏｓｔａｔ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）をブロス希釈アッセイに使用した。

【0130】

（マイクロタイターブロス希釈ＭＩＣ試験）
ポリスチレン９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を５０μｌの改変７Ｈ１０ブロスで満たした。化合物は、試験する最大濃度の４倍で調製し、次いで、第１のウェルに添加してその後連続的に２倍に希釈した。ＩＮＨは、８μｇ／ｍｌ〜０．００８μｇ／ｍｌの範囲の濃度を用いて試験した。ＤＨＦＲ阻害剤は、３２μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍｌの範囲のものを用いて試験した。各菌株に使用する接種物を滴定によって測定し、７Ｈ１０寒天プレート上にプレーティングして実際の接種物を決定した。７Ｈ１０寒天プレートを３７℃で４週間インキュベートした。５０μｌの接種物を、化合物を含有する各ウェルに添加して、約２．５×１０^５ＣＦＵ／ｍｌの初期濃度を得た（試験した種々の分離株の範囲は１．２５×１０^６ＣＦＵ／ｍｌ〜８×１０^４ＣＦＵ／ｍｌであった）。マイクロタイタープレートをＳｅａｌＰｌａｔｅ接着密封フィルム（Ｅｘｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｒｉｇｈｔｗｏｏｄ、ＣＡ）で覆い、周囲空気中、３７℃で１４〜２１日間インキュベートして、その後結果を読み取った。各分離株を２連で試験した。ＭＩＣは、目に見える濁りを生じない抗菌剤の最低濃度として定義した。

【0131】

（結核菌およびヒトＤＨＦＲの発現ならびに精製）
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント大腸菌細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって構築されたｄｆｒＡ遺伝子を保有する組換えｐＥＴ−４１ａ（＋）プラスミドで形質転換した。形質転換した細胞を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを追加したＬＢ培地において、３７℃で、ＯＤ_６００が０．６〜０．７に達するまで増殖させた。細胞を、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２０℃で２０時間誘導し、８０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンした。湿った細胞ペレットの各グラムを、２００μｇ／ｍＬリゾチームおよび１ｍＭ ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加した１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍｌに、再懸濁した。穏やかに回転させながら細胞懸濁液を室温で３０分間インキュベートした後、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を回収した。若干の非標的タンパク質を沈殿させるために、４０％硫酸アンモニウムを細胞溶解物に加え、４℃で一晩撹拌した。１８，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上清を０．２２μｍフィルターに通し、４ＣＶの平衡緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）で予め平衡化したメトトレキサート−アガロースカラムにゆっくりと充填した。カラムを、３ＣＶの洗浄緩衝液Ｂ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｍ ＥＤＴＡおよび１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．５）で洗浄した。酵素を、３ＣＶの溶出緩衝液Ｃ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＤＨＦ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．５）で溶出した。ＤＨＦＲ酵素を含む画分を収集し、濃縮し、１ＣＶの平衡緩衝液Ａ（ｐＨ８．５）で予め平衡化したＨｉ−Ｐｒｅｐ２６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００ ＨＲカラムに充填した。タンパク質溶出を、ＡＫＴＡ ＵＶ／ｖｉｓダイオードアレイ分光光度計を用いて２８０ｎｍでモニタした。純粋な酵素を含む画分をプールし、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。

【0132】

（酵素阻害）
酵素活性および阻害アッセイを、ＤＨＦＲ酵素によって触媒されるジヒドロ葉酸のＮＡＤＰＨ依存性の減少をモニタすることにより行った。ＮＡＤＰＨ酸化速度を、２０ｍＭ ＴＥＳ ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有するアッセイ緩衝液中で、３４０ｎｍで分光光度的に測定した。全ての測定は、純粋な酵素（２ｍｇ／ｍＬ）、１００μＭのＮＡＤＰＨおよび１００μＭのＤＨＦを緩衝液に添加して、室温で行った。阻害アッセイのために、１００％ＤＭＳＯに溶解した阻害剤を混合物に添加し、５分間インキュベートしてＤＨＦを添加した。平均ＩＣ_５０値および標準偏差を３連で測定した。

【0133】

特定のＰＬＡ化合物についてのＭｔｂおよびヒトＤＨＦＲに対するＩＣ_５０値およびＭｔｂ ＭＩＣ値を、表６に示す。非ＤＨＦＲ阻害抗生物質であるトリメトプリム（ＴＭＰ）を陰性対照として使用した。ＤＨＦＲ阻害剤イソニアジド（ＩＮＨ）およびトリメトレキセートを陽性対照として使用した。

【0134】

【表8】

【0135】

本開示の特定の化合物を、ヒト結核菌の多剤耐性分離株に対する抗菌活性について評価した。種々の菌株のＭＩＣ値を表７に示す。

【0136】

【表9】

【0137】

＜実施例１２＞
［化合物Ａに耐性のＭＲＳＡ菌株の生成および特性評価］
化合物Ａによる阻害を克服するための黄色ブドウ球菌４３３００株の潜在的耐性メカニズムについての最初の研究は、以前に報告されている（フリーブキシィ，Ｋ．（Ｆｒｅａｂｘｙ，Ｋ．）ら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．（２０１０）１７０：９３〜９７）。

【化8】

（化合物Ａ）

【0138】

これらの研究は、２つの変異体、ＤＨＦＲ遺伝子中のＦ９８ＹおよびＦ９８Ｉが、低い変異頻度（１０^−１０）で選択されたことを示した。プロパルギル結合抗葉酸剤の耐性プロファイルをさらに特性評価するために、一段階および二段階選択試験を実施し、得られた菌株を特性評価した。一段階試験では、６×ＭＩＣで化合物１に供されたＡＴＣＣ品質管理株４３３００を用いた変異体選択により、臨床的に観察された３つの変異、すなわち、Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０ＮおよびＨ１４９Ｒ、ならびに３つの新規変異、すなわち、Ｆ１５１Ｓ、Ｆ１５１ＣおよびＤ１４２Ｙが生じた。化合物ＡおよびＦ９８ＹまたはＨ１４９Ｒを有する前駆細胞株を用いた２回目の耐性選択により、一連の新規および臨床的に関連する二重変異体の両方を得た（表８）。Ｈ３０Ｎ／Ｆ９８Ｙ変異体およびＦ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒ変異体を含む菌株が臨床的に単離されたので、単一変異体対応物（Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０ＮおよびＨ１４９Ｒ）を含む、これらの変異型酵素および細菌の適応性の完全な特性評価が、生化学的レベル、構造的レベルおよび細胞レベルで行われた。

【0139】

６×ＭＩＣ １を含有するＩｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ（Ｏｘｏｉｄ）寒天プレート上の前駆細胞株の一晩培養物（およそ１０１２ＣＦＵ／ｍＬ）１００μＬをプレーティングし、３７℃で１８時間インキュベートして、耐性菌株を選択した。単一のコロニを単離し、コロニＰＣＲ産物を直接配列決定して、ｄｆｒＢ遺伝子を同定した。コロニＰＣＲのために、０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５中の１ｍｇ／ｍＬリゾスタフィンおよび２０μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを用いて、細胞を溶解させた。標準的ＰＣＲ条件に従って、センスプライマ（５’−ＡＴＧＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣ−３’）、アンチセンスプライマ（５’−ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＧ−３’）およびｒＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をＰｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐシステムを用いて精製し、センスプライマを用いて配列決定した。

【0140】

変異頻度１は、得られたコロニの数を、各前駆細胞株の総接種物（１×１０^１１ＣＦＵ／ｍＬ）で割って決定した。特異的変異の頻度は、阻害剤−菌株対の変異頻度に、特異的変異を含む配列決定されたコロニの数を掛けることによって決定した。

【0141】

（最少阻害濃度（ＭＩＣ））
最小阻害濃度は、Ｉｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ）中の５×１０^５ＣＦＵ／ｍＬの最終接種物を用いて、標準微量希釈ブロス２０アッセイのためのＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインに従って測定した。ＭＩＣは、増殖を視覚的に阻害する阻害剤の最低濃度として定義した。３７℃で１８時間培養した後、Ａ_６００で増殖をモニタした。Ｐｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて比色分析によりＭＩＣを確認した。１０μｇ／ｍＬのチミジンを追加したＩｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔブロスを使用して、全てのオフターゲット抗菌活性を測定した。

【0142】

（増殖曲線）
ＬＢ培地（５０ｍＬ）に一晩培養物１ｍＬを接種した。３０分ごとに、Ａ_６００で増殖をモニタした。倍加時間は、増殖曲線の直線部分から以下の式によって決定した：

【数1】

【0143】

（Ｓａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ１４９Ｒ）およびＳａ（Ｈ１４９Ｒ）ＤＨＦＲ酵素の生成、発現および精製）
Ｓａ（Ｆ９８Ｙ）、Ｓａ（Ｈ３０Ｎ）およびＳａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０Ｎ）ＤＨＦＲ酵素の生成、発現および精製については、先に報告している^{１５，１６}。Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）およびＳａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ１４９Ｒ）ＤＨＦＲプラスミドの生成は、ｐＥＴ−４１ａ（＋）構築物中のＳａ（ＷＴ）およびＳａ（Ｆ９８Ｙ）を使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、センスプライマ５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＡＣ−３’およびアンチセンスプライマ５’−ＣＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＴ−３’を、製造者の指示に従って使用して実施した。変異誘発は、配列決定により確認した。組換えＳａ（Ｈ１４９Ｒ）およびＳａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ１４９Ｒ）酵素は、先に報告した手順により、１ｍＭ ＩＰＴＧを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞で過剰発現させた。１ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＤＮａｓｅＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてペレットを溶解し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィ（５Ｐｒｉｍｅ）を用いて精製した。タンパク質を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、２０％グリセロール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中で脱塩し、分注して−８０℃で保存した。

【0144】

【表10】

【0145】

化合物Ａに曝露された各菌株全体の変異頻度平均は、６×ＭＩＣで化合物１の濃度を有する複数のプレート上に現れる接種物およびコロニの数に基づいて計算した。Ｓａ４３３００は、２．９６×１０^−１０の非常に低い頻度で化合物Ａに対するＭＩＣの上昇を示す。全体の変異頻度は、Ｆ９８ＹおよびＨ１４９Ｒを有する前駆細胞株に対して６．５６×１０^−１１および３．７５×１０^−１１の比率で、さらに低くなる。次いで、特定の変異頻度を、特定の変異を有する配列決定されたコロニの数に基づいて計算した。二重変異体の生成が段階的な方式で起こる場合、組み合わせられた変異の頻度は、１０^−２１と低い可能性がある。倍加時間で測定した細菌の適合度の評価は、倍加時間を維持したか、またはわずかに改善したＳａ（Ｆ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒ）を除いて、大部分の変異株が、増殖時間においてわずかな損失（野生型の１．０８−１．２倍の倍加時間）のみを示すことを示している。（表８）。全体的に、これらの研究は、野生型と比較した場合、変異株が比較的適合していることを示している。

【0146】

組換え変異体ＤＨＦＲ酵素は、野生型酵素の部位特異的変異誘発によって生成し、アフィニティークロマトグラフィを用いて精製した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度論は、先にフレイ（Ｆｒｅｙ）らが公表したアッセイ条件（２０１０）を用いて、各酵素について測定した（表９）。全体として、Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）以外の全ての酵素は、野生型値のおよそ２倍以内のｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ値を有する。Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）は、有意に低下したｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ値（６分の１に減少）を有し、これは、ＤＨＦおよびＮＡＤＰＨの両方についてより高いＫ_Ｍ値を有する結果である。興味深いことに、Ｓａ（Ｆ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒ）酵素により、ＤＨＦおよびＮＡＤＰＨのＫ_Ｍ値がほぼ野生型の値に回復するので、二重変異体Ｓａ（Ｆ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒ）は、単一Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）変異体の低効率を補う。この補償的関係は、二重変異体Ｓａ（Ｆ９８Ｙ／Ｈ３０Ｎ）でも観察される。単一Ｈ３０Ｎ変異は、ＮＡＤＰＨ Ｋ_Ｍ（３１．２１〜７９．８９μＭ）の有意な低下を被り、このＫ_Ｍ値は、二重Ｓａ（Ｈ３０Ｎ／Ｆ９８Ｙ）変異体において野生型に近い値に復元する。

【0147】

【表11】

【0148】

＜実施例１２＞
［変異型黄色ブドウ球菌のＰＬＡ阻害剤］
表１０に示す化合物を、変異型黄色ブドウ球菌の阻害剤として評価した。化合物Ａ〜Ｆは、先に開示されている。

【0149】

【表12】

【0150】

表１０の化合物の阻害効果を、以下のＤＨＦＲ結合アッセイを用いて測定した。酵素阻害アッセイを、２０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨおよび２μｇ／ｍＬ 酵素を用いた１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するアッセイ緩衝液中で、室温で３４０ｎｍの吸光度により、ＤＨＦＲによるＮＡＤＰＨ酸化速度をモニタして行った。ＤＭＳＯ中の阻害剤を酵素：ＮＡＤＰＨ混合物に添加し、５分間インキュベートした後、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．０中の０．１ｍＭ ＤＨＦを添加した。阻害剤濃度および体積は、酵素活性の５０％低下をもたらす条件に基づく。

【0151】

酵素反応速度論は、ＤＨＦ Ｋ_ＭおよびＶ_ｍａｘについては２０μＭのＮＡＤＰＨを伴う１２．５〜１００μＭのＤＨＦを使用する、またはＮＡＤＰＨのＫ_Ｍについては５０μＭのＤＨＦを伴う１２．５〜１００μＭのＮＡＤＰＨを使用する酵素活性アッセイによって生成したＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットによって決定した。Ｋ_Ｍ値は、ＧｒａｐｈＰａｄを用いた非線形回帰分析によって決定した。表１１は、ＷＴおよび変異体ＤＨＦＲ酵素に対するＰＬＡ化合物の阻害定数Ｋ_ｉ（ｎＭ）を開示する。

【0152】

【表13】

【0153】

表１０の全ての化合物は、野生型と比較してほんのわずかの損失で、単一変異酵素Ｓａ（Ｆ９８Ｙ）およびＳａ（Ｈ３０Ｎ）に対して良好な効力（１５ｎＭ未満のＫ_ｉ値）を示す（表１１）。化合物Ｂは、Ｓａ（Ｈ３０Ｎ）酵素に対する親和性の損失が最大で、１２．６倍の損失であった。しかし、単一変異体Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）に対する活性は、より損なわれた。ＴＭＰは、Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）変異体に対して活性を６９倍失う。ＰＬＡは、この酵素に対して、１８５ｎＭのＫ_ｉ値を有する化合物１２から１６４９ｎＭのＫ_ｉ値を有する化合物Ｂまでの範囲の親和性を有する。興味深いことに、拘束されていない３’および４’メトキシ基を有する化合物３は、化合物Ｂと比較した場合、妥当な親和性（１４４ｎＭ）を維持し、柔軟性が変異酵素に対する親和性にとって重要であり得ることを示した。二重変異体Ｓａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０Ｎ）に対して、ＴＭＰの親和性の損失は、３０倍である。一般に、ジオキサラン化合物（ＢおよびＦ）ならびに化合物Ｃ〜Ｅは、Ｓａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０Ｎ）二重変異酵素に対して親和性を有意に失う（１８０〜３００倍の損失）。

【0154】

化合物１５〜１６、２９、３１〜３２の設計は、保持されるアルギニンとの可能な相互作用を前提として、これらの変異酵素における補償的相互作用を提供する。喜ばしいことに、化合物２９、１６および３１〜３２は、二重変異体Ｓａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ３０Ｎ）酵素に対して、１６〜４５ｎＭの範囲のＫ_ｉ値を有し、はるかに大きな親和性を示す。化合物Ａ〜Ｆ、６０および１５およびＴＭＰは、１０７〜２０５９ｎＭのＫ_ｉ値を示すので、二重変異体Ｓａ（Ｆ９８Ｙ、Ｈ１４９Ｒ）酵素に対する活性を維持することが明らかにより困難である。しかし、化合物３１および３２は、それぞれ、６９および５５ｎＭのＫ_ｉ値で、この酵素に対する有意な阻害を示す。ここでも、イオン化されたカルボキシレートの存在は、複合体の他の場所での接触の減少を補償するために、重要な追加の相互作用を提供することができるようである。

【0155】

黄色ブドウ球菌の野生型株および変異株（Ｓａ（Ｆ９８Ｙ）、Ｓａ（Ｈ３０Ｎ）、Ｓａ（Ｈ１４９Ｒ）、Ｓａ（Ｈ３０Ｎ、Ｆ９８Ｙ）およびＳａ（Ｆ９８Ｙ／Ｈ１４９Ｒ））の増殖の阻害についても試験した（表１２）。ＴＭＰの抗菌活性は、単一の変異によっても明らかに損なわれ、二重変異株に対して５０〜１００μｇ／ｍＬのＭＩＣ値に達した。ＰＬＡ Ａ〜Ｆ、６０、１５および２９は、ＴＭＰより野生型株に対してより強力であり、多くは単一変異体に対してより強力であった（０．０７８〜５μｇ／ｍＬの間のＭＩＣ値）。しかし、ＰＬＡ Ａ〜Ｆ、６０、１５および２９も、ＤＨＦＲの二重変異を有する株に対して有意な損失を被った。ＰＬＡ１６、３１および３２は、野生型株ならびに単一および二重変異体の両方を有する株に対して、優れた活性を有する。

【0156】

【表14】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】