特許 6936632 表面修飾基材

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6936632

(24)【登録日】2021年8月31日

(45)【発行日】2021年9月22日

(54)【発明の名称】表面修飾基材

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20210909BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20210909BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20210909BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 Z

   C12N5/071

   !C12N5/10

【請求項の数】6

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-122725(P2017-122725)

(22)【出願日】2017年6月23日

(65)【公開番号】特開2019-4745(P2019-4745A)

(43)【公開日】2019年1月17日

【審査請求日】2020年1月6日

(73)【特許権者】

【識別番号】000002288

【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社

(72)【発明者】

【氏名】道上 恭佑

(72)【発明者】

【氏名】上田 真澄

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１７−０２３００８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Yang, X. et al.，Poly(ε-caprolactone)-based copolymers bearing pendant cyclic ketals and reactive acrylates for the fabrication of photocrosslinked elastomers，Acta Biomater.，2013年，Vol. 9(9)，pp. 8232-8244

【文献】 Villa-Diaz, L. G. et al.，Synthetic polymer coatings for long-term growth of human embryonic stem cells，Nat. Biotechnol.，2010年，Vol. 28(6)，pp. 581-583

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｍ ３／００−３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基材（Ｂ）の表面が、環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体で処理された表面修飾基材であって、環状化合物（Ａ）が、一般式（１）で表される２価の基を、構成単位として含み、前記構成単位を環状に結合してなる環状化合物であって、
前記環状化合物は、一般式（２）で表される２価の基及び一般式（３）で表される２価の基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を構成単位として含んでいてもよく、関係式（Ｉ）を満たし、高分子化合物（Ｃ）が、末端にアミノ基を有するポリエチレングリコールと４−シアノ４−フェニルカルボノチオイルチオペンタン酸との反応物を含む表面修飾基材。
−［（Ｙ^１−Ａ^１）_ｎ１−Ｙ^２−Ｒ^１−Ｘ^１］− （１）
−［（Ｙ^３−Ａ^２）_ｎ２−Ｙ^４−Ｒ^２−Ｙ^５−（Ａ^３−Ｙ^６）_ｎ３−Ｘ^２］− （２）
−［（Ｙ^７−Ａ^４）_ｎ４−Ｙ^８−Ｚ_ｍ−Ｘ^３−Ｒ^３−Ｘ^４］− （３）
［一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、炭素数２〜２１の２価の炭化水素基であり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、それぞれ独立に、カルボニル基であり；Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｙ^４、Ｙ^５、Ｙ^６、Ｙ^７及びＹ^８は、それぞれ独立に、酸素原子であり；Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４は、それぞれ独立に、炭素数２〜８の２価の炭化水素基であり；Ｚは、それぞれ独立に、一般式（１）で表される２価の基又は一般式（２）で表される２価の基であり；ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４及びｍは、それぞれ独立の正数であり；複数ある場合のＲ^１〜Ｒ^３、Ａ^１〜Ａ^４、Ｘ^１〜Ｘ^４、Ｙ^１〜Ｙ^８、Ｚ、ｎ１〜ｎ４及びｍは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。］
関係式（Ｉ）
１≦ｐ＋ｑ＋ｒ≦２０００
［関係式（Ｉ）において、ｐは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（１）で表される２価の基における各ｎ１を合計した値であり；ｑは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（２）で表される２価の基における各ｎ２と各ｎ３とを合計した値であり；ｒは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（３）で表される２価の基における各ｎ４を合計した値である。］

【請求項2】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３がそれぞれ独立に、炭素数３〜１６の直鎖アルキレン基又は炭素数３〜１６の分岐アルキレン基であり、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４がそれぞれ独立に、フェニルエチレン基、炭素数２〜４の直鎖アルキレン基又は炭素数３〜４の分岐アルキレン基である請求項１に記載の表面修飾基材。

【請求項3】

基材（Ｂ）が、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリアミド、ポリイミド、変成ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリトニトリル、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレート、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリテトラフロロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、セルロース及びその共重合物からなる群から選ばれる１種以上である請求項１又は２に記載の表面修飾基材。

【請求項4】

環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体が、環状化合物（Ａ）に高分子化合物（Ｃ）が貫通した複合体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の表面修飾基材。

【請求項5】

細胞培養用である請求項１〜４のいずれか１項に記載の表面修飾基材。

【請求項6】

請求項５に記載の表面修飾基材を用いて細胞を培養する細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は表面修飾基材に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト多様性幹細胞は再生医療への応用が期待されており、安全かつ、適切な細胞を患者に供給するためには、細胞の意図しない分化を抑制し、適切な分化のみを誘起させることが必須である。
細胞の未分化性を維持するために、フィーダー細胞との共培養が一般的に行われる。しかし、フィーダー細胞との共培養ではフィーダー細胞由来の未同定の成分が持ち込まれるため、医療応用を目的とした場合には安全性の担保が困難となる。こうした課題の解決策として、天然物質（ラミニン、フィブロネクチンなど）を含む培養基材を用いる培養方法（例えば特許文献１参照）と合成物質（ポリ［２-メタクリロイロキシ）エチルジメチル-（３-スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド］など）を含む培養基材を用いる培養方法(例えば非特許文献２参照)が検討されている。
天然物質の多くは組換えタンパク質であるため合成基質と比較して製造コストが高いが、細胞の未分化維持の観点では合成基質よりも優れている。一方、合成物質ではさまざまな検討がなされているが、未分化性維持を担う主成分が明確にはわかっておらず、実用レベルには至っていない。しかしながら、近年の研究によって、細胞の未分化性には細胞培養器の表面の環状化合物の運動性の自由度が寄与していると示唆された（特許文献２参照）。
特許文献２では、ポリロタキサンブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養器が用いられているが、ポリロタキサンを調製する方法は工程（例えば特許文献２、特許文献３参照）が煩雑であり、かつ、環状化合物がシクロデキストリンおよびその誘導体に限定されているため、ロタキサンの軸方向以外の運動の自由度はなく、分化抑制効果が低いという課題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１５−１７８５２６号公報

【特許文献2】特開２０１７−２３００８号公報

【特許文献3】国際公開第０１／０８３５６６号

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｃｅ誌１９９８年２８２巻１１４５−１１４７頁

【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌２０１０年２８巻５８１−５８３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、簡便に作製が可能な表面修飾基材を提供し、かつ、細胞の分化抑制効果の高い細胞培養用の表面修飾基材および該表面修飾基材を用いた細胞培養方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体で表面処理された基材（Ｂ）を含む表面修飾基材であって、環状化合物（Ａ）が、
一般式（１）で表される２価の基、一般式（２）で表される２価の基及び一般式（３）で表される２価の基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を構成単位とし、前記構成単位を環状に結合してなる環状化合物であって、関係式（Ｉ）を満たす表面修飾基材；表面修飾基材を用いて細胞を培養する細胞培養方法。
−［（Ｙ^１−Ａ^１）_ｎ１−Ｙ^２−Ｒ^１−Ｘ^１］− （１）
−［（Ｙ^３−Ａ^２）_ｎ２−Ｙ^４−Ｒ^２−Ｙ^５−（Ａ^３−Ｙ^６）_ｎ３−Ｘ^２］− （２）
−［（Ｙ^７−Ａ^４）_ｎ４−Ｙ^８−Ｚ_ｍ−Ｘ^３−Ｒ^３−Ｘ^４］− （３）
［一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、水素原子がハロゲン原子、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていても良い炭素数２〜２１の２価の炭化水素基であり；Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、それぞれ独立に、ホスホン酸から２個の水酸基を除いた残基、カルボニル基、スルホニル基又はチオカルボニル基であり；Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｙ^４、Ｙ^５、Ｙ^６、Ｙ^７及びＹ^８は、それぞれ独立に、酸素原子、硫黄原子、イミノ基又は一般式（４）で表される２価の基であり；Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４は、それぞれ独立に、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数２〜８の２価の炭化水素基であり；Ｚは、それぞれ独立に、一般式（１）で表される２価の基又は一般式（２）で表される２価の基であり；ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４及びｍは、それぞれ独立の正数であり；複数ある場合のＲ^１〜Ｒ^３、Ａ^１〜Ａ^４、Ｘ^１〜Ｘ^４、Ｙ^１〜Ｙ^８、Ｚ、ｎ１〜ｎ４及びｍは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。］
−ＮＲ^４− （４）
［一般式（４）中、Ｒ^４は、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数１〜１２の１価の炭化水素基である。］
関係式（Ｉ）
１≦ｐ＋ｑ＋ｒ≦２０００
［関係式（Ｉ）において、ｐは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（１）で表される２価の基における各ｎ１を合計した値であり；ｑは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（２）で表される２価の基における各ｎ２と各ｎ３とを合計した値であり；ｒは、前記環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（３）で表される２価の基における各ｎ４を合計した値である。］

【発明の効果】

【0006】

本発明の表面修飾基材は簡便に作製が可能であり、かつ、細胞培養に利用した場合、ヒト多様性幹細胞の未分化性を大きく向上させる。

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明の表面修飾基材に用いる環状化合物（Ａ）は、上記一般式（１）で表される２価の基、上記一般式（２）で表される２価の基及び上記一般式（３）で表される２価の基からなる群から選ばれる少なくとも１種の基を構成単位とし、前記構成単位を環状に結合してなる環状化合物であって、上記関係式（Ｉ）を満たす。

【0008】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立に、水素原子がハロゲン原子、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されていても良い炭素数２〜２１の２価の炭化水素基である。

【0009】

炭素数２〜２１の炭化水素基としては、炭素数２〜２１のアルキレン基、炭素数２〜２１のアルケニレン基、炭素数６〜２１のアリーレン基及び炭素数７〜２１のアラルキレン基等が挙げられる。

【0010】

炭素数２〜２１のアルキレン基としては、炭素数２〜２１の直鎖アルキレン基（エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基及びｎ−ヘンイコサニレン基）、炭素数３〜２１の分岐アルキレン基（１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、１−エチルエチレン基、２−エチルエチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、１，１−ジメチルプロピレン基、１−ヘキシルプロピレン基及び１−オクチルエチレン基等）及び炭素数４〜２１のシクロアルキレン基（シクロブチレン基、シクロペンチレン基、２−メチルシクロペンチレン基、シクロヘキシレン基、１，３−ジメチルシクロヘキシレン基、シクロヘプチレン基、１−エチルシクロペンチレン基、シクロオクチレン基、シクロノニレン基、シクロデシレン基、シクロウンデシレン基、シクロドデシレン基、シクロトリデレン基、シクロテトラデシレン基、シクロペンタデシレン基、シクロヘキサデシレン基、シクロヘプタデシレン基、シクロオクタデシレン基、シクロノナデシレン基、シクロエイコシレン基、ノルボルニレン基、ジシクロペンチレン基、イソプロピリデンジシクロヘキシレン基及びシクロヘキサンジメチレン基等）等が挙げられる。

【0011】

炭素数２〜２１のアルケニレン基としては、炭素数２〜２１の直鎖アルケニレン基（エテニレン基、プロペニレン基及びヘンイコセニレン基等）及び炭素数３〜２１の分岐アルケニレン基（１−エチルエテニレン基、１，２−ジメチルエテニレン基、１−ブチルエテニレン基、１−ヘキシルエテニレン基及び１−オクチルエテニレン基等）等が挙げられる。
炭素数６〜２１のアリーレン基としては、ｏ−、ｐ−又はｍ−フェニレン基、２，４−ナフチレン基、ビフェニレン基、ターフェニレン基、アントリレン基、フェナントリレン基、フルオレニレン基、ピレニレン基及び基等が挙げられる。

【0012】

炭素数７〜２１のアラルキレン基としては、フェニルメチレン基、ジフェニルメチン基、１−フェニルエチレン基、ｏ−フェニレンエチル基及びナフチルメチレン基等が挙げられる。

【0013】

これらの基の有する水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換された基としては、１−ブロモ−トリメチレン基、１−アセチル−トリメチレン基、１−メトキシ−トリメチレン基及び１−フェノキシ−トリメチレン基等が挙げられる。

【0014】

これらのうち、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３として、反応効率の観点から好ましいのは炭素数３〜１６の直鎖又は炭素数３〜１６の分岐アルキレン基であり、更に好ましいのはトリメチレン基、ブチレン基、トリデセン基、ペンタデセン基、１−ヘキシルプロピレン基、１−ヘキシルブチレン基、１−ウンデシルプロピレン基及び１−ウンデシルブチレン基である。

【0015】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４は、それぞれ独立に、ホスホン酸から２個の水酸基を除いた残基、カルボニル基、スルホニル基又はチオカルボニル基である。

【0016】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｙ^４、Ｙ^５、Ｙ^６、Ｙ^７及びＹ^８は、それぞれ独立に、酸素原子、硫黄原子、イミノ基又は一般式（４）で表される２価の基である。

【0017】

−ＮＲ^４− （４）
一般式（４）中、Ｒ^４は、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数１〜１２の１価の炭化水素基である。
炭素数１〜１２の１価の炭化水素基としては、炭素数１〜１２の飽和炭化水素基（メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、デシル、ドデシル基等）、１価の脂環式飽和炭化水素基（シクロヘキシル基）、芳香脂肪族炭化水素基（ベンジル基等）及び１価の芳香族炭化水素基（フェニル基等）等が挙げられる。

【0018】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３及びＡ^４は、それぞれ独立に、水素原子がハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素及び沃素等）で置換されていても良い炭素数２〜８の２価の炭化水素基である。

【0019】

炭素数２〜８の２価の炭化水素基のうち、後述する環状化合物（Ａ）の製造方法において、その製造を容易にする観点から好ましいものとしては、フェニルエチレン基、炭素数２〜４のアルキレン基が挙げられ、更に好ましいのは炭素数２〜４の直鎖アルキレン基（エチレン基、プロピレン基及びブチレン基等）及び炭素数３〜４の分岐アルキレン基（メチルエチレン基、エチルエチレン基、メチルプロピレン基及び２−メチルプロピレン等）であり、特に好ましいのは、炭素数２〜４の直鎖アルキレン基及び炭素数３〜４の分岐アルキレン基であり、最も好ましいのは、エチレン基及びプロピレン基である。

【0020】

一般式（３）において、Ｚは、それぞれ独立に、一般式（１）で表される２価の基又は一般式（２）で表される２価の基である。

【0021】

本発明の環状化合物（Ａ）は、上述のように、一般式（１）において、Ｘ１がカルボニル基であり、かつ、Ｙ^１及びＹ^２が酸素原子である２価の基をのみを構成単量体とする環状化合物を除く。即ち、環状化合物（Ａ）が一般式（１）で表される２価の基のみから構成される場合、Ｘ^１がカルボニル基で、かつ、Ｙ^１及びＹ^２が酸素原子となることはない。

【0022】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４及びｍは、それぞれ独立の正数である。
また、ｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４は、関係式（Ｉ）を満たす。
関係式（Ｉ）
１≦ｐ＋ｑ＋ｒ≦２０００ （Ｉ）

【0023】

関係式（Ｉ）において、ｐは、環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（１）で表される２価の基における各ｎ１を合計したモル数である。
なお、環状化合物（Ａ）が、一般式（３）で表される２価の基を構成単位として有し、かつ、Ｚが一般式（１）で表される基である場合、このＺにおけるｎ１も合計してｐの値を求める。
また、ｑは、環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（２）で表される２価の基における各ｎ２と各ｎ３とを合計したモル数である。
なお、環状化合物（Ａ）が、一般式（３）で表される２価の基を構成単位として有し、かつ、Ｚが一般式（２）で表される基である場合、このＺにおけるｎ２及びｎ３も合計してｑの値を求める。
また、ｒは、環状化合物（Ａ）１モルを構成する全ての一般式（３）で表される２価の基における各ｎ４を合計したモル数である。

【0024】

「ｐ＋ｑ＋ｒ」が１未満の場合、環状化合物（Ａ）で表面修飾された素材の修飾層の膜厚が十分ではなく、「ｐ＋ｑ＋ｒ」が２０００を超える場合は、環状化合物（Ａ）で表面修飾された素材の修飾層の密度が低下する。
また、「ｐ＋ｑ＋ｒ」は、環状化合物（Ａ）で表面修飾された素材の表面のモビリティファクター（運動因子）を向上させるという観点から、２以上２０００以下であることが好ましく、更に好ましくは２０以上１０００以下である。

【0025】

環状化合物（Ａ）１分子を構成する一般式（１）で表される２価の基、一般式（２）で表される２価の基及び一般式（３）で表される２価の基の合計数は、これを用いた後述の素材の未分化性を制御する因子、すなわち表面の自由エネルギーを向上させる観点から、２以上２０００以下であることが好ましく、更に好ましくは２０以上１０００以下である。
なお、上記の合計数について、環状化合物（Ａ）が一般式（３）で表される２価の基を構成単位として有し、かつ、ｍが０でなく、即ち一般式（３）中に、一般式（１）で表される２価の基及び／又は一般式（２）で表される２価の基を有している場合、その数も合計して計算する。

【0026】

一般式（１）、一般式（２）及び一般式（３）において、複数ある場合のＲ^１〜Ｒ^３、Ａ^１〜Ａ^４、Ｘ^１〜Ｘ^４、Ｙ^１〜Ｙ^８、Ｚ、ｎ^１〜ｎ^４及びｍは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。

【0027】

複数ある場合のＲ^１〜Ｒ^３、Ａ^１〜Ａ^４、Ｘ^１〜Ｘ^４、Ｙ^１〜Ｙ^８及びＺの組成は、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，５，６９０５．に記載のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法による飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳともいう）により測定分析し、環状化合物（Ａ）の構造を同定することができる。

【0028】

本発明の環状化合物（Ａ）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
本発明の環状化合物（Ａ）として好ましいものとしては、具体的に、一般式（１）において、Ｙ^１及びＹ^２が酸素、Ａ^１がエチレン、プロピレン、クロロプロピレン又はフェニルエチレンであり、Ｒ^１がトリメチレン、ペンタメチレン、テトラデカメチレン又はビニレンであり、Ｘ^１がスルホニル基である２価の基の両末端を結合した環状化合物が挙げられる。
また、一般式（２）において、Ｙ^３、Ｙ^４、Ｙ^５及びＹ^６が酸素であり、Ａ^２、Ａ^３がプロピレン、エチレン、クロロプロピレン又はフェニルエチレンであり、Ｒ^２がエチレン、プロピレン又はビニレンであり、Ｘ^２がカルボニルである２価の基の両末端を結合した環状化合物等が挙げられる。
また、一般式（３）において、Ｙ^７及びＹ^８が酸素であり、Ａ^４がプロピレン、エチレン、クロロプロピレン又はフェニルエチレンであり、Ｒ^３がエチレン、プロピレン又はビニレンであり、ｍは０であり、Ｘ^２及びＸ^３がカルボニルである２価の基の両末端を結合した環状化合物等が挙げられる。

【0029】

環状化合物（Ａ）の「ｐ＋ｑ＋ｒ」の値の調整は、後述の環状化合物（Ａ）の製造方法において、後に詳述する環状化合物（Ｅ）と環状化合物（Ｆ）との比率の調整で行うことができる。
また、一般式（３）中のｍの値は、環状化合物（Ｅ）として、後述の一般式（７）で表される化合物を使用し、更に環状化合物（Ｆ）として、後述の一般式（５）で表される化合物及び／又は後述の一般式（６）で表される化合物を併用することによって調整できる。
なお、環状化合物（Ａ）のｎ１〜ｎ４の値及びｍの値は、Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ．， ２０１４， ５， ６９０５．に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、確認することが出来る。

【0030】

本発明の表面修飾基材に含まれる環状化合物（Ａ）の数平均分子量（以下、Ｍｎと略記する）は、表面修飾される基材（Ｂ）（以下、基材）および高分子化合物（Ｃ）の分子量等に応じて調整することができるが、環状化合物（Ａ）を素材の表面に配向させる観点から、１３０〜１１６，０００であることが好ましい。
環状化合物（Ａ）のＭｎはアルキレン化合物の付加モル数を調整すること等によって、上記の好ましい範囲にすることができる。

【0031】

環状化合物（Ａ）のＭｎは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰＣと略記）を用いて以下の条件で測定することができる。

【0032】

環状化合物（Ａ）のＭｎは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（以下、ＧＰＣと略記）を用いて以下の条件で測定することができる。
・装置：「Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５」［Ｗａｔｅｒｓ社製］
・カラム：「Ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ Ｓｕｐｅｒ Ｈ−Ｌ」（１本）、「ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ２０００、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ３０００、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ４０００を各１本連結したもの」［いずれも東ソー（株）製］
・試料溶液：０．２５重量％のテトラヒドロフラン溶液
・溶液注入量：１０μＬ
・流量：０．６ｍＬ／分
・測定温度：４０℃
・検出装置：屈折率検出器
・基準物質：標準ポリエチレングリコール

【0033】

本発明の環状化合物は、以下に詳述する製造方法により製造することができる。

【0034】

本発明の環状化合物は、一般式（５）で表される化合物（Ｅ１）、一般式（６）で表される化合物（Ｅ２）及び一般式（７）で表される化合物（Ｅ３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の環状化合物（Ｅ）と、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数２〜８の環状エーテル（Ｆ１）、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数２〜８の環状チオエーテル（Ｆ２）及び水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数２〜８の環状イミン（Ｆ３）からなる群から選ばれる少なくとも１種の環状化合物（Ｆ）とを反応させる工程（以下反応工程と略記する）を含む製造方法により製造することができる。

【0035】

【化1】

【0036】

前記の反応工程において、環状化合物（Ｅ）が有するＸ基（Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７及びＸ^８）とＹ基（Ｙ^９、Ｙ^１０、Ｙ^１１及びＹ^１２）との間に、環状化合物（Ｆ）に由来する２価の基（例えば、水素原子がハロゲン原子で置換されていても良い炭素数２〜８の環状エーテルを用いた場合はオキシアルキレン基）が挿入される反応（カルボニル基と酸素原子との間にオキシアルキレン基を挿入する反応の場合、アルコキシル化反応という）が生じる。
例えば、環状化合物（Ｅ）としてγ−ブチロラクトンを用い、環状化合物（Ｆ）としてエチレンオキシドを用いた場合は、一般式（１）において、Ｙ^１が酸素原子であり、Ａ^１がエチレン基であり、Ｙ^２が酸素原子であり、Ｒ^１がトリメチレン基であり、Ｘ^１がカルボニル基である化学式で表される構成単位、即ち、
−［（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）ｎＯＣ_３Ｈ_６ＣＯ］−
で表される２価の基の両末端を直接結合してなる環状化合物が生成する。

【0037】

前記アルコキシル化反応工程では、生成した環状化合物（Ａ）が、環上のＸ基とＹ基を直接結ぶ結合を一旦開裂する反応を生じ、更に、Ｘ基とＹ基を直接結ぶ結合が開裂した他の環状化合物（Ａ）と反応し、一方の環状化合物（Ａ）のＹ基と、他方の環状化合物（Ａ）のＸ基とが結合する挿入付加反応も生じる。
例えば、環状化合物（Ｅ）としてγ−ブチロラクトンを用い、環状化合物（Ｆ）としてエチレンオキシドを用いた場合は、
−［（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＣ_３Ｈ_６ＣＯ］−
で表される２価の基の両末端を直接結合してなる環状化合物が生成する。
そして、この環状化合物２分子が上記の開裂反応及び挿入付加反応し、この２価の基を一分子中に２個有する環状化合物が生成する反応、また、この環状化合物３分子が反応し、この２価の基を一分子中に３個有する環状化合物が生成する反応等も生じる。
また、一般式（５）で表される化合物（Ｅ１）、一般式（６）で表される化合物（Ｅ２）及び一般式（７）で表される化合物（Ｅ３）を併用することで、上記の環状化合物（Ａ）同士の開環反応及び挿入付加反応を経て、一般式（１）で表される２価の基、一般式（２）で表される２価の基及び一般式（３）で表される２価の基を構成単位とする環状化合物（Ａ）を得ることができる。

【0038】

一般式（５）、一般式（６）及び一般式（７）において、Ｒ^５、Ｒ^６及びＲ^７は、一般式（１）、一般式（２）又は一般式（３）で表される化合物の説明で例示した、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３と同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。

【0039】

一般式（５）、一般式（６）及び一般式（７）において、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７及びＸ^８は、一般式（１）、一般式（２）又は一般式（３）で表される化合物の説明で例示した、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３及びＸ^４と同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。

【0040】

一般式（５）、一般式（６）及び一般式（７）において、Ｙ^９、Ｙ^１０、Ｙ^１１及びＹ^１２は、一般式（１）、一般式（２）又は一般式（３）で表される化合物の説明で例示した、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｙ^４、Ｙ^５、Ｙ^６、Ｙ^７及びＹ^８と同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。

【0041】

一般式（５）で表される化合物（Ｅ１）の具体例としては、ラクトン、スルトン、ラクタム、チオラクタム及びスルタム等が挙げられる。

【0042】

一般式（５）で表されるラクトンとして、β−ラクトン（β−プロピオラクトン、β−ブチロラクトン等）、γ−ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、δ−ラクトン（δ−バレロラクトン等）、ε−ラクトン（ε−カプロラクトン等）、長鎖アルキル基を有するラクトン（γ−エナントラクトン、γ−ウンデカノラクトン、γ−ドデカラクトン及びδ−ドデカノラクトン等）、γ−クロトノラクトン、α−メチレン−γ−ブチロラクトン、γ−メチレン−γ−ブチロラクトン、α−ブロモ−γ−ブチロラクトン、α−クロロ−γ−ブチロラクトン、α−ヨード−γ−ブチロラクトン、テトロン酸、大環状ラクトン（１５−ペンタデカノラクトン）及び芳香族ラクトン（３，４−ジヒドロクマリン）等が挙げられる。カルボニル構造を２つ以上含むラクトンとしてはＤ、Ｌ及びＤ／Ｌ−ラクチド、ポリ−εカプロラクトン等も好適に用いることができる。
反応性の観点から、β−ラクトン（β−プロピオラクトン、β−ブチロラクトン等）、γ−ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、δ−ラクトン（δ−バレロラクトン等）、ε−ラクトン（ε−カプロラクトン等）、テトロン酸、大環状ラクトン（１５−ペンタデカノラクトン）及び芳香族ラクトン（３，４−ジヒドロクマリン）が挙げられ、特に好ましくはγ−ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、δ−ラクトン（δ−バレロラクトン等）、ε−ラクトン（ε−カプロラクトン等）が好ましい。

【0043】

一般式（５）で表されるスルトンとして、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン、１，５−ペンタンスルトン、１，６−ヘキサンンスルトン、１，７−ヘプタンスルトン、１，８−オクタンスルトン、１，９−ノナンスルトン、１，１０−デカンスルトン、１，１１−ウンデカンスルトン、１，１２−ドデカンスルトン及びアルキル基を有するスルトン（１−メチル−１，３−プロパンスルトン等）等が挙げられる。好ましくは、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン、１，５−ペンタンスルトン、１，６−ヘキサンンスルトン、１，７−ヘプタンスルトン、１，８−オクタンスルトン、１，９−ノナンスルトン、１，１０−デカンスルトン、１，１１−ウンデカンスルトン、１，１２−ドデカンスルトンが挙げられ、特に好ましくは１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン、１，５−ペンタンスルトン、１，６−ヘキサンンスルトンが挙げられる。

【0044】

一般式（５）で表されるラクタムとして、β−ラクタム（β−プロピオラクタム、β−ブチロラクタム等）、γ−ラクタム（γ−ブチロラクタム等）、δ−ラクタム（δ−バレロラクタム等）、ε−ラクタム（ε−カプロラクタム等）、長鎖アルキル基を有するラクタム（γ−エナントラクタム、γ−ウンデカノラクタム、γ−ドデカラクタム及びδ−ドデカノラクタム等）、Ｎ位に置換基を有するラクタム（Ｎ−メチル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−アリル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−ビニル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−プロパギル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、Ｎ−アリル−ε−カプロラクタム、Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム、Ｎ−プロパギル−ε−カプロラクタム）γ−クロトノラクタム、α−メチレン−γ−ブチロラクタム、γ−メチレン−γ−ブチロラクタム、α−ブロモ−γ−ブチロラクタム、α−クロロ−γ−ブチロラクタム、α−ヨード−γ−ブチロラクタム、大環状ラクタム（１５−ペンタデカノラクタム）及び芳香族ラクタム（３，４−ジヒドロキノリン）等が挙げられる。
反応性の観点から、β−ラクタム（β−プロピオラクタム、β−ブチロラクタム等）、γ−ラクタム（γ−ブチロラクタム等）、δ−ラクタム（δ−バレロラクタム等）、ε−ラクタム（ε−カプロラクタム等）、長鎖アルキル基を有するラクタム（γ−エナントラクタム、γ−ウンデカノラクタム、γ−ドデカラクタム及びδ−ドデカノラクタム等）、Ｎ位に置換基を有するラクタム（Ｎ−メチル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−アリル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−ビニル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−プロパギル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、Ｎ−アリル−ε−カプロラクタム、Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム、Ｎ−プロパギル−ε−カプロラクタム）γ−クロトノラクタム、α−メチレン−γ−ブチロラクタム、γ−メチレン−γ−ブチロラクタムであり、特に好ましくはγ−ラクタム（γ−ブチロラクタム等）、δ−ラクタム（δ−バレロラクタム等）、ε−ラクタム（ε−カプロラクタム等）、Ｎ位に置換基を有するラクタム（Ｎ−メチル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−アリル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−ビニル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−プロパギル−γ−ブチロラクタム、Ｎ−メチル−ε−カプロラクタム、Ｎ−アリル−ε−カプロラクタム、Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム、Ｎ−プロパギル−ε−カプロラクタム）γ−クロトノラクタムが挙げられる。

【0045】

一般式（５）で表されるチオラクタムとして、γ−ブチロチオラクタム、Ｎ−メチル−γ−ブチロチオラクタム（１−メチルピロリジンー２−チオン）、ε−カプロチオラクタム及びＮ−メチル−ε−カプロチオラクタム等が挙げられる。副生物低減の観点から好ましくは、Ｎ−メチル−γ−ブチロチオラクタム（１−メチルピロリジンー２−チオン）及びＮ−メチル−ε−カプロチオラクタムが挙げられる。

【0046】

一般式（５）で表されるスルタムとして、１，３−プロパンスルタム、Ｎ−メチル−１，３−プロパンスルタム、１，４−ブタンスルタム及びＮ−メチル−１，４−ブタンスルタム等が挙げられる。副生物低減の観点から好ましくは、Ｎ−メチル−γ−ブチロチオラクタム（１−メチルピロリジンー２−チオン）及びＮ−メチル−ε−カプロチオラクタムが挙げられる。

【0047】

一般式（６）で表される化合物（Ｅ２）の具体例としては、以下に例示する１，３，２−ジオキサチオラン２，２−ジオキシド、１，３，２−ホスホラン２−オキシド、イミダゾリジノン、１，２，５−チアジアゾリン１，１−ジオキシド、カーボネート及びトリチオカーボネート等が挙げられる。

【0048】

一般式（６）で表される１，３，２−ジオキサチオラン２，２−ジオキシドとして、好ましいものとしては、１，３，２−ジオキサチオラン２，２−ジオキシド等が挙げられる。

【0049】

一般式（６）で表されるホスホラン２−オキシドとして、好ましいものとしては、１，３，２−ジオキサホスホラン２−オキシド及び４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサホスホラン２−オキシド等が挙げられる。

【0050】

一般式（６）で表されるイミダゾリジノンとして、好ましいものとしては、２−イミダゾリジノン及び１，３−ジメチル２−イミダゾリジノン等が挙げられる。

【0051】

一般式（６）で表される１，２，５−チアジアゾリン１，１−ジオキシドとして、好ましいものとしては、１，２，５−チアジアゾリン１，１−ジオキシド及びＮ，Ｎ−ジベンジル−１，２，５−チアジアゾリン１，１−ジオキシド等が挙げられる。

【0052】

一般式（６）で表されるカーボネートとして、好ましいものとしては、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート及び１，３−ジオキサン−２−オン等が挙げられる。

【0053】

一般式（６）で表されるトリチオカーボネートとして、好ましいものとしては、エチレントリチオカーボネート等が挙げられる。

【0054】

一般式（７）で表される化合物（Ｅ３）の具体例としては、酸無水物及び環状イミド等が挙げられる。

【0055】

一般式（７）で表される無水酢酸として、好ましいものとしては、無水コハク酸、３，３−ジエチル無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、トリメリット酸無水物、グルタル酸無水物、３，５−ジメチルグルタル酸無水物、３，３−テトラメチレングルタル酸無水物及び３−オキサビシクロ［３，１，１］ヘプタン−２，４−ジノン等が挙げられる。

【0056】

一般式（７）で表される環状イミドとして、コハク酸イミド、Ｎ−メチルコハク酸イミド、３，３−ジエチルコハク酸イミド、Ｎ−メチル−３，３−ジエチルコハク酸イミド、マレイン酸イミド、Ｎ−メチルマレイン酸イミド、フタル酸イミド、Ｎ−メチルフタル酸イミド、トリメリット酸イミド、Ｎ−メチルトリメリット酸イミド、グルタル酸イミド、Ｎ−メチルグルタル酸イミド、３，５−ジメチルグルタル酸イミド、Ｎ−メチル−３，５−ジメチルグルタル酸イミド、３，３−テトラメチレングルタル酸イミド、Ｎ−メチル−３，３−テトラメチレングルタル酸イミド、３−アザビシクロ［３，１，１］ヘプタン−２，４−ジノン及びＮ−メチル３−アザビシクロ［３，１，１］ヘプタン−２，４−ジノン等が挙げられる。
反応性の観点からはコハク酸イミド、Ｎ−メチルコハク酸イミド、３，３−ジエチルコハク酸イミド、マレイン酸イミド、Ｎ−メチルマレイン酸イミド、フタル酸イミド、Ｎ−メチルフタル酸イミドが好ましい。
また、副生物低減の観点から、Ｎ−メチルコハク酸イミド、Ｎ−メチル−３，３−ジエチルコハク酸イミド、Ｎ−メチルマレイン酸イミド、Ｎ−メチルフタル酸イミド、Ｎ−メチルトリメリット酸イミド、Ｎ−メチルグルタル酸イミド、３、Ｎ−メチル−３，５−ジメチルグルタル酸イミド、Ｎ−メチル−３，３−テトラメチレングルタル酸イミド、３−アザビシクロ［３，１，１］ヘプタン−２，４−ジノン及びＮ−メチル３−アザビシクロ［３，１，１］ヘプタン−２，４−ジノン等が好ましい。

【0057】

環状化合物（Ｅ）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。

【0058】

環状化合物（Ｅ）は、分子内縮合反応等によって製造することができる。
例えば、一般式（５）で表される化合物は、Ｒ^４で表される基の片末端に、Ｘ^５で表される基と水酸基とが結合した１価の基（例えばＸ^５がカルボニル基の場合はカルボキシ基）を結合させ、Ｒ^４で表される基の反対側の末端に、Ｙ^９で表される基と水素原子とが結合した１価の基（例えばＹ^９基が酸素原子の場合は、水酸基）を結合させた化合物を用い、Ｘ^５で表される基と水酸基とが結合した１価の基、及びＹ^９で表される基と水素原子とが結合した１価の基を分子内縮合することで、得ることができる。
分子内脱水してラクトン等を合成する方法としては、公知の方法で加熱脱水する方法、Ｊ．Ｓ．Ｎｉｍｉｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｗｏｌｌｅｍｂｅｒｇ，Ｔｅｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９７８，１９，３５２３に記載方法、及びリパーゼ等の酵素を用いる方法の公知の合成方法を用いることができる。

【0059】

前記の「Ｒ^４で表される基の片末端に、Ｘ^５で表される基と水酸基とが結合した１価の基（例えばＸ^５がカルボニル基の場合はカルボキシ基）を結合させ、Ｒ^４で表される基の反対側の末端に、Ｙ^９で表される基と水素原子とが結合した１価の基（例えばＹ^９基が酸素原子の場合は、水酸基）を結合させた化合物」としては好ましいものとしては、炭素数４〜２２のモノヒドロキシモノカルボン酸等が挙げられる。
炭素数４〜２２のモノヒドロキシモノカルボン酸としては、炭素数４〜２２の直鎖ヒドロキシカルボン酸（３−ヒドロキシプロパン酸、４−ヒドロキシ酪酸、５−ヒドロキシペンタン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、１５−ヒドロキシペンタデカン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸及び４−ヒドロキシ−２−ブテン酸等）及び炭素数３〜２２の分岐ヒドロキシカルボン酸（３−ヒドロキシブタン酸、５−ヒドロキシトリデカン酸、２−メチレン−４−ヒドロキシ酪酸、４−フェニル−４−ヒドロキシ酪酸、２，２−ジメチル−４−ヒドロキシ酪酸、４−ヘキシル−４−ヒドロキシ酪酸及び４−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテン酸等）等が挙げられる。

【0060】

炭素数４〜２２のモノヒドロキシモノカルボン酸の炭素原子に結合した水素原子のうち、少なくとも１つの水素原子がハロゲノ基、アセチル基、アルコキシ基又はフェノキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸が分子内脱水した構造を有するラクトンも用いることもできる。 炭素数４〜２２のモノヒドロキシモノカルボン酸のうち、炭素原子に結合した水素原子の少なくとも１つがハロゲノ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−ブロモ−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられ、アセチル基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−アセチル−４−ヒドロキシブタン酸等が挙げられ、アルコキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−メトキシ−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられ、フェノキシ基で置換されたヒドロキシカルボン酸としては、２−フェニル−４−ヒドロキシ酪酸等が挙げられる。

【0061】

炭素数２〜８の環状エーテルとしては、エチレンオキサイド、１，２−又は１，３−プロピレンオキシド、１，２−、１，３−、１，４−又は２，３−ブチレンオキサイド、１，２−ジクロロオキセタン１，２−ペンチレンオキサイド、１，２−ヘキシレンオキサイド、テトラヒドロフラン、スチレンオキサイド、シクロヘキセンオキサイド、エピクロルヒドリン及びエピブロモヒドリン等が挙げられる。
炭素数２〜８の環状エーテルは、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0062】

炭素数２〜８の環状チオエーテルとしては、エチレンサルファイド、プロピレンサルファイド、１，２−ブチレンサルファイド、２，３−ブチレンサルファイド、１，２−ペンテンサルファイド、シクロヘキセンサルファイド、スチレンサルファイド、エピクロロチオサルファイド、エピブロモチオサルファイド及びパークロロプロピレンサルファイド等が挙げられる。
炭素数２〜８の環状チオエーテルは、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0063】

炭素数２〜８の環状イミンはとしては、エチレンイミン、プロピレンイミン、１ ， ２ − ブチレンイミン、２，３−ブチレンイミン、１，２−ペンテンイミン、シクロヘキセンイミン、スチレンイミン、エピクロロイミン及びエピブロモイミン等が挙げられる。
炭素数２〜８の環状イミンは、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

【0064】

環状化合物（Ｆ）を２種以上を併用する場合、得られる環状化合物（Ａ）が有するＡ（Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３又はＡ^４）で表される２価の基は、使用した環状化合物（Ｆ）の種類に対応した異なる種類のＡを有する。

【0065】

アルコキシル化反応工程は、触媒の存在下で行うことが好ましい。
反応工程で用いる触媒としては、金属（ホウ素、錫、ニッケル、亜鉛及びアルミニウム等）のハロゲン化物、無機酸（硫酸及びリン酸等）、アルカリ金属（リチウム、ナトリウム、カリウム及びセシウム等）の水酸化物、アミン化合物（ジエチルアミン及びトリエチルアミン等）、ホスファゼン、複合金属シアン化物錯体触媒（特開２００５−５３９５２号公報及び特開２０１６−６２０３号公報等に記載された亜鉛ヘキサシアノコバルテート等の２種類の金属を分子内に含有する金属錯体触媒等）、特開２０００−３５４７６３号公報に記載された酸化物複合体、ＡｌとＭｇとの複合酸化物（Ｇ１）及び層状複水酸化物並びにその焼成物等を用いて行うことができる。

【0066】

本発明の製造方法で用いる層状複水酸化物とは、２価の金属（Ｍｇ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｌｉ、Ｎｉ、Ｃｏ及びＣｕ等）と３価の金属（Ａｌ、Ｆｅ及びＭｎ等）の水酸化物とが複合して積層構造を形成した無機の層状化合物を意味し、一般式が［Ｍ_{２＋１−ｈ}Ｍ_３＋ｈ（ＯＨ）_２］［（Ｗ^ｉ−）_ｈ／ｉ・ｊＨ_２Ｏ］［ここで、Ｍ^２＋は２価の金属、Ｍ^３＋は３価の金属、Ｗ^ｉ−はｉ価の陰イオン（ＨＣＯ_３⁻、ＣＯ_３^２−、ＰＯ_４^３−、ＳＯ_４^２−、Ｃｌ⁻、ＮＯ^２−及びＮＯ^３−等）、ｈ、ｉ及びｊはそれぞれ独立の正数である。］で表さる化合物であり、ハイドロタルサイト、モツコレアイト、マナセイト、スティッヒタイト、パイロアウライト、タコバイト、イヤードライト及びメイキセネライト等が含まれる。これらの層状複水酸化物は、粘土鉱物として知られており、天然に産する鉱物に含まれたものであっても、合成によって得られたものであってもよい。

【0067】

触媒は１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
これらの内、反応効率の観点から好ましいのは、ＡｌとＭｇとの複合酸化物（Ｇ１）の焼成物及びＡｌとＭｇを有する層状複水酸化物（Ｇ２）の焼成物である。

【0068】

本発明において用いられる複合酸化物（Ｇ１）は、ＡｌとＭｇを有する酸化物であれば、特に限定されないが、好ましい複合酸化物としては下記一般式（８）又は（９）で示される化合物等が挙げられる。
〔ａＭｇＯ・Ａｌ_２ Ｏ_３ ・ｂＨ_２Ｏ〕 （８）
〔Ｍｇ_ｓＡｌ_ｔＯ_ｕ〕 （９）

【0069】

一般式（８）において、ａ及びｂは、それぞれ独立の正数である。
一般式（９）において、ｓ、ｔ及びｕは、それぞれ独立の正数である。
反応性の観点から、ｓ／ｔは０．１以上０．９未満であることが好ましい。
複合酸化物（Ｇ１）としては、２．５ＭｇＯ・Ａｌ_２ Ｏ_３ ・ｂＨ_２Ｏ及びＭｇ_０．７Ａｌ_０．３Ｏ_１．１５等が挙げられ、それぞれキョーワード３００［協和化学工業（株）製］及びキョーワード２０００［協和化学工業（株）製］等として市場から入手することができる。

【0070】

本発明に用いるハイドロタルサイト（Ｇ２−１）としては、下記一般式（１０）で示される化合物等が挙げられる。
〔Ｍｇ_１−ｃＡｌ_ｃ（ＯＨ）_２ 〕_ｃ＋ 〔ＣＯ_３ｃ／２ ・ｄＨ_２ Ｏ〕^ｃ− （１０）

【0071】

また、一般式（１０）において、ｃは０＜ｃ≦０．３３を満たす数であり、ｄは０＜ｄ≦１．０を満たす数である。

【0072】

ハイドロタルサイト（Ｇ２−１）としては、Ｍｇ_６Ａｌ_２ （ＯＨ）_１６ＣＯ_３・４Ｈ_２ Ｏ及びＭｇ_４．５ Ａｌ_２（ＯＨ）_１３ＣＯ_３ ・３．５Ｈ_２Ｏ等が挙げられ、それぞれキョーワード５００［協和化学工業（株）製］及びキョーワード１０００［協和化学工業（株）製］等として市場から入手することができる。

【0073】

本発明に用いるハイドロタルサイト（Ｇ２−１）としては、上記の化合物以外にも、西ドイツ特許公告第１５９２１２６号及びヨーロッパ特許公開第０２０７８１１号等に記載の既知の鉱物も使用することができる。

【0074】

（Ｇ１）及び（Ｇ２）は、それぞれ１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
これらの内、反応性の観点から好ましいのは複合酸化物（Ｇ１）であり、更に好ましいのは２．５ＭｇＯ・Ａｌ_２Ｏ_３・ｎＨ_２Ｏ（ｎは正数）及びＭｇ_０．７Ａｌ_０．３Ｏ_１．１５である。

【0075】

本発明に用いるハイドロタルサイト（Ｇ２−１）としては、上記の化合物以外にも、西ドイツ特許公告第１５９２１２６号及びヨーロッパ特許公開第０２０７８１１号等に記載の既知の鉱物も使用することができる。

【0076】

（Ｇ１）及び（Ｇ２）は、それぞれ１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
これらの内、反応性の観点から好ましいのは複合酸化物（Ｇ１）であり、更に好ましいのは２．５ＭｇＯ・Ａｌ_２ Ｏ_３ ・ｎＨ_２Ｏ（ｎは正数）及びＭｇ_０．７Ａｌ_０．３Ｏ_１．１５である。

【0077】

ＡｌとＭｇとの複合酸化物（Ｆ１）の焼成物又はＡｌとＭｇを有するハイドロタルサイト（Ｅ２）の焼成物は、ＡｌとＭｇとの複合酸化物（Ｇ１）又はハイドロタルサイト（Ｇ２−１）を空気雰囲気下、好ましくは窒素気流下で、好ましくは４００〜１５００℃（更に好ましくは６００〜１０００℃）にて１〜４時間加熱処理する方法等で得ることができる。
なお、（Ｇ１）又は（Ｇ２）の焼成物は以降、触媒（Ｇ’）と記載する。

【0078】

アルコキシ化反応工程において、触媒の含有量は特に限定されないが、反応速度及び濾過効率の観点から、環状化合物（Ｅ）と環状化合物（Ｆ）との合計重量に対して０．０００１〜１０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０１〜１．０重量％である。

【0079】

また、アルコキシ化反応工程において、攪拌を容易にする等の観点から、環状化合物（Ｅ）、環状化合物（Ｆ）及び触媒以外に、溶剤を添加してもよい。
溶剤としては、トルエン、キシレン、ベンゼン、ジメチルスルホキシド、ジグリム、トリグリム、１，４−ジオキサン、シクロヘキサン、ヘキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、四塩化炭素、Ｎ−メチルピロリドン、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジクロロエタン、Ｏ−ジクロロベンゼン及びクロロホルム等が挙げられる。
溶剤は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
これらの内、環状化合物（Ｅ）及び環状化合物（Ｅ）等との混和性、高沸点並びに留去のしやすさの観点から、トルエン及びキシレンが好ましい。
アルコキシ化反応工程に用いる溶剤の重量は、反応速度等の観点から、環状化合物（Ｅ）と環状化合物（Ｆ）と触媒との合計重量に対して、０〜９９重量％が好ましく、更に好ましくは０〜９０重量％である。

【0080】

アルコキシ化反応工程においては、環状化合物（Ｅ）及び環状化合物（Ｆ）並びに必要に応じて、触媒及び溶媒の混合物の温度が９０〜２５０℃となることが好ましく、更に好ましくは１００〜１９０℃である。
また、上記の温度とする時間は、１〜２００時間が好ましい。

【0081】

アルコキシ化反応工程は、環状化合物（Ｅ）及び環状化合物（Ｆ）並びに必要に応じて、触媒及び溶媒を反応装置へ入れ不活性ガス（窒素及びアルゴン等）により系内を置換・密閉し、前記の反応温度と反応時間とで撹拌混合することで行うことができる。
反応装置としては撹拌装置及び加熱装置の付属した混合容器（スターラー付きフラスコ及びオートクレーブ等）等の公知の反応装置を用いることができる。

【0082】

本発明の製造方法は、アルコキシ化反応工程で得られる生成物［すなわち、環状化合物（Ａ）を含む混合物］を、更に濾過操作（特開２０１１−２１３８６４号公報に記載の方法等）、ゲル透過法及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の方法により精製する工程（以下精製工程と略記する）を含んでいてもよい。
上記の精製工程により、特定の構造を有する環状化合物（Ａ）のみを抽出することができる。

【0083】

本発明の表面修飾基材に含まれる基材（Ｂ）としては、有機材、無機基材を問わず、複合体が吸着できる基材であれば制限はなく、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリオキシメチレン、ポリアミド、ポリイミド、変成ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリトニトリル、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレート、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリテトラフロロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、セルロースの単独重合物や共重合物が挙げられる。
表面修飾のし易さという観点から、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、変成ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリトニトリル、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレート、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、セルロースが好ましく、特に好ましくはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリウレタン、セルロース、及びそれらの共重合物が好ましい。
基材は単独で用いても複数種類を併用してもよく、積層のような分離構造、ミクロ相分離、および完全相溶したものまで含む。さらには、基材（Ｂ）の用途に応じて、例えば、可塑剤、増量剤、酸化防止剤、帯電防止剤、顔料、各種フィラーを含有させる等の公知の方法で製造できるものを含む。

【0084】

本発明の表面修飾基材に含まれる高分子化合物（Ｃ）としてはセルローストリアセテート、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリスチレン、ポリイソプレン、ポリプロピレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルアルコール、ポリＮ−イソプロピルアミド、ポリスルホン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアミド、変成ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレート、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、セルロースが好ましく、単独または共重合物が挙げられる。

【0085】

高分子化合物（Ｃ）は単独で用いても２種以上を併用してもよい。
修飾表面の柔軟性の観点から、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルアルコール、ポリＮ−イソプロピルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、変成ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリアクリトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンサルファイド、ポリアリレート、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトンが好ましく、特に好ましくはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルアルコール、ポリＮ−イソプロピルアミド、ポリビニルピロリドンの単独または共重合物である。

【0086】

高分子化合物（Ｃ）は市販のものを入手してもよく、公知の方法によって製造しても良い。また、高分子化合物（Ｃ）は公知の方法に従い複数の高分子を互いに化学結合および/または物理的に結合させることよって製造してもよい。

【0087】

環状化合物（Ａ）との複合化の観点から、環状化合物（Ａ）の存在下で高分子化合物（Ｃ）の原料であるモノマーの重合をおこなうことが好ましい。
モノマーとしては、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、（メタ）アクリレート、酢酸ビニル、Ｎ−イソプロピルアミド、ビニルピロリドン、スチレン、イソプレン、ブタジエンなどが挙げられ、単一モノマーの重合でもよく、複数モノマーの共重合によって合成しても良く、共重合にはランダムおよびブロック共重合を含む。

【0088】

また、高分子化合物（Ｃ）は、反応性官能基を導入した高分子であってもよく、導入する反応性官能基としては、イソシアネート基、アルケニル基、アルキニル基、（メタ）アクリレート基、水酸基、カルボキシ基、エステル基、アルデヒド基、カルボニル基、ハロゲノ基、スルホ基、ホスホ基、ジスルフィド基、トリアジド基、シアノ基、イミン系置換基、アミジン基、オキシム基、シリル基、シロキシ基、アミノ基、チオ基、水酸基及びマレイミド基等があげられる。これらの反応性官能基を導入した高分子化合物としては、末端アミン変性ポリエチレングリコール、末端チオール変性ポリエチレングリコール及び末端マレイミド変性ポリエチレングリコール等が挙げられ、これらはＳＵＮＢＲＩＴＥシリーズ（ＳＵＮＢＲＩＴＥは日油株式会社の登録商標）として日油株式会社から入手可能である。

【0089】

高分子化合物（Ｃ）の数平均分子量に特に制限はないが、合成し易さ等の観点から、１０００〜１００，０００であることが好ましい。高分子化合物（Ｃ）の数平均分子量は、以下のＧＰＣを用いて以下の条件で測定することができる。
・装置：「Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５」［Ｗａｔｅｒｓ社製］
・カラム：「Ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ Ｓｕｐｅｒ Ｈ−Ｌ」（１本）、「ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ２０００、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ３０００、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨ４０００を各１本連結したもの」［いずれも東ソー（株）製］
・試料溶液：０．２５重量％のテトラヒドロフラン溶液
・溶液注入量：１０μＬ
・流量：０．６ｍＬ／分
・測定温度：４０℃
・検出装置：屈折率検出器
・基準物質：標準ポリエチレングリコール

【0090】

環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）との複合化は、環状化合物（Ａ）存在下で高分子化合物（Ｃ）を合成し、複合化させても良い。また、高分子化合物（Ｃ）を環状化合物（Ａ）と混合することで複合化させても良い。

【0091】

上記の環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合構造を安定して維持する観点から、架橋剤（Ｈ）を併用し、架橋剤（Ｈ）と反応する官能基を導入した高分子化合物同士を架橋してもよい。
架橋剤（Ｈ）としては、２官能以上の反応性置換基をもつ化合物であれば特に制限はなく、グリセリンなどの多価アルコール、ポリイソシアネート化合物、ジアクリレート化合物等が挙げられる。

【0092】

一方、架橋剤（Ｈ）を使用しない場合には、高分子化合物（Ｃ）同士で疑似架橋（水素結合、イオン結合及び分子間力、配位結合）を形成することができる官能基及び／又は結合を有する高分子化合物を用いることができる。

【0093】

高分子化合物（Ｃ）の合成は、上記の環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体を形成しやすくする観点から、後にも記載するように、環状化合物（Ａ）存在下で行うことが好ましい。

【0094】

本発明の表面修飾基材に用いられる環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）との複合体は、環状化合物（Ａ）及び高分子量化合物（Ｃ）以外に、溶剤を含有していてもよい。
溶剤を用いる場合には、環状化合物（Ａ）の溶解性の高い溶媒を適宜選択することが好ましい。
好ましい溶剤としてはトルエン、キシレン、ベンゼン、ジメチルスルホキシド、ジグリム、トリグリム、１，４−ジオキサン、シクロヘキサン、ヘキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、水、四塩化炭素、Ｎ−メチルピロリドン、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジクロロエタン及びクロロホルム、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール等が挙げられる。
溶剤を使用しない場合は、環状化合物（Ａ）と、高分子化合物（Ｃ）又は高分子化合物（Ｃ）を構成する各種モノマーとの親和性が高いことが望ましい。
例えば、環状化合物（Ａ）が、ポリオキシプロピレン鎖を有する場合、高分子化合物（Ｃ）としては、ポリオキシプロピレン鎖を有する高分子化合物（ポリプロピレンオキシド等）を用いることが好ましい
また、環状化合物（Ａ）が、ポリオキシエチレン鎖を有する場合、高分子化合物（Ｃ）としては、ポリオキシエチレン鎖を有する高分子化合物（ポリエチレングリコール等）を用いることが好ましい。

【0095】

本発明の環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体において、環状化合物（Ａ）の環成分を、軸成分である高分子化合物（Ｃ）が貫通した構造を有することが好ましく、環状化合物（Ａ）に高分子化合物（Ｃ）が貫通した場合は、公知の粉末Ｘ線回折及びＮＭＲスペクトルの測定並びに原子間力顕微鏡による観察等を行うことで確認することができる。
粉末Ｘ線回折の測定においては、既知のロタキサンが示す回折ピークと比較をすることで、ロタキサン生成の有無、即ち、環状化合物（Ａ）の環成分を軸成分である高分子化合物（Ｃ）が貫通したか否かを確認することができ、ＮＭＲスペクトルにより、高分子化合物（Ｃ）１分子に対して貫通する環状化合物（Ａ）の数を算出することができる。

【0096】

本発明の表面修飾基材は環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体及び基材（Ｂ）を有しており、複合体が基材（Ｂ）の表面に吸着又は結合していることが好ましい。
環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体の基材（Ｂ）への吸着又は結合方法は公知の手法をもちいて行うことができる。以下に例を挙げて説明する。
物理的な吸着を利用する場合：例えば、環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体を基材（Ｂ）にキャストし、乾燥させることで行うことができる。他、ディップコーティングや、スピンコーティング法も利用できる。なお、コーティング工程では必要に応じて溶剤を用いても良い。
化学結合を利用する場合：例えば、（ｉ）環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体を基材（Ｂ）にキャストし乾燥させた後、γ線照射によって基材（Ｂ）との化学結合を炭素−炭素結合を形成させる方法、（ｉｉ）基材（Ｂ）にプラズマ処理を施して表面に水酸基を生じさせた後、環状化合物（Ａ）と高分子化合物（Ｃ）の複合体と反応させる方法、（ｉｉｉ）超臨界二酸化炭素中で基材（Ｂ）に高分子化合物（Ｃ）の原料となるモノマーを浸漬させた状態でモノマーを重合させ、環状化合物（Ａ）を重合時に存在させておくことで基材の表面に環状化合物（Ａ）を高分子鎖を介して導入する方法が挙げられる。

【0097】

本発明の表面修飾基材の表面のモビリティファクター（運動因子）については、ＱＣＭ−Ｄ（Ｑｕａｒｔｚ−Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ−Ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ）測定から得られる環状化合物水中でのエネルギー散逸量をコーティング質量に相当する周波数変化した数値を用いて算出することができる。具体的には、表面修飾後の質量増加による共振周波数変化（Δｆ）に対する表面修飾によるエネルギー散逸量変化（ΔＤ）の割合を水中でのモビリティファクター（Ｍｆ：運動因子）として用いる。
複合体が、環状化合物（Ａ）の環成分を軸成分である高分子化合物（Ｃ）が貫通した構造を有する場合、環状化合物（Ａ）の軸方向への自由度が高く、モビリティファクターは大きくなる。モビリティファクターが大きければ、細胞の未分化性が高いことが期待できる。
モビリティファクタ―（Ｍｆ）は、細胞の未分化性を維持するという観点から、１．２×１０^−６〜５．０×１０^−５であることが好ましく、更に好ましくは１．２×１０^−６〜８．０×１０^−６である。

【0098】

本発明の表面修飾基材を含む細胞培養器を用いた細胞培養方法について詳述する。細胞培養に必要な材料として、本発明の細胞培養器のほか、細胞および培地を含み、所定の条件で培養する。

【0099】

本発明の表面修飾基材は細胞培養器に利用することができる。本発明の表面修飾基材は、多能性幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、免疫細胞及び癌細胞などの培養を行うことができる。細胞の未分化性を維持するための細胞培養基材として用いる場合は多能性幹細胞を培養することが望ましい。細胞塊を作成するための細胞培養基材として用いる場合は多能性幹細胞、前駆細胞、上皮細胞、内皮細胞、癌細胞を培養することが望ましい。

【0100】

本発明の表面修飾基材で培養可能な多能性幹細胞としては、例えば、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ヒトＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。

【0101】

ヒトＥＳ細胞はＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−３、Ｈ１、Ｈ９などが理研バイオリソースセンターから利用可能である。ヒトｉＰＳ細胞は、２５３Ｇ１、ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４などが利用可能である。

【0102】

細胞培養に必要な材料として利用可能な未分化維持用の培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ＋４ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅＬＬ社）、ｈｕｍａｎ ＥＳ ｍｅｄｉｕｍ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社）、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＳＦＭ ＸＦ／ＦＦ（ＡＴＣＣ社）、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）＋２０％ＫＳＲ＋０．１ｍＭ ＮＥＡＡ＋０．１ｍＭ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ＋５ｎｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｔ社）、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ（株式会社細胞科学研究所）などを利用できる。
また、以下の文献に記載の培地も用いることができる。
（１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．誌２００５年１１８巻４４９５−４５０９頁
（２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．誌２００５年９１巻６８８−６９８頁
（３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．誌２００６年３４６巻１３１−１３９頁
（４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．誌２００６年１０３巻６９０７−６９１２頁
（５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．誌２００６年１０３巻５６８８−５６９３頁

【0103】

本発明の表面修飾基材上で細胞を培養する工程は、表面修飾基材上に多能性幹細胞を播種し、３０〜５０℃（好ましくは３５〜４０℃）の温度で二酸化炭素を３〜７容量％含む雰囲気下で行うことが好ましく、４．７〜５．３容量％含む雰囲気下で行うことが好ましい。

【0104】

本発明の表面修飾基材上で細胞を培養する方法は、細胞を培養する工程に加えて、細胞増殖性の観点から、多能性幹細胞を２００〜４０，０００個／ｃｍ２の濃度で基材（Ｂ）に播種する工程を有することが好ましく、更に好ましくは５００〜２０，０００個／ｃｍ２である。

【0105】

多能性幹細胞を表面修飾基材上に播種する方法としては、多能性幹細胞を含む懸濁液を基材に加える方法等が挙げられる。多能性幹細胞を含む懸濁液にはピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及びＫｎｏｃｋ Ｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ等の公知の添加剤を含んでいても良い。

【0106】

本発明の表面修飾基材上での細胞培養は、細胞をより好適に維持または増殖する観点から、培地交換や継代を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、１〜５日間経過毎に行うことが好ましく、更に好ましくは３日に行うことが望ましい。継代の頻度としては、細胞の集団が大きくなるタイミングで適宜行うことが好ましく、好ましくは３〜１５日間経過毎、より好ましくは６〜１０日間経過毎に行うことが望ましい

【0107】

表面修飾基材上で培養した多能性幹細胞は、分化誘導を行って各細胞組織に分化してもよい。分化誘導は本発明の表面修飾基材の表面で行ってもよく、本発明の素材から別の公知の培養器に細胞を撒き直した後に行ってもよい。各細胞組織としては、中枢神経、感覚系の細胞、角膜、網膜、神経幹細胞、心筋細胞、インシュリン産生細胞、肝細胞、骨、軟骨、造血幹細胞、筋肉、血管、または腎臓の細胞などが挙げられる。

【0108】

多能性幹細胞の未分化性については、例えばＳＯＸ２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇなどの未分化マーカーの蛋白質発現量を定量することで評価することができる。具体的な評価方法としては特に制限されないが、例えばウエスタンブロッティング法、リアルタイムＰＣＲ測定法などがある。

【0109】

本発明の表面修飾基材は医療応用に適した細胞塊を形成するための培養器としても有用である。細胞塊の形成のしやすさから環状化合物（Ａ）に高分子化合物（Ｃ）が貫通した複合体で表面修飾された表面修飾基材であって、高分子化合物（Ｃ）がポリ２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含むことが好ましい。

【0110】

以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、実施例中の部は重量部を示す。

【0111】

＜製造例１＞
複合酸化物の合成
「キョーワード３００」〔化学式：２．５ＭｇＯ・Ａｌ_２Ｏ_３・ｎＨ_２Ｏ（ｎは正数）、協和化学工業（株）製〕を電気炉にて窒素気流下９００℃で２４時間加熱処理し、焼成物を調整した。

【0112】

＜製造例２＞
攪拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、モレキュラーシーブスを用いて脱水したγ−ブチロラクトン［東京化成工業（株）製］２０部と製造例１で得られた焼成物１部を投入した。窒素通気を１時間行った後、減圧（ゲージ圧−０．１ＭＰａ）した。次いで１５０℃に昇温し、エチレンオキサイド５０．７部を１５０℃にて、１０時間かけて圧入した後１０時間熟成した。
その後、オートクレーブから反応混合物５１．４部を抜き取り、オートクレーブに製造例１で得られた焼成物１部を投入した。窒素通気を１時間行った後、減圧（ゲージ圧−０．１ＭＰａ）した。次いで１５０℃に昇温し、エチレンオキサイド４３．６を１５０℃にて、１５時間かけて圧入した。その後、１０時間熟成し、環状化合物（Ａ）を含有する混合物（ＰＡ−１）を得た。
得られた混合物（ＰＡ−１）を５０℃まで冷却し、キシレン１００部を加えて５０℃に温調したのち、濾過助剤であるラヂオライト＃７００（昭和化学工業（株）製）５部及びキョーワード６００（協和化学工業（株）製）５部を層状に充填した吸引漏斗で濾過して触媒を濾別した。次いで、キシレンを減圧留去し、濃縮した。濃縮物にメタノール４０部を加えて撹拌し、水１００部を加えて再沈殿させ、デカンテーションによって沈殿物を分離し、更に沈殿物を減圧乾燥することで、環状化合物（Ａ−１）の平均付加モル数は２０であった。
得られた環状化合物（Ａ−１）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析を行った結果、環状化合物（Ａ−１）は、一般式（１）において、Ｒ^１がトリメチレン基であり、Ａ^１がエチレン基であり、ｎ＝２０である本発明の環状化合物と、更に［Ｒ^１ＣＯ（ＯＡ^１）_ｎＯ］で表される繰り返し単位を２個有する環状化合物と３個有する環状化合物とを含有する混合物であった。

【0113】

＜製造例３＞
攪拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、製造例２で得られた環状化合物（Ａ−１）３０部と製造例１で得られた焼成物２部を投入した。窒素通気を１時間行った後、減圧（ゲージ圧−０．１ＭＰａ）した。次いで１５０℃に昇温し、エチレンオキサイド５４．７部を１５０℃にて、１０時間かけて圧入した。その後、１０時間熟成し、環状化合物（Ａ）を含有する混合物（ＰＡ−２）を得た。
得られた混合物（ＰＡ−２）を５０℃まで冷却し、キシレン１００部を加えて５０℃に温調したのち、濾過助剤であるラヂオライト＃７００（昭和化学工業（株）製）５部及びキョーワード６００（協和化学工業（株）製）５部を層状に充填した吸引漏斗で濾過して触媒を濾別した。次いで、キシレンを減圧留去し、濃縮した。濃縮物にメタノール４０部を加えて撹拌し、水１００部を加えて再沈殿させ、デカンテーションによって沈殿物を分離し、更に沈殿物を減圧乾燥することで、環状化合物（Ａ−２）の平均付加モル数は２０であった。
得られた環状化合物（Ａ−２）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析を行った結果、環状化合物（Ａ−２）は、一般式（１）において、Ｒ^１がトリメチレン基であり、Ａ^１がエチレン基であり、ｎ＝６０である本発明の環状化合物と、更に［Ｒ^１ＣＯ（ＯＡ^１）_ｎＯ］で表される繰り返し単位を２個有する環状化合物と３個有する環状化合物とを含有する混合物であった。

【0114】

＜製造例４＞
攪拌装置及び温度調節機能の付いたステンレス製のオートクレーブに、製造例３で得られた環状化合物（Ａ−２）３０部と製造例１で得られた焼成物２部を投入した。窒素通気を１時間行った後、減圧（ゲージ圧−０．１ＭＰａ）した。次いで１５０℃に昇温し、エチレンオキサイド１９．４部を１５０℃にて、１０時間かけて圧入した。その後、１０時間熟成し、環状化合物（Ａ）を含有する混合物（ＰＡ−３）を得た。
得られた混合物（ＰＡ−３）を５０℃まで冷却し、キシレン１００部を加えて５０℃に温調したのち、濾過助剤であるラヂオライト＃７００（昭和化学工業（株）製）５部及びキョーワード６００（協和化学工業（株）製）５部を層状に充填した吸引漏斗で濾過して触媒を濾別した。次いで、キシレンを減圧留去し、濃縮した。濃縮物にメタノール４０部を加えて撹拌し、水１００部を加えて再沈殿させ、デカンテーションによって沈殿物を分離し、更に沈殿物を減圧乾燥することで、環状化合物（Ａ−３）の平均付加モル数は２０であった。
得られた環状化合物（Ａ−３）についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる分析を行った結果、環状化合物（Ａ−３）は、一般式（１）において、Ｒ^１がトリメチレン基であり、Ａ^１がエチレン基であり、ｎ＝１００である本発明の環状化合物と、更に［Ｒ^１ＣＯ（ＯＡ^１）_ｎＯ］で表される繰り返し単位を２個有する環状化合物と３個有する環状化合物とを含有する混合物であった。

【0115】

＜製造例５＞
高分子化合物（Ｃ１−１）を特開２０１７−２３００８実施例１Ａに記載の方法で合成した。
両末端にアミノ基を有するＰＥＧ（分子量２００００）[ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＥ−２０００ＰＡ， 日油（株）製]，１００部とジヂメチルアミノピリジン[東京化成工業（株）製]０．１８部をジクロロメタン６６０部に溶解し、4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio) pentanoic acid[Sigma-Aldrich社製]１４部と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド８．２部を加えて１２時間撹拌した。更にジクロロメタンを加えて、冷ジエチルエーテル中で沈殿させて回収した。得られた粗生成物を水に溶解して透析し凍結乾燥して高分子化合物（Ｃ１−１）を得た。

【0116】

＜製造例６＞
高分子化合物のポリマー伸長と環状化合物（Ａ−１〜Ａ−３）との複合化
製造例２で得られた環状化合物（Ａ−１）４３部、製造例５で得られた高分子化合物（Ｃ１−１）３８部、ＭＰＣ[日油（株）製]３５．４部およびＢＭＡ[東京化成工業（株）製]６３．３部とエタノール／トルエン（１／１）混合溶媒５８０部中でＡＩＢＮ（０．０８２部を開始剤としてアルゴン雰囲気下で１５分間反応させ、更に６０℃で２４時間反応させた。溶媒を留去し、粗成物を引き続きエタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドで洗浄した。得られた沈殿物を更に４０℃で真空乾燥して複合体（１）とした。

【0117】

＜製造例７＞
製造例６において、環状化合物（Ａ−１）４３部を環状化合物（Ａ−２）１２１部に変更する以外は、製造例５と同様の操作を行い、本発明の複合体（２）を得た。

【0118】

＜製造例８＞
製造例６において、環状化合物（Ａ−１）４３部を環状化合物（Ａ−３）２００部に変更する以外は、製造例５と同様の操作を行い、本発明の複合体（３）を得た。

【0119】

＜比較製造例１＞
特開２０１７−２３００８記載の実施例１Ａ〜Ｄの方法に従って、比較用のポリロタキサン（ＨＡ−１）（１分子あたりのα−ＣＤ貫通数１２、α−ＣＤへのメトキシ基導入率９０％のＰＥＧ・ＭＰＣ・ＢＭＡ共重合物）を得た。

【0120】

＜実施例１＞
製造例６で得られた複合体（１）１．８９部を４０００部のエタノールと５０００部の水に溶解させ、複合体の溶液を調整した。この溶液を２７φの直径を有するガラスボトムディシュ（IWAKI社製）に１００μＬキャストし、一晩クリーンベンチで乾燥させて、表面修飾基材（１）を得た。

【0121】

＜実施例２＞
実施例１において、複合体（１）１．８９部を複合体（２）３．１２部に変更する以外は、実施例１と同様の操作を行い、本発明の表面修飾基材（２）を得た。

【0122】

＜実施例３＞
製造例６において、複合体（１）１．８９部を複合体（３）４．３６部に変更する以外は、製造例５と同様の操作を行い、本発明の表面修飾基材（３）を得た。

【0123】

＜比較例１＞
製造例６において、複合体（１）１．８９部をポオリロタキサン（ＨＡ−１）５部に変更する以外は、製造例５と同様の操作を行い、比較用の表面修飾基材（４）を得た。

【0124】

＜モビリティファクター（運動因子）の評価＞
モビリティファクターは未分化性と相関があることが期待でき、モビリティファクターの評価方法は以下の通りである。
散逸モニタリング水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）としてＱ−ｓｅｎｓｅＥ４（ＢｉｏｌｉｎＳｃｉｎｅｔｉｆｉｃ社製）を使用し、測定に用いるセンサは金コーティングされたＱＳＺ３０１（ＢｉｏｌｉｎＳｃｉｎｅｔｉｆｉｃ社製）を使用して、以下の手順でモビリティファクターを評価した。フローチャンバーを通して，実施例１から３で作製したキャスト用の溶液（５ｍＬ）を注入して、ｉｎｓｉｔｕでモニタリングした。共鳴周波数の変化（Δｆ）は、１５−ＭＨｚの共鳴周波数に対応する３次オーバートーン（ν＝３）で測定した。また、本測定で用いたＱＣＭ−Ｄは振動エネルギーの散逸量（ΔＤ）を同時に測定することができる。これらの値を用いて、モビリティファクターはＭｆ＝ΔＤ／Δｆの式から算出した。

【0125】

＜細胞の培養方法＞
本発明の表面修飾基材を使用し、マウス由来のｉＰＳ細胞（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−１７８Ｂ−５、京都大学ｉＰＳ細胞研究所ＣｉＲＡ樹立）を３７℃、二酸化炭素濃度５容量％、１ｍLの未分化培地（１５重量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）培地）の条件下で８日間培養した。その際、播種後は毎日培地交換を行った。
細胞の未分化性を評価するために、以下の手順で示すウェスタンブロットによって、未分化マーカーであるＯｃｔ−４の蛋白質発現量を算出した。蛋白質発現量が高いと細胞の未分化性が抑制されることがわかる。

【0126】

＜ウェスタンブロット＞
細胞溶解液の調整
未分化培地で培養したｉＰＳ細胞をＭｉｎｕｔｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−Ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて溶解した。その後、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて細胞溶解液のタンパク質濃度を定量した。細胞溶解液のタンパク質溶液は９００μｇ／ｍＬの濃度に調整した。
電気泳動
電気泳動は、細胞溶解液１０μｌとＬａｍｉｅｌ Ｂｕｆｆｅｒ（バイオラッド社製）
１０μｌを混合した液を用いて以下の条件で実施することができる。
ポリアクリルアミドゲル：１０％アクリルアミドグラディエントゲル（バイオラッド社製）
電気泳動槽：ＷＳＥ−１１００Ｐ パジェラン−Ｒ（アトー株式会社製品）
印加電圧：２００Ｖ
電気泳動時間：３０分
転写
転写は、上記条件で電気泳動後、下記転写メンブレンを用いて以下の条件で実施することができる。
転写メンブレン：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ０．４５ ＰＶＤＦ（ＧＥヘルスケア株式会社製品）
転写液：ＡＥ−１４６５ＥｚＦａｓｔＢｌｏｔ （アトー株式会社製品）を蒸留水で１０倍に希釈した液
電圧／電流：１２Ｖ／４００ｍＡ
転写時間：３０分
発色
上記条件で転写後、その転写メンブレンを５％スキムミルク（Ｗａｋｏ社製）溶液で室温１時間浸した後、抗Ｏｃｔ４抗体（ウサギ由来、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１％スキムミルク溶液で１,０００倍希釈した溶液に室温で２時間浸した。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１％スキムミルク溶液で１，０００倍希釈した溶液で室温６０分浸した。その後ＰＢＳで３回洗浄を行った後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（富士フィルム社製）を用いて発色させた。
＜発現量の解析方法＞
発色させたことで得られる目的タンパク質のバンドの濃さをイメージＪによって数値化した。バンドが濃いほど、細胞溶解液の単位体積あたりのタンパク質の発現量が高いことを意味している。比較例で、イメージＪから得られるバンド濃さを数値化した値を１として、相対的に定量評価を行った。この結果を表１に示す。

【0127】

【表1】

【産業上の利用可能性】

【0128】

本発明の表面修飾基材は、細胞培養器、船底塗料、各種フィラー、ウレタンエラストマー、ハードコート、フィルム、ウレタンエラストマー、ウレタンフォーム、塗料、ゴム、医療材料、電子材料、その他工業に用いられる機能性材料として有用である。