特許 6927467 タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6927467

(24)【登録日】2021年8月10日

(45)【発行日】2021年9月1日

(54)【発明の名称】タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/02 20060101AFI20210823BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20210823BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/02

   C12N9/88ZNA

   C12N15/60

【請求項の数】6

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2019-553228(P2019-553228)

(86)(22)【出願日】2018年3月30日

(65)【公表番号】特表2020-511986(P2020-511986A)

(43)【公表日】2020年4月23日

(86)【国際出願番号】KR2018003768

(87)【国際公開番号】WO2018182354

(87)【国際公開日】20181004

【審査請求日】2019年9月27日

(31)【優先権主張番号】10-2017-0042166

(32)【優先日】2017年3月31日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0111489

(32)【優先日】2017年8月31日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0111494

(32)【優先日】2017年8月31日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0158765

(32)【優先日】2017年11月24日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12096P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12237P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12095P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11995P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11999P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12097P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12107P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12108P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12233P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM12234P

(73)【特許権者】

【識別番号】512088051

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣｈｅｉｌＪｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， スンジェ

(72)【発明者】

【氏名】リー， ヤン ミ

(72)【発明者】

【氏名】パク， イル ヒャン

(72)【発明者】

【氏名】チョ， ヒュン ク

(72)【発明者】

【氏名】キム， ソン ボ

(72)【発明者】

【氏名】リー， チャン−ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】チェ， ユン ジュン

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０１８６１６２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１６−５２３５２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Archives of Microbiology，２００２年，Vol.177，pp.410-419

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含む、タガトース生産用組成物。

【請求項2】

前記組成物が、果糖をさらに含む、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項3】

前記組成物が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列からなるタガトース−ビスリン酸アルドラーゼを１つ以上含むものである、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項4】

前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼが、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｌｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ｓｐ．またはＣａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体である、請求項１に記載のタガトース生産用組成物。

【請求項5】

果糖を、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて、前記果糖をタガトースに転換させる段階を含む、タガトースの製造方法。

【請求項6】

前記接触が、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の条件で、３０℃〜８０℃の温度条件で、または０．５時間〜４８時間行われる、請求項５に記載のタガトースの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、果糖−４−エピマー化酵素を含むタガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タガトースは、牛乳、チーズ及びカカオなどの食品、そしてリンゴやみかんなどの甘味が出る天然果実に少量存在する天然甘味料である。タガトースのカロリーは１．５ｋｃａｌ／ｇで砂糖の１／３水準であり、ＧＩ（Ｇｌｙｃｅｍｉｃ ｉｎｄｅｘ、血糖指数）は３で砂糖の５％水準であるのに対し、砂糖と物理的性質が類似して、同様の甘味を出しながら、様々な健康機能性を有するため、健康と味を同時に満足できる砂糖代替の甘味料として様々な製品に用いられる。

【0003】

従来公知されるか公用されたタガトースの製造方法は、ガラクトースを主原料とした化学的方法（触媒反応）と生物学的方法（異性化酵素反応）がある（特許文献１〜３を参照）。しかし、前記従来の製造方法で主原料として用いられるガラクトースの基礎原料となる乳糖は、国際市場での原乳及び乳糖の生産量、需要及び供給量などに応じて価格が不安定で、安定的な需給に限界があるため、普遍化された糖（砂糖、ブドウ糖、果糖など）を原料としてタガトースを製造しうる新しい方法が求められて研究されたところ、前記文献は、グルコースとガラクトース及び果糖からそれぞれガラクトース、プシコース及びタガトースを生産する方法を開始している（特許文献４〜６）。

【0004】

一方、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ：ＥＣ４．１．２．４０）は、下記［反応式１］のようにＤ−タガトース１，６−ビスリン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質にしてグリセロンホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産し、ガラクトース代謝に関与することが公知されたが、前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼがタガトースを生産する活性を有するかについての研究はない。

【0005】

［反応式１］
Ｄ−タガトース１，６−ビスリン酸 ＜＝＞ グリセロンホスフェート＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸

【0006】

このような背景下で、本発明者らは、果糖をタガトースに転換させる活性を有する酵素を開発するために鋭意研究努力した結果、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ：ＥＣ４．１．２．４０）が果糖をタガトースに転換させる機能があることを確認することにより、本出願を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際特許公報ＷＯ２００６／０５８０９２

【特許文献2】韓国登録特許第１０−０９６４０９１号

【特許文献3】韓国登録特許第１０−１３６８７３１号

【特許文献4】韓国登録特許第１０−７４４４７９号

【特許文献5】韓国登録特許第１０−１０５７８７３号

【特許文献6】韓国登録特許第１０−１５５０７９６号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， ９．５０−９．５１， １１．７−１１．８

【非特許文献2】Ｓｃｈｅｉｔ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）

【非特許文献3】Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ９０：５４３−５８４（１９９０）

【非特許文献4】Ｉｚｓｖａｋ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． ３０２：９３−１０２（２０００）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本出願の目的は、タガトースの製造に有用な組成物を提供することにあって、前記組成物はタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を含む。

【0010】

本出願の他の目的は、本出願の果糖−４−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を果糖と接触させて果糖をタガトースに転換させる段階を含むタガトースの製造方法を提供することにある。

【0011】

本出願の他の目的及び利点は、添付した請求範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。本明細書に記載されない内容は、本出願の技術分野または類似の分野で熟練された者であれば、十分に認識かつ類推できるため、その説明を省略する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

以下、本出願の内容について具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示した一実施様態の説明及び実施形態は、共通事項について別の様態の説明及び実施形態にも適用されうる。また、本出願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本出願のカテゴリに属する。加えて、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。

【0013】

本出願の目的を達成するために、本出願は一様態として、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むタガトース生産用組成物を提供する。

【0014】

前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼは、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ：ＥＣ ４．１．２．４０）であって、例えば、果糖を基質としてタガトースを生産できれば、限定なく含まれてもよい。具体的には、前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼは、基質である果糖からタガトースへの転換率（転換率＝タガトース重量／初期果糖重量×１００）が０．０１％以上、具体的には、０．１％以上、より具体的には、０．３％以上のものであってもよい。より具体的には、転換率は、０．０１％〜４０％の範囲、０．１％〜３０％の範囲、０．３％〜２５％の範囲、または０．３％〜２０％の範囲であってもよい。

【0015】

具体的には、前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、前記相同性を有し、前記配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能（すなわち、果糖の４番炭素位置をエピマー化してタガトースに転換させる果糖−４−エピマー化活性）を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドであれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有しても、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記ポリペプチドを暗号化する塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとして、果糖−４−エピマー化活性を有するポリペプチドも制限なく含まれてもよい。また、前記組成物は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列からなるタガトース−ビスリン酸アルドラーゼの１つ以上を含んでもよい。

【0016】

本願に至って「タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ」が果糖の４番炭素位置をエピマー化して果糖をタガトースに転換させる果糖−４−エピマー化活性を示すことを明らかにし、したがって、本願では「果糖−４−エピマー化酵素」と互換的に用いられてもよい。

【0017】

本出願において、用語、「厳格な条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野によく知られて、文献（例えば、非特許文献１）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の相同性を有する遺伝子同士ハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。前記ハイブリッド化に用いられるプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。これらのプローブは、公知配列に基づいて作成されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲによって作製されてもよい。また、当業者は温度及び洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さのような要因によって、必要に応じて調節してもよい。

【0018】

本出願において、用語、「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの一部分（Ｍｏｉｅｔｙ）間の同一性のパーセントをいう。１つの一部分から、もう１つの一部分までの配列間相同性は公知の当該技術によって決定してもよい。例えば、相同性は、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて２つのポリヌクレオチド分子または２つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を直接整列して決定してもよい（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解して、分解された断片の大きさを決定することにより決定してもよい。

【0019】

一具現例として、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、耐熱性微生物由来の酵素であってもよく、例えば、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｌｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ｓｐ．、 Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｓｐ．またはＣａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．由来の酵素またはその変異体であってもよい。具体的には、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｏｌｅａｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ、Ｌｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｐｉｌｏｓａ、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＣａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ由来の酵素またはその変異体であってもよい。より具体的には、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｉ ＤＳＭ ２２２１２またはＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＡＴＣＣ ４３８１２由来の酵素またはその変異体であってもよい。

【0020】

本願の果糖−４−エピマー化酵素またはその変異体は、Ｄ−フルクトース（果糖）の４番炭素位置をエピマー化してＤ−タガトースに転換させる特徴がある。前記果糖−４−エピマー化酵素は、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）活性を有し、Ｄ−タガトース１，６−ビスリン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質としてグリセロンホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生産し、ガラクトース代謝に関与することが知られていた。本出願に至って、前記タガトース−ビスリン酸アルドラーゼが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを新たに明らかにした。そこで、本出願の一具現例は、果糖からタガトースを製造するに当たり、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼを果糖−４−エピマー化酵素として用いることを含む、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの新規用途に関する。また、本出願の一具現例は、タガトース−ビスリン酸アルドラーゼを果糖−４−エピマー化酵素として用いて、果糖からタガトースを製造する方法に関する。

【0021】

一具現例として、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、耐熱性の高い酵素であってもよい。具体的には、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、５０℃〜７０℃で最大活性の５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％または７５％〜１００％の活性を示しうる。より具体的には、本出願の果糖−４−エピマー化酵素は、５５℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、５５℃、６０℃、または７０℃で最大活性の８０％〜１００％または８５％〜１００％の活性を示しうる。

【0022】

さらに、これに制限されるものではないが、前記配列番号１からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号２のヌクレオチド配列によって；配列番号３からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号４のヌクレオチド配列によって；配列番号５からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号６のヌクレオチド配列によって；配列番号７からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号８のヌクレオチド配列によって；配列番号９からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１０のヌクレオチド配列によって；配列番号１１からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１２のヌクレオチド配列によって；配列番号１３からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１４のヌクレオチド配列によって；配列番号１５からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１６のヌクレオチド配列によって；配列番号１７からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号１８のヌクレオチド配列によって；配列番号１９からなる果糖−４−エピマー化酵素は、配列番号２０のヌクレオチド配列によって、それぞれ暗号化されたものであってもよい。

【0023】

本出願の果糖−４−エピマー化酵素またはその変異体は、本出願の前記酵素またはその変異体を発現するＤＮＡ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０でＥ． ｃｏｌｉなどの菌株に形質転換させた後、これを培養して培養物を収得し、前記培養物を破砕して、カラムなどを介して精製して得られたものであってもよい。前記形質転換用菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの他、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどがある。

【0024】

具体例では、これらの形質転換された菌株としてＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃｋｒ＿またはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅがあり、これらはそれぞれ順にブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１９９５Ｐ（寄託日：２０１７年３月２０日）、寄託番号ＫＣＣＭ１１９９９Ｐ（寄託日：２０１７年３月２４日）、ＫＣＣＭ１２０９７Ｐ（寄託日：２０１７年８月１１日）、ＫＣＣＭ１２０９６Ｐ（寄託日：２０１７年８月１１日）、ＫＣＣＭ１２０９５Ｐ（寄託日：２０１７年８月１１日）、ＫＣＣＭ１２１０７Ｐ（寄託日：２０１７年９月１３日）とＫＣＣＭ１２１０８Ｐ（寄託日：２０１７年９月１３日）、ＫＣＣＭ１２２３３Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）、ＫＣＣＭ１２２３４Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）及びＫＣＣＭ１２２３７Ｐ（寄託日：２０１８年３月２３日）に寄託した。

【0025】

本出願で用いられる果糖−４−エピマー化酵素は、これを暗号化する核酸を用いて提供されてもよい。

【0026】

本出願において、用語、「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸で基本的な構成単位であるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体も含んでもよい（非特許文献２及び３参照）。

【0027】

前記核酸は、本出願の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のアミノ酸配列からなるポリペプチドを暗号化する核酸または本出願の果糖−４−エピマー化酵素と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有しながら果糖−４−エピマー化酵素活性を有するポリペプチドを暗号化する核酸であってもよい。具体的には、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列からなる果糖−４−エピマー化酵素を暗号化する核酸は、配列番号２の塩基配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％相同性を有する核酸であってもよい。また、例えば、前記配列番号３のアミノ酸配列からなる果糖−４−エピマー化酵素を暗号化する核酸は、配列番号４の塩基配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％相同性を有する核酸であってもよく、これは本願に記述された他のアミノ酸配列の酵素を暗号化する核酸にも適用されてもよい。また、本出願の核酸はコドン縮退性（ｃｏｄｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって本出願の果糖−４−エピマー化酵素に翻訳されうる核酸を含んでもよく、前記配列番号２、４、６、８、１０ 、１２、１４、１６、１８または２０の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と厳しい条件下で混成化し、本出願の果糖−４−エピマー化酵素活性を有するポリペプチドを暗号化する核酸も含まれることは自明である。

【0028】

本出願で用いられる果糖−４−エピマー化酵素を発現する微生物は、前記核酸を含む組換えベクターを含む微生物であってもよい。前記ベクターは、本出願の核酸が作動可能に連結された形態であってもよい。本出願において、用語、「作動可能に連結された」とは、一般的に機能を実行するように塩基発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする塩基配列が作動可能に連結されてコードする塩基配列の発現に影響を与えてもよい。ベクターとの作動可能な連結は当業界の公知の遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよい。本出願において、用語、「ベクター」は、有機体、例えば、宿主細胞に塩基のクローニング及び／または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して、結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよい。ここで、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、つまり、自らの調節によって複製可能な任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。本出願の用語、「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で有機体、例えば、宿主細胞に塩基を導入するためのウイルス及び非ウイルス媒介物を含んでもよく、ミニ球形ＤＮＡ、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）のようなトランスポゾン（非特許文献４）、または人工染色体を含んでもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。本出願で用いられてもよいベクターは、特に制限されるものではなく、公知の組換えベクターを用いてもよい。また、前記ベクターは、様々な抗生剤抵抗性遺伝子をさらに含むことを特徴とする組換えベクターであってもよい。本出願において、用語、「抗生剤抵抗性遺伝子」とは、抗生剤に対して抵抗性を有する遺伝子であって、これを有する細胞は当該抗生剤を処理した環境でも生存するため、大腸菌で大量にプラスミドを得る過程で選別マーカーとして有用に用いられる。本出願で抗生剤抵抗性遺伝子は、本出願の核心技術であるベクターの最適の組み合わせによる発現効率に大きく影響を与える要素ではないため、選別マーカーとして一般的に用いられる抗生剤抵抗性遺伝子を制限なく用いてもよい。具体的な例としては、、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、またはネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）に対する抵抗遺伝子などを用いてもよい。

【0029】

本出願で用いられてもよい果糖−４−エピマー化酵素を発現する微生物は、前記酵素を暗号化する核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入する方法を用いてもよく、前記ベクターを形質転換させる方法は核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれてもよく、当該分野で公知されたように、適切な標準技術を選択して行ってもよい。エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム共沈 （ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法及び熱ショック法などが含まれてもよいが、これに制限されない。

【0030】

形質転換された遺伝子は、宿主細胞内に発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入された形態及び染色体外に位置している形態すべてを含んでもよい。また、前記遺伝子はポリペプチドを暗号化しうるポリヌクレオチドとしてＤＮＡ及びＲＮＡを含み、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、制限なく用いられてもよい。例えば、前記遺伝子は、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な組換えベクターの形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

【0031】

本出願の微生物は、本出願の核酸または本出願の組換えベクターを含み、本出願の果糖−４−エピマー化酵素を生産しうる微生物であれば、原核微生物及び真核微生物いずれも含まれてもよい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、 Ｅ． ｃｏｌｉまたはｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであってもよいが、これに制限されない。このような微生物の例としては、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４ＥまたはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅ、またはＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅがある。

【0032】

本出願の微生物は、前記核酸またはベクター導入の他にも、様々な公知の方法により本出願の果糖−４−エピマー化酵素を発現しうる微生物をすべて含んでもよい。

【0033】

本出願の微生物の培養物は、本出願のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼを発現する微生物を培地で培養して製造したものであってもよい。

【0034】

本出願において、用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は当業界に公知の適当な培地と培養条件に応じて行われてもよい。このような培養過程は選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して用いてもよい。前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。この時、培養条件は特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ７〜９）を調節してもよい。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよく、また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気の状態を維持するために気体を注入せず、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養温度は、２５〜４０℃、具体的には、３０〜３７℃を維持してもよいが、これに制限されない。培養期間は、所望の有用物質の生産量が収得できるまで続けてもよく、具体的には、約０．５時間〜６０時間培養してもよいが、これに制限されない。また、用いられる培養用培地は炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたりまたは混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。

【0035】

本出願のタガトース生産用組成物は、さらに果糖を含んでもよい。

【0036】

本出願のタガトース生産用組成物は、果糖を直接タガトースに転換させる果糖−４−エピマー化活性を有するタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むものであって、基質である果糖以外の他の酵素を含まないことを特徴としてもよい。

【0037】

例えば、α−グルカンホスホリラーゼ（α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、デンプンホスホリラーゼ（ｓｔａｒｃｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）またはスクロースホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；
グルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；
タガトース−６−リン酸脱リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物；及び／または
α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）、スクラーゼ（ｓｕｃｒａｓｅ）またはイソアミラーゼ（ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）；前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物；または前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を含まないことを特徴としてもよい。

【0038】

本出願のタガトース生産用組成物は、当該タガトース生産用組成物に通常用いられる任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0039】

本出願のタガトース生産用組成物は、金属をさらに含んでもよい。一具現例では、本出願の金属は２価陽イオンを含む金属であってもよい。具体的には、本出願の金属はニッケル、マグネシウム（Ｍｇ）またはマンガン（Ｍｎ）であってもよい。より具体的には、本出願の金属は金属イオンまたは金属塩であってもよく、より具体的には、前記金属塩は、ＭｇＳＯ_４、ＮｉＳＯ_４、ＮｉＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２またはＭｎＳＯ_４であってもよい。

【0040】

本出願は別の様態として、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を本出願の果糖−４−エピマー化酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて前記果糖をタガトースに転換する段階を含むタガトースの製造方法を提供する。

【0041】

一具現例として、本出願の接触はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の条件で、３０℃〜８０℃の温度条件で、及び／または０．５時間〜４８時間行ってもよい。

【0042】

具体的には、本出願の接触はｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の条件またはｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の条件で行ってもよい。また、本出願の接触は３５℃〜８０℃、４０℃〜８０℃、４５℃〜８０℃、５０℃〜８０℃、５５℃〜８０℃、６０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、３５℃〜７０℃、４０℃〜７０℃、４５℃〜７０℃、５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、６０℃〜７０℃、３０℃〜６５℃、３５℃〜６５℃、４０℃〜６５℃、４５℃〜６５℃、５０℃〜６５℃、５５℃〜６５℃、３０℃〜６０℃、３５℃〜６０℃、４０℃〜６０℃、４５℃〜６０℃、５０℃〜６０℃または５５℃〜６０℃の温度条件で行ってもよい。また、本出願の接触は０．５時間〜３６時間、０．５時間〜２４時間、０．５時間〜１２時間、０．５時間〜６時間、１時間〜４８時間、１時間〜３６時間、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、１時間〜６時間、３時間〜４８時間、３時間〜３６時間、３時間〜２４時間、３時間〜１２時間、３時間〜６時間、６時間〜４８時間、６時間〜３６時間、６時間〜２４時間、６時間〜１２時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、１２時間〜２４時間、１８時間〜４８時間、１８時間〜３６時間、または１８時間〜３０時間行ってもよい。

【0043】

一具現例として、本出願の接触は金属の存在下で行ってもよい。用いられてもよい金属は、前述した様態のとおりである。

【0044】

本出願の製造方法は、製造されたタガトースを分離及び／または精製する段階をさらに含んでもよい。前記分離及び／または精製は、本出願の技術分野で通常用いられる方法を用いてもよく、非限定的な例として、透析、沈殿、吸着、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及び分別結晶などを用いてもよい。前記精製は一つの方法だけ行ってもよく、２つ以上の方法を一緒に行ってもよい。

【0045】

また、本出願の製造方法は、前記分離及び／または精製する段階の前後に脱色及び／または脱塩を行う段階をさらに含んでもよい。前記脱色及び／または脱塩を行うことにより、より品質に優れたタガトースを得ることができる。

【0046】

他の具現例として、本出願の製造方法は、本出願のタガトースに転換する段階、分離及び／または精製する段階、または脱色及び／または脱塩する段階の後にタガトースを結晶化する段階をさらに含んでもよい。前記結晶化は通常用いる結晶化方法を用いて行ってもよい。例えば、冷却結晶化方法を用いて結晶化を行ってもよい。

【0047】

別の具現例として、本出願の製造方法は、前記結晶化する段階の前にタガトースを濃縮する段階をさらに含んでもよい。前記濃縮は結晶化の効率を高めうる。

【0048】

別の具現例として、本出願の製造方法は、本出願の分離及び／または精製する段階の後、未反応の果糖を本出願の酵素、前記酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させる段階、本出願の結晶化する段階の後に結晶が分離された母液を前記分離及び／または精製段階に再利用する段階、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。前記追加段階を介してタガトースをさらに高収率で得ることができ、捨てられる果糖の量を削減することができて経済的利点がある。

【発明の効果】

【0049】

本出願の果糖−４−エピマー化酵素であるタガトース−ビスリン酸アルドラーゼは、耐熱性に優れて産業的にタガトース生産が可能であり、普遍化された糖である果糖をタガトースに転換する経済性が高い効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素（ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅ）が果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果である。

【図2】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素（ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅ）の果糖−４−エピマー化活性における温度変化による活性度を示すグラフである。

【図3】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーグラフである。

【図4a】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅの温度変化に係る果糖−４−エピマー化酵素活性を示すグラフである。

【図4b】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅの温度変化に係る果糖−４−エピマー化酵素活性を示すグラフである。

【図5a】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化活性を示すグラフである。

【図5b】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅの金属添加による果糖−４−エピマー化活性を示すグラフである。

【図6】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーグラフである。

【図7a】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅの温度変化に係る果糖−４−エピマー化活性を示すグラフである。

【図7b】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化活性を示すグラフである。

【図8a】本出願の一実施例で製造したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示したグラフである。

【図8b】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示したグラフである。

【図9a】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅの温度に係る果糖−４−エピマー化酵素活性を示したグラフである。

【図9b】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの温度に係る果糖−４−エピマー化酵素活性を示したグラフである。

【図10a】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化活性を示したグラフである。

【図10b】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの金属添加に係る果糖−４−エピマー化活性を示すグラフである。

【図11】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示したグラフである。

【図12】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示したグラフである。

【図13】本出願の一実施例で製造したＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅが果糖−４−エピマー化酵素活性を有することを示すＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0051】

以下、本出願にかかる実施例を介して本発明をより詳細に説明する。ただし、本出願の下記実施例は、本出願の一例示に過ぎない。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、添付された請求項に記載された本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかである。

【0052】

実施例１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0053】

実施例１−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を提供するために、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｏｌｅａｒｉａに由来したタガトース−ビスリン酸アルドラーゼの遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物（形質転換体）を製造した。

【0054】

具体的には、前記遺伝子３種のうちＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に登録されたＴｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｏｌｅａｒｉａの遺伝子配列を対象にタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜し、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓのアミノ酸配列（配列番号１）と塩基配列（配列番号２）、Ｋｏｓｍｏｔｏｇａ ｏｌｅａｒｉａのアミノ酸配列（配列番号５）と塩基配列（配列番号６）に基づいて大腸菌発現可能ベクターであるｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓに挿入して製作された組換え発現ベクターをバイオニアに合成依頼した。

【0055】

タンパク質の発現を誘導するために大腸菌発現用菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、それぞれＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅと命名した。ブダペスト条約下で、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅは２０１７年３月２０日に韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１９９５Ｐとして寄託され、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅは２０１７年３月２４日に寄託番号ＫＣＣＭ１１９９９Ｐとして寄託された。

【0056】

実施例１−２：組換え酵素の製造及び精製
組換え酵素を製造するために、前記実施例１−１で製造した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅをアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢ液体培地５ｍｌを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子であるラクトースが含有された液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記培養過程中の撹拌速度は１８０ｒｐｍであり、培養温度は３７℃が維持されるようした。培養液は８，０００ｒｐｍで、４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭ イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）及び３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に再懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物は１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液はＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。最終２５０ｍＭ イミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）緩衝液を流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析した後、酵素特性解析のための酵素を確保した。

【0057】

実施例１−３：果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例１−２から得られた酵素の活性を測定するために、３０重量％果糖を用い、ここに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＣｏＳＯ_４、前記実施例１−２で分離された２０ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して、温度６０℃で２時間反応した。果糖−４−エピマー化酵素３種、ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅ、及びＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅによって転換されたタガトースの濃度及び果糖からタガトースに転換された転換率を確認した結果、ＣＪ＿ＴＤ＿Ｆ４Ｅの場合、４．６％であり、ＣＪ＿ＫＯ＿Ｆ４Ｅの場合、１６．０％であった。前記換算率は次の式で計算された：転換率＝タガトース重量／初期果糖重量×１００

【0058】

また、反応後に残存する果糖と生成物であるタガトースの場合、ＨＰＬＣを用いて定量した。用いたカラムはＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０であり、カラム温度を８０℃にし、移動相である水の流速は１ｍｌ／分で流した。図１にＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて果糖を基質とする前記酵素の反応を示すピークを検出し定量した。

【0059】

実施例１−４：果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響
本出願の酵素のエピマー化活性に対する温度の影響性を調査するために、果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、前記実施例１−２で製造した１ｍｇ／ｍｌの精製酵素をそれぞれ添加して、５０℃〜８０℃で３時間反応し、反応終了液はＨＰＬＣを用いてタガトースを定量分析した。その結果、本出願の酵素２種はすべて７０℃で最大活性を示した（図２）。

【0060】

実施例２：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0061】

実施例２−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
本出願に係る新規な耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｉ ＤＳＭ ２２２１２、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＡＴＣＣ ４３８１２由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0062】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されたＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｉ ＤＳＭ ２２２１２、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ ＡＴＣＣ ４３８１２の遺伝子配列からタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜して、前記２種の微生物のアミノ酸配列（配列番号７及び９）と塩基配列（配列番号８及び１０）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換えベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅを製造した（（株）バイオニア、韓国）。

【0063】

前記それぞれの各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記形質転換菌株をそれぞれＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１７年０８月１１日付けで寄託し、それぞれＫＣＣＭ１２０９７Ｐ、ＫＣＣＭ１２０９６Ｐを与えられた。

【0064】

実施例２−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例２−１で製造した形質転換菌株 Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素を製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。前記種菌培養の結果、得られた培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度１８０ｒｐｍと３７℃の条件で行った。次に、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。前記回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、１３，０００ ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール、及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。続いて、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析し、酵素特性解析のために精製酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅをそれぞれ確保した。

【0065】

実施例２−３：果糖からタガトースへの転換及び活性の確認
前記実施例２−２で確保した本出願組換え酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を測定するために、３０重量％果糖に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＮｉＳＯ_４及び各２０ｍｇ／ｍｌ ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で１０時間反応させた。

【0066】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースの定量はＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃にして、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図３）。

【0067】

実験の結果、本出願ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅ酵素反応による果糖からタガトースへの転換率は、それぞれ５．７％及び１１．１％と確認された。

【0068】

実施例２−４：温度による組換え酵素の活性の確認
前記実施例２−２で製造した酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために、１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、各１ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅを添加して、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃及び７０℃の様々な温度で３時間反応させた。前記反応の完了後、反応物内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0069】

実験の結果、ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅは６５℃で最大活性を示し、６０℃〜７０℃で最大活性の７０％以上、すべての温度範囲で最大活性の５０％以上を維持した（図４ａ）。そして、ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅは７０℃で最大活性を示し、５５℃〜７０℃で最大活性の７０％以上、すべての温度範囲で最大活性の４０％以上を維持した（図４ｂ）。

【0070】

実施例２−５：金属イオンの添加による本発明組換え酵素の活性の確認
前記実施例２−２で製造した酵素ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性の金属イオン別の影響力を確認するために、１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、各１ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４Ｅと各１ｍＭの様々な金属イオン（ＺｎＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、ＣａＣｌ_２、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、またはＮｉＳＯ_４）を添加して、６０℃で５時間反応させた。反応完了後、反応物のタガトースをＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0071】

実験の結果、ＣＪ＿ＲＰ＿Ｆ４ＥはＮｉＳＯ_４それぞれの添加によって活性が増加することが示され、ニッケルイオンが活性を増加させることができ（図５ａ）、ＣＪ＿ＲＭ＿Ｆ４ＥはＭｎＳＯ_４及びＮｉＳＯ_４の添加によって活性が増加することが示され、マンガンまたはニッケルイオンが本出願組換え酵素の活性を増加させうることを確認した（図５ｂ）。

【0072】

実施例３：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0073】

実施例３−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換体の製造
本発明者らはＬｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｐｉｌｏｓａ ＤＳＭ ２８７８７由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能な組換えベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0074】

より具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）とＥＮＡ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ）に登録されたＬｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｐｉｌｏｓａの遺伝子配列を対象にタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜して、Ｌｉｍｎｏｃｈｏｒｄａ ｐｉｌｏｓａ由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅのアミノ酸配列（配列番号１１）及び塩基配列（配列番号１２）に基づいて、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換え発現ベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを製造した（（株）バイオニア、韓国）。

【0075】

前記組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記形質転換菌株をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１７年０８月１１日付けで寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２０９５Ｐを付与された。

【0076】

実施例３−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例３−１に従って製造した形質転換菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅ由来のＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅから本出願組換え酵素を収得するために、前記それぞれの形質転換微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。続いて、前記培養液を８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して、酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0077】

実施例３−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例３−２で確保した本出願組換え酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅの活性を測定するために、３０重量％果糖の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＮｉＳＯ_４、及び各２０ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で１０時間反応させた。

【0078】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースはＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した（図６）。

【0079】

実験の結果、本出願の各酵素によって果糖からタガトースに転換された転換率はＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを用いた場合、９．５％であることを確認した。

【0080】

実施例３−４：温度による組換え酵素活性の確認
前記実施例３−２で得られた本出願組換え酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に１ｍｇ／ｍｌ ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを添加して４５℃、５０℃、５５℃、６０℃及び７０℃の様々な温度で３時間反応させた。反応が完了した後、反応液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0081】

実験の結果、本出願のＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅ酵素は６０℃で最大活性を示し、ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅは４５℃〜７０℃で最大活性の５０％以上を維持することが確認できた（図７ａ）。

【0082】

実施例３−５：金属イオンの添加による組換え酵素活性の確認
従来公知の異性化酵素、例えば、グルコース異性化酵素及びアラビノース異性化酵素及びエピマー酵素、例えば、プシコース３−エピマー化酵素は、金属イオンを必要とすることが知られている。したがって、前記実施例３−２で得られた本出願の組換え酵素ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅの場合も金属イオンが果糖−４−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。

【0083】

より具体的には、１０重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に、２ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅを添加し、様々な金属イオンＮｉＳＯ_４、ＣａＣｌ_２、ＺｎＳＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＭｎＳＯ_４、ＦｅＳＯ_４、ＣｕＳＯ_４、または（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を各１ｍＭずつ添加して酵素活性を測定した。金属イオンを処理しない場合を対照群として設定した。前記反応が完了した後、反応液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0084】

実験の結果、本出願ＣＪ＿ＬＰ＿Ｆ４Ｅ酵素は、各ＭｎＳＯ_４、ＮｉＳＯ_４の添加によって活性が増加することが示され、マンガンイオンやニッケルイオンなどの金属イオンの要求性があることが分かった。特に、ＮｉＳＯ_４を添加した場合、最大活性を示すことが確認された（図７ｂ）。

【0085】

実施例４：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0086】

実施例４−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えベクター及び組換え微生物の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ ＤＳＭ １３４９７及びＣａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １８９０２由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0087】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されたＣａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ ＤＳＭ １３４９７及びＣａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ １８９０２の遺伝子配列からタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜し、前記微生物それぞれのアミノ酸配列（配列番号１３及び１５）と塩基配列（配列番号１４及び１６）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換えベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ −ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0088】

前記各組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をそれぞれＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４ＥとＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１７年９月１３日付で寄託して、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２１０７Ｐ及びＫＣＣＭ１２１０８Ｐを与えられた。

【0089】

実施例４−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例４−１で製造した各遺伝子組換え微生物Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅを製造するために、それぞれの組換え微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液は８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0090】

実施例４−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例４−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を測定するために、１０重量％果糖の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び各５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で２４時間反応させた。

【0091】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースの定量はＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析はＳｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃にして、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した。

【0092】

その結果、遺伝子組換え酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅによる果糖からタガトースへの転換率は、それぞれ３．８％と４．０％であることを確認した（図８ａ及び図８ｂ）。

【0093】

実施例４−４：温度による組換え酵素活性の確認
前記実施例４−２で得られた組換え酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために、５重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に各５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅを添加し、各３７℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃及び７０℃で５時間反応させた。反応完了液内のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。その結果、ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅは５５℃で、ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅは６０℃で最大活性を示し、両方の酵素すべて５０℃〜７０℃で最大活性の７５％以上の活性を示すことを確認した（表１、図９ａ及び９ｂ） 。

【0094】

【表1】

【0095】

実施例４−５：金属添加による本出願組換え酵素活性の確認
前記実施例４−２で得られた組換え酵素ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの金属が果糖−４−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。

【0096】

具体的には、５重量％果糖を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液に各５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅ及びＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅと１ｍＭの金属イオン（ＭｇＳＯ_４またはＭｎＳＯ_４）を添加して６０℃で５時間反応させた。金属イオンを処理しない場合を対照群（ｗ／ｏ）と設定した。前記反応が完了した後、反応完了液のタガトースはＨＰＬＣを用いて定量分析した。

【0097】

その結果、ＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４ＥはＭｎＳＯ_４の添加によって約２倍、ＭｇＳＯ_４の添加によって１０倍以上の活性が増加し、マンガンやマグネシウムイオン（または、その塩）がＣＪ＿Ｃａｂ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を増加させうることを確認した（図１０ａ）。また、ＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅは ＭｇＳＯ_４添加時対照群と同様の活性を示したが、ＭｎＳＯ_４の添加によって活性が約２倍に増加して、マンガンイオン（または、その塩）がＣＪ＿Ｃｋｒ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を増加させうることを確認した（図１０ｂ）。

【0098】

実施例５：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0099】

実施例５−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えベクター及び組換え微生物の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するためにＣａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0100】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されたＣａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ遺伝子配列からタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜して、前記微生物それぞれのアミノ酸配列（配列番号１７）と塩基配列（配列番号１８）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換えベクターｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅをクローニングした。

【0101】

組換え発現ベクターを用いるために、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ ａｅｒｏｐｈｉｌａのＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを用いて、プライマー１：
ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＧＡとプライマー２：
ＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＡを用い、ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間変性後、９４℃３０秒の変性、６５℃ ３０秒のアニーリング、７２℃で２分の伸長を３５回繰り返した後、７２℃で５分間伸長反応を行った。

【0102】

前記組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１８年３月２３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２２３３Ｐを与えられた。

【0103】

実施例５−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例５−１で製造した各遺伝子組換え微生物Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液は８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール、及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素の特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0104】

実施例５−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例５−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を測定するために、１０重量％果糖の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び各２０ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で２４時間反応させた。

【0105】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースの定量はＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃とし、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した。

【0106】

その結果、遺伝子組換え酵素ＣＪ＿ＣＡＥ＿Ｆ４Ｅによる果糖からタガトースへの転換率は１．８％であることを確認した（図１１）。

【0107】

実施例６：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0108】

実施例６−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えベクター及び組換え微生物の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を取得して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0109】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されたＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓの遺伝子配列からタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子配列を選抜して、前記微生物アミノ酸配列（配列番号１９）と塩基配列（配列番号２０）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換えベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0110】

前記組換えベクターは、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をそれぞれＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１８年３月２３日付で寄託し寄託番号ＫＣＣＭ１２２３４Ｐを付与された。

【0111】

実施例６−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例６−１で製造した組換え微生物Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液は８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれている５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0112】

実施例６−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例６−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を測定するために、３０重量％果糖の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び各５ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅを添加して、６０℃で２４時間反応させた。

【0113】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースの定量はＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃として、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した。

【0114】

その結果、遺伝子組換え酵素ＣＪ＿ＴＡＴＨ＿Ｆ４Ｅによる果糖からタガトースへの転換率は２．９％であることを確認した（図１２）。

【0115】

実施例７：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼの製造及びその活性の評価

【0116】

実施例７−１：タガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えベクター及び組換え微生物の製造
新規耐熱性の果糖−４−エピマー化酵素を発掘するために、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のタガトース−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物を製造した。

【0117】

具体的には、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）及びＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に登録されたＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍの遺伝子配列からタガトース−ビスリン酸アルドラーゼの遺伝子配列を選抜して、前記微生物アミノ酸配列（配列番号３）と塩基配列（配列番号４）の情報を基に、前記酵素の塩基配列を含む大腸菌発現可能な組換えベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを合成した（（株）バイオニア、韓国）。

【0118】

前記組換えベクターは熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、２００１）によって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、組換え微生物を製造した後、５０％グリセロールに冷凍保管して使用した。前記組換え微生物をＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅと命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０１８年３月２３日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２２３７Ｐを付与された。

【0119】

実施例７−２：組換え酵素の製造及び精製
前記実施例７−１で製造した組換え微生物Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅから組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを製造するために、遺伝子組換え微生物をアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）抗生剤が含まれたＬＢ液体培地５ｍＬを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をＬＢとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度１８０ｒｐｍ及び３７℃の条件で行った。その後、前記培養液は８，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、１０ｍＭイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と３００ｍＭ ＮａＣｌが含まれた５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて破砕し、細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をＨｉｓ−ｔａｑ親和クロマトグラフィーを用いて精製し、２０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を充填剤の１０倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、２５０ｍＭイミダゾール及び３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ８．０）緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で透析して酵素の特性解析のための精製酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを確保した。

【0120】

実施例７−３：組換え酵素の果糖からタガトースへの転換活性の評価
前記実施例７−２で確保した組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅの果糖−４−エピマー化活性を測定するために、１重量％果糖の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｎＳＯ_４と各１０ｍｇ／ｍｌのＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅを添加して５５℃で２４時間反応させた。

【0121】

反応後に残存する果糖及び生成物であるタガトースの定量はＨＰＬＣを用いて分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｓｈｏｄｅｘ Ｓｕｇａｒ ＳＰ０８１０カラムを用い、カラム温度は８０℃にして、移動相である水の流速は１ｍＬ／ｍｉｎで流した。

【0122】

その結果、遺伝子組換え酵素ＣＪ＿ＡＢ＿Ｆ４Ｅによる果糖からタガトースへの転換率は、８％であることを確認した（図１３）。

【0123】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【0124】

【表2】

【0125】

【表3】

【0126】

【表4】

【0127】

【表5】

【0128】

【表6】

【0129】

【表7】

【0130】

【表8】

【0131】

【表9】

【0132】

【表10】

【0133】

【表11】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10a】

【図10b】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]