特許 6934235 遺伝子発現制御のための発現制御核酸分子およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6934235

(24)【登録日】2021年8月25日

(45)【発行日】2021年9月15日

(54)【発明の名称】遺伝子発現制御のための発現制御核酸分子およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20210906BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210906BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20210906BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 110Z

   A61P35/00

   A61K31/7088ZNA

【請求項の数】6

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-168499(P2016-168499)

(22)【出願日】2016年8月30日

(65)【公開番号】特開2018-33353(P2018-33353A)

(43)【公開日】2018年3月8日

【審査請求日】2019年7月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】505457994

【氏名又は名称】学校法人東京医科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100129137

【弁理士】

【氏名又は名称】中山 ゆみ

(72)【発明者】

【氏名】黒田 雅彦

(72)【発明者】

【氏名】大野 慎一郎

【審査官】 中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１８０４２０８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 大野慎一郎他, 「副作用のない短鎖型核酸医薬の開発」，東京医科大学雑誌, 2016.07.30, vol. 74, no.3, p. 348 (P1-13)

【文献】 "Accession: AB349931.1 GI: 158850637, DEFINITION: Mus musculus non-coding RNA, oocyte_piRNA747, complete sequence", NCBI Sequence Revision History [online], 2008.05.24 uploaded, NCBI，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/158850637?sat=3&satkey=9181864

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）のポリヌクレオチドを含み、標的遺伝子が、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子、およびＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの癌関連遺伝子であることを特徴とする癌関連遺伝子発現制御用組成物。
（ａ）配列番号１または２の塩基配列からなるポリヌクレオチド

【請求項2】

前記ポリヌクレオチドが、分子内でステムループ構造を形成する、請求項１記載の癌関連遺伝子発現制御用組成物。

【請求項3】

前記癌関連遺伝子の発現を抑制する、請求項１または２記載の癌関連遺伝子発現制御用組成物。

【請求項4】

標的遺伝子が、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子、およびＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの癌関連遺伝子であり、in vitroにおいて、または非ヒト動物に対して、請求項１から３のいずれか一項に記載の癌関連遺伝子発現制御用組成物を使用することを特徴とする標的遺伝子の発現を制御する発現制御方法。

【請求項5】

前記癌関連遺伝子発現制御用組成物を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項４記載の発現制御方法。

【請求項6】

前記標的遺伝子の発現を抑制する、請求項４または５記載の発現制御方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子発現を制御する発現制御核酸分子およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の医療分野への応用が、試みられている。しかしながら、これらの核酸分子は、遺伝子発現を抑制するものの、反対に、生体内の自然免疫を作動させてしまうことが懸念されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

そこで、本発明は、新たな発現制御核酸分子の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

前記目的を達成するために、本発明の発現制御核酸分子は、癌関連遺伝子の発現を制御する発現制御核酸分子であり、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド

【0005】

本発明の発現制御方法は、標的遺伝子の発現を制御する方法であって、前記本発明の発現制御核酸分子を使用することを特徴とする。

【0006】

本発明の治療方法は、前記本発明の発現制御核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。

【0007】

本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記本発明の発現制御核酸分子であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0008】

本発明の発現制御核酸分子によれば、癌関連遺伝子の発現を制御することができる。このため、本発明の発現制御核酸分子は、遺伝子治療等の医療分野において、非常に有用といえる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明の発現制御核酸分子の一例を示す概略図である。

【図2】図２は、本発明の実施例１における各遺伝子の発現の相対値を示すグラフである。

【図3】図３は、本発明の実施例２におけるＲＮＡスポンジの概略図である。

【図4】図４は、本発明の実施例２におけるルシフェラーゼ発光の相対値を示すグラフである。

【図5】図５は、本発明の実施例２におけるＭＥＴの発現の相対値を示すグラフである。

【図6】図６は、本発明の実施例３におけるＨ１２９９細胞のＡＧＯｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。

【図7】図７は、本発明の実施例３における各遺伝子のノックダウン効率を示すグラフである。

【図8】図８は、本発明の実施例３における各遺伝子のノックダウン効率を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。

【0011】

（１）発現制御核酸分子
本発明の発現制御核酸分子は、前述のように、癌関連遺伝子の発現を制御する発現制御核酸分子であり、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチド

【0012】

【表1】

【0013】

前記表１に示す本発明の発現制御核酸分子は、例えば、ヒト末梢血細胞等に存在する核酸であるが、これらを同定し、且つ、機能を解明したのは、本発明者らが初めてである。

【0014】

本発明の発現制御核酸分子は、後述するように、癌関連遺伝子に対して発現制御を行う核酸分子である。なお、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、癌関連遺伝子以外の発現制御を行ってもよい。

【0015】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、前記ポリヌクレオチドが、分子内でステムループ構造を形成する。本発明の発現制御核酸分子は、例えば、図１の模式図に示すような構造を有する。なお、図１において、丸が各ヌクレオチド分子を示すが、個数は例示であって、これには制限されない。本発明において、「ステムループ構造を形成する」とは、例えば、実際にステムループ構造を形成すること、ステムループ構造が形成されていなくても、条件によってステムループ構造を形成可能なことも含む。「ステムループ構造を形成」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。

【0016】

本発明の発現制御核酸分子は、長さが３０塩基前後であり、その配列から、分子の内部で、ステム間にループを有するステムループ構造（以下、「ヘアピン構造」ともいう）またはステム間にループを有さないステム構造を形成する構造をとる。このため、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、同じ一本鎖核酸であっても、ｓｈＲＮＡよりも、相対的に短い全長である。また、ｓｉＲＮＡのような二本鎖構造ではなく、一本鎖構造である。このため、本発明の発現制御核酸分子によれば、例えば、核酸に対する自然免疫の作動を回避して、標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。

【0017】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、癌関連遺伝子の発現を抑制または促進できる。発現抑制とは、例えば、前記遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記遺伝子の発現抑制は、例えば、前記遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記遺伝子の発現促進は、例えば、前記遺伝子からの転写産物の生成量の増加、前記転写産物の活性の増加、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の増加、または前記翻訳産物の活性の増加等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。

【0018】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、前述のステムループ構造をとることで、例えば、Ｄｉｃｅｒ非依存で、発現抑制を行うことができる。一般的に、多くの腫瘍細胞ではＤｉｃｅｒの発現が低下しているため、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、Ｄｉｃｅｒ非依存であることで、例えば、Ｄｉｃｅｒの発現が低下している腫瘍細胞においても有効に機能できる。また、自然免疫に関与するＴＬＲ ｆａｍｉｌｙ、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５による核酸認識は、核酸の長さに強く依存する。本発明の発現制御核酸分子は、例えば、全長が相対的に短いため、自然免疫反応を回避できる。さらに、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。

【0019】

本発明の発現制御核酸分子において、前記（ｂ）のヌクレオチドは、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチドである。前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、前記癌関連遺伝子の発現を制御する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。

【0020】

本発明の発現制御核酸分子において、前記（ｃ）のヌクレオチドは、前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチドである。前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、前記癌関連遺伝子の発現を制御する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。

【0021】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、前記癌関連遺伝子の発現を制御するポリヌクレオチドでもよい。前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。

【0022】

前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２^ｎｄ Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。

【0023】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明の発現制御核酸分子は、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。

【0024】

本発明の発現制御核酸分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の発現制御核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の発現制御核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。

【0025】

本発明の発現制御核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の発現制御核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。

【0026】

前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）を有する。

【0027】

前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。

【0028】

前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。

【0029】

前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。

【0030】

前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。

【0031】

本発明の発現制御核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、^２Ｈ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３３Ｓ、^３４Ｓおよび^３６Ｓがあげられる。

【0032】

本発明の発現制御核酸分子は、前述のように、前記癌関連遺伝子の発現を制御できる。前記癌関連遺伝子は、例えば、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子、ＣＣＬ２遺伝子およびＡＢＣＣ６等である。本発明の発現制御核酸分子は、例えば、これらの遺伝子の発現を抑制できる。このため、本発明の発現制御核酸分子は、例えば、前記癌関連遺伝子が原因となる疾患（癌）の治療剤として使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記癌疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。

【0033】

本発明の発現制御核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記癌関連遺伝子を有する投与対象に、前記発現制御核酸分子を投与すればよい。

【0034】

前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。

【0035】

本発明の発現制御核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現制御方法および治療方法等の記載を参照できる。

【0036】

本発明の発現制御核酸分子は、前述のように、前記癌関連遺伝子の発現を制御可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。

【0037】

本発明の発現制御核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。

【0038】

（２）組成物
本発明の発現制御用組成物は、前述のように、癌関連遺伝子の発現を制御するための組成物であって、前記本発明の発現制御核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現制御核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現制御用組成物は、例えば、発現制御用試薬ということもできる。

【0039】

本発明によれば、例えば、前記癌関連遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現制御を行うことができる。

【0040】

また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の発現制御核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の薬学的組成物は、前記本発明の発現制御核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。

【0041】

本発明によれば、例えば、癌遺伝子が原因となる癌疾患の患者に投与することで、前記癌関連遺伝子の発現を抑制し、前記癌疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記癌疾患の予防、癌疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。

【0042】

本発明において、治療の対象となる癌疾患は、特に制限されず、前記癌関連遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記癌疾患の種類に応じて、その癌疾患の原因となる癌関連遺伝子を標的遺伝子に設定すればよい。

【0043】

本発明の発現制御用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記癌関連遺伝子を有する投与対象に、前記発現制御核酸分子を投与すればよい。

【0044】

前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。

【0045】

前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。

【0046】

本発明の組成物は、例えば、本発明の発現制御核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。

【0047】

本発明の組成物において、前記発現制御核酸分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記発現制御核酸分子を効率よくデリバリーすることができる。

【0048】

前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。

【0049】

前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。

【0050】

（３）発現制御方法
本発明の発現制御方法は、前述のように、癌関連遺伝子の発現を制御する方法であって、前記本発明の発現制御核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現制御方法は、前記本発明の発現制御核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。

【0051】

本発明の発現制御方法は、例えば、前記癌関連遺伝子が存在する対象に、前記発現制御核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記発現制御核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。

【0052】

本発明の発現制御方法は、例えば、前記発現制御核酸分子を単独で投与してもよいし、前記発現制御核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。

【0053】

（４）治療方法
本発明の治療方法は、前述のように、前記本発明の発現制御核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の発現制御核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。

【0054】

本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現制御方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。

【0055】

（５）発現制御核酸分子の使用
本発明の使用は、前記癌関連遺伝子の発現制御のための、前記本発明の発現制御核酸分子の使用である。

【0056】

本発明の核酸分子は、疾患（例えば、癌疾患）の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明の発現制御核酸分子であることを特徴とする。

【0057】

以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0058】

（実施例１）
ｇｈＲＮＡ−２（配列番号１）を合成し、ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子およびＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の抑制を確認した。

【0059】

ｇｈＲＮＡ−２を、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）で溶解し、１００μｍｏｌ／ＬのｇｈＲＮＡ溶液を調製した。ｍＲＮＡの検出には、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ―Ｈ１２９９、ＡＴＣＣ社）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ―１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ_２下とした。

【0060】

まず、前記細胞を前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、５００μＬずつ、１×１０^４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記ｇｈＲＮＡ−２を、トランスフェクション試薬RNAi MAX Transfection Reagent（Life Technologies社）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２日間培養した。

【0061】

そして、得られた培養細胞について、ISOGEN reagent（ニッポンジーン社）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。

【0062】

次に、逆転写酵素（商品名M-MLV reverse transcriptase、Invitrogen社）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、各遺伝子のｃＤＮＡ量を測定した。

【0063】

コントールとして、ｇｈＲＮＡ−２未添加の細胞（Non-treated）、トランスフェクション試薬のみ添加の細胞（Mock）、ヒトのデータベース上の全ての転写産物に相補的でないコントロール核酸をトランスフェクションした細胞（Control）についても、同様にｃＤＮＡ量を測定した。そして、Non-treatedのｃＤＮＡ量を１として、相対値を求めた。

【0064】

これらの結果を図２に示す。図２は、各遺伝子の発現の相対値を示すグラフである。図２に示すように、いずれの遺伝子も、ｇｈＲＮＡ−２によって、発現が有意に抑制された。

【0065】

（実施例２）
ｇｈＲＮＡ−２は、細胞内にも存在する核酸分子であることから、ＲＮＡスポンジにより内在ｇｈＲＮＡ−２の機能をブロックした上で、外来ｇｈＲＮＡ−２を細胞に導入し、内在ｇｈＲＮＡ−２および外来ｇｈＲＮＡ−２による発現への影響を確認した。なお、特に示さない限り、前記実施例１の方法を援用した。

【0066】

（１）内在ｇｈＲＮＡ−２の機能をブロックした細胞の構築
図３に、ＲＮＡスポンジの概略を示す。図３に示すように、ｇｈＲＮＡ−２のシード領域のみが結合するｇｈＲＮＡ−２スポンジｍｉＲＮＡ型、ｇｈＲＮＡ−２の全体が結合するｇｈＲＮＡ−２スポンジｓｉＲＮＡ型、ｇｈＲＮＡ−２の逆向き配列が結合するｇｈＲＮＡ−２スポンジコントロール、ｇｈＲＮＡ−２の結合領域を持たないＮｏｎ−スポンジコントロールを作成した。

【0067】

そして、前記各ＲＮＡスポンジを細胞に導入した以外は、前記実施例１と同様にｇｈＲＮＡ−２を導入し、前記ＲＮＡスポンジに組み込んだホタル（Firefly）由来ルシフェラーゼとシーパンジー（Renilla）由来ルシフェラーゼの発光を測定し、その相対比を求めた。

【0068】

これらの結果を図４に示す。図４は、各細胞におけるルシフェラーゼ発光の相対比を示すグラフである。図４において、各細胞に関するバーは、左からNon-treated、Mock、Control ghRNA、ghRNA-2である。図４に示すように、ｇｈＲＮＡ−２スポンジｍｉＲＮＡ型またはｇｈＲＮＡ−２スポンジｓｉＲＮＡ型を導入した細胞の場合、ｇｈＲＮＡ−２の添加により、ルシフェラーゼ活性の相対値が顕著に減少した。この結果から、ｇｈＲＮＡ−２スポンジｍｉＲＮＡ型またはｇｈＲＮＡ−２スポンジｓｉＲＮＡ型により内在ｇｈＲＮＡ−２の機能がブロックされ、外来ｇｈＲＮＡ−２により、内在ｇｈＲＮＡ−２と同様の機能が回復していることが確認できた。

【0069】

（２）ＭＥＴ遺伝子の発現への影響
前記（１）で作成した、内在ｇｈＲＮＡ−２の機能をブロックした細胞について、ＭＥＴ遺伝子の発現相対値を確認した。これらの結果を、図５に示す。図２は、ＭＥＴ遺伝子の発現の相対値を示すグラフである。図５に示すように、内在性ｇｈＲＮＡ−２の機能をブロックした細胞は、ＭＥＴ遺伝子の発現量が有意に増加した。この結果から、ｇｈＲＮＡ−２は、ＭＥＴ遺伝子の発現抑制に関与していることが確認できた。

【0070】

（実施例３）
ｇｈＲＮＡ−２による発現抑制活性と、ＡＧＯとの関係とを確認した。なお、特に示さない限り、前記実施例１の方法を援用した。

【0071】

（１）ｇｈＲＮＡ−２のＡＧＯ１、２、３または４への依存
図６に、Ｈ１２９９細胞におけるＡＧＯ１〜ＡＧＯ４のｍＲＮＡコピー数を示す。このＨ１２９９細胞のＡＧＯ１ノックアウト株、ＡＧＯ２ノックアウト株、ＡＧＯ３ノックアウト株、ＡＧＯ４ノックアウト株について、前記実施例１と同様にして、ｇｈＲＮＡ−２を導入し、各遺伝子（ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子）のノックダウン効果を確認した。

【0072】

これらの結果を、図７に示す。図７は、各遺伝子に対するノックダウン効率を示すグラフである。図７に示すように、ＭＥＴ遺伝子は、Ｈ１２９９におけるノックダウン効果が、ＡＧＯ２ノックダウン株において減少していることから、ｇｈＲＮＡ−２は、ＭＥＴ遺伝子に対してＡＧＯ２に依存的であることがわかった。また、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子およびＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子は、Ｈ１２９９におけるノックダウン効果が、ＡＧＯ２ノックアウト株およびＡＧＯ３ノックアウト株において減少していることから、ｇｈＲＮＡ−２は、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子およびＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子に対してＡＧＯ２およびＡＧＯ３に依存的であることがわかった。

【0073】

（２）ｇｈＲＮＡ−２のＡＧＯファミリーへの依存
Ｈ１２９９細胞と、そのＡＧＯ１、２および３ノックアウト株２種類（＃１、＃２）について、前記実施例１と同様にして、ｇｈＲＮＡ−２を導入し、各遺伝子（ＭＥＴ遺伝子、ＣＤＫ２ＡＰ１遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ１遺伝子）のノックダウン効果を確認した。

【0074】

これらの結果を、図８に示す。図８は、各遺伝子に対するノックダウン効率を示すグラフである。図８に示すように、いずれの遺伝子も、Ｈ１２９９におけるノックダウン効果が、ノックアウト株（＃１、＃２）において減少していることから、ｇｈＲＮＡ−２は、各遺伝子に対してＡＧＯファミリーに依存的であることがわかった。

【0075】

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

【産業上の利用可能性】

【0076】

本発明の発現制御核酸分子によれば、例えば、癌関連遺伝子の発現を制御することができる。このため、本発明の発現制御核酸分子は、遺伝子治療等の医療分野において、非常に有用といえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]