特許 6934164 新規イリジウム錯体、酸素濃度測定試薬、酸素濃度測定方法及び合成中間体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6934164

(24)【登録日】2021年8月25日

(45)【発行日】2021年9月15日

(54)【発明の名称】新規イリジウム錯体、酸素濃度測定試薬、酸素濃度測定方法及び合成中間体

(51)【国際特許分類】

   C07F 15/00 20060101AFI20210906BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20210906BHJP

   G01N 31/00 20060101ALI20210906BHJP

   G01N 31/22 20060101ALI20210906BHJP

【ＦＩ】

   C07F15/00 ECSP

   G01N33/533

   G01N31/00 L

   G01N31/22 122

【請求項の数】10

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2017-45545(P2017-45545)

(22)【出願日】2017年3月10日

(65)【公開番号】特開2018-150245(P2018-150245A)

(43)【公開日】2018年9月27日

【審査請求日】2020年2月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】504145364

【氏名又は名称】国立大学法人群馬大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】吉原 利忠

(72)【発明者】

【氏名】飛田 成史

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 学

(72)【発明者】

【氏名】増田 範夫

【審査官】 東 裕子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−２５７８９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０２６２３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−２６６２４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５２５３６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０６９５３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０６３６９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５３４２１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２８１４６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０８８００５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 AOKI,Shin et al，Inorg.Chem.，2011年 月 日，50，806-818

【文献】 QIU, Kangqiang，ACS Applied materials & Interfaces，2016年 月 日，8，12702-12710

【文献】 GENNARI, Marcello et al，J.Phys.Chem.Lett.，2014年 月 日，5，2254-2258

【文献】 LO, Kenneth Kam-Wing，Chem.Eur.J，2003年 月 日，9(2)，475-483

【文献】 KERR, Emily，Chem.Eur.J.，2015年 月 日，21，14987-14995

【文献】 CHEN,Kun et al，Chem.Commun.，2014年 月 日，50，5756-5759

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ １５／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００

Ｇ０１Ｎ ３１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）で表されるイリジウム錯体。

【化1】

〔式（１）中、
Ｒ¹は、下記式（２）で表される１価の基を示し、Ｒ²及びＲ³は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（２）で表される１価の基を示し、Ｒ⁴〜Ｒ²⁴は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示す。〕

【化2】

〔式（２）中、
Ｘは、下記式（３）で表される１価の基を示し、
Ｚ¹及びＺ²は、水素原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【化3】

〔式（３）中、
Ｒ²⁵は、単結合、炭素数１〜６のアルカンジイル基、又は炭素数１〜６のアルカンジイル基の炭素原子の一部がアミド結合に置き換わった基を示し、
Ｙは、ヒドロキシ基、カルボキシ基、第１級アミノ基、Ｃ１〜３アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジＣ１〜３アルキルアミノ基又は下記式（４）で表される基を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【化4】

〔式（４）中、
Ｒ²⁶〜Ｒ²⁸は、それぞれ独立して、非置換の炭素数６〜１２の芳香族炭化水素基又はハロゲン原子が置換している炭素数６〜１２の芳香族炭化水素基を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【請求項2】

Ｙが、ヒドロキシ基、カルボキシ基、第１級アミノ基、Ｃ１〜３アルキルアミノ基又はＮ，Ｎ−ジＣ１〜３アルキルアミノ基である、請求項１に記載のイリジウム錯体。

【請求項3】

Ｙが、ヒドロキシ基、カルボキシ基又はＮ，Ｎ−ジＣ１〜３アルキルアミノ基である、請求項１に記載のイリジウム錯体。

【請求項4】

Ｒ²⁵が、単結合、又は炭素数１〜６のアルカンジイル基の炭素原子の一部がアミド結合に置き換わった基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のイリジウム錯体。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のイリジウム錯体を含む、酸素濃度測定試薬。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のイリジウム錯体を含む、スフェロイド内酸素濃度測定試薬。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のイリジウム錯体を用いる、酸素濃度測定方法。

【請求項8】

請求項１〜４のいずれか１項に記載のイリジウム錯体を用いる、スフェロイド内の酸素濃度を測定する方法。

【請求項9】

下記式（５）で表されるイリジウム錯体。

【化5】

〔式（５）中、
Ｒ³¹は、下記式（６）で表される１価の基を示し、Ｒ³²及びＲ³³は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（６）で表される１価の基を示し、Ｒ³⁴〜Ｒ⁵⁴は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を示す。〕

【化6】

〔式（６）中、
Ｒ⁵⁵は、炭化水素基を示し、
Ｚ³及びＺ⁴は、水素原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【請求項10】

Ｒ⁵⁵が、炭素数１〜１２のアルキル基である、請求項９に記載のイリジウム錯体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規イリジウム錯体、酸素濃度測定試薬、酸素濃度測定方法及び合成中間体に関する。より詳細には、新規イリジウム錯体、当該錯体を用いた酸素濃度測定試薬及び酸素濃度測定方法、並びに前記錯体の合成中間体に関する。

【背景技術】

【0002】

創薬開発や分子生物学研究の分野において、細胞培養技術によって培養した細胞が、薬剤の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターとして広く利用されている。従来、平面基板上で細胞は培養されていたが、この手法で培養した細胞（平面培養細胞）は二次元方向に広がった単層細胞であるため、三次元組織である生体内の細胞と機能が異なる場合があるという報告があり、近年では、生体内の細胞に近い機能を有する三次元組織であるスフェロイドが注目されている。

【0003】

一方、細胞内や生体組織内の酸素濃度を測定する方法として、酸素濃度に依存してりん光を発する化合物を用いた方法が提案されている。
例えば、平面培養細胞内の酸素濃度を測定する方法として、２−フェニルキノリンを配位子とするイリジウム錯体を用いる方法、２−（２−ピリジニル）−１−ベンゾチオフェンとアセチルアセトンとを配位子とするイリジウム錯体を用いる方法、この錯体にペプチド残基を導入したイリジウム錯体を用いる方法が知られている（特許文献１、２）。
また、スフェロイド内の酸素濃度を測定する方法としては、ビス［２−（２’−ベンゾチエニル）−ピリジナト−Ｎ，Ｃ３’］イリジウム（アセチルアセトナート）を用いる方法が報告されている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第４９３０９４３号公報

【特許文献2】特許第５３９２７４６号公報

【特許文献3】国際公開第２０１５／０８８００５号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、上記イリジウム錯体は、いずれも赤色りん光を発するものであった。赤色りん光を発する酸素濃度測定試薬を用いた場合、代謝過程や発現タンパク質等を調べるためのプローブとして赤色以外の色調の光を発現するプローブを選択する必要が生じる。また、赤色りん光ではシャープな画像が得られにくいため、緑色りん光を発する酸素濃度測定試薬の開発が望まれる。
一方、緑色りん光を発するイリジウム錯体として、トリス［２−（２−ピリジニル）フェニル］イリジウム（ＩＩＩ）（以下、「ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３」とも称する）が知られているが、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３を細胞内や生体組織内の酸素濃度測定試薬として実際に用いたという具体的な報告はない。そこで、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３について本発明者らが検討を行ったところ、スフェロイド内への移行性に劣るものであることが判明した。

【0006】

本発明が解決しようとする課題は、緑色りん光を発し、且つ酸素濃度測定試薬として有用な新規イリジウム錯体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、特定の１価の基を有するイリジウム錯体が、緑色りん光を発し、且つ酸素濃度測定試薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。

【0009】

〔１〕 イリジウムを中心原子として含む単核錯体であって、下記式（Ａ）で表される配位子を含有する、イリジウム錯体（以下、この錯体を「本発明のイリジウム錯体」とも称する）。

【0010】

【化1】

【0011】

〔式（Ａ）中、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｇ及びＲ^ｈは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（２）で表される１価の基を示し、
＊は、イリジウム原子との結合位置を示す。
但し、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｇ及びＲ^ｈのうち少なくとも１つ以上は、式（２）で表される１価の基である。〕

【0012】

【化2】

【0013】

〔式（２）中、
Ｘは、親水性基を含む１価の基を示し、
Ｚ^１及びＺ^２は、それぞれ独立して、親水性基を含む１価の基、水素原子、１価の有機基、又はハロゲン原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0014】

〔２〕 下記式（１）で表されるイリジウム錯体。

【0015】

【化3】

【0016】

〔式（１）中、
Ｒ^１〜Ｒ^２４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は上記式（２）で表される１価の基を示す。
但し、Ｒ^１〜Ｒ^２４のうち少なくとも１つ以上は、上記式（２）で表される１価の基である。〕

【0017】

〔３〕 Ｒ^１が、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^２及びＲ^３が、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^２４が、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である〔２〕に記載のイリジウム錯体。

【0018】

〔４〕 Ｘが、下記式（３）で表される１価の基である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のイリジウム錯体。

【0019】

【化4】

【0020】

〔式（３）中、
Ｒ^２５は、単結合又は２価の有機基を示し、
Ｙは、１価の親水性基を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0021】

〔５〕 前記１価の親水性基が、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、リン原子含有基、メルカプト基、アルデヒド基、スルホ基又はカルバモイル基である〔４〕に記載のイリジウム錯体。

【0022】

〔６〕 前記１価の親水性基が、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基又はリン原子含有基である〔４〕又は〔５〕に記載のイリジウム錯体。

【0023】

〔７〕 Ｚ^１及びＺ^２が、それぞれ独立して、親水性基を含む１価の基、又は水素原子である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のイリジウム錯体。

【0024】

〔８〕 〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のイリジウム錯体を含む、酸素濃度測定試薬（以下、「本発明の酸素濃度測定試薬」とも称する）。
〔９〕 〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のイリジウム錯体を含む、スフェロイド内酸素濃度測定試薬。

【0025】

〔１０〕 〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のイリジウム錯体を用いる、酸素濃度測定方法（以下、「本発明の酸素濃度測定方法」とも称する）。
〔１１〕 〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のイリジウム錯体を用いる、スフェロイド内の酸素濃度を測定する方法。

【0026】

〔１２〕 イリジウムを中心原子として含む単核錯体であって、下記式（Ｂ）で表される配位子を含有する、イリジウム錯体（以下、この錯体を「本発明の合成中間体」とも称する）。

【0027】

【化5】

【0028】

〔式（Ｂ）中、
Ｒ^ｓ、Ｒ^ｔ、Ｒ^ｕ、Ｒ^ｖ、Ｒ^ｗ、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ及びＲ^ｚは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（６）で表される１価の基を示し、
＊は、イリジウム原子との結合位置を示す。
但し、Ｒ^ｓ、Ｒ^ｔ、Ｒ^ｕ、Ｒ^ｖ、Ｒ^ｗ、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ及びＲ^ｚのうち少なくとも１つ以上は、式（６）で表される１価の基である。〕

【0029】

【化6】

【0030】

〔式（６）中、
Ｒ^５５は、炭化水素基を示し、
Ｚ^３及びＺ^４は、それぞれ独立して、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^５６（Ｒ^５６は炭化水素基を示す）、水素原子、１価の有機基、又はハロゲン原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0031】

〔１３〕 下記式（５）で表されるイリジウム錯体。

【0032】

【化7】

【0033】

〔式（５）中、
Ｒ^３１〜Ｒ^５４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は上記式（６）で表される１価の基を示す。
但し、Ｒ^３１〜Ｒ^５４のうち少なくとも１つ以上は、上記式（６）で表される１価の基である。〕

【0034】

〔１４〕 Ｒ^３１が、式（６）で表される１価の基であり、Ｒ^３２及びＲ^３３が、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（６）で表される１価の基であり、Ｒ^３４〜Ｒ^５４が、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である〔１３〕に記載のイリジウム錯体。

【0035】

〔１５〕 Ｚ^３及びＺ^４が、それぞれ独立して、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^５６、又は水素原子である〔１２〕〜〔１４〕のいずれかに記載のイリジウム錯体。

【発明の効果】

【0036】

本発明のイリジウム錯体は、緑色りん光を発し、且つ酸素濃度測定試薬として有用である。
また、本発明の合成中間体は、本発明のイリジウム錯体の合成中間体として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1-1】ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３及び実施例１〜４で得たイリジウム錯体の吸収スペクトル（空気飽和下）及びりん光スペクトル（真空脱気下）を示す図である。

【図1-2】実施例１、５で得たイリジウム錯体の吸収スペクトル（空気飽和下）及びりん光スペクトル（空気飽和下）を示す図である。

【図2-1】ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３のスフェロイド内移行性を示す画像である。

【図2-2】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）のスフェロイド内移行性を示す画像である。

【図2-3】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）のスフェロイド内移行性を示す画像である。

【図2-4】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＤＭ）のスフェロイド内移行性を示す画像である。

【図2-5】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＴＰＰ）のスフェロイド内移行性を示す画像である。

【図3】実施例１〜４で得たイリジウム錯体の平面培養細胞内移行性を示す画像である。

【図4-1】直径４０〜１１０μｍの範囲のスフェロイド内のりん光強度を数値化した図である。

【図4-2】直径１〜４０μｍの範囲のスフェロイド内のりん光強度を数値化した図である。

【図5-1】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）によるＨＴ２９細胞の低酸素領域検出結果を示す画像である。

【図5-2】ＬＯＸ−１によるＨＴ２９細胞の低酸素領域検出結果を示す画像である。

【図5-3】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）によるＰＡＮＣ−１細胞の低酸素領域検出結果を示す画像である。

【図5-4】ＬＯＸ−１によるＰＡＮＣ−１細胞の低酸素領域検出結果を示す画像である。

【図6-1】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）とＢＴＰＤＭ１を平面培養細胞に添加した後に緑色りん光イメージングした画像である。

【図6-2】（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）とＢＴＰＤＭ１を平面培養細胞に添加した後に赤色りん光イメージングした画像である。

【図6-3】（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３ＩｒとＢＴＰＤＭ１を平面培養細胞に添加した後に緑色りん光イメージングした画像である。

【図6-4】（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３ＩｒとＢＴＰＤＭ１を平面培養細胞に添加した後に赤色りん光イメージングした画像である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

＜イリジウム錯体＞
本発明のイリジウム錯体は、イリジウムを中心原子として含む単核錯体であって、下記式（Ａ）で表される配位子（以下、「配位子（Ａ）」とも称する）を含有することを特徴とするものである。なお、イリジウム原子と式（Ａ）中の窒素原子との間の結合は、配位結合である。また、本発明のイリジウム錯体に光学異性体が存在する場合はいずれの光学異性体であってもよく、また、１種の光学異性体を単独で用いても、複数の光学異性体を組み合わせて用いてもよい。

【0039】

【化8】

【0040】

〔式（Ａ）中、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｇ及びＲ^ｈは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（２）で表される１価の基を示し、
＊は、イリジウム原子との結合位置を示す。
但し、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｇ及びＲ^ｈのうち少なくとも１つ以上は、式（２）で表される１価の基である。〕

【0041】

【化9】

【0042】

〔式（２）中、
Ｘは、親水性基を含む１価の基を示し、
Ｚ^１及びＺ^２は、それぞれ独立して、親水性基を含む１価の基、水素原子、１価の有機基、又はハロゲン原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0043】

本発明のイリジウム錯体において、配位子（Ａ）は、二座配位子として中心原子（イリジウム原子）に配位している。また、配位子（Ａ）の個数は、本発明のイリジウム錯体１分子あたり、通常１〜３個であるが、細胞内移行性、オルガネラ局在性、低毒性、合成しやすさ、溶解性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度やりん光量子収率、りん光寿命の観点から、好ましくは２〜３個である。
配位子（Ａ）としては、下記式（Ａ−２）で表される配位子が好ましい。

【0044】

【化10】

【0045】

〔式（Ａ−２）中、各記号は式（Ａ）中の各記号と同義である。〕

【0046】

また、配位子（Ａ）の個数が１又は２個の場合、本発明のイリジウム錯体は、配位子（Ａ）以外の配位子を含有していてもよい。配位子（Ａ）以外の配位子としては、配位子（Ａ）以外のフェニルピリジン系配位子の他、２−フェニルキノリン、２−フェニル−８−メチルキノリン等のフェニルキノリン系配位子；１−フェニルイソキノリン等のフェニルイソキノリン系配位子；２−（２−ピリジニル）−１−ベンゾチオフェン等のピリジニルベンゾチオフェン系配位子；アセチルアセトン、トリフルオロアセチルアセトン、ヘキサフルオロアセチルアセトン等のアセチルアセトン系配位子；２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）キノリン；１−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）イソキノリン；６−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）ベンゾ［ｃ］キノリン等が挙げられるが、配位子（Ａ）以外のフェニルピリジン系配位子が好ましい。

【0047】

本発明のイリジウム錯体としては、細胞内移行性、オルガネラ局在性、低毒性、合成しやすさ、溶解性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度やりん光量子収率、りん光寿命の観点から、下記式（１）で表されるイリジウム錯体が好ましい。なお、式（１）中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0048】

【化11】

【0049】

〔式（１）中、
Ｒ^１〜Ｒ^２４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は上記式（２）で表される１価の基を示す。
但し、Ｒ^１〜Ｒ^２４のうち少なくとも１つ以上は、上記式（２）で表される１価の基である。〕

【0050】

ここで、式（Ａ）、（Ａ−２）、（１）、（２）中の各記号について説明する。
Ｒ^ａ〜Ｒ^ｈ、Ｒ^１〜Ｒ^２４で示されるアルキル基としては、直鎖状又は分枝状のアルキル基が好ましい。また、当該アルキル基の炭素数は１〜６であるが、好ましくは１又は２である。当該アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基等が挙げられる。

【0051】

また、式（Ａ）、（Ａ−２）中、Ｒ^ａ〜Ｒ^ｈのうち少なくとも１つ以上は、式（２）で表される１価の基であり、式（１）中、Ｒ^１〜Ｒ^２４のうち少なくとも１つ以上は、式（２）で表される１価の基である。
この構成によって、本発明のイリジウム錯体は、スフェロイド内に移行しやすいものとなる。また、本発明のイリジウム錯体は、式（２）中の炭素原子（Ｘ、Ｚ^１及びＺ^２と結合した炭素原子）を有することによって、所望の緑色りん光を発するものであり、上記炭素原子がない場合には所望の緑色りん光が得られなくなる。

【0052】

式（Ａ）、（Ａ−２）中、細胞内移行性、オルガネラ局在性、低毒性、合成しやすさ、溶解性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度やりん光量子収率、りん光寿命の観点から、上記Ｒ^ａ〜Ｒ^ｈのうち、１〜４個が式（２）で表される１価の基であるのが好ましく、１〜３個が式（２）で表される１価の基であるのがより好ましく、１〜２個が式（２）で表される１価の基であるのが更に好ましく、１個が式（２）で表される１価の基であるのが特に好ましい。
また、式（Ａ）、（Ａ−２）中、合成しやすさ、細胞内移行性、オルガネラ局在性、溶解性、安定性の観点から、Ｒ^ａ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｆ及びＲ^ｇのうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基であるのが好ましく、Ｒ^ａ及びＲ^ｇのうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基であるのがより好ましく、Ｒ^ａが式（２）で表される１価の基であるのが特に好ましい。

【0053】

また、式（Ａ）、（Ａ−２）中、Ｒ^ａとしては、合成しやすさ、細胞内移行性、オルガネラ局在性、溶解性、安定性の観点から、水素原子、式（２）で表される１価の基が好ましく、式（２）で表される１価の基がより好ましい。
Ｒ^ｂ〜Ｒ^ｈとしては、合成しやすさ、安定性の観点から、水素原子が好ましい。

【0054】

式（Ａ）、（Ａ−２）中、Ｒ^ａ〜Ｒ^ｈの組み合わせとしては、合成しやすさ、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、
Ｒ^ａ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｆ及びＲ^ｇが、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ及びＲ^ｈが、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ^ａ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｆ及びＲ^ｇのうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基である組み合わせが好ましく、
Ｒ^ａ及びＲ^ｇが、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ及びＲ^ｈが、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ^ａ及びＲ^ｇのうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基である組み合わせがより好ましく、
Ｒ^ａが、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^ｂ〜Ｒ^ｈが、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である組み合わせが更に好ましく、
Ｒ^ａが、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^ｂ〜Ｒ^ｈが、水素原子である組み合わせが特に好ましい。

【0055】

また、式（１）中、細胞内移行性、オルガネラ局在性、低毒性、合成しやすさ、溶解性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度やりん光量子収率、りん光寿命の観点から、上記Ｒ^１〜Ｒ^２４のうち、１〜１２個が式（２）で表される１価の基であるのが好ましく、１〜９個が式（２）で表される１価の基であるのがより好ましく、１〜６個が式（２）で表される１価の基であるのが更に好ましく、１〜３個が式（２）で表される１価の基であるのが更に好ましく、２又は３個が式（２）で表される１価の基であるのが特に好ましい。
また、式（１）中、合成しやすさ、細胞内移行性、オルガネラ局在性、溶解性、安定性の観点から、Ｒ^１〜Ｒ^３、Ｒ^７〜Ｒ^９及びＲ^１６〜Ｒ^２１のうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基であるのが好ましく、Ｒ^１〜Ｒ^３及びＲ^１９〜Ｒ^２１のうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基であるのがより好ましく、Ｒ^１〜Ｒ^３のうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基であるのが特に好ましい。

【0056】

また、式（１）中、Ｒ^１としては、合成しやすさ、細胞内移行性、オルガネラ局在性、溶解性、安定性の観点から、水素原子、式（２）で表される１価の基が好ましく、式（２）で表される１価の基がより好ましい。
Ｒ^２としては、合成しやすさ、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、水素原子、式（２）で表される１価の基が好ましく、式（２）で表される１価の基が特に好ましい。
Ｒ^３としては、合成しやすさ、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、水素原子、式（２）で表される１価の基が好ましい。
Ｒ^４〜Ｒ^２４としては、合成しやすさ、安定性の観点から、水素原子が好ましい。

【0057】

式（１）中、Ｒ^１〜Ｒ^２４の組み合わせとしては、合成しやすさ、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、
Ｒ^１〜Ｒ^３、Ｒ^７〜Ｒ^９及びＲ^１６〜Ｒ^２１が、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^６、Ｒ^１０〜Ｒ^１５及びＲ^２２〜Ｒ^２４が、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ^１〜Ｒ^３、Ｒ^７〜Ｒ^９及びＲ^１６〜Ｒ^２１のうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基である組み合わせが好ましく、
Ｒ^１〜Ｒ^３及びＲ^１９〜Ｒ^２１が、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^１８及びＲ^２２〜Ｒ^２４が、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ^１〜Ｒ^３及びＲ^１９〜Ｒ^２１のうち少なくとも１つ以上が式（２）で表される１価の基である組み合わせがより好ましく、
Ｒ^１が、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^２及びＲ^３が、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^２４が、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である組み合わせが更に好ましく、
Ｒ^１が、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^２及びＲ^３が、それぞれ独立して、水素原子又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^２４が、水素原子である組み合わせが更に好ましく、
Ｒ^１及びＲ^２が、式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^３が、水素原子又は式（２）で表される１価の基であり、Ｒ^４〜Ｒ^２４が、水素原子である組み合わせが特に好ましい。

【0058】

式（２）中、Ｘは、親水性基を含む１価の基を示す。この構成によって、本発明のイリジウム錯体は、細胞内移行性、オルガネラ局在性、溶解性、ハンドリング性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度等が良好なものとなる。当該１価の基における親水性基の置換位置及び置換個数は任意であるが、その個数は、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、特に好ましくは１又は２個である。

【0059】

上記親水性基は、アニオン性、カチオン性、中性のいずれでもよい。親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、リン原子含有基、メルカプト基、アルデヒド基、スルホ基、カルバモイル基等の１価の親水性基；ポリオキシアルキレン基、アミド結合等の２価以上の親水性基が挙げられ、Ｘで示される１価の基は、これらのうち１種のみを含んでいても２種以上を含んでいてもよい。上記親水性基の中でも、細胞内移行性、合成しやすさ、安定性の観点から、１価又は２価の親水性基が好ましく、１価の親水性基、アミド結合がより好ましく、１価の親水性基が更に好ましい。

【0060】

上記アミノ基としては、第１級アミノ基（−ＮＨ_２）；アルキルアミノ基等の第２級アミノ基；Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ基等の第３級アミノ基が挙げられる。アルキルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ基におけるアルキル基は、直鎖状、分枝状、環状のいずれでもよい。また、当該アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜１５であり、より好ましくは１〜９であり、特に好ましくは１〜３である。アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。また、上記アミノ基の中では、第３級アミノ基が好ましい。

【0061】

上記リン原子含有基としては、リン原子を基中に１個含有するものが好ましい。また、リン原子含有基としては、例えば、下記式（４）で表される基、リン酸基等が挙げられ、式（４）で表される基が好ましい。なお、本発明のイリジウム錯体が式（４）で表される基を有する場合、本発明のイリジウム錯体は対アニオンを有していてもよい。対アニオンとしては、例えば、Ｆ⁻、Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻等のハロゲン化物イオン；ＣｌＯ_４⁻、ＢＦ_４⁻、ＣＨ_３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ⁻、ＰＦ_６⁻等の酸の対アニオン等が挙げられる。

【0062】

【化12】

【0063】

〔式（４）中、
Ｒ^２６〜Ｒ^２８は、それぞれ独立して、置換又は非置換の炭化水素基を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0064】

Ｒ^２６〜Ｒ^２８で示される炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。これらの中では、芳香族炭化水素基が好ましい。

【0065】

上記脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１２であり、特に好ましくは１〜６である。脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよい。また、脂肪族炭化水素基は、分子内に不飽和結合を有していてもよいが、アルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
上記脂環式炭化水素基の炭素数は、好ましくは３〜１２であり、より好ましくは３〜８である。また、脂環式炭化水素基としては、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。
上記芳香族炭化水素基の炭素数は、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは６〜８である。また、芳香族炭化水素基としては、具体的には、フェニル基、トリル基、キシリル基等のアリール基が挙げられる。
Ｒ^２６〜Ｒ^２８における置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。

【0066】

上記１価の親水性基の中では、細胞内移行性、合成しやすさ、ハンドリング性、低毒性、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、リン原子含有基が好ましく、細胞内移行性の観点から、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基がより好ましい。なお、本発明のイリジウム錯体が、ヒドロキシ基、カルボキシ基を有する場合、小胞体に局在しやすくなり、アミノ基を有する場合、リソソームに局在しやすくなり、リン原子含有基を有する場合、ミトコンドリアに局在しやすくなる。
これらの中でも、スフェロイド内移行性、低毒性の観点からは、ヒドロキシ基、カルボキシ基が更に好ましく、ハンドリング性の観点から、ヒドロキシ基が特に好ましい。一方、平面培養細胞内移行性の観点からは、アミノ基が特に好ましい。

【0067】

また、Ｘとしては、細胞内移行性、合成しやすさ、安定性、低酸素状態（特に細胞内）でのりん光強度の観点から、下記式（３）で表される１価の基が好ましい。

【0068】

【化13】

【0069】

〔式（３）中、
Ｒ^２５は、単結合又は２価の有機基を示し、
Ｙは、１価の親水性基を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0070】

Ｙで示される１価の親水性基としては、上記で親水性基の一例として挙げた１価の親水性基と同様のものが挙げられる。

【0071】

また、Ｒ^２５で示される２価の有機基としては、置換又は非置換の２価の炭化水素基、当該置換又は非置換の２価の炭化水素基の炭素原子の一部がエーテル結合、アミド結合、エステル結合及びチオ基から選ばれる１種以上に置き換わった基が好ましく、置換又は非置換の２価の炭化水素基、当該置換又は非置換の２価の炭化水素基の炭素原子の一部がアミド結合に置き換わった基がより好ましい。
なお、置換又は非置換の２価の炭化水素基の炭素原子の一部がエーテル結合、アミド結合、エステル結合及びチオ基から選ばれる１種以上に置き換わった基において、エーテル結合、アミド結合、エステル結合、チオ基は１つでもよく、２つ以上でもよい。
また、Ｒ^２５で示される２価の有機基の総炭素数としては、１〜４２が好ましく、１〜３０がより好ましく、１〜１８が更に好ましく、１〜６が特に好ましい。

【0072】

また、Ｒ^２５における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基のいずれでもよい。これらの中では、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。

【0073】

上記２価の脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜４２であり、より好ましくは１〜３０であり、更に好ましくは１〜１８であり、特に好ましくは１〜６である。２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよい。また、２価の脂肪族炭化水素基は、分子内に不飽和結合を有していてもよいが、アルカンジイル基が好ましい。アルカンジイル基としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
上記２価の脂環式炭化水素基の炭素数は、好ましくは３〜２０であり、より好ましくは３〜１６であり、更に好ましくは３〜１２であり、特に好ましくは３〜８である。具体的には、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロへキシレン基等のシクロアルキレン基が挙げられる。
上記２価の芳香族炭化水素基の炭素数は、好ましくは６〜１８であり、より好ましくは６〜１２であり、特に好ましくは６〜８である。具体的には、フェニレン基、ナフチレン基等のアリーレン基が挙げられる。
なお、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基の結合部位は、環上のいずれの炭素上でもよい。
Ｒ^２５における置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子等が挙げられる。

【0074】

また、式（２）中、Ｚ^１及びＺ^２は、それぞれ独立して、親水性基を含む１価の基、水素原子、１価の有機基、又はハロゲン原子を示す。
Ｚ^１及びＺ^２で示される親水性基を含む１価の基としては、Ｘで示される親水性基を含む１価の基と同様のものが挙げられる。
Ｚ^１及びＺ^２で示される１価の有機基としては、置換又は非置換の炭化水素基が挙げられる。当該置換又は非置換の炭化水素基としては、Ｒ^２６で示される置換又は非置換の炭化水素基と同様のものが挙げられる。
Ｚ^１及びＺ^２で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
上記の中でも、Ｚ^１、Ｚ^２としては、合成しやすさの観点から、親水性基を含む１価の基、水素原子が好ましく、水素原子が特に好ましい。

【0075】

＜合成中間体＞
本発明の合成中間体は、下記式（Ｂ）で表される配位子を含有し、イリジウムを中心原子として含む単核錯体である。なお、イリジウム原子と式（Ｂ）中の窒素原子との間の結合は、配位結合である。
式（Ｂ）で表される配位子としては、式（Ｂ−２）で表される配位子が好ましい。また、本発明の合成中間体としては、下記式（５）で表されるイリジウム錯体が好ましい。

【0076】

【化14】

【0077】

〔式（Ｂ）中、
Ｒ^ｓ、Ｒ^ｔ、Ｒ^ｕ、Ｒ^ｖ、Ｒ^ｗ、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ及びＲ^ｚは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は下記式（６）で表される１価の基を示し、
＊は、イリジウム原子との結合位置を示す。
但し、Ｒ^ｓ、Ｒ^ｔ、Ｒ^ｕ、Ｒ^ｖ、Ｒ^ｗ、Ｒ^ｘ、Ｒ^ｙ及びＲ^ｚのうち少なくとも１つ以上は、式（６）で表される１価の基である。〕

【0078】

【化15】

【0079】

〔式（６）中、
Ｒ^５５は、炭化水素基を示し、
Ｚ^３及びＺ^４は、それぞれ独立して、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^５６（Ｒ^５６は炭化水素基を示す）、水素原子、１価の有機基、又はハロゲン原子を示し、
＊は、結合手を示す。〕

【0080】

【化16】

【0081】

〔式（Ｂ−２）中、各記号は式（Ｂ）中の各記号と同義である。〕

【0082】

【化17】

【0083】

〔式（５）中、
Ｒ^３１〜Ｒ^５４は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又は上記式（６）で表される１価の基を示す。
但し、Ｒ^３１〜Ｒ^５４のうち少なくとも１つ以上は、上記式（６）で表される１価の基である。〕

【0084】

式（Ｂ）、（Ｂ−２）、（５）、（６）中の各記号の定義は、Ｘ、Ｚ^１及びＺ^２における親水性基を含む１価の基が、これを誘導する−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^５５、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ^５６であること以外は、式（Ａ）、（Ａ−２）、（１）、（２）中の各記号の定義と同義である。Ｒ^５５、Ｒ^５６で示される炭化水素基としては、Ｒ^２６〜Ｒ^２８で示される炭化水素基と同様のものが挙げられるが、脂肪族炭化水素基が好ましく、アルキル基がより好ましい。

【0085】

次に、本発明のイリジウム錯体の合成方法について説明する。
本発明のイリジウム錯体は、常法や文献（特開２００４−１６８７５６号公報、国際公開第２０１２／０５７１３９号パンフレット、J. Poly. Sci. Part A: Poly. Chem., 46, 7517-7533, 2008.等）を参考にして合成することができる。加水分解や縮合反応、保護反応、脱保護反応等を必要に応じて適宜組み合わせて行ってもよい。
本発明のイリジウム錯体を合成する具体的な方法としては、例えば、以下の方法１〜４が挙げられる。
方法１：式（２）で表される１価の基を置換基として有する２−フェニルピリジン、又は式（２）で表される１価の基及び炭素数１〜６のアルキル基を置換基として有する２−フェニルピリジン（以下、これらを「ピリジン誘導体α」とも総称する）を鈴木カップリング反応等により調製し、２−フェニルピリジンを配位子とする塩素架橋２核イリジウム錯体（[Ｉｒ（ｐｐｙ）_２Ｃｌ]_２）又は炭素数１〜６のアルキル基を置換基として有する２−フェニルピリジンを配位子とする塩素架橋２核イリジウム錯体に、ピリジン誘導体αを有機配位子として反応させる方法。
方法２：ピリジン誘導体αと塩化イリジウム・３水和物とを反応させ、得られた塩素架橋２核イリジウム錯体に、２−フェニルピリジンを有機配位子として反応させる方法。
方法３：ピリジン誘導体αと塩化イリジウム・３水和物とを反応させ、得られた塩素架橋２核イリジウム錯体に、ピリジン誘導体αを有機配位子として反応させる方法。
なお、方法１〜３で用いるピリジン誘導体αとしては、例えば、６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール等が挙げられる。

【0086】

方法４：加水分解や縮合反応、脱保護反応等によって式（２）で表される１価の基に官能基変換（又は式（２）で表される１価の基を導入）できる基（以下、基βとも称する）を有する２−フェニルピリジン、又は基β及び炭素数１〜６のアルキル基を有する２−フェニルピリジン（以下、これらを「ピリジン誘導体γ」とも総称する）を鈴木カップリング反応等により調製し、ピリジン誘導体γを[Ｉｒ（ｐｐｙ）_２Ｃｌ]_２と反応させることで基βを有するイリジウム錯体（以下、「合成中間体δ」とも称する）を得て、この錯体に加水分解や縮合反応、脱保護反応等を行う方法。なお、方法４で用いるピリジン誘導体γとしては、２−（６−フェニルピリジン−３−イル）酢酸エチル等が挙げられる。
ここで、合成中間体δとしては、本発明の合成中間体が好ましく、式（５）で表されるイリジウム錯体がより好ましい。本発明の合成中間体は、本発明のイリジウム錯体の合成に有用な新規化合物である。本発明の合成中間体は、基βとしてエステル結合を有し、加水分解によって、カルボキシ基を親水性基として有するイリジウム錯体を誘導できる。また、この得られた錯体に、カルボキシ基以外の親水性基を有するアミン（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン、（２−アミノエチル）トリフェニルホスホニウム臭素塩等）を反応させることで、カルボキシ基以外の親水性基を有するイリジウム錯体を簡便に得ることもできる。

【0087】

そして、後記実施例に示すように、上記のようにして合成できる本発明のイリジウム錯体は、酸素濃度に依存して緑色りん光を発するものであり、酸素濃度が低いときに緑色りん光の強度や寿命が増大する。さらに、スフェロイド、平面培養細胞等の細胞内や生体組織内に移行しやすく、これら細胞内等の低酸素領域で強い緑色りん光を発するものである。
したがって、本発明のイリジウム錯体は、低酸素プローブ等の酸素濃度測定試薬として有用であり、酸素濃度測定方法に用いることができる。また、本発明のイリジウム錯体は、発現される緑色りん光が一般に使用されるフィルタを用いて観察できる色調であり、しかも、平面培養細胞内、スフェロイド内のいずれの酸素濃度測定にも用いることができるため、酸素濃度測定試薬として広範に利用することができる。また、本発明のイリジウム錯体は、細胞毒性が低い。

【0088】

＜酸素濃度測定試薬＞
本発明の酸素濃度測定試薬は、本発明のイリジウム錯体を含むものである。
本発明のイリジウム錯体の含有量は、本発明の酸素濃度測定試薬中、通常０．００５〜５質量％であり、好ましくは０．０１〜１質量％である。
また、本発明の酸素濃度測定試薬は、溶剤等を含んでいてもよい。溶剤としては、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類；エタノール、メタノール等のアルコール類；アセトニトリル等のニトリル類等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0089】

＜酸素濃度測定方法＞
本発明の酸素濃度測定方法は、本発明のイリジウム錯体を用いるものである。当該測定方法は、本発明のイリジウム錯体を用いる以外は特許文献１〜３等に記載の方法や常法と同様にして行えばよい。また、本発明のイリジウム錯体の使用量は、最終濃度で、通常０．０１〜１００μＭであり、好ましくは０．０５〜５０μＭである。

【0090】

本発明の酸素濃度測定方法としては、具体的には、測定対象と本発明のイリジウム錯体とを接触させる工程を含む方法が挙げられ、この接触を行った後、培養（通常１時間〜１４日間程度）を必要に応じて行い、りん光強度及び／又はりん光寿命を観察・測定すればよい。これによって、りん光が強いときやりん光寿命が長いときに酸素濃度が低いといった判定をすることや、酸素濃度とりん光強度との関係を求めておくことにより酸素濃度を定量的に測定することができる。

【0091】

測定対象としては、細胞、生体組織が挙げられる。また、マウスやラット等の実験動物を用いてもよく、これにより酸素濃度が低下している部位を検出できる。これらの中でも、測定対象としては細胞が好ましい。細胞は、平面培養細胞、スフェロイド、浮遊細胞のいずれでもよく、また、株化培養細胞でも初代培養細胞でもよい。細胞としては、具体的には、がん細胞、卵子細胞、受精卵細胞、精子細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、組織幹細胞、線維芽細胞、フィーダー細胞、血管内皮細胞、骨髄（幹）細胞、歯髄（幹）細胞、免疫細胞、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、膵臓細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、角膜細胞、網膜細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、滑膜由来細胞、滑膜幹細胞、骨芽細胞、歯芽細胞、歯根膜細胞、口腔粘膜細胞、鼻粘膜細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞、脂肪幹細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、表皮細胞、卵巣、赤血球、白血球、血小板、植物細胞等が挙げられる。

【0092】

なお、スフェロイド内の酸素濃度を測定する具体的な方法としては、スフェロイドを形成可能な培養基材上で細胞と本発明のイリジウム錯体とを接触させ、この接触を行った後に培養を行う方法や、スフェロイドを形成可能な培養基材上でスフェロイドを形成させ、当該スフェロイドと本発明のイリジウム錯体とを接触させ、この接触を行った後に培養を行う方法等が挙げられる。

【0093】

また、りん光強度及び／又はりん光寿命の観察・測定は、イリジウム錯体を励起してりん光を観察できるような蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置等を用いて行えばよい。

【0094】

そして、本発明の酸素濃度測定方法は、細胞内や生体組織内の酸素濃度のモニタリング、細胞内や生体組織内の酸素濃度に変化を及ぼす化合物のスクリーニング等に有用であり、共染色、多色イメージング等に用いることもできる。

【実施例】

【0095】

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例における¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−ＥＣＳ４００を用いて測定した（内部標準物質：テトラメチルシラン、溶媒：重クロロホルム（ＣＤＣｌ_３）、重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ_６））。
また、下記式で表されるイリジウム錯体（ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３）は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨより購入して使用した。なお、式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0096】

【化18】

【0097】

〔実施例１〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）における式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0098】

【化19】

【0099】

（１） （６−フェニルピリジン−３−イル）メタノールの合成
フェニルボロン酸（３．１ｇ，２５．４ｍｍｏｌ）、（６−クロロピリジン−３−イル）メタノール（３．４ｇ，２３．７ｍｍｏｌ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１．１ｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を、トルエン（７５ｍＬ）、エタノール（２５ｍＬ）及び２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）の混合液に加え、窒素ガス雰囲気下で６時間還流した。これを室温に冷却後、脱イオン水を加え、クロロホルムで抽出を行い、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル）を用いて精製した（（６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール，４．０ｇ，２１．６ｍｍｏｌ，９１％）。
¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.66(s, 1H), 7.99-7.98(d, 2H), 7.82-7.74(dd, 2H), 7.50-7.40(m, 3H), 4.77(s, 2H)

【0100】

（２） （ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）の合成
[Ｉｒ（ｐｐｙ）_２Ｃｌ]_２（１．０９ｇ，１．０２ｍｍｏｌ）及び上記（１）で得た（６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール（０．５５ｇ，２．９７ｍｍｏｌ）を２−エトキシエタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、２０分間窒素バブリングを行った。その後、トリフルオロ酢酸銀（０．６８ｇ，３．０８ｍｍｏｌ）を素早く加え、窒素ガス雰囲気下１１０℃で溶液を１８時間撹拌した。これを室温に冷却後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９６：４，ｖ／ｖ）を用いて精製した。さらにリサイクル型分取クロマトグラフィーを用いて精製した（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ），０．４５ｇ，０．６５ｍｍｏｌ，３２％）。
¹HNMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.14-8.08 (m, 3H), 7.81-7.70 (m, 6H), 7.50-7.48 (d, 3H), 7.15-7.11 (t, 3H), 6.81-6.77 (m, 3H), 6.70-6.62 (m, 6H), 5.21-5.18 (t, 1H), 4.34-4.33 (d, 2H)

【0101】

〔実施例２〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）における式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0102】

【化20】

【0103】

（１） ２−（６−フェニルピリジン−３−イル）酢酸エチルの合成
フェニルボロン酸（３．５ｇ，２８．７ｍｍｏｌ）、２−（６−クロロピリジン−３−イル）酢酸エチル（５．２ｇ，２６．１ｍｍｏｌ）及びテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１．１ｇ，０．９５ｍｍｏｌ）を、シクロペンチルメチルエーテル（８０ｍＬ）及び２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）の混合液に加え、窒素ガス雰囲気下で１５時間還流した。これを室温に冷却後、脱イオン水を加え、クロロホルムで抽出を行い、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて精製した（２−（６−フェニルピリジン−３−イル）酢酸エチル，３．２ｇ，１３．３ｍｍｏｌ，５１％）。
¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.58(s, 1H), 7.97-7.95(d, 2H), 7.73-7.68(d, 2H), 7.50-7.40(m, 3H), 4.21-4.13(q, 2H), 3.67(s, 2H), 1.28-1.22(t, 3H)

【0104】

（２） （ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）の合成
２−フェニルピリジン（０．９８ｇ，６．３ｍｍｏｌ）及び塩化イリジウム・３水和物（１．０６ｇ，３ｍｍｏｌ）を、２−エトキシエタノール（１００ｍＬ）と水（３０ｍＬ）の混合液に懸濁させ、１５時間還流を行った。これを室温に冷却後、生成した黄色沈殿をろ別し、この固形物をメタノール及びヘキサンで洗浄し、[Ｉｒ（ｐｐｙ）_２Ｃｌ]_２を得た（１．４ｇ，１．３ｍｍｏｌ，８７％）。次いで、[Ｉｒ（ｐｐｙ）_２Ｃｌ]_２（０．５４ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）及び上記（１）で得た２−（６−フェニルピリジン−３−イル）酢酸エチル（０．３５ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を２−エトキシエタノール（４０ｍＬ）に溶解させ、２０分間窒素バブリングを行った。その後、トリフルオロ酢酸銀（０．３４ｇ，１．５４ｍｍｏｌ）を素早く加え、窒素ガス雰囲気下１１０℃で溶液を１８時間撹拌した。これを室温に冷却後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９８：２，ｖ／ｖ）を用いて精製した（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ），０．３０ｇ，０．４０ｍｍｏｌ，４０％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.15-8.09 (m, 3H), 7.82-7.72 (m, 6H), 7.50-7.42 (m, 3H), 7.15-7.11 (t, 2H), 6.82-6.78 (t, 3H), 6.72-6.62 (m, 6H), 4.02-3.96 (q, 2H), 3.57 (s, 2H), 1.09-1.08(t, 3H)

【0105】

（３） （ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）の合成
上記（２）で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）（２５０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）及び水酸化リチウム・１水和物（６０ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）、エタノール（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）の混合液に溶解させ、８０℃で１５時間撹拌した。これを室温に冷却後、５Ｎ塩酸を加えて溶液のｐＨを約３にした。この溶液に脱イオン水を加え、クロロホルムで抽出を行い、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ），２７８ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ，９８％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.18-8.08 (m, 3H), 7.78-7.70 (m, 6H), 7.50-7.42 (m, 3H), 7.14-7.10 (m, 2H), 6.82-6.75 (m, 3H), 6.70-6.60 (m, 6H), 3.46-3.42 (d, 2H)

【0106】

〔実施例３〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＤＭ）」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＤＭ）における式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0107】

【化21】

【0108】

実施例２で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）（７４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（２６ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を、乾燥ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１００μＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７０μＬ）を加えて室温で１５時間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し減圧乾固させた。得られた粗生成物をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９８：２，ｖ／ｖ）を用いて精製した（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＤＭ），５０ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ，６３％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.13-8.11 (d, 2H), 8.09-8.07 (d, 1H), 7.94-7.92 (t, 1H), 7.80-7.68 (m, 6H), 7.49-7.45 (t, 3H), 7.39 (s, 1H), 7.14-7.11 (t, 2H), 6.82-6.76 (m, 3H), 6.70-6.60 (m, 6H), 3.27 (s, 2H), 3.07-3.03 (m, 2H), 2.20-2.18 (m, 2H), 2.10, (s, 6H)

【0109】

〔実施例４〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＴＰＰ）」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＴＰＰ）における式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0110】

【化22】

【0111】

実施例２で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）（７４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（１９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を、乾燥ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、（２−アミノエチル）トリフェニルホスホニウム臭素塩（７８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７０μＬ）を加えて室温で１５時間撹拌した。その後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し減圧乾固させた。得られた粗生成物をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９８：２，ｖ／ｖ）を用いて精製した（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＴＰＰ），４０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，３７％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.42-8.40 (t, 1H), 8.15-8.13 (d, 1H), 8.08-8.04 (d, 2H), 7.88-7.62 (m, 21H), 7.48-7.44 (d, 2H), 7.36 (s, 1H), 7.11-7.07 (m, 2H), 6.72-6.76 (m, 3H), 6.70-6.60 (m, 6H), 3.70-3.64 (q, 2H), 3.19-3.17(d, 2H)

【0112】

〔実施例５〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒ」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒにおける式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0113】

【化23】

【0114】

（６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール（０．４１ｇ，２．２ｍｍｏｌ）及び塩化イリジウム・３水和物（０．３５ｇ，１ｍｍｏｌ）を、２−エトキシエタノール（３０ｍＬ）と水（１０ｍＬ）の混合液に懸濁させ、１５時間還流を行った。これを室温に冷却後、生成した沈殿をろ別し、この固形物をメタノール及びヘキサンで洗浄し、［Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２Ｃｌ］_２を得た（０．４８ｇ，０．４ｍｍｏｌ，８０％）。［Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２Ｃｌ］_２（０．６ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）及び（６−フェニルピリジン−３−イル）メタノール（０．４ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を２−エトキシエタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、２０分間窒素バブリングを行った。その後、トリフルオロ酢酸銀（０．３６ｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を素早く加え、窒素ガス雰囲気下１１０℃で溶液を１８時間撹拌した。これを室温に冷却後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をジオールシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９８：２，ｖ／ｖ）を用いて精製した。さらにリサイクル型分取クロマトグラフィーを用いて精製した（（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒ，１００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ，１３％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.11-8.09 (d, 3H), 7.74-7.70 (t, 6H), 7.51-7.50 (d, 2H), 7.48 (s, 1H), 6.81-6.87 (m, 3H), 6.70-6.60 (m, 6H), 5.22-5.20 (q, 3H), 4.37-4.35 (d, 1H), 4.34-4.33 (d, 2H)

【0115】

〔実施例６〕
下記式で表されるイリジウム錯体（以下、「（ｐｐｙ）Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２」とも称する）を以下の合成経路に従って合成した。なお、（ｐｐｙ）Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２における式中の窒素原子とイリジウム原子との間の実線は配位結合である。

【0116】

【化24】

【0117】

[Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２Ｃｌ]_２（０．６９ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）及び２−フェニルピリジン（０．２７ｇ，１．７５ｍｍｏｌ）を２−エトキシエタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、２０分間窒素バブリングを行った。その後、トリフルオロ酢酸銀（０．４２ｇ，１．９０ｍｍｏｌ）を素早く加え、窒素ガス雰囲気下１１０℃で溶液を１８時間撹拌した。これを室温に冷却後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルムとメタノールの混液，クロロホルム：メタノール＝９６：４，ｖ／ｖ）を用いて精製した。さらにリサイクル型分取クロマトグラフィーを用いて精製した（（ｐｐｙ）Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_２，１５０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ，１８％）。
¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.13-8.07 (m, 3H), 7.79-7.70 (m, 6H), 7.50-7.48 (d, 3H), 7.15-7.12 (t, 1H), 6.71-6.77 (3H), 6.70-6.60 (m, 6H), 5.22-5.20 (t, 2H), 4.34-4.33 (d, 4H)

【0118】

〔試験例１ 吸収スペクトル及びりん光スペクトル〕
ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３、実施例１〜５で得たイリジウム錯体の吸収スペクトル及びりん光スペクトルを以下の条件で測定した。結果を図１−１、図１−２に示す。
（吸収スペクトル測定条件）
装置：紫外可視分光光度計（Ｊａｓｃｏ製Ｕｂｅｓｔ−Ｖ５５０）
溶媒：アセトニトリル（空気飽和下）
測定温度：２２℃
（りん光スペクトル測定条件）
装置：蛍光光度計（浜松ホトニクス製Ｃ１００２７−０１）、絶対発光量子収率測定装置（浜松ホトニクス製Ｃ９９２０−０１）、蛍光寿命計（浜松ホトニクス製Ｃ１１３６７）
溶媒：アセトニトリル（真空脱気、空気飽和下）
測定温度：２２℃

【0119】

図１−１、図１−２に示すとおり、実施例１〜５で得たイリジウム錯体は、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３と非常によく似た吸収スペクトル、りん光スペクトルを示した。特に、実施例１〜５で得たイリジウム錯体は、りん光極大波長が５１０〜５４０ｎｍ付近にあり、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３と同様の緑色りん光を発することがわかった。

【0120】

〔試験例２ 光物理特性〕
ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３、実施例１〜６で得たイリジウム錯体をアセトニトリルにそれぞれ溶解させ、絶対発光量子収率測定装置（浜松ホトニクス製Ｃ９９２０−０１）及び蛍光寿命計（浜松ホトニクス製Ｃ１１３６７）を使用し真空脱気下又は空気飽和下で、真空脱気下のりん光寿命（τ_ｐ^０ （μｓ））、空気飽和下のりん光寿命（τ_ｐ （ｎｓ））、真空脱気下のりん光量子収率（Φ_ｐ^０）、空気飽和下のりん光量子収率（Φ_ｐ）をそれぞれ測定した。そして、真空脱気下のりん光寿命と空気飽和下のりん光寿命からτ_ｐ^０／τ_ｐを算出し、真空脱気下のりん光量子収率と空気飽和下のりん光量子収率からΦ_ｐ^０／Φ_ｐを算出した。
結果を表１に示す。なお、τ_ｐ^０／τ_ｐ又はΦ_ｐ^０／Φ_ｐの値が５を超えていれば低酸素応答性は概ね充分といえる。

【0121】

【表1】

【0122】

表１に示すとおり、実施例１〜６で得たイリジウム錯体は、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３と同様にτ_ｐ^０／τ_ｐ、Φ_ｐ^０／Φ_ｐの値が大きく、低酸素応答性が良好だった。

【0123】

〔試験例３ 細胞内移行性（スフェロイド内移行性）〕
ＨＴ２９細胞（１．２×１０^６個）と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、３次元培養プレート（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＮＣＰ−ＬＨ３８４）のウェルに、細胞数が３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように上記細胞懸濁液を添加し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で６日間培養した。その後、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３を５．０μＭの最終濃度でウェルに添加し、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３の添加から２４時間経過後、ＮｅｘＣｅｌｏｍｅ社製Ｃｅｌｉｇｏ（蛍光チャネル：Ｇｒｅｅｎ）を用いてりん光顕微画像を撮影し（ｅｘ／ｅｍ：４８３ｎｍ／５３６ｎｍ、露光時間：１００００μｓ）、スフェロイド内移行性を確認した。
また、実施例１〜４で得たイリジウム錯体についても、上記と同様の操作を行い、スフェロイド内移行性を確認した。さらに、実施例１〜４で得たイリジウム錯体については最終濃度１０．０μＭの試験も行った。
結果を図２−１〜図２−５に示す。なお、スフェロイドのサイズは約１００μｍになっていた。

【0124】

この結果、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３はスフェロイド内への移行性に劣るものであることが判明した（図２−１）。
これに対し、実施例１〜４で得たイリジウム錯体については、スフェロイド内への移行が確認された（図２−２〜図２−５）。
特に、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）、実施例２で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）は、５．０μＭ、１０．０μＭいずれの濃度でも非常に高い移行性を示した（図２−２、図２−３）。また、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）は、バックグラウンドの上昇もみられなかった（図２−２）。

【0125】

〔試験例４ 細胞内移行性（平面培養細胞内移行性）〕
ＨｅＬａ細胞と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地４ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、平面培養シャーレ（グライナー社製４区画シャーレ）のウェルに上記細胞懸濁液を添加した。次に、実施例１で得たイリジウム錯体を５００ｎＭの最終濃度でウェルに添加し、常酸素条件下（酸素濃度：２１体積％）、３７℃で２時間培養した。その後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ（−））でそれぞれ２回ずつ洗浄し、オリンパス社製ＩＸ−７１及びＰＨＯＴＯＭＥＴＲＩＣＳ社製Ｅｖｏｌｖｅ５１２を用いてりん光顕微画像を撮影し（励起波長：４５０〜５００ｎｍ、観測波長：５１５〜５６５ｎｍ、対物レンズ×１００）、平面培養細胞内移行性を確認した。
また、実施例２〜４で得たイリジウム錯体についても、上記と同様の操作を行い、平面培養細胞内移行性を確認した。
結果を図３に示す。

【0126】

この結果、実施例１〜４で得たイリジウム錯体は平面培養細胞内への移行性を有することが確認された。また、発光顕微画像の形態解析から、実施例１及び２で得たイリジウム錯体は小胞体に局在し、実施例３で得たイリジウム錯体はリソソームに局在し、実施例４で得たイリジウム錯体はミトコンドリアに局在することがわかった。

【0127】

〔試験例５ 平面培養細胞内りん光強度〕
ＨｅＬａ細胞（４．５×１０^６個）と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１５ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、平面培養プレート（グライナー社製９６穴ブラックプレート）のウェルに、細胞数が３．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように上記細胞懸濁液を添加した。次に、実施例１で得たイリジウム錯体を５００ｎＭの最終濃度でウェルに添加し、常酸素条件下（酸素濃度：２１体積％）、３７℃で２時間培養した。その後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ（−））でそれぞれ２回ずつ洗浄し、Ｔｅｃａｎ社製Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ ２００を用いてりん光強度測定を実施した（励起波長：４５０ｎｍ、観測波長：５３０ｎｍ）。
また、実施例２〜４で得たイリジウム錯体についても、上記と同様の操作を行い、平面培養細胞内りん光強度を測定した。
その結果、実施例１、２、３で得たイリジウム錯体はりん光強度が特に強く、実施例４で得たイリジウム錯体の約３．７倍（実施例１）、約２．６倍（実施例２）、約１２．２倍（実施例３）のりん光強度を示した。

【0128】

〔試験例６ 平面培養細胞内低酸素応答性〕
実施例１、３で得たイリジウム錯体について、平面培養細胞内低酸素応答性を確認した。
すなわち、試験例５におけるりん光強度の測定を行った後に、実施例１、３で得たイリジウム錯体を添加したＨｅＬａ細胞を、酸素濃度１０体積％、３７℃で２時間更に培養し、Ｔｅｃａｎ社製Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ ２００を用いてりん光強度を求めた（ｅｘ／ｅｍ：４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）。次に、酸素濃度２．５体積％、３７℃で２時間更に培養し、Ｔｅｃａｎ社製Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ ２００を用いてりん光強度を求めた（ｅｘ／ｅｍ：４５０ｎｍ／５３０ｎｍ）。その後、試験例５で求めたりん光強度（常酸素条件下（酸素濃度：２１体積％））を１００％として、酸素濃度１０体積％、酸素濃度２．５体積％で培養した後のりん光強度の相対値をそれぞれ算出した。
結果を表２に示す。

【0129】

【表2】

【0130】

〔試験例７ 細胞毒性〕
ＨＴ２９細胞又はＰＡＮＣ−１細胞（１．２×１０^６個）と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、３次元培養プレート（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＮＣＰ−ＬＨ３８４）のウェルに、細胞数が３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように上記細胞懸濁液を添加した。次に、ｆａｃ−Ｉｒ（ｐｐｙ）_３を０．５μＭ又は５．０μＭの最終濃度でウェルに添加し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で７日間培養した。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用し、このキットのプロトコルに従って、イリジウム錯体を添加していないネガティブコントロールに対する細胞生存率を求めた。
また、実施例１、２、５で得たイリジウム錯体についても、上記と同様の操作を行い、細胞生存率を求めた。
結果を表３〜６に示す。

【0131】

【表3】

【0132】

【表4】

【0133】

【表5】

【0134】

【表6】

【0135】

〔試験例８ スフェロイド内りん光強度〕
Ａ５４９細胞（１．２×１０^６個）と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、３次元培養プレート（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＮＣＰ−ＬＨ３８４）のウェルに、細胞数が３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように上記細胞懸濁液を添加し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で６日間培養した。その後、実施例１で得たイリジウム錯体を、１．０μＭ、２．０μＭ、５．０μＭ、７．５μＭ又は１０．０μＭの最終濃度でウェルに添加し、イリジウム錯体の添加から２４時間経過後、ＮｅｘＣｅｌｏｍｅ社製Ｃｅｌｉｇｏ（蛍光チャネル：Ｇｒｅｅｎ）を用いてりん光顕微画像を撮影し（ｅｘ／ｅｍ：５３１ｎｍ／６２９ｎｍ、露光時間：１００００μｓ）、ＮｅｘＣｅｌｏｍｅ社製Ｃｅｌｉｇｏの解析プログラムを使用して、直径４０〜１１０μｍの範囲のスフェロイド、直径１〜４０μｍの範囲のスフェロイドについて、スフェロイド内りん光強度をそれぞれ数値化した。
また、実施例５で得たイリジウム錯体を用いて上記と同様の操作を行い、直径４０〜１１０μｍの範囲のスフェロイド、直径１〜４０μｍの範囲のスフェロイドについて、スフェロイド内りん光強度をそれぞれ数値化した。
直径４０〜１１０μｍの範囲のスフェロイドについて解析した結果を図４−１に示し、直径１〜４０μｍの範囲のスフェロイドについて解析した結果を図４−２に示す。
なお、図４−１、図４−２の縦軸Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙは、スフェロイドの個数とＩｎｔｅｎｓｉｔｙとの積である（ｎ＝２の平均値）。

【0136】

この結果、図４−１では、実施例５で得た（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒは、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）の約３倍のりん光強度を示しており、実施例５で得た（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒは大きいサイズのスフェロイドに移行しやすいことがわかった。

【0137】

〔試験例９ 低酸素領域検出能〕
実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）の低酸素領域検出能を、市販の低酸素プローブ（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＬＯＸ−１）と比較した。なお、ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＬＯＸ−１は、赤色りん光を発するイリジウム錯体を含有する低酸素プローブである。
すなわち、ＨＴ２９細胞又はＰＡＮＣ−１細胞（１．２×１０^６個）と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１０ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、３次元培養プレート（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社製ＮＣＰ−ＬＨ３８４）のウェルに、細胞数が３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように上記細胞懸濁液を添加し、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で６日間培養した。その後、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）とＬＯＸ−１をそれぞれ２．５μＭの最終濃度でウェルに添加し、当該添加から２４時間経過後、ＮｅｘＣｅｌｏｍｅ社製Ｃｅｌｉｇｏを用いて以下の条件でりん光顕微画像を撮影した。
（（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）のりん光顕微画像撮影条件）
蛍光チャネル：Ｇｒｅｅｎ、ｅｘ／ｅｍ：４８３ｎｍ／５３６ｎｍ、露光時間：４０００μｓ
（ＬＯＸ−１のりん光顕微画像撮影条件）
蛍光チャネル：Ｒｅｄ、ｅｘ／ｅｍ：５３１ｎｍ／６２９ｎｍ、露光時間：４００００μｓ
実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）によるＨＴ２９細胞の低酸素領域検出結果を図５−１に示し、ＬＯＸ−１によるＨＴ２９細胞の低酸素領域検出結果を図５−２に示す。
また、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）によるＰＡＮＣ−１細胞の低酸素領域検出結果を図５−３に示し、ＬＯＸ−１によるＰＡＮＣ−１細胞の低酸素領域検出結果を図５−４に示す。

【0138】

この結果、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）が低酸素プローブとして有用であることが確認された。

【0139】

〔試験例１０ 細胞内多色イメージング〕
ＨｅＬａ細胞と１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地４ｍＬを混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、平面培養シャーレ（グライナー社製４区画シャーレ）のウェルに上記細胞懸濁液を添加した。次に、実施例１で得た（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）と下記式で表されるＢＴＰＤＭ１（赤色りん光を発し、リソソームに局在化するイリジウム錯体）をそれぞれ５００ｎＭの最終濃度でウェルに添加し、常酸素条件下（酸素濃度：２１体積％）、３７℃で２時間培養した。

【0140】

【化25】

【0141】

その後、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ（−））でそれぞれ２回ずつ洗浄し、オリンパス社製ＩＸ−７１及びＰＨＯＴＯＭＥＴＲＩＣＳ社製Ｅｖｏｌｖｅ５１２を用いてりん光顕微画像を撮影した（励起波長：４５０〜５００ｎｍ、観測波長：５１５〜５６５ｎｍ）。次に、励起波長：４８０〜５５０ｎｍ、観測波長：＞５９０ｎｍのフィルタ（オリンパス社製Ｕ−ＭＳＷＧ２）に変更してりん光顕微画像を再度撮影した。
（ｐｐｙ）_２Ｉｒ（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）とＢＴＰＤＭ１でイメージングしたりん光顕微画像を、図６−１、図６−２に示す。
また、実施例５で得た（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３Ｉｒを用いて、上記と同様の操作で（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３ＩｒとＢＴＰＤＭ１による多色イメージングを行った。
（ｐｐｙ−５−ＣＨ_２ＯＨ）_３ＩｒとＢＴＰＤＭ１でイメージングしたりん光顕微画像をを、図６−３、図６−４に示す。
なお、図６−１〜図６−４の（ａ）は、励起波長：４５０〜５００ｎｍ、観測波長：５１５〜５６５ｎｍのフィルタを用いたりん光顕微画像であり、図６−１〜図６−４の（ｂ）は、励起波長：４８０〜５５０ｎｍ、観測波長：＞５９０ｎｍのフィルタを用いたりん光顕微画像である。

【0142】

この結果、実施例１、５で得たイリジウム錯体が、共染色、多色イメージングに有用であることが確認された。また、実施例１、５で得たイリジウム錯体は小胞体に局在していた。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】