特許 6933393 皮膚異常の処置のための治療用化粧品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6933393

(24)【登録日】2021年8月23日

(45)【発行日】2021年9月8日

(54)【発明の名称】皮膚異常の処置のための治療用化粧品

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/42 20170101AFI20210826BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20210826BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20210826BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210826BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 8/65 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 8/98 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20210826BHJP

   A61K 8/06 20060101ALI20210826BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/42

   A61K47/36

   A61P17/02

   A61P17/00

   A61Q19/00

   A61K8/65

   A61K8/98

   A61K8/73

   A61K9/08

   A61K9/10

   A61K9/06

   A61K8/06

【請求項の数】10

【外国語出願】

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2019-157768(P2019-157768)

(22)【出願日】2019年8月30日

(65)【公開番号】特開2020-58785(P2020-58785A)

(43)【公開日】2020年4月16日

【審査請求日】2019年12月20日

(31)【優先権主張番号】16/123986

(32)【優先日】2018年9月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519315877

【氏名又は名称】マリン エッセンス バイオサイエンシズ コーポレーション オブ ユーエスエー

【氏名又は名称原語表記】Ｍａｒｉｎｅ Ｅｓｓｅｎｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＳＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110002468

【氏名又は名称】特許業務法人後藤特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ダニー チウ

(72)【発明者】

【氏名】セルジオ マドリガル カルバージョ

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００３−５１４８３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４８７４０１４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４４７４５７２（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０４５４６５３２（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Progress in Molecular and Subcellular Biology，Vol.39(echinodermata)，2005年，pp.221-250

【文献】 Marine Environmental Research，Vol.128，2017年，pp.46-57

【文献】 International Journal of Dentistry，Vol.2013, Article ID 521547，2013年，pp.1-13

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−Ａ６１Ｌ ３３／００

Ａ６１Ｋ ９／００−Ａ６１Ｋ ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−Ａ６１Ｋ ４７／６９

Ａ６１Ｋ ８／００−Ａ６１Ｋ ８／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コラーゲン増殖、瘢痕治癒、創傷治癒、肝斑および褐色斑の低減を促進するための治療用化粧品であって：
棘皮動物から単離される易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）およびキトサンであって、前記キトサンが前記ＭＣＴに静電結合してマトリックスを形成しており、前記キトサンおよびＭＣＴの前記マトリックスがＭＣＴ−キトサン複合体材料の形態である、易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）およびキトサン；ならびに
薬学的に許容可能な局所的キャリア
を含む、
治療用化粧品。

【請求項2】

前記薬学的に許容可能な局所的キャリアが溶液、懸濁液、液体、ゲル、軟膏剤、ローションまたはクリームからなる群から選択される、請求項１に記載の治療用化粧品。

【請求項3】

前記薬学的に許容可能な局所的キャリアがゲルである、請求項２に記載の治療用化粧品。

【請求項4】

前記薬学的に許容可能な局所的キャリアがクリームである、請求項２に記載の治療用化粧品。

【請求項5】

前記ＭＣＴは、ウニおよびナマコからなる群から選択される棘皮動物から単離されるＭＣＴである、請求項１に記載の治療用化粧品。

【請求項6】

前記ＭＣＴがコラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含む、請求項１に記載の治療用化粧品。

【請求項7】

前記ＭＣＴが、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型もしくはＸＩ型から、または、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型およびＸＩ型の２種以上の混合物からなる群から選択される線維状コラーゲンからなる、請求項１に記載の治療用化粧品。

【請求項8】

前記グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸から、または、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸の混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の治療用化粧品。

【請求項9】

ＭＣＴ対キトサンの質量比が、１０：９０、２０：８０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、８０：２０または９０：１０からなる群から選択される、請求項１に記載の治療用化粧品。

【請求項10】

前記ＭＣＴ−キトサン複合体が、ＭＣＴ中のＧＡＧとコラーゲンとの間に高分子電解質架橋構造を含み、キトサン上にＮ−グルコサミン単位を有する、請求項６に記載の治療用化粧品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月６日に出願した米国特許出願第１６／１２３，９８６号明細書の利益を主張すると共に、参照によりこの特許出願の全体を援用する。

【0002】

本発明の態様は、組織再生誘導（ＧＴＲ）のためのバイオマテリアルデバイスに関する。より具体的には、本発明の態様は、ＧＴＲを実施するための、易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）を含む組織スポンジ、創傷被覆材、美容用組成物および他のデバイス、ならびに、局所用組成物に関する。さらにより具体的には、本発明の態様は、ＧＴＲを実施するためのＭＣＴおよびキトサンバイオポリマー（ＣＨＴ）の複合体を含むデバイスに関する。本発明の態様はまた、ＧＴＲを促進するために、単独で、または、複合体として、バイオマテリアルデバイス中においてＭＣＴを適用することによる、火傷、創傷、潰瘍および他の病変、ならびに、関連する皮膚障害の処置に関する。本発明の態様はまた、美容用配合物中においてＭＣＴおよび／またはＭＣＴ−キトサン複合体を適用することによる、瘢痕および皮膚変色、褐色斑を含む変色などの皮膚異常の処置に関する。

【背景技術】

【0003】

天然のポリマーが、多くの薬学用途および医学デバイス技術において用いられてきている。１種の天然のポリマーであるキトサン（度々、本明細書においてＣＨＴと称される）が、ナノ粒子、微小球、ヒドロゲル、フィルム、繊維および錠剤の調製に用いられてきている。キトサンは、経口、経鼻、非経口、経皮および点眼配合物などの有望な薬物送達系の調製に用いられてきている。キトサンはまた、創傷被覆材および組織スポンジの調製にも用いられてきている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００４，１０４，６０１７−６０８４）。しかしながら、キトサン配合物および材料には、限定的な安定性、生分解性および引張強度を含む数多くの欠点がある。修飾キトサンおよび合成複合体材料などの材料がキトサンが評価されてきたものと同一の用途の多くについて試験されているが、しかしながら、これらの材料の多くが、不十分な生体適合性を含む同様の欠点を有している。

【0004】

従って、生体適合性および生分解性であると共に、ヒトおよび他の哺乳類の処置および治療における使用について好適な安定性および機械特性ならびに性能を有する新規材料に対する必要性が存在している。これらの新規材料および組成物は、キトサンのみの場合を超える、追加のおよび／または向上した生体適合性、高い安定性および向上した物理的および生物学的特性などの利点を有することが好ましいであろう。これらの材料が、組織スポンジ、創傷被覆材、美容用薬品、および／または、治療薬の送達系として使用可能であれば、バイオメディカルエンジニアリング、バイオマテリアルおよびティッシュエンジニアリングの領域における研究者のさらなる助けとなることであろう。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の実施形態は、生分解性および生体適合性の易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）およびＭＣＴ−キトサン複合体材料を提供する。これらの複合体は、ヒドロゲル、バイオフィルム、三次元スポンジおよびナノファイバーなどの多様な材料に形成可能である。ＭＣＴ−キトサン複合体材料は、公知のキトサン材料よりも強く、より良好な機械特性を有する。複合体のＭＣＴ構成成分によって、キトサン構成成分の抗菌性および止血性に対して、生体適合性、細胞付着性、物理的および化学的安定性、ならびに、向上した機械特性が加えられ、これにより、治療用途における複合体の有効性が顕著に高められる。

【0006】

従って、一態様において、本発明は、ＭＣＴを含む組成物、または、ＭＣＴおよびキトサン（ＣＨＴ）のマトリックスを提供するものであり、ここで、ＭＣＴは、海洋無脊椎動物から単離されるものである。マトリックス中において、ＣＨＴは、水素結合および双極子−双極子相互作用などの静電気的相互作用によってＭＣＴに結合して、ＭＣＴ−ＣＨＴ複合体材料を形成していてもよい。一態様において、ＭＣＴ−キトサン複合体は、ＭＣＴ中のＧＡＧとコラーゲンとの間に高分子電解質架橋構造、および、キトサン上におけるＮ−グルコサミン単位とのその相互作用を含む。易変性コラーゲン組織は、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含んでいることが可能である。

【0007】

一態様において、ＭＣＴは、コラーゲンおよびコンドロイチン硫酸を含んでいることが可能である。組成物、または、組成物の形成に用いられるＭＣＴは、Ｉ型コラーゲンから実質的に構成されていることが可能である。キトサンは、約６０％〜約９９％の脱アセチル化度を有していることが可能である。キトサンの平均分子量は、約２０ｋＤａ〜約４００ｋＤａであることが可能である。いくつかの実施形態において、複合体材料中におけるＭＣＴの質量比は、複合体材料中のキトサンの質量比を基準として１００：０〜１０：９０であることが可能である。いくつかの実施形態において、ＭＣＴの質量比は、キトサンの質量比を基準として約１００：０〜５０：５０である。

【0008】

適切な海洋無脊椎動物供給源（例えば、スポンジ、クラゲ、軟体動物および棘皮動物）および単離法を選択することにより、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを高い収率で伴って得られるＭＣＴの量および割合は制御可能である。例えば、Ｉ型コラーゲンを高含有量で含むＭＣＴ（数々の結合組織の重要な構造組成物であるコラーゲンの線維型）を単離可能であり、また、本明細書に記載の組成物において使用可能である。さらに、単離されたＭＣＴは、線維状コラーゲンの型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ）およびグリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸）、ならびに、これらの構造不均一性の性質の観点で偏りがあることも、または、制御されていることも可能である。

【0009】

一実施形態において、ＭＣＴは、スポンジ、クラゲ、軟体動物および棘皮動物などの海洋無脊椎動物から単離されることが可能である。さらなる特定の実施形態において、ＭＣＴは、ウニおよびナマコなどの海洋無脊椎棘皮動物から単離されるであろう。さらなる特定の実施形態において、ＭＣＴはナマコから単離されるであろう。

【0010】

他の実施形態において、ＭＣＴは、コラーゲンから組成されていることが可能である。さらなる特定の実施形態において、コラーゲンは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶまたはＸＩ型線維状コラーゲンであることが可能である。さらなる特定の実施形態において、線維状コラーゲンはＩ型である。本明細書に記載の単離プロセスによって、Ｉ型線維状コラーゲンは、選択的に単離することが可能である。

【0011】

他の実施形態において、ＭＣＴは、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含んでいることが可能である。いくつかの実施形態において、グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸および／もしくはデルマタン硫酸、または、両構成成分の混合物を含んでいることが可能である。他の実施形態において、ＭＣＴ中のグリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸および／もしくはヒアルロン酸、または、両構成成分の混合物を含んでいるであろう。

【0012】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン組成物は、ヒドロゲル、バイオフィルム、３Ｄスポンジまたはナノファイバーであることが可能である。ナノ粒子は、経口溶液、ＩＶ溶液またはエアロゾルなどの種々の治療薬送達系に配合することが可能である。バイオフィルムは、創傷治癒、表面コーティングまたは包装材材料に形成可能である。３Ｄスポンジは、ティッシュエンジニアリングおよび創傷被覆材テンプレートのためのものなどのスポンジとして使用可能である。ナノファイバーは、創傷被覆材テンプレートまたは表面コーティング剤として配合可能である。

【0013】

いくつかの実施形態において、ＭＣＴおよびＭＣＴ−ＣＨＴ複合体材料は、物理プロセスおよび／または化学プロセスによって架橋可能である。物理架橋は、放射線処理（ＵＶ、γ線）および／または熱処理によって達成可能である。化学架橋は、ＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体への架橋剤の添加により達成可能であり、架橋バイオマテリアルにおいて用いられる架橋剤の量は、ＭＣＴの含有量を基準として、約０．１〜約１．０％であることが可能である。使用可能である架橋剤としては、グルタルアルデヒド、エチル−ジメチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、リボフラビン、ゲニピン等が挙げられる。

【0014】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料はまた、向上した吸水度、熱安定性、蒸気透過性および細胞付着性を有する３Ｄスポンジのバイオフィルムとして配合されることが可能である。このような実施形態において、バイオフィルムおよび／または３Ｄスポンジは、ティッシュエンジニアリング用スポンジ、ならびに、手術および医療用途のための創傷被覆材テンプレートとして好適であろう。

【0015】

本発明の態様はまた、生理活性剤を哺乳動物に送達する方法を提供するものであり、本方法は、哺乳動物に、本明細書に記載のＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体材料を投与するステップを含む。ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料は、例えば薬物または栄養分といった生理活性剤を封入する、ナノ粒子、ナノファイバー、ヒドロゲル、バイオフィルムまたは３Ｄスポンジを形成することが可能である。配合物に組み込まれることが可能である薬物、ビタミンおよび栄養分の例としては、ω−３およびω−６脂肪酸を含む脂肪酸などの脂質、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅおよび／またはＫ）、抗生物質（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、バンコマイシン等）、生細胞（例えば乳酸菌、ビフィズス菌等）、有効な皮膚用化合物（例えば、レチノイン酸、トラネキサム酸、過酸化水素、ハイドロキノン、システアミン、アゼライン酸、チロシナーゼ阻害剤等）、β−カロチンおよび／またはアスコルビン酸などの微量栄養素、タンパク質、ならびに、ペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＭＣＴおよび他の栄養補助剤もまた、ＭＣＴ−キトサン複合体マトリックス中、または、ＭＣＴ−キトサン複合体マトリックスを含む組成物中に含まれていることが可能である。

【0016】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料は、構成成分の量ならびにＭＣＴおよび複合体材料の調製方法を変更することにより、種々の条件下で一連の割合で分解するよう調整が可能である。それ故、本発明の態様はまた、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料の調製方法を提供する。本発明の態様はさらに、ヒトなどの哺乳動物における、細菌性感染症および／または真菌性感染症、火傷、糖尿病性足病変および炎症性状態などの状態の処置に有用なバイオメディカルデバイスおよび医薬品を製造するための、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。

【0017】

さらなる態様において、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルは、ＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体を、特にこれらに限定されないが、溶液、懸濁液、液体、ゲル、軟膏剤、ローションまたはクリームを含む薬学的に許容可能な局所的キャリアと併せて用いる、コラーゲン増殖、瘢痕治癒、創傷治癒、肝斑および褐色斑の低減、ならびに、他の皮膚に関連する有益性を促進するための治療用化粧品または美容用薬品として提供されてもよい。

【0018】

以下の図面は本明細書の一部を構成するものであり、本発明の一定の実施形態または種々の態様をさらに実証するために含められている。いくつかの事例において、本発明の実施形態は、本明細書において提示されている発明を実施するための形態と組み合わせて、添付の図面を参照することにより最も良く理解することが可能である。記載および添付の図面は、本発明の一定の特定的な実施例、または、一定の態様を強調するものであり得る。しかしながら、実施例または態様の一部は、本発明の実施形態に係る他の実施例または態様と組み合わされて用いられてもよいことを、通常の当業者は理解するであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】図１Ａは、一般的なコラーゲン構造および一般的なＭＣＴ構造間における比較のための構造を示す。

【図1B】図１Ｂは、一般的なコラーゲン構造および一般的なＭＣＴ構造間における比較のための構造を示す。

【図2】図２はグリコサミノグリカンに係る一般的な構造を示す。

【図3A】図３Ａは、ウシコラーゲンおよびＭＣＴ間におけるコラーゲン線維構造の比較形態を示す。

【図3B】図３Ｂは、ウシコラーゲンおよびＭＣＴ間におけるコラーゲン線維構造の比較形態を示す。

【図4】図４はキトサンの一般的な構造を示す。

【図5A】図５Ａは、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体材料の生成に係る概略図である。

【図5B】図５Ｂは、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体材料の生成に係る概略図である。

【図6】図６は、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムの生成に係る概略図である。

【図7】図７は、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジの生成に係る概略図である。

【図8】図８は、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体ヒドロゲルの生成に係る概略図である。

【図9A】図９Ａは、ＭＣＴ−キトサンエレクトロスピニングによるナノファイバーの生成に係る概略図である。

【図9B】図９Ｂは、得られる実施形態に係るナノファイバーの写真である。

【図10A】図１０Ａは、ＭＣＴ−ＣＨＴ複合体バイオフィルムの機械特性に対する架橋剤（グルタルアルデヒド０．１％ ｖ／ｖ）の効果を示す。

【図10B】図１０Ｂは、実施形態に係るＭＣＴ−ＣＨＴ複合体バイオフィルムの膨潤挙動を示す。

【図11】図１１Ａ、図１１Ｂは、ＭＣＴ−キトサンバイオフィルムおよびその創傷被覆材テンプレートとしての潜在的な用途の図示的な描写を示す。図１１Ｃ、図１１Ｄは、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）における、エレクトロスピニングによるＭＣＴ−キトサン複合体ナノファイバーの形態的な特徴付けを示す。

【図12】図１２は、ＧＴＲ用途において用いられる異なるＭＣＴ−キトサン複合体材料の概略図である。

【図13】図１３Ａ−図１３Ｃは、実施形態に係る、異なるＭＣＴ／ＣＨＴ質量比で作成されたＭＣＴ−キトサン（ＭＣＴ／ＣＨＴ）複合体３Ｄスポンジの物理的外観を示す。

【図14】図１４は、異なるＭＣＴ／ＣＨＴ質量比で配合されたＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジに係るＴＧＡサーモグラムを示す。

【図15】図１５は、異なるＭＣＴ／ＣＨＴ質量比で配合された異なるＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジに係る吸水能を示す。

【図16】図１６Ａ（細胞加えず）は、ＭＣＴ−ＣＨＴ ３Ｄスポンジに対するＡＤＳＣ細胞の吸着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。図１６Ｂ（細胞追加）は、ＭＣＴ−ＣＨＴ ３Ｄスポンジに対するＡＤＳＣ細胞の吸着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。

【図17】図１７は、１５日間のインキュベーション期間の間、ＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジ上で培養したＡＤＳＣ細胞の増殖プロファイルを示す。

【図18】図１８は、異なるＭＣＴ−キトサン複合体の質量比で生成したエレクトロスピニングによる複合体ナノファイバー（ＥＳＮＦ）のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを示す。

【図19】図１９は、キトサン、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体に係るＴＧＡによる熱分析を示す。

【図20】図２０Ａは、キトサンのＳＥＭ顕微鏡写真であり、１０μｍのスケールバーを有する。図２０Ｂは、キトサンのＳＥＭ顕微鏡写真であり、２μｍのスケールバーを有し、ここで、丸はキトサンＥＳＮＦにおけるエレクトロスピニングプロセス不良に伴う液滴の存在を表し、これは、エレクトロスピニングによるナノファイバーを得るためのＭＣＴ−キトサン複合体の向上を示している。図２０Ｃは、キトサンのＳＥＭ顕微鏡写真であり、２００ｎｍのスケールバーを有し、ここで、丸はキトサンＥＳＮＦにおけるエレクトロスピニングプロセス不良に伴う液滴の存在を表し、これは、エレクトロスピニングによるナノファイバーを得るためのＭＣＴ−キトサン複合体の向上を示している。図２０Ｄは、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦのＳＥＭ顕微鏡写真であり、１０μｍのスケールバーを有する。図２０Ｅは、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦのＳＥＭ顕微鏡写真であり、２μｍのスケールバーを有する。図２０Ｆは、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦのＳＥＭ顕微鏡写真であり、２００ｎｍのスケールバーを有する。

【図21】図２１は、キトサン、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体ＥＳＮＦと共に共培養したＬ９２９線維芽細胞の増殖を示す。

【図22】図２２Ａは、７日間のインキュベーション後における、キトサンＥＳＮＦに対する細胞付着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。図２２Ｂは、７日間のインキュベーション後における、ＭＣＴ−キトサン複合体ＥＳＮＦに対する細胞付着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。図２２Ｃは、７日間のインキュベーション後における、ＭＣＴＥＳＮＦに対する細胞付着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。

【図23】図２３は、子ウシおよびニワトリから抽出したコラーゲンサンプルと比したＭＣＴに係る主なタンパク質バンドを表すゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。

【図24】図２４は、バッチ毎についてのＭＣＴに係るタンパク質バンドにおける一致性によって示される、ナマコからのＭＣＴ単離プロセスの有効性を示すゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。

【図25A】図２５Ａは、子ウシコラーゲンと比したＭＣＴコラーゲンのＦＴＩＲ−赤外線スペクトルを示すものであって、両方のサンプル間の化学構造の差異を示す。

【図25B】図２５Ｂは、バッチ毎についてのＭＣＴに係るＦＴＩＲ化学プロファイルにおける一致性によって示される、ナマコからのＭＣＴ単離プロセスの有効性を示す比較ＦＴＩＲスペクトルを示す。

【図26】図２６はコラーゲンサンプルの熱重量分析（ＴＧＡ）を示すものであって、ＭＣＴおよび子ウシコラーゲンサンプルの熱挙動における差異を示す。

【図27】図２７は、子ウシの皮膚から単離したウシコラーゲンと比した、ナマコから抽出した易変性コラーゲン組織に見出されるコラーゲン構造アミノ酸組成物の分布を示す。

【図28A】図２８Ａは、溶剤流延技術により生成したＭＣＴ−キトサン被覆材テンプレート（３Ｄスポンジ）の形態および間隙率を表す走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）画像である。

【図28B】図２８Ｂは、溶剤流延技術により生成したＭＣＴ−キトサン被覆材テンプレート（３Ｄスポンジ）の形態および間隙率を表す走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）画像である。

【図29A】図２９Ａは、エレクトロスピニング技術により生成したＭＣＴ−キトサンナノファイバー被覆材テンプレートの表面形態および構造を表す走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）画像である。

【図29B】図２９Ｂは、エレクトロスピニング技術により生成したＭＣＴ−キトサンナノファイバー被覆材テンプレートの表面形態および構造を表す走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）画像である。

【図30】図３０Ａおよび３０Ｂは、実施形態に係る瘢痕クリームを適用した効果を示すその前後の写真である。

【図31】図３１Ａおよび３１Ｂは、実施形態に係る瘢痕クリームを適用した効果を示す追加のその前後の写真である。

【図32】図３２Ａ−３２Ｃは、実施形態に係る瘢痕クリームを適用した効果を示すさらなるその前後の写真である。

【図33】図３３Ａおよび３３Ｂは、実施形態に係る瘢痕クリームを適用した効果を示すさらなるその前後の写真である。

【図34】図３４Ａ−３４Ｄは、実施形態に係る瘢痕クリームを適用した効果を示すさらなるその前後の写真である。

【図35】図３５Ａは、ＭＣＴ−ＣＨＴマトリックス構造を示す。図３５Ｂは、ＭＣＴ−ＣＨＴマトリックス構造を示す。図３５Ｃは、ＭＣＴ−ＣＨＴマトリックス構造を示す。

【図36】図３６は、創傷スポンジ、ならびに、実施形態に係るその特徴および特色を示す。

【図37】図３７は、実施形態に係る３Ｄスポンジの機能を示す。

【図38】図３８は、実施形態に係るデバイスの機能を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明の態様によれば、本出願には、易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）とキトサンとの組み合わせを含む生分解性で生体適合性の新規複合体材料が記載されている。ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体はきわめて多機能であり、皮膚パッチ、三次元スポンジ、生分解性縫合材、および、ティッシュエンジニアリングにおける細胞増殖用スポンジ、ならびに、組織再生用ヒドロゲルおよびバイオフィルムなどの様々な種類のバイオマテリアルに配合されることが可能である。

【0021】

さらに、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料はまた、向上した吸水度、熱安定性、蒸気透過性および細胞付着性を有する３Ｄスポンジのバイオフィルムとして配合されることが可能である。このような実施形態において、バイオフィルムおよび／または３Ｄスポンジは、ティッシュエンジニアリングにおける組織再生誘導のためのスポンジ、ならびに、手術および医療用途のための創傷被覆材テンプレートとして好適であろう。

【0022】

定義：本明細書において用いられるところ、一定の用語は以下の意味を有する。この明細書において用いられているすべての他の用語および句は、本技術分野における当業者が理解するであろう、その平易かつ通常の意味を有する。このような平易かつ通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ １４^th Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１などの技術用語辞書を参照することにより取得し得る。

【0023】

本明細書中における、「一実施形態」、「実施形態」、「例示的実施形態」等に対する言及は、記載されている実施形態が特定の態様、特色、構造、部分または特徴を含み得るが、すべての実施形態が必ずその態様、特色、構造、部分または特徴を含んでいるわけではないことを示している。しかも、これらのような句は、必ずしもそうとは限らないが、本明細書中の他の部分において参照されている同一の実施形態を参照していてもよい。さらに、特定の態様、特色、構造、部分または特徴が実施形態と関連して記載されている場合、明記されているか否かに関わらず、このような態様、特色、構造、部分または特徴を他の実施形態と関連して実施することは、通常の当業者の知識の範囲内である。

【0024】

「および／または」という用語は、この用語が付随しているある事項のいずれか１つ、ある事項のいずれかの組み合わせ、または、ある事項のすべてを意味する。

【0025】

単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上で別段の記載で明らかにされていない限りにおいて、複数形での言及を包含する。それ故、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」に対する言及は、複数のこのような化合物を包含し、従って、化合物Ｘ（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｘ）は複数の化合物Ｘを包含する。

【0026】

「約」という用語は、特定されている値の±５％、±１０％、±２０％または±２５％の変動値を指すことが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、「約５０」パーセントは、４５〜５５パーセントの変動値を含むことが可能である。整数の範囲については、「約」という用語は、列挙されている整数を超えるおよび／またはそれ未満の１つまたは２つの整数を含んでいることが可能である。本明細書において別段の記載が無い限りにおいて、「約」という用語は、個々の成分、組成物または実施形態に係る機能性の観点で均等である列挙されている範囲に近似する値（例えば重量パーセント）を含むことを意図している。加えて、列挙されている範囲（例えば、重量パーセント、炭素基等）は、範囲中における各特定の値、整数、小数または同一の値を含む。範囲等について本明細書において列挙されている特定の値は単なる例示であり；これらは、他の定義されている値、または、定義されている範囲中の他の値を排除するものではない。

【0027】

「１つ以上」という句は、特にその用法に係る文脈を読み取った場合には、当業者によって容易に理解される。例えば、フェニル環上の１つ以上の置換基とは、１〜５つ、または、例えばフェニル環が二置換である場合には１〜４つ以下を指す。

【0028】

「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」という用語は、例えば化学反応または物理的変化を、例えば溶液または他の反応混合物において生起させるために、分子レベルにおけるものを含めて、当てる行為、接触を行う行為、または、至近距離に近接させるもしくはきわめて近くに近接させる行為を指す。

【0029】

「有効量」とは一般に、所望の効果をもたらす量を意味する。従って、有効量は、疾病状態または処置される状態に係る処置の有効性を増強させるのに十分な投与量を意味する。それ故、有効量は、患者、疾病、および、実施されている処置に応じて様々である可能性がある。

【0030】

「患者」または「被験者」という用語は、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類およびヒトを含む哺乳動物などのいずれかの動物を指す。

【0031】

ＭＣＴへの言及において、「実質的にコラーゲンを含む」という句は、ＭＣＴが少なくとも線維状コラーゲンを含むことを意味する。例えば、ＭＣＴ線維状コラーゲンは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖおよび／またはＸＩ型コラーゲンを含んでいることが可能である。一態様において、ＭＣＴ線維状コラーゲンは、Ｉ型と特徴付けられるであろう。本明細書に記載の複合体に特定的に含まれるか、または、排除される可能性がある他の化合物としては、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖおよび／またはＸＩ型線維状コラーゲン、または、これらの組み合わせが挙げられる。「グリコサミノグリカン」という用語は、繰り返される二糖単位を含有する長鎖の分岐していない多糖類を含む分子を指し、例えば、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸および／またはデルマタン硫酸が含まれる。

【0032】

易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）：棘皮動物は、すべての海洋に広く生息している海洋無脊椎動物であり、数十年にわたって食物源とされている（例えばナマコおよびウニ）。これらは、易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）と呼ばれ、神経系制御下において受動的機械特性（剛性および粘度）を急速に変化させることが可能である特有の結合組織に関しても周知である。ＭＣＴは、棘皮動物の固有の特色であり、現存する５種の分類すべてにおいて記載されている（Ｉ．Ｃ．Ｗｉｌｋｉｅ，“Ｍｕｔａｂｌｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ”，Ｖ．Ｍａｔｒａｎｇａ（Ｅｄ．），Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｍａｒｉｎｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００５），ｐｐ．２２１−２５０）。易変性コラーゲン構造は、フィブリリン微細線維の弾性ネットワークによって束（繊維）に組織化されると共に、線維に結合して凝集させるグリコサミノグリカンからなる応力伝達マトリックスによって相互に結合された、非連続的なコラーゲン線維から構成される。この種の組織は、近年、ティッシュエンジニアリングおよび再生医学用途のための「スマートダイナミックバイオマテリアル」に対するインスピレーションの潜在的な供給源として提案されている（Ａ．Ｂａｒｂａｇｌｉｏ，Ｓ．Ｔｒｉｃａｒｉｃｏ，Ｃ．Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ，Ｄ．Ｆａｓｓｉｎｉ，Ａ．Ｐ．Ｌｉｍａ，Ａ．Ｒ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｃ．Ｃ．Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｍ．Ｓｕｇｎｉ，Ｆ．Ｂｏｎａｓｏｒｏ，Ｉ．Ｃ．Ｗｉｌｋｉｅ，Ｍ．Ｂａｒｂｏｓａ，Ｍ．Ｄ．Ｃａｎｄｉａ Ｃａｒｎｅｖａｌｉ，“Ｔｈｅ ｓｍａｒｔ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍｓ：ａ ｍａｔｅｒｉａｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｍｉｓｅ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｃａｈ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ．，５４（２０１３），ｐｐ．７１３−７２０；Ｃ．Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ，Ａ．Ｂａｒｂａｇｌｉｏ，Ｔ．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ，Ｖ．Ａｌｏｎｇｉ，Ｄ．Ｆａｓｓｉｎｉ，Ｅ．Ｃｕｌｌｏｒａ，Ｍ．Ｐａｔｒｕｎｏ，Ｆ．Ｂｏｎａｓｏｒｏ，Ｍ．Ａ．Ｂａｒｂｏｓａ，Ｍ．Ｄ．Ｃａｎｄｉａ Ｃａｒｎｅｖａｌｉ，Ｍ．Ｓｕｇｎｉ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｓｏｕｒｃｅ：ｔｈｅ ｓｅａ ｕｒｃｈｉｎ Ｐａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｌｉｖｉｄｕｓ”，Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，１２（２０１４），ｐｐ．４９１２−４９３３）。特に、ナマコメンブラン（周知のＭＣＴ）は、再生医学用途のための薄いメンブランを製造するための天然の線維状コラーゲンの持続可能で生体適合性の供給源を提供することが可能である。図１は、左側に一般的なコラーゲン構造（この場合はウシコラーゲンのもの）を示し、右側に、ＭＣＴの一般的な構造を示す。ＭＣＴの場合、図１における右側は、線維間マトリックス間およびコラーゲン線維間にプロテオグリカン−ＣＡＧ架橋を有する構造の一部の分解立体図を示す。

【0033】

「ブルーバイオマテリアル（ｂｌｕｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）」のうち、海洋無脊椎動物コラーゲンはそれ自体、もっとも一般的に用いられている哺乳動物に由来するコラーゲン（例えば図１の左側に示されているウシコラーゲン）に対する有効な代替とされている。哺乳動物に由来するコラーゲンは、食品、医薬品／栄養補助食品産業および化粧品などの大規模の用途から、細胞培養およびバイオメディカル／臨床用途などのより目的が定められた分野までの広い範囲のヒトを対象とした用途で日常的に採用されている。しかしながら、アレルギー問題、宗教的制約および社会的制約／ライフスタイルに関わる制約、疾病の伝染に関連する理由（例えばウシ海綿状脳症）、ならびに、組み換え技術にかかる高いコストのために、哺乳動物に代わるコラーゲン供給源が常に研究されている（Ｔ．Ｈ．Ｓｉｌｖａ，Ｊ．Ｍｏｒｅｉｒａ−Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｌ．Ｐ．Ｍａｒｑｕｅｓ，Ａ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ，Ｙ．Ｂａｙｏｎ，Ｒ．Ｌ．Ｒｅｉｓ，“Ｍａｒｉｎｅ ｏｒｉｇｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，１２（２０１４），ｐｐ．５８８１−５９０１）。

【0034】

その一般的な構造が以下の図２に示されているグリコサミノグリカンは、繰り返される二糖単位から構成される長鎖の分岐していない多糖類である。繰返し単位は、アミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトースアミン）を伴うウロン糖（グルクロン酸またはイズロン酸）またはガラクトースから構成される。グリコサミノグリカンは極性が高く、水を引き寄せるものである。従って、これらは、主として細胞の表面上に、または、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に配置される潤滑剤または衝撃吸収材として、身体に有用である。

【0035】

棘皮動物ＭＣＴのさらなる利点は、本来の構造を維持したまま天然のコラーゲン線維を大量に入手することが比較的容易であることである（上記に引用されている、Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。実際に、ほとんどの哺乳類コラーゲンは通常、その加水分解された（酸可溶化）形態で利用され、製造されるメンブラン／スポンジの機械的性能は大きく低減してしまっているという特徴がある。そして、これが、三次元に組織化された線維を伴う高い耐性を有する材料が必要とされるバイオメディカル用途（例えば腱／靱帯再生または真皮再構築）における制限となる可能性がある。棘皮動物ＭＣＴは、結合組織の生理学的状況に対して超微細構造的および機械的特徴の両方の観点において高い類似性を有する線維状コラーゲンメンブランの容易かつ迅速な製造に有用である可能性がある。図３Ａおよび３Ｂは、ウシコラーゲン（図３Ａ）およびＭＣＴ（図３Ｂ）のコラーゲン線維構造の比較形態を示す。ＭＣＴ線維はＧＡＧ（グルコサミノグリカン）によって内部架橋されており、それ故、コラーゲンの巨大分子構造に高い安定性がもたらされて、その生分解性が低減されており、これは創傷治癒に係る重要な態様であって、ウシコラーゲンに欠如している性状である。図３５Ａ〜３５Ｃは、ＧＡＧによる線維の架橋を示す。図３５Ａは、コラーゲン線維の巨視的な配置を示すと共に、整列した線維構造が、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）とコラーゲンのコアタンパク質との間の相互作用による線維内架橋ネットワークによって一緒に維持されていることを図示している。図３５Ｂは、線維内架橋ネットワークをより詳細に表す。図３５Ｃは、インビボでの向上した機械的性能および生分解特性をもたらす、強固に組織化されたメッシュの多方向にわたる安定性を示す。

【0036】

ＭＣＴ線維状コラーゲンが商業用途に好適な特定の再生医学分野は、組織再生誘導（ＧＴＲ）である。ＧＴＲの目標の一つは、一般的であり、かつ、部分的にしか解消されていない、適切な組織の再生を妨げる合併症である術後の組織癒着を低減させることである。癒着は異常な付着であるか、または、手術後もしくは局所的な炎症による組織間もしくは組織間に形成される細胞の混合物である。ごく最近になってから、研究者らがこれらを克服する有効で満足なツールの作成の試行を行っている。実際に、数々の異なるバイオマテリアル（例えばキトサンおよびヒアルロン酸）を含むバリアメンブランがＧＴＲのために試験されているが、しかしながら、下位の解剖学的画分への細胞の浸透を防止するというもっとも重要なものを含む、必要とされる機能的特性のすべてを発揮したものはなかった（Ｓ．Ｔａｎｇ，Ｗ．Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｍａｏ，“Ａｇａｒｏｓｅ／ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｓ ａｎ ａｎｔｉ−ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｈｅｅｔ”，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．，２（２００７），ｐｐ．Ｓ１２９−Ｓ１３４）。棘皮動物ＭＣＴ系メンブランは、所望のとおり改変可能である間隙率および三次元構造を有している。

【0037】

キトサン：キチンは、ポリＮ−アセチルグルコサミンから組成されるバイオポリマーである。キチンは、セルロースに次いで地球上で２番目に豊富に存在するバイオポリマーである。これは通常、海洋性節足動物の殻などの多くの無脊椎動物の外骨格または角質の中、および、ほとんどの真菌類およびいく種かの藻類の細胞壁中に見出される。キチンは一般に不水溶性であるが、水酸化ナトリウムなどのカセイアルカリで処理することにより脱アセチル化して、可溶性のカチオン性多糖（キトサン）を形成することが可能である。キトサンの化学名は、ポリ（β−（１→４）−２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース）である。図４は、キトサンの一般的な化学構造を示す。

【0038】

最近、ＨｅｍＣｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のキトサン系の包帯および手術用被覆材が、ＭＲＳＡおよびアシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）を含む広い範囲の有害生物に対する抗細菌特性が証明された止血用包帯としての使用にＵ．Ｓ．ＦＤＡより承認された。これらの包帯および被覆材は、広範囲の動脈出血を含む出血を迅速に止めるために用いることが可能である。材料の血液凝固および抗細菌特性の両方が、キトサンに起因している可能性がある（本明細書において参照により援用されている、米国特許第７，４８２，５０３号明細書（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと）。ＭＣＴ−キトサン複合体材料をここに記載されている組成物中のキトサンの代わりに用いることが可能であり、その一方でなお、粘膜付着性、生体適合性および生分解性などのキトサンの有用な特徴は維持可能である。

【0039】

キトサンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯなどの多くの化学物質のサプライヤから市販されている。キトサンは、種々のグレード、平均分子量および脱アセチル化度で提供されている。

【0040】

いくつかの実施形態において、キトサンは、「高分子量」キトサンであることが可能である。高分子量キトサンとは、少なくとも約１００ｋＤａ、および、典型的には約１７０ｋＤａ〜約４００ｋＤａの数平均分子量を有するキトサンを指す。いくつかの実施形態において、高分子量キトサンは、少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約１１０ｋＤａ、少なくとも約１５０ｋＤａ、または、少なくとも約２００ｋＤａの分子量を有していることが可能である。他の実施形態において、高分子量キトサンは、約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１２０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１７０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１２０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１７０ｋＤａ〜約３００ｋＤａの分子量を有していることが可能である。図４中の「ＤＡ」の値は、本明細書に記載のキトサンのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有量に係る近似値がもたらされる任意の数または範囲であることが可能である。当業者によって容易に認識されるであろうとおり、図４に図示されているキトサンは部分的にアセチル化されていてもよい。

【0041】

他の実施形態は低分子量キトサンを含み得る。低分子量キトサンとは、１００単量体単位未満（約１８ｋＤａ未満または約２０ｋＤａ未満）のキトサン分子を指す。キトサンの分子量は、例えばゲルパーミエーションクロマトグラフィおよびキャピラリ粘度によって測定可能である。

【0042】

キトサンは、典型的には、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または、少なくとも約９９％の脱アセチル化度を有していることが可能である。代わりに、キトサンは完全に脱アセチル化されていることが可能である。

【0043】

ＭＣＴ−キトサン複合体材料：キトサンは、ＭＣＴおよびキトサン高分子量および荷電密度の両方のために、正電荷アミノ基によって生起される静電気的相互作用によってＭＣＴ中の構造構成成分に結合して、強固な水素結合および双極子−双極子相互作用を形成可能とする。これらの相互作用によって、ヒドロゲル、バイオフィルム、３Ｄスポンジおよびナノファイバーなどの安定なバイオマテリアルの形成が可能となる。ＭＣＴ−キトサン複合体材料をＧＴＲにおいて用いて、皮膚パッチ、美容用薬品、および、創傷治癒用途のための被覆材を調製することが可能である。ＭＣＴ−キトサン複合体材料はまた、ヒドロゲルもしくはスポンジ様材料、または、皮膚および軟骨組織培養のためのスキャフォールドとして、ティッシュエンジニアリングのためのマトリックスとして、ならびに、バイオメディカルデバイスのための生体適合性コーティングとして用いることが可能である。

【0044】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料は、公知の合成および動物コラーゲン系デバイスと比較して、高い生体適合性、向上した機械的性能、および、優れた生分解性をもたらすものである。ＭＣＴ−キトサン複合体に由来する直接的な生物学的効果（抗菌性、抗真菌性および創傷治癒特性）に追加して、バイオマテリアルは、標的化または徐放系のために、経口、経皮または呼吸器送達用に治療薬をカプセル化することが可能である。

【0045】

ナノ粒子およびバイオフィルムは、本明細書に記載のＭＣＴおよびキトサンから調製可能である。コラーゲンを含むＭＣＴがナノ粒子の調製に特に有用である。ＭＣＴは主に線維状コラーゲンを含むため、ＭＣＴは、ＭＣＴ−キトサン複合体ヒドロゲル、バイオフィルム、３Ｄスポンジおよびナノファイバーを調製して、公知の動物コラーゲン系バイオマテリアルと比較して優れた機械的性能を有している複合体バイオマテリアルをもたらすためにかなり好適である。

【0046】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルは、生物学的に適合性の架橋剤（グルタルアルデヒド、ＥＣＣ／ＮＨＳ）を伴う反応による化学処理によって、または、減圧下における熱処理によって、調製の最中に架橋することが可能である。複合体高分子マトリックスの膨潤は、より速い分解および機械特性の低下をもたらす可能性がある。架橋によって、複合体バイオマテリアルの自然発生的な膨潤が低減されるかまたは防止され、機械的性能および取り扱い性が向上する。

【0047】

いくつかの実施形態において、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料は、キトサンまたはＭＣＴ以外のポリマーを含んでいても、または、含んでいなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態は、デキストラン、アルギン酸塩、および／または、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース由来材料を含んでおり；他の実施形態では、これらのいくつかまたはすべてが排除されている。いくつかの実施形態は、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトンまたはポリエチレンオキシドなどの合成ポリマーを含んでおり、一方で、他の実施形態では、これらのいくつかまたはすべてが排除されている。

【0048】

ＭＣＴ、キトサンおよび複合生成物の分析：多様な方法を用いて、ＭＣＴ、キトサンおよびこれらの複合体生成物を分析および評価することが可能である。これらの技術は、複合体バイオマテリアルの、質量分光測定、機械特性（引張強度）および膨潤特性、表面形態を特徴づける走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）および原子間力顕微法（ＡＦＭ）、熱的特徴付けのための示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を含む。複合体バイオマテリアルの引張強度および膨潤特性はＡＳＴＭ計測で特徴付けた。

【0049】

本明細書に記載のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体の分析は、複合体材料が、キトサンのみを含む組成物と比較して、向上した安定性、高い薬物負荷容量、向上した薬物放出特性、向上した細胞摂取、大きい間隙率、向上した引張強度および熱安定性を有していることを示す。これらの材料はまたインビトロで非細胞障害性である。

【0050】

創傷治癒：ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルはまた、純粋なキトサンを基準として高い静菌活性、向上した生体適合性および高い機械特性を示すため、創傷治癒用途に有益な特性を有する。ＭＣＴ−キトサン複合体は、キトサン抗菌活性の上昇を示す。複合体は負電荷の細菌の表面に結合して、細胞膜に干渉する。これらの特性は、例えば潰瘍および火傷の治癒を促進するために、注射可能なヒドロゲル、皮膚パッチおよび創傷被覆材テンプレートを配合することによりＧＴＲ用途における使用に適用することが可能である。ＭＣＴ−キトサン複合体はまた、創傷および手術用被覆材における止血剤として使用可能である。

【0051】

ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルは、多様な他のバイオメディカル用途において使用可能である。良好な血液適合性、強化された機械的性能および細胞成長効率などの生体適合特性のために、ＭＣＴ−キトサン複合体は、手術用途および再生医学において使用可能である。ＭＣＴ−キトサン複合膜の浸透性は、プラズマ処理により制御が可能である。従って、このような複合膜は透析において使用可能である。

【0052】

上記の米国特許第７，４８２，５０３号明細書（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．）には、創傷被覆材の調製方法が記載されている。創傷被覆材は、Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．が記載しているキトサンバイオマテリアルの代わりに本明細書に記載のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料を用いる方法に従って調製可能である。さらに、ＭＣＴ−キトサン複合体は、有害なバイオフィルムの形成または患者における菌血症を予防するため、また、生体模倣および骨統合を促進するための、ステント、カテーテルおよび補てつ物などの医学デバイスのコーティングとして用いられることが可能である。キトサンへのＭＣＴ複合体生成は、コラーゲン線維における表面改質を促進して、ＳＥＭ顕微鏡写真に示されているとおり、その３Ｄスポンジスキャフォールドの間隙率を高める。ＭＣＴはまた、機械分析およびＤＳＣ熱量測定法によって示されるとおり、引張強度、膨潤度および熱安定性などのキトサンスキャフォールドの物理特性を向上させることが見出された。

【0053】

ティッシュエンジニアリング：ティッシュエンジニアリング（ＴＥ）リサーチは、多孔性生分解性ポリマーマトリックスへの細胞の播種に基づいている。播種が成功するための主な要因は、細胞が増殖および分化するための一時的なマトリックスまたはスキャフォールドとされる良好なバイオマテリアルの利用可能性である。近年において、キトサンおよびその誘導体は、これらは、最終的に炎症反応または有害な分解を伴うことなく、新たな組織が形成されるに伴って分解するために、スポンジ様材料に対する魅力的な候補であるとして報告されている。ＴＥ用途において、キトサンのカチオン性の性質が、アニオン性グリコサミノグリカン、プロテオグリカンおよび他の負電荷分子との静電気的相互作用に主に関与している。

【0054】

キトサンへのＭＣＴ複合体生成は、キトサンフィルムにおける表面改質を促進して、ＳＥＭ顕微鏡写真に示されているとおり、その３Ｄスポンジスポンジの間隙率を高める。ＭＣＴはまた、機械分析およびＤＳＣ熱量測定法によって示されるとおり、引張強度、膨潤度および熱安定性などのキトサンバイオフィルムの物理特性を向上させることが見出された。ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルは細胞の形態および機能の制御に用いられることが可能であり、従って、ＧＴＲに係る創傷治癒用途におけるティッシュエンジニアリングスキャフォールドまたはマトリックスとして用いられることが可能である。ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルはまた、ＴＥ用途のために化学的に改変可能である。例えば、複合体は、特定の糖質をＭＣＴ主鎖にグラフトすることにより改変可能である。一定の細胞は、特定の糖質を区別して認識することが可能であり、それ故、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞に対する特定の認識を示すことが可能である。

【0055】

美容用配合物：本発明はまた、治療用化粧品（美容用薬品）として用いられる本明細書に記載のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体を含む配合物を提供する。粉末または溶液形態のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体を基剤となる化粧品配合物に添加して、調合薬および／または機能性化粧品生成物を形成することが可能である。これらの美容用組成物は、特にこれらに限定されないが、溶液、懸濁液、液体、ゲル、軟膏剤、ローションもしくはクリームを含む皮膚学的および／または薬学的に許容可能な局所的キャリアと共に配合可能である。これらの組成物は、ＭＣＴおよびＣＨＴの組織中への持続的な放出をもたらして、コラーゲン増殖、瘢痕治癒、創傷治癒、黒皮病／褐色斑の低減または他の皮膚変色の低減、および、皮膚に対する他の有益性を促進する。

【0056】

化粧品組成物は、共に本明細書において参照により援用されている米国特許第９，９８０，８９４号明細書（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）および米国特許第９，９６２，４６４号明細書（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている技術などの、通常の当業者に公知である標準的な技術によって配合可能である。

【0057】

配合物に組み込むことが可能である薬物、ビタミンおよび栄養分の例としては、ω−３およびω−６脂肪酸を含む脂肪酸などの脂質、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅおよび／またはＫ）、水溶性ビタミン（例えば、ビタミンＣ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２）、抗生物質（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、ペニシリン、テトラサイクリン、バンコマイシン等）、生細胞（例えば乳酸菌、ビフィズス菌等）、有効な皮膚用化合物（例えばレチノイン酸、トラネキサム酸、過酸化水素、ハイドロキノン、システアミン、アゼライン酸、チロシナーゼ阻害剤等）、β−カロチンおよび／またはアスコルビン酸などの微量栄養素、タンパク質ならびにペプチドが挙げられる。

【0058】

このような組成物および調製は典型的には、少なくとも０．１％のＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体材料を含有する。組成物および調製の割合は当然様々であり得、簡便には、所与の単位剤形の重量の約２％〜約６０％であり得る。このような治療的に有用な組成物中のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料の量は、有効な投与量レベルが得られるようなものである。

【0059】

美容用組成物等はまた、以下を含有していてもよい：キサンタンガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどのバインダ；リン酸二カルシウムなどの賦形物；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等などの崩壊剤；および／または、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤。いくつかの特定の美容用組成物は、上記のタイプの材料に追加して、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体キャリアを含有していてもよい。液体キャリアまたはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒のグリセリルエステル、および、これらの好適な混合物を含む溶剤または液体分散媒体であることが可能である。例えば、分散体の場合には必要とされる粒径を維持することにより、または、界面活性剤を用いることにより、適切な流動度を維持することが可能である。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール等といった種々の追加の抗細菌剤および抗真菌剤によって、一定の微生物の活動を防止することが可能である。多くの事例において、例えば糖質、緩衝剤または塩化ナトリウムといった等張剤を含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった吸収を遅延させる薬剤を組成物において用いることにより達成可能である。当然のように、いずれかの単位剤形の調製に用いられる材料はいずれも、薬学的に許容可能であり、かつ、利用される量で実質的に無毒であるべきである。

【0060】

局所投与のために、ＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン複合体材料は、純粋な形態で適用され得る。しかしながら、固体であっても液体であってもよい皮膚学的および／または薬学的に許容可能な局所的キャリアと例えば組み合わせて、組成物または配合物として皮膚に投与されることが一般的に望ましいであろう。

【0061】

有用な固体キャリアとしては、タルク、クレイ、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等などの微細な固形分が挙げられる。有用な液体キャリアとしては、任意選択により無毒の界面活性剤を用いることによって、ＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体材料を有効なレベルで溶解または分散可能である、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール、または、グリコールもしくは水−アルコール／グリコールブレンドが挙げられる。芳香剤および追加の抗菌剤などの補助剤は、所与の使用について特性を最適化するために添加可能である。得られる液体組成物は、包帯および他の被覆材に含浸させるために用いられる吸収パッドから、または、ポンプ式もしくはエアロゾル式噴霧器を用いて患部に噴霧することで適用可能である。

【0062】

合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、修飾セルロースまたは修飾無機材料などの増粘剤を、液体キャリアと一緒に利用して、使用者の皮膚に直接適用するための延展可能なペースト、ゲル、軟膏剤、セッケン等を形成することも可能である。

【0063】

皮膚へのＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体材料の送達に使用可能である有用な外皮用組成物の例は技術分野において公知である；例えば、本明細書において参照によりそのすべてが援用されている、Ｊａｃｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）、および、Ｗｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照のこと。

【0064】

本発明の態様は、哺乳動物におけるＧＴＲに関連する種々の状態を処置する治療方法を提供するものであり、これは、このような状態を有する哺乳動物に、有効量の本発明の１つ以上の実施形態のＭＣＴまたはＭＣＴ−キトサン複合体を投与するステップを含む。哺乳動物としては、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギの等が挙げられる。

【0065】

以下の実施例は本発明の態様の例示を意図しており、本発明の範囲を狭めるよう解釈されるべきではない。通常の当業者は、本実施例は、本発明を実施可能である他の方法を示唆するものであると容易に認識するであろう。本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて数多くの変形および変更を成し得ることが理解されるべきである。

【実施例】

【0066】

実施例１．ＭＣＴ−キトサン複合体：調製、データおよび用途
薬学グレードのキトサン（¹Ｈ ＮＭＲによる算出で９２％の脱アセチル化度；特定の粘度測定法による算出で１８５ｋＤａの平均分子量）を、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。脱アセチル化度および平均分子量分布は、脱アセチル化度がより高くもしくは低く、および／または、平均分子量がより高くもしくは低くなるよう、キトサンを生成するためのＭＣＴ−キトサン複合体の生成において制御可能である。

【0067】

易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）を海洋無脊椎棘皮動物から単離した。ウニ、ヒトデおよびナマコの成体試料を、特に中国、タヒチおよび日本におけるスキューバダイバーにより収集し、直ぐに解剖した。ウニの囲口膜、ヒトデの異常な腕の壁部およびナマコの全身の壁部のサンプルを集め、以後の、Ｆｅｒｒａｒｉｏ Ｃ．，Ｌｅｇｇｉｏ Ｌ．，Ｌｅｏｎｅ Ｒ．，Ｄｉ Ｂｅｎｅｄｅｔｔｏ Ｃ．，Ｇｕｉｄｅｔｔｉ Ｌ．，Ｃｏｃｃｅ Ｖ．，Ａｓｃａｇｎｉ Ｍ．，Ｂｏｎａｓｏｒｏ Ｆ．，Ｌａ Ｐｏｒｔａ ＣＡＭ，Ｃａｎｄｉａ Ｃａｒｎｅｖａｌｉ ＭＤ，Ｓｕｇｎｉ Ｍ，“Ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｒｏｍ ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｍａｒ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｒｅｓ．Ｖｏｌｕｍｅ １２８，ｐｐ．４６−５７に記載されているコラーゲン抽出プロトコルのために−２０℃で保管した。動物の収集および実験の操作は、各国の法律および規則に則って行った。ウニ（囲口膜）およびヒトデ（異常な腕の壁部）は小片に切り分けし、人工海水ですすぎ、低張緩衝剤（１０ｍＭトリス、０．１％ＥＤＴＡ）中に１２時間、室温で（室温）で静置し、次いで、脱細胞化溶液（１０ｍＭトリス、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）中に１２時間、室温で静置した。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で数回洗浄した後、サンプルを脱凝集溶液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１Ｍ β−メルカプトエタノール、０．０５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａ）中に入れた。得られたＭＣＴ懸濁液をろ過し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ−Ｎａ溶液（ｐＨ８．０）に対して室温で３時間、および、ｄＨ₂Ｏに対して室温で一晩透析に供した。ヒトデサンプルは、脱細胞化と脱凝集溶液との間において、新鮮な組織中に存在する炭酸カルシウムの小骨を可能な限り除去するために、１ｍＭクエン酸（ｐＨ３〜４）中の追加のステップに供した。すべてのステップは撹拌条件下で実施した。ナマコＭＣＴを、異なるプロトコルに従って全身の壁部から抽出した。簡潔には、出発組織を小片に切断し、ＰＢＳおよびゲンタマイシン（４０μｇ／ｍＬ）中に入れ、撹拌条件下に室温で少なくとも５日間静置してＭＣＴ懸濁液を得、これをその後ろ過した。次いで、３つの実験モデルで得られた懸濁液を使用するまで−８０℃で保管した。

【0068】

ＭＣＴ−キトサン複合体の調製：易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）を室温で一晩かけて酢酸（０．５％ ｖ／ｖ）中に溶解し、脱気し、その後、キトサンとのバイオマテリアルおよび複合体を調製した。キトサン溶液を、キトサン粉末を酢酸水溶液（０．５％ ｖ／ｖ）中に室温で（室温）溶解することにより調製した。キトサン粉末が完全に溶解した後、この溶液を減圧ろ過によりろ過および脱気した。図５Ａは、実施形態に係るキトサン溶液の溶解および脱気を概略的に図示する。次いで、キトサン溶液（０．１〜０．５％ ｗ／ｖ）を、異なるＭＣＴ−ＣＨＴモル比（１００：０、８０：２０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、２０：８０および１０：９０）で、棘皮動物から単離したＭＣＴ（２．０〜１０．０％ ｖ／ｖ）と混合した。溶液を、撹拌しながら、室温で１時間反応に供した。図５Ｂは、実施形態に係るＭＣＴ−キトサン複合体の調製をさらに図示するものである。キトサンおよびＭＣＴの濃度は、異なる比のそれぞれの構成成分を添加することにより複合体材料を形成するプロセスにおいて制御して、所望の組成物を得た。

【0069】

ＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムの調製：ＭＣＴ−キトサン複合体溶液をガラスまたはケイ素製鋳型に流延し、ゆっくりと延展して均一な液体フィルムを形成した。次いで、液体フィルムを８０℃で２４時間、または、４０℃で一晩蒸発させて、２Ｄ流延複合体バイオフィルムを得た。図６は、実施形態に係るＭＣＴ−キトサンバイオフィルムを流延するステップを図示する。

【0070】

ＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジの調製：ＭＣＴ−キトサン３Ｄスポンジは、減圧下における熱処理により行われる架橋法によって調製される。複合体スポンジ（直径＝１２ｍｍ、厚さ＝６ｍｍ）を流延／凍結乾燥技術（ステップ３ｃ）により調製した。図７に図示のとおり、１グラムの水中の２％ ｗ／ｗキトサン溶液または酢酸中の０．５％ ｖ／ｖキトサン溶液をＭＣＴ水溶液（０．５〜２．５％ ｖ／ｖ）と混合した。得られた混合物を適当なサイズのガラスまたはケイ素製鋳型中に注ぎ入れ、−２０℃で凍結させ、凍結乾燥して溶剤を除去して、ＭＣＴ−キトサン多孔性３Ｄスポンジを得た。ＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジは公知のキトサンスポンジと物理的に類似している。しかしながら、複合体３Ｄスポンジは、高い保水性（膨潤）、向上した機械特性および優れた生体適合性などの追加の特性を顕著に有している。ＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジは、キトサンの止血効果がＭＣＴ構成成分の免疫抑制特性によって高められているために、例えば向上した創傷および止血（血液凝固）被覆材を提供するために使用可能である。ＭＣＴを添加することで、機械的性能、細胞付着性および成長もまた改善される。

【0071】

ＭＣＴ−キトサン複合体ヒドロゲルの調製：ＭＣＴ（２％ ｖ／ｖ）、キトサン（１％ ｗ／ｖ）複合体溶液を−２０℃で凍結させ、凍結乾燥して溶剤を除去して、粉末材料とした。図８に図示のとおり、２グラムの凍結乾燥したＭＣＴ−キトサン複合体を１００ｍＬの脱イオン水中に溶解し、ＮａＯＨ ６Ｎの濃縮溶液を滴下してｐＨを高めながら激しく撹拌した。一旦溶液が適当なｐＨ値（約７．２）に達したら、複合体ヒドロゲルが自然に形成され、分散体の粘度が顕著に増加した。他の実施形態において、ＭＣＴ−キトサンヒドロゲルはまた、高分子量（ＨＭＷ）キトサンの最終濃度を２〜１０％ ｗ／ｖに調節することにより、または、最終ＭＣＴ−キトサン複合体と、とりわけヒドロキシエチルセルロース、グリセロールまたはポリエチレングリコールなどの増粘添加剤とを混合することにより生成可能である。

【0072】

エレクトロスピニングによるＭＣＴ−キトサン複合体ナノファイバーの調製：図９Ａおよび９Ｂに図示のとおり、ＭＣＴ−キトサン不織ナノファイバーマットを、エレクトロスピニング技術により調製した。０．５〜２．０（％ｗ／ｖ）の範囲のキトサン濃度でＭＣＴ−キトサン複合体を脱イオン水中に溶解した。ＭＣＴ−キトサン複合体の濃度は、その粘度および伝導性がエレクトロスピニングに好適となるよう調節した。分散体は、エレクトロスピニング実験前に完全な水和のために、冷蔵庫（４℃）中に一晩静置した。最大せん断速度は、２．７８×１０^-10ｍ³／ｓの体積流量（Ｑ）および１ｍｍの管内径（Ｒ＝０．５×１０^-3ｍ）を有する管状の幾何学的形状の冪乗則材料に従っていた。エレクトロスピニングのためのＭＣＴ−キトサン複合体特性を向上するために、サンプルを、エレクトロスピニングアジュバントとしてポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と混合した。ＰＶＡ（１０％ ｗ／ｖ）は、８０℃で４時間激しく撹拌しながら水中に溶解した。ＭＣＴ−キトサン複合体およびＰＶＡブレンド分散体は、１００：００、６０：４０、５０：５０、４０：６０および０：１００質量比で混合した。ＭＣＴ−キトサン／ＰＶＡブレンドサンプル（５ｍＬ）は、エレクトロスピニングデバイスおよび３０−ｋＶの電源供給（Ｇａｍｍａ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒｍｏｎｄ Ｂｅａｃｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いてエレクトロスピニングした。ニードルチップとコレクタとの間の距離は２０ｃｍに設定し、電圧は２０ｋＶであり、溶液は１ｍＬ／時間で送出した。図９Ａにも図示のとおり、ナノファイバーをアルミニウムフォイル上に集め、さらなる特徴付けのためにデシケータ中において保管した。

【0073】

ＭＣＴ−キトサンバイオフィルムの特徴付け：ＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムの機械特性を、引張強度および膨潤挙動を比較することにより評価した。膨潤は、バイオフィルムの物理的分解における最初のステップである。急速な膨潤は、バイオフィルムマトリックスからの有効成分（例えば、薬物および／または有害生物防除剤）の急速で無制御な放出を促進させる。グルタルアルデヒドは通例、キトサンバイオフィルムの作成において膨潤速度を遅くするために架橋剤として添加される。ヒドロゲル配合物においてグルタルアルデヒドを用いる欠点は、バイオフィルムの引張強度の低減である。ＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムを既述の方法に従って流延した。加えて、架橋バイオフィルムを、先ず予め流延したキトサンまたはＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムをグルタルアルデヒド溶液（０．１０％ ｖ／ｖ）中に３０分間浸漬し、続いて、脱イオン水で徹底的に洗浄し、続いて、８０℃で２時間乾燥させることにより形成した。

【0074】

機械特性の評価：引張強度の計測を、汎用型の機械試験機（モデルＴＥＳＴ １０８，ＧＴ Ｔｅｓｔ製，Ｆｒａｎｃｅ，Ｔｅｓｔ Ｗｉｎｎｅｒ ９２０ソフトウェアを備えていた）により、１０ｍｍ／分間のクロスヘッド速度および２ｋＮ静負荷細胞で行った。バイオフィルムを、ダンベル型ナイフ（Ｈ３タイプ）から１７ｍｍ×４ｍｍ×０．０８ｍｍ（長さ×幅×厚さ）の寸法に標準的な引っ張り試験用サンプルを切り取った。各タイプのバイオフィルムについて少なくとも５つのサンプルを、５±３％ＲＨおよび湿度室中に２３±２℃（ＣＩＡＴ，Ｆｒａｎｃｅ）における好適な保管期間（３および２０週間）の後に試験した。最大引っ張り応力（ＴＳ）を、フィルムを破断させる最大負荷を断面積により除することにより算出した。ＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムは、単独のキトサンバイオフィルムよりも高い引張強度を示した。図１０Ａおよび１０Ｂは、キトサン単独（０：１００）と比した異なるＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルム（それぞれ、５０：５０および１００：０質量比）の機械的挙動を図示する。データは、［平均±ＳＤ；ｎ＝５］として示されている。非架橋のものと比較すると、架橋剤（グルタルアルデヒド）を添加するとすべてのバイオフィルムの引張強度が低下した。

【0075】

膨潤挙動の評価：キトサンおよびＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムの膨潤度を重量法により評価した。乾燥したバイオフィルムの各々を先ず分析用天秤（Ｗ_d）で計量した。計量の後、バイオフィルムを蒸留水中に室温で６０分間沈めた。次いで、バイオフィルムを水から取り出し、５、１０、２０、３０、４０、５０および６０分間で計量した（Ｗ_s）。高精密天秤で計量する前に、各バイオフィルムサンプルは水浴から素早く取り出し、過剰な水をティッシュペーパーで吸い取って除去した。計量した後、バイオフィルムを水中に戻した。次いで、各バイオフィルムサンプルの膨潤度（％）を以下の式に従って算出した。
膨潤度（％）＝［（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｓ］×１００

【0076】

結果は、ＭＣＴ−キトサン複合体バイオフィルムは、キトサンバイオフィルム単独と比して、膨潤速度が遅く、かつ、合計膨潤度が低いことを示す。図１０Ｂは、時間の関数としてＭＣＴ−キトサンヒドロゲルの膨潤度を図示する。

【0077】

これらの結果は、ＭＣＴ−キトサン複合体材料が強力な架橋剤またはその均等物として作用し、バイオフィルムの引張強度を向上させながら複合体材料の膨潤を低減することを示す。ＭＣＴによってもたらされる特性は、キトサンバイオフィルム中のグルタルアルデヒド架橋剤よりも優れていた。ＭＣＴは従って、パッケージング、パッチおよび手術用バイオマテリアル用のバイオフィルムを形成するためのグルタルアルデヒドに対する好適で、信頼性が高く、生体適合性である「環境に優しい代替物（ｇｒｅｅｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）」である。

【0078】

ＭＣＴ−キトサン複合体創傷被覆材テンプレート（バイオフィルム、３Ｄスポンジおよびエレクトロスピニングによるナノファイバー）の特徴付け：ＭＣＴ−キトサン複合体創傷被覆材テンプレート（バイオフィルム、３Ｄスポンジおよびエレクトロスピニングによるナノファイバー）は、減衰全反射フーリエ変換赤外分光法（Ｎｉｃｏｌｅｔ ４７００ ＡＴＲ ＦＴ−ＩＲ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いる化学プロファイル、および、熱重量分析（ＴＧＡ，Ｑ１００，ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｉｎｄｏｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）による熱特性に従って特徴付けた。熱分析（ＤＳｃおよびＴＧＡ）は、窒素雰囲気（２０ｍＬ／分）中において、２０〜４００℃の温度走査範囲にわたって５℃／分で行った。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＭＣＴ−キトサンバイオフィルムおよびその創傷被覆材テンプレートとしての潜在的な用途を図示する。ナノファイバーの形態を、ＳＥＭ（Ｌｅｏ １５３０−ＦＥ，Ｚｅｉｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて試験した。平均繊維径は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、ＳＥＭ画像中において少なくとも２０本の繊維を分析することにより測定した。図１１Ｃおよび１１Ｄは、表面形態を図示する。

【0079】

キトサンバイオマテリアルと比したＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルの利点：ＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアル（図１２）は、キトサンバイオマテリアルと比して多様な用途のための顕著に向上した特性を提供する。ＭＣＴ−キトサン複合体バイオマテリアルは、ナノ粒子、ヒドロゲル、バイオフィルム、３Ｄスポンジまたはエレクトロスピニングによるナノファイバーとして調製されることが可能である。バイオマテリアルのこれらの形態の各々は種々の対象用途に用いられることが可能であり、複合体バイオマテリアルの各々は、以下の表１にまとめられているとおり、キトサンバイオマテリアルを超える顕著な利点を有する。

【0080】

【表1】

【0081】

実施例２．ＧＴＲ、創傷治癒およびティッシュエンジニアリングにおける用途のためのＭＣＴ−キトサン複合体３Ｄスポンジ。
キトサン（ＣＨＴ）は、生体適合性および生体吸収性であると報告されている。特に、ＣＨＴは、良好な創傷治癒促進剤であると考えられている。他方で、コラーゲン（ＭＣＴ）は、ティッシュエンジニアリングにおいてもっとも広範に用いられているマトリックスバイオマテリアルの一種である。高度に多孔性であるＭＣＴ単成分３Ｄスポンジが多くの種類の組織のインビトロ成長を支持するために用いられてきた。ハイブリッド３Ｄスポンジバイオマテリアルを、ＣＨＴおよびＭＣＴ（ナマコ試料から単離した）を異なる質量比で混合し、溶剤流延および凍結乾燥を含む既述の方法を適用することにより作成した。ＭＣＴ／ＣＨＴハイブリッド３Ｄスポンジを、それらの吸水能、機械特性、熱挙動（ＴＧＡ）および形態（ＳＥＭ）に従って特徴付けた。ハイブリッド３Ｄスポンジは、単成分３Ｄスポンジと比して、向上した安定性、大きい間隙率、高い熱安定性および機械特性、ならびに、高い生分解性を示した。脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）との細胞培養インキュベーションおよびＳＥＭ画像化で、ＭＣＴ／ＣＨＴハイブリッド３Ｄスポンジによって、インビトロでのＡＤＳＣ付着、拡散および増殖が可能であることが示された。

【0082】

ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの作成：キトサン（ＣＨＴ、２．０％ ｗ／ｖ）を酢酸（０．１％ ｖ／ｖ）中に溶解し、コラーゲン水溶液（ＭＣＴ、５％ ｗ／ｖ）とゆっくりと混合して、それぞれ、ＭＣＴ−ＣＨＴ １００：０、８０：２０、６０：４０および５０：５０のモル比でハイブリッド溶液を生成した。ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジを、各溶液をガラス製の鋳型に注ぎ入れ、溶剤流延および４８時間凍結乾燥することにより作成した。さらなる特徴付けおよび細胞増殖研究、および、デシケータ中における制御された相対湿度での保管のために、これらのスポンジを小さなフラグメント（直径１２ｍｍおよび厚さ３ｍｍ）に切った。

【0083】

ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの物理的および化学的特徴付け：作成したハイブリッドスポンジの光学顕微鏡による画像を、倒立顕微鏡（ＬＩＢ−３０５，ＵＳＡ）により４×の倍率で集めた。ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの形態を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，ＪＳＭ−５２００，ＪＥＯＬ，ＵＳＡ）により２０ｋ×の倍率で試験した。各サンプルの傾斜角は３０度であった。熱重量分析（ＴＧＡ）をＴＧＡ−７機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）で行った。スポンジサンプル（５〜１０ｍｇ）をアルミニウムホルダに注ぎ入れ、窒素雰囲気下（１０ｍＬ／分）に、５０〜６００℃で設定した温度プログラムに従って１０℃／分の加熱速度で分析した。ＭＣＴ／ＣＨＴハイブリッド３Ｄスポンジの一軸機械圧縮テスト（ｎ＝５／状態）を、最大出力２５０Ｎの汎用型の引張り試験機（Ｔｅｎｓｉｌｏｎ ＲＴＧ，Ｊａｐａｎ）ロードセルを用いることにより、周囲条件（２０℃および５０％相対湿度、ＲＨ）で行った。圧縮（ｍｍ）および荷重（Ｎ）を５ｍｍ／分のクロスヘッド速度で収集した。圧縮弾性率を、圧縮曲線の初期線形領域における応力−ひずみ曲線の接線勾配として算出した。圧縮強度は、１５％ひずみで算出した（すべてのサンプルにおいて応力−ひずみ曲線が線形であった領域中）。乾燥３Ｄスポンジサンプルは、電子マイクロメータ（ＤＭＨ Ｓｅｒｉｅｓ ２９３，Ｍｉｔｏｔｏｙｏ，Ｊａｐａｎ）による計測で１２ｍｍの直径および３ｍｍの厚さを有する円柱形であった。

【0084】

細胞付着性および増殖研究：脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を生きているウマから単離した。ＡＤＳＣ（約１０⁵個の細胞／ｃｍ²）を、ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの各々の上に置いた。組織培養プレート（ポリスチレン）ウェルを対照として用いた。培養はインキュベータに１日間入れ、取り出してから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処理した。得られた溶解した細胞懸濁液のアリコートを、コールターカウンターマルチサイザー（Ｍｏｄｅｌ ０６４６，Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）でカウントした。直径８〜３２μｍ間のカウントのみを用いた。細胞増殖はまた、培養中において１、３、７および１０日後に上記のとおり細胞のカウントにより測定した。この実験においては、６つの複製サンプルを試験した。付着し、および／または、増殖したＡＤＳＣ細胞を、グルタルアルデヒド（２．５％ ｖ／ｖ）により、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中において３０分間固定し、次いで、０．１Ｍ ＰＢＳですすいだ。固定した細胞サンプルを凍結乾燥し、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ，Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍｏｄｅｌ Ｓ−２４６０Ｎ，Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）による形態分析のために金でスパッタコーティングした。

【0085】

データおよび統計分析：すべてのデータは、少なくとも３つの複製の平均±標準偏差として報告した。統計分析は、ｐ＝０．０５に設定したＪＭＰ Ｐｒｏ（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０．０；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて行った。独立した可変要素「サンプル」および「濃度」間の相互作用を含む二元ＡＮＯＶＡモデルで結果を分析して有意差を評価した。

【0086】

結果および考察
ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの物理的および化学的特徴付け：キトサンは、利用可能なアミンおよび水酸基によってもたらされる水素結合相互作用によってコラーゲンに物理的に結合する。この相互作用によって、ナノ粒子、バイオフィルム、バイオフォームおよび組織スポンジなどの安定なバイオマテリアルの形成が可能となる（Ｍａｄｒｉｇａｌ−Ｃａｒｂａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｂｉｏ−ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｎｔｏ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅｃｉｔｈｉｎ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ５（３）（２０１２）１９６−２０９；Ｍａｄｒｉｇａｌ−Ｃａｒｂａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｏａｄｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｎ ｅｇｇ−ｗｈｉｔｅ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｂｙ ｍｕｒｉｎｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ３（２）（２０１０）１７９−１９１；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，‘Ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｉｌａｙｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｓ ａ ｓｐｏｎｇｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｆｅｔａｌ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ’，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（４）（２００１），ｐｐ．３３１−３３６）。図１３Ａは、作成されたＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジを示す。図１３Ａから分かるとおり、図示のハイブリッド３Ｄスポンジは、異なるＭＣＴ／ＣＨＴ質量比（５０：５０、６０：４０、８０：２０および１００：０）で作成されている。図１３Ｂはスポンジの光学顕微鏡画像を示し、および、図１３Ｃは、作成された３Ｄスポンジの各々のＳＥＭ顕微鏡写真である。図１３Ｃにおいて、スケールバーは５００μｍである。

【0087】

図１３Ｃ中のＳＥＭ顕微鏡写真は、ＭＣＴと組み合わされた場合における、キトサン単成分スポンジの表面形態の変化を示す。この変化は、ＭＣＴ／ＣＨＴハイブリッド３ＤスポンジマトリックスにおけるＭＣＴの添加に伴う外見上の孔径の縮小によって示されている。それ故、キトサンとのＭＣＴ相互作用が、恐らくは両方の巨大分子間で利用可能である強力な水素結合相互作用の数が多いことによる高い架橋密度をもたらし、それ故、分子の配向およびまとまり具合を高めているようである。

【0088】

図１４は、熱重量測定（ＴＧ）によるＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジの熱分析のグラフであって、ＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）ハイブリッド３Ｄスポンジの熱挙動が、ＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）複合体スポンジの両方の間の中間であったことを示している。ＭＣＴが組み込まれているハイブリッド３Ｄスポンジは、平均分解温度が３００℃で、キトサン単成分スポンジよりも良好な熱安定性を示し、これは、ＣＨＴ単成分スポンジと比した場合に熱安定性の１５倍の増大に相当する。

【0089】

生物学的３Ｄスポンジは、移植後における完全性を維持するために十分な機械特性を必要とする。従って、圧縮テストをＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジで行って応力−ひずみ機械曲線を得、表２に示すとおり、それぞれ、弾性モジュラスおよび圧縮応力（１５％ひずみ）の両方を算出した。結果は、キトサン３ＤスポンジマトリックスへのＭＣＴの添加で、機械特性に対する好ましい効果を示す。ハイブリッドＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）３Ｄスポンジは、ＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）スポンジと比した場合に、約８５倍の圧縮ヤング率の増加を示した。また、圧縮強度（１５％ひずみ）は、ＭＣＴ／ＣＨＴ（６０：４０）ハイブリッド３Ｄスポンジ系については約７８倍の増加が見出された。観察された機械的強度の増強は、マトリックスの機械的安定性を促進させる、コラーゲンとキトサンとの間における内部水素結合による高分子ネットワークの形成に関連している可能性があり、それ故、潜在的な移植目的に好適な３Ｄスポンジである可能性がある。

【0090】

【表2】

【0091】

膨潤特性は、水和および細胞の成長を促進するためにスポンジにおいて重要である。ＭＣＴ−キトサン３Ｄスポンジは、ＭＣＴおよびキトサンの２種の単成分スポンジの中間の挙動を示し、ここで、キトサンの比がもっとも高いものがもっとも高い吸水能を示す。これらの結果は、コラーゲンのものよりも高い利用可能性を有するキトサン生体分子における水素結合点の存在によって説明が可能であり、これは、コラーゲンの第四級構造に起因する官能基の回転および易動性の低減に起因する。

【0092】

図１５は、異なるＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジについて得られた吸水度挙動を示す。図１５において、データは、同一の時間点におけるＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）単成分３Ｄスポンジと比して、平均±ＳＤ、ｎ＝３および（＊）＝ｐ＜０．０５として表されている。図１５はまた、ＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）ハイブリッド３Ｄスポンジの膨潤挙動を示すために、例示を目的とする差し込まれた写真を含んでいる。図１５のグラフは、異なるハイブリッド３Ｄスポンジのすべてに対する、７０％未満の相対湿度での類似性を示す。一方で、８５％の相対湿度に達した後には、ハイブリッド３Ｄスポンジマトリックス中におけるＭＣＴの比が高くなるに伴って、系の間に有意差が観察され、約３００％ともっとも高い吸水能を示すＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）ハイブリッド３Ｄスポンジと、５０％に近い値を有するもっとも低い吸水能を示すＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）単成分３Ｄスポンジとで、２５０倍にわたる吸水度の差が見られた。ＭＣＴ／ＣＨＴ（８０：２０）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（６０：４０）は、ＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）とＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）との間の吸水能を示す。

【0093】

複合体スポンジの保水能は、皮膚のティッシュエンジニアリングに対する特性および適合性を評価するための重要な態様である。ＭＣＴ−キトサンスポンジの水結合能は、その親水性および三次元構造の維持の両方に起因する性状である可能性がある。キトサンおよびＭＣＴは、水をその微小構造中に保持することが可能であるヒドロキシル、アミノおよびカルボキシル基などの親水性基を豊富に有する。ＭＣＴは、高い相対湿度における親水性の増大を促進し、それにより、より高い吸水能をもたらしていると思われる。ＭＣＴ−キトサンスポンジについて得られた吸水度の値は、既に報告されている同様の実験と一致する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，‘Ｃｈｉｔｏｓａｎ ｐｏｒｏｕｓ ｓｐｏｎｇｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２４（２６）（２００３），ｐｐ．４８３３−４８４１；Ｃｈｈａｂｒａ ｅｔ ａｌ．，‘Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ２％ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｐｏｎｇｅ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ’，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ ＆ ｂｉｏａｌｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｄｋｎｏｗ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８（４）（２０１６），ｐ．３００）。

【0094】

ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジ上での脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の成長：ＡＤＳＣとＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジとの間における相互作用を調べるために、およそ１２ｍｍの直径および３ｍｍの厚さを有する多孔性構造を用いた。７２時間培養した後、ＡＤＳＣは、スポンジ上の９０％を超えるコンフルエンスに達した。ＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）３Ｄスポンジの断面のＳＥＭ画像（図１６Ａおよび１６Ｂ）は、細胞の播種から７２時間後に、ＡＤＳＣが付着し、および、多孔性ＭＣＴ−キトサン（１００：０）３Ｄスポンジ表面に広がり、細胞が付着していないスポンジ系（図１６Ａ）と比して、細胞間の接続が視認不可能なほどに相互に完全に合併した（図１６Ｂ）ことを示した。図１６Ａおよび１６Ｂにおいて、スケールバーは１０μｍを示す。多孔性スポンジの表面は、細胞と、細胞からの分泌されたＥＣＭ沈殿物であることが可能であるフィルムとで埋まっていた（Ｌｉｎ，Ｌｉ ａｎｄ Ｓｕ，‘Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｐｏｎｇｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ’，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃ，４２（２０１４），ｐｐ．４７４−４７８；Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，‘Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ−ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｐｏｎｇｅ ｗｉｔｈ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ’，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６（２）（２０１３），ｐｐ．５１３−５１８）。

【0095】

図１７は、１５日間のインキュベーション期間後のＭＣＴ−キトサン（５０：５０）複合体３Ｄスポンジへの増殖レベルを示し、ここで、凡例（□）はＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）３Ｄスポンジを示し、凡例（ｏ）はＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）単成分３Ｄスポンジを示し、および、凡例（△）はＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）複合体３Ｄスポンジを示し、また、データは、同一の時間点におけるＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）単成分３Ｄスポンジとの比較で、平均±ＳＤ、ｎ＝５、（＊）＝ｐ＜０．０５として表されている。３つのグラフは、３ＤスポンジＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）、ＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）複合体３Ｄスポンジを示している。ＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）複合体３Ｄスポンジは、ＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）３Ｄスポンジの両方と比した場合に、ＡＤＳＣとの３日間のインキュベーションで開始する細胞付着性および増殖の顕著な増加を示した。

【0096】

ポリスチレンディッシュの表面は、良好な細胞付着性を有すると共に、インキュベーション中に早い細胞コンフルエンスを示すことで知られている（Ｊｅｏｎｇ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，‘Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｐｏｎｇｅ ｆｏｒ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ’，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１（２）（２０００），ｐｐ．１５３−１５９）。細胞付着および増殖の程度は、ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジは良好な細胞適応性を有することを示唆している。スポンジ上における細胞増殖の試験で、ＡＤＳＣとの３日間のインキュベーション後には、実験グループと対照グループとの間には統計的な有意差が存在することが明らかになった。これは、ＡＤＳＣのスポンジへの取り込みに続く適応プロセスからもたらされた可能性がある。３日間のインキュベーションの後にサンプル間の差異が有意なものとなり始めたという事実は、ＡＤＳＣが、スポンジにおける初期のゆっくりとした増殖速度を示し、これに続いて、３日目以降におけるより標準的な増殖速度への復帰を示すことによる可能性がある。しかも、ＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）複合体３Ｄスポンジは、細胞付着性および増殖の顕著な増加を示した。１５日間のインキュベーション期間で、ＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）３Ｄスポンジのものとは対照的に、ＭＣＴ／ＣＨＴ（５０：５０）複合体３Ｄスポンジでは約５０倍と高い程度の細胞付着性および増殖が観察された。ＭＣＴは、骨芽細胞および靱帯線維芽細胞の増殖、化学走性およびコラーゲン様タンパク質合成を刺激することが知られている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，‘Ｎｏｖｅｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｐｏｎｇｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１ ＤＮＡ ｆｏｒ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３４４（１）（２００６），ｐｐ．３６２−３６９）。また、ＭＣＴは、前駆細胞の増殖を増加させることが報告されている（Ｃｏｓｔａ−Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，‘Ａｄｈｅｓｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＢＭＣ９）ｓｅｅｄｅｄ ｏｎ ｎｏｖｅｌ ｍｅｌｔ−ｂａｓｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ３Ｄ ｐｏｒｏｕｓ ｓｐｏｎｇｅｓ．’，Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ Ａ，１４（６）（２００８），ｐｐ．１０４９−１０５７）。ＭＣＴおよびキトサンの組み合わせは、細胞増殖応答を高めるためにきわめて有益であり得る。

【0097】

結論：急速に分解するコラーゲンとは対照的に、キトサンはインビトロでゆっくりと生分解される。コラーゲン３Ｄスポンジをキトサンで修飾することで、向上した機械的強度、熱安定性、生体適合性および生分解性がもたらされる。ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３Ｄスポンジは、ＡＤＳＣの表面および内部の両方に、細胞付着性、遊走および増殖のための空間的特色を有する多次元的構造をもたらし、および、細胞成長を促進させる。７２時間のインキュベーションの後、ＡＤＳＣは合併され、ならびに、スポンジの表面がほとんど覆われており、および、少しの孔しか視認できず、および、少しの細胞が孔の中で遊走するよう、スポンジの表面上に完全な細胞層を形成していたことが見出された。ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３ＤスポンジはＡＤＳＣの付着、増殖および分化を支持していた。ＳＥＭ画像は、多孔性スポンジの大表面積によって、スポンジ上におけるＡＤＳＣの付着、拡散および成長が可能となったことを示していた。平坦な形態、ならびに、相互に連結する多孔性構造の中およびその周囲への優れた拡散は、強固な細胞付着および細胞の成長を示していた。従って、ＭＣＴ−キトサンハイブリッド３ＤスポンジはＡＤＳＣ付着に対する生体適合性を発揮し、それ故、ティッシュエンジニアリングにおける潜在的な用途に対する優れた候補である。

【0098】

実施例３．創傷治癒およびティッシュエンジニアリング用途における細胞増殖のための生体適合性スポンジとしての、エレクトロスピニングによるＭＣＴ−キトサン複合体ナノファイバー
エレクトロスピニングによるナノファイバー（ＥＳＮＦ）をＭＣＴ−キトサン複合体材料から調製した。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を助剤として用いた。異なる体積比（１００：０、８０：２０、６０：４０、４０：６０、２０：８０および０：１００）のＭＣＴ−キトサン／ＰＶＡ混合溶液を調製し、エレクトロスピニングに好適である粘度および導電性で同様となるよう調節した。ＥＳＮＦの形態を、走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）および示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を用いて試験した。研究は、ナノファイバー（ＮＦ）の化学的組成および熱特徴を特徴づけるために用いた。線維芽細胞増殖を支持するＮＦの能力を、最適化したＭＣＴ−キトサン／ＰＶＡ溶液を用いてインビトロで調べた。結果は、ＭＣＴ−キトサン系ＥＳＮＦは線維芽細胞の成長にきわめて好適であり、ＰＶＡのＥＳＮＦよりも相当に良好であることを示す。結果はまた、ＭＣＴ−キトサンが、細胞増殖の支持に関して、キトサンのみの場合よりも良好であることを示す。

【0099】

エレクトロスピニングのためのＭＣＴ−キトサン複合体の調製：ＭＣＴ−キトサン粉末を、均質な分散体（１％ ｖ／ｖ）が得られるまで、激しく撹拌しながら脱イオン水中において膨潤させた。特徴付け実験に先行して、分散体を、完全な水和を達成するために、冷蔵庫（４℃）中に一晩静置した。ＭＣＴ−キトサン複合体分散体を、コーン・プレート型のレオメータ（Ｃ−ＶＯＲ，Ｂｏｈｌｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）における応力スイープテストによる粘度の計測、および、０．７２６５ｃｍ^-1の電極導電率を有する導電率計（Ｏｒｉｏｎ Ｓｔａｒ Ａ２１５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ，ＵＳＡ）による２５℃での導電性の計測により特徴付けた。

【0100】

ＭＣＴ−キトサン複合体のエレクトロスピニング：ＭＣＴ−キトサン複合体を、均質な分散体が得られるまで、激しく撹拌しながら水性アセトン（３０％ ｖ／ｖ）と混合した。複合体溶液の濃度は、それらの粘度および伝導性が同様であり、ならびに、エレクトロスピニングに好適であるよう調節した。分散体は、エレクトロスピニング実験前に完全な水和のために、冷蔵庫（４℃）中に一晩静置した 。各ＭＣＴ−ＣＨＴ複合体サンプルについて、最大せん断速度を、２．７８×１０^-10ｍ³／ｓの体積流量（Ｑ）および１ｍｍの管内径（Ｒ＝０．５×１０^-3ｍ）を有する管状の幾何学的形状の冪乗則材料に従って算出した。

【0101】

エレクトロスピニングのための複合体特性を向上するために、サンプルを、エレクトロスピニングアジュバントとしてＰＶＡと混合した。ＰＶＡ（１０％ ｗ／ｖ）は、８０℃で４時間激しく撹拌しながら水中に溶解した。ＭＣＴ−キトサン複合体およびＰＶＡブレンド分散体は、１００：００、６０：４０、５０：５０、４０：６０および０：１００体積比で混合した。ＭＣＴ−キトサン／ＰＶＡブレンドサンプル（５ｍＬ）は、エレクトロスピニングデバイスおよび３０−ｋＶの電源供給（Ｇａｍｍａ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒｍｏｎｄ Ｂｅａｃｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いてエレクトロスピニングした（図９Ａおよび９Ｂを参照のこと）。ニードルチップとコレクタとの間の距離は２０ｃｍに設定し、溶液は１ｍＬ／時間で送出した。ナノファイバーをアルミニウムフォイル上に集め、さらなる特徴付けのためにデシケータ中において保管した。

【0102】

ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦの特徴付け：ＥＳＮＦは、減衰全反射フーリエ変換赤外分光法（Ｎｉｃｏｌｅｔ ４７００ ＡＴＲ ＦＴ−ＩＲ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いる化学プロファイル、および、熱重量分析（ＴＧＡ，Ｑ１００，ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｉｎｄｏｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）による熱特性に従って特徴付けた。ＴＧＡ分析は、窒素雰囲気（２０ｍＬ／分）中において、１００〜４００℃の温度走査範囲にわたって５℃／分で行った。ナノファイバーの形態を、ＳＥＭ（Ｌｅｏ １５３０−ＦＥ，Ｚｅｉｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて試験した。平均繊維径は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、ＳＥＭ画像中において少なくとも２０本の繊維を分析することにより測定した。

【0103】

細胞増殖アッセイ：細胞増殖を、ＭＴＴ細胞増殖アッセイにより生存細胞数について測定した。簡潔には、既に無菌条件下で収集しておいたＥＳＮＦを培地を含む無菌細胞培養プレート中の異なるウェルに入れ、および、３ｍＬの線維芽細胞懸濁液（Ｌ９２９、１．５×１０５）を各処理ウェルに加えた。細胞培養プレートを、３７℃で、それぞれ、３、７および１４日間、インキュベータ中に入れた。インキュベーションの後、培地を除去し、ＭＴＴ溶液を、新たな培地との１：１０希釈で各処理ウェルに加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートし、吸光度を、マイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて５６０ｎｍで計測した。細胞成長実験（７日目）の後、ＥＳＮＦを回収し、培地で洗浄し、グルタルアルデヒド（２．５％ ｖ／ｖ）により４℃で２時間固定し、ＳＥＭによる画像化の前に金でコーティングした。

【0104】

統計分析：統計分析は、ＡｓｓｉｓｔａｔＶＲソフトウェア（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）を用いて行った。実験データは、平均±ＳＤ値として表した。対照グループと実験グループとを比較するために、データを、一般化線形モデル、続いて、最小二乗平均（ＳＡＳ；Ｃａｒｙ，ＮＣ）により分析した。差異は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなした。

【0105】

図１８は、ＭＣＴ／ＣＨＴ（０：１００）（「＋」によって示す）およびＭＣＴ／ＣＨＴ（１００：０）（「ｏ」によって示す）（別々）、ならびに、２種の異なるＭＣＴ／ＣＨＴ複合体（６０：４０は「^*」によって示し、および、４０：６０は「ｘ」によって示す）の、ＥＳＮＦのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルのグラフを示す。図中の矢印は、ＭＣＴのキトサンへの添加に関連するナノファイバーＦＴＩＲスペクトル中における変化を示す。特に、高い吸収の傾向が、１６５０ｃｍ^-1および１０００ｃｍ^-1の両方で見ることが可能である。これらは、それぞれ、キトサンの多糖性に付随する、カルボニル（実線矢印）および炭素−酸素（破線矢印）伸縮周波数に相当する。全体として、ＣＨＴとＭＣＴとの間の差異はこの図において明らかである。これら２種の複合体については、グラフ中の特定の箇所で転換があるが、多くの箇所においては、かなりの共通点が存在しており、これは、ＣＨＴおよびＭＣＴの比較的類似した割合の観点から意外ではない。

【0106】

図１９はＭＣＴ／ＣＨＴ複合体（１００：０、６０：４０、４０：６０および０：１００）のＴＧＡ熱分析を示すものであり、ＭＣＴの添加により得られるキトサン熱安定性に対する好ましい効果を示す。ＭＣＴ−キトサン（６０：４０）複合体は、キトサンのみの場合を超える向上した熱安定性を示す。ＭＣＴ−キトサン（６０：４０）複合体は、約３２０℃の平均分解温度を示す一方で、単独のキトサンは、約２８０℃の平均分解温度を示す。

【0107】

図２０Ａ〜２０Ｆは、キトサンエレクトロスピニングによるナノファイバーおよびＭＣＴ−キトサンエレクトロスピニングによるナノファイバーのＳＥＭ顕微鏡写真を示す。図２０Ａおよび２０Ｄにおいて、スケールバーは１０μｍであり；図２１Ｂおよび２０Ｅにおいて、スケールバーは２μｍであり、ならびに、図２０Ｃおよび２０Ｆにおいて、スケールバーは２００ｎｍである。点線による円は、キトサンＥＳＮＦにおける劣ったエレクトロスピニングプロセスに関連する液滴の存在を示し、これは、ＭＣＴ−キトサン複合体のＥＳＮＦの改善を示す。

【0108】

図２１は、キトサン、ＭＣＴおよびＭＣＴ−ＣＨＴ複合体（５０：５０）ＥＳＮＦと共に共培養したＬ９２９線維芽細胞の増殖を示す。この図は、ＰＶＡ ＥＳＮＦを対照として用いるＭＴＴ細胞増殖アッセイからのデータを示す。生存細胞±標準偏差の平均割合は、３回の異なる時に実施した実験に由来する。図２２Ａ〜２２Ｃはそれぞれ、キトサン、ＭＣＴ−キトサン複合体およびＭＣＴに対する細胞付着を示すＳＥＭ顕微鏡写真である。

【0109】

結論：ＭＣＴ−キトサン複合体ナノファイバーはＰＶＡ（１０％ ｗ／ｖ）を助剤として用いるエレクトロスピニングにより成功裏に作成した。ＭＣＴ−キトサン複合体ナノファイバーを作成するためのエレクトロスピニングパラメータを設定し、ＭＣＴ対キトサンの質量比を５０：５０に最適化した。ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析は、ＥＳＮＦ中のＭＣＴ−キトサン構成成分の存在を示す。ＭＣＴ−キトサン複合体ＥＳＮＦの熱安定性をキトサンのみの場合のものと比較したところ、ＭＣＴのキトサンへの添加はＥＳＮＦの熱安定性を向上させることが示唆された。線維芽細胞増殖の結果は、７日間のインキュベーションの後に、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦは、細胞成長に好適であることを示し、また、キトサンまたはＭＣＴ ＥＳＮＦのみの場合よりも顕著に良好であることを示す。ＳＥＭ画像は、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦの大表面積によって、Ｌ９２９線維芽細胞の良好な付着、拡散および成長が実現されたことを示す。これらの結果は、ＭＣＴ−キトサンＥＳＮＦが線維芽細胞付着に係る生体適合性および活性を向上させ、それ故、ティッシュエンジニアリング、再生医学における用途、および、組織の火傷の処置のための創傷治癒被覆材としての用途のための創傷被覆材テンプレートの開発に有用であることを示す。

【0110】

図３６〜３８の以下の考察は、実施形態に係るＧＴＲデバイスの構造および適用、ならびに、これらのデバイスの利点の概要を提供する。

【0111】

図３６は、実施形態に係る３Ｄスポンジを示す。この図において、スポンジは、新生真皮（ｎｅｏｄｅｒｍｉｓ）の主構成成分であるコラーゲンおよびグリコサミノグリカンから組成されているＭＣＴを含む。新生真皮は創傷治癒中に形成される新たな組織である。ＭＣＴのコラーゲン−ＧＡＧ構造が、治癒プロセス中におけるインテグリン結合を促進させる。既述のとおり、ＭＣＴは、一態様において海洋無脊椎動物、より特定的な態様において棘皮動物、ならびに、さらなる特定的な態様においてウニおよび／またはナマコを含む海洋性の供給源に由来する。このＭＣＴの超微細構造は、ヒト結合組織に対するいくらかの類似性を有するものであり、新生真皮形成などの有益なＧＴＲ効果を示唆するものである。

【0112】

図３６中のスポンジはまた、水分の管理をもたらして、創傷閉鎖および治癒を促進させる。一態様において、スポンジはゲル化効果を有し、これが、治癒の最中における冷却、鎮静効果を通して患者の快適さを促進させる。ＭＣＴを架橋処理することで、得られる構造が、低い物理的分解性とタンパク質分解酵素に対する耐性とを示すために、最長で３０日間にわたってスポンジが効果的とされる。特に、得られる構造が、タンパク質を分解可能であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）などの過剰量の酵素を標的化し、非活性化する。このような標的化および非活性化は、創傷閉鎖および治癒を促進および改善する。

【0113】

図３７は、いくつかの実施形態に係る３Ｄスポンジを示す。このスポンジは、実施形態に応じて、ＭＣＴから組成されているか、または、ＭＣＴ−ＣＨＴのマトリックスから組成され得る。スポンジ中のこの材料が組織および血管の内殖を支持する。スポンジ構造の他の態様は、湿性環境を維持すると共に、滲出物を制御して、治癒および組織再生を促進させる、吸収性ゲル形成組成物を含む。

【0114】

図３８は、処置の一部として皮膚の解放部に縫合された、ＭＣＴまたはＭＣＴ−ＣＨＴのマトリックスから組成されたものであり得るＧＴＲデバイスを示す。この図は、治癒プロセスの一部として、デバイスの周囲の縫合材、ならびに、デバイスの下方に形成されている新生真皮を示す。図３８の一部分は新生真皮の分解立体図を示し、単独のＭＣＴ、または、インテグリン結合部位を伴うＣＨＴと複合体マトリックスを形成しているＭＣＴを示す。

【0115】

実施例４．美容用剤形
以下の配合物は、特にこれらに限定されないが、溶液、懸濁液、液体、ゲル、軟膏剤、ローションもしくはクリームを含む皮膚学的および／または薬学的に許容可能な局所的キャリアを利用する、本明細書に記載のＭＣＴおよびＭＣＴ−キトサン（ＭＣＴ−ＣＨＴ）組成物の治療的または予防的投与に用いられ得る代表的な調合薬剤形を例示している。以下の例においては、ゲルまたはクリームが提供される。

【0116】

【表3】

【0117】

この配合物は、以下の個別のステージで調製する。混合物の要素Ａは、Ｃａｒｂｏｐｏｌを水中に分散させ、次いで、他の構成成分中で撹拌することにより調製した。すべての要素Ｂ構成成分を一緒に混合し、７０℃に加熱した。次いで、要素ＡおよびＢを組み合わせ、トリエタノールアミンおよび香料を添加した（要素Ｃ）。得られたクリームは、安定およびなめらかであると共に、良好な湿性品質および皮膚への優れた触感を有していた。

【0118】

【表4】

【0119】

配合物を、すべての構成成分を一緒に混合することにより調製した。

【0120】

【表5】

【0121】

この配合物は、以下の個別のステージで調製する。混合物の要素Ａは、Ｃａｒｂｏｐｏｌを水中に分散させ、次いで、他の構成成分中で撹拌することにより調製した。すべての要素Ｂ構成成分を一緒に混合し、７０℃に加熱した。次いで、要素ＡおよびＢを組み合わせ、トリエタノールアミンおよび香料を添加した（要素Ｃ）。得られたクリームは、優れた湿性化品質に富んでおり、皮膚上でグリス様の触感を与えた。

【0122】

【表6】

【0123】

調製手法：
１−１５０ｍｇのビタミンＥを計量し、これを、クリーム基剤分散体と穏やかに撹拌しながら混合する。

【0124】

２−１０００ｍｇのＭＣＴ−ＣＨＴ凍結乾燥粉末（ＭＣＴ：ＣＨＴ質量比１００：０〜７０：３０での形成）を計量し、これを、蒸留水（ｐＨ３．２）中に調製した５．００ｍＬの酢酸（０．５Ｍ）に溶解させる。

【0125】

３−２００ｍｇのワサビノキ／ビタミンＣ抽出物を計量し、これを、ＭＣＴ−ＣＨＴの水溶液に溶解させる。

【0126】

４−５０ｍｇのアスタキサンチンを計量し、これを、ＭＣＴ−ＣＨＴおよびワサビノキ／ビタミンＣ抽出物を含有する水溶液に溶解させる。

【0127】

５−１００ｍｇのロイヤルゼリーを計量し、これを、ＭＣＴ−ＣＨＴ、ワサビノキ／ビタミンＣ抽出物およびアスタキサンチンを含有する水溶液と混合する。

【0128】

６−ＭＣＴ−ＣＨＴ、ワサビノキ／ビタミンＣ抽出物およびアスタキサンチンを含有する水溶液を、ビタミンＥを含有するクリーム基剤と、均質な分散体が得られるまで、穏やかな撹拌を継続しながら混合する。

【0129】

７−均質な瘢痕クリーム配合物を適当なガラス容器に入れ、室温で保管する。

【0130】

上記の配合物は、薬学分野において周知である従来の手法によって調製され得る。上記の美容用組成物は、周知の薬学技術に従って、異なる量および型のＭＣＴ−ＣＨＴ複合体を有効成分として含有するよう変更され得ることが認識されるであろう。

【0131】

既述の瘢痕クリーム組成物を数人の患者に適用した。図３０Ａおよび３０Ｂは、１人の患者に係る前後の結果を示す。図３０Ａは、上記の瘢痕クリームを適用する前における、帝王切開から５年経過した瘢痕の写真である。図３０Ｂは、瘢痕クリームを２週間の間毎日適用した後の同一の瘢痕の写真である。図３０Ｂから明らかであるとおり、処置後の瘢痕は短くなっており、また、周囲の皮膚の色に近い異なる色となっている。

【0132】

図３１Ａおよび３１Ｂは、他の患者に係る前後の結果を示す。図３１Ａは、上記の瘢痕クリームを適用する前における、左膝関節下部における１５年経過した瘢痕の写真である。図３１Ｂは、瘢痕クリームを適用した後の同一の瘢痕の写真である。図３１Ｂから明らかであるとおり、瘢痕は、周囲の皮膚の色に近い異なる色となっている。

【0133】

図３２Ａ〜３２Ｃは、さらに他の患者に係る前後の結果を示す。図３２Ａは、上記の瘢痕クリームを適用する前における、２５年が経過した虫垂切除術による瘢痕の写真である。図３２Ｂは毎日適用した後の同一の瘢痕の写真であり、および、図３２Ｃは、実施形態に係る瘢痕クリームを８日間毎日適用した後の同一の瘢痕の写真である。図３２Ｂおよび３２Ｃから明らかであるとおり、処置後の瘢痕は短くなっており、また、周囲の皮膚の色に近い異なる色となっている。

【0134】

図３３Ａおよび３３Ｂは、さらに他の患者に係る前後の結果を示す。図３３Ａは、膝手術から６ヶ月経過した瘢痕の写真であり、および、図３３Ｂは、上記の瘢痕クリームを７日間毎日適用した後の同一の瘢痕の写真である。図３３Ａおよび３３Ｂから明らかであるとおり、処置後の瘢痕は前よりもかなり目立たなくなっており、また、周囲の皮膚の色に近い異なる色となっている。患者には副作用または過形成は生じなかった。

【0135】

図３４Ａ〜Ｄは、瘢痕の処置における、さらに他の患者に係る進行結果を示す。図３４Ａは火傷瘢痕の写真を示し、図３４Ｂおよび３４Ｃは上記の瘢痕クリームを毎日適用している最中の瘢痕の写真を示し、ならびに、図３４Ｄは、７日間の処置後の瘢痕の写真を示す。これらの図から明らかであるとおり、処置後の瘢痕は実質的に治癒しており、処置前の瘢痕の外観と比して、色は周囲の皮膚の色に近くなっている。

【0136】

前述の処置例に追加して、瘢痕の形成は、例えば外傷、手術、塑性手術、または、他の修復および／または治癒手法その結果として、眼瞼の中およびその周囲を含む身体の種々の領域に生じる可能性がある。上記の瘢痕クリームは、この種の処置にも用いられて、良好な効果が得られている。

【0137】

先に前述した研究および実施した実施例の一部として、ナマコから抽出したＭＣＴと、子ウシの皮膚組織から単離したウシコラーゲンとの間における構造的な差異を判定し示すために研究を行った。コラーゲンサンプルのアミノ酸組成物分析を（Ｃｕｉ Ｆ．，Ｌｉ Ｚ．，Ｚｈａｎｇ Ｙ．，Ｄｏｎｇ Ｐ．，Ｆｕ Ｘ．，Ｇａｏ Ｘ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｏｄｙ Ｗａｌｌ ｏｆ Ｓｅａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ”，Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ Ｊａｐｏｎｉｃｕｓ”，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１００（３）（２００７）：１１２０−５）に記載されているとおりに判定した。簡潔には、コラーゲンサンプルを６Ｍ ＨＣｌにより１１０℃で２４時間加水分解し、次いで、加水分解物の主なアミノ酸組成物を、ＳＹＫＡＭアミノ酸分析器Ｓ４３３Ｄ（ＳＹＫＡＭ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析した。

【0138】

以下の表３は、ナマコから単離した異なるＭＣＴサンプル、および、子ウシの皮膚から単離したウシ（子ウシ−皮膚）コラーゲンに係るアミノ酸組成物を示す。以下の表における子ウシ−皮膚コラーゲンサンプル１〜４の分析は、以下の記事において見いだされ得るリサーチで行った：Ｘ．Ｃｈｅｎｇ，Ｚ．Ｓｈａｏ，Ｃ．Ｌｉ，Ｌ．Ｙｕ，Ｍ．Ａ．Ｒａｊａ，Ｃ．Ｌｉｕ，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ Ｒｈｏｐｉｌｅｍａ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１７，０１６９７３１；Ｙ．Ｈａｎ，Ｊ−Ｒ．Ａｈｎ，Ｊ−Ｗ．Ｗｏｏ，Ｃ−Ｋ．Ｊｕｎｇ，Ｓ−Ｍ．Ｃｈｏ，Ｙ−Ｂ．Ｌｅｅ，Ｓ−Ｂ．Ｋｉｍ，“Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｙｅｌｌｏｗｆｉｎ Ｔｕｎａ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ａｌｂａｃａｒｅｓ）”，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ａｑｕａｔｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｉｓｓｕｅ ２，２０１０，ｐｐ．１０２−１１１；Ｈ．Ｌｉ，Ｂ．Ｌ．Ｌｉｕ，Ｌ．Ｚ．Ｇａｏ，Ｈ．Ｌ．Ｃｈｅｎ，“Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｂｕｌｌｆｒｏｇ ｓｋｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ”，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，Ｉｓｓｕｅ １，Ｊａｎｕａｒｙ ２００４，ｐｐ．６５−６９；Ｐ．Ｋｉｔｔｉｐｈａｔｔａｎａｂａｗｏｎ，Ｓ．Ｎａｌｉｎａｎｏｎ，Ｓ．Ｂｅｎｊａｋｕｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｉｓｈｉｍｕｒａ．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｅｐｓｉｎ−Ｓｏｌｕｂｉｌｉｓｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｓｋｉｎ ｏｆ Ｓｐｌｅｎｄｉｄ Ｓｑｕｉｄ（Ｌｏｌｉｇｏ ｆｏｒｍｏｓａｎａ）”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１５，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４８２３５４，８ ｐａｇｅｓ。

【0139】

【表7】

【0140】

表３は、易変性コラーゲン組織（ＭＣＴ）およびウシコラーゲン（ＢＣ）のアミノ酸組成物を示す。ＭＣＴの主アミノ酸は、グリシン（１９．０％）、グルタミン酸（１４．０％）、プロリン（１２．０％）、アラニン（９．０％）、アスパラギン酸（９．０％）、アルギニン（８．０％）およびヒドロキシプロリン（６．７％）であり、これらは、表４に示されているウシコラーゲンに見出されるものと同様であった（文献を参照のこと）。

【0141】

Ｉ型コラーゲンの一次構造は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列（ここで、Ｘは主としてプロリンであり、および、Ｙは主としてヒドロキシプロリンである）の連続する繰り返し、ならびに、テロペプチドと呼ばれるきわめて短鎖のＮ−およびＣ−末端領域（１５〜２６アミノ酸残渣）を有するドメインを含有すると特徴付けられる。α１鎖におけるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し配列は、二次構造の三重らせん形成において重要な役割を果たす。Ｇｅｌｓｅ Ｋ，Ｐｏｅｓｃｈｌ Ｅ，Ａｉｇｎｅｒ Ｔ．２００３．Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｒｅｖ ５５（１２）：１５３１−４６；Ｇｏｍｅｚ−Ｇｕｉｌｌｅｎ Ｍ，Ｇｉｍｅｎｅｚ Ｂ，Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｂａｌｌｅｒｏ Ｍ，Ｍｏｎｔｅｒｏ Ｍ．２０１１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｆｒｏｍ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ ２５（８）：１８１３−２７．Ａｓ ａｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ， ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｈｅｌｉｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｆｏｌｄ ｃｏｍｐａｃｔｌｙ［３］を参照のこと。Ｆｒａｓｅｒ Ｒ，ＭａｃＲａｅ Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｅ．１９７９．Ｃｈａｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２９（３）：４６３−８１を参照のこと。従って、グリシンは、ウシコラーゲン中における主アミノ酸である。既述の文献によれば、ウシコラーゲン中のグリシン含有量は、１４〜３３％の範囲であり、アミノ酸合計の約四分の一であり、これは、ＭＣＴグリシン含有量（１９％）と一致していた。

【0142】

図２３および２４は、子ウシおよびニワトリコラーゲンと比した、海洋コラーゲンに係るコラーゲンマトリックスの純度分析の結果を示し、ならびに、海洋コラーゲンが子ウシおよびニワトリコラーゲンと同等に安全であり、従って、既述の用途における使用について十分に安全であることを示す。これらの図は三重らせん構造を示し、ここで、下部の幅広い青いバンドはαらせんであり、βまたはγらせんが上部にある。これらの図中のＭＣＴ１およびＭＣＴ２は、異なるＭＣＴバッチを示し、結果の再現性を表している。

【0143】

図２５Ａにおいて、図中右側に「＋」によって示されるピークは、子ウシコラーゲンを可溶化する加水分解を示す。比較用グラフはＭＣＴを「ｏ」で示す。図２５Ｂは比較用ＦＴＩＲスペクトルを示すものであって、ナマコに対するＭＣＴ単離プロセスの有効性に係る結果の再現性を示しており、ここで、ＭＣＴ１は「＊」によって示されており、および、ＭＣＴ２は「ｘ」によって示されている。図２５Ｂは、バッチ毎についてのＭＣＴ化学プロファイルにおける高い程度での一致性を示す。

【0144】

図２６は、コラーゲンサンプルの熱重量分析（ＴＧＡ）の結果を示し、また、ＭＣＴサンプルに係る熱挙動における差異を示す。図２６においては、安定性の低下が、グラフの下方に向かうラインによって示されている。子ウシコラーゲンのラインは２８０℃で不安定性の増大を示すが、一方で、ＭＣＴ１およびＭＣＴ２のラインは、４００℃でも安定性を示している。このグラフは子ウシコラーゲンに係るものよりも良好なＭＣＴに係る熱安定性を示し、ＭＣＴ系生成物を保持する向上した能力を示している。

【0145】

イミノ酸（プロリンおよびヒドロキシプロリン）は、ピロリジン環によるコラーゲン三重らせんの安定性を維持することが可能であるために、α鎖中にＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し配列を含む重要なアミノ酸である。Ｗｏｎｇ，ＤＷ．１９８９．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｉｎ ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄを参照のこと。図２７に示されているとおり、ＭＣＴ中のプロリンおよびヒドロキシプロリンの含有量は、２０．０％の合計イミノ酸含有量（ウシコラーゲンについて見出される値よりもわずかに低い）に対して、それぞれ１２．０および７．０％であった。

【0146】

プロリンおよびヒドロキシプロリンの含有量は、環境温度に関連することが見出されている。Ｚｈｏｎｇ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｔ，Ｈｕ Ｃ，Ｒｅｎ Ｃ．２０１５．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｏｄｙ Ｗａｌｌ ｏｆ Ｓｅａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｔｉｃｈｏｐｕｓ ｍｏｎｏｔｕｂｅｒｃｕｌａｔｕｓ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ８０（４）：Ｃ６７１−Ｃ６７９を参照のこと。しかしながら、ウシコラーゲンと比した場合、Ｇｌｙ対イミノ酸含有量の比（Ｈｙｐ／Ｐｒｏ）は低く、それ故、ＭＣＴ中のイミノ酸によるＧｌｙ系三重らせんのより効率的な安定化が示唆される。

【0147】

コラーゲン安定性は、アミノ酸組成物、特にイミノ酸によって影響される可能性がある。プロリン（ＰＲＯ）およびヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）は、ピロリジン環を伴うコラーゲンの空間的構造を維持することが可能であるが、一方で、ヒドロキシプロリンの水酸基は隣接する鎖と一緒に水素結合を形成して三重らせんの安定性を向上させる。ＭＣＴのアミノ酸組成物分析は、ウシコラーゲンよりも遅い分解速度を示す安定なコラーゲン三重らせんの形成に好適であるグリシンおよびイミノ酸が多く存在していることを示す。

【0148】

図２７は、子ウシコラーゲンの複数のサンプルと比較する、ＭＣＴ１およびＭＣＴ２サンプルに係るＧＬＹ、ＨＹＰ、ＰＲＯおよびイミノ酸（ＨＹＰおよびＰＲＯの和）の棒グラフである。ＭＣＴのきわめて好ましい一態様は、一貫して再現可能である、ＧＬＹ対イミノ酸の約１：１の比である。比較として、もっとも好ましい子ウシコラーゲンサンプルであっても（図の中程）、ＭＣＴ１およびＭＣＴ２サンプルのように１：１比に近い比は示さない。イミノ酸と比したＧＬＹの高い含有量は安定性が劣っていることを示す。高いＧＬＹ含有量が好ましいが、ＧＬＹ対イミノ酸の１：１の比がより高い安定性を示す。

【0149】

図２８Ａおよび２８Ｂ、ならびに、図２９Ａおよび２９Ｂは、２つの異なる方法で形成されたＭＣＴの走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）写真である。図２８Ａおよび２８Ｂは、溶剤流延技術を用いてＭＣＴ−キトサン複合体を形成した結果を示す。図２８Ａは、ＭＣＴ−キトサン被覆材テンプレート（例えば３Ｄスポンジ）の構造の形態を示す。図２８Ｂは、この構造に係る高い間隙率を示す。図２９Ａおよび２９Ｂは、エレクトロスピニング技術を用いてＭＣＴ−キトサン被覆材テンプレートを形成した結果を示す。図２８Ａおよび２８Ｂと同様に、それぞれ、図２９Ａは構造の形態を示し、および、図２９Ｂは構造に係る高い間隙率を示す。間隙率は細胞付着性および成長を促進する組織再生誘導における重要な性状である。

【0150】

参照した刊行物、特許および特許文献はすべて、参照により個々に援用されているかのように本明細書において参照により援用されている。さらに、本発明の種々の態様が、種々の特定的で、かつ、好ましい実施形態および技術を参照して記載されている。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内において多くの変形および修正を成し得ることが理解されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】