特許 6943390 新規抗酸化眼内灌流液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6943390

(24)【登録日】2021年9月13日

(45)【発行日】2021年9月29日

(54)【発明の名称】新規抗酸化眼内灌流液

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/198 20060101AFI20210916BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210916BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20210916BHJP

   A61K 38/06 20060101ALI20210916BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/198

   A61P27/02

   A61P39/06

   A61K38/06

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2017-543669(P2017-543669)

(86)(22)【出願日】2016年9月30日

(86)【国際出願番号】JP2016079191

(87)【国際公開番号】WO2017057768

(87)【国際公開日】20170406

【審査請求日】2019年9月12日

(31)【優先権主張番号】特願2015-194716(P2015-194716)

(32)【優先日】2015年9月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504157024

【氏名又は名称】国立大学法人東北大学

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(74)【代理人】

【識別番号】100151596

【弁理士】

【氏名又は名称】下田 俊明

(72)【発明者】

【氏名】中澤 徹

(72)【発明者】

【氏名】赤池 孝章

(72)【発明者】

【氏名】國方 彦志

【審査官】 井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】 特開平７−９７３３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２３８３１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式（１）及び一般式（２）で表される活性イオウ分子からなる群より選択される１種以上を含有する、眼内灌流液。
Ｒ^１Ｓ（Ｓ）_ｎＨ ・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ^１はＬ−システイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）であって、チオール基以外の部分を表す。ｎは１以上の整数である。）
Ｒ^２Ｓ（Ｓ）_ｎＲ^３・・・（２）
（上記式（２）中、Ｒ^２及びＲ^３は、独立してＬ−システイン（Ｃｙｓ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）であって、チオール基以外の部分を表す。ｎは２以上の整数である。）

【請求項2】

前記活性イオウ分子が、システインパースルフィド及びグルタチオンパースルフィドから選択される１種以上を含有する、請求項１に記載の眼内灌流液。

【請求項3】

前記活性イオウ分子の前記眼内灌流液における濃度が０．０００３μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の眼内灌流液。

【請求項4】

前記活性イオウ分子の前記眼内灌流液における濃度が０．０１μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の眼内灌流液。

【請求項5】

前記活性イオウ分子の前記眼内灌流液における濃度が０．３μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の眼内灌流液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は眼内灌流液に関する。より具体的には、活性イオウ分子を含有する、新規眼内灌流液に関する。

【背景技術】

【0002】

白内障治療、角膜移植、硝子体手術などの眼科手術では、手術時に眼内組織を保護するため、眼内灌流液が用いられる。
眼内灌流液としては、グルタチオン誘導体を含有する眼内灌流液が開発されており、カルシウムの沈澱を効果的に抑制し、極めて安定な眼内灌流液であるとされている（特許文献１参照）。
また、アスコルビン酸とトコフェロールとのリン酸ジエステルを含有する眼内灌流液も開発されており、角膜細胞の保護に優れ、眼科手術を安全に行うことができるとされている（特許文献２参照）。

【0003】

一方で、活性イオウ分子であるシステインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）は、生体内で生成されることが報告されている。例えば、脱アミノ酵素などの補酵素としてよく知られるピリドキサールリン酸（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＰＬＰ）は、直接シスチン（Ｃｙｓｔｉｎｅ）と反応し、ＣｙｓＳＳＨを生成することが報告されている。また、ある種の酵素、特にシアン（ＣＮ^-）の解毒酵素として知られているロダネーゼ（Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ）の活性中心のシステイン残基は、チオ硫酸イオン（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ）よりイオウ分子の供給を受けることでパースルフィドを形成しており、これがシアンイオンと反応して、チオシアンイオン（ＳＣＮ^-）に解毒代謝することが知られている。

【0004】

一般にＣｙｓＳＳＨは、このような特殊な酵素の触媒活性を担う不安定な代謝中間体として認識されていたところ、本発明者らはＣｙｓＳＳＨなどの活性イオウ分子が、生体内で高い抗酸化活性やレドックスシグナルの制御機能を発揮していることを見出している（非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平７−９７３３１号公報

【特許文献2】特開平７−１０７０１号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ida, T. et al. Reactive cysteine persulfides and S-polythiolation regulate oxidative stress and redox signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2014, doi: 10.1073 / pnas.1321232111

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

眼科手術では、眼内灌流液により眼内組織が保護される一方で、眼科手術後に視力低下をきたす症例が散在する。本発明者らはこの原因として、手術侵襲由来の酸化ストレスによる角膜混濁、水晶体混濁、網膜細胞死などがあげられると考える。即ち、眼科手術ではその性質上、術中に手術用眼内灌流液を常に多量に循環させており、これが各眼内組織に直接触れ続けるため、これが手術侵襲になると考えている。
本発明は、このような問題を解決するものであり、眼科手術時に眼内組織が十分に保護され、更に安全性が高い眼内灌流液を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、眼科手術が必要な疾患を有する患者の眼内組織においては、健常者の眼内組織と比較して活性イオウ分子の濃度が高い状態であるという知見を得た。そして、眼科手術後の術後不良が、手術侵襲由来の酸化ストレスであるとの推定のもと、本発明者らが見出した抗酸化活性を有する活性イオウ分子を眼内灌流液成分として利用することで、眼科手術時に眼内組織が十分に保護され、更に安全性が高い眼内灌流液を提供できることに到達し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち本発明は、一般式（１）及び一般式（２）で表される活性イオウ分子、並びに前記活性イオウ分子の誘導体からなる群より選択される１種以上を含有する、眼内灌流液である。
Ｒ¹Ｓ（Ｓ）_nＨ ・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ¹はチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、チオール基以外の部分を表す。ｎは１以上の整数である。）
Ｒ²Ｓ（Ｓ）_nＲ³ ・・・（２）
（上記式（２）中、Ｒ²及びＲ³は、独立してチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、チオール基以外の部分を表す。ｎは２以上の整数である。）
また、本発明の好ましい実施形態は、前記Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³がＬ−システイン（Ｃｙｓ）、ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）であって、チオール基以外の部分を表す形態である。
また、本発明の好ましい実施形態は、前記活性イオウ分子が、システインパースルフィド及びグルタチオンパースルフィドから選択される１種以上を含有する形態である。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、眼科手術時に眼内組織が十分に保護され、更に安全性が高い眼内灌流液を提供できる。即ち、本発明者が先に見出したように、活性イオウ分子は高い抗酸化作用を有することから、眼内灌流液として利用することで手術侵襲由来の酸化ストレスを十分に抑制することが可能となる。また、眼科手術が必要な疾患を有する患者の眼内組織においては、健常者の眼内組織と比較して活性イオウ分子の濃度が高い状態であり、本発明の眼内灌流液は患者の眼内に存在する活性イオウ分子を含むことから、眼内での親和性が極めて高く、安全性が高い眼内灌流液である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】生体内活性パースルフィドの生成機構を示す図である。

【図2】メタボローム解析の原理を示す図である。

【図3】糖尿病性網膜症患者とコントロールの、血漿中でのイオウ関連物質濃度の比較を示すグラフである。

【図4】糖尿病性網膜症患者とコントロールの、前房水でのイオウ関連物質濃度の比較を示すグラフである。

【図5】糖尿病性網膜症患者とコントロールの、硝子体でのイオウ関連物質濃度の比較を示すグラフである。

【図6】洗浄サンプルのHPLC解析結果を示すグラフである。

【図7A-1】各種活性イオウ分子（ＧＳＳＧ、ＧＳＳＳＧ、ＧＳＳＳＳＧ、及びＧＳＳＳＳＳＧ）のスタンダードピークを示すグラフである。

【図7A-2】濃度既知のＧＳＳＧ（１μM、１０μM、及び５０μM）を用いた３点でのスタンダードカーブを示すグラフである。

【図7B】合成直後のサンプル（洗浄前）のＨＰＬＣ測定結果を示すグラフ（上）及び各種活性イオウ分子の定量結果を示す表（下）である。

【図7C】溶出サンプルのＨＰＬＣ測定結果を示すグラフ（上）及び各種活性イオウ分子の定量結果を示す表（下）である。

【図8】ＧＳ（Ｓ）_ｎＧの細胞毒性試験結果を示すグラフである。

【図9】ＧＳ（Ｓ）_ｎＧ及びＧＳＳＧそれぞれによる網膜細胞保護効果を示すグラフである。

【図10】ＧＳＳＧ、ＧＳＨ及びＧＳ（Ｓ）_ｎＧそれぞれ０．００００２ｍｇ/ｍｌでの網膜細胞保護効果を示すグラフである。

【図11】ＧＳＳＧ、ＧＳ（Ｓ）_ｎＧの、網膜細胞保護効果におけるＢＳＳとの相乗効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々に変形して実施することができる。

【0013】

本発明の実施形態である眼内灌流液は、活性イオウ分子又は活性イオウ分子誘導体を含む。
活性イオウ分子は、以下の式（１）及び（２）で表される。
Ｒ¹Ｓ（Ｓ）_nＨ ・・・（１）
Ｒ²Ｓ（Ｓ）_nＲ³ ・・・（２）
上記式（１）中、Ｒ¹はチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）、ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）またはグルタチオン（ＧＳＨ）であることが好ましい。なお、Ｒ¹はチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドであって、チオール基以外の部分を表す。また、ｎは１以上の整数であり、２以上であってよく、上限は特段ないが、例えば１０以下であり、８以下であってよく、５以下であってよい。
すなわち式（１）で表される化合物は、Ｌ−システインを例にあげれば、以下に表すとおり、Ｌ−システインのチオール基に更に過剰なイオウが結合した構造を有する化合物である。

【化1】

【0014】

上記式（２）中、Ｒ²及びＲ³は、独立してチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドから選択され、Ｌ−システイン、ホモシステインまたはグルタチオンであることが好ましい。なお、Ｒ²及びＲ³はチオール基を有するアミノ酸及びポリペプチドであって、チオール基以外の部分を表す。ｎは２以上の整数であり、３以上であってよく、上限は特段ないが、例えば１０以下であり、８以下であってよく、５以下であってよい。

【0015】

上記式（１）で表される分子としては、システインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）、グルタチオンパースルフィド（ＧＳＳＨ）、ホモシステインパースルフィド（ＨｃｙｓＳＳＨ）、及びこれらに更にイオウが結合した分子、があげられる。更にイオウが結合した分子としてはＣｙｓＳＳＳＨ、ＣｙｓＳＳＳＳＨ、ＧＳＳＳＨ、ＧＳＳＳＳＨなどが例示されるが、この限りではない。
なお、本明細書におけるＧＳＨとの表記はグルタチオンの慣用表記であり、ＧＳＳＨはグルタチオンのチオール基にイオウが１分子結合した構造を有する化合物を表す一方で、ＣｙｓＳＳＨはシステインパースルフィドを示し、Ｌ−システインのチオール基にイオウが１分子結合した構造を有する化合物を表す。
また、上記式（１）で表される分子の誘導体としては、Ｒ¹に含まれるアミノ酸及びポリペプチド鎖において、アミノ基、カルボキシル基などが任意の置換基で置換された誘導体があげられる。誘導体の例としては、シリル化体、エステル化体、アシル化体、アセチル化体などが例示される。

【0016】

上記式（２）で表される分子としては、シスチンにイオウが結合した分子（ＣｙｓＳＳＳＣｙｓ）、ホモシスチンにイオウが結合した分子（ＨｃｙｓＳＳＳＨｃｙｓ）、オキシグルタチオンにイオウが結合した分子（ＧＳＳＳＧ）、及びこれらに更にイオウが結合した分子、があげられる。更にイオウが結合した分子としてはＣｙｓＳＳＳＳＣｙｓ、ＧＳＳＳＳＧなどが例示されるが、この限りではない。
上記式（２）で表される分子の誘導体としては、上記式（１）での誘導体と同様の誘導体があげられる。

【0017】

先に述べたように、これらの活性イオウ分子は生体内で生成されることが知られている。また、本発明者らは、図１に示す生体内活性パースルフィドの生成機構を明らかにしており、生体内機構を用いて活性イオウ分子を産生し、抽出・生成することで、当業者は活性イオウ分子を入手することができる。

【0018】

眼内灌流液に含まれる活性イオウ分子の濃度は、使用対象患者の症状や活性イオウ分子の種類によって異なるが、最終濃度として、通常０．０００３μｇ／ｍＬ以上であり、０．００３μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．０１μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．０３μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．１μｇ／ｍＬ以上であってよく、０．３μｇ／ｍＬ以上であってよく、１μｇ／ｍＬ以上であってよく、３μｇ／ｍＬ以上であってよく、１０μｇ／ｍＬ以上であってよく、３０μｇ／ｍＬ以上であってよい。一方上限は、通常１０００μｇ／ｍＬ以下であり、３００μｇ／ｍＬ以下であってよく、１００μｇ／ｍＬ以下であってよく、３０μｇ／ｍＬ以下であってよい。

【0019】

本発明の実施形態に係る眼内灌流液には、通常眼内灌流液に配合される成分を配合してもよい。このような成分としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの各種の電解質、ブドウ糖などの単糖類、グルタチオンなどのペプチド類、ペニシリンなどの抗生物質などがあげられる。これらの成分は、通常量配合することができる。

【0020】

本発明の実施形態に係る眼内灌流液の製造方法は特段限定されず、公知の方法に従い調製される。例えば、活性イオン分子を含む配合成分を滅菌精製水に溶解させ、その後塩酸や水酸化ナトリウムなどのｐＨ調整剤により所望のｐＨに調整する。所望のｐＨに調整された溶液は、フィルター濾過を行った後、加熱滅菌処理される。滅菌処理後の溶液を空冷することで、眼内灌流液を製造することができる。

【0021】

本発明の実施形態に係る眼内灌流液は、高い抗酸化活性を有する活性イオン分子が含まれていることから、眼科手術における高い酸化ストレスをキャンセルすることができるため、眼科手術更なる低侵襲化が達成でき、術中術後の眼内組織破壊を最小限にできる。

【実施例】

【0022】

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
＜糖尿病網膜症患者の眼内環境分析＞
東北大学病院眼科で入院手術加療を行った糖尿病網膜症患者１８名（平均年齢５７．７±１６．１、男性９名、女性９名）を対象とし糖尿病網膜症疾患群とした。また、白内障または非炎症性黄斑疾患（黄斑前膜または黄斑円孔）患者２２名（平均年齢７１．０±１３．４、男性９名、女性１３名）をコントロール群とした。手術前３日から、術前無菌化療法の為、広域抗菌点眼剤点眼液を１日４回３日間連続で点眼させた。手術当日に、血液・前房水・硝子体サンプルを採取した。血液サンプルは、術前に静脈ルート確保の際に、約１ｍＬ採取し、遠心分離を行った後、血漿を凍結保存した。白内障手術の際には、前房穿刺し前房水サンプルを約１００μＬ採取し、凍結保存した。硝子体手術の際には、硝子体切除術(後部硝子体剥離術、および病態により黄斑前膜・増殖膜切除・内境界膜剥離術併用)を施行し、切除した硝子体サンプル約１００μＬを凍結保存した。術翌日より、術後の抗炎症効果を目的としてステロイド性抗炎症剤点眼液を１日４回点眼、さらに非ステロイド性抗炎症剤点眼液を１日２回点眼し、術後１か月以上継続した。また、術翌日より、術後感染症予防を目的として広域抗菌点眼剤点眼液を１日４回点眼し、術後１か月以上継続した。
糖尿病網膜症患者の特徴を表１に示す。

【0023】

【表1】

【0024】

糖尿病網膜症疾患群及びコントロール群の患者の血漿、前房水、及び硝子体について、活性イオウ分子濃度を、メタボローム解析により測定した。
還元型のポリスルフィドである活性イオン分子は、化学的反応性が高く不安定であり、直接同定・定量することが困難なため、試料をチオール基のアルキル化試薬であるモノブロモビマンと反応させ、試料中の還元型ポリスルフィドを安定なポリスルフィド−ビマン付加体に変換した。試料に、既知量の安定同位体標識した各種ポリスルフィド−ビマン付加体および酸化型ポリスルフィドの標準標品を添加し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（アジレント社６４３０）を用いて、非標識および安定同位体標識各種ポリスルフィド-ビマン付加体および酸化型ポリスルフィドを測定した。安定同位体標識標準標品の合成方法、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける各種ポリスルフィド−ビマン付加体および酸化型ポリスルフィドの測定条件は、非特許文献１に開示の方法に従った。試料中の各種ポリスルフィドの濃度は、添加した既知量の安定同位体標識標準標品のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムのシグナル強度をもとに算出した。測定の原理を図２に示す。

【0025】

また、各種ポリスルフィド関連標準標品は、非特許文献１に開示の方法に従って調製した。具体的には、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ７．４）に溶解した０．５ ｍＭシステイン、グルタチオン、またはホモシステインに、Ｐ−ＮＯＮＯａｔｅ（０．５ ｍＭ）を添加し室温で１５分間静置した後、ＮａＨＳ（０．５ ｍＭ）を添加し室温で１５分間反応させ、還元型ポリスルフィドを生成した。還元型ポリスルフィドは不安定であるため、チオール基のアルキル化試薬であるモノブロモビマン（５ ｍＭ）と反応させることにより安定なポリスルフィド−ビマン付加体に変換した。反応液中の各ポリスルフィド-ビマン付加体、および自動酸化により生成した酸化型ポリスルフィドは、高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製し、標準標品とした。
結果を図３〜図５に示す。

【0026】

図３は、血漿中では、糖尿病網膜症疾患群とコントロール群とを比較して、活性イオウ分子濃度の差はないという結果を示す。
図４は、前房水では、糖尿病網膜症疾患群とコントロール群とを比較して、糖尿病網膜症疾患群の方が、活性イオウ分子濃度が高いという結果を示す。
図５は、硝子体では、糖尿病網膜症疾患群とコントロール群とを比較して、糖尿病網膜症疾患群の方が、活性イオウ分子濃度が高いという結果を示す。

【0027】

図３〜図５の結果から明らかなとおり、血漿中では、システインパースルフィドやグルタチオンパースルフィドなどの活性イオウ分子濃度が、糖尿病網膜症疾患群において増加するという傾向は見られなかった。一方で、前房水及び硝子体、すなわち眼内組織では、システインパースルフィドやグルタチオンパースルフィドなどの活性イオウ分子濃度が、糖尿病網膜症疾患群において増加するという傾向が見られた。

【0028】

活性イオウ分子濃度が糖尿病網膜症疾患群において増加する理由は定かではないが、糖尿病網膜症の病態には、酸化ストレス蓄積が関与していることが知られており、生体の防御機構が働き、抗酸化物質が眼内に産生されているのではないかと推察している。
活性イオウ分子は、従来の眼内灌流液に含まれているグルタチオンと比較して、非常に高い抗酸化活性を有し、かつ、眼内疾患患者のみならずコントロール群でも眼内に存在が確認できた安全性の高い物質である。
眼科手術による酸化ストレスは、角膜、水晶体、網膜に影響を及ぼすと考えられ、本発明の実施形態に係る眼内灌流液は高い抗酸化活性を有することから、酸化ストレスの眼内暴露を防ぐことが可能である。そのため、眼科手術後に角膜内皮疲弊が進行し水疱性角膜症に至る症例、水晶体温存硝子体手術後に水晶体核硬化が進行し白内障に至る症例、硝子体手術で網膜細胞死が進行し術後視機能不良に至る症例を減らすことが可能となる。

【0029】

すなわち、本発明の実施形態に係る眼内灌流液は、眼内疾患患者の眼内環境において高濃度で存在する活性イオウ分子を含むため、眼内において親和性が高く極めて安全な眼内灌流液であるといえ、かつ、高い抗酸化活性を有することから、眼科手術後の眼内組織破壊を抑制することができ、術後不良を大幅に改善することができる。

【0030】

次に、システインパースルフィドやグルタチオンパースルフィドなどの活性イオウ分子による細胞保護効果を検証する。

【0031】

以下に、ＧＳ（Ｓ）_ｎＧの一調製例を示すが、この方法とは異なる方法で、活性イオウ分子を調製してもよい。
＜試薬＞
・還元型グルタチオン（ＧＳＨ） SIGMA-ALDRICH社 G4251-5G (M.W=307.2)
・Sodium disulfide (Na₂S₂) 同仁化学 SB02
・0.1%ギ酸（MilliQ水300 ml＋ギ酸 300μl）
・0.1%ギ酸／60%メタノール(0.1% ギ酸80 ml＋メタノール120 ml)
＜方法＞
１．Sep-pakカラムを0.1%ギ酸により平衡化した (100 ml)。
２．GSHおよびNa₂S₂を溶解する超純水を脱気しアルゴン置換した。
３．GSHおよびNa₂S₂を秤量し、200 mM GSHと200 mM Na₂S₂を調製した（GSH31.4 mg＋MilliQ水511μl）(Na₂S₂ 11.1 mg＋MilliQ水505μl)。
４．200 mM GSHと200 mM Na₂S₂を0.5 mlずつエッペンチューブに混ぜ、室温で15分間反応させた。
５．上記４を15 mlチューブに移し、0.1%ギ酸を4 ml加えて反応を止めた。
６．上記５のチューブを遠心分離 (9000rpm、10min) し、HPLC確認用に上清を10μl回収した（合成直後のサンプル）。
７．平衡化したSep-pakカラムに６の上清を全てロードした。
８．洗浄：0.1%ギ酸を200 ml流し（85 mlを流した後、10 mlずつ12本回収）、洗浄サンプルを得た。
９．溶出：0.1%ギ酸／60%メタノールを10 ml×6本で回収し、溶出サンプルを得た。
１０．得られた洗浄サンプルおよび合成直後のサンプルをHPLCで確認した (0.1% ギ酸90μl＋sample10μl、検出：A254nm)。結果をそれぞれ図６及び７Ｂに示す。図６に示された洗浄サンプルに見られたピークはＧＳＳＧであり、図７Ａ−１に示されたＧＳＳＧ、ＧＳＳＳＧ、ＧＳＳＳＳＧ、及びＧＳＳＳＳＳＧ標準標品のHPLC解析によるリテンションタイムを参照すると、洗浄サンプルにはＧＳ（Ｓ）_ｎＧ（但しｎは２以上）は含まれていないことが確認できた。一方、図７Ｂは、合成直後のサンプル（洗浄・溶出前のサンプル）のＨＰＬＣ解析結果である。
１１．溶出サンプルのうち、フラクション２及び３をよく混合し、5 ml × 4本に分注し、Centirifugal evaporator CVE-3100 (EYELA)で乾固しＧＳ（Ｓ）_ｎＧ（ｎは２以上）を得た。
１２．得られたＧＳ（Ｓ）_ｎＧをＨＰＬＣ（検出：A254nm）を用いて定量するために、10ｍＭのＧＳＳＧ（ＧＳＳＧ5.5μg＋MilliQ水897.7μl）を用いて濃度既知のサンプル1ｍＭ、100μＭ、50μＭのＧＳＳＧを作成し、スタンダードカーブを作成した（図７Ａ−２）。スタンダードカーブより溶出液中のＧＳ（Ｓ）_ｎＧ含有量を算出した結果フラクション2は19.3mgとなった。結果を図７Ｃに示す。図７Ｃは溶出サンプルのHPLC解析結果であり、リテンションタイム２分にピークが存在しないことからＧＳＳＧは含まれず、ＧＳ（Ｓ）_ｎＧ（但しｎは２以上）の溶出が確認できた。その多くはＧＳＳＳＧ及びＧＳＳＳＳＧでありＧＳＳＳＳＳＧは微量であった。その時のA254nmの値が0.701であることからフラクション3（A254nm 0.507）は13.9mgとなり合計33.2mgのＧＳ（Ｓ）_ｎＧを得ることができた。

【0032】

＜活性イオウ分子の細胞毒性の検証＞
上記の通り合成されたＧＳ（Ｓ）_ｎＧ（但しｎは２以上）を用いて、網膜神経節由来細胞株（ＲＧＣ５細胞）に対する細胞毒性および神経保護効果を、in vitro暴露実験により確認した。ＲＧＣ５細胞を0.75×10⁴cells/100ulで96well plateに播種し一晩培養した。ＧＳ（Ｓ）_ｎＧを、最終濃度0.02mg/ml、0.002mg/ml、0.0002mg/ml、及び0.00002mg/mlとなるようにそれぞれ添加し、37℃で24時間培養した。その後AlamarBlue法により細胞の生存状況を測定した。結果を図８に示す。ＧＳ（Ｓ）_ｎＧによる細胞毒性は見られなかった。

【0033】

＜活性イオウ分子による細胞保護効果の検証１＞
ＧＳＳＧ（G4376、SIGMA-ALDRICH社）、及び上記方法で得られたＧＳ（Ｓ）_ｎＧ（但しｎは２以上）を用いてＲＧＣ５細胞に対する保護効果を、in vitro暴露実験により確認した。ＲＧＣ５細胞を1×10⁴cells/100μl で96well plateに播種し500 μM BSO（Ｌ−ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ−（Ｓ，Ｒ）−ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ、和光純薬）を含む培地中で15時間培養した。その後Reductase及びNADPHとともにＧＳ（Ｓ）_ｎＧ及びＧＳＳＧ（終濃度25 μg/ml）をそれぞれ培地に添加した。コントロールとしては各種活性イオウ分子の代わりに水を同量添加した。添加6時間後に過酸化水素（終濃度100 μM）を添加し1.5時間放置し、AlamarBlue法により細胞の生存率を測定した。結果を図９に示す。結果から、ＧＳ（Ｓ）_ｎＧは細胞障害に対し、ＧＳＳＧよりも優れた保護効果を発揮することが分かった。

【0034】

＜活性イオウ分子による細胞保護効果の検証２＞
次に、上記方法で得られたＧＳ（Ｓ）_ｎＧを用いて、活性イオウ分子の濃度を変化させ、細胞保護効果について検証した。ＲＧＣ５細胞を0.75×10⁴cells/100μl で96well plateに播種し一晩培養した。ＧＳ（Ｓ）_ｎＧ、ＧＳＳＧ、及びＧＳＨ（G4251、SIGMA ALDRICH社）をそれぞれ、最終濃度0.00002mg/mlで添加し、37℃で培養した。添加2時間後に過酸化水素（終濃度0.3mM）を添加しさらに２４時間培養を続け、AlamarBlue法により細胞の生存率を測定した。結果を図１０に示す。これにより、ＧＳ（Ｓ）_ｎＧは低濃度においても細胞保護効果を発揮することが分かった。この効果はＧＳＳＧ及びＧＳＨと比較して顕著であった。

【0035】

＜ＢＳＳとの相乗効果＞
ＲＧＣ５細胞を1×10⁴cells/100μl で96well plateに播種し500 μM BSOを含む培地中で15時間培養した。その後、培地を除去し、日本アルコン社製ビーエスエスプラス２５０眼灌流液0.0184%（希釈液とＧＳＳＧストック溶液により構成）に付属する希釈液、またはＧＳＳＧストックを添加した希釈液（ＢＳＳ;終濃度0.0184%）100μlと交換した。続いて、Reductase及びNADPHとともにＧＳ（Ｓ）_ｎＧ及びＧＳＳＧ（終濃度25 μg/ml）をそれぞれ培地に添加した。コントロールとしては各種活性イオウ分子溶液の代わりに水を同量添加した。添加6時間後に過酸化水素（終濃度100 μM）、AlamarBlue検出液を添加し、3時間放置し細胞の生存率を測定した。結果を図１１に示す。ＢＳＳ単独に加えてＧＳ（Ｓ）_ｎＧをさらに加えることで細胞保護効果が増強された。

【産業上の利用可能性】

【0036】

本発明により、グルタチオンを有効成分とする従来の眼内灌流液と比較して、非常に高い抗酸化活性を有し、かつ、眼内疾患患者のみならずコントロール群でも眼内に存在が確認できた安全性の高い新規な眼内灌流液を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A-1】

【図7A-2】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】