特許 6929791 エピゲノム編集のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6929791

(24)【登録日】2021年8月13日

(45)【発行日】2021年9月1日

(54)【発明の名称】エピゲノム編集のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20210823BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210823BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210823BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K14/195

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N15/09 100

【請求項の数】11

【全頁数】74

(21)【出願番号】特願2017-560481(P2017-560481)

(86)(22)【出願日】2016年2月9日

(65)【公表番号】特表2018-505219(P2018-505219A)

(43)【公表日】2018年2月22日

(86)【国際出願番号】US2016017221

(87)【国際公開番号】WO2016130600

(87)【国際公開日】20160818

【審査請求日】2019年2月12日

(31)【優先権主張番号】62/113,569

(32)【優先日】2015年2月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100137626

【弁理士】

【氏名又は名称】田代 玄

(72)【発明者】

【氏名】ゲルスバッハ チャールズ エイ

(72)【発明者】

【氏名】ヒルトン アイザック

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１９７７４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１５２４３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nat. Biotechnol.，２０１５年 ４月 ６日，vol.33，p.510-519

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第１のポリペプチドドメインは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、第２のポリペプチドドメインは、ｐ３００ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインを含み、かつ前記融合タンパク質は、配列番号１４０または１４９のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。

【請求項2】

２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、
第１のポリペプチドドメインは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、
第２のポリペプチドドメインは、ｐ３００ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインを含み、
ここで、前記第１のポリペプチドドメインは配列番号１０のポリペプチド配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドドメインは配列番号２のポリペプチド配列を含む、または、前記第１のポリペプチドドメインは配列番号１０のポリペプチド配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドドメインは配列番号３のポリペプチド配列を含む、または、前記第１のポリペプチドドメインは配列番号１のポリペプチド配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドドメインは配列番号２のポリペプチド配列を含む、融合タンパク質。

【請求項3】

前記第１のポリペプチドドメインを前記第２のポリペプチドドメインと連結させるリンカーをさらに含む、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

標的遺伝子の転写を活性化する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、ＤＮＡターゲティング系。

【請求項8】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、標的領域を標的にし、前記標的領域が、標的遺伝子のエンハンサー領域、標的遺伝子のプロモーター領域、標的遺伝子の調節エレメント、標的遺伝子のシス調節領域、または標的遺伝子のトランス調節領域を含む、請求項７に記載のＤＮＡターゲティング系。

【請求項9】

前記標的領域が、標的遺伝子の遠位または近位のシス調節領域である、請求項８に記載のＤＮＡターゲティング系。

【請求項10】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項７〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系をコードするポリヌクレオチドを含む、細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化するための組成物。

【請求項11】

２つ以上の標的遺伝子の発現が、活性化される、請求項１０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，５６９号明細書に対する優先権を主張する。

【0002】

政府の権利の陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって拠出された連邦政府助成金第１Ｒ０１ＤＡ０３６８６５号に基づいて、政府支援の下で行われた。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。

【0003】

技術分野
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系および前記の系を使用する方法を対象とする。

【背景技術】

【0004】

ヒトゲノム計画は、資金提供が行われ、ヒトゲノムの配列決定が、循環器疾患、神経変性状態、および糖尿病などの代謝疾患を含めた、強い遺伝性要素を有する複雑な疾患の遺伝的根拠を明らかにするであろうという前提に基づいて推進された。この情報が、これらの広範な疾患に対する新規の薬物標的をもたらすであろうと信じられていた。しかし、何千ものゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）が、これらの複雑な疾患と関係がある遺伝的変異が、遺伝子内に発生するのではなく特定の遺伝子のレベルを制御する遺伝子間調節領域において発生することを示している。同様に、メンデル遺伝病（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のおよそ２０％は、検出可能なコード化変異を有さず、原因となる変異が遺伝子調節エレメント内にあることを示唆している。重要なことには、これらの調節エレメントに、機能的役割を割り当てることは非常に難しい。何故なら、これらの調節エレメントは、しばしば、その標的遺伝子から離れた位置に位置するからである。さらに、多くの遺伝子および調節エレメントは、ＧＷＡＳ研究ごとに、それぞれの陽性のヒットに分類される。実際には、ヒトゲノム計画に対するフォローアッププロジェクト、例えばＮＩＨ出資のＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ＥＮＣＯＤＥ）およびＲｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔなどが、多くのヒト細胞型および組織について、ヒトゲノム全域の何百万もの推定上の調節エレメントを同定している。

【0005】

ゲノム機能解析の最初の難関は、個々の遺伝子座でのゲノム機能を直接的かつ正確に操作する技術を発展させることである。ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｊｅｃｔなどのプロジェクトは、多くのヒト細胞型および組織について、ヒトゲノム全域の何百万ものエピジェネティックマークを同定している。しかし、これらのマークの機能を研究することは、もっぱら遺伝子発現との統計的関連性に限られている。これらのエピジェネティック特性の直接操作のための技術は、こうした関連性に基づく発見を遺伝子調節の機構的原理に変換するために必須である。こうした進歩は、ゲノムの標的領域のエピジェネティックコードを改変する遺伝子治療、系譜特定のエピジェネティックリプログラミングに基づく再生医療および疾患モデリングのための戦略、およびエピゲノム特異的な薬物スクリーニングプラットフォームの設計をもたらす可能性があるので、人間の健康に利益を与える可能性を有する。

【0006】

エピゲノムの操作は、細胞を、ヒストン脱アセチル酵素またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤などの小分子薬物で処理すること、または細胞を特定の系譜に分化させることによって可能である。しかし、小分子に基づく方法は、エピゲノムおよびトランスクリプトームを全体的に変化させ、個々の遺伝子座を標的にするのには適していない。エピゲノム修飾酵素と、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などのプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質との融合を含めたエピゲノム編集技術は、標的にされるＤＮＡメチル化、ＤＮＡヒドロキシメチル化、およびヒストン脱メチル化、メチル化、および脱アセチル化を達成するのに有効である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）のオリゴマーなどの活性化ドメインと融合されると、ｄＣａｓ９は、合成の転写調節因子として機能することができる。しかし、複数の活性化ドメインの必要性、または活性化ドメイン間の相乗効果によって高レベルの遺伝子導入を実現するためのｇＲＮＡの組み合わせの必要性を含めて、ｄＣａｓ９活性化因子の使用における制限は残ったままである。ＶＰ１６のテトラマーＶＰ６４などの、これらの遺伝子改変された転写因子において使用される、従来の活性化因子ドメインは、転写開始前複合体の複数の成分を動員するための骨格として機能し、クロマチン状態を特異的に調節する直接的な酵素機能は有しない。エピジェネティックリモデリングのこの間接的方法は、特定のエピジェネティックマークの役割を試験することを可能にせず、また、エピジェネティック状態の直接プログラミングほど強力ではない可能性がある。エピジェネティック特性の直接操作を目標にする能力の必要性が、依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であって、第１のポリペプチドドメインが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、ヒストンアセチル化酵素活性を有するペプチドを含む、融合タンパク質を対象とする。

【0009】

本発明は、先に記載した融合タンパク質と、少なくとも１種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、ＤＮＡターゲティング系を対象とする。

【0010】

本発明は、細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する方法であって、この細胞を、ＤＮＡターゲティング系（ここでは、ＤＮＡターゲティング系は、先に記載したの融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む）をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む方法を対象とする。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A-1C】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、近位プロモーター領域からの内在性遺伝子の転写を活性化することを示す。図１Ａは、ｄＣａｓ９融合タンパク質ｄＣａｓ９^VP64、ｄＣａｓ９^{FL p300}、およびｄＣａｓ９^{p300 Core}の模式図を示す。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ不活性化変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含有する。ｐ３００ ＨＡＴドメイン内のＤ１３９９触媒残基を示す。図１Ｂは、同時導入細胞におけるｄＣａｓ９融合タンパク質およびＧＡＰＤＨの発現レベルを示すウエスタンブロットを示す（図７Ｃに完全なブロットを示す）。図１Ｃは、各プロモーター領域を標的にする４種のｇＲＮＡを同時導入した指示されたｄＣａｓ９融合タンパク質による、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ、およびＯＣＴ４の相対的ｍＲＮＡ発現を示す（テューキー検定、＊Ｐ値＜０．０５、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。バーの上の数字は、平均発現量を示す。ＦＬＡＧ、エピトープタグ；ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素エピトープタグ；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図2A-2C】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、遠位エンハンサー領域からの内在性遺伝子の転写を活性化することを示す。図２Ａは、近位または遠位調節領域を標的にするｇＲＮＡのプールとｄＣａｓ９^VP64またはｄＣａｓ９^{p300 Core}とを同時導入した細胞における相対的ＭＹＯＤ ｍＲＮＡ産生；図１Ｃからのプロモーターデータを示す（テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入細胞と比較して）、テューキー検定 †Ｐ値 ＜０．０５（ｄＣａｓ９^{p300 Core}とｄＣａｓ９^VP64との間）、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ヒトＭＹＯＤ遺伝子座を、赤色の対応するｇＲＮＡ位置を伴って模式的に描写する。ＣＥ、ＭｙｏＤコアエンハンサー；ＤＲＲ、ＭｙｏＤ遠位調節領域。図２Ｂは、近位および遠位調節領域を標的にするｇＲＮＡのプールとｄＣａｓ９^VP64またはｄＣａｓ９^{p300 Core}とを同時導入した細胞における相対的ＯＣＴ４ ｍＲＮＡ産生；図１Ｃからのプロモーターデータを示す（テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入細胞と比較して）、テューキー検定 †Ｐ値 ＜０．０５（ｄＣａｓ９^{p300 Core}とｄＣａｓ９^VP64との間）、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ヒトＯＣＴ４遺伝子座を、赤色の対応するｇＲＮＡ位置を伴って模式的に描写する。ＤＥ、Ｏｃｔ４遠位エンハンサー；ＰＥ、Ｏｃｔ４近位エンハンサー。図２Ｃは、ヒトβ−グロビン遺伝子座が、適切な位置の高感受性領域２（ＨＳ２）エンハンサー領域および下流遺伝子（ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、およびＨＢＢ）を伴って模式的に描写されることを示す。対応するＨＳ２ ｇＲＮＡ位置は、赤で示す。ＨＳ２エンハンサーを標的にする４種のｇＲＮＡと、指示されたｄＣａｓ９タンパク質とを同時導入した細胞における遠位遺伝子からの相対的ｍＲＮＡ産生。バックグラウンド発現を示す対数的ｙ軸および赤破線に留意すること（各β−グロビン遺伝子についての条件間のテューキー検定、†Ｐ値 ＜０．０５、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ｎ．ｓ．、有意差なし。

【図3A-3B】ｄＣａｓ９^{p300 Core}に標的にされる転写活性化が、特異的かつ頑強であることを示す。図３Ａ〜３Ｃは、ｄＣａｓ９^VP64（図３Ａ）、ｄＣａｓ９^{p300 Core}（図３Ｂ）、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}（図３Ｃ）と４種のＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを一過的に同時導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、ｄＣａｓ９と４種のＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを一過的に同時導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した、ゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑデータのＤＥｓｅｑ２解析からもたらされたＭＡプロットを示す。図３Ａ〜３Ｃのそれぞれにおいて、ＩＬ１ＲＮアイソフォームに対応するｍＲＮＡを、青で示し、丸で囲む。図３Ｂおよび３Ｃにおける赤で標識された点は、多重仮説検定後に有意に濃縮されたオフターゲット転写物に相当する（ＫＤＲ、（ＦＤＲ＝１．４×１０^-3）；ＦＡＭ４９Ａ、（ＦＤＲ＝０．０４）；図３Ｂにおいてｐ３００、（ＦＤＲ＝１．７×１０^-4））。

【図3C】ｄＣａｓ９^{p300 Core}に標的にされる転写活性化が、特異的かつ頑強であることを示す。図３Ａ〜３Ｃは、ｄＣａｓ９^VP64（図３Ａ）、ｄＣａｓ９^{p300 Core}（図３Ｂ）、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}（図３Ｃ）と４種のＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを一過的に同時導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの、ｄＣａｓ９と４種のＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを一過的に同時導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較した、ゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑデータのＤＥｓｅｑ２解析からもたらされたＭＡプロットを示す。図３Ａ〜３Ｃのそれぞれにおいて、ＩＬ１ＲＮアイソフォームに対応するｍＲＮＡを、青で示し、丸で囲む。図３Ｂおよび３Ｃにおける赤で標識された点は、多重仮説検定後に有意に濃縮されたオフターゲット転写物に相当する（ＫＤＲ、（ＦＤＲ＝１．４×１０^-3）；ＦＡＭ４９Ａ、（ＦＤＲ＝０．０４）；図３Ｂにおいてｐ３００、（ＦＤＲ＝１．７×１０^-4）；および図３Ｃにおいてｐ３００、（ＦＤＲ＝４．４×１０^-10））。

【図4A】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、標的にされるエンハンサーおよび対応する下流遺伝子で、クロマチンをアセチル化することを示す。図４Ａは、染色体１１上のヒトβ−グロビン遺伝子座（５，３０４，０００〜５，２６８，０００；ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）を包含する領域を示す。ＨＳ２ ｇＲＮＡ標的位置は、赤で示し、ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアンプリコン領域は、対応する緑色の数字と共に黒で描写する。比較のために、Ｋ５６２細胞におけるＥＮＣＯＤＥ／Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮シグナルを示す。ＨＳ２エンハンサー、ＨＢＥ、およびＨＢＧ１／２プロモーター領域についての拡大挿入図を、下に示す。

【図4B-4C】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、標的にされるエンハンサーおよび対応する下流遺伝子で、クロマチンをアセチル化することを示す。図４Ｂ〜４Ｄは、ＨＳ２エンハンサーを標的にする４種のｇＲＮＡと、指示されたｄＣａｓ９融合タンパク質とを同時導入した細胞における、ＨＳ２エンハンサー、ＨＢＥプロモーター、およびＨＢＧ１／２プロモーターでのＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ濃縮（ｄＣａｓ９に対して；赤色点線）を示す。ＨＢＧ ＣｈＩＰアンプリコン１および２は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーターの冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）配列を増幅させる（‡によって表される）。各ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ領域についての条件間のテューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図4D】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、標的にされるエンハンサーおよび対応する下流遺伝子で、クロマチンをアセチル化することを示す。図４Ｂ〜４Ｄは、ＨＳ２エンハンサーを標的にする４種のｇＲＮＡと、指示されたｄＣａｓ９融合タンパク質とを同時導入した細胞における、ＨＳ２エンハンサー、ＨＢＥプロモーター、およびＨＢＧ１／２プロモーターでのＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ濃縮（ｄＣａｓ９に対して；赤色点線）を示す。ＨＢＧ ＣｈＩＰアンプリコン１および２は、ＨＢＧ１およびＨＢＧ２プロモーターの冗長（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）配列を増幅させる（‡によって表される）。各ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ領域についての条件間のテューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図5A-5B】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、単一のｇＲＮＡと共に、調節領域からの内在性遺伝子の転写を活性化することを示す。ｄＣａｓ９^{p300 Core}またはｄＣａｓ９^VP64と、それぞれのプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを同時導入した細胞から産生された、相対的ＩＬ１ＲＮ（図５Ａ）、ＭＹＯＤ（図５Ｂ）、またはＯＣＴ４（図 ５Ｃ）ｍＲＮＡ（ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ＨＳ２、β−グロビン遺伝子座対照領域高感受性領域２；ｎ．ｓ．、有意差なし（テューキー検定使用）。

【図5C-5D】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、単一のｇＲＮＡと共に、調節領域からの内在性遺伝子の転写を活性化することを示す。ｄＣａｓ９^{p300 Core}またはｄＣａｓ９^VP64と、それぞれのプロモーターを標的にするｇＲＮＡとを同時導入した細胞から産生された、相対的ＩＬ１ＲＮ（図５Ａ）、ＭＹＯＤ（図５Ｂ）、またはＯＣＴ４（図 ５Ｃ）ｍＲＮＡ（ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と、指示されたＭＹＯＤまたはＯＣＴ４エンハンサーを標的にする指示されたｇＲＮＡとを同時導入した細胞から産生された、相対的ＭＹＯＤ（図５Ｄ）またはＯＣＴ４（図５Ｅ）ｍＲＮＡ（ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ＨＳ２、β−グロビン遺伝子座対照領域高感受性領域２；ｎ．ｓ．、有意差なし（テューキー検定使用）。

【図5E-5G】ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質が、単一のｇＲＮＡと共に、調節領域からの内在性遺伝子の転写を活性化することを示す。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と、指示されたＭＹＯＤまたはＯＣＴ４エンハンサーを標的にする指示されたｇＲＮＡとを同時導入した細胞から産生された、相対的ＭＹＯＤ（図５Ｄ）またはＯＣＴ４（図５Ｅ）ｍＲＮＡ（ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ＤＲＲ、ＭＹＯＤ遠位調節領域；ＣＥ、ＭＹＯＤコアエンハンサー；ＰＥ、ＯＣＴ４近位エンハンサー；ＤＥ、ＯＣＴ４遠位エンハンサー。（ｍｏｃｋ導入細胞と比較した、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と単一のＯＣＴ４ ＤＥ ｇＲＮＡとの間のテューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５、すべてと比較した、ｄＣａｓ９^{p300 Core}とＯＣＴ４ ＤＥ ｇＲＮＡとの間のテューキー検定、†Ｐ値 ＜０．０５）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と、ＨＳ２エンハンサーを標的にする指示されたｇＲＮＡとを同時導入した細胞における、相対的ＨＢＥ（図５Ｆ）またはＨＢＧ（図５Ｇ）ｍＲＮＡ産生（ｍｏｃｋ導入細胞と比較した、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と単一のＨＳ２ ｇＲＮＡとの間のテューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５、すべてと比較した、ｄＣａｓ９^{p300 Core}とＨＳ２単一ｇＲＮＡとの間のテューキー検定、†Ｐ＜０．０５、ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。ＨＳ２、β−グロビン遺伝子座対照領域高感受性領域２；ｎ．ｓ．、有意差なし（テューキー検定使用）。

【図6A-6C】多様なプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質によって、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ゲノム上の遺伝子座を標的にすることができることを示す。図６Ａは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）ｄＣａｓ９融合タンパク質Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64およびＮｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}の模式図を示す。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｄＣａｓ９は、ヌクレアーゼ不活性化変異Ｄ１６Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、およびＮ６１１Ａを含有する。図６Ｂ〜６Ｃは、ＨＢＥまたはＨＢＧプロモーターを標的にする指示された５種の個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｅ）Ｎｍ ｇＲＮＡと、Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64またはＮｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}とを同時導入した細胞における、相対的ＨＢＥ（図６Ｂ）またはＨＢＧ（図６Ｃ）ｍＲＮＡを示す。テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入対照と比較して）、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素タグ；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図6D-6E】多様なプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質によって、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ゲノム上の遺伝子座を標的にすることができることを示す。図６Ｄ〜６Ｅ ＨＳ２エンハンサーを標的にする指示された５種の個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｅ）Ｎｍ ｇＲＮＡと、Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64またはＮｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}とを同時導入した細胞における、相対的ＨＢＥ（図６Ｄ）またはＨＢＧ（図６Ｅ）ｍＲＮＡ。テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入対照と比較して）、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素タグ；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図6F】多様なプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質によって、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ゲノム上の遺伝子座を標的にすることができることを示す。図６Ｆは、ＩＬ１ＲＮに標的にされる反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（反復ドメイン）を含有するドメインを有するＴＡＬＥの模式図を示す。テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入対照と比較して）、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素タグ；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図6G】多様なプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質によって、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ゲノム上の遺伝子座を標的にすることができることを示す。図６Ｇは、個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｄ）ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^VP64またはＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^{p300 Core}をコードするプラスミドを導入した細胞における、相対的ＩＬ１ＲＮ ｍＲＮＡを示す。テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入対照と比較して）、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素タグ；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図6H-6I】多様なプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質によって、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ゲノム上の遺伝子座を標的にすることができることを示す。図６Ｈは、ＩＣＡＭ１プロモーターを標的にするジンクフィンガーヘリックス１〜６（Ｆ１〜Ｆ６）を有するＺＦ融合タンパク質の模式図を示す。図６Ｉは、ＩＣＡＭ１ ＺＦ^VP64またはＩＣＡＭ１ ＺＦ^{p300 Core}を導入した細胞における、相対的ＩＣＡＭ１ ｍＲＮＡを示す。テューキー検定、＊Ｐ値 ＜０．０５（ｍｏｃｋ導入対照と比較して）、ｎ＝３（それぞれ独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．ＮＬＳ、核局在化シグナル；ＨＡ、赤血球凝集素タグ；Ｂｄ、ブロモドメイン；ＣＨ、システイン−ヒスチジン−リッチ領域；ＨＡＴ、ヒストンアセチル化酵素ドメイン。

【図7A-7B】ｄＣａｓ９^{p300 Core}変異体融合タンパク質活性を示す。図７Ａは、ＷＴ ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質およびｐ３００ Ｃｏｒｅ変異体誘導体の模式図描写を示す。変異したアミノ酸の相対的位置は、ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクタードメイン内の黄色のバーとして示す。図７Ｂは、ｄＣａｓ９^{p300 Core}バリアントが、４種のＩＬ１ＲＮプロモーターｇＲＮＡと共に一過的に同時導入され、ＩＬ１ＲＮ遺伝子座からのｍＲＮＡ産生を介して、活性亢進（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）¹（アミノ酸１６４５／１６４６ ＲＲ／ＥＥおよびＣ１２０４Ｒ変異）または活性低下（ｈｙｐｏａｃｔｉｖｉｔｙ）（‡によって表される）についてスクリーニングされたことを示す（上パネル、ｎ＝２（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。実験は、一方のウェルをＲＮＡ単離のために使用し、他方のウェルをウエスタンブロッティングのために使用して２重に実施し、発現を確認した（下パネル）。ニトロセルロース膜を切断し、α−ＦＬＡＧ一次抗体（上、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ｆ７４２５）またはα−ＧＡＰＤＨ（下、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．＃ １４Ｃ１０）、次いでα−ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ａ６１５４）と共にインキュベートした。

【図7C】ｄＣａｓ９^{p300 Core}変異体融合タンパク質活性を示す。図７Ｃは、本文（図１Ｂ）に示されたウエスタンブロットの膜全体を示す。ニトロセルロース膜を切断し、α−ＦＬＡＧ一次抗体（上、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ｆ７４２５）またはα−ＧＡＰＤＨ（下、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．＃ １４Ｃ１０）、次いでα−ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ａ６１５４）と共にインキュベートした。膜を、切り取られたピースの慎重な再配列後、指示された期間、現像した。

【図8】標的遺伝子活性化が、合成のｄＣａｓ９融合タンパク質の過剰発現によって影響を受けないことを示す。

【図9A】個々のおよびプールされたｇＲＮＡを伴う、ＨＳ２エンハンサーからの、Ｓｐ．ｄＣａｓ９遺伝子導入とＮｍ．ｄＣａｓ９遺伝子導入との比較を示す。図９Ａは、ＨＳ２エンハンサーでの化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９（Ｓｐ．ｄＣａｓ９）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｄＣａｓ９（Ｎｍ．ｄＣａｓ９）ｇＲＮＡ位置を含む、ヒトβ−グロビン遺伝子座の模式的表示を示す。９種のＥＮＣＯＤＥ細胞株（ＧＭ１２８７８、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＨｅｐＧ２、ＨＳＭＭ、ＨＵＶＥＣ、Ｋ５６２、ＮＨＥＫ、およびＮＨＬＦ）からの、８の垂直表示範囲に格付けした転写の重ね合わせプロフィールを、Ｋ５６２、Ａ５４９（ＥｔＯＨ．０２）、ＨｅＬＡ−Ｓ３、およびＳＫＮ＿ＳＨ＿ＲＡ細胞株におけるＥＮＣＯＤＥ ｐ３００結合ピークに加えて示す。ＥＮＣＯＤＥ ＨＥＫ２９３Ｔ ＤＮａｓｅ高感受性領域（ＨＥＫ２９３Ｔ ＤＨＳ）を、ＨＳ２エンハンサー挿入図内に示す。

【図9B-9E】個々のおよびプールされたｇＲＮＡを伴う、ＨＳ２エンハンサーからの、Ｓｐ．ｄＣａｓ９遺伝子導入とＮｍ．ｄＣａｓ９遺伝子導入との比較を示す。図９Ｂ〜９Ｅは、それぞれＳｐ．ｄＣａｓ９^{p300 Core}またはＮｍ．ｄＣａｓ９^{p300 Core}との同時導入に応答した、単一のおよびプールされたＳｐ．ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ（Ａ〜Ｄ）または単一のおよびプールされたＮｍ．ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡ（Ａ〜Ｅ）からの、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、およびＨＢＤ転写物の相対的転写誘導を示す。ｇＲＮＡを、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９におけるその位置に対応する各ｄＣａｓ９オルソログについてタイル状配置する。灰色の破線は、一過的に同時導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるバックグラウンド発現レベルを示す。図９Ｂ〜９Ｅの間の共通の対数スケールに留意すること。図９Ｂ〜９Ｅにおけるバーの上の数字は、平均発現量を示す（ｎ＝少なくとも３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図10】ｄＣａｓ９^VP64およびｄＣａｓ９^{p300 Core}が、ＩＬ１ＲＮ ｇＲＮＡに標的にされるクロマチンで、Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮を誘発することを示す。

【図11A-11C】ＴＡＬＥとｄＣａｓ９プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質間の、ＶＰ６４およびｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクタードメインの直接比較を示す。図１１Ａは、ＩＬ１ＲＮ転写開始点を包含するＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９領域が、ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ結合部位およびｄＣａｓ９ ＩＬ１ＲＮ ｇＲＮＡ標的部位と共に模式的に示されることを示す。図１１Ｂは、個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｄ）ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^VP64融合タンパク質を導入した場合の、または、ｄＣａｓ９^VP64と、個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｄ）ＩＬ１ＲＮを標的にするｇＲＮＡとを同時導入した場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＬ１ＲＮ活性化の直接比較を示す。図１１Ｃは個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｄ）ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^{p300 Core}融合タンパク質を導入した場合の、または、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と、個々のまたはプールされた（Ａ〜Ｄ）ＩＬ１ＲＮを標的にするｇＲＮＡとを同時導入した場合の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＩＬ１ＲＮ活性化の直接比較を示す。図１１Ｂおよび図１１Ｃ間の共通の対数スケールに留意すること。図１１Ｂおよび図１１Ｃにおけるバーの上の数字は、平均値を示す。テューキー検定、＊Ｐ値＜０．０５、ｎ＝少なくとも３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ。

【図12A-12B】ＴＡＬＥおよびＺＦ融合タンパク質発現を示す。図１２Ａは、個々のまたはプールされたＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥタンパク質を一過的に導入した細胞に対してウエスタンブロッティングが実施されたことを示す。ニトロセルロース膜を切断し、α−ＨＡ一次抗体（ＴＢＳＴ＋５％ミルクでの１：１０００希釈、上、Ｃｏｖａｎｃｅ ｃａｔ．＃ ＭＭＳ−１０１Ｐ）またはα−ＧＡＰＤＨ（下、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．＃ １４Ｃ１０）、次いで、それぞれα−マウスＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２００５）またはα−ウサギＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ａ６１５４）二次抗体で探索した。図１２Ｂは、ＩＣＡＭ１ ＺＦ−エフェクタータンパク質を一過的に導入した細胞に対してウエスタンブロッティングが実施され、ニトロセルロース膜を切断し、α−ＦＬＡＧ一次抗体（上、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ｆ７４２５）またはα−ＧＡＰＤＨ（下、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．＃ １４Ｃ１０）、次いでα−ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃ Ａ６１５４）で探索したことを示す。赤いアスタリスクは、非特異的なバンドを示す。

【図13A-13B】ｄＣａｓ９^{p300 Core}とｄＣａｓ９^VP64が、トランス活性化における相乗作用を呈さないことを示す。図１３Ａは、ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、ＰＬ−ＳＩＮ−ＥＦ１α−ＥＧＦＰ３（ＧＦＰ）、ｄＣａｓ９、またはｄＣａｓ９^VP64に対して１：１の質量比で、指示された通りの４種のＩＬ１ＲＮプロモーターｇＲＮＡと同時導入されたことを示す（ｎ＝２（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。図１３Ｂは、ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、ＧＦＰ、ｄＣａｓ９、またはｄＣａｓ９^VP64に対して１：１の質量比で、指示された通りの４種のＭＹＯＤプロモーターｇＲＮＡと同時導入されたことを示す（ｎ＝２（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。テューキー検定を使用すると、有意差は認められなかった（有意差なし）。

【図14A-14B】ｄＣａｓ９^{p300 Core}標的遺伝子座の基本的クロマチン状況を示す。図１４Ａ−１４Ｄは、この研究に使用される関連する化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡと共に、指示された遺伝子座を、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９における対応するゲノム上の位置で示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「ＤＨＳ」）における有意なＤＮａｓｅ高感受性の領域と共に、ＥＮＣＯＤＥ ＨＥＫ２９３Ｔ ＤＮａｓｅ高感受性の濃縮が示される（変化をスケールで記す）。さらに、１２５の細胞型にわたるＥＮＣＯＤＥマスターＤＮａｓｅクラスターが示される。７種の細胞株（ＧＭ１２８７８、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ＨＳＭＭ、ＨＵＶＥＣ、Ｋ５６２、ＮＨＥＫ、およびＮＨＬＦ）にわたるＥＮＣＯＤＥ Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３濃縮の重ね合わせも呈示し、それぞれ５０から１５０の垂直表示範囲に格付けした。各遺伝子座およびそれぞれの細胞株について、内在性ｐ３００結合プロフィールも示された。

【図14C-14D】ｄＣａｓ９^{p300 Core}標的遺伝子座の基本的クロマチン状況を示す。図１４Ａ−１４Ｄは、この研究に使用される関連する化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡと共に、指示された遺伝子座を、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９における対応するゲノム上の位置で示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「ＤＨＳ」）における有意なＤＮａｓｅ高感受性の領域と共に、ＥＮＣＯＤＥ ＨＥＫ２９３Ｔ ＤＮａｓｅ高感受性の濃縮が示される（変化をスケールで記す）。さらに、１２５の細胞型にわたるＥＮＣＯＤＥマスターＤＮａｓｅクラスターが示される。７種の細胞株（ＧＭ１２８７８、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ＨＳＭＭ、ＨＵＶＥＣ、Ｋ５６２、ＮＨＥＫ、およびＮＨＬＦ）にわたるＥＮＣＯＤＥ Ｈ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ４ｍｅ３濃縮の重ね合わせも呈示し、それぞれ５０から１５０の垂直表示範囲に格付けした。各遺伝子座およびそれぞれの細胞株について、内在性ｐ３００結合プロフィールも示された。

【図14E】図１４Ａ〜１４Ｄで提供された情報の総覧を示す。

【図15A】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15B】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15C】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15D】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15E】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15F】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15G】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15H】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15I】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図15J】ｄＣａｓ９コンストラクトのアミノ酸配列を示す。

【図16】ＩＣＡＭ１ジンクフィンガー１０エフェクターのアミノ酸配列を示す。

【図17】ｇＲＮＡ設計およびスクリーニングを示す。

【図18】ｇＲＮＡ組み合わせ活性化を示す。

【図19】２９３ＴにおけるＰａｘ７ガイドスクリーニングを示す。

【図20】ｇＲＮＡ１９がＤＨＳに局在することを示す。

【図21】ｄＣａｓ９^{p300 Core}を伴うまたは伴わない、２９３ＴにおけるＦＧＦ１Ａ ｍＲＮＡの相対量を示す。

【図22】ｄＣａｓ９^{p300 Core}、ｄＣａｓ９^VP64、またはｄＣａｓ９（単独）を伴う、２９３ＴにおけるＦＧＦ１ＢおよびＦＧＦ１Ｃの発現レベルを示す。

【図23】ｄＣａｓ９^{p300 Core}、ｄＣａｓ９^VP64、またはｄＣａｓ９（単独）を伴う、２９３ＴにおけるＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃの発現レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本明細書で開示するのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系、および前記系を使用する方法である。この系は、エピゲノムおよび下流遺伝子発現の確実な制御を容易にするための、容易にプログラム可能な手法を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、Ｃａｓ９タンパク質とヒストンアセチル化酵素活性を有するタンパク質（ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００の、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）触媒コアドメインなど）との融合タンパク質である、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼを含む。Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を有しない可能性がある。ヌクレアーゼ活性が無効にされているＣａｓ９タンパク質の例は、ｄＣａｓ９である。ｄＣａｓ９とｇＲＮＡによる、アセチルトランスフェラーゼ機能のゲノム上の標的部位への動員は、エピジェネティック構造の直接的調節を可能にし、したがって、遺伝子活性化の有効な手段を提供する。

【0013】

開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼは、その標的部位でのヒストンＨ３リジン２７のアセチル化を触媒し、プロモーターならびに近位および遠位エンハンサーからの標的遺伝子の頑強な転写活性化をもたらす。本明細書で開示する通り、これらの標的化されるアセチルトランスフェラーゼによる遺伝子活性化は、ゲノム全体にわたって高度に特異的である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼは、ゲノム内の任意の部位を標的にすることができ、遠位調節エレメントを活性化する独自の能力がある。従来のｄＣａｓ９に基づく活性化因子とは対照的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼは、個々のまたは単一のガイドＲＮＡと共に、エンハンサー領域からの遺伝子を効率的に活性化する。

【0014】

１．定義
用語「含む」、「含まれる」、「有すること」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびこれらの異形は、本明細書で使用する場合、追加の作用または構造可能性を排除しない、制約のない移り変わる語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。本開示はまた、明確に説明してもしなくても、本明細書で提供される実施態様または要素を「含む」、「〜からなる」、および「本質的に〜からなる」、他の実施態様を意図する。

【0015】

本明細書の数値範囲の列挙については、それぞれその間にある数が、同じ程度の正確性で、明確に意図される。例えば、６〜９の範囲については、６および９に加えて、数値７および８が意図され、範囲６．０〜７．０については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明確に意図される。

【0016】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本文書が、定義を含めて、優先されることとなる。好ましい方法および材料は、以下に記載するが、本明細書に記載したものと類似または等価な方法および材料を、本明細書の実施または試験において使用することができる。本明細書に言及したすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献の全体を、参照によって本明細書に組み込む。本明細書に開示した材料、方法、および実施例は、実例に過ぎず、限定的であることを意図されない。

【0017】

本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種を感染させる、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する、小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、現在、疾患を引き起こすことが知られておらず、したがって、ウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。

【0018】

本明細書で使用される「クロマチン」は、ヒストンと結合した染色体ＤＮＡの組織化された複合体を指す。

【0019】

本明細書で互換的に使用される「Ｃｉｓ−調節エレメント」または「ＣＲＥ」は、近くの遺伝子の転写を調節するノンコーディングＤＮＡの領域を指す。ＣＲＥは、それが調節する遺伝子（１または複数）の近傍に見られる。ＣＲＥは、一般的に、転写因子に対する結合部位として機能することによって、遺伝子転写を調節する。ＣＲＥの例としては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。

【0020】

本明細書で互換的に使用される「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノム内に見られる複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座を指す。

【0021】

本明細書で使用される「コード配列」または「コードする核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個人または哺乳類の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、コドン最適化することができる。

【0022】

本明細書で使用される「相補体」または「相補的」は、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を生じることができることを意味する。「相補性」は、互いに逆平行に整列させた時に各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるような、２つの核酸配列間に共有される性質を指す。

【0023】

本明細書で使用される「内在性遺伝子」は、生物、組織、または細胞内に起源をもつ遺伝子を指す。内在性遺伝子は、その正常なゲノムおよびクロマチン状況であり、かつその細胞に対して異種ではない細胞に固有である。こうした細胞遺伝子には、例えば、動物遺伝子、植物遺伝子、細菌遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、および葉緑体遺伝子が含まれる。

【0024】

本明細書で使用される「エンハンサー」は、複数の活性化因子およびリプレッサー結合部位を含有する、ノンコーディングＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、長さが２００ｂｐから１ｋｂの範囲であり、近位、すなわちプロモーターに対して５’上流、もしくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、または遠位、すなわちその遺伝子座から離れた隣接遺伝子のイントロンまたは遺伝子間領域内であり得る。活性なエンハンサーは、ＤＮＡルーピングを介して、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーター特異性に依存してプロモーターと接触する。４から５個のエンハンサーが、プロモーターと相互作用することができる。同様に、エンハンサーは、連結に制限されずに２つ以上の遺伝子を調節することができ、隣接遺伝子を「スキップ」して、より離れた遺伝子を調節することができる。転写調節は、プロモーターが存在する染色体とは異なる染色体に位置するエレメントを伴うことができる。隣接遺伝子の近位エンハンサーまたはプロモーターは、より遠位のエレメントを動員するためのプラットフォームとして働くことができる。

【0025】

本明細書で使用される「融合タンパク質」は、元々は別のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子の連結を介して作製されたキメラタンパク質を指す。融合体遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能特性をもつ単一のポリペプチドをもたらす。

【0026】

本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個人の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されることとなるような、タンパク質をコードするコード配列に、作動可能に連結された必須の調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。

【0027】

「ヒストンアセチル化酵素」または「ＨＡＴ」は、本明細書で互換的に使用され、ヒストンタンパク質上の保存リジンアミノ酸を、アセチルＣｏＡからアセチル基を転移させることによってアセチル化して、ε−Ｎ−アセチルリジンを形成する酵素を指す。ＤＮＡは、ヒストンの周囲に巻き付けられ、アセチル基をヒストンに転移させることによって、遺伝子をオンオフさせることができる。一般に、ヒストンアセチル化は、転写活性化につながり、また、ユークロマチンと関係があるので、遺伝子発現を増大させる。ヒストンアセチル化酵素はまた、核内受容体および他の転写因子などの非ヒストンタンパク質をアセチル化して、遺伝子発現を促進することもできる。

【0028】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況で本明細書で使用される「同一な」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域にわたって同一である、特定の割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適に整列させ、これらの２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一な残基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を出し、マッチ位置の数を、特定の領域における位置の総数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性の割合を出すことによって算出することができる。２つの配列が異なる長さのものである、または整列によって１つ以上の粘着末端が生じて比較の特定の領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、等しいとみなすことができる。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって実施することができる。

【0029】

本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって共に連結された、少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。単鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写した単鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同一の目的のために、核酸の多くのバリアントを使用することができる。したがって、核酸は実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。

【0030】

核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るし、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することもできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。

【0031】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結されたプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御するプロモーターと遺伝子との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知であるように、この距離のバリエーションは、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応させることができる。

【0032】

本明細書で互換的に使用される「ｐ３００タンパク質」、「ＥＰ３００」、または「Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００」は、ＥＰ３００遺伝子によってコードされる、アデノウイルスＥ１Ａ関連細胞ｐ３００転写コアクチベータータンパク質を指す。ｐ３００は、広範な細胞過程に関与する、高度に保存されるアセチルトランスフェラーゼである。ｐ３００は、クロマチンリモデリングを介して転写を調節するヒストンアセチル化酵素として機能し、細胞増殖および分化の過程と関与する。

【0033】

本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または促進することが可能である、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するための、かつ／または、空間的発現および／または同じものの時間的発現を変更するための、１つ以上の特異的な転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた起源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、または誘発物質などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的または変動的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

【0034】

本明細書で使用される「標的エンハンサー」は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系によって標的にされるエンハンサーを指す。標的エンハンサーは、標的領域内であり得る。

【0035】

本明細書で使用される「標的遺伝子」は、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子には、プロモーターおよびエンハンサー領域などの調節領域、コード領域を含む転写領域、および他の機能配列領域が含まれる。

【0036】

本明細書で使用される「標的領域」は、それに対するガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を動員して、エピジェネティック構造を調節し、かつ標的遺伝子の遺伝子発現の活性化を可能にするように設計される、標的遺伝子のシス調節領域またはトランス調節領域を指す。

【0037】

本明細書で使用される「標的調節エレメント」は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系によって標的にされる調節エレメントを指す。標的調節エレメントは、標的領域内であり得る。

【0038】

本明細書で使用される「転写領域」は、ＤＮＡ分子からの遺伝情報のメッセンジャーＲＮＡへの伝達をもたらす、メッセンジャーＲＮＡとして公知である単鎖ＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡの領域を指す。転写中、ＲＮＡポリメラーゼは、３’から５’の方向に鋳型鎖を読み取り、５’から３’にＲＮＡを合成する。ｍＲＮＡ配列は、ＤＮＡ鎖に対して相補的である。

【0039】

本明細書で互換的に使用される「転写開始点」または「ＴＳＳ」は、そこでＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ転写物の合成を開始する、転写されたＤＮＡ配列の最初のヌクレオチドを指す。

【0040】

本明細書で使用される「導入遺伝子」は、ある生物から単離されており、別の生物に導入される、遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持することもできるし、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常な機能を変えることもできる。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。

【0041】

本明細書で使用される「トランス調節エレメント」は、そこから転写される遺伝子から離れた遺伝子の転写を調節する、ノンコーディングＤＮＡの領域を指す。トランス調節エレメントは、標的遺伝子と同じ又は異なる染色体上にあり得る。

【0042】

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参考ヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参考ヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部；（ｉｉｉ）参考核酸と実質的に同一である核酸もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参考核酸とハイブリッド形成する核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列を意味する。

【0043】

ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参考タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸と置き換えることは、微小な変化を一般的に伴うものと当技術分野で認識されている。これらの微小な変化は、当技術分野で理解されている通り、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性指標のアミノ酸が置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドという状況でのアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生体機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。

【0044】

本明細書で使用される「ベクター」は、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、配列番号１４０、１４１、または１４９のアミノ酸配列、および／または配列番号２３〜７３、１８８〜２２３、または２２４〜２５４のいずれか１つの少なくとも１つのｇＲＮＡヌクレオチド配列を有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼをコードすることができる。

【0045】

２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系
本明細書で提供されるのは、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化するのに使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ｄＣａｓ９などの、ヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓ９タンパク質の融合タンパク質と、ヒストンアセチル化酵素またはヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインとを含む。ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）によって実施されるヒストンアセチル化は、クロマチン動態を調節することおよび転写調節における基本的役割を果たす。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、ＤＮＡを、そのヘテロクロマチン状態から開放し、内在性の細胞機構による持続性かつ頑強な遺伝子発現を可能にする。ｄＣａｓ９による、ゲノム上の標的部位へのアセチルトランスフェラーゼの動員は、エピジェネティック構造を直接的に調節することができる。

【0046】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、その標的部位でのヒストンＨ３リジン２７のアセチル化を触媒し、プロモーターならびに近位および遠位エンハンサーからの標的遺伝子の頑強な転写活性化をもたらすことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、高度に特異的であり、わずか１つのガイドＲＮＡを使用して標的遺伝子に導かれ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ゲノム内の離れた位置のエンハンサーを標的にすることによって、遺伝子１つまたは遺伝子のファミリーの発現を活性化することができる。

【0047】

ａ）ＣＲＩＳＰＲ系
ＣＲＩＳＰＲ系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ノンコーディングＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短い部分が、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Ｃａｓ９は、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）の３’末端との複合体を形成し、このタンパク質−ＲＮＡ対は、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ定義された２０ｂｐ ＤＮＡ配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム上の標的を認識する。この複合体は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）内のコードされた領域を介して、病原体ＤＮＡの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）（ＰＡＭ）に誘導される。ノンコーディングＣＲＩＳＰＲアレイは、ダイレクトリピート内で転写および切断されて、個々のスペーサー配列を含有する短いｃｒＲＮＡとなり、これが、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトスペーサー）に誘導する。発現されるキメラｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列を単に交換することによって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ゲノム上の新しい標的に誘導することができるようになる。ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、真核生物におけるＲＮＡｉと同様の方式で外来性遺伝因子を認識および発現停止させるために使用される。

【0048】

３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型エフェクター系）が公知である。ＩＩ型エフェクター系は、単一のエフェクター酵素、Ｃａｓ９を使用して、４つの連続的ステップで、標的ＤＮＡ二本鎖破壊を行って、ｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核細胞などの代替状況において機能することができる。ＩＩ型エフェクター系は、長い前駆‐ｃｒＲＮＡ（これは、スペーサー含有ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される）、Ｃａｓ９タンパク質、およびｔｒａｃｒＲＮＡ（これは、前駆‐ｃｒＲＮＡプロセシングに関与する）からなる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、前駆‐ｃｒＲＮＡのスペーサーを隔てている反復領域とハイブリッド形成し、したがって、内在性ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｄｓＲＮＡ切断を開始する。この切断に、Ｃａｓ９による各スペーサー内の第２の切断現象が続き、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９と結合されたままである成熟ｃｒＲＮＡが産生され、Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。

【0049】

化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の遺伝子改変された形態のＩＩ型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Ｃａｓ９タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドＲＮＡ」（「ｇＲＮＡ」、また、本明細書ではキメラｓｇＲＮＡと互換的に使用され、一般に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ およびｃｒＲＮＡプロセシングの必要性を不要にするｃｒＲＮＡ‐ｔｒａｃｒＲＮＡ融合体である）によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。

【0050】

Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ＤＮＡ二重鎖をほどき、ｃｒＲＮＡとの配列マッチングを探索して切断する。標的認識は、標的ＤＮＡ内の「プロトスペーサー」配列と、ｃｒＲＮＡ内の残存するスペーサー配列との間の相補性の検出時に発生する。Ｃａｓ９は、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）もプロトスペーサーの３’末端に存在する場合に、標的ＤＮＡの切断を媒介する。プロトスペーサーターゲティングについては、配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちＤＮＡ切断に必要とされるＣａｓ９ヌクレアーゼによって認識される短い配列の直後でなければならない。別のＩＩ型系は、異なるＰＡＭ要件を有する。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＣＲＩＳＰＲ系は、５’−ＮＲＧ−３’（ここでは、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかである）としての、かつ、ヒト細胞におけるこの系の特異性を特徴付ける、このＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のためのＰＡＭ配列を有することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の独自の能力は、２つ以上のｓｇＲＮＡを伴う単一のＣａｓ９タンパク質を同時発現させることによって、複数の異なるゲノム上遺伝子座を同時に標的にする、直接的な能力である。例えば、遺伝子改変された系において、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型系は、本来は「ＮＧＧ」配列（ここでは、「Ｎ」は、いずれかのヌクレオチドであり得る）を使用することを好むが、「ＮＡＧ」などの他のＰＡＭ配列も受け入れられる（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。同様に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）は、通常、ＮＮＮＮＧＡＴＴという天然のＰＡＭを有するが、高度に縮重したＮＮＮＮＧＮＮＮ ＰＡＭを含めた様々なＰＡＭにわたって活性を有する（Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６８１）。

【0051】

Ｃａｓ９
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９融合タンパク質を含むことができる。Ｃａｓ９タンパク質は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、また、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、また、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に含まれる。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの、あらゆる細菌または古細菌種由来であり得る。Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化されるように変異させることができる。いくつかの実施態様では、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の不活性化されたＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる；配列番号１）を使用することができる。本明細書で使用する場合、「ｉＣａｓ９」および「ｄＣａｓ９」はどちらも、アミノ酸置換Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを有し、かつそのヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣａｓ９タンパク質を指す。いくつかの実施態様では、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＮｍＣａｓ９などの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の不活性化されたＣａｓ９タンパク質を使用することができる。

【0052】

ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ｐ３００タンパク質、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ；ｐ３００の類似体）、ＧＣＮ５、もしくはＰＣＡＦ、またはこれらの断片などの、ヒストンアセチル化酵素タンパク質を含むことができる。ｐ３００タンパク質は、体全体にわたる組織における多くの遺伝子の活性を調節する。ｐ３００タンパク質は、細胞成長および分裂を調節する、また、細胞が成熟するのを促し、特殊化機能（分化させる）を担う、また、癌性腫瘍の成長を予防する役割を果たす。ｐ３００タンパク質は、転写因子を、細胞の核内で転写を行うタンパク質の複合体と連結させることによって、転写を活性化することができる。ｐ３００タンパク質はまた、クロマチンリモデリングを介して転写を調節するヒストンアセチル化酵素としても機能する。

【0053】

ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、ヒトｐ３００タンパク質またはその断片を含むことができる。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、野生型ヒトｐ３００タンパク質またはヒトｐ３００タンパク質の変異体、またはその断片を含むことができる。ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、ヒトｐ３００タンパク質のリジン−アセチルトランスフェラーゼコアドメイン、すなわち、ｐ３００ ＨＡＴ Ｃｏｒｅ（「ｐ３００ Ｃｏｒｅ」としても公知である）を含むことができる。いくつかの実施態様では、ヒストンアセチル化酵素タンパク質は、配列番号２または３のアミノ酸配列を含む。

【0054】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ヒストンアセチル化エフェクタードメインを含むことができる。ヒストンアセチル化エフェクタードメインは、ヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００のヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）触媒コアドメイン（本明細書では「ｐ３００ Ｃｏｒｅ」とも呼ばれる）であり得る。いくつかの実施態様では、ｐ３００ Ｃｏｒｅは、配列番号２のアミノ酸１０４８〜１６６４（すなわち、配列番号３）を含む。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、配列番号１４１のｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質または配列番号１４９のＮｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質を含む。ｐ３００ Ｃｏｒｅは、ヒストンＨ３上のリジン２７をアセチル化し（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）、Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮を提供することができる。

【0055】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質は、標的にされる内在性遺伝子座でのアセチル化を合成的に操作し、近位および遠位エンハンサーによって調節される遺伝子の調節をもたらすための、強力かつ容易にプログラム可能な手段である。ｐ３００の触媒コアドメインとｄＣａｓ９との融合体は、頑強なタンパク質発現にもかかわらず、下流遺伝子の、完全長ｐ３００タンパク質の直接的融合体よりも実質的に高いトランス活性化をもたらす可能性がある。ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質はまた、例えば、Ｎｍ−ｄＣａｓ９骨格の状況で、特に、遠位エンハンサー領域で（そこではｄＣａｓ９^VP64は、わずかな、あるとしても測定可能な下流転写活性しか呈さなかった）、ｄＣａｓ９^VP64と比較して増大したトランス活性化能力を示す可能性がある。さらに、ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、正確で確実なゲノムワイド転写特異性を呈する。ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、エピジェネティック修飾されたエンハンサーによって標的にされるプロモーターでの強力な転写活性化およびアセチル化の同時濃縮の能力があり得る。

【0056】

ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、プロモーターおよび／または特徴付けられたエンハンサーを標的にし、これと結合する単一のｇＲＮＡを介して、遺伝子発現を活性化することができる。この技術はまた、推定上のおよび既知の調節領域から遠位の遺伝子を人工的にトランス活性化する能力をもたらし、単一のプログラム可能なエフェクターと単一の標的部位の適用を介するトランス活性化を容易にする。これらの能力は、いくつかのプロモーターおよび／またはエンハンサーを同時に標的にするための多重化を可能にする。哺乳類起源のｐ３００は、免疫原性の可能性を最小限にすることによって、インビボ適用について、ウイルス由来のエフェクタードメインに対する利点を提供することができる。

【0057】

ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ある核酸配列を標的にする少なくとも１つのｇＲＮＡを含むことができる。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系のターゲティングを提供する。ｇＲＮＡは、２種のノンコーディングＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの融合体である。ｓｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的との相補的塩基対形成を介して、ターゲティング特異性を付与する２０ｂｐプロトスペーサーをコードする配列を交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的にすることができる。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクター系に含まれる天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。この二重鎖は、例えば、４２−ヌクレオチドのｃｒＲＮＡと７５−ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができ、Ｃａｓ９のためのガイドとして作用する。

【0058】

ｇＲＮＡは、標的遺伝子の標的領域を標的にし、これと結合することができる。標的領域は、標的遺伝子のシス調節領域またはトランス調節領域であり得る。いくつかの実施態様では、標的領域は、標的遺伝子の遠位または近位のシス調節領域である。ｇＲＮＡは、標的遺伝子のシス調節領域またはトランス調節領域を標的にし、これと結合することができる。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子のエンハンサー領域、プロモーター領域、または転写領域を標的にし、これと結合することができる。例えば、ｇＲＮＡは、ヒトβ−グロビン遺伝子座のＨＳ２エンハンサー、ＭＹＯＤ遺伝子の遠位調節領域（ＤＲＲ）、ＭＹＯＤ遺伝子のコアエンハンサー（ＣＥ）、ＯＣＴ４遺伝子の近位（ＰＥ）エンハンサー領域、またはＯＣＴ４遺伝子の遠位（ＤＥ）エンハンサー領域のうちの少なくとも１つである、標的領域を標的にし、これと結合することができる。いくつかの実施態様では、標的領域は、ＨＩＶプロモーターなどのウイルスプロモーターであり得る。

【0059】

標的領域は、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントを含むことができる。いくつかの実施態様では、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントは、いくつかの標的遺伝子の遺伝子発現を制御する。いくつかの実施態様では、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントは、１つ以上の標的遺伝子の遺伝子発現に関与する細胞表現型を制御する。いくつかの実施態様では、１つ以上の標的遺伝子の同一性は、既知である。いくつかの実施態様では、１つ以上の標的遺伝子の同一性は、未知である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、細胞表現型に関与するこれらの未知の遺伝子の同一性の決定を可能にする。細胞表現型の例としては、限定はされないが、Ｔ細胞表現型、造血細胞分化などの細胞分化、発癌、免疫調節、刺激に対する細胞応答、細胞死、細胞成長、薬物耐性、または薬物感受性が挙げられる。

【0060】

いくつかの実施態様では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントを標的にし、これと結合することができ、それによって１つ以上の遺伝子の発現が活性化される。例えば、１遺伝子から２０遺伝子、１遺伝子から１５遺伝子、１遺伝子から１０遺伝子、１から５遺伝子、２遺伝子から２０遺伝子、２遺伝子から１５遺伝子、２遺伝子から１０遺伝子、２遺伝子から５遺伝子、５遺伝子から２０遺伝子、５遺伝子から１５遺伝子、または５遺伝子から１０遺伝子が、少なくとも１つのｇＲＮＡによって活性化される。いくつかの実施態様では、少なくとも１遺伝子、少なくとも２遺伝子、少なくとも３遺伝子、少なくとも４遺伝子、少なくとも５遺伝子、少なくとも６遺伝子、少なくとも７遺伝子、少なくとも８遺伝子、少なくとも９遺伝子、少なくとも１０遺伝子、少なくとも１１遺伝子、少なくとも１２遺伝子、少なくとも１３遺伝子、少なくとも１４遺伝子、少なくとも１５遺伝子、または少なくとも２０遺伝子が、少なくとも１つのｇＲＮＡによって活性化される。

【0061】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、転写開始点（ＴＳＳ）に対して近位の位置と遠位の位置のどちらの遺伝子も活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＴＳＳから、少なくとも約１塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約２，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約１０，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約２０，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約５０，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約７５，０００塩基対から約１００，０００塩基対、少なくとも約１塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約２，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約１０，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約２０，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約５０，０００塩基対から約７５，０００塩基対、少なくとも約１塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約２，０００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約１０，０００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約２０，０００塩基対から約５０，０００塩基対、少なくとも約１塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約２，０００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約１０，０００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約２０，０００塩基対から約２５，０００塩基対、少なくとも約１塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約２，０００塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対から約１０，０００塩基対、少なくとも約１塩基対から約５，０００塩基対、少なくとも約１００塩基対から約５，０００塩基対、少なくとも約２５０塩基対から約５，０００塩基対、少なくとも約５００塩基対から約５，０００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対から約５，０００塩基対、または少なくとも約２，０００塩基対から約５，０００塩基対上流である領域を標的にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＴＳＳから、少なくとも約１塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約５００塩基対、少なくとも約１，０００塩基対、少なくとも約１，２５０塩基対、少なくとも約２，０００塩基対、少なくとも約２，２５０塩基対、少なくとも約２，５００塩基対、少なくとも約５，０００塩基対、少なくとも約１０，０００塩基対、少なくとも約１１，０００塩基対、少なくとも約２０，０００塩基対、少なくとも約３０，０００塩基対、少なくとも約４６，０００塩基対、少なくとも約５０，０００塩基対、少なくとも約５４，０００塩基対、少なくとも約７５，０００塩基対、または少なくとも約１００，０００塩基対上流である領域を標的にすることができる。

【0062】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＴＳＳから、少なくとも約１塩基対から少なくとも約５００塩基対、少なくとも約１塩基対から少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約１塩基対から少なくとも約２００塩基対、少なくとも約１塩基対から少なくとも約１００塩基対、少なくとも約５０塩基対から少なくとも約５００塩基対、少なくとも約５０塩基対から少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約５０塩基対から少なくとも約２００塩基対、少なくとも約５０塩基対から少なくとも約１００塩基対、少なくとも約１００塩基対から少なくとも約５００塩基対、少なくとも約１００塩基対から少なくとも約２５０塩基対、または少なくとも約１００塩基対から少なくとも約２００塩基対下流である領域を標的にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＴＳＳから、少なくとも約１塩基対、少なくとも約２塩基対、少なくとも約３塩基対、少なくとも約４塩基対、少なくとも約５塩基対、少なくとも約１０塩基対、少なくとも約１５塩基対、少なくとも約２０塩基対、少なくとも約２５塩基対、少なくとも約３０塩基対、少なくとも約４０塩基対、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約６０塩基対、少なくとも約７０塩基対、少なくとも約８０塩基対、少なくとも約９０塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約１１０塩基対、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０塩基対、少なくとも約１５０塩基対、少なくとも約１６０塩基対、少なくとも約１７０塩基対、少なくとも約１８０塩基対、少なくとも約１９０塩基対、少なくとも約２００塩基対、少なくとも約２１０塩基対、少なくとも約２２０、少なくとも約２３０、少なくとも約２４０塩基対、または少なくとも約２５０塩基対下流である領域を標的にすることができる。

【0063】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、標的遺伝子と同じ染色体上にあるが、ＴＳＳから、１００，０００塩基対よりも上流または２５０塩基対よりも下流である標的領域を標的にし、これと結合することができる。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、標的遺伝子とは異なる染色体上にある標的領域を標的にし、これと結合することができる。

【0064】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、様々な配列および長さのｇＲＮＡを使用することができる。ｇＲＮＡは、ＮＧＧが後続する標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列を含むことができる。ｇＲＮＡは、相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含むことができる。ｇＲＮＡは、ＮＧＧが後続する標的ＤＮＡ配列の、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、または少なくとも３５塩基対の相補的ポリヌクレオチド配列を含むことができる。ｇＲＮＡは、標的遺伝子の、プロモーター領域、エンハンサー領域、または転写領域のうちの少なくとも１つを標的にすることができる。ｇＲＮＡは、配列番号２３〜７３、１８８〜２２３、または２２４〜２５４のうちの少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。

【0065】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９個の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、少なくとも１個のｇＲＮＡから少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡから少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１個のｇＲＮＡから少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡから少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡから少なくとも８個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるｇＲＮＡから少なくとも４個の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡから少なくとも１０個の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも４個の異なるｇＲＮＡから少なくとも８個の異なるｇＲＮＡを含むことができる。

【0066】

標的遺伝子
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、任意の標的遺伝子の発現を標的にし、これを活性化するように設計することができる。標的遺伝子は、細胞株における、内在性遺伝子、導入遺伝子、またはウイルス遺伝子であり得る。いくつかの実施態様では、標的領域は、標的遺伝子とは異なる染色体上にある。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、２個以上のｇＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、２個以上の異なるｇＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施態様では、異なるｇＲＮＡは、異なる標的領域に結合する。例えば、異なるｇＲＮＡは、異なる標的遺伝子の標的領域に結合することができ、２つ以上の標的遺伝子の発現が活性化される。

【0067】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、約１個の標的遺伝子から約１０個の標的遺伝子、約１個の標的遺伝子から約５個の標的遺伝子、約１個の標的遺伝子から約４個の標的遺伝子、約１個の標的遺伝子から約３個の標的遺伝子、約１個の標的遺伝子から約２個の標的遺伝子、約２個の標的遺伝子から約１０個の標的遺伝子、約２個の標的遺伝子から約５個の標的遺伝子、約２個の標的遺伝子から約４個の標的遺伝子、約２個の標的遺伝子から約３個の標的遺伝子、約３個の標的遺伝子から約１０個の標的遺伝子、約３個の標的遺伝子から約５個の標的遺伝子、または約３個の標的遺伝子から約４個の標的遺伝子を活性化することができる。いくつかの実施態様ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、少なくとも１個の標的遺伝子、少なくとも２個の標的遺伝子、少なくとも３個の標的遺伝子、少なくとも４個の標的遺伝子、少なくとも５個の標的遺伝子、または少なくとも１０個の標的遺伝子を活性化することができる。例えば、ヒトβ−グロビン遺伝子座の高感受性領域２（ＨＳ２）エンハンサー領域を標的にし、下流遺伝子（ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、およびＨＢＢ）を活性化することができる。

【0068】

いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、遺伝子発現の対照レベルと比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１６０倍、少なくとも１７０倍、少なくとも１８０倍、少なくとも１９０倍、少なくとも２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、または少なくとも１０００倍の、標的遺伝子の遺伝子発現を誘発する。標的遺伝子の遺伝子発現の対照レベルは、いかなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系でも処理されていない細胞における標的遺伝子の遺伝子発現のレベルであり得る。

【0069】

標的遺伝子は、哺乳類遺伝子であり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ１、ＯＣＴ４、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、ＨＢＢ、ＭＹＯＣＤ（ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ））、ＰＡＸ７（ペアードボックスタンパク質（Ｐａｉｒｅｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｐａｘ−７）、ＦＧＦ１（線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−１）遺伝子、例えばＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃなどの哺乳類遺伝子を標的にすることができる。他の標的遺伝子としては、限定はされないが、Ａｔｆ３、Ａｘｕｄ１、Ｂｔｇ２、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｅｄｎ１、Ｅｒｅｇ、Ｆｏｓ、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｉｅｒ２、Ｉｅｒ３、Ｉｆｒｄ１、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６、Ｉｒｆ１、Ｊｕｎｂ、Ｌｉｆ、Ｎｆｋｂｉａ、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｐｔｇｓ２、Ｓｌｃ２５ａ２５、Ｓｑｓｔｍ１、Ｔｉｅｇ、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｚｆｐ３６、Ｂｉｒｃ２、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ２０、Ｃｃｌ７、Ｃｅｂｐｄ、Ｃｈ２５ｈ、ＣＳＦ１、Ｃｘ３ｃｌ１、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｘｃｌ５、Ｇｃｈ、Ｉｃａｍ１、Ｉｆｉ４７、Ｉｆｎｇｒ２、Ｍｍｐ１０、Ｎｆｋｂｉｅ、Ｎｐａｌ１、ｐ２１、Ｒｅｌｂ、Ｒｉｐｋ２、Ｒｎｄ１、Ｓ１ｐｒ３、Ｓｔｘ１１、Ｔｇｔｐ、Ｔｌｒ２、Ｔｍｅｍ１４０、Ｔｎｆａｉｐ２、Ｔｎｆｒｓｆ６、Ｖｃａｍ１、１１１０００４Ｃ０５Ｒｉｋ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１０２９１）、Ａｂｃａ１、ＡＩ５６１８７１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＩ１４３９１５）、ＡＩ８８２０７４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ７３０９１２）、Ａｒｔｓ１、ＡＷ０４９７６５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２６６４２．１）、Ｃ３、Ｃａｓｐ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ９、Ｃｄｓｎ、Ｅｎｐｐ２、Ｇｂｐ２、Ｈ２−Ｄ１、Ｈ２−Ｋ、Ｈ２−Ｌ、Ｉｆｉｔ１、Ｉｉ、Ｉｌ１３ｒａ１、Ｉｌ１ｒｌ１、Ｌｃｎ２、Ｌｈｆｐｌ２、ＬＯＣ６７７１６８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０１９３２５）、Ｍｍｐ１３、Ｍｍｐ３、Ｍｔ２、Ｎａｆ１、Ｐｐｉｃａｐ、Ｐｒｎｄ、Ｐｓｍｂ１０、Ｓａａ３、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｇ、Ｓｅｒｐｉｎｆ１、Ｓｏｄ３、Ｓｔａｔ１、Ｔａｐｂｐ、Ｕ９０９２６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２０５６２）、Ｕｂｄ、Ａ２ＡＲ（アデノシンＡ２Ａ受容体）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６とも呼ばれる）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１とも呼ばれる）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）；ＣＤ２７２とも呼ばれる）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）；ＣＤ１５２とも呼ばれる）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体（Ｋｉｌｌｅｒ−ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子−３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ−３））、ＰＤ−１（プログラム死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １）（ＰＤ−１）受容体）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）、およびＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（Ｖ−ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）が挙げられる。

【0070】

遺伝子活性化のための組成物
本発明は、細胞または対象における標的遺伝子、標的エンハンサー、または標的調節エレメントの遺伝子発現を活性化させるための組成物を対象とする。この組成物は、上に開示した通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を含むことができる。この組成物はまた、ウイルス送達系を含むことができる。例えば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変されたレンチウイルスベクターを含むことができる。

【0071】

核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用して、核酸（例えば発現コンストラクト）を細胞に導入することができる。適切な方法としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、遺伝子導入、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在性の遺伝子導入、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性の遺伝子導入、リポソーム介在性の遺伝子導入、パーティクル・ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子介在性の核酸送達などが挙げられる。いくつかの実施態様では、組成物は、ｍＲＮＡ送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達することができる。

【0072】

ａ）コンストラクトおよびプラスミド
組成物は、上に記載した通り、本明細書に開示する通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドまたは発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼおよび／または少なくとも１つのｇＲＮＡなどの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする核酸を含むことができる。組成物は、上に記載した通り、改変されたＡＡＶベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書に開示する通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする核酸配列を含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする核酸を含むことができる。組成物は、上に記載した通り、改変されたレンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼと、少なくとも１種のｓｇＲＮＡとをコードする核酸を含むことができる。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として、細胞内に存在することができる。遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体（セントロメアを含めて）、テロメア、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。

【0073】

遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

【0074】

核酸配列は、遺伝子コンストラクト（これはベクターであり得る）を構成することができる。ベクターは、哺乳類の細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系などの融合タンパク質を発現する能力があり得る。ベクターは、組換えであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系などの融合タンパク質をコードする異種の核酸を含むことができる。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、細胞に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする核酸を導入するのに有用であり得、ここでは、転換された宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の発現が起こる条件下で培養および維持される。

【0075】

コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある場合では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。

【0076】

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする異種の核酸を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系コード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系コード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系コード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、時空間における遺伝子活性化の動的な制御を可能にするために、光誘導性または化学誘導性制御下であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。こうしたプロモーターの例は、その内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書に記載されている。

【0077】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

【0078】

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼコード配列またはｓｇＲＮＡの上流のエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞において、ベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。

【0079】

ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたは系であり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。いくつかの実施態様では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列、および配列番号２３〜７３、１８８〜２２３、または２２４〜２５４の少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を含めて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする核酸配列を含むことができる。

【0080】

組み合わせ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系組成物は、異なる遺伝子座への、特定のエフェクター機能の独立したターゲティングの研究を容易にするために、直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ｄＣａｓ９ｓ、ＴＡＬＥ、およびジンクフィンガータンパク質と組み合わせることができる。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系組成物を、様々な活性化因子、リプレッサー、およびエピジェネティックモディファイヤーを用いて多重化し、細胞表現型を正確に制御する、または遺伝子調節の複雑なネットワークを解読することができる。

【0081】

使用の方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の潜在的用途は、科学およびバイオテクノロジーの多くの分野にわたり多様である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を使用して、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する、または、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントを標的にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を使用して、細胞および遺伝子治療、遺伝子リプログラミング、および再生医療に関連して、細胞を分化転換するおよび／または遺伝子を活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を使用して、系譜特定をリプログラミングすることができる。細胞の運命の主要な調節因子をコードする内在性遺伝子の（これらの因子の強制的な過剰発現ではなく）活性化は、遺伝子リプログラミングおよび分化転換のための、より迅速な、効率的な、安定な、または特異的な方法を潜在的にもたらすことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、哺乳類の遺伝子発現を調節するための他の手段を補うための、転写活性化因子の、より大きな多様性を提供する可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を使用して、遺伝子異常を補う、血管新生を抑制する、癌遺伝子を不活性化する、腫瘍抑制因子（ｓｉｌｅｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）を活性化する、組織を再生する、または遺伝子をリプログラミングすることができる。

【0082】

遺伝子発現を活性化する方法
本開示は、上に記載した通りの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を介してヒストンアセチル化酵素を標的領域に標的化することに基づいて標的遺伝子の発現を活性化するための機構を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、サイレンス（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）遺伝子を活性化することができる。標的遺伝子のＴＳＳの上流の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系標的領域は、標的遺伝子の遺伝子発現を実質的に誘発した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードするポリヌクレオチドはまた、細胞に直接的に導入することができる。

【0083】

本方法は、細胞または対象に、上に記載した通りの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の組成物、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを投与することを含むことができる。本方法は、上に記載した通りの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の組成物、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを、哺乳類細胞または対象に投与することを含むことができる。

【0084】

医薬組成物
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、医薬組成物中であり得る。この医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする約１ｎｇから約１０ｍｇのＤＮＡを含むことができる。本発明による医薬組成物は、使用される投与方式に従って製剤化される。医薬組成物が、注射用医薬組成物である場合、これは、無菌、パイロジェンフリー、かつ粒子状物質フリーである。等張性製剤が使用されることが好ましい。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。場合によっては、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、血管収縮剤が、製剤に添加される。

【0085】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を含有する医薬組成物は、医薬として許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。医薬として許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能性分子であり得る。医薬として許容し得る賦形剤は、遺伝子導入促進剤（これには界面活性剤が含まれ得る）、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤であり得る。

【0086】

遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。遺伝子導入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を含有する医薬組成物中に、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。遺伝子導入促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレンを含むことができ、また、遺伝子コンストラクトと共に、ヒアルロン酸も使用することができる。いくつかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードするＤＮＡベクターはまた、例えば脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、またはとしての、当技術分野で公知の他のリポソームを含めて）、ＤＮＡ−リポソーム混合物としてのもの（例えば国際公開第０９３２４６４０号パンフレット参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知のものを含むことができる。好ましくは、は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。

【0087】

送達の方法
本明細書で提供されるのは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の遺伝子コンストラクトおよび／またはタンパク質を提供するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の医薬製剤を送達するための方法である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の送達は、細胞において発現され、かつ細胞の表面に送達される、１つ以上の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の遺伝子導入または電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系タンパク質を、細胞に送達することができる。これらの核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置または他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔することができる。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水（製品＃Ｄ８５３７）（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めた、いくつかの様々な緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃａｍｉｎｅ ２０００などの遺伝子導入試薬を含むことができる。

【0088】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系タンパク質をコードするベクターは、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、および／または組換えベクターによって、哺乳類に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス型によって送達することができる。ウイルス型は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および／または組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。

【0089】

標的遺伝子の遺伝子発現を誘発するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系タンパク質をコードするヌクレオチドを、細胞に導入することができる。例えば、標的遺伝子に誘導されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を、哺乳類細胞に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系の細胞への送達時に、また、ベクターの哺乳類の細胞への送達時に、遺伝子導入細胞ｓは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を発現することとなる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系を、哺乳類に投与して、哺乳類における標的遺伝子の遺伝子発現を誘発または調節することができる。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。

【0090】

投与の経路
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系およびその組成物は、経口的、非経口的、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所的、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせを含めた、様々な経路によって、対象に投与することができる。獣医学的使用については、組成物は、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適した投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系およびその組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｓ）」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」、または超音波によって投与することができる。組成物は、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、組換えベクター、例えば組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めたいくつかの技術によって、哺乳類に送達することができる。

【0091】

細胞型
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、あらゆる型の細胞と共に使用することができる。いくつかの実施態様では、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、または動物細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は、限定はされないが、ＧＭ１２８７８、Ｋ５６２、Ｈ１ヒト胚性幹細胞、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＩＭＲ９０、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＨＭＥＣまたはＬＨＣＭ、ＣＤ１４＋、ＣＤ２０＋、初代心臓または肝臓細胞、分化したＨ１細胞、８９８８Ｔ、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿ｎａｉｖｅ、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿Ｔｈ０、Ａｄｕｌｔ＿ＣＤ４＿Ｔｈ１、ＡＧ０４４４９、ＡＧ０４４５０、ＡＧ０９３０９、ＡＧ０９３１９、ＡＧ１０８０３、ＡｏＡＦ、ＡｏＳＭＣ、ＢＣ＿Ａｄｉｐｏｓｅ＿ＵＨＮ００００１、ＢＣ＿Ａｄｒｅｎａｌ＿Ｇｌａｎｄ＿Ｈ１２８０３Ｎ、ＢＣ＿Ｂｌａｄｄｅｒ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｂｒａｉｎ＿Ｈ１１０５８Ｎ、ＢＣ＿Ｂｒｅａｓｔ＿０２−０３０１５、ＢＣ＿Ｃｏｌｏｎ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｃｏｌｏｎ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｊｅｊｕｎｕｍ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｋｉｄｎｅｙ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｋｉｄｎｅｙ ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｌｅｆｔ＿Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ＿Ｎ４１、ＢＣ＿Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ＿ＵＨＮ００２０４、ＢＣ＿Ｌｉｖｅｒ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｌｕｎｇ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｌｕｎｇ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐａｎｃｒｅａｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐｅｎｉｓ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ＿Ｈ１２５２９Ｎ、ＢＣ＿Ｐｌａｃｅｎｔａ＿ＵＨＮ００１８９、ＢＣ＿Ｐｒｏｓｔａｔｅ＿Ｇｌａｎｄ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｒｅｃｔｕｍ＿Ｎ２９、ＢＣ＿Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｓｋｉｎ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｓｍａｌｌ＿Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｓｐｌｅｅｎ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｓｔｏｍａｃｈ＿０１−１１００２、ＢＣ＿Ｓｔｏｍａｃｈ＿Ｈ１２８１７Ｎ、ＢＣ＿Ｔｅｓｔｉｓ＿Ｎ３０、ＢＣ＿Ｕｔｅｒｕｓ＿ＢＮ０７６５、ＢＥ２＿Ｃ、ＢＧ０２ＥＳ、ＢＧ０２ＥＳ−ＥＢＤ、ＢＪ、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＨＳ２７ａ、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＨＳ５、ｂｏｎｅ＿ｍａｒｒｏｗ＿ＭＳＣ、Ｂｒｅａｓｔ＿ＯＣ、Ｃａｃｏ−２、ＣＤ２０＋＿ＲＯ０１７７８、ＣＤ２０＋＿ＲＯ０１７９４、ＣＤ３４＋＿Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ、ＣＤ４＋＿Ｎａｉｖｅ＿Ｗｂ１１９７０６４０、ＣＤ４＋＿Ｎａｉｖｅ＿Ｗｂ７８４９５８２４、Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ＿ＯＣ、Ｃｅｒｅｂｒｕｍ＿ｆｒｏｎｔａｌ＿ＯＣ、Ｃｈｏｒｉｏｎ、ＣＬＬ、ＣＭＫ、Ｃｏｌｏ８２９、Ｃｏｌｏｎ＿ＢＣ、Ｃｏｌｏｎ＿ＯＣ、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿ｎａｉｖｅ、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿Ｔｈ０、Ｃｏｒｄ＿ＣＤ４＿Ｔｈ１、Ｄｅｃｉｄｕａ、Ｄｎｄ４１、ＥＣＣ−１、Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ＿ＯＣ、Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿ＢＣ、Ｆｉｂｒｏｂｌ、Ｆｉｂｒｏｂｌ＿ＧＭ０３３４８、ＦｉｂｒｏＰ、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ０８３９５、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ０８３９６、ＦｉｂｒｏＰ＿ＡＧ２０４４３、Ｆｒｏｎｔａｌ＿ｃｏｒｔｅｘ＿ＯＣ、ＧＣ＿Ｂ＿ｃｅｌｌ、Ｇｌｉｏｂｌａ、ＧＭ０４５０３、ＧＭ０４５０４、ＧＭ０６９９０、ＧＭ０８７１４、ＧＭ１０２４８、ＧＭ１０２６６、ＧＭ１０８４７、ＧＭ１２８０１、ＧＭ１２８１２、ＧＭ１２８１３、ＧＭ１２８６４、ＧＭ１２８６５、ＧＭ１２８６６、ＧＭ１２８６７、ＧＭ１２８６８、ＧＭ１２８６９、ＧＭ１２８７０、ＧＭ１２８７１、ＧＭ１２８７２、ＧＭ１２８７３、ＧＭ１２８７４、ＧＭ１２８７５、ＧＭ１２８７８−ＸｉＭａｔ、ＧＭ１２８９１、ＧＭ１２８９２、ＧＭ１３９７６、ＧＭ１３９７７、ＧＭ１５５１０、ＧＭ１８５０５、ＧＭ１８５０７、ＧＭ１８５２６、ＧＭ１８９５１、ＧＭ１９０９９、ＧＭ１９１９３、ＧＭ１９２３８、ＧＭ１９２３９、ＧＭ１９２４０、ＧＭ２００００、Ｈ０２８７、Ｈ１−ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｈ７−ｈＥＳＣ、Ｈ９ＥＳ、Ｈ９ＥＳ−ＡＦＰ−、Ｈ９ＥＳ−ＡＦＰ＋、Ｈ９ＥＳ−ＣＭ、Ｈ９ＥＳ−Ｅ、Ｈ９ＥＳ−ＥＢ、Ｈ９ＥＳ−ＥＢＤ、ＨＡｃ、ＨＡＥｐｉＣ、ＨＡ−ｈ、ＨＡＬ、ＨＡｏＡＦ、ＨＡｏＡＦ＿６０９０１０１．１１、ＨＡｏＡＦ＿６１１１３０１．９、ＨＡｏＥＣ、ＨＡｏＥＣ＿７０７１７０６．１、ＨＡｏＥＣ＿８０６１１０２．１、ＨＡ−ｓｐ、ＨＢＭＥＣ、ＨＢＶＰ、ＨＢＶＳＭＣ、ＨＣＦ、ＨＣＦａａ、ＨＣＨ、ＨＣＨ＿００１１３０８．２Ｐ、ＨＣＨ＿８１００８０８．２、ＨＣＭ、ＨＣｏｎＦ、ＨＣＰＥｐｉＣ、ＨＣＴ−１１６、Ｈｅａｒｔ＿ＯＣ、Ｈｅａｒｔ＿ＳＴＬ００３、ＨＥＥｐｉＣ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−Ｔ−ＲＥｘ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ、ＨＦＤＰＣ、ＨＦＤＰＣ＿０１００５０３．２、ＨＦＤＰＣ＿０１０２７０３．３、ＨＦＦ，ＨＦＦ−Ｍｙｃ、ＨＦＬ１１Ｗ、ＨＦＬ２４Ｗ、ＨＧＦ、ＨＨＳＥＣ、ＨＩＰＥｐｉＣ、ＨＬ−６０、ＨＭＥｐＣ、ＨＭＥｐＣ＿６０２２８０１．３、ＨＭＦ、ｈＭＮＣ−ＣＢ、ｈＭＮＣ−ＣＢ＿８０７２８０２．６、ｈＭＮＣ−ＣＢ＿９１１１７０１．６、ｈＭＮＣ−ＰＢ、ｈＭＮＣ−ＰＢ＿００２２３３０．９、ｈＭＮＣ−ＰＢ＿００８２４３０．９、ｈＭＳＣ−ＡＴ、ｈＭＳＣ−ＡＴ＿０１０２６０４．１２、ｈＭＳＣ−ＡＴ＿９０６１６０１．１２、ｈＭＳＣ−ＢＭ、ｈＭＳＣ−ＢＭ＿００５０６０２．１１、ｈＭＳＣ−ＢＭ＿００５１１０５．１１、ｈＭＳＣ−ＵＣ、ｈＭＳＣ−ＵＣ＿００５２５０１．７、ｈＭＳＣ−ＵＣ＿００８１１０１．７、ＨＭＶＥＣ−ｄＡｄ、ＨＭＶＥＣ−ｄＢｌ−Ａｄ、ＨＭＶＥＣ−ｄＢｌ−Ｎｅｏ、ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ−Ａｄ、ＨＭＶＥＣ−ｄＬｙ−Ｎｅｏ、ＨＭＶＥＣ−ｄＮｅｏ、ＨＭＶＥＣ−ＬＢｌ、ＨＭＶＥＣ−ＬＬｙ、ＨＮＰＣＥｐｉＣ、ＨＯＢ、ＨＯＢ＿００９０２０２．１、ＨＯＢ＿００９１３０１、ＨＰＡＥＣ、ＨＰＡＥｐｉＣ、ＨＰＡＦ、ＨＰＣ−ＰＬ、ＨＰＣ−ＰＬ＿００３２６０１．１３、ＨＰＣ−ＰＬ＿０１０１５０４．１３、ＨＰＤＥ６−Ｅ６Ｅ７、ＨＰｄＬＦ、ＨＰＦ、ＨＰＩＥｐＣ、ＨＰＩＥｐＣ＿９０１２８０１．２、ＨＰＩＥｐＣ＿９０４１５０３．２、ＨＲＣＥｐｉＣ、ＨＲＥ、ＨＲＧＥＣ、ＨＲＰＥｐｉＣ、ＨＳａＶＥＣ、ＨＳａＶＥＣ＿００２２２０２．１６、ＨＳａＶＥＣ＿９１００１０１．１５、ＨＳＭＭ、ＨＳＭＭ＿ｅｍｂ、ＨＳＭＭ＿ＦＳＨＤ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ＿ｅｍｂ、ＨＳＭＭｔｕｂｅ＿ＦＳＨＤ、ＨＴ−１０８０、ＨＴＲ８ｓｖｎ、Ｈｕｈ−７、Ｈｕｈ−７．５、ＨＶＭＦ、ＨＶＭＦ＿６０９１２０３．３、ＨＶＭＦ＿６１００４０１．３、ＨＷＰ、ＨＷＰ＿００９２２０５、ＨＷＰ＿８１２０２０１．５、ｉＰＳ、ｉＰＳ＿ＣＷＲＵ１、ｉＰＳ＿ｈＦｉｂ２＿ｉＰＳ４、ｉＰＳ＿ｈＦｉｂ２＿ｉＰＳ５、ｉＰＳ＿ＮＩＨｉ１１、ｉＰＳ＿ＮＩＨｉ７、Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋｉｄｎｅｙ＿ＢＣ、Ｋｉｄｎｅｙ＿ＯＣ、ＬＨＣＮ−Ｍ２、ＬＨＳＲ、Ｌｉｖｅｒ＿ＯＣ、Ｌｉｖｅｒ＿ＳＴＬ００４、Ｌｉｖｅｒ＿ＳＴＬ０１１、ＬＮＣａＰ、Ｌｏｕｃｙ、Ｌｕｎｇ＿ＢＣ、Ｌｕｎｇ＿ＯＣ、Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ＿ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅ、Ｍ０５９Ｊ、ＭＣＦ１０Ａ−Ｅｒ−Ｓｒｃ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｍｅｄｕｌｌｏ、Ｍｅｄｕｌｌｏ＿Ｄ３４１、Ｍｅｌ＿２１８３、Ｍｅｌａｎｏ、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ＣＤ１４＋、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ＣＤ１４＋＿ＲＯ０１７４６、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ−ＣＤ１４＋＿ＲＯ０１８２６、ＭＲＴ＿Ａ２０４、ＭＲＴ＿Ｇ４０１、ＭＲＴ＿ＴＴＣ５４９、Ｍｙｏｍｅｔｒ、Ｎａｉｖｅ＿Ｂ＿ｃｅｌｌ、ＮＢ４、ＮＨ−Ａ、ＮＨＢＥ、ＮＨＢＥ＿ＲＡ、ＮＨＤＦ、ＮＨＤＦ＿００６０８０１．３、ＮＨＤＦ＿７０７１７０１．２、ＮＨＤＦ−Ａｄ、ＮＨＤＦ−ｎｅｏ、ＮＨＥＫ、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２＿５０７１３０２．２、ＮＨＥＭ．ｆ＿Ｍ２＿６０２２００１、ＮＨＥＭ＿Ｍ２、ＮＨＥＭ＿Ｍ２＿７０１１００１．２、ＮＨＥＭ＿Ｍ２＿７０１２３０３、ＮＨＬＦ、ＮＴ２−Ｄ１、Ｏｌｆ＿ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ、Ｏｓｔｅｏｂｌ、ｏｖｃａｒ−３、ＰＡＮＣ−１、Ｐａｎｃｒｅａｓ＿ＯＣ、ＰａｎＩｓｌｅｔＤ、ＰａｎＩｓｌｅｔｓ、ＰＢＤＥ、ＰＢＤＥＦｅｔａｌ、ＰＢＭＣ、ＰＦＳＫ−１、ｐＨＴＥ、Ｐｏｎｓ＿ＯＣ、ＰｒＥＣ、ＰｒｏｇＦｉｂ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ＿ＯＣ、Ｐｓｏａｓ＿ｍｕｓｃｌｅ＿ＯＣ、Ｒａｊｉ、ＲＣＣ＿７８６０、ＲＰＭＩ−７９５１、ＲＰＴＥＣ、ＲＷＰＥ１、ＳＡＥＣ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、Ｓｋｅｌｅｔａｌ＿Ｍｕｓｃｌｅ＿ＢＣ、ＳｋＭＣ、ＳＫＭＣ、ＳｋＭＣ＿８１２１９０２．１７、ＳｋＭＣ＿９０１１３０２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ＿ＲＡ、Ｓｍａｌｌ＿ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＿ＯＣ、Ｓｐｌｅｅｎ＿ＯＣ、Ｓｔｅｌｌａｔｅ、Ｓｔｏｍａｃｈ＿ＢＣ、Ｔ＿ｃｅｌｌｓ＿ＣＤ４＋、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ９８Ｇ、ＴＢＥＣ、Ｔｈ１、Ｔｈ１＿Ｗｂ３３６７６９８４、Ｔｈ１＿Ｗｂ５４５５３２０４、Ｔｈ１７、Ｔｈ２、Ｔｈ２＿Ｗｂ３３６７６９８４、Ｔｈ２＿Ｗｂ５４５５３２０４、Ｔｒｅｇ＿Ｗｂ７８４９５８２４、Ｔｒｅｇ＿Ｗｂ８３３１９４３２、Ｕ２ＯＳ、Ｕ８７、ＵＣＨ−１、Ｕｒｏｔｈｅｌｉａ、ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、およびＷＩ−３８を含めた、ＥＮＣＯＤＥ細胞株であり得る。

【0092】

キット
本明細書で提供されるのは、標的遺伝子の遺伝子発現を活性化させるために使用することができるキットである。キットは、上に記載した通りの、遺伝子発現を活性化させるための組成物、および前記組成物を使用するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は、包装材料に貼り付けることもできるし、パッケージ挿入物として含めることもできる。説明書は、一般的に、書面のまたは印刷された素材であるが、これに限定されない。こうした説明書を保管する、また、これらをエンドユーザーに伝えることが可能なあらゆる媒体が、本開示によって企図される。こうした媒体としては、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。

【0093】

遺伝子発現を活性化するための組成物は、改変されたＡＡＶベクターと、上に記載した通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子活性化系は、標的遺伝子のシス調節領域またはトランス調節領域と特異的に結合し、これを標的にする、上に記載した通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼを含むことができる。標的遺伝子の特定の調節領域と特異的に結合し、これを標的にするための、上に記載した通りのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアセチルトランスフェラーゼを、キットに含めることができる。

【実施例】

【0094】

先述のことは、例示の目的のために与えられ、かつ本発明の範囲を制限しない、次の実施例を参照することによって、より良く理解することができる。

【0095】

実施例１
方法および材料−活性化因子
細胞株および遺伝子導入。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙを通じて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ ＶＡ）から入手した。細胞を、１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加して３７℃および５％ ＣＯ₂に維持したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養した。遺伝子導入は、製造業者の説明書の通りに、３７５ｎｇのそれぞれのｄＣａｓ９発現ベクターおよび１２５ｎｇの等モルのプールされたまたは個々のｇＲＮＡ発現ベクター（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ．＃１１６６８０１９）と混合）を使用して、２４ウェルプレートにおいて実施した。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験については、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の説明書の通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、および３０μｇのそれぞれのｄＣａｓ９発現ベクター、および１０μｇの等モルのプールされたｇＲＮＡ発現ベクターを含む１５ｃｍディッシュ内で遺伝子導入させた。

【0096】

プラスミドコンストラクト。ｐｃＤＮＡ−ｄＣａｓ９^VP64（ｄＣａｓ９^VP64；Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃４７１０７）を使用した（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３−９７６（２０１３））。ＡｓｃＩ／ＰａｃＩ制限酵素部位を介してｄＣａｓ９^VP64からＶＰ６４エフェクタードメインを除去し、等温構築（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ）（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３４３−３４５（２００９））を使用し、製造業者の説明書（ＮＥＢ ｃａｔ．＃２６１１）の通りに、適切な配列を含有するアニーリングされたオリゴのセットを含めることによって、ｄＣａｓ９（エフェクターなし）に、ＨＡエピトープタグを添加した。ｐｃＤＮＡ−ｄＣａｓ９^FLp300（ｄＣａｓ９^FLp300）を、ｐｃＤＮＡ３．１−ｐ３００（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃２３２５２）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．２１：６５３９−６５４８（２００２））からの完全長ｐ３００を２つの別の断片で増幅させ、これらの断片を等温構築を介してｄＣａｓ９^VP64骨格にクローン化することによって作製した。ｄＣａｓ９^FLp300中の、また、前駆体（前駆物質）ｐｃＤＮＡ３．１−ｐ３００中の、ＨＡＴ Ｃｏｒｅ領域の外側に位置する完全長ｐ３００タンパク質（Ｌ５５３Ｍ）内の置換を、配列検証中に特定した。ｐｃＤＮＡ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}（ｄＣａｓ９^{p300 Core}）を、最初にｃＤＮＡからのヒトｐ３００のアミノ酸１０４８〜１６６４を増幅させ、次いで、得られたアンプリコンをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ^{p300 Core}）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ．＃Ｋ２７００）にサブクローン化することによって産生した。ＡｓｃＩ部位、ＨＡ−エピトープタグ、およびＰｍｅＩ部位を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ^{p300 Core}からのｐ３００ ＣｏｒｅのＰＣＲ増幅によって付加し、その後、このアンプリコンを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ^{p300 Core+HA}）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ．＃Ｋ２７００）にクローン化した。ＨＡタグされたｐ３００ Ｃｏｒｅを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ^{p300 Core+HA}からｄＣａｓ９^VP64骨格に、共通のＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ制限酵素部位を介してクローン化した。ｐｃＤＮＡ−ｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}（ｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}）を、特定の核酸変異を含むプライマーセットを用いるｄＣａｓ９^{p300 Core}からのｐ３００ Ｃｏｒｅの増幅によって、オーバーラップ断片で産生し、連結（ｌｉｎｋａｇｅ）ＰＣＲに引き続いて、共通のＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ制限酵素部位を使用してｄＣａｓ９^{p300 Core}骨格にクローン化した。すべてのＰＣＲ増幅は、Ｑ５ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ ｃａｔ．＃Ｍ０４９１）を使用して実施した。すべてのｄＣａｓ９コンストラクトのタンパク質配列を、図１５Ａ〜１５Ｊに示す。

【0097】

ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ、およびＯＣＴ４プロモーターｇＲＮＡプロトスペーサーは、これまでに記載されている（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３−９７６ （２０１３）；Ｈｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２：４３７５−４３９０ （２０１４））。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｄＣａｓ９^VP64（Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64）は、Ａｄｄｇｅｎｅ（プラスミド＃４８６７６）から入手した。Ｎｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、プライマーを用いてｄＣａｓ９^{p300 Core}からＨＡタグされたｐ３００ Ｃｏｒｅを増幅させて、等温構築（ＮＥＢ ｃａｔ．＃ ２６１１）を使用するＡｌｅＩ／ＡｇｅＩ消化Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64骨格にサブクローン化することを容易にすることによって作製した。ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^{p300 Core}ＴＡＬＥは、ｄＣａｓ９^{p300 Core}由来のＨＡタグされたｐ３００ Ｃｏｒｅドメインを、以前に公表された（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３−９７６ （２０１３））ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^VP64コンストラクトに、共通のＡｓｃＩ／ＰｍｅＩ制限酵素部位を介してサブクローン化することによって産生した。ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ標的部位を、表１に示す。

【0098】

【表1】

【0099】

ＩＣＡＭ１ ＺＦ^VP64およびＩＣＡＭ１ ＺＦ^{p300 Core}は、ｐＭＸ−ＣＤ５４−３１Ｏｐｔ−ＶＰ６４⁵⁴由来のＩＣＡＭ１ ＺＦを、等温構築（ＮＥＢ ｃａｔ．＃ ２６１１）を使用してｄＣａｓ９^VP64およびｄＣａｓ９^{p300 Core}骨格それぞれにサブクローン化することによって構築した。ＩＣＡＭ１ ＺＦコンストラクトのタンパク質配列を、図１６に示す。導入効率は、すべての実験において、ＰＬ−ＳＩＮ−ＥＦ１α−ＥＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２１３２０）とｇＲＮＡ空（ｅｍｐｔｙ）ベクターとの同時導入によって分析した場合に、決まって９０％超であった。すべての化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡを、ＮＥＢ ＢｂｓＩおよびＴ４リガーゼ（Ｃａｔ．＃ｓ Ｒ０５３９ ａｎｄ Ｍ０２０２）を使用して、わずかな改変を伴う発現（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３（２０１３））のためにｐＺｄｏｎｏｒ−ｐＳＰｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４７１０８）にアニーリングおよびクローン化した。Ｎｍ−ｄＣａｓ９ ｇＲＮＡオリゴを、公開されているＰＡＭ要件（ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）（Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６−１１２１（２０１３））を使用して合理的に設計し、次いで、ｐＺＤｏｎｏｒ−Ｎｍ−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ−ｈＵ６（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃６１３６６）に、ＢｂｓＩ部位を介してクローン化した。プラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅを通じて入手可能である（表２）。

【0100】

【表2】

【0101】

すべてのｇＲＮＡプロトスペーサー標的を、表３および４に列挙する。

【0102】

【表3】

【0103】

【表4】

【0104】

ウエスタンブロッティング。ＳＤＳ ＰＡＧＥのために２０μｇのタンパク質を乗せ、ウエスタンブロットのためにニトロセルロース膜に転写させた。一次抗体（α−ＦＬＡＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃Ｆ７４２５およびα−ＧＡＰＤＨ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔ．＃１４Ｃ１０）は、ＴＢＳＴ＋５％ミルクでの１：１０００希釈で使用した。二次α−ウサギＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ．＃Ａ６１５４）は、ＴＢＳＴ＋５％ミルクでの１：５０００希釈で使用した。ＥＣＬ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｃａｔ．＃１７０−５０６０）の添加後に膜を露光させた。

【0105】

定量逆転写ＰＣＲ。遺伝子導入細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．＃７４１３６）を使用してＲＮＡを単離し、５００ｎｇの精製されたＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．＃１１７５４）のための鋳型として使用した。リアルタイムＰＣＲを、ＰｅｒｆｅＣＴａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＦａｓｔＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．＃９５０７２）と、Ｃ１０００サーマルサイクラーを備えたＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。ベースライン減算曲線適合分析モード（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｅ）を使用してベースライン値を引き、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ ２．１を使用して閾値を自動的に算出した。結果は、ΔΔＣｔ法（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：１１０１−１１０８（２００８））を使用するＧＡＰＤＨ発現に対する標準化後の、対照ｍｏｃｋ導入細胞（ＤＮＡなし）を超える変化（倍）として表す。すべてのｑＰＣＲプライマーおよび条件を、表５に列挙する。

【0106】

【表5】

【0107】

ＲＮＡ−ｓｅｑ。１実験条件あたり３反復実験を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。遺伝子導入細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ．＃７４１３６）を使用してＲＮＡを単離し、１μｇの精製されたｍＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成およびライブラリ構築（ＰｒｅｐＸ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（Ｗａｆｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ．＃４０００３９）を使用）のための鋳型として使用した。ライブラリは、製造業者の説明書の通りに、Ａｐｏｌｌｏ ３２４リキッドハンドリングプラットフォーム（ｌｉｑｕｉｄ ｈａｎｄｌｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）を使用して調製した。インデックス付加されたライブラリを、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ２２００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、品質およびサイズ分布について確認し、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＫＫ４８３５）を使用するｑＰＣＲによって数量化し、その後、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ施設で多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）プーリングおよび配列決定を行った。ライブラリをプールし、次いで、５０ｂｐシングルエンドリードをＨｉｓｅｑ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定し、脱多重化（ｄｅ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）し、次いでＢｏｗｔｉｅ ２を使用してＨＧ１９トランスクリプトームと整列させた（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３５７−３５９（２０１２））。ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５：２０７８：２０７９（２００９））スイートを使用して、転写物量を算出し、ＤＥＳｅｑ２解析パッケージを使用して差次的発現をＲで決定した。多重仮説補正は、＜５％のＦＤＲを用いるＢｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇの方法を使用して実施した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、ＮＣＢＩ’ｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託されており、ＧＥＯ Ｓｅｒｉｅｓアクセッション番号ＧＳＥ６６７４２でアクセス可能である。

【0108】

ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、試験される各条件について生物学的３回反復試験で、１５ｃｍプレート中で、４種のＨＳ２エンハンサーｇＲＮＡコンストラクトと指示されたｄＣａｓ９融合体発現ベクターを同時導入した。細胞を、１％ホルムアルデヒド（最終濃度；Ｓｉｇｍａ Ｆ８７７５−２５ＭＬ）で室温で１０分間クロスリンクさせ、次いで、グリシンの添加（１２５ｍＭの最終濃度まで）によって反応を停止させた。Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ濃縮のために、各プレートから、〜２．５ｅ７細胞を使用した。クロマチンを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＸＬ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用して、２５０ｂｐという中間の断片サイズに剪断した。Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮は、５μｇのＡｂｃａｍ ａｂ４７２９および２００μｌのヒツジ抗ウサギＩｇＧ磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１２０３Ｄ）と共に、４℃で１６時間インキュベートすることによって実施した。ドデシル硫酸ナトリウムとの６５℃での一晩のインキュベーションによって、クロスリンクを反転させ、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＤＮＡ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡを精製した。Ｃ１０００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を備えたＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを使用するその後のｑＰＣＲ反応のために、１０ｎｇのＤＮＡを使用した。ベースライン減算曲線適合分析モード（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｏｄｅ）を使用してベースライン値を引き、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ ２．１を使用して閾値を自動的に算出した。結果は、ΔΔＣｔ法（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：１１０１−１１０８（２００８））を使用するβ−アクチン濃縮に対する標準化後の、ｄＣａｓ９と４種のＨＳ２ ｇＲＮＡを同時導入した細胞を超える変化（倍）として表す。すべてのＣｈＩＰ−ｑＰＣＲプライマーおよび条件を、表５に列挙する。

【0109】

実施例２
ｐ３００ ＨＡＴドメインとのｄＣａｓ９融合体は、標的遺伝子を活性化する。
完全長ｐ３００タンパク質を、ｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９^FLp300；図１Ａ〜１Ｂ）と融合させ、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ１（ＭＹＯＤ）、およびＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４（ＯＣＴ４）の内在性プロモーターを標的にする４種のｇＲＮＡとのヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性同時導入によるトランス活性化に関するその能力について分析した（図１Ｃ）。各プロモーターを標的にする４種のｇＲＮＡの組み合わせを使用した。ｄＣａｓ９^FLp300は、十分に発現され、ＶＰ６４酸性活性化ドメイン（ｄＣａｓ９^VP64）と融合された基本のｄＣａｓ９活性化因子と比較して、バックグラウンドを超える中程度の活性化を誘発した（図１Ａ〜１Ｃ）。完全長ｐ３００タンパク質は、主としてその終端を介して多数の内在性タンパク質と相互作用する、見境なしのアセチルトランスフェラーゼである。これらの（ｔｈｅｓｅ）相互作用を弱めるために、ｐ３００ ＨＡＴ ｃｏｒｅドメイン（ｐ３００ Ｃｏｒｅ）として公知である、もっぱら固有のＨＡＴ活性のためだけに必要とされる完全長ｐ３００（２４１４ ａａ）の近接領域（アミノ酸１０４８〜１６６４）を単離した。ｄＣａｓ９のＣ末端と融合される場合（ｄＣａｓ９^{p300 Core}、図１Ａ〜１Ｂ）、ｐ３００ Ｃｏｒｅドメインは、内在性ｇＲＮＡに標的にされるプロモーターからの高レベルの転写を誘発した（図１Ｃ）。ＩＬ１ＲＮおよびＭＹＯＤプロモーターを標的にする場合、ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合体は、ｄＣａｓ９^VP64よりも有意に高いレベルのトランス活性化を呈した（Ｐ値 それぞれ０．０１９２４および０．０３２４；図１）。これらのｄＣａｓ９−エフェクター融合タンパク質は、同様のレベルで発現され（図１Ｂ、図７）、これは、観察される差の原因が、トランス活性化能力の差であったことを示している。さらに、エフェクター融合体が、ｇＲＮＡなしで導入された場合には、標的遺伝子発現に対する変化は観察されなかった（図８）。図８については、ｄＣａｓ９融合タンパク質は、空のｇＲＮＡベクター骨格を一過的に同時導入し、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ、およびＯＣＴ４のｍＲＮＡ発現を、本文に示すように分析した。赤い破線は、ＤＮＡなし−遺伝子導入細胞からのバックグラウンド発現レベルを示す。ｎ＝２（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．、分析されたいずれの標的遺伝子についても、有意な活性化は認められなかった。

【0110】

ｐ３００ Ｃｏｒｅアセチルトランスフェラーゼ活性が、ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合体を使用する遺伝子トランス活性化の原因であったことを確かめるために、一団のｄＣａｓ９^{p300 Core}ＨＡＴドメイン変異体融合タンパク質をスクリーニングした（図７）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}（ｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}のＨＡＴ ｃｏｒｅドメイン内の単一の不活性化アミノ酸置換（完全長ｐ３００のＷＴ残基Ｄ１３９９）（図１Ａ）は、融合タンパク質のトランス活性化能力をなくし（図１Ｃ）、これは、インタクトなｐ３００ Ｃｏｒｅアセチルトランスフェラーゼ活性が、ｄＣａｓ９^{p300 Core}介在性のトランス活性化に必要とされることを示した。

【0111】

実施例３
ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、近位および遠位エンハンサーから遺伝子を活性化する
ｐ３００が、内在性エンハンサーで役割を果たし、内在性エンハンサーに局在するので、ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、適切に標的化されるｇＲＮＡと共に、遠位調節領域からの転写を効率的に誘発することができる。ヒトＭＹＯＤ遺伝子座の遠位調節領域（ＤＲＲ）およびコアエンハンサー（ＣＥ）は、各領域を標的にする４種のｇＲＮＡとｄＣａｓ９^VP64またはｄＣａｓ９^{p300 Core}のいずれかとの同時導入によって標的化される（図２Ａ）。ｍｏｃｋ導入対照と比較して、ｄＣａｓ９^VP64は、ＭＹＯＤ ＤＲＲまたはＣＥ領域を標的にする場合に、いかなる誘発も示さなかった。対照的に、ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、対応するｇＲＮＡと共に、いずれかのＭＹＯＤ調節エレメントを標的にする場合に、有意な転写を誘発した（Ｐ値 ＣＥおよびＤＲＲ領域についてそれぞれ０．０１１５および０．０００９）。ヒトＯＣＴ４遺伝子の、上流の近位（ＰＥ）および遠位（ＤＥ）エンハンサー領域も、６種のｇＲＮＡとｄＣａｓ９^VP64またはｄＣａｓ９^{p300 Core}のいずれかとの同時導入によって標的化した（図２Ｂ）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、これらの領域からの有意な転写を誘発した（Ｐ値 ＤＥおよびＰＥについてそれぞれ≦０．０００１およびＰ値≦０．００３）のに対して、ｄＣａｓ９^VP64は、ＰＥまたはＤＥ領域のいずれかを標的にする場合に、バックグラウンドレベルを超えてＯＣＴ４を活性化することができなかった。

【0112】

十分に特徴付けられた哺乳類のβ−グロビン遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、下流のヘモグロビン遺伝子；ヘモグロビンε１（ＨＢＥ、〜１１ｋｂから）、ヘモグロビンγ１および２（ＨＢＧ、〜３０ｋｂから）、ヘモグロビンδ（ＨＢＤ、〜４６ｋｂから）、およびヘモグロビンβ（ＨＢＢ、〜５４ｋｂから）の転写を統制する（図２Ｃ）。β−グロビンＬＣＲ内のＤＮａｓｅ高感受性領域は、遠位標的遺伝子発現を調整する、ｐ３００を含めた転写モディファイヤーおよびクロマチンモディファイヤーのためのドッキング部位として働く。ＬＣＲエンハンサー領域（ＨＳ２エンハンサー）内のＤＮａｓｅ高感受性領域２を標的にする４種のｇＲＮＡを産生した。これらのＨＳ２を標的にする４種のｇＲＮＡを、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９^VP64、ｄＣａｓ９^{p300 Core}、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}と同時導入し、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、およびＨＢＢからの得られたｍＲＮＡ産生を分析した（図２Ｃ）。ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９^VP64、およびｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}は、ＨＳ２エンハンサーを標的にする場合に、いずれの下流遺伝子もトランス活性化することができなかった。対照的に、ｄＣａｓ９^{p300 Core}のＨＳ２エンハンサーへの標的化は、下流ＨＢＥ、ＨＢＧ、およびＨＢＤ遺伝子の有意な発現をもたらした（Ｐ値 ＨＢＥ、ＨＢＧ、およびＨＢＤについて、それぞれ≦０．０００１、０．００５６、および０．０００３（ ｄＣａｓ９^{p300 Core}とｍｏｃｋ導入細胞との間））。まとめると、ＨＢＤおよびＨＢＥは、ＨＳ２エンハンサーからの合成ｐ３００ Ｃｏｒｅ介在性活性化に対する反応性が比較的に低いように見え；発見は、いくつかの細胞株にわたるこれらの２遺伝子からの、より低い速度の一般的な転写と一致している（図９Ａ〜９Ｅ）。

【0113】

それにもかかわらず、最も遠位のＨＢＢ遺伝子を除いて、ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、分析されるすべての特徴付けられたエンハンサー領域を標的にする場合、下流遺伝子からの転写を活性化する能力、すなわちｄＣａｓ９^VP64については認められない能力を示した。まとめると、これらの結果は、ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、様々なプロモーター−近位およびプロモーター−遠位位置からの遺伝子発現を調節するために使用することができる、強力なプログラム可能な転写因子であることを実証する。

【0114】

実施例４
ｄＣａｓ９^{p300 Core}による遺伝子活性化は、高度に特異的である。
最近の報告によれば、ｄＣａｓ９は、いくつかのｇＲＮＡと組み合わせて、遺伝子発現のオフターゲット変化を潜在的にもたらす可能性がある、哺乳類細胞における広範なオフターゲット結合事象を有する可能性があることが示されている。ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合タンパク質の転写特異性を評価するために、４種のＩＬ１ＲＮ標的化ｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９^VP64、ｄＣａｓ９^{p300 Core}、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}のいずれかとを同時導入した細胞におけるＲＮＡ−ｓｅｑによって、トランスクリプトームプロファイリングを実施した。ゲノムワイドの転写変化を、エフェクタードメインが融合されていないｄＣａｓ９と、ｄＣａｓ９^VP64、ｄＣａｓ９^{p300 Core}、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}のいずれかとの間で比較した（図３）。ｄＣａｓ９^VP64とｄＣａｓ９^{p300 Core}は、どちらも、４種すべてのＩＬ１ＲＮアイソフォームを上方調節したが、ｄＣａｓ９^{p300 Core}の効果のみが、ゲノムワイドの有意性に到達した（図３Ａ〜３Ｂ、表６；ｄＣａｓ９^VP64についてはＰ値 １．０×１０^-3〜５．３×１０^-4；ｄＣａｓ９^{p300 Core}についてはＰ値 １．８×１０^-17〜１．５×１０^-19）。

【0115】

【表6】

【0116】

対照的に、ｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}は、いずれのＩＬ１ＲＮ発現も有意には誘発しなかった（図３Ｃ；４種すべてのＩＬ１ＲＮアイソフォームについてＰ値＞０．５）。ｄＣａｓ９との比較分析により、偽陽性率（ＦＤＲ）＜５％：ＫＤＲ（ＦＤＲ＝１．４×１０^-3）；およびＦＡＭ４９Ａ（ＦＤＲ＝０．０４）で、２つの転写物のみがバックグラウンドを超えて有意に誘発、限定されたｄＣａｓ９^{p300 Core}オフターゲット遺伝子導入が明らかにされた（図３Ｂ、表６）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}およびｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}を導入した細胞において、ｐ３００ ｍＲＮＡの発現の増大が認められた。この発見は、一過的に導入したｐ３００ ｃｏｒｅ融合ドメインからのｍＲＮＡに対するＲＮＡ−ｓｅｑリードマッピングによって説明される可能性が高い。このように、ｄＣａｓ９^{p300 Core}融合体は、高いゲノムワイドの標的化転写特異性と、４種すべての標的化ＩＬ１ＲＮアイソフォームの頑強な遺伝子導入を呈した。

【0117】

実施例５
ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、Ｈ３Ｋ２７をエンハンサーおよびプロモーターでアセチル化する
調節エレメントの活性は、アセチル化およびメチル化などの共有結合性のヒストン修飾と相関する。これらのヒストン修飾のうち、ヒストンＨ３上でのリジン２７のアセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）は、エンハンサー活性の最も広く記録された指標の一つである。Ｈ３Ｋ２７のアセチル化は、ｐ３００によって触媒され、また、内在性ｐ３００結合プロフィールと相関する。したがって、Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮を、ゲノム上の標的部位での相対的ｄＣａｓ９^{p300 Core}介在性アセチル化の尺度として使用した。ｄＣａｓ９^{p300 Core}によるＨ３Ｋ２７アセチル化を数量化するために、４種のＨＳ２エンハンサー標的化ｇＲＮＡと、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９^VP64、ｄＣａｓ９^{p300 Core}、またはｄＣａｓ９^{p300 Core(D1399Y)}のいずれかとを同時導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体を用いるクロマチン免疫沈降、それに続いて定量ＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を実施した（図４）。３つのアンプリコンを、ＨＢＥおよびＨＢＧ遺伝子のＨＳ２エンハンサー内またはプロモーター領域内の標的部位でまたは標的部位の周囲で、分析した（図４Ａ）。注目すべきことには、高レベルのグロビン遺伝子発現を有するヒトＫ５６２赤血球細胞株において、Ｈ３Ｋ２７ａｃは、これらの領域のそれぞれにおいて濃縮される（図４Ａ）。ＨＳ２エンハンサー標的遺伝子座で、ｄＣａｓ９^VP64（ＣｈＩＰ領域１についてＰ値０．００５６、およびＣｈＩＰ領域３についてＰ値 ０．００２９）を同時導入された試料と、ｄＣａｓ９^{p300 Core}（ＣｈＩＰ領域１についてＰ値 ０．００１３、およびＣｈＩＰ領域３についてＰ値 ０．００６９）を同時導入された試料との両方で、ｄＣａｓ９での処理と比較して有意なＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮が認められた（図４Ｂ）。

【0118】

ｄＣａｓ９^VP64またはｄＣａｓ９^{p300 Core}を用いてＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にする場合に、Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮の同様の傾向が認められた（図１０）。図１０は、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９上のＩＬ１ＲＮ遺伝子座を、ＩＬ１ＲＮ ｇＲＮＡ標的部位と共に示す。さらに、７細胞株（ＧＭ１２８７８、Ｈ１−ｈＥＳＣ、ＨＳＭＭ、ＨＵＶＥＣ、Ｋ５６２、ＮＨＥＫ、およびＮＨＬＦ）からのＥＮＣＯＤＥ Ｈ３Ｋ２７ａｃ濃縮の重ね合わせは、５０に設定した垂直範囲設定を用いて示す。ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９上の対応する位置に、タイル状のＩＬ１ＲＮ ＣｈＩＰ ｑＰＣＲアンプリコン（１〜１３）も示す。４種のＩＬ１ＲＮ標的化ｇＲＮＡを同時導入し、４種のＩＬ１ＲＮ標的化ｇＲＮＡを同時導入したｄＣａｓ９に対して標準化したｄＣａｓ９^VP64およびｄＣａｓ９^{p300 Core}についてのＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を、分析される各ＣｈＩＰ ｑＰＣＲ遺伝子座について示す。各反応のために、５ｎｇのＣｈＩＰ調製ＤＮＡを使用した（ｎ＝３（独立した実験）、エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．）。

【0119】

ｄＣａｓ９^VP64とｄＣａｓ９^{p300 Core}の両方による、標的部位でのＨ３Ｋ２７ａｃのこれらの増大とは対照的に、ＨＳ２調節されるＨＢＥおよびＨＢＧプロモーターでのＨ３Ｋ２７ａｃの強い濃縮は、ｄＣａｓ９^{p300 Core}処理でのみ観察された（図４Ｃ〜Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、ｇＲＮＡに標的にされる遺伝子座での、またエンハンサーに標的にされる遠位プロモーターでのＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を特異的に触媒することを実証する。したがって、ＨＳ２でｄＣａｓ９^{p300 Core}によって確立されるアセチル化は、ｄＣａｓ９^{p300 Core}によるがｄＣａｓ９^VP64によらないＨＳ２エンハンサーからのＨＢＥ、ＨＢＧ、およびＨＢＤ遺伝子の遠位活性化によって示される通り、ｄＣａｓ９^VP64による転写開始前複合体成分の直接的動員とは別の方式で、エンハンサー活性を触媒することができる（図２Ｃ、図９Ａ〜９Ｅ）。

【0120】

実施例６
ｄＣａｓ９^{p300 Core}は、単一のｇＲＮＡと共に遺伝子を活性化する
ｄＣａｓ９−エフェクター融合タンパク質を使用する頑強なトランス活性化は、現在、複数のｇＲＮＡ、複数のエフェクタードメイン、またはこれらの両方の適用に依存している。転写活性化は、単一のｄＣａｓ９−エフェクター融合体と連携する、単一のｇＲＮＡを使用して単純化することができるであろう。これはまた、別の標的遺伝子の多重化、および系への追加的機能性の組み込みを容易にするであろう。単一のｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９^{p300 Core}のトランス活性化の可能性を、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ、およびＯＣＴ４プロモーターを標的にする４種のプールされたｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９^{p300 core}のトランス活性化の可能性と比較した（図５Ａ〜５Ｂ）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と、試験される各プロモーターでの単一のｇＲＮＡとの同時導入時に、実質的な活性化が認められた。ＩＬ１ＲＮおよびＭＹＯＤプロモーターについては、プールされたｇＲＮＡと最も良い個々のｇＲＮＡとの間に有意差はなかった（図５Ａ〜５Ｂ；ＩＬ１ＲＮ ｇＲＮＡ「Ｃ」、Ｐ値 ０．７８；ＭＹＯＤ ｇＲＮＡ「Ｄ」、Ｐ値 ０．２６）。４種のｇＲＮＡが、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と共にプールされた場合、ＯＣＴ４プロモーターの活性化は、相加効果を生じたが、最も強力な単一のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ「Ｄ」）は、ｄＣａｓ９^VP64と４種すべてのプロモーターｇＲＮＡの等モルのプールとの同時導入時に認められる量に統計的に匹敵する量の遺伝子発現を誘発した（Ｐ値 ０．７３；図５Ｃ）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と比較して、ｄＣａｓ９^VP64および単一のｇＲＮＡでの遺伝子活性化のレベルは、実質的に低かった。また、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と対照的に、ｄＣａｓ９^VP64は、あらゆる場合において、ｇＲＮＡとの組み合わせで相乗効果を示した（図５Ａ〜５Ｃ）。

【0121】

エンハンサー領域での、また、プロモーター領域での単一のｇＲＮＡを伴う、ｄＣａｓ９^{p300 Core}のトランス活性化能力に基づくと、ｄＣａｓ９^{p300 Core}が、単一の標的化ｇＲＮＡを介してエンハンサーをトランス活性化できる可能性もあることが仮定される。ＭＹＯＤ（ＤＲＲおよびＣＥ）、ＯＣＴ４（ＰＥおよびＤＥ）、ならびにＨＳ２エンハンサー領域を、等モル濃度のプールまたは単一のｇＲＮＡと共に試験した（図５Ｄ〜５Ｇ）。両ＭＹＯＤエンハンサー領域については、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と単一のエンハンサーを標的にするｇＲＮＡとの同時導入は、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と４種のプールされたエンハンサーｇＲＮＡとを同時導入した細胞と同様のレベルまで遺伝子発現を活性化するのに十分であった（図５Ｄ）。同様に、ＯＣＴ４遺伝子発現も、６種のＰＥに標的にされるｇＲＮＡのプールを伴って局在化されたｄＣａｓ９^{p300 Core}と同様のレベルまで、単一のｇＲＮＡを伴うｄＣａｓ９^{p300 Core}局在化を介して、ＰＥから活性化された（図５Ｅ）。ＤＥからのＯＣＴ４（図５Ｅ）の、およびＨＳ２エンハンサーからのＨＢＥおよびＨＢＧ遺伝子（図５Ｆ〜５Ｇ）の、ｄＣａｓ９^{p300 Core}介在性の誘発は、単一のｇＲＮＡと比較して、プールされたｇＲＮＡを用いた場合に、発現の増大を示した。それでも、これらのエンハンサーで、いくつかの単一のｇＲＮＡについて、対照を超える標的遺伝子発現の活性化が存在した（図５Ｅ〜５Ｇ）。

【0122】

実施例７
ｐ３００ ＨＡＴドメインは、他のＤＮＡ結合タンパク質に移植可能である。
化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ系は、その頑強で、汎用性があり、かつ容易にプログラム可能な性質のおかげで、広く採用されている。しかし、他の種由来の直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ｄＣａｓ９系、ＴＡＬＥ、およびジンクフィンガータンパク質を含めたいくつかの他のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質も、様々な用途のために開発中であり、特定の用途にとって好ましいものであり得る。ｐ３００ Ｃｏｒｅ ＨＡＴドメインが、これらの他の系に移植可能であるかどうかを決定するために、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のｄＣａｓ９（Ｎｍ−ｄＣａｓ９）、４つの異なるＴＡＬＥを標的にするＩＬ１ＲＮプロモーター、およびジンクフィンガータンパク質を標的にするＩＣＡＭ１との融合体を作製した（図６）。Ｎｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}とＨＢＥまたはＨＢＧプロモーターを標的にする５種のＮｍ−ｇＲＮＡとの同時導入は、ｍｏｃｋ導入対照と比較して、有意な遺伝子導入をもたらした（Ｐ値 ＨＢＥおよびＨＢＧについて、それぞれ０．０３８および０．０１４１）（図６Ｂ〜６Ｃ）。ＨＳ２エンハンサーを標的にする５種のＮｍ−ｇＲＮＡを同時導入した場合、Ｎｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}はまた、ｍｏｃｋ導入対照と比較して、遠位ＨＢＥおよびＨＢＧ、グロビン遺伝子を有意に活性化した（それぞれｐ＝０．０１９２およびｐ＝０．０３９３）（図６Ｄ〜６Ｅ）。ｄＣａｓ９^{p300 Core}と同様に、Ｎｍ−ｄＣａｓ９^{p300 Core}も、単一のｇＲＮＡを介してプロモーターおよびＨＳ２エンハンサーからの遺伝子発現を活性化した。Ｎｍ−ｄＣａｓ９^VP64は、単一のまたは複数のｇＲＮＡと共に、プロモーター領域への、またはＨＳ２エンハンサーへの局在化にかかわらず、ＨＢＥまたはＨＢＧをトランス活性化する無視できる能力を呈した（図６Ｂ〜６Ｅ）。ＩＬ１ＲＮプロモーターを標的にする４種のＴＡＬＥ^{p300 Core}融合タンパク質（ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^{p300 Core}）の組み合わせに対する発現プラスミドの導入も、４種の対応するＴＡＬＥ^VP64融合体（ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥ^VP64）よりも低い程度ではあるが、下流遺伝子発現を活性化した（図６Ｆ〜６Ｇ）。しかし、単一のｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクターは、ＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥと融合された場合、単一のＶＰ６４ドメインよりもはるかに強力であった。興味深いことに、いずれかの単一の結合部位に誘導されるｄＣａｓ９^{p300 Core}は、単一のまたはプールされたＩＬ１ＲＮ ＴＡＬＥエフェクターに匹敵するＩＬ１ＲＮ発現をもたらし、直接的比較は、ｄＣａｓ９が、より大きなｐ３００ Ｃｏｒｅ 融合ドメインと融合された場合に、ＴＡＬＥよりも頑強な活性化因子であり得ることを示唆した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクタードメインは、追加的なｇＲＮＡまたはＴＡＬＥとの相乗作用も（図５、６、９、および１１参照）、ＶＰ６４との組み合わせでの相乗作用も（図１３Ａ〜１３Ｂ参照）呈さなかった。ｄＣａｓ９^{p300 Core}標的遺伝子座の基本的クロマチン状況を、図１４Ａ〜１４Ｅに示す。

【0123】

ＩＣＡＭ１プロモーターを標的にするＺＦ^{p300 Core}融合体（ＩＣＡＭ１ ＺＦ^{p300 Core}）も、対照と比較して、かつ、ＺＦ^VP64（ＩＣＡＭ１ ＺＦ^VP64）と同様のレベルで、その標的遺伝子を活性化した（図６Ｈ−６Ｉ）。複数の標的ドメインを有するｐ３００ Ｃｏｒｅ融合体の汎用性は、これが、標的化されたアセチル化および遺伝子調節のための確固たる手法であるという証拠である。ウエスタンブロットによって決定された通り、種々のｐ３００ ｃｏｒｅ融合タンパク質が十分に発現されたが（図１２Ａ〜１２Ｂ）、異なる融合タンパク質間のｐ３００ Ｃｏｒｅ活性の差は、結合親和性またはタンパク質フォールディングに起因する可能性がある。

【0124】

実施例８
ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）
ＭＹＯＣＤ遺伝子の−２０００ｂｐから＋２５０ｂｐ（ＴＳＳに対する座標）領域にわたる、３６種のｇＲＮＡを設計した（表７）。

【0125】

【表7】

【0126】

これらのｇＲＮＡを、ｈＵ６プロモーターとＢｂｓＩ制限酵素部位とを含有するｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ発現ベクターにクローン化した。これらのｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｄＣａｓ９^{p300 Core}と共に一過的に同時導入した。ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）に対する得られたｍＲＮＡ産生を、導入の３日後に回収した試料において分析した（図１７）。Ｃｒ３２、Ｃｒ１３、Ｃｒ３０、Ｃｒ２８、Ｃｒ３１、およびＣｒ３４とｄＣａｓ９^{p300 Core}との組み合わせを分析した（表８；図１８）。

【0127】

【表8】

【0128】

実施例９
Ｐａｘ７
ＰＡＸ７遺伝子を取り囲む領域にわたるｇＲＮＡを設計した（表９）。これらのｇＲＮＡを、ｈＵ６プロモーターとＢｂｓＩ制限酵素部位とを含有するｓｐＣａｓ９ ｇＲＮＡ発現ベクターにクローン化した。これらのｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｄＣａｓ９^{p300 Core}またはｄＣａｓ９^VP64と共に一過的に同時導入した。Ｐａｘ７に対する得られたｍＲＮＡ産生を、導入の３日後に回収した試料において分析した（図１９）。さらなる実験においてｇＲＮＡ１９（「ｇ１９」）を使用し、これが、ＤＮａｓｅ高感受性領域（ＤＨＳ）に局在することが示された（図２０）。

【0129】

【表9】

【0130】

実施例１０
ＦＧＦ１
ＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃ遺伝子について、ｇＲＮＡを設計した（表１０および１１）。２５ｎＭのこれらのｇＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｄＣａｓ９^{p300 Core}またはｄＣａｓ９^VP64と共に一過的に同時導入した。ＦＧＦ１発現に対する得られたｍＲＮＡ産生を決定した（図２１〜２３）。図２３では、レンチウイルスベクターを導入した安定な細胞株の数は、ｎ＝１であるＦＧＦ１Ａを除いて、２であった。

【0131】

【表10】

【0132】

【表11】

【0133】

前述の詳細な説明および付随する実施例は、単に実例に過ぎず、本発明の範囲への制限と受け取るべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されることが理解されよう。

【0134】

開示された実施態様に対する様々な変更および改変は、当業者には明らかであろう。限定はされないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用の方法に関するものを含めた、こうした変更および改変を、その趣旨および範囲から逸脱せずに行うことができる。

【0135】

完全性の理由から、本発明の種々の態様を、次の番号付けした条項で提示する：

【0136】

第１項．第１のポリペプチドドメインが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）関連（Ｃａｓ）タンパク質を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、ヒストンアセチル化酵素活性を有するペプチドを含む、２つの異種のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質。

【0137】

第２項．標的遺伝子の転写を活性化する、第１項に記載の融合タンパク質。

【0138】

第３項．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９を含む、第１項または２項に記載の融合タンパク質。

【0139】

第４項．Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性をノックアウトする少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、第３項に記載の融合タンパク質。

【0140】

第５項．Ｃａｓタンパク質が、配列番号１または配列番号１０を含む、第４項に記載の融合タンパク質。

【0141】

第６項．第２のポリペプチドドメインが、ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインを含む、第１〜５項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0142】

第７項．ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインが、ｐ３００ヒストンアセチル化酵素エフェクタードメインである、第６項に記載の融合タンパク質。

【0143】

第８項．第２のポリペプチドドメインが、配列番号２または配列番号３を含む、第１〜７項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0144】

第９項．第１のポリペプチドドメインが、配列番号１または配列番号１０を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、配列番号２または配列番号３を含む、第１〜８項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0145】

第１０項．第１のポリペプチドドメインが、配列番号１を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、配列番号３を含む、または、第１のポリペプチドドメインが、配列番号１０を含み、かつ第２のポリペプチドドメインが、配列番号３を含む、第１〜９項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0146】

第１１項．第１のポリペプチドドメインを第２のポリペプチドドメインと連結させるリンカーをさらに含む、第１〜１０項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0147】

第１２項．配列番号１４０、１４１、または１４９のアミノ酸配列を含む、第１〜１１項のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【0148】

第１３項．第１〜１２項のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、ＤＮＡターゲティング系。

【0149】

第１４項．少なくとも１つのｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフが後続する標的ＤＮＡ配列の１２〜２２塩基対の相補的ポリヌクレオチド配列を含む、第１３項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0150】

第１５項．少なくとも１つのｇＲＮＡが、標的領域を標的にし、標的領域が、標的エンハンサー、標的調節エレメント、標的遺伝子のシス調節領域、または標的遺伝子のトランス調節領域を含む、第１３または１４項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0151】

第１６項．標的領域が、標的遺伝子の遠位または近位のシス調節領域である、第１５項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0152】

第１７項．標的領域が、標的遺伝子のエンハンサー領域またはプロモーター領域である、第１５または１６項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0153】

第１８項．標的遺伝子が、内在性遺伝子または導入遺伝子である、第１５〜１７項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0154】

第１９項．標的領域が、標的エンハンサーまたは標的調節エレメントを含む、第１５項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0155】

第２０項．標的エンハンサーまたは標的調節エレメントが、２つ以上の標的遺伝子の遺伝子発現を制御する、第１９項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0156】

第２１項．ＤＮＡターゲティング系が、１から１０個の異なるｇＲＮＡを含む、第１５〜２０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0157】

第２２項．ＤＮＡターゲティング系が、１個のｇＲＮＡを含む、第１５〜２１項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0158】

第２３項．標的領域が、標的遺伝子と同じ染色体上に位置する、第１５〜２２項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0159】

第２４項．標的領域が、標的遺伝子の転写開始点の約１塩基対から約１００，０００塩基対上流に位置する、第２３項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0160】

第２５項．標的領域が、標的遺伝子の転写開始点の１０００塩基対から約５０，０００塩基対上流に位置する、第２４項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0161】

第２６項．標的領域が、標的遺伝子と異なる染色体上に位置する、第１５〜２２項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0162】

第２７項．異なるｇＲＮＡが、異なる標的領域に結合する、第１５〜２８項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0163】

第２８項．異なるｇＲＮＡが、異なる標的遺伝子の標的領域に結合する、第２７項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0164】

第２９項．２つ以上の標的遺伝子の発現が、活性化される、第２７項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0165】

第３０項．標的遺伝子が、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ１、ＯＣＴ４、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、ＨＢＢ、ＭＹＯＣＤ、ＰＡＸ７、ＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃからなる群から選択される、第１５〜２９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0166】

第３１項．標的領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子座のＨＳ２エンハンサー、ＭＹＯＤ遺伝子の遠位調節領域（ＤＲＲ）、ＭＹＯＤ遺伝子のコアエンハンサー（ＣＥ）、ＯＣＴ４遺伝子の近位（ＰＥ）エンハンサー領域、またはＯＣＴ４遺伝子の遠位（ＤＥ）エンハンサー領域のうちの少なくとも１つである、第３０項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0167】

第３２項．ｇＲＮＡが、配列番号２３〜７３、１８８〜２２３、または２２４〜２５４のうちの少なくとも１つを含む、第１３〜３１項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系。

【0168】

第３３項．第１〜１２項のいずれか一項に記載の融合タンパク質または第１３〜３２項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング系をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【0169】

第３４項．第３３項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【0170】

第３５項．第３３項に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは第３４項のベクターを含む細胞。

【0171】

第３６項．第１〜１２項のいずれか一項に記載の融合タンパク質、第１３〜３２項に記載のＤＮＡターゲティング系、第３３項に記載の単離されたポリヌクレオチド、第３４項に記載のベクター、または第３５項に記載の細胞を含むキット。

【0172】

第３７項．細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する方法であって、細胞を、第１〜１２項のいずれか一項に記載の融合タンパク質、第１３〜３２項に記載のＤＮＡターゲティング系、第３３項に記載の単離されたポリヌクレオチド、または第３４項に記載のベクターと接触させることを含む方法。

【0173】

第３８項．細胞における標的遺伝子の遺伝子発現を活性化する方法であって、細胞を、ＤＮＡターゲティング系をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、ＤＮＡターゲティング系は、第１〜１２項のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、方法。

【0174】

第３９項．少なくとも１つのｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフが後続する標的ＤＮＡ配列の１２〜２２塩基対の相補的ポリヌクレオチド配列を含む、第３８項の方法。

【0175】

第４０項．少なくとも１つのｇＲＮＡが、標的領域を標的にし、標的領域が、標的遺伝子のシス調節領域またはトランス調節領域である、第３８または３９項に記載の方法。

【0176】

第４１項．標的領域が、標的遺伝子の遠位または近位のシス調節領域である、第４０項に記載の方法。

【0177】

第４２項．標的領域が、標的遺伝子のエンハンサー領域またはプロモーター領域である、第４０または４１項に記載の方法。

【0178】

第４３項．標的遺伝子が、内在性遺伝子または導入遺伝子である、第４０〜４２項に記載の方法。

【0179】

第４４項．ＤＮＡターゲティング系が、１から１０個の異なるｇＲＮＡを含む、第４３項に記載の方法。

【0180】

第４５項．ＤＮＡターゲティング系が、１個のｇＲＮＡを含む、第４３項に記載の方法。

【0181】

第４６項．標的領域が、標的遺伝子と同じ染色体上に位置する、第４０〜４５項に記載の方法。

【0182】

第４７項．標的領域が、標的遺伝子の転写開始点の約１塩基対から約１００，０００塩基対上流に位置する、第４６項に記載の方法。

【0183】

第４８項．標的領域が、標的遺伝子の転写開始点の１０００塩基対から約５０，０００塩基対上流に位置する、第４６項に記載の方法。

【0184】

第４９項．標的領域が、標的遺伝子と異なる染色体上に位置する、第４０〜４５項に記載の方法。

【0185】

第５０項．異なるｇＲＮＡが、異なる標的領域に結合する、第４０〜４５項に記載の方法。

【0186】

第５１項．異なるｇＲＮＡが、異なる標的遺伝子の標的領域に結合する、第５０項に記載の方法。

【0187】

第５２項．２つ以上の標的遺伝子の発現が、活性化される、第５１項に記載の方法。

【0188】

第５３項．標的遺伝子が、ＩＬ１ＲＮ、ＭＹＯＤ１、ＯＣＴ４、ＨＢＥ、ＨＢＧ、ＨＢＤ、ＨＢＢ、ＭＹＯＣＤ、ＰＡＸ７、ＦＧＦ１Ａ、ＦＧＦ１Ｂ、およびＦＧＦ１Ｃからなる群から選択される、第４０〜５２項に記載の方法。

【0189】

第５４項．標的領域が、ヒトβ−グロビン遺伝子座のＨＳ２エンハンサー、ＭＹＯＤ遺伝子の遠位調節領域（ＤＲＲ）、ＭＹＯＤ遺伝子のコアエンハンサー（ＣＥ）、ＯＣＴ４遺伝子の近位（ＰＥ）エンハンサー領域、またはＯＣＴ４遺伝子の遠位（ＤＥ）エンハンサー領域のうちの少なくとも１つである、第５３項に記載の方法。

【0190】

第５５項．ｇＲＮＡが、配列番号２３〜７３、１８８〜２２３、または２２４〜２５４のうちの少なくとも１つを含む、第３７〜５４項に記載の方法。

【0191】

第５６項．ＤＮＡターゲティング系が、ウイルス的または非ウイルス的に細胞に送達される、第３７〜５５項のいずれか一項に記載の方法。

【0192】

第５７項．細胞が、哺乳類細胞である、第３７〜５６項のいずれか一項に記載の方法。

【0193】

付属書類−配列

【0194】

化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４９Ａを伴う）（配列番号１）

【0195】

ヒトｐ３００（Ｌ５５３Ｍ変異を伴う）（配列番号２）

【0196】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号３）

【0197】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（Ｄ１３９９Ｙ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号４）

【0198】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（１６４５／１６４６ ＲＲ／ＥＥ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号５）

【0199】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（Ｃ１２０４Ｒ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号６）

【0200】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（Ｙ１４６７Ｆ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号７）

【0201】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（１３９６／１３９７ ＳＹ／ＷＷ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８−１６６４）（配列番号８）

【0202】

ｐ３００ Ｃｏｒｅエフェクター（Ｈ１４１５Ａ、Ｅ１４２３Ａ、Ｙ１４２４Ａ、Ｌ１４２８Ｓ、Ｙ１４３０Ａ、およびＨ１４３４Ａ変異を伴う配列番号２のａａ １０４８〜１６６４）（配列番号９）

【0203】

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９（Ｄ１６Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、およびＮ６１１Ａ変異を伴う）（配列番号１０）

【0204】

３Ｘ「Ｆｌａｇ」エピトープ（配列番号１１）
ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ

【0205】

核局在化配列（配列番号１２）
ＰＫＫＫＲＫＶＧ

【0206】

ＨＡエピトープ（配列番号１３）
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ

【0207】

ＶＰ６４エフェクター（配列番号１４）
ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬＧＳＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ

【図1A-1C】

【図2A-2C】

【図3A-3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B-4C】

【図4D】

【図5A-5B】

【図5C-5D】

【図5E-5G】

【図6A-6C】

【図6D-6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H-6I】

【図7A-7B】

【図7C】

【図8】

【図9A】

【図9B-9E】

【図10】

【図11A-11C】

【図12A-12B】

【図13A-13B】

【図14A-14B】

【図14C-14D】

【図14E】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図15G】

【図15H】

【図15I】

【図15J】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]