特許 6943937 幹細胞培養のためのマイクロキャリア

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6943937

(24)【登録日】2021年9月13日

(45)【発行日】2021年10月6日

(54)【発明の名称】幹細胞培養のためのマイクロキャリア

(51)【国際特許分類】

   C12N 11/02 20060101AFI20210927BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20210927BHJP

   C12N 11/08 20200101ALI20210927BHJP

   C12N 11/12 20060101ALI20210927BHJP

【ＦＩ】

   C12N11/02

   C12N5/0735

   C12N11/08

   C12N11/12

【請求項の数】14

【全頁数】146

(21)【出願番号】特願2019-211253(P2019-211253)

(22)【出願日】2019年11月22日

(62)【分割の表示】特願2017-222498(P2017-222498)の分割

【原出願日】2009年3月17日

(65)【公開番号】特開2020-39356(P2020-39356A)

(43)【公開日】2020年3月19日

【審査請求日】2019年12月17日

(31)【優先権主張番号】61/069,694

(32)【優先日】2008年3月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/110,256

(32)【優先日】2008年10月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/148,064

(32)【優先日】2009年1月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/155,940

(32)【優先日】2009年2月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503231882

【氏名又は名称】エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(72)【発明者】

【氏名】オー，スティーブ

(72)【発明者】

【氏名】レシナ，マルティ

(72)【発明者】

【氏名】チュー，アンドレ

(72)【発明者】

【氏名】ルーヴェニー，ショール

(72)【発明者】

【氏名】ツヴァイゲルト，ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】チェン，アレン

【審査官】 長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００７／０２６４７１３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１４７９５９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １１／０２

Ｃ１２Ｎ ５／０７３５

Ｃ１２Ｎ １１／０８

Ｃ１２Ｎ １１／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックスでコートされており、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含み、
マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなり、
マトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含み、
幹細胞を、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、または肺細胞に分化させる、方法。

【請求項2】

幹細胞を、ウシ血清アルブミン、ダイズ水解物、および脂質混合物からなる群より選択されてもよい培地補充物の存在下で培養する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

幹細胞を培養して胚様体を形成させる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養し分化させる方法であって、
（ｉ）ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は細胞外マトリックス成分を含むマトリックスでコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復し；
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックスでコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、幹細胞の数を各継代間で拡張させ、
マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなり、
マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含み、
幹細胞を、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、または肺に分化させる、前記方法。

【請求項5】

工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代、または少なくとも７継代、または少なくとも１０継代反復する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

継代することが、ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞をマイクロキャリアの表面から離脱させることを含み、前記離脱させることは、機械的解離または酵素解離を含んでもよい、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１または４に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックスでコートされている、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ヒト幹細胞をマイクロキャリアから分離することをさらに含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

マイクロキャリアが親水性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞生物学、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は幹細胞を粒子状キャリア上で培養する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂して、自己再生する（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ）か、または表現型および機能の異なる娘細胞に分化する能力をもつ(Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993; 225: 900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005; 105: 359-368)。

【0003】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、多様な幹細胞タイプに分化する能力をもつ多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。幹細胞、たとえば胚性幹細胞（ＥＳＣ）の多分化能、およびそれらが３種類すべての胚葉からの細胞に分化する能力により、これらは多くの疾患および組織傷害に対する再生医療に理想的な細胞源となる(Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678)。

【0004】

１以上の継代を必要とする幹細胞の大量拡張は、細胞療法の前提条件である。
現在、コロニーとして増殖する幹細胞（ヒト胚性幹細胞ｈＥＳＣを含めて）は、通常はプラスチック培養表面において二次元（２Ｄ）成長で維持されている。２Ｄ培養においてより多量にまで拡張するには大きな表面積の使用が必要であろう。これらの２Ｄコロニーをより小さなサイズに分断するためのピペッティングまたは酵素処理の反復による細胞継代の手動性は、非実用的となるであろう。大きな表面積に接種するための多数のプレートの調製は、取扱い誤差の対象となる可能性がある。さらに、たとえばヌンク（Ｎｕｎｃ）トレーのような著しく大きな表面積が必要であろう。

【0005】

したがって、コートしたプラスチック表面で２Ｄコロニー培養として幹細胞を増殖させる現在の方法は、スケールアップになじまず、培養を実施する実験条件は一般に良好には制御しにくい。先行技術には、幹細胞を三次元（”３Ｄ”）環境で、たとえばマイクロキャリア上において懸濁培養で培養する多数の試みが含まれる。マイクロキャリア上のマウス胚性幹細胞(Fernandes et al., 2007; Abranches et al., 2007; King and Miller, 2007)およびｈＥＳＣを懸濁培養において胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）として分
化させるもの(Dang et al., 2004; Fok and Zandstra, 2005; Cameron et al., 2006)な
ど幾つかの研究を除いて、ｈＥＳＣを懸濁培養において長期間、連続培養する強力な方法はない。

【0006】

当技術分野で、胚性幹細胞を懸濁培養において”胚様体”として分化させることが知られている。そのような胚様体は多量の既に分化した細胞を含む。たとえばGerecht Nir et
al (2004)には、胚様体を培養するための回転壁バイオリアクターの使用が記載されている。撹拌システムを用いる胚様体培養も、Zandstra et al (2003), Dang et al (2004)およびWartenberg et al (1998)により示された。胚様体の懸濁培養も、Dang and Zandstra
(2005)およびKing and Miller (2007)により報告されている。そのような技術は、分化
した幹細胞を含むこれらの組織様の胚様体集合体を培養するのには適しているが、未分化の幹細胞には適さない。

【0007】

Fok and Zandstra (2005)には、未分化のマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）の伝播のため
の撹拌懸濁培養システムが記載されている。この撹拌懸濁培養システムは、マイクロキャ
リアおよび集合体の培養からなっていた。ガラスマイクロキャリア上で培養されたマウス胚性幹細胞は、組織培養フラスコ対照に匹敵する集団倍増時間をもっていた。白血病阻害因子を除去すると、このｍＥＳＣ集合体は多系列分化しうる胚様体（ＥＢ）に発生した。マウスＥＳＣの懸濁培養は、King and Miller (2005)にも記載されている。しかし、King
and Miller (2005)には、”未分化のヒトＥＳＣｓ（ｈＥＳＣ）の拡張はｍＥＳＣの場合より難しく、まだ撹拌培養においては報告されていない”と述べられている。

【0008】

ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）には、ヒト胚性幹細胞をマイクロキャリア上で培養する試みが開示されている。ヒト胚性幹細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）マイクロキャリアと共に、種々の体積の馴化培地と一緒にスピナーまたはバイオリアクターに導入している。この培養物を２０〜３０ｒｐｍで１時間中の３０分間撹拌する。培養物を１０日ないし６週間の種々の期間、維持している。しかし、いずれの時点でも、培養物はいずれも、幹細胞の大規模連続生産に必須の要件である継代または二次培養がなされなかった。マイクロキャリア上での連続継代および二次培養能の証明は、’良好な’（指数）成長速度と共に、幹細胞の大規模生産に必須の要件である。これはＴｅｒｓｔｅｇｇｅらの研究により証明されなかった。

【0009】

ＷＯ２００８／００４９９０には、幹細胞をフィーダー細胞の不存在下で培養する試みが記載され、マイクロキャリアの使用を考慮している。それは、Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用しない培養に関する。ＷＯ２００８／００４９９０には、幹細胞分化の阻害における陽電荷をもつ表面の影響が記載されている。

【0010】

Phillips et al., 2008 (Journal of Biotechnology 138 (2008) 24-32)には、ｈＥＳ
Ｃをマイクロキャリア上で集合体および単一細胞の接種により培養する試みが報告されている。最初は３倍拡張が５日間かけて達成されたが、各連続継代に伴って細胞拡張が低下し、最終的に６週目を超えて細胞を継代することはできなかった。

【0011】

市販のマイクロキャリア、たとえばＣｙｔｏｄｅｘ １および３をヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養のスケールアップのために使用するこれまでの試みは成功しなかった。ｈＥＳＣ培養物はキャリア上で死滅または分化し、伝播できなかった(Oh & Choo, 2006)。

【0012】

ヒト幹細胞を含めた霊長類に由来する未分化の多分化能性細胞の懸濁液中での安定な連続成長は、これまで達成されていない。霊長類またはヒトの幹細胞、特に胚性幹細胞の連続継代を、懸濁培養において証明した者はこれまでいない。

【0013】

幹細胞を他の有用な細胞タイプに大規模で分化させることもきわめて重要である。たとえば、臨床試験、薬物探索を実施するためには、また有望な将来の細胞療法を開発するためにも、多数の心筋細胞が必要である。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は多分化能性であり、あらゆる胚葉に分化しうるので、ｈＥＳＣはこれらの用途のための心筋細胞および他の細胞タイプの供給源を提供することができる。これまで、ｈＥＳＣに由来する心筋細胞の分化プロトコルは科学社会でわずかに記載されているが、提唱された生物学的方法のスケール調節可能性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）は明らかではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】ＵＳ２００７／０２６４７１３

【特許文献2】ＷＯ２００８／００４９９０

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155

【非特許文献2】Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678

【非特許文献3】Wiles, Methods in Enzymology. 1993; 225: 900-918

【非特許文献4】Choi et al, Methods Mol Med. 2005; 105: 359-368

【非特許文献5】Fernandes et al., 2007

【非特許文献6】Abranches et al., 2007

【非特許文献7】King and Miller, 2007

【非特許文献8】Dang et al., 2004

【非特許文献9】Fok and Zandstra, 2005

【非特許文献10】Cameron et al., 2006

【非特許文献11】Gerecht Nir et al (2004)

【非特許文献12】Zandstra et al (2003)

【非特許文献13】Wartenberg et al (1998)

【非特許文献14】Dang and Zandstra (2005)

【非特許文献15】King and Miller (2005)

【非特許文献16】Phillips et al., 2008 (Journal of Biotechnology 138 (2008) 24-32)

【非特許文献17】Oh & Choo, 2006

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の問題を解決することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、ヒトまたは霊長類の胚性幹細胞を安定に長期間、インビトロ培養において培養するための方法を提供する。この方法を用いて、ヒト胚性幹細胞を各継代間で連続拡張させることができ、拡張したヒト胚性幹細胞集団の多分化能性は少なくとも５継代を超えて、通常は１０継代を超えて維持される。

【0018】

重要なことに、好ましくは細胞外マトリックス成分を含むマトリックスでマイクロキャリアをコートした場合、マイクロキャリア上での幹細胞の培養および分化を改善しうることを本発明者らは見いだした。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。

【0019】

幹細胞の成長および増殖のために好ましいマトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロン酸、ラミニンのうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むか、あるいはそれらからなることができる。

【0020】

幹細胞の分化のために好ましいマトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むか、あるいはそれらからなることができる。

【0021】

１観点において、本発明は、培養物中の幹細胞の多分化能性状態を維持しつつ、マイクロキャリア上で懸濁培養において幹細胞を多数継代にわたって成長および増殖させることに関する。好ましくは細胞外成分を含むマトリックス中にマイクロキャリアをコートし、そして幹細胞を接種する。好ましくは、マイクロキャリアは陽電荷をもつ。幹細胞を懸濁
培養において培養して、好ましくは培養物中の幹細胞の数を拡張させる。次いで、培養幹細胞を継代し、同一または異なるマトリックスコーティングをもつマイクロキャリア上に継代幹細胞を接種する。こうして、培養および継代した幹細胞が多分化能性状態を維持したまま、幹細胞は複数継代、たとえば少なくとも３継代を経ることができる。この方法を用いると、継代間の各培養サイクル期間中に幹細胞の増殖がみられ、多数（少なくとも１０）継代にわたって増殖を維持することができる。

【0022】

この培養方法により、インビトロ培養における幹細胞の連続した成長および継代が可能になり、これにより多分化能をもつ幹細胞を療法に有用な数まで拡張させるための方法が提供される。

【0023】

マイクロキャリア上での幹細胞の連続継代がしばしば好ましいであろうが、本発明方法の一部として、幹細胞をマイクロキャリア上での培養から他の培養システム、たとえば２Ｄコロニー培養へ移植し、続いて懸濁マイクロキャリア培養に戻すことができる。

【0024】

本方法は、好ましくは、培養の各サイクル中に、マトリックスコートしたマイクロキャリアに継代前に幹細胞を付着させる工程を伴う。しかし、ある培養サイクルをコートしていないマイクロキャリア上で行なうことが許容される；ただし、継代を伴う培養サイクルを全体として合計で少なくとも３回は、マトリックスコートしたマイクロキャリア上で行なうことが好ましいであろう。より好ましくは、これは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の培養サイクルのいずれかであろう。

【0025】

したがって、本発明方法はインビトロ培養における多分化能性幹細胞の長期継代を提供し、その際、幹細胞は安定に培養および継代されてそれらの多分化能状態は保存される。
本発明の他の観点は、マイクロキャリアに付着した多分化能性幹細胞の分化に関する。

【0026】

ある態様において、前記の観点に記載したマイクロキャリア培養法を用いることにより、多分化能性幹細胞を分化に必要な細胞密度まで成長させることができる。必要な細胞密度が得られた時点で、マイクロキャリアに付着した幹細胞の分化を誘導するように培養条件を変更することができる。分化のためには、幹細胞の成長に用いたものと比較して同一または異なるマイクロキャリアを使用できる。同様に、同一または異なるマトリックスコーティングを使用できる。たとえば、第１コーティングをもつ第１マイクロキャリアを多分化能性幹細胞の成長および増殖のために用い、第２コーティングをもつ第２マイクロキャリアをそれらの幹細胞の分化のために用いることができる。分化のためには、マイクロキャリアはコートされていなくてもよい。

【0027】

幹細胞の増殖とそれらの分化の両方にマイクロキャリア培養を採用することは、分化用培養に増殖培養物を再接種する必要性が避けられ、これによって多数の多分化能性細胞が分化のために供給され、かつ培養条件の変更により増殖から分化へ簡便に変更されるという利点をもつ。

【0028】

他の態様においては、他の培養法、たとえば２Ｄコロニー培養によって、分化のための多分化能性幹細胞を必要な細胞密度まで成長させることができる。次いで、マトリックスコーティングをもつマイクロキャリアにこれらの細胞を付着させ、幹細胞の分化を誘導する条件下で懸濁培養において培養する。

【0029】

ある態様においては、既に分化（ただし、好ましくは最終分化ではない）を行なった細胞を、マトリックスコーティングをもつマイクロキャリアまたはコーティングしていないマイクロキャリアに付着させ、幹細胞の分化を誘導する条件下で懸濁培養において培養す
ることができる。

【0030】

本発明の１観点によれば、幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性である。

【0031】

幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞であり、好ましくは霊長類またはヒトのものである。
マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。

【0032】

マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなることができる。あるいは、マイクロキャリアはマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンとカップリングしていてもよい。

【0033】

マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもち、好ましくは表面陽電荷をもつ。それは親水性であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくはロッド形、たとえば円筒形、または実質的に球形の形状である。

【0034】

好ましくは、工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する。ある態様では、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞はその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる。

【0035】

本発明の態様において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する。

【0036】

好ましい態様では、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％において、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の連続サイクル中に、マイクロキャリアは同一マトリックス中にコートされていてもよく、あるいは、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１および第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しなくてもよい。

【0037】

好ましい態様において、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。

【0038】

好ましい態様において、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。

【0039】

ある態様において、本方法は、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含むことができる。
他の態様において、フィーダー細胞がマイクロキャリアに付着してもよい。フィーダー細胞は、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着してもよい。

【0040】

本発明は、本発明方法により得られる多分化能性幹細胞を含む。
他の態様において、本方法はさらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含むことができる。これは、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことにより達成できる。あるいは、本方法は、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含むことができる。

【0041】

したがって、ある態様において本方法は、さらに多分化能性幹細胞の分化を含むことができ、これは
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。

【0042】

第１マトリックスと第２マトリックスは同一でも異なってもよい。第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアは同一でも異なってもよい。
ある態様においては、さらなる分化を誘導することができ、その際、本方法はさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。

【0043】

第３マトリックスは、第１および第２マトリックスと異なってもよく、あるいは第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一であってもよい。第３マイクロキャリアは、第１および第２マイクロキャリアと異なってもよく、あるいは第１および第２マイクロキャリアのいずれか１つと同一であってもよい。

【0044】

本発明は、本発明方法により得られる分化した細胞を含む。
本発明方法により得られる分化した細胞を培養して胚様体を形成させることができる。胚様体をマイクロキャリアに付着させることができる。こうして得られる胚様体は本発明
の一部を形成する。

【0045】

本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性であり、培養物はフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞はヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である。

【0046】

本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性であり、この方法はさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。

【0047】

第１マトリックスと第２マトリックスは同一でも異なってもよい。第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアは同一でも異なってもよい。
本方法はさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含むことができる。

【0048】

第３マトリックスは、第１および第２マトリックスと異なってもよく、あるいは第１および第２マトリックスの１つと同一であってもよい。第３マイクロキャリアは、第１および第２マイクロキャリアと異なってもよく、あるいは第１および第２マイクロキャリアの１つと同一であってもよい。

【0049】

本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで分化させる方法が提供され、この方法は、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養
において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む。

【0050】

幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞であり、好ましくは霊長類またはヒトのものである。
マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。

【0051】

マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなることができる。あるいは、マイクロキャリアはマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアであってもよい。マイクロキャリアはプロタミンまたはポリリジンとカップリングしていてもよい。

【0052】

マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもち、好ましくは表面陽電荷をもつ。それは親水性であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくはロッド形、たとえば円筒形、または実質的に球形の形状である。

【0053】

本発明の他の観点においては、霊長類またはヒトの幹細胞の伝播のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用が提供され、マイクロキャリアはＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される。

【0054】

マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。

【0055】

本発明の一部として、本明細書に記載する方法は、多分化能性ではない（ｎｏｎ−ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、特に多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、たとえば成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞（たとえば胚性幹細胞に由来する多能性幹細胞）の安定な長期培養を達成するためにも使用できる。多能性幹細胞はヒトまたは霊長類の多分化能性幹細胞、たとえばｈＥＳＣに由来するものであってもよい。

【0056】

本明細書に記載する方法の使用により、多能性幹細胞（たとえば成体幹細胞）を各継代間で連続拡張させることができ、かつ拡張した成体幹細胞集団の多能性を少なくとも２継代を超えて、より好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５継代のうちのいずれかを超えて維持することができる。

【0057】

したがって、多能性幹細胞の培養、成長、伝播および分化は、幹細胞、たとえばヒトまたは霊長類の胚性幹細胞の培養、成長、分化および伝播のための本明細書に記載するいず
れかの方法、観点、態様、および好ましい特徴に従って実施できる。多能性幹細胞の培養、成長、増殖および／または分化のために用いるマイクロキャリアはコートされていなくてもよく、あるいはマトリックスコーティングをもつこともできる。

【0058】

これによれば、本発明の他の観点において、多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞は多能性である。

【0059】

本発明の他の観点においては、多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多能性である。

【0060】

上記の２観点のある態様において、工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされている。
これらの方法により得られる多能性幹細胞も提供される。

【0061】

本発明の他の観点においては、多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多能性であり、該方法はさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。

【0062】

ある態様において、工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされている。
本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで分化させる方法が提供され、この方法は、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む。

【0063】

これらの方法により得られる分化した細胞も提供される。
本発明の１観点によれば、それにコートされたマトリックスを含み、陽電荷をもつ粒子
が提供され、この粒子はそれに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を集合させることができるサイズのものである。

【0064】

本発明の粒子は、実質的に細長い、円筒形もしくはロッドの形状の粒子、または実質的にコンパクトな、もしくは球形の形状の粒子を含むことができる。
本発明の粒子は、５０μｍ〜４００μｍの最長寸法をもつ、実質的に細長い、円筒形もしくはロッドの形状の粒子を含むことができる。粒子は約２００μｍの最長寸法を含むことができる。粒子は２０μｍ〜３０μｍの最短寸法を含むことができる。粒子は、円筒形のセルロースマイクロキャリアを含むことができる。

【0065】

本発明の粒子は、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。
本発明の粒子は、約２０μｍ〜約１２０μｍのサイズをもつ実質的にコンパクトな、または球形の形状の粒子を含むことができる。粒子は約６５μｍのサイズをもつことができる。粒子は、親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリル系マトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状（ｂｅａｄｅｄ）マイクロキャリアを含むことができる。

【0066】

本発明の粒子は、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。
本発明の粒子は、マクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。

【0067】

本発明の粒子は陽電荷をもつように誘導体化されていてもよい。粒子は、粒子の乾燥物質重量グラム当たり１〜２ミリ当量の小さなイオン交換容量の第三級アミンまたは第四級アミンとカップリングしていてもよい。粒子は、最高２０ｍｇ／粒子ｍｌの濃度の硫酸プロタミンまたはポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩とカップリングしていてもよい。粒子の陽電荷は、０．５〜４ミリ当量単位／ｍｌ（ｍＥｑ）であってよい。

【0068】

マトリックスは、幹細胞の成長を可能にする生理学的関連マトリックスを含むことができる。マトリックスは、細胞外マトリックス成分を含むことができる。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸、ウシのガラス体液に由来するヒアルロン酸、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン硫酸、ウシの腎臓に由来するヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸からなる群から選択することができる。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むことができる。

【0069】

本発明の他の観点によれば、前記の本発明の観点による粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を含むものが提供される。
本明細書に記載する本発明の観点、態様および特徴によれば、多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ懸濁培養に使用するのに適切な粒子またはマイクロキャリアが提供され、これにより、多分化能性もしくは多能性の状態を有する新たな細胞または多分化能性もしくは多能性細胞の分化の産物である細胞が生成し、これらの粒子またはマイクロキャリアは、コンパクトな、または細長い形状をもち、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法をもち、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており、多数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスに付着している。ある態様において、マトリックスコーティングはマトリックスの層、好ましくは薄層の形である。

【0070】

１態様においてはマイクロキャリアが提供され、その際、マイクロキャリアは多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切であり、マイクロキャリアはセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を含み、マイクロキャリアは細長い形状をもち、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法をもち、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着している。

【0071】

ある態様において、マイクロキャリアはロッド形である。ある態様において、マトリックスコーティングは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む。ある態様において、マイクロキャリアは陽電荷をもち、あるいは表面陽電荷をもつ。ある態様において、マイクロキャリアの最長寸法は５０μｍ〜４００μｍである。

【0072】

２種類以上の前記マイクロキャリアを含む集合体も提供される。
多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、マイクロキャリアの使用も提供される。多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、マイクロキャリアの使用も提供される。したがって、多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成するのに適切な条件下でマイクロキャリアを培養することを含む方法も提供される。多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下でマイクロキャリアを培養することを含む方法も提供される。

【0073】

本発明者らは、本発明の他の観点により、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法を提供し、この方法は（ａ）第１粒子に付着した霊長類またはヒトの第１幹細胞を用意し；（ｂ）第２粒子に付着した霊長類またはヒトの第２幹細胞を用意し；（ｃ）霊長類またはヒトの第１幹細胞を霊長類またはヒトの第２幹細胞に接触させて細胞の集合体を形成させ；そして（ｄ）集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代伝播させることを含み；その際、第１および第２粒子はそれぞれその上にコートされたマトリックスを含み、陽電荷をもち、粒子はそれに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を集合させることができるサイズのものである。

【0074】

前記の粒子または各粒子は、前記の本発明の観点に述べた特徴を含むことができる。
この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を多数継代、連続伝播させるのを可能にすることができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、または少なくとも１４継代、連続伝播させるのを可能にすることができる。この方法は、２Ｄコロニー培養への、または２Ｄコロニー培養からの継代を含むことができる。

【0075】

前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞の凍結および融解を含むことができる。この方法は、３０ｒｐｍ以上、または１００ｒｐｍ以上での撹拌を含むことができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を２５ｍｌ以上または５０ｍｌ以上の体積で伝播させるのを含むことができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞をスピナー懸濁培養において伝播させるのを含むことができる。

【0076】

伝播した霊長類またはヒトの幹細胞は、前記の回数の継代後、霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性のうち少なくとも１つを保持することができる。霊長類またはヒトの幹細胞
の生物活性は、（ｉ）多分化能性マーカーの発現；（ｉｉ）細胞の生存率；（ｉｉｉ）正常な核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力からなる群から選択できる。霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性は、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群から選択される多分化能性マーカーの発現を含むことができる。

【0077】

前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を１：６以上、１：１０以上、１：１５以上、１：２０以上、または１：２６以上の分割比率（ｓｐｌｉｔ ｒａｔｉｏ）で継代するのを可能にすることができる。前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を２００万細胞／ｍｌ以上の体積生産量にまで伝播させることができる。

【0078】

前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を無血清培地または幹細胞用馴化培地中で伝播させることを含むことができる。
前記の方法は、さらに、霊長類またはヒトの幹細胞を粒子から分離する工程を含むことができる。

【0079】

本発明の他の観点として、分化した細胞を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、そして霊長類またはヒトの幹細胞を分化させることを含む。

【0080】

本発明者らは、本発明の他の観点により、胚様体を生成するための方法を提供し、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、そして霊長類またはヒトの幹細胞を培養して胚様体を形成させることを含む。

【0081】

本発明は、他の観点において、処置の必要な個体において疾患を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、本発明の前記の観点により分化した細胞を生成し、あるいは本発明の前記の観点により胚様体を形成し、そして霊長類またはヒトの幹細胞、分化した細胞、または胚様体を個体に投与することを含む。

【0082】

霊長類またはヒトの幹細胞は、霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞、霊長類もしくはヒトの成体幹細胞、または霊長類もしくはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を含むことができる。

【0083】

本発明の他の観点においては、それに幹細胞が付着した２以上の粒子を含む（それぞれ本発明のいずれかの観点による）集合体が提供される。
本発明の他の観点により、本発明者らは、本発明の観点による粒子または本発明の上記の観点による集合体を含む、細胞培養物を提供する。

【0084】

本発明者らは、本発明の他の観点により、本発明の観点による粒子または本発明の前記の観点による集合体を細胞培養培地と共に含む、容器を提供する。
本発明の他の観点によれば、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させるためのデバイスが提供され、このデバイスは、本発明の観点による粒子または本発明の前記の観点による集合体を含む。

【0085】

前記の容器またはデバイスはバイオリアクターであってもよい。
本発明の他の観点として、本発明者らは、本発明の前記の観点による方法により伝播させた霊長類またはヒトの幹細胞、本発明の前記の観点による方法により生成した分化した細胞、または本発明の前記の観点による方法により生成した胚様体を提供する。

【0086】

本発明の他の観点によれば、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播および／または分化させるための粒子の使用が提供され、この粒子はＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される。

【0087】

本発明の１観点によれば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイクロキャリアは
（ａ）最長寸法が２５０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティングでコートされている。

【0088】

マイクロキャリアに付与されるマトリックスコーティングは、場合によりＭａｔｒｉｇｅｌおよび／またはヒアルロン酸からなることができる。
ある好ましい態様において、マイクロキャリアは実質的に球形の形状であり、９０μｍ〜１０μｍ、より好ましくは８０μｍ〜４０μｍ、または７０μｍ〜５０μｍの直径をもつ。ある態様において、マイクロキャリアは実質的に球形の形状であり、約６５μｍの直径をもつ。

【0089】

他の好ましい態様において、マイクロキャリアはロッド形である。好ましくは、ロッド形のマイクロキャリアは２０００μｍ〜２０μｍの最長寸法をもつ。好ましい態様において、マイクロキャリアは、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、またはコラーゲンのうち１以上から構成される。特に好ましい態様において、マイクロキャリアはセルロース、デキストランまたはポリスチレンマイクロキャリアである。好ましいマイクロキャリアは、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）；Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＤＥ−５２、ＤＥ−５３、ＱＡ−５２、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、Ｈｉｌｌｅｘ、Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩから選択される。ある態様において、マクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、たとえばプロタミンまたはポリリジンで誘導体化されて、陽電荷を生じてもよい。

【0090】

ある態様では、継代の前に、工程（ｉｉ）においてｈＥＳＣを集密状態またはほぼ集密状態にまで拡張させる。ｈＥＳＣを各工程（ｉｉ）において、または前記方法全体において拡張させて、これによりｈＥＳＣの集団を、継代前に、工程（ｉ）でマイクロキャリアに付着させたｈＥＳＣの数より少なくとも０．２、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．８、または少なくとも１桁のいずれかで多くなるようにすることができる。ｈＥＳＣを各工程（ｉｉ）において、または前記方法全体において拡張させて、これによりｈＥＳＣの集団を、継代前に、工程（ｉ）でマイクロキャリア
に付着させたｈＥＳＣの数より少なくとも２、３、４、５、１０または２０倍のいずれかで多くなるようにすることができる。

【0091】

工程（ｉｖ）において、好ましくは工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する。

【0092】

前記の方法において、拡張したヒト胚性幹細胞の有意割合が多分化能性であろう。好ましい態様においては、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％のｈＥＳＣが多分化能性である。

【0093】

多分化能性は、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべての発現を検出することにより測定できる。好ましい態様においては、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％のｈＥＳＣが、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する。

【0094】

ある態様において、本方法は、培養物から得られる細胞総数において培養開始時の細胞数と比較してｌｏｇ^１０の差を達成するのに十分な継代を継続することができる。
ある態様においては、ヒト胚性幹細胞をフィーダー細胞と共培養することができる。フィーダー細胞は培養物に添加するマイクロキャリアに付着させることができる。これらのマイクロキャリアは、本明細書に記載するように、場合によりマトリックスコーティング中にコートされていてもよい。あるいは、コートされていないマイクロキャリアにフィーダー細胞を付着させてもよい。ある態様においては、フィーダー細胞と幹細胞を同一マイクロキャリア（１以上）に接種することができる。

【0095】

好ましくは、ヒト胚性幹細胞数の拡張は、実質的にあらゆる継代間で起きる；たとえば、ヒト胚性幹細胞の数は少なくとも７０％の継代間で、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％の継代間で増加する。

【0096】

本発明による方法は、別の培養システム、たとえば２Ｄ培養への継代またはそれからの継代を含むことができる。培養システム間での移植を容易にするために、細胞をたとえば凍結して保存し、そして融解することができる。

【0097】

ある態様においては、ヒト胚性幹細胞を、限られた期間、他の粒子／表面で培養することができる。たとえば、工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からのヒト胚性幹細胞を、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）について２Ｄ培養において培養した後、マトリックスコートしたマイクロキャリア上での培養に戻すことができる。同様な例で、工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からのヒト胚性幹細胞を、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）についてマトリックスコートしていないマイクロキャリア上で培養した後、マトリックスコートしたマイクロキャリア上での培養に戻すことができる。

【0098】

ある態様においては、ヒト胚性幹細胞を前記の培養法から取り出して、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）について別の培養システムで維持した後、本発明による懸濁培養に戻すことができる。

【0099】

他の態様においては、ヒト胚性幹細胞を前記の培養法から取り出し、保存（たとえば凍結細胞として）した後、本発明による懸濁培養に戻すことができる。
そのような態様において、本発明による懸濁培養に戻すのは同一培養に戻すことを必要としない。本発明による懸濁培養は、たとえば細胞の凍結および／または移植の後に、異なる場所で継続することすらできる。

【0100】

したがって、本発明の他の観点においては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイクロキャリアは
（ａ）最長寸法が２５０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、その際、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティング中にコートされている。

【0101】

好ましくは、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティング中にコートされている。

【0102】

本発明による方法は、細胞培養物の連続的または間欠的な撹拌、たとえば約５から約２００ｒｐｍまで、約５から約１５０ｒｐｍまで、約５から約１００ｒｐｍまで、約３０ｒｐｍ以上、約５０ｒｐｍ以上、または約１００ｒｐｍ以上の撹拌を含むことができる。あるいは、本発明方法は静止培養を含むことができる。

【0103】

ある態様においては、細胞の分化を誘導するために撹拌速度または撹拌量の増大を採用でき、これに対し、より低い撹拌速度または撹拌量を採用して、有意の分化を誘導することなく多分化能性または多能性の細胞集団を拡張させることができる。

【0104】

有意の分化を誘導することなく多分化能性または多能性の細胞集団を培養するためには、培養物を約５ｒｐｍから約１００ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約５０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約４０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約３０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約２５ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約２０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約１５ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約１０ｒｐｍまでで撹拌することができる。

【0105】

有意の分化を誘導するするためには、培養物を約２５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、たとえば約３０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約３５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約４０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまた
はそれ以上、約４５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約５０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約７５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約１００ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上で撹拌することができる。

【0106】

細胞の有意の分化には、培養物中の少なくとも約１０％の細胞が分化している状態を含めることができる。あるいは、これは培養物中の約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のうち少なくともいずれかの細胞が分化している状態であってもよい。

【0107】

したがって、本発明方法は、細胞をそれらの多分化能性または多能性状態を維持したまま培養するために、方法の第１部を第１の速度または量で撹拌して実施し、続いて培養物中の細胞を分化させるために、第２の速度または量で撹拌して細胞を培養する第２部を実施することを含むことができる。第１の速度または量は、好ましくは第２の速度または量より小さい。したがって、本発明方法の第１部は多分化能性または多能性の細胞集団を拡張させることができ、本発明方法の第２部はそれらの細胞の一部または全部が内胚葉、外胚葉および中胚葉の系列へ分化するプロセスを開始することができる。

【0108】

伝播したヒト胚性幹細胞は、好ましくは前記の継代回数の後、ヒト胚性幹細胞の少なくとも１つの生物活性を保持する。この生物活性は、（ｉ）多分化能性マーカーの発現；（ｉｉ）細胞生存率；（ｉｉｉ）正常な核型；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力からなる群から選択できる。生物活性は、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群から選択される多分化能性マーカーの発現を含むことができる。

【0109】

本発明による方法は、好ましくはヒト胚性幹細胞を１：６以上、１：１０以上、１：１５以上、１：２０以上、または１：２６以上の分割比率で継代することを可能にする。
本発明による方法は、好ましくはヒト胚性幹細胞を２００万細胞／ｍｌ以上の体積生産量にまで伝播させることができる。

【0110】

本発明による方法は、さらに、ヒト胚性幹細胞を粒子から分離する工程を含むことができる。
分化した細胞を生成するための方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、続いてヒト胚性幹細胞を分化させることを含む。

【0111】

胚様体を生成するための方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、そしてヒト胚性幹細胞を培養して胚様体を生成させることを含む。
処置の必要な個体において疾患を処置する方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、分化した細胞または胚様体を生成し、そしてヒト胚性幹細胞、分化した細胞、または胚様体を個体に投与することを含む。

【0112】

本発明の実施には、別途指示しない限り、一般的な化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の技術が採用され、それらは当業者がなしうる範囲内である。そのような技術は文献中に説明されている。たとえば下記を参照：J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,
Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA
Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,
Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3。これらの全般的テキストそれぞれを本明細書に援用する。

【0113】

本発明には、前記の観点および好ましい特徴の組合わせが含まれる；ただし、そのような組合わせが明らかに許容できない場合または殊に避けるべきである場合を除く。
本明細書中で用いるセクション表題は組織化のためのものにすぎず、記載する主題を限定するものと解すべきではない。

【0114】

本発明の観点および態様を、たとえば添付の図面を参照して以下に説明する。他の観点および態様は当業者に明らかであろう。本明細書に述べるすべての文献およびテキストを本明細書に援用する。

【0115】

本発明の原理を説明する態様および実験を、添付の図面を参照して以下に述べる：

【図面の簡単な説明】

【0116】

【図1A】図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ａは、セルロースマイクロキャリアを示す。

【図1B】図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｂは、東ソー（親水性）マイクロキャリアを示す。

【図1C】図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｃは、ミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを示す。

【図1D】図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｄは、マクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを示す。

【図2】図２は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。コロニー２Ｄ培養物を機械的解離または酵素解離によりマイクロキャリアへ移植し、そして両方法によりマイクロキャリア培養物をマイクロキャリアへ継代するワークフロー。

【図3】図３は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。マイクロキャリア培養物を元の２Ｄコロニー培養へ移植し、またマイクロキャリア培養物を連続継代し、続いて培養物を細胞数、生存率、多分化能性マーカーのフローサイトメトリー、組織学、核型、胚様体およびテラトーマ形成により特性分析するワークフロー。

【図4】図４は、本明細書に記載するマイクロキャリアがｈＥＳＣ培養物の凍結を支持しうることを示す。２ＤコロニーｈＥＳＣを凍結し、そして培養のためにマイクロキャリア上へｈＥＳＣを直接融解するワークフロー。マイクロキャリア培養物を再び凍結、融解および伝播させることもできる。

【図5】図５は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地および規定培地における成長速度および代謝を示す。馴化培地、ならびに２種類の市販の無血清培地ＳｔｅｍＰｒｏおよびｍＴｅＳＲ−１中で培養したマイクロキャリアの成長速度、グルコース、グルタミン、ラクテート、アンモニア、アミノ酸の代謝、およびｐＨの測定。

【図6A】図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ａは、機械的解離後の多分化能性マーカーの保持を示す：細胞を１００および５００ミクロンのメッシュに通し、そしてマイクロキャリアに接種。ｈＥＳＣを１００ミクロンのメッシュに通した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図6B】図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｂは、マイクロキャリア上の細胞をピペッティングにより機械的に分断し、続いて１：１０希釈して新たなマイクロキャリアに接種した後の多分化能性マーカーの保持を示す。ｈＥＳＣをピペッティングに続いて１：１０希釈してマイクロキャリア上へ付与した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図6C】図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｃは、対照の２Ｄコロニー培養を示す。

【図6D】図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｄは、酵素解離後の多分化能性マーカーの保持を示す：ＴｒｙｐＬＥ処理したｈＥＳＣをマイクロキャリア上に接種する。７日目に求めた細胞数＝４．３Ｅ６細胞／ウェル。

【図7A】図７は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。２ＤコロニーのｈＥＳＣの７日目の培養物をｔｒｙｐＬＥ処理した後のものをマイクロキャリア培養物と対比。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図７Ａ．２Ｄコロニー培養物中およびマイクロキャリア上のｈＥＳＣの写真；０．８×および５×の倍率。

【図7B】図７は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。２ＤコロニーのｈＥＳＣの７日目の培養物をｔｒｙｐＬＥ処理した後のものをマイクロキャリア培養物と対比。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図７Ｂ．マイクロキャリア上の１および６日目のｈＥＳＣ；０．８×および５×の倍率。

【図8A】図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ａ．継代５の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図8B】図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｂ．継代９の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図8C】図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｃおよび図８Ｄは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上での継代４および６におけるｈＥＳＣの安定なＦＡＣＳを示す。核数は７００〜８００万／ウェルの範囲である。図８Ｃ．継代４の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図8D】図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｃおよび図８Ｄは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上での継代４および６におけるｈＥＳＣの安定なＦＡＣＳを示す。核数は７００〜８００万／ウェルの範囲である。図８Ｄ．継代６の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図８Ｅ．対照２Ｄコロニー培養における多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。核数は一般に２００〜４００万／ウェルにすぎない。

【図9】図９は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。馴化培地およびＫＯ培地におけるマイクロキャリア培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析。ｈＥＳＣセルロースマイクロキャリア培養物の組織学的分析；継代３におけるＨＥＳ−３。列１：機械的解離、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。列２：ｔｒｙｐＬＥ酵素収穫、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。列３：そのままの（ｎａｔｉｖｅ）マイクロキャリア、ＣＭ懸濁液中、１００ｒｐｍ。列４：そのままのマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。

【図10A】図１０は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｈＥＳＣをマイクロキャリアからｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍ組織培養ペトリ皿へ再播種（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）；Ｐ５からＰ６へ。核数＝２０００万細胞／プレート。図１０Ａ．マイクロキャリア培養を６ｃｍペトリ皿上へ再播種した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図10B】図１０は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｈＥＳＣをマイクロキャリアからｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍ組織培養ペトリ皿へ再播種（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）；Ｐ５からＰ６へ。核数＝２０００万細胞／プレート。図１０Ｂ．再播種したｈＥＳＣの写真；０．８×および５×の倍率。

【図11A】図１１は、ｈＥＳＣ培養物の凍結を示す。図１１Ａ．凍結ｈＥＳＣコロニーをマイクロキャリア上へ直接融解した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。７日目の核数＝４．２×１０Ｅ６細胞／ウェル、６ウェルプレート。

【図11B】図１１は、ｈＥＳＣ培養物の凍結を示す。図１１Ｂ．凍結、融解、およびそれらの各細胞数で培養した後のマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。１４日目の核数＝７．１４×１０^６細胞／ウェル。注釈：融解後の細胞死のため細胞をより長期間にわたって培養した。細胞は経時的に正常な成長速度を回復した。

【図12】図１２は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ成長速度の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ成長速度、およびそれらの関連ｐＨプロフィール。接種密度０．６７×１０Ｅ６細胞／ウェル（培地５ｍｌ中に２０ｍｇ／ｍｌのマイクロキャリア）。

【図13】図１３は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。

【図14】図１４は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。

【図15】図１５は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。２Ｄコロニー培養からとマイクロキャリア培養からの接種を比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養対照上でのｈＥＳＣの成長速度およびそれらの関連ｐＨプロフィール。細胞数／ウェル：接種密度５×１０Ｅ５細胞／ウェル。マイクロキャリアについての細胞数の方が高い。分割比率１：１８。倍増時間：マイクロキャリア＝３３時間。２Ｄコロニー培養＝５８時間。ｐＨ測定：３条件すべてについて、５日目後にｐＨがより大きく低下。

【図16-1】図１６は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。

【図16-2】図１６は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。

【図17-1】図１７は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。

【図17-2】図１７は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。

【図18】図１８は、無血清規定培地における成長速度および代謝を示す。ＳｔｅｍＰｒｏ無血清培地（継代５）およびｍＴｅＳＲ−１（継代４）中でのマイクロキャリアにおけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図19】図１９は、キャリアのコーティングを示す。ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸。ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、馴化培地、ＫＯ培地およびｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたセルロースマイクロキャリアの７日目の細胞数。

【図20】図２０は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上のｈＥＳＣを１００ｒｐｍで撹拌したものを示す。１００ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの１および６日目の写真；０．８×および５×の倍率。

【図21A】図２１は、１００、１５０ｒｐｍにおける撹拌を示す。１００および１５０ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果。注釈：両実験ともマイクロキャリア上のｈＥＳＣから継代した。図２１Ａ．１００ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図21B】図２１は、１００、１５０ｒｐｍにおける撹拌を示す。１００および１５０ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果。注釈：両実験ともマイクロキャリア上のｈＥＳＣから継代した。図２１Ｂ．１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図22】図２２は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上のｈＥＳＣを１５０ｒｐｍで撹拌したものを示す。１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの１および６日目の写真；０．８×および５×の倍率。

【図23】図２３は１５０ｒｐｍで連続２週間撹拌した、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果を示す。１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの継代１および２における多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図24】図２４は、静止培養および１５０ｒｐｍ培養におけるマイクロキャリア上の継代２のＨＥＳ−２を示す。２Ｄコロニーおよび１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア培養からのｈＥＳＣ（ＨＥＳ−２細胞系）の継代２における多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図25】図２５は、２Ｄコロニー培養−対−静止、１００ｒｐｍおよび１５０ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。連続７継代にわたる２Ｄコロニー、静止状態、１００ｒｐｍおよび１５０ｒｐｍでの撹拌におけるマイクロキャリアで培養したｈＥＳＣの細胞数。

【図26A】図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ａ．２Ｄコロニーで培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図26B】図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ｂ．マイクロキャリアにおいて静止状態で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図26C】図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ｃ．１００ｒｐｍで培養および撹拌したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ；継代５。

【図27】図２７は、キャリアの電荷を示す−ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｑ５３。図２７Ａ．セルロースマイクロキャリアＤＥ５２で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図２７Ｂ．セルロースマイクロキャリアＤＥ５３で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図２７Ｃ．セルロースマイクロキャリアＱＡ５２で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ；継代３。

【図28】図２８は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。カーボンｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０で染色した、５日目のカーボンマイクロキャリア上のマイクロキャリア培養物の組織学的分析。ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０で染色した、７日目のカーボンマイクロキャリア上のマイクロキャリア培養物の組織学的分析。

【図29】図２９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。異なるコーティングをもつミクロ多孔質カーボン（ＳＨ１０１０）マイクロキャリア上でのＨＥＳ３の増殖を、２４ウェルプレート内で対照と比較。コートしていないＳＨ１０１０ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上、フィブロネクチンまたはｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたものにおけるｈＥＳＣの成長速度を、２Ｄコロニー対照と比較。

【図30】図３０は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：３日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートしたマイクロキャリア上、３日目。

【図31】図３１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：５日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンコートしたマイクロキャリア上、５日目。

【図32】図３２は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：７日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンコートしたマイクロキャリア上、７日目。

【図33】図３３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。７日目のＦｎコートしたカーボンビーズと対照の間のＯｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−４発現レベルのＦＡＣＳ分析および比較。２Ｄコロニー対照およびフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図34A】図３４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。Ｆｎコートしたカーボンビーズ−対−対照におけるＯｃｔ−４ ＧＦＰ ＨＥＳ２。図３４Ａ．２Ｄコロニー対照およびフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長。生存率＞９５％。

【図34B】図３４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。Ｆｎコートしたカーボンビーズ−対−対照におけるＯｃｔ−４ ＧＦＰ ＨＥＳ２。図３４Ｂ．両条件における多分化能性マーカーＯｃｔ−４のＦＡＣＳ。

【図35】図３５は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＳＨ１０１０およびＳＭ１０１０マイクロキャリア対−２Ｄコロニー対照（ＯＣＤ）の比較。２Ｄコロニー対照ならびにフィブロネクチンコートしたマクロ多孔質（ＳＨ１０１０）およびミクロ多孔質（ＳＭ１０１０）カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長。

【図36-1】図３６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図36-2】図３６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図37】図３７は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＤＡＰＩ、ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）およびＴＲＡ−１−６０で染色したマクロ多孔質およびミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上のｈＥＳＣ培養物の組織学的分析。

【図38】図３８は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１５日目のマイクロキャリア培養物。ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上での１５日間にわたるｈＥＳＣの成長を７日間にわたる２Ｄコロニー対照と比較。

【図39-1】図３９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で１５日間にわたって培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図39-2】図３９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で１５日間にわたって培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図40】図４０は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。馴化培地の供給を増加。２倍体積−対−１倍体積を供給したカーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長を２Ｄコロニー対照と比較。

【図41-1】図４１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で２倍体積を供給して培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図41-2】図４１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で２倍体積を供給して培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図42】図４２は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＤＡＰＩ、ファロイジンおよびＴＲＡ−１−６０で染色したマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の組織学的分析。

【図43A】図４３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたＨＥＳ２ ＧＦＰ細胞系を２Ｄコロニー対照と対比。図４３Ａおよび４３Ｂ．マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたもうひとつの細胞系（ＨＥＳ−２）についての二重実験を２Ｄコロニー対照と対比。

【図43B】図４３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたＨＥＳ２ ＧＦＰ細胞系を２Ｄコロニー対照と対比。図４３Ａおよび４３Ｂ．マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたもうひとつの細胞系（ＨＥＳ−２）についての二重実験を２Ｄコロニー対照と対比。

【図44-1】図４４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したＨＥＳ−２細胞系の７日後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図44-2】図４４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したＨＥＳ−２細胞系の７日後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図45】図４５は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。２日毎に蛍光顕微鏡下でイメージを撮影；４×の倍率。画像は、マイクロキャリア上で培養したＧＦＰ細胞が１日目から７日目まで成長したことを示す。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で７日間にわたって成長している蛍光ＨＥＳ−２ ＧＦＰ細胞系の写真。

【図46A】図４６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１ｍｍのマクロ多孔質ビーズを２Ｄ対照と対比。培養を１２日目まで延長すると、細胞密度が１．２×１０ｅ６細胞にまで増大した。図４６Ａ．静止、高速混合（３０分毎）および低速混合（２時間毎）したｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートしたカーボンマイクロキャリア上に接種した後のｈＥＳＣの成長を、ｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートした２Ｄコロニー対照と対比。Ｈｉｇｈ ｍｉｘ（高速混合）−３０分毎。Ｌｏｗ ｍｉｘ（２時間毎）−２時間毎。接種中の混合は、１ｍｍビーズ上での細胞成長を低下させない。これらの条件下での多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図46B】図４６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１ｍｍのマクロ多孔質ビーズを２Ｄ対照と対比。培養を１２日目まで延長すると、細胞密度が１．２×１０ｅ６細胞にまで増大した。図４６Ｂ．多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現は安定している。

【図47A】図４７は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４７Ａ．Ｃｙｔｏｄｅｘ上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの写真。

【図47B】図４７は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４７Ｂ．ポリリジンコートした東ソー上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの写真。

【図48A】図４８は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４８Ａ．Ｃｙｔｏｄｅｘ上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養物の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図48B】図４８は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４８Ｂ．ポリリジンコートした東ソー上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。

【図49】図４９は、スピナー培養を示す。マイクロキャリア上での５０ｍｌスピナー培養におけるｈＥＳＣの指数成長プロフィールを、静止マイクロキャリア培養および２Ｄコロニー培養と比較。

【図50】図５０は、継代６における核型が正常である特性分析データを示す。セルロースマイクロキャリア上で６回連続継代した後（２４細胞倍増と同等）のＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３細胞系の核型は正常。

【図51】図５１は、セルロースマイクロキャリア上と２Ｄコロニー培養とのｈＥＳＣ成長の比較を示す。

【図52】図５２は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３キャリア上でのｈＥＳＣ培養の継代１５および１６におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図53】図５３は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３キャリア上でのｈＥＳＣ培養の継代２１〜２３における、および継代２３を２Ｄコロニー培養へ再播種した後の、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図54】図５４は、ＨＥＳ−３のマイクロキャリア培養が継代２２および２５に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。

【図55】図５５は、ＨＥＳ−２のマイクロキャリア培養が継代１４に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。

【図56】図５６は、継代３および２７におけるマイクロキャリア培養からのｈＥＳＣが胚様体に分化しており、内胚葉（アミラーゼおよびＧＡＴＡ６）、外胚葉（ケラチンおよびニューロフィラメントＮＦ）および中胚葉（ＭＳＸ１およびＨＡＮＤ１）の遺伝子により表わされる３胚葉の細胞を形成できたことを示す。

【図57】図５７（Ａ〜Ｃ）は、図５６からの３胚葉の細胞についてテラトーマが形成されたことを示す。

【図58】図５８は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長を示す；ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ培地。

【図59】図５９は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの倍増時間の比較を示す；ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ培地。

【図60】図６０は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）における代謝の比較を示す。

【図61】図６１は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）における代謝の比較を示す。

【図62】図６２は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）におけるイオンおよびオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）の比較を示す。

【図63】図６３は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）におけるアミノ酸分析を示す。

【図64】図６４は、下記を示す：（ａ）ｍＴｅＳＲ１中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてのアミノ酸消費率；（ｂ）ＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてのアミノ酸消費率。

【図65】図６５は、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてｐＨおよび細胞総数を示す。

【図66】図６６は、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養について成長速度を示す。

【図67】図６７は、ＨＥＳ−３細胞の成長を示す。静止マイクロキャリア培養、２０ｒｐｍ撹拌での５０ｍｌスピナーフラスコ、単層培養、および２５ｒｐｍ撹拌での５０ｍｌスピナーフラスコの比較。

【図68】図６８は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からの馴化培地の代謝産物分析を示す。

【図69】図６９は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からの馴化培地中における代謝産物の比産生率を示す。

【図70】図７０は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からのｐＨおよびオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）状態を示す。

【図71】図７１は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０は、３および４日目に高い状態を保持している。

【図72】図７２は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるｈＥＳＣの形態が、４および５日目にマイクロキャリア上で緻密な集合体のままであることを示す。

【図73】図７３は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるＨＥＳ−２の成長を示す。

【図74】図７４は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、スピナー培養の開始時に２Ｄコロニー対照と同等であったことを示す。

【図75】図７５は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、ピーク細胞密度に達した５および７日目に高い状態を維持しており、対照静止培養と同等であったことを示す。

【図76】図７６は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるｈＥＳＣが、５および７日目にマイクロキャリアの周りに大きな細胞集合体を形成していることを示す。

【図77】図７７は、１００ｍｌのスピナーフラスコにおける３５０万細胞／ｍｌの密度が、それぞれ２００万細胞／ｍｌを含む臓器培養皿（ＯＣＤ）１７５個でｈＥＳＣを生成するのと同等であることを示す。

【図78】図７８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ上のマウスフィーダー、およびフィーダーでコートしたポリリジンコートした東ソー・ビーズを、セルロースＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣと一緒に共培養して成長した、セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣを示す。

【図79】図７９は、ｈＥＳＣと、それぞれＣｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダー細胞との３種類の共培養物について、継代１におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を示す。

【図80】図８０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上との３種類の異なる共培養物において、継代２におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現を示す；これらはｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアを用いた対照と同等またはより良好である（図７９を参照）。

【図81】図８１は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣからのＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図82】図８２は、東ソー・マイクロキャリア（１０μｍおよび６５μｍ）上での継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；４ｍｇプロタミン（１０μｍ）、０．２ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１０μｍ）、４ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１０μｍ）、４ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（６５μｍ）を含む。

【図83】図８３は、ポリリジン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度。

【図84】図８４は、プロタミン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度のもの。

【図85】図８５は、ポリリジンコートおよびプロタミンコートした両方の東ソー・ビーズ（６５ミクロン）の細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、４継代について。

【図86】図８６は、ポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、継代１。

【図87】図８７は、プロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、継代１。

【図88】図８８は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、継代２における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図89】図８９は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代２における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図90】図９０は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代３における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図91】図９１は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代３における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図92】図９２は、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートした大型ポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で、継代４のｈＥＳＣが未分化集合体を形成し続けることを示す。

【図93】図９３は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジンおよびプロタミン−マイクロキャリア上での、継代４におけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示す。

【図94】図９４は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングをもつポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で５継代成長させたｈＥＳＣの安定な細胞数を示す。

【図95】図９５は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上での、継代５におけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示す。

【図96】図９６は、ポリリジンおよびプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上の、継代５におけるｈＥＳＣ集合体を示す。

【図97】図９７は、マイクロキャリア濃度を１００万細胞当たり４８，０００ビーズに最適化すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリアについて多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が継代６と７の間でより高いレベルに回復したことを示す。

【図98】図９８は、マイクロキャリア濃度を１００万細胞当たり４８，０００ビーズに最適化すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリアについて多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が継代６と７の間でより高いレベルに回復したことを示す。

【図99】図９９は、継代５まで、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアは撹拌（１００および１２０ｒｐｍの両方）および非撹拌の両方の条件でｈＥＳＣの成長を可能にしたことを示す。

【図100】図１００は、継代７まで、撹拌しないｍａｔｒｉｇｅｌコートＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上でｈＥＳＣが生存し続け、継代９にまで成長したことを示す。

【図101】図１０１は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上をｈＥＳＣがほとんど覆っていないことを示す。

【図102】図１０２は、１００ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの大きなクラスターを示す。

【図103】図１０３は、撹拌しない条件におけるｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上のｈＥＳＣの集密成長を示す。

【図104】図１０４は、撹拌条件（１００ｒｐｍ）におけるｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上のｈＥＳＣの集密成長を示す。

【図105】図１０５は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上で、継代３により多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現がダウンレギュレーションされることを示す。

【図106】図１０６は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアについて、継代９においてすらＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が強く発現することを示す。

【図107】図１０７は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上で撹拌条件において成長したｈＥＳＣは、継代３により多分化能性マーカーがダウンレギュレーションされることを示す。

【図108】図１０８は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むＣｙｔｏｄｅｘ ３上で撹拌条件において成長したｈＥＳＣは、継代Ｐ３により多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。

【図109】図１０９は、継代１３により、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアが静止条件ではＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を強く発現するｈＥＳＣをなお支持することを示し、一方、フィブロネクチンおよびラミニンでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３は継代６において多分化能性マーカーの発現の低下を示した。

【図110】図１１０は、ｈＥＳＣの核型判定が、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３上において１１継代後に正常な４６ＸＸ核型を示したことを示す。

【図111】図１１１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １上で成長しているｈＥＳＣを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの。

【図112】図１１２は、Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリア上で成長しているｈＥＳＣを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの。

【図113】図１１３は、ＨｉｌｌｅｘおよびＣｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャリア上のｈＥＳＣの細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの、撹拌するものと撹拌しないもの、３つの継代後。

【図114】図１１４は、ＨｉｌｌｅｘおよびＣｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャリアの静止（撹拌しない）培養を継代９まで継代しうることを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。

【図115】図１１５は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣの平均細胞濃度および平均拡張倍率を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。

【図116】図１１６は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリアが、コートしていないマイクロキャリアより集密状態であることを示す。Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリアは、培地からのフェノールレッドで赤色に着色し続ける。

【図117】図１１７は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、ｈＥＳＣ多分化能性マーカー（Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４）の代表的なプロットを示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、継代６。

【図118】図１１８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、種々の継代における（２〜１０継代）３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４のＦＡＣＳ分析を示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。

【図119】図１１９は、継代１３において、ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＣｙｔｏｄｅｘ １上で培養したｈＥＳＣが３種類の多分化能性マーカーを発現することを示す。

【図120】図１２０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、ｈＥＳＣ核型が正常なことを示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、継代７。

【図121】図１２１は、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヒアルロン酸のコーティングを含むＤＥ５３セルロースマイクロキャリアのｈＥＳＣ培養物について、継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図122】図１２２は、ＫＯ培地のコーティングを含むｈＥＳＣ ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア培養物について、継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。

【図123】図１２３は、ヒアルロン酸（ＨＡ）＋ヘパリン塩（ＨＳ）で、およびフィブロネクチン＋ＨＳ＋ＨＡでコートした、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアを示す。

【図124】図１２４は、ヒアルロン酸（ＨＡ）で、およびフィブロネクチン＋ＨＡでコートした、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアを示す。

【図125】図１２５は、フィブロネクチン（ＦＮ）；フィブロネクチン＋ＨＳ＋ＨＡ；およびＨＡ＋ＨＳでコートしたＤＥ５３について、継代１によりＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。

【図126】図１２６は、ＨＡ＋ＦＮ；およびＨＡでコートしたＤＥ５３について、継代１によりＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。

【図127】図１２７は、ＨＳ、ＦＮ、ＨＳ、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの組合わせでコートしたＤＥ５３について、継代１〜３における細胞数を示す。

【図128】図１２８は、セルロースＤＥ−５３マイクロキャリア上にコートしたＥＣＭとＨＡの種々の組合わせについて、ｈＥＳＣの形態を示す。

【図129】図１２９は、セルロースＤＥ−５３マイクロキャリア上にコートしたＥＣＭとＨＳの種々の組合わせについて、ｈＥＳＣの形態を示す。

【図130】図１３０は、ＨＡコートしたＤＥ−５３およびＨＳコートしたＤＥ−５３上のｈＥＳＣの形態を示す。

【図131】図１３１は、ＨＡとＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンとの組合わせを含むマイクロキャリア上のｈＥＳＣの形態が、他のＥＣＭ組合わせと比較して緻密な細胞集合体を形成することを示す。

【図132】図１３２は、ＨＡ＋ＣＯＬ１＋ＦＮおよびＨＡ＋ＣＯＬ４＋ＦＮのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。

【図133】図１３３は、ＨＡ＋ＣＯＬ１＋ＦＮ＋ＬＭおよびＨＡ＋ＣＯＬ４＋ＦＮ＋ＬＭのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。

【図134】図１３４は、ＨＳ＋ＣＯＬ１＋ＦＮおよびＨＳ＋ＣＯＬ４＋ＦＮのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。

【図135】図１３５は、ＨＳ＋ＣＯＬ１＋ＦＮ＋ＬＭおよびＨＳ＋ＣＯＬ４＋ＦＮ＋ＬＭのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。

【図136】図１３６は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で活発なｈＥＳＣ成長が継続することを示す。

【図137】図１３７は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現が継続することを示す。

【図138】図１３８は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で、継代８および９においてＴＲＡ−１−６０の高い発現が継続することを示す。

【図139】図１３９は、ＨＡコートしたＤＥ−５３セルロースマイクロキャリア上で継代６において成長した緻密なｈＥＳＣ集合体の形態を示す；２つの異なる倍率。

【図140】図１４０は、ｈＥＳＣ懸濁培養に適したマイクロキャリアの模式図を示す。

【図141】図１４１、表１は、ＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ培地中でｈＥＳＣにより消費および産生されたアミノ酸を示す。

【図142】図１４２、表２は、ＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中でｈＥＳＣにより消費および産生されたアミノ酸の個々のレベルに関する詳細な情報を示す。

【図143】図１４３、表３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３および東ソー・球形マイクロキャリア上のフィーダー細胞との共培養、ならびにロッド形セルロースＤＥ５３マイクロキャリア上との共培養における、継代０および継代１におけるｈＥＳＣの細胞密度を示す。

【図144】図１４４、表４は、３種類の共培養物中のｈＥＳＣの細胞数が、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上の対照と比較して約２倍高いことを示す。

【図145】図１４５、表５は、小型（１０ミクロン）および大型（６５ミクロン）両方の東ソー・マイクロキャリアが、継代０および継代１においてｈＥＳＣの成長を支持したことを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。

【図146】図１４６、表６は、ポリリジンおよびプロタミンコートした両方の東ソー・ビーズ（６５ミクロン）の細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、４継代について。

【図147】図１４７、表７は、成長したｈＥＳＣの細胞数がＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で比較的安定であることを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたものとｍａｔｒｉｇｅｌを含まないもの、非撹拌条件および撹拌条件で３継代培養。

【図148】図１４８、表８は、セルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣの７日後の細胞数を示す；コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパリン（ＨＳ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）の種々のコーティングを含む；それらの最初の原液濃度から１：１０〜１：８０希釈；ＫＯ培地および馴化培地（ＣＭ）のコーティングを用いて成長した対照と比較；継代Ｐ０。

【図149】図１４９、表９は、継代Ｐ１において、ｈＥＳＣの細胞数がＣＳ、ＨＳおよびＨＡコートしたセルロースマイクロキャリアについて１００万／ウェルより多く、ＫＯ培地のコーティングを含む対照と類似することを示す。

【図150】図１５０、表１０は、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアについて、継代０および１における細胞数を示す；フィブロネクチン（ＦＮ）；ヒアルロン酸（ＨＡ）＋ヘパリンナトリウム塩（ＨＳ）＋ＦＮ；ＨＡ＋ＨＳ；ＨＳ＋ＦＮ；およびＨＡ中にコートしたもの。

【図151】図１５１、表１１は、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアについて、継代１、２および３における細胞数を示す；ＨＡ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ；ＨＡ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ；ＨＡ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＡ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＳ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ；ＨＳ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ；ＨＳ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＳ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ＋ＬＭ中にコートしたもの。

【図152】図１５２は、（左から右へ）１００ミクロンのフィルター、機械的ピペッティング、ＴｒｙｐＬＥ酵素消化を用いた継代後の、および２Ｄコロニー対照の、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャートである。

【図153】図１５３は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの連続継代を示す。９週間にわたる静止マイクロキャリア培養におけるｈＥＳＣの細胞密度を示すグラフ、および継代９におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャート。

【図154】図１５４は、マイクロキャリアおよび２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの細胞濃度を示すグラフである。

【図155】図１５５は、マイクロキャリアおよび２Ｄコロニー培養について、グルコースおよびグルタミンの比消費率、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率を示すチャートである。

【図156】図１５６は、２種類の規定培地（ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ）中でのマイクロキャリア培養に際してのｈＥＳＣの総数を示すチャートである。

【図157】図１５７は、規定培地（ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ）中でマイクロキャリア上において培養したｈＥＳＣからのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャートである。

【図158】図１５８は、東ソー・マイクロキャリア上で培養した場合の、ｈＥＳＣの成長および継代、ならびにｈＥＳＣからのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す、顕微鏡写真およびチャートである。

【図159】図１５９は、２Ｄコロニー培養、静止マイクロキャリア培養および撹拌マイクロキャリア培養におけるｈＥＳＣの細胞濃度を示すチャートである。

【図160】図１６０は、（左から右へ）２Ｄコロニー培養、静止マイクロキャリア培養および撹拌マイクロキャリア培養におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現率パーセントを示すチャートである。

【図161】図１６１は、撹拌マイクロキャリア培養（スピナーフラスコ）、静止マイクロキャリア培養および２Ｄ単層培養において培養したｈＥＳＣについて細胞総数を示すチャートである。

【図162】図１６２は、セルロースマイクロキャリア上でのヒトｉＰＳ細胞の培養を示す顕微鏡写真である。

【図163】図１６３は、マイクロキャリア培養におけるヒトｉＰＳ細胞からのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現、ならびに３継代にわたるマイクロキャリア培養におけるヒトｉＰＳ細胞の成長を示す、チャートである。

【図164】図１６４は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上での１０継代にわたるヒトｉＰＳ細胞の成長の成功、継代１０におけるマイクロキャリア培養ｉＰＳ細胞からのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャート、ならびにＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上での１０継代後のｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。

【図165】図１６５は、分化実験に用いたマイクロキャリアおよび種々のコーティングを示す表である。

【図166】図１６６は、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンでコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上の細胞付着を、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたおよびコートしていないＤＥ５３マイクロキャリアならびに一般的なＥＢ培養と比較して示す顕微鏡写真である。

【図167】図１６７は、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチン中にコートしたＤＥ５３マイクロキャリア、ならびにプロタミンおよびプロタミン＋ラミニンでコートした東ソー ６５マイクロキャリアを用いた、心筋細胞分化実験における拍動面積のパーセントおよび総面積を示すチャートである。

【図168】図１６８は、ラミニンマイクロキャリア、ｍａｔｒｉｇｅｌマイクロキャリア、およびコートしていないマイクロキャリア上での心筋細胞分化実験における拍動性集合体の形成を示す顕微鏡写真である。

【図169】図１６９は、ラミニンマイクロキャリア、ｍａｔｒｉｇｅｌマイクロキャリア、およびコートしていないマイクロキャリア上での心筋細胞分化実験に際しての細胞の拡張を示すチャートである。

【図170】図１７０は、マイクロキャリア上での分化のための無血清培地ｂＳＦＳに添加した添加剤を示す表である。

【図171】図１７１は、コートしていないマイクロキャリア上で、ｂＳＦＳ培地中における添加剤の使用により心筋細胞の形成が増強したことを示すチャートである。

【図172】図１７２は、マイクロキャリアからマイクロキャリアへ接種したｈＥＳＣを用いるマイクロキャリア上での分化のための無血清培地ｂＳＦＳまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＳＢ２０３５８０に添加した添加剤を示す表である。

【図173】図１７３は、図１７２に記載した添加剤の存在下でマイクロキャリアからマイクロキャリアへ接種したｈＥＳＣからの心筋細胞形成が増強したことを示すチャートである。

【図174】図１７４は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で、図１７５に記載するマイクロキャリア濃度における、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を示すチャートである。

【図175】図１７５は、実施例４２．１に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された倍増時間を示す表である。

【図176】図１７６は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で、図１７７に記載する細胞接種濃度における、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を示すチャートである。

【図177】図１７７は、実施例４２．２に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された倍増時間を示す表である。

【図178】図１７８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上および単層対照培養におけるｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長の比較を示すチャートである。

【図179】図１７９は、実施例４２．３に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された細胞密度および倍増時間を示す表である。

【図180】図１８０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたるｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を、２種類の継代方法について示すチャートである（実施例４２．４を参照）。

【図181】図１８１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて達成された倍増時間を、２種類の継代方法について示すチャートである（実施例４２．４を参照）。

【図182】図１８２は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて、ＭＳＣマーカーＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関する１０日目のＦＡＣＳ分析を示す；マイクロキャリアの添加により継代した場合。

【図183】図１８３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて、ＭＳＣマーカーＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５に関する１０日目のＦＡＣＳ分析を示す；ｔｒｙｐＬＥ酵素を用いる脱着に続いてマイクロキャリアの添加により継代した場合。

【図184】図１８４は、ラミニンコーティング（１〜３マイクログラム／グラム（セルロースマイクロキャリア））が、フィブロネクチンコートしたマイクロキャリアまたはコートしていないマイクロキャリアと比較して、より良好な細胞付着、したがって増大した数の拍動性集合体をもたらすことを示す。

【図185】図１８５は、ラミニンコートしたＤＥ５３マイクロキャリア培養における種々の培地補充物の評価を示し、化学的に規定された脂質混合物、ビタミン溶液、およびＨｙＳｏｙ（ダイズ水解物）が有意に増大した数の拍動性胚様体または心筋細胞を生じることが示される。

【図186】図１８６は、２種類のヒトｉＰＳ細胞を無血清培地ｍＴｅＳＲ１中でセルロースマイクロキャリア上において２または３週間にわたって連続継代すると、細胞数の増加、ならびに多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびｍＡｂ８４の安定発現が示されることを示す。

【図187】図１８７は、管理された低グルコース供給実験で得られたｈＥＳＣの細胞密度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0117】

本発明の１以上の態様を、たとえば本発明者らが考える本発明の実施に最良の様式の具体的な詳細を含めて、以下に記載する記述中に述べる。これらの具体的な詳細に限定されることなく本発明を実施しうることは当業者に明らかであろう。

【0118】

懸濁培養におけるｈＥＳＣの長期安定伝播
本発明者らは、懸濁培養におけるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の長期安定伝播を今回証明した。特に、マイクロキャリアのＭａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸およびラミニンコーティングは、ｈＥＳＣが多分化能性を維持した状態で少なくとも継代５を超えて、一般に継代８、９または１０を超えて伝播されるのを可能にすることを本発明者らは証明する。こうして本発明者らは、２５連続継代を超えるマイクロキャリア懸濁培養を証明するのに今回成功し、培養された細胞を細胞密度の分析、生存率、多分化能性マーカーのＦＡＣＳ分析、組織学的分析、および核型により特性分析した。

【0119】

本発明者らは、最高２３継代後の成長速度、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４の発現、正常な核型、ならびに３胚葉に分化する能力の維持により測定して、ヒト胚性幹細胞の長期伝播のためのマイクロキャリア培養の安
定性を証明した。

【0120】

マイクロキャリア上のｈＥＳＣを無血清培地中での成長にも適応させ、それらのアミノ酸代謝率を測定した。さらに、マイクロキャリア培養をｈＥＳＣ系についてスピナーフラスコにまでスケールアップした。セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣと球形Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびセルロースマイクロキャリア上で増殖したフィーダー細胞との共培養も証明した。

【0121】

本発明者らは、５タイプのマイクロキャリア：ＤＥ５３セルロース、東ソー（１０および６５ミクロン）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３およびＨｉｌｌｅｘ（すべてｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたもの）がｈＥＳＣを長期培養において支持しうることを証明した。しかし、これらのマイクロキャリアは、マトリックスコーティングがなければ、多分化能性マーカーのダウンレギュレーションおよび細胞密度の低下なしに５継代または最良で１０継代を超えてｈＥＳＣを支持することはできない。

【0122】

胚性幹細胞の培養に必要なマイクロキャリアの特性を模式的にまとめたものを図１４０に示す。マイクロキャリアは、長さ２０〜２０００ミクロン、直径５〜５０ミクロンのロッドまたは円筒もしくはらせん様であってもよい。それらは５０〜２０００ミクロンの範囲の直径をもつ球形または卵様であってもよい。本発明のマイクロキャリアの組成は、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、ガラス、コラーゲン、ゼラチン、マクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄまたは他の材料であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもつか、またはコラーゲン／ゼラチン材料のものである。マイクロキャリアは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、たとえばｍａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、または他のＥＣＭでコートされてもよい。これらのＥＣＭは、それらに吸着された成長因子を含まなくてもよく、含んでもよい。

【0123】

特に、本発明者らは下記を証明するのに今回成功した：
１．ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの継代２３までの連続継代；
２．セルロースマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの特性分析（胚様体の核型判定、ＲＴ−ＰＣＲ、およびテラトーマ形成）；
３．アミノ酸代謝データ分析による、無血清培地でのｈＥＳＣ−セルロースマイクロキャリアの培養；
４．スピナーフラスコ内における２種類のｈＥＳＣ細胞系のセルロースマイクロキャリア培養；
５．球形またはロッド形マイクロキャリア上のフィーダー細胞とロッド形セルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣとの共培養；
６．Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む小型および大型球形マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣ培養；
７．Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む大型マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣ培養；
８．ｈＥＳＣ培養のためのセルロースマイクロキャリア上のヒアルロン酸コーティング。

【0124】

幹細胞の懸濁培養および継代
本発明者らは、霊長類およびヒトの幹細胞ならびにｉＰＳ細胞を粒子上で培養、伝播および継代するのが可能であることを今回証明した。特に、本発明者らは幹細胞を懸濁培養において連続成長させ、かつ継代しうることを示す。本発明者らは、マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の連続的で継代可能な三次元培養を証明する。

【0125】

本発明者らは、幹細胞を懸濁状態で伝播させる方法を記載する。この伝播方法は、幹細胞を成長（増殖）（ｇｒｏｗｉｎｇ）、伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）、拡張（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）または増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）させることを含むことができる。伝播させる幹細胞を、後記に述べるように１継代以上、継代することができる。そのような伝播は、特定の特性を備えたマイクロキャリアまたは粒子の使用により達成できる。これらのマイクロキャリアまたは粒子は、電荷をもつことができる。マイクロキャリアまたは粒子は、コーティングを含むことができる。他の特性には、サイズを含めることができる。

【0126】

幹細胞を伝播させる方法は、粒子を供給する工程を含むことができる。粒子は、それにコートされたマトリックスを含むことができ、かつ陽電荷をもつことができる。粒子は、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞の集合が可能なサイズをもつことができる。幹細胞を粒子に付着させる。異なる粒子上で成長している細胞を互いに接触させて、集合体を形成させる。この培養物を少なくとも１継代、継代する。幹細胞をキャリアに付着た状態で、またはそれらから脱着もしくは分離して使用することができる。それらは未分化もしくは多分化能性の状態または両方で使用でき、あるいは目的とする細胞タイプに分化させることができる。それらを用いて胚様体を形成することができる。

【0127】

粒子が連続成長を支持するためには、それらは霊長類またはヒトの幹細胞の寸法と適合するサイズをもたなければならない：たとえば１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍなど。この大きさのサイズをもつそのような粒子上での霊長類またはヒトの幹細胞の培養により、それらの上で成長している細胞が互いに集合し、連続成長を支持することが可能になるであろう。粒子の適切な組成、形状およびサイズを、後記にさらに詳細に記載する。

【0128】

実施例は、幹細胞培養物、たとえばヒト胚性幹細胞の２Ｄコロニー培養物をマイクロキャリア粒子上に接種し、１以上の継代を伴う数世代、連続成長させうることを示す。幹細胞をいずれかの手段、たとえば機械的解離もしくは酵素解離または両方法の組合わせで表面から離脱させることにより、継代することができる。

【0129】

マイクロキャリア粒子培養物を、粒子上で世代から世代へ成長させることができる。あるいは、またはさらに、その間に１以上の世代について培養物を一般的な２Ｄ培養において成長させることができる。マイクロキャリア上で成長しているヒト幹細胞を２Ｄコロニー培養に戻すことができ、その逆も可能である。

【0130】

本明細書に記載する方法により、幹細胞を最初は未分化の形態で効率的に伝播させる方法が得られる。それらは、機械的解離または酵素解離により分割比率１：２〜１：１０でマイクロキャリア培養物をマイクロキャリア上へ継代することを可能にする；この比率は一般的な２Ｄ培養について可能なものより高い。これによって、培養をより速やかにスケールアップして生物材料をより効率的に利用することができる。

【0131】

マイクロキャリア培養における細胞の体積収率は、２Ｄコロニー対照より普通は２〜４倍高い。本明細書に記載する方法により伝播させたヒト幹細胞の体積収率は、２００万細胞／ｍｌまたはそれ以上に及ぶ可能性がある。

【0132】

本明細書に記載する方法により、後記にさらに詳細に記載するように、ヒト幹細胞を粒子から粒子へ１０継代以上継代することが可能になる。
本明細書に記載する方法により、それらの多分化能性を保持した幹細胞を伝播させることが可能になる。実施例は、本明細書に記載する方法および組成物により伝播したヒト胚性幹細胞が幹細胞の１以上の生物学的特性を維持することを示す。たとえば、伝播した幹細胞は５継代について、２Ｄコロニー培養で成長した幹細胞と同等な多分化能性マーカー、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−４の発現を示し、正常な核型を保持し、かつインビトロ（胚様体）およびインビボ（テラトーマ）で分化して３胚葉になることができる。

【0133】

重要なことに、幹細胞をセルロースマイクロキャリア上に固定すると、より大規模なスピナーフラスコ内で連続継代することができる。
いかなる幹細胞も本明細書に記載する方法を用いて伝播させることができる。これらには、霊長類の幹細胞、たとえばサル、類人猿またはヒトの幹細胞を含めることができる。幹細胞には、胚性幹細胞または成体幹細胞を含めることができる。幹細胞には、誘導した多分化能性幹細胞を含めることができる。たとえば、幹細胞には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含めることができる。本明細書に記載する方法および組成物に使用するのに適切なこれらおよび他の幹細胞については後記にさらに詳細に記載する。

【0134】

本明細書に記載する方法および組成物は、既知の”２Ｄ”培養法に優る種々の利点をもつ。本発明の粒子は幹細胞の付着において、２Ｄコロニー培養支持体より効率的である。この理由その他のため、懸濁培養した細胞はより効率的に継代することができる。本明細書に記載する方法により、幹細胞を数サイクルにわたって凍結および融解することが可能になる。それらをマイクロキャリア上で直接凍結し、増殖培地（伝統的な平板培養であっても、または粒子状マイクロキャリア上であっても）上へ融解することができる。マイクロキャリア上で伝播させた幹細胞を、ＧＭＰ適応した無血清培地中で成長させることができる。

【0135】

本明細書に記載する方法により、幹細胞、たとえば胚性幹細胞を、未分化状態で培養および維持することが本質的に可能になる。伝播した幹細胞を培養状態で（たとえばマイクロキャリア上で）またはそれから脱着させて、部分的または全体的に分化させることができる。

【0136】

伝播した幹細胞を用いて、その後使用するために胚様体を形成することができる。マイクロキャリア上で成長している幹細胞を分化用培地へ移植するだけで、胚様体を直接形成することができる；これは、胚様体形成の前に細胞を２Ｄ成長表面から分離する追加工程を必要とする先行技術方法と対照的である。したがって、本明細書に記載する方法により、幹細胞を、成長している表面または支持体上で、それから分離することなく定方向分化させることが可能になる。

【0137】

本明細書に記載する方法および組成物によって、培養した幹細胞をより大きな体積に拡張およびスケールアップするのが可能になる。バイオリアクターまたは工業的規模へのスケールアップは、より生産性の高い幹細胞培養を可能にする。マイクロキャリア上で撹拌培養により幹細胞を成長させるのが可能であることは、培養を懸濁条件にまでスケールアップできることを意味する。制御されたバイオリアクター、たとえばＷａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒまたは撹拌培養を採用できる。これによって、現在の足場依存型の二次元コロニー培養の制約と比較して、細胞をより大きな体積で拡張させることが可能になる。数百リットルに及ぶバイオリアクター内での大規模懸濁培養が可能である。

【0138】

陽電荷
本発明の粒子またはマイクロキャリアは、たとえば中性ｐＨまたは生理学的関連ｐＨ、たとえばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で陽電荷をもつことができる。粒子はクロマトグラ
フィー樹脂、たとえばアニオン交換樹脂を含むことができる。

【0139】

陽電荷の量は重要ではあるが、きわめて重要というわけではなく、細胞が粒子に付着しうるのに十分な高さである限り、広範に及ぶことができる。たとえば、粒子がアミン、たとえば第四級または第三級アミンとのカップリングにより荷電した場合、粒子上の電荷は乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約０．５〜４ミリ当量、たとえば乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約１〜３．５ミリ当量、または乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約１〜２ミリ当量の小さなイオン交換容量に相当する可能性がある。

【0140】

陽電荷は、粒子のｐＫａが７より大きい（たとえば７．４より大きい、たとえば７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５またはそれ以上）ものであってもよい。

【0141】

たとえば、最高２０ｍｇ／粒子ｍＬの濃度の硫酸プロタミンまたはポリ−Ｌ−リジン塩酸塩にカップリングさせることにより粒子を誘導体化することができる。
理論により拘束されたくはないが、粒子上の陽電荷の存在により細胞がそれに付着するのが可能になると本発明者らは考える。

【0142】

本発明の粒子は、当技術分野で既知のいずれかの手段で陽電荷をもつことができる。粒子は陽電荷をもつ基を含むことができ、あるいは粒子がこれらをもつように誘導体化することができる。

【0143】

本発明の粒子は、ジエチルアミノエチル−セルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）またはその誘導体を含むことができる。ＤＥＡＥ−セルロースは、炭水化物のＣＨ_２ＯＨ基をイオン化性第三級アミン基に変換するように化学修飾された微粒状セルロースを含む。それは中性ｐＨで陽電荷をもつ。粒子は、Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズ、たとえばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを含むことができる。粒子は、共有架橋していてもよいアガロースビーズ、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（すなわちＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を含むことができる。粒子はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを含むことができる。ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌおよびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる。粒子はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含むことができる。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの荷電基は、力価測定できない陽電荷をもつ第四級アミンである。

【0144】

本発明の粒子は、陽電荷をもつように誘導体化されていてもよい。たとえば、粒子はそれに結合したアミン基を含むことができる。アミン基は第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基または第四級アミン基であってよい。粒子とアミン含有化合物のカップリングにより、アミン基を粒子に結合させることができる。カップリング方法は当技術分野で周知である。たとえば、臭化シアンを用いてアミンを粒子にカップリングさせることができる。

【0145】

架橋剤も使用できる。これらは、２つの同一反応基を含むホモ二官能性架橋剤、または２つの異なる反応基を含むヘテロ二官能性架橋剤に分類される。ヘテロ二官能性架橋剤は、重合を最小限に抑えた連続コンジュゲーションを可能にする。カップリングおよび架橋用の試薬は多数の製造業者から、たとえばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍまたはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得ることができる。

【0146】

粒子の反応性を高めるために、粒子をカップリング前に活性化することができる。クロロ酢酸を用いてコンパクトな粒子を活性化し、続いてＥＤＡＣ／ＮＨＳ−ＯＨを用いてカップリングを行なうことができる。ヘキサンジイソシアネートを用いて粒子を活性化して
、第一級アミノ基を付与することもできる。そのような活性化された粒子をいずれかのヘテロ二官能性架橋剤と組み合わせて用いることができる。ある態様においては、ジビニルスルホンを用いてコンパクトな粒子を活性化する。そのような活性化されたコンパクトな粒子は、たとえばペプチド上のアミノ基またはチオール基と反応しうる部分を含む。

【0147】

トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応しうる部分を付与することもできる。塩化シアンを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応しうる部分を付与することもできる。

【0148】

Ｃｙｔｏｄｅｘ １は、架橋デキストランマトリックスをベースとし、これが陽電荷をもつＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基で置換されている。この荷電基はマイクロキャリアマトリックス全体に分布している。

【0149】

荷電していない粒子
本発明の粒子またはマイクロキャリアは、荷電していなくてもよく、あるいはたとえば中性ｐＨまたは生理学的関連ｐＨ、たとえばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で電荷中性であってもよい。

【0150】

荷電していない粒子の例には、ゼラチンまたはコラーゲンの粒子が含まれる。たとえば、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３は架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングした変性コラーゲンの薄層からなる。

【0151】

マトリックスコーティング
本発明の粒子をマトリックスでコートすることができ、これを本明細書に関しては粒子に、たとえばその表面に、付着した物質の層（たとえば薄層またはフィルム）と言う。マトリックスは、細胞の成長を支持しうる生体適合性または生理学的関連性のマトリックスを含むことができる。それは細胞成長のための基質を含むことができる。

【0152】

前記のマトリックスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を含むことができる。ＥＣＭのいずれかの既知成分、たとえば幹細胞の成長を支持しうるものを使用できる。細胞外マトリックスの成分は当技術分野で既知であり、たとえばAlberts et al (2002), Molecular Biology of the Cell, Chapter IV、およびそれに引用された参考文献に記載され
ている。

【0153】

ＥＣＭ成分を常法により粒子に付着またはカップリングまたはコートすることができる。たとえば、前記のいずれかのカップリング試薬および架橋剤を用いてＥＣＭ成分を粒子にカップリングさせることができる。

【0154】

ＥＣＭ成分は、高分子、たとえば多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（通常はタンパク質にプロテオグリカンの形で共有結合した状態でみられる）、繊維状タンパク質：エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む、コラーゲン（たとえばＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン）などを含むことができる。

【0155】

マトリックスコーティングはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含むことができる。グリコサミノグリカンは、反復二糖単位からなる枝分かれしていない多糖鎖を含む。反復二糖中の２つの糖のうちの１つは常にアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）であり、これは大部分の場合、硫酸化されている。第２の糖は通常はウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）である。

【0156】

マトリックスコーティングは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれる）またはその誘導体を含むことができる。ヒアルロン酸は、多数の供給源のいずれかに由来するもの、たとえばウシのガラス体液に由来するものであってもよい。ヒアルロン酸の塩または塩基、たとえばヒアルロン酸ナトリウムを使用できる。これは連鎖球菌に由来するものであってもよい。

【0157】

マトリックスコーティングはラミニンを含むことができる。
マトリックスコーティングはフィブロネクチンを含むことができる。
マトリックスコーティングはビトロネクチンを含むことができる。

【0158】

マトリックスコーティングは、たとえばＧＡＧ、たとえばコンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸を、たとえばタンパク質にプロテオグリカンとして連結したものとして含むことができる。ＥＣＭ成分はアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）などを含むことができる。

【0159】

マトリックスコーティングは、ヘパラン、またはそれの誘導体、たとえば塩基もしくは塩類を含むことができる。マトリックスコーティングはヘパラン硫酸プロテオグリカンを含むことができる。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、多数の供給源のいずれかに由来するもの、たとえばウシの腎臓に由来するものであってもよい。

【0160】

マトリックスコーティングは、デキストラン、たとえばデキストラン硫酸またはデキストラン硫酸ナトリウムを含むことができる。マトリックスコーティングは、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、またはＩＶ型コラーゲンを含むことができる。マトリックスコーティングはコンドロイチン硫酸を含むことができる。

【0161】

マトリックスコーティングは、ゼラチン、ポリオルニチンを含むか、またはフィブロネクチンのＲＧＤ結合ドメインの結合モチーフを含むことができる。
マトリックスコーティングは、これらの成分のうちいずれか２種類以上の種々の割合の混合物を含むことができる。マトリックスコーティングは、精製した、または実質的に精製したＥＣＭ成分を含むことができる。マトリックスコーティングは、部分精製したＥＣＭ成分を含むことができる。それはＥＣＭ抽出物、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌを含むことができる。

【0162】

細胞培養は、種々のマトリックスコーティングをもつ粒子を含むことができる。たとえば、前記のものから選択される第１マトリックスコーティングをもつ第１粒子集団、および前記のものから選択される第２マトリックスコーティングをもつ第２粒子集団。

【0163】

Ｍａｔｒｉｇｅｌ
本発明の粒子は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むマトリックスコーティングでコートすることができる。

【0164】

Ｍａｔｒｉｇｅｌは、マウス腫瘍細胞から分泌されるゲル状タンパク質混合物の商品名であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国マサチュセッツ州ベッドフォード）から市販されている。この混合物は、多くの組織にみられる複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者が細胞培養のための基質として用いている。

【0165】

ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは、ＥＨＳマウス肉腫、すなわちＥＣＭタンパク質に富む腫瘍から抽出された可溶化した基底膜調製物である。それの主成分は、ラミニン（約５６％）、続いてＩＶ型コラーゲン（約３１％）、ヘパラン硫酸プロテオグ
リカン、およびエンタクチン１（約８％）である。室温でＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは重合して、哺乳動物の細胞基底膜に類似する生物活性マトリックス材料を生成する。

【0166】

一般的な実験室手法は、少量の冷却（４℃）Ｍａｔｒｉｇｅｌをプラスチック製の組織培養実験器具などの表面に分配するものである。３７℃（体温）でインキュベートすると、Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は自己集合して薄膜を生成し、これが表面を覆う。

【0167】

Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞の形態、生化学的機能、移動または侵入、および遺伝子発現に関して生理学的に適切な環境を提供する。
Ｍａｔｒｉｇｅｌが複雑な細胞挙動を刺激する能力は、それの不均質な組成の結果である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分は構造タンパク質、たとえばラミニンおよびコラーゲンであり、これらが培養細胞にそれらの自然環境で遭遇するであろう接着ペプチド配列を提供する。多くの細胞タイプの分化および増殖を促進する成長因子も存在する。Ｍａｔｒｉｇｅｌは下記の成長因子を含む（濃度範囲、平均濃度）：ＥＧＦ（０．５〜１．３ｎｇ／ｍｌ，０．７ｎｇ／ｍｌ），ｂＦＧＦ（＜０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌ，未知），ＮＧＦ（＜０．２ｎｇ／ｍｌ，未知），ＰＤＧＦ（５〜４８ｐｇ／ｍｌ，１２ｐｇ／ｍｌ），ＩＧＦ−１（１１〜２４ｎｇ／ｍｌ，１６ｎｇ／ｍｌ），ＴＧＦ−β（１．７〜４．７ｎｇ／ｍｌ，２．３ｎｇ／ｍｌ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌは多数の他のタンパク質を少量含有する。

【0168】

マトリックスコーティングの変更
ある態様においては、第１マトリックスコーティングをもつ粒子上で１継代以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０継代またはそれ以上）細胞を培養した後、異なる（第２）マトリックスコーティングをもつ粒子へ１継代以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０継代またはそれ以上）移植することができる。場合により、次いで第２コーティングと異なるマトリックスコーティングをもつ粒子へ、たとえば元の第１マトリックスコーティングもしくは他のマトリックスコーティングをもつ粒子またはコートしていない粒子へ細胞を移植することができる。

【0169】

粒子組成
本明細書に記載する方法および組成物においては、粒子またはマイクロキャリア上で幹細胞を伝播させる。本明細書中で用いる用語として、”粒子”にはその上で幹細胞が付着または成長しうるいずれかの支持体が含まれる。粒子は後記に述べるようにいかなる形状または構造であってもよい。

【0170】

粒子には、IUPAC Compendium of Chemical Terminology (2nd Edition, 1992, Vol. 64, p. 160)に記載されるマイクロキャリアを含めることができる。
粒子は、それが前記のようにたとえば幹細胞に対する付着点または支持体としてのその目的を果たすのを可能にする物理的特性をもつ限り、いかなる材料も含むことができる。したがって、粒子はこの目的のために、硬い（ｓｔｉｆｆ）、剛性（ｒｉｇｉｄ）、展性（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）、中実（ｓｏｌｉｄ）、多孔質（ｐｏｒｏｕｓ）その他の材料を含むことができる。それは固体材料または半固体、ゲルなどの材料を含むことができる。

【0171】

その材料は、少なくとも陽電荷および／またはマトリックスコーティングの付着を可能にするために反応性であり、あるいは活性剤によって反応性にすることができるが、その他の点では一般に不活性である物質を含むことができる。粒子は複合材料を含むことができ、したがって１種類より多い材料で粒子を構成することができる。たとえば、粒子のコアが表面部分と異なる材料を含むことができる。たとえば、粒子のコアは一般に不活性である材料を含むことができ、一方、表面部分はマトリックスまたは陽電荷の付着または化学的カップリングのために反応性である材料を含むことができる。

【0172】

粒子は天然由来のものまたは合成によるものであってよい。天然材料および合成材料ならびにそれらを得るための供給源は、当技術分野で周知である。粒子は、少なくともある程度の機械的抵抗性、化学的攻撃もしくは熱処理に対する少なくともある程度の抵抗性、またはこれらの組合わせをもつことができる。

【0173】

別態様において、粒子は”非生物性”物体を含むことができる；この用語は、細胞性材料を含まないか、または実質的に含まないことを意味する。したがって、そのような非生物性または非細胞性の粒子は、合成材料、または天然には存在しない材料を含むことができる。種々の形状をもつ種々の粒子が当技術分野で知られており、これにはたとえば多様な種類のビーズが含まれる。粒子の態様には、マイクロビーズ、たとえばアガロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、シリカゲルビーズなどが含まれる。

【0174】

たとえば、粒子を作製する材料は、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、コラーゲンその他を含むことができる。たとえば、セルロースまたは誘導体、たとえばＤＥＡＥ−セルロースで粒子を作製することができる（後記に述べる）。粒子は、セルロース、改質した親水性ビーズ、およびカーボンをベースとするマイクロキャリアを含むことができる。

【0175】

粒子は市販のマトリックスまたはキャリア、たとえばビーズまたはマイクロビーズを含むことができる。粒子は、クロマトグラフィー用マトリックスとして使用するために販売されている樹脂、たとえばアニオン交換樹脂を含むことができる。

【0176】

粒子は、セルロースマイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。粒子は、親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリレートマトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。粒子は、マクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア、たとえばＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。

【0177】

粒子はデキストランをベースとするマイクロキャリアであってもよい。粒子は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙｔｏｄｅｘ ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むことができる。Ｃｙｔｏｄｅｘ １は架橋デキストランマトリックスをベースとし、陽電荷をもつＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基でこれが置換されている。荷電基はマイクロキャリアマトリックス全体に分布している。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３は、架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングした変性コラーゲンの薄層からなる。

【0178】

粒子は、ポリスチレンをベースとするマイクロキャリアであってもよい。粒子は、ＨｉｌｌｅｘまたはＨｉｌｌｅｘ ＩＩ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。ＨｉｌｌｅｘおよびＨｉｌｌｅｘ ＩＩは、カチオン性トリメチルアンモニウムコーティングをもつ改質ポリスチレンマイクロキャリアである。

【0179】

粒子は、細胞をその上で成長させる前に処理することができる。そのような処理は、本明細書の他の箇所に記載するように、より大きい接着性、電荷の利用能、生体適合性などの達成を目標とするものであってもよい。

【0180】

セルロースマイクロキャリア、たとえばＤＥ−５３、ＤＥ−５２およびＱＡ−５２は、ロッド形であってもよい。
細胞培養物は、１より多いタイプの粒子の混合物を含むことができる。たとえば、第１粒子集団（たとえばコンパクトな形状の粒子の）および第２粒子集団（たとえば細長い形状の粒子の）。ある態様においては、第１細胞タイプ、たとえばフィーダー細胞を第１粒子に付着させ、第２細胞タイプ、たとえばｈＥＳＣを第２粒子に付着させることができる。各タイプの粒子は、同一または異なるマトリックスコーティングをもつことができる。場合により、一方または両方のタイプの粒子がマトリックスコーティングをもたなくてもよい。

【0181】

ビーズ
使用するのに適切なビーズまたはマイクロビーズには、ゲルクロマトグラフィーに用いられるもの、たとえばゲル濾過媒体、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘが含まれる。この種の適切なマイクロビーズには、下記のものが含まれる：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０：ビーズサイズ４０〜１２０をもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０３−９）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０４−７）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０６−３）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ２０〜８０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０７−１）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ５０〜１５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０９−８）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ１００〜３００μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１０−１）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１２−８）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ２０〜８０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１３−６）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ５０〜１５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１４−４）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ１００〜３００μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１５−２）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１６−０）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１７−９）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１８−７）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１９−５）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１２１−７）、およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１２３−３）；ただし、本明細書の他の箇所に記載するように、それらがサイズに関して適合する限りにおいてである。

【0182】

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、たとえば液体クロマトグラフィーに用いられるものも使用できる。例はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズであり、たとえばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０１）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０４）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−６０）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０１）
、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０４）およびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号ｌ １７−５０７３−６０）などとして入手できる。

【0183】

粒子の形状
粒子は細胞の成長に適切ないずれかの形状、たとえばコンパクトな形状または細長い形状をもつことができる。

【0184】

コンパクトな（ｃｏｍｐａｃｔ）形状
コンパクトな形状の例は、概して球形の粒子、楕円体の形状の粒子、または顆粒状の粒子である。

【0185】

”コンパクト”とは、概して細長くない形状を意味する。言い換えると、”コンパクト”な形状は、概して細長くない（ｎｏｎ−ｅｌｏｎｇａｔｅ）もしくは伸長していない（ｕｎｅｘｔｅｎｄｅｄ）のもの、すなわちいずれの寸法においても伸長していないものである。コンパクトな形状は、概して広がって（ｓｐｒｅａｄ）いないもの、または長く（ｌｏｎｇ）ない、もしくは紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｙ）でないものであってもよい。したがって、そのような”コンパクトな形状”は一般に、概して類似する可能性のある、または大きな相異がない、直線寸法をもつ。

【0186】

したがって、コンパクトな形状のいずれか２つの寸法の比率は、５：１以下、たとえば４：１以下、たとえば３：１、２．５：１、２．４：１、２．３：１、２．２：１、２．１：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１以下であってもよい。たとえば、２対の寸法が５：１以上の比率をもつことはできない。

【0187】

ある態様において、コンパクトな形状の最長寸法はコンパクトな形状の最短寸法より５倍未満である。他の態様において、コンパクトな形状の最長寸法は最短寸法より有意に大きくはない；すなわちその形状は比較的均一である。

【0188】

本明細書中で用いる用語”最長寸法”は、主軸、すなわち粒子を通って描くことができる最長の線を含む軸の長さを意味すると解釈すべきである。同様に、”最短寸法”は、副軸、すなわち粒子を通って描くことができる最短の線を含む軸の長さである。

【0189】

直線寸法がほぼ等しいかまたは類似し、あるいは最長寸法−対−最短寸法の比率が５：１未満である規則的な形状は、本明細書に記載するコンパクトな粒子に含まれる。したがって、前記の比率は最長寸法−対−最短寸法の比率に関するものであってもよい。ある態様において、２つの寸法の比率（たとえば、最長寸法−対−最短寸法）は１．１：１未満、たとえば１：１（すなわち規則的または均一な形状）である。

【0190】

したがって、適用できる場合、粒子の長さは幅または直径の５倍未満、たとえばそれの幅または直径の４倍未満、たとえば３倍未満、たとえば２倍未満、またはそれ未満である。

【0191】

コンパクトな形状には、規則的な立体（ｓｏｌｉｄ）、球体（ｓｐｈｅｒｅ）、回転楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、扁平回転楕円体（ｏｂｌａｔｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、平たい回転楕円体（ｆｌａｔｔｅｎｅｄ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、長円体（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）、立方体（ｃｕｂｅ）、錐体（ｃｏｎｅ）、円筒（ｃｙｌｉｎｄｅｒ）、または多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）を含めることができる。多面体には、単純な多面体または規則的な多面体が含まれる。多面体には、たとえば六面体（ｈｅｘａｈｅｄｒｏｎ）、ホリヘ
ドロン（ｈｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、直方体（ｃｕｂｏｉｄ）、三面体（ｄｅｌｔａｈｅｄｒｏｎ）、五面体（ｐｅｎｔａｈｅｄｒｏｎ）、十四面体（ｔｅｔｒａｄｅｃａｈｅｄｒｏｎ）、多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、テトラフレクサゴン（ｔｅｔｒａｆｌｅｘａｇｏｎ）、偏四角面体（ｔｒａｐｅｚｏｈｅｄｒｏｎ）、切頭多面体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、フラードーム（ｇｅｏｄｅｓｉｃ ｄｏｍｅ）、七面体（ｈｅｐｔａｈｅｄｒｏｎ）、および六十面体（ｈｅｘｅｃｏｎｔａｈｅｄｒｏｎ）が含まれる。上記の形状はいずれも、前記の定義に従った”コンパクト”なものとして使用できる。たとえば、その形状が扁平回転楕円体を含む場合、これはその回転楕円体がコンパクトであって細長くないような適切な扁平度をもつ。

【0192】

ある態様において、コンパクトな形状には、寸法が前記のものである限り、バルーン形、葉巻形、ソーセージ形、円板形、涙滴形、ボール形または楕円（ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ）状を含めることができる。コンパクトな形状には、球形、立方体形、直方体形、タイル状、卵形（ｏｖｏｉｄ）状、長円体（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）形、円板形、セル状、ピル（ｐｉｌｌ）形、カプセル形、平らな円筒形、豆（ｂｅａｎ）形、滴形、小球（ｇｌｏｂｕｌａｒ）形、エンドウ豆（ｐｅａ）形、ペレット形なども含めることができる。

【0193】

細長い（ｅｌｏｎｇａｔｅ）形状
粒子は概して細長い形状をもつことができる。細長い形状の例は、概してロッド形の粒子、円筒形の粒子、またはスティック形の粒子である。細長い粒子は中空繊維を含むことができる。

【0194】

”細長い”とは、概してコンパクトではない形状を意味する。言い換えると、”細長い”形状は、概して他の方向と比較して一方向に伸長したものである。細長い形状は、広がった、長いまたは紡錘形のものであってもよい。したがって、そのような”細長い形状”は一般に、おおまかに多少とも互いに異なる直線寸法をもつ。

【0195】

したがって、細長い形状のいずれか２つの寸法の比率は、５：１以上、４：１以下、たとえば１．１：１以上、１．２：１以上、１．３：１以上、１．４：１以上、１．５：１以上、１．６：１以上、１．７：１以上、１．８：１以上、１．９：１以上、２：１以上、２．１：１以上、２．２：１以上、２．３：１以上、２．４：１以上、２．５：１以上、３：１以上、４：１以上、または５：１以上であってもよい。

【0196】

たとえば、いずれか２対の寸法が５：１以上の比率をもつことができる。したがって、ある態様において、細長い形状の最長寸法は細長い形状の最短寸法の５倍より大きい。
したがって、適用できる場合、粒子の長さは幅または直径の２倍より大きく、たとえばそれの幅または直径の３倍より大きく、たとえば４倍より大きく、たとえば５倍より大きく、または１０倍より大きい。

【0197】

細長い、またはロッド形のマイクロキャリアは、本発明方法に使用するために特に好ましい。それらは細胞−マイクロキャリア集合体を形成するためのマトリックスをより良好に付着させることが観察された。理論により制約または拘束されるわけではないが、ロッド形マイクロキャリアの長軸は、ビーズ（球）マイクロキャリアと比較して優れた付着をもたらすと考えられる；これは、付着に利用できる大きな表面積により、撹拌に際して安定な細胞−キャリアの集合が数時間以内に可能になるためである。

【0198】

粒子サイズ
粒子が連続成長を支持するためには、それらは細胞が粒子上で成長しうるサイズをもつことができる。粒子のサイズは、細胞が他の粒子上で成長している細胞と集合するのを可能にするものでもある。たとえば、粒子のサイズは、少なくとも１つの寸法が霊長類また
はヒトの幹細胞の寸法と適合するものであることが必要である可能性がある。

【0199】

粒子のサイズは、粒子を選択し、幹細胞を付着させて成長させ（本明細書に説明し、実施例に詳述するように）、そして多数のパラメーターのいずれか、たとえば幹細胞の成長、生存率、生物学的特性の保持、核型などをアッセイすることにより、経験的に選択できる。

【0200】

一例として、粒子は概して球形または顆粒状のコンパクトなマイクロキャリアを含むことができる。この場合、コンパクトなマイクロキャリアは約２０μｍ〜約２５０μｍの範囲の寸法をもつことができる。

【0201】

コンパクトなマイクロキャリアについての寸法の範囲の上限は、約２５０μｍ、約２４０μｍ 、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ 、約５０μｍ、約４０μｍまたは約３０μｍであってよい。

【0202】

コンパクトなマイクロキャリアの寸法の範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍまたは約１１０μｍであってよい。

【0203】

コンパクトなマイクロキャリアは、１２０μｍ〜２０μｍ、１１０μｍ〜３０μｍ、１００μｍ〜４０μｍ、９０μｍ〜５０μｍ、８０μｍ〜４０μｍ、７０μｍ〜５０μｍまたは９０〜３０μｍ、８０〜４０μｍ、７０〜４０μｍ、７０〜３０μｍ、６０〜４０μｍ、６０〜３０μｍ、６０〜５０μｍ、５０〜４０μｍ、５０〜３０μｍ、５０〜５μｍ、５０〜１０μｍ、６０〜１０μｍ、７０〜１０μｍ、６０〜２０μｍ、７０〜２０μｍの寸法をもつことができる。

【0204】

コンパクトなマイクロキャリアは、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍまたは約１２０μｍの寸法をもつことができる。

【0205】

コンパクトなマイクロキャリアの寸法は、たとえば約６５μｍであってもよい。
寸法は、マイクロキャリアの直径であってもよい。
コンパクトな粒子は、たとえば親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリル系マトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリア、たとえばＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。

【0206】

ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗに関する情報は、http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Affinity/TSKgel+Tresyl-5PW.htmに見いだすことができる。

【0207】

Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０に関する情報は、http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/ProcessMedia/ByMode/AFC/ToyopearlAF-Tresyl-650.htmに見いだすことができる。

【0208】

他の例として、粒子は、概してロッドまたは円筒の形状をもつ細長いマイクロキャリアを含むことができる。この場合、細長いマイクロキャリアは約４００μｍ〜約５０μｍの範囲の最長寸法をもつことができる。

【0209】

細長いマイクロキャリアについての最長寸法の範囲の上限は、約２０００μｍ、約１９００μｍ、約１８００μｍ、約１７００μｍ、約１６００μｍ、約１５００μｍ、約１４００μｍ、約１３００μｍ、約１２００μｍ、約１１００μｍ、約１０００μｍ、約９００μｍ、約８００μｍ、約７００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３９０μｍ、約３８０μｍ、約３７０μｍ、約３６０μｍ、約３５０μｍ、約３４０μｍ、約３３０μｍ、約３２０μｍ、約３１０μｍ、約３００μｍ、約２９０μｍ、約２８０μｍ、約２７０μｍ、約２６０μｍ、約２５０μｍ、約２４０μｍ、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍまたは約５０μｍであってよい。

【0210】

細長いマイクロキャリアについての最長寸法の範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２１０μｍ、約２２０μｍ、約２３０μｍ、約２４０μｍ、約２５０μｍ、約２６０μｍ、約２７０μｍ、約２８０μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、約３３０μｍ、約３４０μｍ、約３５０μｍ、約３６０μｍ、約３７０μｍ、約３８０μｍまたは約３９０μｍであってよい。

【0211】

細長いマイクロキャリアは、２０００μｍ〜２０μｍ、たとえば４００μｍ〜５０μｍ、３９０μｍ〜６０μｍ、３８０μｍ〜７０μｍ、３７０μｍ〜８０μｍ、３６０μｍ〜９０μｍ、３５０μｍ〜１００μｍ、３４０μｍ〜１１０μｍ、３３０μｍ〜１２０μｍ、３２０μｍ〜１３０μｍ、３１０μｍ〜１４０μｍ、３００μｍ〜１５０μｍ、２９０μｍ〜１６０μｍ、２８０μｍ〜１７０μｍ、２７０μｍ〜１８０μｍ、２６０μｍ〜１９０μｍ、２５０μｍ〜２００μｍ、２４０μｍ〜２１０μｍまたは２３０μｍ〜２２０μｍの最長寸法をもつことができる。

【0212】

細長いマイクロキャリアの最長寸法は、たとえば約１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍなどであってもよい。
細長いマイクロキャリアは、１０μｍ〜５０μｍの範囲の最短寸法をもつことができる。細長いマイクロキャリアは、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍまたは約４５μｍの最短寸法をもつことができる。

【0213】

細長いマイクロキャリアは、ほぼ円形または長円形の断面をもつ円筒形またはロッド形であってもよく、その最短寸法は約５μｍ〜約５０μｍの範囲、たとえば約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、または約４５μｍのいずれかであってもよい。直径が約５μｍ〜２０μｍ、約１０μｍ〜２５μｍ、約１５μｍ〜３０μｍ、約２０μｍ〜３５μｍ、約２５μｍ〜４０μｍ、約３０μｍ〜４５μｍ、約３５μｍ〜５０μｍのいずれかの範囲であってもよい。

【0214】

細長い粒子は、たとえばセルロース円筒形マイクロキャリア、たとえばＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。

【0215】

いずれか特定のマイクロキャリアのサイズおよび寸法は、バッチ内またはバッチ間で異なってもよい。たとえばＤＥ−５３ロッド形セルロースマイクロキャリアについて、本発明者らはバッチ内のキャリアの長さおよび寸法を測定し、キャリアの長さは５０〜２５０
μｍ（平均長さ１３０±５０μｍ）の可能性があり、キャリアの直径は１７μｍと少なくとも５０μｍの間（平均直径３５±７μｍ）の可能性があることが分かった。

【0216】

粒子は多孔質であってもよい。多孔質粒子は培地が成長領域の内部を通って循環するのを可能にし、これは細胞の成長を助成することができる。たとえば、粒子はマクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを含むことができる。粒子はＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。

【0217】

幹細胞の培養
いずれか適切な幹細胞培養方法、たとえば実施例に述べる方法を、本明細書に記載する方法および組成物に使用できる。

【0218】

いずれか適切な容器を、本明細書に記載する方法および組成物により幹細胞を伝播させるために使用できる。適切な容器には、米国特許公開ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）に記載されたものが含まれる。

【0219】

容器には、たとえばバイオリアクターおよびスピナーを含めることができる。本明細書中で用いる”バイオリアクター”は、真核細胞、たとえば動物細胞または哺乳動物細胞を、たとえば大規模で培養するのに適切な容器である。調節型バイオリアクターの一般的な培養体積は２０ｍｌ〜５００ｍｌである。

【0220】

バイオリアクターには、１以上の条件、たとえば酸素分圧を制御またはモニターできる、調節型バイオリアクターを含めることができる。これらの条件を測定および調節するための装置は当技術分野で既知である。たとえば、酸素電極を酸素分圧測定のために使用できる。酸素分圧は、選択するガス混合物（たとえば空気、または空気および／または酸素および／または窒素および／または二酸化炭素の混合物）の量および組成により調節できる。酸素分圧を測定および調節するのに適切な装置は、Bailey, J E. (Bailey, J E., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw-Hill, Inc. ISBN 0-07-003212-2 Higher Education, (1986))、またはJackson A T. Jackson A T., Verfahrenstechnik in der Biotechnologie, Springer, ISBN 3540561900 (1993))に記載されている
。

【0221】

他の適切な容器にはスピナーが含まれる。スピナーは、調節型または非調節型バイオリアクターであり、これらは種々の撹拌メカニズム、たとえばガラスボール撹拌機、インペラー撹拌機、および他の適切な撹拌機を用いて撹拌することができる。スピナーの培養体積は一般に２０ｍｌ〜５００ｍｌである。ローラーボトルは、培養面積４００〜２０００ｃｍ^２のプラスチック製またはガラス製の丸型細胞培養フラスコである。細胞をこれらのフラスコの内面全体に沿って培養する；細胞は培養培地でコートされ、これは”回転”運動、すなわちボトルをそれら自身の個々の軸の周りに回転させることにより達成される。

【0222】

あるいは、培養は静止状態であってもよく、すなわちこの場合は培養／培地の能動的撹拌を用いない。培養物の撹拌を抑えることにより、細胞／マイクロキャリアの集合体を形成させることができる。培地が培養細胞全体に分散および流動するのを促進するためにある程度の撹拌を用いてもよいが、これは集合体の形成を実質的に妨げないように行なうことができる。たとえば、低ｒｐｍの撹拌、たとえば３０ｒｐｍ未満または２０ｒｐｍ未満の撹拌を採用できる。

【0223】

継代を伴う伝播
本明細書に記載する方法および組成物は、継代、または培養中の分割を含むことができ
る。この方法は、連続的または継続的な継代を伴うことができる。

【0224】

”連続的”または”継続的”とは、本発明方法により幹細胞が継代されるのを可能にする様式で幹細胞を成長させうることを意味する；たとえば、それらが成長しているマイクロキャリアから離脱させて他のマイクロキャリアまたは粒子へ移植し、このプロセスを少なくとも１回、たとえば２回、３回、４回、５回など反復することができる（後記に述べるように）。場合により、これを任意の多数回、たとえば不定または無限に反復することができる。最も好ましくは、このプロセスを５回以上、たとえば６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上、１１回以上、１２回以上、１３回以上、１４回以上、１５回以上、１６回以上、１７回以上、１８回以上、１９回以上、２０回以上、２１回以上、２２回以上、２３回以上、２４回以上、２５回以上反復する。用語”継続的”または”連続的”は、細胞成長などの事象が実質的に中断されずに延長されることを意味するためにも使用できる。たとえば、本発明方法は、成長または培養を終止する必要なしに、幹細胞を希望する任意世代数まで拡張させることを可能にする。

【0225】

培養細胞を基質またはフラスコから解離させ、”分割し”、組織培養培地中への希釈および再播種により二次培養または継代することができる。
粒子上で成長している細胞を粒子培養へ戻して継代することができる。あるいは、それらを一般的な（２Ｄ）培養に戻して継代することができる。プレート上で成長している組織培養細胞を粒子培養へ継代することができる。これらの各方法を、後記および実施例にさらに詳細に記載する。

【0226】

用語”継代”は、一般に細胞培養のアリコートを採取し、細胞を完全または部分的に解離させ、希釈して培地に接種するプロセスを表わすことができる。継代は１回以上反復することができる。アリコートは、細胞培養物の全部または一部を含むことができる。アリコートの細胞は完全に集密状態であるか、部分的に集密状態であり、または集密状態でなくてもよい。継代は以下の一連の工程のうち少なくとも一部を含むことができる：吸引、すすぎ、トリプシン処理、インキュベーション、離脱、クエンチング、再接種、およびアリコート採取。Hedrick Lab, UC San Diegoにより公開されたプロトコルを使用できる(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。

【0227】

細胞をいずれか適切な手段で、たとえば当技術分野で既知の機械的手段または酵素手段で解離させることができる。細胞を機械的解離により、たとえば細胞スクレーパーまたはピペットを用いて分断することができる。細胞を適切なふるいサイズを通して、たとえば１００ミクロンまたは５００ミクロンのふるいを通してふるい分けることにより解離することができる。細胞を酵素解離により、たとえばコラゲナーゼ処理により分割し、またはｔｒｙｐＬＥ収穫することができる。解離は完全または部分的であってよい。

【0228】

希釈はいずれか適切な希釈であってよい。細胞培養物中の細胞をいずれか適切な比率で分割することができる。たとえば、細胞を１：２以上、１：３以上、１：４以上または１：５以上の比率で分割することができる。細胞を１：６以上、１：７以上、１：８以上、１：９以上または１：１０以上の比率で分割することができる。分割比率は１：１０以上であってもよい。それは１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９または１：２０以上であってもよい。分割比率は１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５もしくは１：２６またはそれ以上であってもよい。

【0229】

したがって、幹細胞を１継代以上、継代することができる。たとえば、幹細胞を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５継代またはそれ以上、継代することができる
。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５継代以上、継代することができる。幹細胞を培養において無限に伝播させることができる。

【0230】

継代を細胞成長の世代として表わすことができる。本発明の方法および組成物は、幹細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代以上、伝播させるのを可能にする。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５世代以上、成長させることができる。

【0231】

継代を細胞倍増回数として表わすこともできる。本発明の方法および組成物は、幹細胞を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５の細胞倍増回数以上、伝播させることができる。幹細胞を２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５の細胞倍増回数以上、伝播させることができる。

【0232】

幹細胞を５より多い、１０より多い、１５より多い、２０より多い、２５より多い、３０より多い、４０より多い、４５より多い、５０より多い、１００より多い、２００より多い、５００より多い、または８００より多い継代、世代または細胞倍増回数、培養することができる。幹細胞を１００、２００、５００またはそれ以上の継代、世代または細胞倍増回数、維持することができる。

【0233】

成長および生産量
本明細書に記載する方法および組成物は、幹細胞の大量生産を可能にする。
本発明方法は、培養における幹細胞の指数成長を可能にする。指数成長は遅滞期を伴ってもよく、伴わなくてもよい。指数成長は培養細胞の成長の一部または実質的期間を形成することができる。指数成長を評価する方法は当技術分野で既知である。

【0234】

たとえば、細胞の比成長速度は下記に従うことができる：

【0235】

【数1】

[この文献は図面を表示できません]

【0236】

上記において、ｘ＝細胞濃度、ｔ＝時間である。本明細書に記載する方法および組成物は、伝統的な２Ｄ培養方法（たとえばプレート上での培養）と比較してより大きな生産量の細胞成長を可能にすることができる。たとえば、本発明方法の体積生産量は１×１０^６細胞／ウェル以上、たとえば２．５×１０^６細胞／ウェル以上、たとえば３、４、５、６または７×１０^６細胞／ウェル以上の可能性がある。ウェルは約３．５ｃｍの直径または約９．５ｃｍ^２の面積をもつことができる。本発明方法の体積生産量は、１００万細胞／ｍｌ以上、たとえば２００万細胞／ｍｌ以上、２５０万細胞／ｍｌ以上、３００万細胞／ｍｌ以上、３５０万細胞／ｍｌ以上、１００万細胞／ｍｌ以上、たとえば４００万細胞／ｍｌ以上、４５０万細胞／ｍｌ以上、５００万細胞／ｍｌ以上の可能性がある。

【0237】

幹細胞の特性の維持
伝播した幹細胞は、霊長類またはヒトの幹細胞の少なくとも１つの特性を保持することができる。幹細胞は、１以上の継代後にその特性を保持することができる。それらは複数回の継代後にその特性を保持することができる。それらは前記に述べた回数の継代数後にその特性を保持することができる。

【0238】

その特性には、形態学的特性、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性などを含めることができる。その特性には生物活性を含めることができる。
幹細胞の特性
本発明方法により伝播させた幹細胞は、下記の幹細胞特性のいずれかを表わすことができる：
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１および／またはＴＲＡ−１−６０および／またはＭａｂ８４の発現の増大を示すことができる。自己再生している幹細胞は、自己再生していない幹細胞と比較して短縮した細胞周期を示す。

【0239】

幹細胞は、一定の形態を示すことができる。たとえば、標準的な二次元顕微鏡画像において、ヒト胚性幹細胞は画像平面で高い核／細胞質比、顕著な核小体、および識別可能な細胞間結合の少ない緻密なコロニーの形成を示す。

【0240】

幹細胞は、後記にさらに詳細に述べるように、発現した細胞マーカーをも特徴とする。
多分化能性マーカーの発現
保持される生物活性には、１以上の多分化能性マーカーの発現を含めることができる。

【0241】

時期特異的胚性抗原（ｓｔａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＳＳＥＡ）は、特定の胚細胞タイプの特徴である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（メリーランド州ベテスダ）から入手できる。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１指定抗体を用いて検出できる(Andrews et al., Cell Lines from
Human Germ Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, 前掲)。ヒト胚性幹細胞は一般にＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は一般にＳＳＥＡ−１陽性である。霊長類多分化能性幹（ｐｒｉｍａｔｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ）（ｐＰＳ）細胞がインビトロで分化すると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の発現が失われ、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。ｐＰＳ細胞はアルカリホスファターゼ活性の存在により特徴づけることもでき、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで基質としてのＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄで、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）の記載に従って発色させることにより検出できる。

【0242】

胚性幹細胞は一般にテロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性でもある。テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰ活性アッセイ(Kim et al., Science 266:2011, 1997)により、市販のキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ． ＸＫ Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃａｔ．ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ ニューヨーク；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ ＥＬＩＳＡ ｐｌｕｓ，Ｃａｔ．２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，インディアナポリス）を用いて測定できる。ｈＴＥＲＴ発現も、ｍＲＮＡレベルでＲＴ−ＰＣＲにより評価することができる。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ定量キット（Ｃａｔ．３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が研究用として市販されている。

【0243】

ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４などを含めてこれらの多分化能性マーカーのうちいずれか１以上を、伝播した幹細胞が保持することができる。

【0244】

マーカーの検出は、当技術分野で既知のいずれかの手段で、たとえば免疫学的に達成できる。組織化学的染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、酵素
結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを使用できる。

【0245】

フローイムノサイトケミストリーは、細胞表面マーカーの検出に使用できる。免疫組織化学（たとえば固定した細胞または組織切片の）は、細胞内または細胞表面マーカーの検出に使用できる。ウェスタンブロット分析は、細胞抽出物について実施できる。酵素結合イムノアッセイは、細胞抽出物または培地中へ分泌された産物について使用できる。

【0246】

この目的には、多分化能性マーカーに対する市販の抗体を使用できる。
時期特異的胚性抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）、ならびに腫瘍拒絶抗原（Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ）１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）は、たとえばＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州テメキュラ）から市販されている。モノクローナル抗体を用いるこれらの抗原の免疫学的検出は、多分化能性幹細胞を特性分析するために広く用いられている(Shamblott M.J. et. al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et. al. (2000). PNAS 97: 11307-11312; Thomson J.A. et. al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et. al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et. al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et. al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10.)。

【0247】

組織特異的遺伝子産物の発現は、ｍＲＮＡレベルでノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析、または標準増幅法で配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出することもできる。本明細書に開示する個々のマーカーの配列データは公開データベース、たとえばＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)から入手できる。これ以上の詳細につい
てはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，７８０を参照されたい。

【0248】

伝播した細胞の実質的に全部またはそれらの実質部分が前記のマーカー（１以上）を発現することができる。たとえば、１以上のマーカーを発現する細胞のパーセントは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％の可能性がある。

【0249】

細胞の生存率
生物活性には、前記の回数の継代後の細胞の生存率を含めることができる。細胞の生存率は、多様な方法で、たとえばトリパンブルー排除によりアッセイできる。

【0250】

生体染色のためのプロトコルを以下に記載する。適宜な試験管に適切な体積の細胞懸濁液（２０〜２００μＬ）を入れ、等体積の０．４％トリパンブルーを添加し、穏やかに混合し、室温に５分間放置する。１０μｌの染色した細胞を血球計数器に入れ、生存（染色されていない）細胞および死（染色されてる）細胞の数を計数する。各四分の一中の染色されていない細胞の平均数を計算し、２ｘ１０^４倍して細胞／ｍｌを求める。生存細胞のパーセントは、生存細胞数を死細胞と生存細胞の数で割ったものである。

【0251】

細胞の生存率は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％の可能性がある。

【0252】

核型
伝播した幹細胞は、伝播の前または後に正常な核型を保持していることができる。”正常な”核型は、幹細胞が由来する親幹細胞の核型と同一、類似または実質的に類似の核型、あるいはそれと異なるけれども実質的な程度にではない核型である。たとえば、何らか
の大きな異常、たとえば転座、染色体喪失、欠失などがあってはならない。

【0253】

核型は多数の方法により、たとえば視覚的に光学顕微鏡下で評価することができる。核型は、McWhir et al. (2006)、Hewitt et al. (2007)、およびGallimore and Richardson
(1973)の記載に従って調製および分析することができる。標準的なＧ−バンド法（ルー
ティンな核型判定サービスを提供する多くの臨床診断検査室で入手できる；たとえばＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂ、カリフォルニア州オークランド）を用いて細胞の核型を判定し、公開された幹細胞核型と比較することもできる。

【0254】

伝播した細胞の全部または実質部分が正常な核型を保持することができる。この割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％の可能性がある。

【0255】

多分化能性
伝播した幹細胞は、３つの細胞系列、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉のすべてに分化する能力を保持していることができる。幹細胞を誘導してこれらの系列それぞれに分化させる方法は当技術分野で既知であり、多分化能性幹細胞の可能性を評価するために採用できる。伝播した細胞の全部または実質部分がこの能力を保持することができる。これは伝播した幹細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または実質的に１００％の可能性がある。

【0256】

共培養およびフィーダー
本発明方法は、共培養物の存在下または不存在下での幹細胞の培養を含むことができる。用語”共培養物（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）”は、一緒に成長している２以上の異なる種類の細胞、たとえば間質フィーダー細胞の混合物を表わす。これらの２以上の異なる種類の細胞を同一表面、たとえば粒子もしくは細胞容器表面で、または異なる表面で成長させることができる。異なる種類の細胞を異なる粒子の上で成長させることができる。

【0257】

本明細書中で用いる用語、フィーダー細胞は、異なるタイプの細胞の培養に使用または要求される細胞を意味することができる。幹細胞の培養に関して、フィーダー細胞はＥＳ細胞の生存、増殖、および多分化能性の維持を保証する機能をもつ。ＥＳ細胞の多分化能性は、フィーダー細胞を直接共培養することにより達成できる。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞をある培地で培養して、それを調整する（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）ことができる。この馴化培地を用いて幹細胞を培養することができる。

【0258】

容器、たとえば培養皿の内面を、分裂しないように処理したマウス胚性皮膚細胞のフィーダー細胞層でコートすることができる。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞の成長に要求される栄養素を培養培地中へ放出する。したがって、粒子上で成長している幹細胞は、そのようなコートされた容器内で成長することができる。

【0259】

フィーダー細胞自体を粒子上で成長させることができる。それらを、幹細胞について記載したと同様に粒子に接種することができる。伝播すべき幹細胞をそのようなフィーダー粒子と一緒に、または別個に成長させることができる。したがって、そのようなフィーダー細胞をコートした粒子上で層上に幹細胞を成長させることができる。他方では、幹細胞を別個の粒子上で成長させることができる。これらの様式のいずれの組合わせも可能である；たとえば、粒子上で成長させたフィーダー細胞、フィーダー細胞と幹細胞をもつ粒子、および成長している幹細胞をもつ粒子を含む培養。これらの組合わせを、フィーダー層をもつ容器またはもたない容器内で成長させることができる。

【0260】

その上でフィーダー細胞を成長させる粒子は、マトリックスコーティング中にコートされもよく、コートされなくてもよい。
フィーダー細胞が存在しないか、または要求されない様式もありうる。たとえば、フィーダー細胞または幹細胞により調整した培地中で細胞を成長させることができる。

【0261】

培地およびフィーダー細胞
多分化能性幹細胞を分離および伝播するための培地は、得られる細胞が目的の特性をもち、かつさらに伝播しうる限り、幾つかの異なる処方のいずれかをもつことができる。

【0262】

適切な供給源は下記のものである：ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；Ｋｎｏｃｋｏｕｔダルベッコの改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。血清を含む胚性幹（ＥＳ）細胞培地の例は、８０％のＤＭＥＭ（一般にＫＯ ＤＭＥＭ）、２０％の規定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（熱不活性化していないもの）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノールを用いて調製される。この培地を濾過し、４℃に保存する（２週間を超えない）。血清を含まない胚性幹（ＥＳ）細胞培地は、８０％のＫＯ ＤＭＥＭ、２０％の血清代替物、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのベータ−メルカプトエタノールを用いて調製される。有効な血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。この培地を濾過し、４℃に保存する（２週間を超えない）。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを添加して最終濃度４ｎｇ／ｍＬにする（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ、国際特許出願公開ＷＯ ９９／２０７４１）。

【0263】

培地は、下記のものを補充したＫｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，ニューヨーク州グランドアイランド）を含むことができる：１０％の血清代替媒質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ− Ｇｉｂｃｏ，ニューヨーク州グランドアイランド），５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，ニューヨーク州グランドアイランド）および５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州ロッキーヒル）。

【0264】

フィーダー細胞（使用する場合）は、９０％のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）および２ｍＭのグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で伝播させることができる。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ＃４３０８２５）内で伝播させ、細胞を隔日にトリプシンで１：２に分割して、細胞を集密状態以下に保つ。フィーダー細胞層を調製するために、増殖を阻止するけれどもヒト胚性幹細胞を支持する重要な因子の合成は可能である線量で細胞を照射する（約４０００ラドのガンマ線照射）。６ウェル培養プレート（たとえばＦａｌｃｏｎ＃３０４）を、３７℃でウェル当たり１ｍＬの０．５％ゼラチンと共に一夜インキュベートすることによりコートし、ウェル当たり３７５，０００個の照射ｍＥＦを播種する。フィーダー細胞層は、一般に播種後、５時間ないし４日間で使用される。ｐＰＳ細胞の接種直前に、培地を新鮮なヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）培地と交換する。

【0265】

他の幹細胞を培養するための条件は既知であり、適宜、細胞タイプに従って最適化できる。先のセクションに述べた特定の細胞タイプのための培地および培養技術は、引用した参考文献中に示されている。

【0266】

無血清培地
本明細書に記載する方法および組成物は、無血清培地中での幹細胞の培養を含むことができる。

【0267】

用語”無血清培地”には、血清タンパク質、たとえばウシ胎仔血清を含まない細胞培養培地を含めることができる。無血清培地は当技術分野で既知であり、たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，６３１，１５９および５，６６１，０３４に記載されている。無血清培地は、たとえばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。

【0268】

無血清培地は、未知組成のタンパク質、水解物および成分を含まないという点で無タンパク質であってもよい。無血清培地には、すべての成分が既知の化学構造をもつ化学的に規定された培地を含めることができる。化学的に規定された無血清培地は、完全に規定された系を提供し、変動性を排除し、改良された再現性およびより一貫した性能を可能にし、外因性物質の混入の可能性を減らすので、有利である。

【0269】

無血清培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，ニューヨーク州グランドアイランド）を含めることができる。
無血清培地には、１種類以上の成分、たとえば血清代替媒質を、たとえば５％、１０％、１５％などの濃度で補充することができる。無血清培地には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランド）からの血清代替媒質を１０％補充することができる。

【0270】

解離させた（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）または離散させた（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）胚性幹細胞を培養する無血清培地は、１種類以上の成長因子を含むことができる。多数の成長因子が当技術分野で既知であり、これにはＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）Ａ、ＴＧＦベータ１、ＨＲＧ１ベータ、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａその他が含まれる。成長因子はいずれか適切な濃度、たとえば１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌで使用できる。

【0271】

培地補充物
培養培地に１種類以上の添加物を補充することができる。たとえば、これらは下記のうち１以上から選択できる：脂質混合物、ウシ血清アルブミン（たとえば０．１％ ＢＳＡ）、ダイズタンパク質の水解物。

【0272】

幹細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
本明細書中で用いる用語”幹細胞”は、分裂に際して２つの発生選択肢に直面する細胞を表わす：娘細胞は元の細胞と同一である可能性があり（自己再生）、あるいはそれらはより特殊化した細胞タイプの子孫である可能性がある（分化）。したがって、幹細胞は一方または他方の経路をとることができる（各細胞タイプの１つを形成しうる他の経路がある）。したがって、幹細胞は、最終分化しておらず他のタイプの細胞を生成しうる細胞である。

【0273】

本明細書中で述べる幹細胞には、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、および多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を含めることができる。

【0274】

一般に、本明細書中の幹細胞（複数）という表記は単一（幹細胞）を含むことができる。特に、幹細胞を培養および分化させる方法は単一細胞および集合体の培養技術を含むことができる。

【0275】

本発明において、幹細胞培養物は集合体または単一細胞であってよい。
全能性幹細胞（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
”全能性”細胞とは、成体内のいかなる細胞タイプにもなる可能性をもつ細胞、または胚体外膜（ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（たとえば胎盤）のいずれかの細胞を表わす。したがって、唯一の全能性細胞は受精卵およびそれの分裂により生成する最初の４個程度の細胞である。

【0276】

多分化能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
”多分化能性”幹細胞は、体内の分化したいかなる細胞をも作る可能性を備えた真の幹細胞である。しかしそれらは、栄養芽細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）に由来する胚体外膜を作るのには関与できない。幾つかのタイプの多分化能性幹細胞が見いだされている。

【0277】

胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
胚性幹（ＥＳ）細胞は、卵子着床が起きた際に胚が発生する段階である胞胚（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）（ＩＣＭ）から分離することができる。

【0278】

胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ）
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、流産胎児内の生殖腺への前駆体から分離することができる。
胚性癌腫細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ）
胚性癌腫（ＥＣ）細胞は、奇形癌、すなわち胎児の生殖腺に稀に起きる腫瘍から分離することができる。最初の２つと異なり、それらは通常は異数性である。３種類のこれらのタイプの多分化能性幹細胞は、胚または胎児の組織のみから分離することができ、培養により成長させることができる。これらの多分化能性細胞が分化するのを阻止する方法は当技術分野で既知である。

【0279】

成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
成体幹細胞は多種多様なタイプを含み、これには神経幹細胞、皮膚幹細胞、および骨髄移植における活性成分である造血幹細胞が含まれる。これら後者の幹細胞タイプは、臍帯に由来する幹細胞の主要な特徴でもある。成体幹細胞は、実験室および体内の両方において機能性でより特殊化した細胞タイプに成熟させることができるが、細胞タイプの厳密な数は選択する幹細胞のタイプによって制限される。たとえば、成体幹細胞は間葉幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、内皮幹細胞、または神経幹細胞であってもよい。成体幹細胞は多能性である可能性がある。

【0280】

多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）
多能性幹細胞は、真の幹細胞であるが、限られた数のタイプに分化しうるにすぎない。たとえば骨髄は、血液のすべての細胞を生じうるけれども他のタイプの細胞を生じない多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は成体動物にみられる。身体のあらゆる臓器（脳、肝臓）は、それらが死んだ細胞または損傷を受けた細胞を交換できる場合にはそれらを含むと考えられる。

【0281】

幹細胞を特性分析する方法は当技術分野で既知であり、これには標準アッセイ法、たとえばクローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、ならびに分子生物学的技術、たとえばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロット法の使用が含まれる。

【0282】

ヒトとネズミの多分化能性幹細胞は、形態学的な相異のほか、それらの多数の細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現が異なる。幹細胞のマーカーおよびそれらの検出方法を本明細書の他の箇所に記載する（”幹細胞の特性の維持”）。

【0283】

幹細胞の供給源
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８５１，８３２に、脳組織から得られた多能性神経幹細胞が報告されている。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７６６，９４８に、新生児大脳半球から神経芽細胞を生成することが報告されている。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６５４，１８３および５，８４９，５５３に、哺乳動物神経冠幹細胞の使用が報告されている。

【0284】

Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０４０，１８０に、哺乳動物多能性ＣＮＳ幹細胞の培養物から、分化した神経細胞をインビトロ生成することが報告されている。ＷＯ ９８／５０５２６およびＷＯ ９９／０１１５９に、神経上皮幹細胞、乏突起神経膠細胞−神経膠星状細胞前駆体、および系列限定−神経細胞前駆体の生成および分離が報告されている。

【0285】

Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９６８，８２９には、胚性前脳から得られ、グルコース、トランスフェリン、インスリン、セレン、プロゲステロン、および他の幾つかの成長因子を含む培地で培養された、神経幹細胞が報告されている。

【0286】

初代肝細胞培養物は、ヒトの生検材料または外科的に切除された組織から、適切な組合わせのコラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼと共に潅流することにより得ることができる。あるいは、ＥＰ ０ ９５３ ６３３ Ａｌに、ミンスしたヒト肝組織を調製し、濃縮した組織細胞を増殖培地に再懸濁し、そして細胞を培養において拡張することにより、肝細胞を分離することが報告されている。増殖培地は、グルコース、インスリン、トランスフェリン、Ｔ_３、ＦＣＳ、および肝細胞が悪性トランスフォーメーションせずに成長するのを可能にする種々の組織抽出物を含む。

【0287】

肝臓の細胞は、肝実質細胞、クッパー細胞、類洞内皮および胆管上皮を含めた特殊化した細胞、ならびに成熟した肝細胞または胆管上皮細胞の両方に分化する能力をもつ前駆細胞（”肝芽細胞”または”卵形細胞”と言う）を含むと考えられている(L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998)。

【0288】

Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１９２，５５３に、ヒトの新生児または胎児の造血幹細胞または前駆細胞を分離するための方法が報告されている。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７１６，８２７に、Ｔｈｙ−１陽性前駆体であるヒト造血細胞、およびそれらをインビトロで再生させるのに適切な増殖培地が報告されている。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６３５，３８７に、ヒト造血細胞およびそれらの前駆体を培養するための方法および装置が報告されている。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０１５，５５４に、ヒトリンパ球様細胞および樹状細胞を再構築（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ）する方法が記載されている。

【0289】

Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，４８６，３５９に、１より多いタイプの結合組織、たとえば骨、軟骨、腱、靭帯および真皮の細胞に分化しうるヒト間葉幹細胞の均一集団が報告されている。それらは骨髄または骨膜から得られる。間葉幹細胞を拡張するために用いた培養条件も報告されている。ＷＯ ９９／０１１４５に、成長因子、たとえばＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦで処理した個体の末梢血から分離されたヒト間葉幹細胞が報告されている。ＷＯ ００／５３７９５に、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない、脂肪組織由来の幹細胞および格子（ｌａｔｔｉｃｅ）が報告されている。報告によれば、これらの細胞を拡張および培養してホルモンおよび馴化培地を生成することができる。

【0290】

いかなる脊椎動物種の幹細胞も使用できる。ヒト、ならびにヒト以外の霊長類、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ、ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、およびヒト以外の他の哺乳動物、たとえばげっ歯類、マウス、ラットなどに由来する幹細胞が含まれる。

【0291】

本明細書に記載する方法および組成物に適切な幹細胞には、妊娠後に形成された組織、たとえば胚盤胞、または妊娠中のいずれかの時期に採取した胎児組織もしくは胚組織に由来する、霊長類の多分化能性幹細胞（ｐＰＳ）またはヒト多分化能性幹細胞が含まれる。限定ではない例は、胚性幹細胞の初代培養物または樹立した系列である。

【0292】

胚性幹細胞
胚性幹細胞は、霊長類の種のメンバーの胚盤胞から分離できる(Thomson et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995)。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、ヒト胚盤胞細胞から、Thomson et al.（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８４３，７８０；Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998)およびReubinoff et al, Nature Biotech. 18: 399, 2000に記載された技術を用いて調製できる。

【0293】

要約すると、ヒト胚盤胞をヒトのインビボ着床前期胚から得ることができる。あるいは、インビトロ受精（ＩＶＦ）胚を使用でき、または１細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡張させることができる(Bongso et al., Hum Reprod 4: 706, 1989)。ヒト胚をＧ１．２およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階まで培養する(Gardner et al., Fertil. Steril. 69:84, 1998)。発生した胚盤胞を胚性幹細胞分離のために選択する。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）へ
の短時間曝露により胚盤胞から透明帯を除去する。内細胞塊をイムノサージェリーにより分離する；その際、胚盤胞をウサギ抗ヒト脾細胞抗血清の１：５０希釈液に３０分間曝露し、次いでＤＭＥＭ中で５分間、３回洗浄し、モルモット補体（Ｇｉｂｃｏ）の１：５希釈液に３分間曝露する（参照：Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975)。ＤＭＥＭ中でさらに２回洗浄した後、溶解した栄養外胚葉細胞を無傷の内細胞塊（ＩＣＭ）から穏やかなピペッティングにより除去し、ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上に播種する。

【0294】

９〜１５日後、内細胞塊由来の増殖物を、カルシウムおよびマグネシウムを含まない１ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）への曝露、ディスパーゼもしくはトリプシンへの曝露、またはマイクロピペットによる機械的解離により解離させてクランプにする；次いで新鮮な培地中のｍＥＦ上に再播種する。解離した細胞を新鮮な胚性幹（ＥＳ）細胞培地中のｍＥＦフィーダー層上に再播種し、コロニー形成を観察する。未分化形態を示しているコロニーを、マイクロピペットにより個別に選択し、機械的に解離させてクランプにし、再播種する。胚性幹細胞様の形態は、明らかに高い核−対−細胞質比および顕著な核小体をもつ緻密なコロニーとして特徴づけられる。得られた胚性幹細胞を、次いで短時間のトリプシン処理、ダルベッコのＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まず、２ｍＭのＥＤＴＡを含む）への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露、またはマイクロピペットによる個別のコロニーの選択により、ルーティンに１〜２週毎に分割する。約５０〜１００細胞のクランプサイズが最適である。

【0295】

胚性生殖細胞
ヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞は、最終月経期後の約８〜１１週目に採取したヒト胎児材料中に存在する始原生殖細胞から調製できる。適切な調製方法は、Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０９０，６２２に記載されている。

【0296】

要約すると、生殖隆起を等張緩衝液ですすぎ、次いで０．１ｍＬの０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム溶液（ＢＲＬ）に入れ、＜１ｍｍ^３の塊（ｃｈｕｎｋ）に切断する。次いでこの組織を１００／μＬティップによりピペッティングして、細胞をさらに離散させる。それを３７℃で約５分間インキュベートし、次いで約３．５ｍ
ＬのＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、ＤＭＥＭ；４５００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭの炭酸水素ナトリウム；１５％の胚性幹（ＥＳ）細胞用ウシ胎仔血清（ＢＲＬ）；２ｍＭのグルタミン（ＢＲＬ）；１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００Ｕ／ｍＬのヒト組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）；１〜２ｎｇ／ｍｌのヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ，Ｇｅｎｚｙｍｅ）；および１０μＭのフォルスコリン（１０％ ＤＭＳＯ中）である。別法においては、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／ＤＮＡｓｅを用いてＥＧ細胞を分離する。生殖腺原基または生殖隆起を腸間膜と共に胎児材料から切除し、生殖隆起をＰＢＳ中ですすぎ、次いで０．１ｍｌのＨＣＤ消化液（０．０１％のＶ型ヒアルロニダーゼ、０．００２％のＤＮＡｓｅ Ｉ、０．１％のＩＶ型コラゲナーゼ；すべてＳｉｇｍａから；ＥＧ増殖培地中に調製）に入れる。組織をミンスし、３７℃で１時間または一夜インキュベートし、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地に再懸濁し、フィーダー層上へ播種する。

【0297】

ＬＩＦ、ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含まない改変ＥＧ増殖培地中で３日間培養した集密状態以下のフィーダー細胞層を５０００ラドのγ−線で不活性化したもの含む、９６ウェル組織培養プレートを調製する。適切なフィーダーはＳＴＯ細胞（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＣＲＬ １５０３）である。０．２ｍＬの初代生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウェルに添加する。１回目の継代を７〜１０日後にＥＧ増殖培地中で実施し、各ウェルを、照射したＳＴＯマウス線維芽細胞で予め調製した２４ウェル培養皿の１つのウェルへ移植する。ＥＧ細胞と一致する細胞形態がみられるまで、培地を１日１回交換しつつ細胞を培養する；一般に７〜３０日後または１〜４継代後。

【0298】

誘導された多分化能性幹細胞
本明細書に記載する方法および組成物は、誘導された多分化能性幹細胞の伝播に使用できる。

【0299】

一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略称される誘導された多分化能性幹細胞（人工多能性幹細胞）（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、非多分化能性細胞、一般に成体の体細胞、たとえば線維芽細胞、肺細胞またはＢ細胞から、特定の遺伝子を装入することにより人工的に誘導したタイプの多分化能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は、Takahashi, K. & Yamanaka (2006)、Yamanaka S, et. al. (2007)、Wernig M, et. al. (2007)、Maherali N, et. al. (2007)、およびThomson JA, Yu J, et al. (2007)、およびTakahashi et al., (2007)に概説および考察されている。

【0300】

ｉＰＳ細胞は一般に、特定の幹細胞関連遺伝子を、非多分化能性細胞、たとえば成体線維芽細胞へトランスフェクションすることにより誘導される。トランスフェクションは一般にウイルスベクター、たとえばレトロウイルスにより達成される。トランスフェクションされた遺伝子は、マスタートランスフェクション調節物質Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を増強することが示唆されている。３〜４週後、少数のトランスフェクションした細胞が形態学的および生化学的に多分化能性幹細胞に類似するようになり始め、それらを一般に形態学的選択、倍増時間により、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染により分離する。

【0301】

多分化能性細胞の供給源
本発明のある観点および態様は、多分化能性細胞の使用に関する。胚性幹細胞および誘導された多分化能性幹細胞をそのような細胞の例として記載する。

【0302】

胚性幹細胞は、伝統的に胚盤胞期の胚の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する(Evans, M.J., and Kaufman, M.H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 292, 154-156. Martin, G.R. (1981). Isolation of a pluripot
ent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634-7638. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S., and Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147)。これらの方法は、胚性幹細胞を分離する際に胚の破壊を
引き起こす可能性がある。

【0303】

多分化能性幹細胞の分離のために、現在では胚の破壊を生じない幾つかの方法、たとえば成体の体細胞または生殖細胞の形質転換による方法が提示されている。これらの方法には下記のものが含まれる：
１．核移植によるリプログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞または受精体への核移植を伴う。ある状況において、これは動物−ヒトハイブリッド細胞の作製をもたらすことができる。たとえば、ヒトの体細胞と動物の卵母細胞もしくは受精体との融合、またはヒトの卵母細胞もしくは受精体と動物の体細胞の融合により、細胞を作製することができる。

【0304】

２．胚性幹細胞との融合によるリプログラミング。この技術は、体細胞と胚性幹細胞の融合を伴う。この技術も、前記の１の場合と同様に動物−ヒトハイブリッド細胞の作製をもたらすことができる。

【0305】

３．培養による自然リプログラミング。この技術は、長期培養後の非多分化能性細胞からの多分化能性細胞の生成を伴う。たとえば、多分化能性胚生殖（ＥＧ）細胞が、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養により生成した(Matsui et al., Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell 70,
841-847, 1992, 本明細書に援用する)。骨髄に由来する細胞の長期培養後の多分化能性
幹細胞の発現も報告された(Jiang et al., Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418, 41-49, 2002, 本明細書に援用する)。彼らはこ
れらの細胞を多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＭＡＰＣ）と表記した。Shinoharaらも、マウス新生仔精巣由来
の生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養中に多分化能性幹細胞が生成する可能性があることを証明し、これを彼らは多能性生殖系列幹（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ）（ｍＧＳ）細胞と表記した(Kanatsu-Shinohara et al., Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119, 1001-1012, 2004)。

【0306】

５．特定の因子によるリプログラミング。たとえば、レトロウイルス仲介によりマウス胚または成体線維芽細胞に転写因子（たとえばＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）を導入することによるｉＰＳ細胞の生成；たとえば前記。Kaji et al (Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. オンライン発表 1 March 2009)も、２Ａペプチドと連結したｃ−Ｍｙｃ
、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む単一の多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載している；これはマウスおよびヒト両方の線維芽細胞をリプログラミングすることができる。この非ウイルスベクターを用いて生成したｉＰＳ細胞は、リプログラミングされた状態の指標となる強い多分化能性マーカー発現を示し、これはインビトロ分化アッセイおよび成体キメラマウス形成によって機能的に確認される。彼らは、胚線維芽細胞から、強い多分化能性マーカー発現を伴うリプログラミングされたヒト細胞系を樹立するのに成功した；
方法１〜４は、Shinya Yamanaka，Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell 1, July 2007 a2007
Elsevier Inc)に記載および考察されている；本明細書に援用する。

【0307】

５．単一の卵割球または生検卵割球からのｈＥＳＣ系列の誘導。参照：Klimanskaya I,
Chung Y, Becker S, Lu SJ, Lanza R. Human embryonic stem cell lines derived from
single blastomeres. Nature 2006; 444: 512, Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research (2007) 17: 682-688, Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, et al. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature. 2006; 439: 216-219. Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, et al. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres. Nature. 2006; 444: 481-485. Chung Y, Klimanskaya I, Becker S, et al. Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction. Cell Stem Cell. 2008; 2: 113-117 and Dusko Ilic et al (Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on
human feeders with a minimal exposure to xenomaterials. Stem Cells And Development -公表前報文)；すべてを本明細書に援用する。

【0308】

６．インビトロで卵割を停止させて、桑実胚および胚盤胞に発生することができなかった分裂停止胚から得られるｈＥＳＣ系列。参照：Zhang X, Stojkovic P, Przyborski S, et al. Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos. Stem Cells 2006; 24:2669-2676 and Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells: current status, problems and challenges. Cell Research (2007) 17:682-688；両方を本明細書に援用する。

【0309】

７．単為生殖（ｐａｒｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓまたはｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。この技術は、未受精卵を化学的または電気的に刺激して卵割球にまで発生させることを伴い、それから胚性幹細胞を誘導することができる。たとえば、Lin et al. Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes. Stem Cells. 2003; 21(2): 152-61を参照；彼らは、未受精分裂中期ＩＩの卵母細胞の化学的活性
化を用いて幹細胞を生成させた。

【0310】

８．胎児由来の幹細胞。これらの細胞は潜在能力に関して胚性幹細胞と成体幹細胞の間にあり、多分化能性細胞または多能性細胞の誘導に使用できる。多分化能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１を含む；β−ガラクトシダーゼ染色および一貫したテロメラーゼ活性の発現により示されるように、老化の証拠は最少）を発現しているヒト臍帯由来−胎児間葉幹細胞（ＵＣ ｆＭＳＣ）の誘導に成功した；Chris H. Jo et al (Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res (2008) 334:423-433；本明細書に援用する)。Winston Costa Pereira et al (Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J Tissue Eng Regen Med 2008; 2: 394-399；本明細
書に援用する)は、ヒト臍帯のワートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ ｊｅｌｌｙ）から
純粋な間葉幹細胞集団を分離した。ワートンゼリー由来の間葉幹細胞は、Troyer & Weiss
(Concise Review: Wharton’s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population. Stem Cells 2008:26:591-599)にも概説されている。Kim et al (Ex vivo characteristics of human amniotic membrane-derived stem cells. Cloning Stem Cells 2007 Winter;9(4):581-94；本明細書に援用する)は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉細胞を分離するのに成功した。臍帯は普通は廃棄される組織であり、この組織に由来する幹細胞は、道徳または倫理上の反対を引き寄せにくい。

【0311】

本発明は、これらの供給源から得られる、またはこれらのいずれかの方法により作製される、多分化能性または多能性幹細胞の使用を含む。ある態様において、本発明方法に用
いた多分化能性または多能性幹細胞は、胚の破壊を引き起こさない方法により得られた。より好ましくは、ある態様において、本発明方法に用いた多分化能性または多能性幹細胞は、ヒトまたは哺乳動物の胚の破壊を引き起こさない方法により得られた。したがって本発明方法は、それらの細胞を誘導しうるヒト胚の破壊を必然的に伴う方法によってのみ調製されたものではない細胞を用いて実施することができる。この任意制約は、特に欧州特許庁のDecision G0002/06 of 25 November 2008 of the Enlarged Board of Appealを考
慮に入れるためのものである。

【0312】

分化／胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ）
当業者に既知の種々の分化方法を用いて培養幹細胞を分化させて、いずれか適切な細胞タイプにすることができる。

【0313】

本発明者らは、分化した細胞を生成するための方法であって、幹細胞を本明細書に記載する方法により伝播させ、次いで幹細胞を既知の技術に従って分化させることを含む方法を記載する。たとえば、本発明者らは、外胚葉、中胚葉および内胚葉、ならびに心筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞などに分化させる方法を提供する。本発明者らはさらに、そのような方法により得られる胚様体および分化した細胞を提供する。そのような幹細胞および分化した細胞から作製される細胞系も提供する。

【0314】

幹細胞を分化させる方法は当技術分野で既知であり、たとえば下記に記載されている：Itskovitz-Eldor (2000)およびGraichen et al (2007)、Kroon et al (2008)およびHay et al (2008)、ＷＯ ２００７／０３０８７０、ＷＯ ２００７／０７０９６４、Niebrugge et al (2009)、R Passier et al. 2005、P W Burridge et al. 2006、M A Laflamme et al. 2007、L Yang et al. 2008、およびX Q Xu et al. 2008。培養幹細胞を胚様体の形成にも使用できる。胚様体およびそれらを作製するための方法は、当技術分野で既知である。用語”胚様体”は、懸濁液中での胚性幹細胞の成長により生成する培養物中にみられる球状コロニーを表わす。胚様体は混合細胞タイプのものであり、特定の細胞タイプの分布および出現のタイミングは、胚内でみられたものに対応する。胚様体は、胚性幹細胞を半固体培地などの培地に播種することにより生成させることができる。Lim et al, Blood. 1997;90:1291-1299に記載されるメチルセルロース培地を使用できる。

【0315】

たとえばItskovitz-Eldor (2000)に記載された方法を用いて胚性幹細胞を誘導して、胚様体を形成することができる。胚様体は３胚葉のすべての細胞を含む。
胚様体を、たとえば適切な誘導因子または環境変化に曝露することによりさらに誘導して、種々の系列に分化させることができる。Graichen et al (2007)は、ヒト胚性幹細胞
からｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の操作により心筋細胞を形成することを記載している。Graichenは、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤、たとえば１０マイクロモル濃度未満のＳＢ２０３５８０への曝露により幹細胞からの心筋細胞形成が誘導されることを証明している。

【0316】

分化した細胞は、いずれか適切な目的、たとえば当技術分野で知られているように再生医療のために利用できる。
本発明による培養方法および技術により得られる幹細胞を用いて、医療処置方法に使用するための他の細胞タイプに分化させることができる。たとえば、分化した細胞タイプは、本発明による培養方法および技術により得られる幹細胞から、これを続いて分化させて誘導することができる。分化した細胞タイプは、本発明による培養方法および技術により得られる幹細胞を続いて分化させた産物とみなすことができる。そのような分化した細胞を、場合により医薬的に許容できるキャリア、佐剤または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供することができる。そのような医薬組成物は、医療処置方法に有用となることができる。

【0317】

マイクロキャリア上での分化
本発明によれば、幹細胞、特に胚性幹細胞およびｉＰＳを、マイクロキャリア上での懸濁培養中に分化するように誘導することができる。

【0318】

胚性幹細胞を誘導して、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉、ならびにそれらの派生物に分化させることができる。胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成させることができる。したがって、広範な細胞タイプおよび組織、たとえば心筋細胞、心臓中胚葉、肝細胞、肝臓内胚葉、膵島細胞、膵臓内胚葉、インスリン産生細胞、神経組織、神経外胚葉、上皮組織、表層外胚葉、骨、軟骨、筋肉、靭帯、腱、または他の結合組織を得ることができる。

【0319】

幹細胞の分化および胚様体の形成のための方法は前記に述べられており、マイクロキャリア培養における幹細胞の分化に適用できる。
マイクロキャリア培養中に幹細胞を分化させる方法は、前記に従ってマイクロキャリアをマトリックスコーティング中にコートすることが必要な場合がある。たとえば、適切なコーティングは下記のうち１以上を含むことができる：Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸。

【0320】

マイクロキャリア培養中に幹細胞を分化させる方法は、培養培地に補充物を添加することが必要な場合がある。たとえば、補充物はウシ血清アルブミン、脂質またはＨｙ−Ｓｏｙ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−これはダイズタンパク質の酵素水解物である）を含むことができる。

【0321】

マイクロキャリア培養中に幹細胞を分化させる方法は、２Ｄ培養または３Ｄ懸濁マイクロキャリア培養における幹細胞の初代培養および伝播、続いてマイクロキャリア培養中における分化の誘導を伴うことができる。

【0322】

用途
本明細書に記載する方法および組成物は、多様な手段に利用できる。
たとえば、本明細書に記載する粒子を、より簡単な幹細胞培養のための研究用ツールまたは実験室試薬として提供できる。それらは、分化した細胞を生成するために、マイクロキャリア上での未分化幹細胞の拡張に使用できる。これは受注製造の可能性に発展させることができる。幹細胞を薬物検査に使用するために、拡張させ、場合により分化させることができる。粒子またはマイクロキャリアを種々の培地条件での幹細胞のコンビナトリアル分化のために標識することができる。

【0323】

本明細書に記載する方法により伝播させた幹細胞を、商業的に重要な多様な研究、診断、および療法の目的に使用できる。幹細胞をこれらの目的に直接使用でき、あるいは当技術分野で既知の方法を用いていずれか選択した細胞タイプに分化させることができる。前駆細胞を幹細胞から誘導することもできる。分化した細胞もしくは前駆細胞または両方を、幹細胞の代わりに、または幹細胞と組み合わせて、同じ目的のために使用できる。したがって、本明細書に幹細胞について記載する用途はいずれも、幹細胞から誘導された前駆細胞または分化した細胞に同等に適用される。同様に、分化した細胞のいずれかの用途は、それらにとって前駆体である幹細胞、または前駆細胞に同等に適用されるであろう。

【0324】

幹細胞などの用途は一般に当技術分野で周知であるが、ここに簡単に記載する。
療法用途
本明細書に記載する方法および組成物を用いて、再生医療のための幹細胞を伝播させることができる。幹細胞を拡張し、そして患者に直接投与することができる。それらは外傷
後の損傷を受けた組織の再構成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のために使用できる。

【0325】

胚性幹細胞を再生医療に直接使用でき、あるいはそれらを用いて外胚葉、中胚葉または内胚葉の前駆細胞集団を発生させることができる。前駆細胞はエクスビボ拡張により作製でき、あるいは患者に直接投与することができる。それらも外傷後の損傷を受けた組織の再構成のために使用できる。

【0326】

たとえば、造血前駆細胞は骨髄置換のために使用でき、一方、心臓前駆細胞は心不全患者のために使用できる。皮膚前駆細胞は患者に用いる皮膚移植片を成長させるために利用でき、内皮前駆細胞は人工補綴物、たとえばステントまたは人工心臓の内皮形成（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）のために使用できる。

【0327】

胚性幹細胞は、変性性疾患、たとえば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、などの処置のための外胚葉、中胚葉または内胚葉の前駆細胞の供給源として使用できる。胚性幹細胞は、癌の免疫療法のためのＮＫ細胞または樹状細胞に対する中胚葉または内胚葉前駆体の供給源として使用できる。

【0328】

本明細書に記載する方法および組成物は、外胚葉、中胚葉または内胚葉の前駆細胞の生成を可能にし、これらはもちろん、当技術分野で既知の方法を用いてさらに分化させて、最終分化した細胞タイプにすることができる。

【0329】

したがって、最終分化した細胞の使用はいずれも、それらの源である外胚葉、中胚葉または内胚葉の前駆細胞（または幹細胞）に同等に結び付くであろう。
本明細書に記載する方法および組成物により生成する幹細胞、外胚葉、中胚葉または内胚葉の前駆細胞、および分化した細胞は、疾患の処置に使用でき、あるいは疾患の処置のための医薬組成物の調製に使用できる。そのような疾患は、再生医療により処置できる疾患を含むことができ、これには心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性性疾患、たとえば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、および癌が含まれる。

【0330】

ライブラリー
たとえば、未分化細胞または分化した細胞の集団を用いて、その分化した表現型に特異的な抗体およびｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。抗体を産生、精製および修飾する際に用いる一般法、ならびに免疫アッセイ法および免疫分離法におけるそれらの使用は、Handbook of Experimental Immunology (Weir & Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (Coligan et al., eds.);およびMethods of Immunological Analysis (Masseyeff et al., eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH)に記載されている。ｍＲ
ＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの調製に関する一般法は、RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (R. E. Farrell, Academic Press, 1998); cDNA Library Protocols (Cowell & Austin, eds., Humana Press);およびFunctional Genomics (Hunt & Livesey, eds., 2000)に記載されている。薬物スクリーニングお
よび医療用途に使用するためには、比較的均一な細胞集団が特に適切である。

【0331】

薬物スクリーニング
幹細胞および分化した細胞を用いて、幹細胞または分化した細胞の特性に影響を及ぼす因子（たとえば溶媒、低分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または環境条件（たとえば培養条件または操作）をスクリーニングすることもできる。

【0332】

幹細胞を用いて、多分化能性または分化を促進する因子をスクリーニングすることができる。ある態様においては、分化した細胞を用いて、成熟を促進する因子、またはそのような細胞の長期培養における増殖および維持を促進する因子をスクリーニングすることが
できる。たとえば、候補となる成熟因子または成長因子を異なるウェル内の細胞に添加し、次いで生じる何らかの表現型変化を以後の細胞の培養および使用のために望ましい基準に従って判定することにより、それらを試験する。

【0333】

格別なスクリーニング用途は、薬物探索における医薬化合物の試験に関連する。標準的なテキスト”In vitro Methods in Pharmaceutical Research”, Academic Press, 1997
、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０３０，０１５）、ならびに本明細書の他の箇所にある薬物スクリーニングの一般的記載を参照されたい。候補となる医薬化合物の活性の評価は、一般に、幹細胞または分化した細胞を候補化合物と接触させ、その化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性における何らかの変化を判定し（非処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、次いでその化合物の作用と観察した変化との相関性を求めることを伴う。

【0334】

スクリーニングは、たとえばその化合物が特定の細胞タイプに対する薬理作用をもつように設計されたという理由で、あるいは他の何らかの作用をもつように設計された化合物が意図しない副作用をもつ可能性があるという理由で、行なうことができる。２種類以上の薬物を組み合わせて（同時または逐次のいずれかで細胞と組み合わせることにより）試験して、可能性のある薬物−薬物相互作用を検出することができる。ある用途においては、化合物をまず潜在毒性についてスクリーニングする(Castell et al., pp. 375-410 in ”In vitro Methods in Pharmaceutical Research,” Academic Press, 1997)。細胞毒性は、最初に細胞の生育力、生存率、形態、および特定のマーカー、受容体または酵素の発現または放出により判定することができる。薬物が染色体ＤＮＡに及ぼす影響は、ＤＮＡの合成または修復を測定することにより判定できる。［^３Ｈ］チミジンまたはＢｒｄＵの取込み、特に細胞周期の予定外の時期における取込み、または細胞複製に必要なレベルより高い取込みは、薬物作用と一致する。目的外の作用には、分裂中期拡散により判定した姉妹染色分体交換の異例な速度も含めることができる。これ以上の詳細については、A. Vickers (PP 375-410，”In vitro Methods in Pharmaceutical Research”, Academic Press, 1997)を参照されたい。

【0335】

組織再生
本明細書に記載する方法および組成物により伝播した幹細胞（およびそれに由来する分化した細胞）は、療法、たとえばその必要がある個々の患者における組織の再構築または再生のために使用できる。それらの細胞を、意図する組織部位にそれらがグラフトして機能欠損領域を再構築または再生しうる様式で投与することができる。

【0336】

伝播した幹細胞またはそれに由来する分化した細胞は、組織工学のために、たとえば皮膚移植片を成長させるために使用できる。それらは人工的な臓器もしくは組織の生体工学的作製、または補綴物、たとえばステントに使用できる。

【0337】

分化した細胞も、その必要があるヒト患者において、組織の再構築または再生のために使用できる。それらの細胞を、意図する組織部位にそれらがグラフトして機能欠損領域を再構築または再生しうる様式で投与することができる。

【0338】

たとえば、本明細書に記載する方法および組成物を用いて幹細胞の分化を調節することができる。分化した細胞は、組織工学のために、たとえば皮膚移植片を成長させるために使用できる。幹細胞分化の調節は、人工的な臓器もしくは組織の生体工学的作製、または補綴物、たとえばステントに使用できる。

【0339】

他の例においては、処置すべき疾患に応じて、神経幹細胞を中枢神経系の実質部位またはクモ膜下部位に直接移植する。移植は単一細胞の懸濁液または小さな集合体を用いて２
５，０００〜５００，０００細胞／ｍｕ．Ｌの密度で行われる（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９６８，８２９）。神経細胞移植体の有効性は、McDonald et al. (Nat. Med. 5:1410, 1999に従って急性脊髄損傷のラットモデルにおいて評価することができる。移植が成
功すると、病変部に存在する移植体由来の細胞が２〜５週後に神経膠星状細胞、乏突起神経膠細胞および／または神経細胞に分化し、病変部末端から脊髄に沿って移動し、ゲート、協調および負荷が改善されたことを示すであろう。

【0340】

特定の神経前駆細胞は、神経系に対する急性または慢性の損傷を処置するために設計される。たとえば、てんかん、卒中、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含めた多様な状態において、刺激毒性の関与が指摘されている。本明細書に記載する方法により作製した特定の分化した細胞は、髄鞘発育不全障害、たとえばペリツェウス−メルツバッハー病、多発性硬化症、白質萎縮症、神経炎および神経障害の処置にも適切となることができる。これらの目的に適切なものは、再有髄化を促進するために乏突起神経膠細胞または乏突起神経膠細胞前駆体に富む細胞培養物である。

【0341】

本発明方法を用いて調製した肝細胞および肝細胞前駆体を、動物モデルにおいて肝損傷を修復する能力について評価することができる。そのような例のひとつは、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射により起きた損傷である(Dabeva et al., Am. J. Pathol. 143:1606,
1993)。処置の有効性は、肝細胞マーカーについての免疫組織化学的染色、成長している組織中に小管構造が形成されているかどうかの顕微鏡判定、およびその処置が肝特異的タンパク質の合成を回復させる能力により決定できる。肝細胞は、劇症肝不全後に、直接投与により、または対象の肝組織が自己再生する間の一時的な肝機能を提供する生体補助デバイスの一部として、療法に使用できる。

【0342】

心筋細胞は、たとえば特異的ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害薬であるＳＢ２０３５８０でＭＡＰキナーゼ経路を調節することにより幹細胞の分化を誘導することによって調製できる；Graichen et al (2007)に記載。そのような心筋細胞の有効性は、処置しなければ左
心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする心臓冷却傷害の動物モデルにおいて評価することができる(Li et al., Ann. Thorac. Surg. 62:654, 1996; Sakai et al., Ann. Thorac. Surg. 8:2074, 1999, Sakai et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 118:715, 1999)。処
置が成功すると、瘢痕領域が縮小し、瘢痕拡大が制限され、収縮期血圧、拡張期血圧および活動血圧（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）により判定される心機能が改善されるであろう。心臓傷害は左後方下行動脈の遠位部分に塞栓形成コイルを用いてモデル化することもでき(Watanabe et al., Cell Transplant. 7:239, 1998)、処置の有効性は組
織学的所見および心機能により評価することができる。心筋細胞調製物は、心筋を再生し、不完全な心機能を処置するための療法に使用できる（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，９１９，４４９およびＷＯ ９９／０３９７３）。

【0343】

癌
本明細書に記載する方法および組成物により伝播した幹細胞およびそれに由来する分化した細胞は、癌の処置に使用できる。

【0344】

用語”癌”および”癌性”は、哺乳動物において一般に無調節な細胞成長を特徴とする生理的状態を表現または記載する。癌の例には癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。

【0345】

そのような癌のより具体的な例には下記のものが含まれる：扁平上皮癌、小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫、たとえばグリア芽細胞腫および神経線維腫症、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、直腸癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌腫、ならびに種々
のタイプの頭頚部癌。他の例は、大腸癌、乳癌、肺癌および前立腺癌を含めた固形腫癌、白血病およびリンパ腫を含めた造血系悪性疾患、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚癌および家族性腺腫様多発ポリポーシスである。他の例には下記のものが含まれる：脳新生物、結腸直腸新生物、胸部新生物、子宮頚部新生物、眼新生物、肝新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生物、ファロピウス管新生物、直腸新生物、結腸新生物、腎新生物、胃新生物、および甲状腺新生物。乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頚癌、および胆管癌も含まれる。

【0346】

本明細書に記載する方法および組成物により伝播した幹細胞およびそれに由来する分化した細胞は、抗癌薬、たとえばエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）およびアンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、または細胞毒性薬剤もしくは化学療法剤と組み合わせて使用できる。たとえば薬物、たとえばアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、シス−プラチナム（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、およびアルカロイド、たとえばビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、および代謝拮抗薬、たとえばメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）。本明細書中で用いる用語”細胞毒性薬剤”は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を表わす。この用語は、放射性同位体（たとえばＩ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、および毒素、たとえば細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素活性毒素、またはそのフラグメントを含むものとする。

【0347】

この用語には、癌遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害薬、たとえば下記のものも含まれる：二環式アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）類、ＷＯ ９４／２２８６７に開示；１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ ６００８３２に開示；６，７−ジアミノ−フタラジン−１−オン誘導体、ＥＰ ６００８３１に開示；４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、ＥＰ ５１６５９８に開示；またはチロシンキナーゼがＳＨ２−含有基質タンパク質に結合するのを阻害するペプチド（たとえばＷＯ ９４／０７９１３を参照）。”化学療法剤”は、癌の療法に有用な化合物である。化学療法剤の例には、下記のものが含まれる：アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、チオテパ（Ｔｈｉｏｔｅｐａ）、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール（Ｔａｘｏｌ）、メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、マイトマイシンＣ（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ＶＰ−１６、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、テニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ダウノマイシン（Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、カルミノマイシン（Ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン類、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ）、エスペラマイシン（Ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）類（参照：Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６７５，１８７）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタード類、ならびに内分泌療法剤（たとえばジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）（ＤＥＳ）、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン（ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ）類、抗プロゲスチン類など）。

【0348】

他の観点
本発明者らは、ヒト幹細胞を伝播させる方法であって、下記の工程を含む方法を記載する：（ａ）ヒト幹細胞が付着した第１マイクロ粒子を用意し；（ｂ）第１マイクロ粒子を、付着した第２のヒト幹細胞を含む第２マイクロ粒子と接触させて、集合体を形成させ；そして（ｃ）集合体を培養する；その際、それぞれの第１および第２マイクロ粒子はその上にコートされたマトリックスを含み、かつ陽電荷をもつ。

【0349】

本発明者らは、ヒト幹細胞をキャリア上で伝播させる方法を記載し、その際、キャリアは陽電荷をもち、細胞外マトリックス成分でコートされており、かつ幹細胞がキャリアの集合体を形成しうるサイズのものである。

【0350】

本発明者らは、ヒト幹細胞を伝播させる方法であって、下記の工程を含む方法を記載する：（ａ）ヒト幹細胞が付着した複数のマイクロ粒子を用意し、各マイクロ粒子は陽電荷をもち、かつコートされたマトリックスを含み；（ｂ）複数のマイクロ粒子を集合させて集合体を形成させ；そして（ｃ）集合体を培養する。

【0351】

本発明者らは、ヒト幹細胞を伝播させる方法であって、下記の工程を含む方法を記載する：（ａ）陽電荷およびコートされたマトリックスを含むマイクロ粒子を用意し；（ｂ）ヒト幹細胞を粒子に付着させ；そして（ｃ）幹細胞が付着したマイクロ粒子を集合させて、これによりヒト幹細胞を伝播させる。

【0352】

番号を付けた下記のパラグラフは、本明細書に開示した本発明の技術的特徴の広範な組合わせの記載を含む：
１．それにコートされたマトリックスを含み、かつ陽電荷をもつ粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞が集合しうるサイズの粒子。

【0353】

２．パラグラフ１による粒子であって、実質的に細長い、円筒形もしくはロッド形の粒子、または実質的にコンパクトもしくは球形の粒子。
３．パラグラフ１または２による粒子であって、５０μｍ〜４００μｍの最長寸法を有し、実質的に細長い、円筒形またはロッド形の粒子。

【0354】

４．パラグラフ３による粒子であって、約２００μｍの最長寸法を有する粒子。
５．パラグラフ３または４による粒子であって、２０μｍ〜３０μｍの最短寸法を有する粒子。

【0355】

６．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、円筒形のセルロースマイクロキャリアを含む粒子。
７．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含む粒子。

【0356】

８．パラグラフ１または２による粒子であって、約２０μｍ〜約１２０μｍのサイズを有し、実質的にコンパクトまたは球形の粒子。
９．パラグラフ８による粒子であって、約６５μｍのサイズを有する粒子。

【0357】

１０．パラグラフ１、２、８および９による粒子であって、親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリル系マトリックスマイクロキャリアまたは誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリアを含む粒子。

【0358】

１１．パラグラフ１、２、８、９および１０による粒子であって、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（
東ソー）を含む粒子。

【0359】

１２．パラグラフ１または２による粒子であって、マクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを含む粒子。
１３．パラグラフ１２による粒子であって、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ） ｏｒ ＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含む粒子。

【0360】

１４．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、陽電荷をもつように誘導体化された粒子。
１５．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、粒子の乾燥重量グラム当たり１〜２ミリ当量の小さなイオン交換容量の第三級または第四級アミンとカップリングした粒子。

【0361】

１６．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、最高２０ｍｇ／粒子ｍｌの濃度の硫酸プロタミンまたはポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩とカップリングした粒子。
１７．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、陽電荷が０．５〜４ミリ当量単位／ｍｌ（ｍＥｑ）である粒子。

【0362】

１８．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、マトリックスが幹細胞の成長を可能にする生理学的関連マトリックスである粒子。
１９．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む粒子。

【0363】

２０．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、マトリックスがＭａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、ウシのガラス体液に由来するヒアルロン酸、連鎖球菌に由来するヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン硫酸、ウシの腎臓に由来するヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸からなる群から選択される粒子。

【0364】

２１．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、マトリックスがＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む粒子。
２２．前記のいずれかのパラグラフによる粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を含む粒子。

【0365】

２３．霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法であって、
（ａ）第１粒子に付着した霊長類またはヒトの第１幹細胞を用意し；
（ｂ）第２粒子に付着した霊長類またはヒトの第２幹細胞を用意し；
（ｃ）霊長類またはヒトの第１幹細胞を霊長類またはヒトの第２幹細胞に接触させて細胞の集合体を形成させ；そして
（ｄ）集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代、伝播させる
ことを含み；その際、第１および第２粒子はそれぞれその上にコートされたマトリックスを含み、陽電荷をもち、粒子はそれに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を集合させることができるサイズのものである。

【0366】

２４．パラグラフ２３による方法であって、粒子または各粒子がパラグラフ２〜２２のいずれかに述べた特徴を含む方法。
２５．パラグラフ２３または２４による方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を複数継代、連続伝播させるのを可能にする方法。

【0367】

２６．パラグラフ２３、２４または２５による方法であって、霊長類またはヒトの幹細
胞を少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４継代、連続伝播させるのを可能にする方法。

【0368】

２７．パラグラフ２３〜２６のいずれかによる方法であって、２Ｄコロニー培養へ、または２Ｄコロニー培養から継代することを含む方法。
２８．パラグラフ２３〜２７のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を凍結および融解することを含む方法。

【0369】

２９．パラグラフ２３〜２８のいずれかによる方法であって、３０ｒｐｍ以上または１００ｒｐｍ以上で撹拌することを含む方法。
３０．パラグラフ２３〜２９のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を２５ｍｌ以上または５０ｍｌ以上の体積で伝播させることを含む方法。

【0370】

３１．パラグラフ２３〜３０のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞をスピナー懸濁培養において伝播させることを含む方法。
３２．パラグラフ２３〜３１のいずれかによる方法であって、伝播した霊長類またはヒトの幹細胞が前記回数の継代後に霊長類またはヒトの幹細胞の少なくとも１つの生物活性を保持している方法。

【0371】

３３．パラグラフ３２による方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性が、（ｉ）多分化能性マーカーの発現；（ｉｉ）細胞の生存率；ならびに（ｉｉｉ）正常な核型；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力からなる群から選択される方法。

【0372】

３４．パラグラフ３２または３３による方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性が、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群から選択される多分化能性マーカーの発現を含む方法。

【0373】

３５．パラグラフ２３〜３４のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を１：６以上、１：１０以上、１：１５以上、１：２０以上、または１：２６以上の分割比率で継代するのを可能にする方法。

【0374】

３６．パラグラフ２３〜３５のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を２００万細胞／ｍｌ以上の体積生産量にまで伝播させることを可能にする方法。
３７．パラグラフ２３〜３６のいずれかによる方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞を無血清培地または幹細胞用馴化培地中で伝播させることを含む方法。

【0375】

３８．パラグラフ２３〜３７のいずれかによる方法であって、さらに、霊長類またはヒトの幹細胞を粒子から分離する工程を含む方法。
３９．分化した細胞を生成する方法であって、パラグラフ２３〜３８のいずれかにより霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、続いて霊長類またはヒトの幹細胞を分化させることを含む方法。

【0376】

４０．胚様体を生成するための方法であって、パラグラフ２３〜３８のいずれかにより霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、そして霊長類またはヒトの幹細胞を培養して胚様体を形成することを含む方法。

【0377】

４１．処置の必要な個体において疾患を処置する方法であって、パラグラフ２３〜３８のいずれかにより霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、パラグラフ３９により分化した細胞を生成し、あるいはパラグラフ４０により胚様体を形成し、そして霊長類またはヒト
の幹細胞、分化した細胞、または胚様体を個体に投与することを含む方法。

【0378】

４２．前記のいずれかのパラグラフによる粒子または方法であって、霊長類またはヒトの幹細胞が、霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞、霊長類もしくはヒトの成体幹細胞、または霊長類もしくはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を含む粒子または方法。

【0379】

４３．それに幹細胞が付着したそれぞれパラグラフ１〜２２または４２のいずれかによる２以上の粒子を含む、集合体。
４４．パラグラフ１〜２２もしくは４２のいずれかによる２以上の粒子、またはパラグラフ４３による集合体を含む、細胞培養物。

【0380】

４５．パラグラフ１〜２２もしくは４２のいずれかによる２以上の粒子またはパラグラフ４３による集合体を、細胞培養培地と共に含む、容器。
４６．霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させるためのデバイスであって、パラグラフ１〜２２もしくは４２のいずれかによる２以上の粒子またはパラグラフ４３による集合体を含むデバイス。

【0381】

４７．バイオリアクターである、パラグラフ４５による容器またはパラグラフ４６によるデバイス。
４８．パラグラフ２３〜３７のいずれかによる方法により伝播させた霊長類またはヒトの幹細胞、パラグラフ３９による方法により生成した分化した細胞、またはパラグラフ４０による方法により生成した胚様体。

【0382】

４９．霊長類またはヒトの幹細胞を伝播および／または分化させるための粒子の使用であって、粒子がＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される使用。

【0383】

５０．添付の図面の図１〜５０を参照して実質的に以上に記載した、およびそれらに示した、粒子、方法、集合体、細胞培養物、容器、デバイス、霊長類またはヒトの幹細胞、分化した細胞。

【0384】

５１．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法であって、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイクロキャリアは
（ａ）最長寸法が９０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびヒアルロン酸のうち１以上を含むマトリックスコーティング中にコートされている方法。

【0385】

５２．パラグラフ５１の方法であって、マイクロキャリアが実質的に球形の形状であり、９０μｍ〜１０μｍの直径を有する方法。
５３．パラグラフ５１の方法であって、マイクロキャリアがロッド形である方法。

【0386】

５４．パラグラフ５１の方法であって、マイクロキャリアがロッド形であり、２０００μｍ〜２０μｍの最長寸法を有する方法。
５５．パラグラフ５１〜５４のいずれかの方法であって、マイクロキャリアが、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレンおよび／またはコラーゲンのうち１以上から構成される方法。

【0387】

５６．パラグラフ５１〜５４のいずれかの方法であって、マイクロキャリアがセルロース、デキストランまたはポリスチレンマイクロキャリアである方法。
５７．パラグラフ５１〜５６のいずれかの方法であって、工程（ｉｉ）においてｈＥＳＣを集密状態またはほぼ集密状態にまで拡張させる方法。

【0388】

５８．パラグラフ５１〜５７のいずれかの方法であって、工程（ｉｖ）において、好ましくは工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する方法。

【0389】

５９．パラグラフ５１〜５８のいずれかの方法であって、工程（ｉｖ）の後に培養物中の少なくとも６０％のｈＥＳＣが多分化能性である方法。
６０．パラグラフ５１〜５８のいずれかの方法であって、工程（ｉｖ）の後に培養物中の少なくとも９０％のｈＥＳＣが多分化能性である方法。

【0390】

６１．パラグラフ５１〜６０のいずれかの方法であって、工程（ｉｖ）の後に培養物中の少なくとも６０％のｈＥＳＣがＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２またはすべてを発現する方法。

【0391】

６２．パラグラフ５１〜６０のいずれかの方法であって、工程（ｉｖ）の後に培養物中の少なくとも９０％のｈＥＳＣがＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２またはすべてを発現する方法。

【0392】

６３．ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法であって、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイ
クロキャリアは
（ａ）最長寸法が９０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、その際、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびヒアルロン酸のうち１以上を含むマトリックスコーティング中にコートされている方法。

【0393】

６４．パラグラフ６３の方法であって、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも７０％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティング中にコートされている方法。

【0394】

６５．パラグラフ６３の方法であって、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも９０％について、マイクロキャリアは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびヒアルロン酸のうち１以上を含むマトリックスコーティング中にコートされている方法。

【実施例】

【0395】

実施例および実験結果の序論
本発明者らは、種々の細胞外マトリックスコーティング（たとえばｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニンおよびヒアルロン酸）を含む多様なロッド形および球形のマイクロキャリアを用いる、容易かつ強力なプラットホーム技術を開発した；これらは三次元懸濁培養において未分化ｈＥＳＣの連続伝播を支持することができる。マイクロキャリア培養は一般に、フィーダー細胞を含まない２Ｄコロニー培養の場合より２〜４倍高い細胞密度を達成した。マイクロキャリア上における２種類のｈＥＳＣ系の安定な連続伝播が、馴化培地中で６カ月間証明された。マイクロキャリア培養は、２種類の無血清規定培地（ＳｔｅｍＰｒｏおよびｍＴｅＳＲ１）においても証明された。マイクロキャリア培養は、懸濁スピナーフラスコにおいてさらに高い細胞濃度を達成し、したがって制御されたバイオリアクターにおける伝播の将来性を開いた。

【0396】

本発明者らは、ｈＥＳＣの多分化能性マーカーを保持した状態で、マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの強力かつ連続的な培養および継代を証明する。マイクロキャリア培養（ＭＣ）の成長速度および代謝を２Ｄコロニー培養と比較し、ｈＥＳＣの懸濁ＭＣを２種類の細胞系について証明した。本発明者らは、マイクロキャリア懸濁培養状態において心筋細胞へのｈＥＳＣ分化をも証明する。

【0397】

本発明者らは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたセルロースマイクロキャリアが２Ｄコロニー培養と同様に、分化せずにｈＥＳＣの簡単なルーティン継代を可能にすることを証明した。この継代は、機械的解離（たとえば１００ミクロンのメッシュを通す、または手動ピペッティングによる）および酵素解離（ＴｒｙｐＬＥ酵素またはコラゲナーゼ）の両方法によって容易に実施できる。マイクロキャリアに２Ｄコロニー培養から直接接種することができ、あるいはＭＣから２Ｄコロニー培養へ再接種することができる。多分化能性の３種類の規定マーカー（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ）、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現は、ＨＥＳ−３細胞をこれらの方法により継代した後、対照２Ｄコロニー培養と同等であり（図１５２）、機械的方法または酵素法により継代したマイクロキャリアにおいて達成された細胞密度は類似していた。

【0398】

ｈＥＳＣの機械的継代の後、１日目で細胞は裸のマイクロキャリアを急速にコロニー化し、６日目で完全に集密状態の細胞−マイクロキャリア集合体になった。マイクロキャリアの組織学的分析は、ｈＥＳＣがマイクロキャリア上に多層の細胞を形成し、すべての細胞がＴＲＡ−１−６０について陽性染色されることを示す。ｈＥＳＣマイクロキャリアを
２Ｄコロニー培養へ再播種すると、それらはｍａｔｒｉｇｅｌコートした表面に拡散し、７日間にわたって細胞密度が４倍増大し、９０％を超える生存率をもち、３種類の幹細胞マーカー、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を発現し続けた。９週間の継代後、ｈＥＳＣはなおこれらの多分化能性マーカーの高発現レベルを保持し、６ウェルプレート内において９０％を超える生存率で一般に１２０〜１８０万細胞／ｍｌに達した。馴化培地中で２５継代まで（６カ月間）伝播した正常な核型のＭＣが２種類の細胞系（ＨＥＳ−２およびＨＥＳ３）について証明された。

【0399】

それぞれ継代１４および２５におけるＨＥＳ−２およびＨＥＳ３の核型は正常なままである。マイクロキャリアは、細胞が外胚葉、中胚葉および内胚葉からの遺伝子を発現した状態で胚様体に分化するそれらの能力を保持し、かつ組織が３胚葉を示した状態でＳＣＩＤマウスにおいてテラトーマも形成した。

【0400】

馴化培地におけるＭＣの成長速度および代謝を一般的な２Ｄコロニー培養と比較した。２Ｄコロニー培養は一般に５日目までに８０万細胞／ｍｌ（または６ウェルプレートにおいて４００万細胞／ウェル）の最大集密細胞密度に達した。これに対し、ＭＣは成長し続けて７日目までに２倍の細胞密度１６０万細胞／ｍｌに達した；これは、細胞マイクロキャリア集合体としての３Ｄ成長に利用できる表面積の増大によるものである。１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費レベルならびにラクテートおよびアンモニアの産生レベルは、両方の培養について類似していた。しかし、代謝産物の比消費率および老廃物の比産生率は、マイクロキャリアについては２Ｄコロニー培養と比較して高い細胞数が達成されたため約５０％低かった；これは、前者における、より効率的な代謝の指標となる。本発明者らは２３継代を超えてマイクロキャリアをルーティンに伝播させた；これは、２Ｄコロニー培養についての１：４と比較して、一般に週１回、１：１０の分割比率で、９０％を超える生存率を維持しながら継代された。

【0401】

さらに、ＨＥＳ−３細胞はｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中でマイクロキャリア上において２０継代を超える（５カ月間）成長に適応した。正常な核型がそれぞれ継代１９および２０でみられ、多分化能性マーカーが維持された。

【0402】

５０ｍｌのスピナーフラスコＭＣにおけるｈＥＳＣの成長速度はさらに、静止マイクロキャリア培養（１５０万細胞／ｍｌ）および２Ｄコロニー培養（８０万細胞／ｍｌ）と比較して、ＨＥＳ−３細胞が３５０万細胞／ｍｌの卓越した密度を達成することを証明した。スピナーフラスコ培養の場合、２１時間の倍増時間（比成長速度０．０３３ｈｒ^−１）も、静止マイクロキャリア培養についての３０時間および２Ｄコロニー培養についての３３時間という一般的な倍増時間と比較して速やかであった。スピナー培養における速やかな細胞成長は、撹拌環境での酸素伝達がより良好であることに起因する可能性がある。

【0403】

長期懸濁培養を評価するために、第２のｈＥＳＣ細胞系ＨＥＳ−２を同様に６ウェルプレート内で７週間、静止および撹拌ＭＣとして連続継代し、２Ｄコロニー対照と比較した。静止および撹拌マイクロキャリアは両方とも、２Ｄコロニー培養より有意に高い最大細胞密度を達成した。多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびＳＳＥＡ４は、対照と比較して静止および撹拌マイクロキャリアでは強く発現し続けた。

【0404】

自動化技術の進歩にもかかわらず、表面でＥＳＣを成長させる限界は、細胞密度の増大が利用可能な面積に限定されることである。したがって、バッチ生産行程当たり数リットルというきわめて大量の細胞培養物が結果的に要求される可能性のある医療用途のためには、２Ｄ培養表面をスケールアップするのではなくむしろ懸濁バイオリアクターのような３Ｄ環境におけるバイオプロセスの開発が必要である。

【0405】

現在まで、マイクロキャリア上で未分化ヒトｈＥＳＣを拡張させるのはマウスＥＳＣの場合より困難であることが証明されていた。本発明者らは、未分化のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上での三次元（３Ｄ）懸濁培養において維持するための容易かつ強力な方法を初めて報告し、これにより二次元（２Ｄ）コロニー培養の場合より２〜４倍高い細胞密度を達成した。マイクロキャリア上でｈＥＳＣが安定に連続伝播されることが、馴化培地および２種類の無血清規定培地（ＳｔｅｍＰｒｏおよびｍＴｅＳＲ１）において証明された。

【0406】

スピナーフラスコのデータに基づけば、マイクロキャリアはさらに高い細胞濃度を達成し、表面での拡張の代わりに、より大きな体積でｈＥＳＣを容易に拡張しうる可能性をもつ。たとえば、１００ｍｌの懸濁培養は１７５個の臓器培養皿と同等のｈＥＳＣを生成することができる。将来は、バイオリアクターにおけるｐＨ、溶存Ｏ_２および供給方式などのパラメーターを制御することによって、これらの培養をさらに最適化することもできるであろう。

【0407】

本発明者らは、これらのマイクロキャリアの使用を他の細胞系、たとえばヒトｉＰＳ細胞、およびｈＥＳＣの分化にも拡大した。マイクロキャリア懸濁培養プラットホーム上での心筋細胞産生のためのスケール調節可能なバイオプロセスの開発も調べた。培地の再配合（ｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）および細胞集合体の形成は重要なパラメーターであることが本発明者らの予備試験で確認された。ｂＳＦＳ培地（血清およびインスリンを含まない培地に、先にＺｗｅｉｇｅｒｔらが決定したｐ３８阻害物質を５μＭ補充したもの）に、ＢＳＡ、Ｈｙ−Ｓｏｙ、脂質混合物またはイーストオレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を補充した。この強化培地は細胞の成長および活性を増強し、このプラットホームの細胞拡張倍率を有意に高め、かつ分化効率を改善して最高６０％の拍動性集合体を達成する。キャリア表面の細胞付着を改善するために、数種類の細胞外マトリックスを評価した（コートしないもの、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチンおよびｍａｔｒｉｇｅｌ）。最も効率的な分化結果は、キャリアをラミニンまたはフィブロネクチンでコートした場合に得られた（両方の場合とも最高７０％の拍動性集合体）。これらの結果は、スケール調節可能な心筋細胞産生プラットホームとしての三次元マイクロキャリア懸濁培養の使用を支持する。

【0408】

まとめると、本発明者らは、３Ｄマイクロキャリアは２Ｄコロニー培養に代わる簡単で安定かつ強力な代替法になりうることを証明した。マイクロキャリアはバイオリアクターにおけるの制御されたバイオプロセスとしてスケールアップしやすく、ｈＥＳＣの定方向分化も容易にするであろう。

【0409】

実施例１．ヒト胚性幹細胞の懸濁培養
未分化状態のｈＥＳＣの成長を支持する幾つかのタイプのマイクロキャリアの使用を証明する。主な所見を特に図１〜５に示す。

【0410】

ｈＥＳＣを３Ｄで成長させることができる下記の３クラスのマイクロキャリア（図１を参照）を試験した；すなわち：ロッド形セルロースマイクロキャリア（ＤＥ５２、ＤＥ５３およびＱ５３）；小型の球形 東ソー・親水性マイクロキャリア（１０および６５ミクロンの直径）；大型の球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質マイクロキャリア。

【0411】

図２は、マイクロキャリア培養のワークフローを示す。一般的な２Ｄコロニー培養物を２組の方法でマイクロキャリア上へ継代することができる；たとえば細胞スクレーパーもしくはピペットを用いる機械的解離、または酵素解離、たとえばコラゲナーゼ収穫したクランプもしくはｔｒｙｐＬＥ収穫した単一細胞。これらのマイクロキャリア培養物をさらに他のマイクロキャリア上へ機械的解離により、たとえばピペットを用いて、１００ミク
ロンもしくは５００ミクロンのふるいを通して、または酵素解離、たとえばコラゲナーゼもしくはｔｒｙｐＬＥ収穫したクランプにより、継代することができる。

【0412】

図３は、２Ｄコロニー培養からコロニー培養へ継代した場合の一般的な分割比率１：４〜１：５と比較して、はるかに高い１：１０を超える（極端な例では最高１：２６の比率）分割比率で、マイクロキャリア培養物を元の２Ｄコロニー培養へ移植し、またはマイクロキャリア上で連続継代しうることを示す。マイクロキャリア培養物は少なくとも１２継代、継代された（現在までに、細胞は１３継代、継代されている）。細胞数、生存率、多分化能性マーカーのフローサイトメトリー、組織学および核型に基づくこれらの培養物の特性分析を、２Ｄコロニー培養物と比較して以下の図に示す。培養細胞は胚様体に分化し、テラトーマを形成することができる。

【0413】

図４は、ｈＥＳＣの凍結のワークフローを示す。一般的な２Ｄコロニー培養物を凍結させ、その後これらの細胞を直接にマイクロキャリア上へ融解して接種する。得られる培養物は高い生存率を保持し、多分化能性マーカーを発現した。マイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣをマイクロキャリアと一緒に凍結することもできる。その後、融解すると、それらはマイクロキャリア培養として伝播し続けることができる。

【0414】

図５に示すように、ｈＥＳＣの成長速度、ならびに代謝、たとえばグルコースおよびグルタミンの消費、ラクテートおよびアンモニアの産生、ｐＨ、ならびにアミノ酸の消費／産生の測定を、フィーダー調整した培地を補充したマイクロキャリア培養において実施した。

【0415】

これらのパラメーターを２Ｄ対照コロニー培養と比較する。同様に、ｈＥＳＣの増強速度および代謝を２種類の市販の無血清培地ＳｔｅｍＰｒｏおよびｍＴｅＳＲ−１中で測定する。これらの培地は、より良好な成長を達成するために、主エネルギー源、たとえばグルコースおよびグルタミンの濃度を制御することによる再配合がより容易であり、これにより培養終了時の激しいｐＨ降下が抑えられる。現在までに、ｈＥＳＣはマイクロキャリア上においてこれら２種類の無血清培地中で、それらの多分化能性マーカーを保持した状態で５継代を超えて成長している。

【0416】

マイクロキャリア上の一般的なｍａｔｒｉｇｅｌコーティングのほか、ｈＥＳＣが付着して成長しうる他のコーティング、たとえばヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸も試験する。また、マイクロキャリア培養を１００および５００ｒｐｍで撹拌し、継代して、それらがそれらの多分化能性マーカーを保持しうるかを判定する。

【0417】

異なる電荷のマイクロキャリアＤＥ５２、ＤＥ５３およびＱ５３がすべて、ｈＥＳＣを成長させることができる。さらに、Ｃａｒｂｏｓｅｅｄ、ミクロ多孔質およびマクロ多孔質カーボンマイクロキャリアがｈＥＳＣの成長を支持することができる。

【0418】

異なる直径（１０および６５ミクロン）の球形親水性マイクロキャリア（東ソー）を種々の電荷でコートする。不死フィーダーとｈＥＳＣの共培養が多分化能性ｈＥＳＣの拡張を可能にすることも証明された。また、マイクロキャリア培養を５ｍｌ静止培養からより大きな５０ｍｌスピナー培養へスケールアップし、それらの成長速度を追跡する。

【0419】

実施例２．ヒト胚性幹細胞系およびヒトｉＰＳ細胞系
ヒト胚性幹細胞系ＨＥＳ−２（４６ Ｘ，Ｘ）およびＨＥＳ−３（４６ Ｘ，Ｘ）は、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得られる。細胞を２Ｄコロニー培養からから得た２００ｘ２００μｍの細胞クランプの懸濁液として、またはマイクロキャリア
培養から得た細胞−マイクロキャリア集合体として凍結し、液体窒素中に保存する。ヒトｉＰＳ細胞（ｉＭＲ９０）は、Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得られた。

【0420】

実施例３．マイクロキャリア：円筒形セルロースマイクロキャリア
ＤＥ−５２、ＤＥ−５３およびＱＡ−５２微粒状円筒形アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス（Ｗｈａｔｍａｎ）を、細胞伝播のためのマイクロキャリアとして用いる。

【0421】

ＤＥ−５２およびＤＥ−５３マイクロキャリアは、それぞれ乾燥材料のグラム当たり１および２ミリ当量の小さなイオン交換容量で第三級アミン（ＤＥＡＥ）を負荷されている。

【0422】

ＱＡ−５２マイクロキャリアは、乾燥材料のグラム当たり１ミリ当量の小さなイオン交換容量の第四級アミン（ＱＡＥ）を負荷されている。これらのマイクロキャリアを、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋を含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ＝７．２）で平衡化し、５ｇ／１００ｍｌのバッチで高圧蒸気滅菌する。

【0423】

２０ｍｇのマイクロキャリアを４ｍｌのｍａｔｒｉｇｅｌ溶液（１：３０希釈）中で４℃において一夜インキュベートすることにより、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアを調製する。陰電荷をもつポリマーによるマイクロキャリアのコーティングを、ポリマー溶液中で一夜のインキュベーション（４℃）により行なう。

【0424】

下記のポリマー溶液に対して２０ｍｇのマイクロキャリアを試験する。１ｍｌのウシガラス体液由来ヒアルロン酸０．５ｍｇ／ｍｌ溶液；１．５ｍｌの連鎖球菌由来ヒアルロン酸ナトリウム２ｍｇ／ｍｌ溶液；１ｍｌのウシ腎臓由来ヘパラン硫酸０．２５ｍｇ／ｍｌ；１ｍｌのブタ腸粘膜由来ヘパラン硫酸高速移動画分０．２５ｍｇ／ｍｌ；１．５ｍｌのデキストラン硫酸ナトリウム（ＭＷ＝５００，０００）；連鎖球菌由来のヒアルロン酸ナトリウム塩４１０ｍｇ／ｍｌ、希釈比１：１０、１：２０、１：４０および１：８０；ヘパリンナトリウム塩２００ｍｇ／ｍｌ、希釈比１：１０、１：２０、１：４０および１：８０；ならびにウシ気管由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム７．０９ｍｇ／ｍｌ、希釈比１：１０、１：２０、１：４０および１：８０。すべてのコーティング材料がＳｉｇｍａから購入される。

【0425】

実施例４．マイクロキャリア：誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリア
ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５ＰｗおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ，米国ペンシルベニア州モントゴメリービル）を、マイクロキャリア調製のベースとして用いる：不活性親水性ヒドロキシル化メタクリル系マトリックス、トレシル活性基、ならびにそれぞれ１０および６５μｍのビーズ直径をもつもの。

【0426】

ビーズへのタンパク質のカップリングを、製造業者の指示に従って行なう。種々の荷電度を形成するために、硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ３３６９）、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ１３９９またはＰ５８９９）を、０〜２０ｍｇ／ビーズｍｌの範囲の濃度でビーズにカップリングさせる。

【0427】

Ｍａｔｒｉｇｅｌを０．５ｍｌ／ビーズｍｌの濃度でビーズにカップリングさせる。カップリング後にビーズをＴｒｉｓ緩衝液でブロックする。ビーズの殺菌をガンマ線により行なう（７〜１０ｋＧｒｅｙｓ／ｈｒの線量で８分間の照射）。

【0428】

実施例５．マイクロキャリア：Ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア
ＳＭ１０１０（１ｍｍ）ミクロ多孔質およびＳＨ１０１０（１ｍｍ）マクロ多孔質、生体不活性、乱層構造（ｔｕｒｂｏｓｔｒａｔｉｃ）カーボンマイクロキャリア（Ｂｌｕｅ
Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ＧｍｂＨ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；およびＣｉｎｖｅｎｔｉｏｎ ＡＧ，Ｎａｎｏ−Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｒｈｅｉｎｇａｕｓｔｒ．１９０−１９６，６５２０３ Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をｈＥＳＣ培養に用いる。マイクロキャリアを７０％エタノールおよびＵＶ線により殺菌する。

【0429】

殺菌後、マイクロキャリアを無菌水と共にインキュベートし、これを１日１回交換してすべての脱落カーボン粒子を除去する。７日後、若干のマイクロキャリアは脱泡されたため沈降し、若干は浮遊しているであろう。沈降したマイクロキャリアをｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートし、２４ウェルプレート内でｈＥＳＣを接種する。

【0430】

すべてのマイクロキャリアをそれらの使用前に増殖培地で洗浄する。
実施例６．細胞培養：馴化培地（ＣＭ）
マウス胚性線維芽細胞で調整した培地（ＭＥＦ−ＣＭ）を調製するために、ゼラチン処理した培養皿に、１．４ｘ１０^５細胞ｃｍ^−２のマイトマイシン−Ｃ処理した不死化△Ｅ−ＭＥＦを、Ｆ−ＤＭＥＭ培地（９０％のＤＭＥＭ高グルコース；１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ならびに２５Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび２５μｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したもの，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中において、先の記載に従って接種する（Choo et al, 2006）。２４時間後、培地をＫＮＯＣＫＯＵＴ（ＫＯ）培地に交換する；これは８５％のＫＯ−ＤＭＥＭに、１５％のＫＯ血清代替物、１ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、ならびに０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび４〜８ｎｇ ｍｌ^−１の塩基性線維芽細胞成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したものを含んでいた。ＫＯ培地を皿に添加した後、２４時間毎にＣＭを採集する。ＣＭを濾過し（０．２２μｍ）、さらに８ｎｇ ｍｌ^−１の組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充する。

【0431】

実施例７．細胞培養：２Ｄコロニー培養
細胞を３７℃／５％ＣＯ_２において、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートした培養皿（４℃で一夜、冷ＫＯ−ＤＭＥＭ中に１：３０の希釈比で希釈したｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と共にインキュベートしたもの）上で培養する。１ｍｌの培地を含む臓器培養皿（ＯＣＤ）内で細胞をルーティンに維持する。２Ｄコロニー培養とマイクロキャリア培養を比較する実験を、５ｍｌの培地を含む６ウェル皿内で実施する。

【0432】

用いる培地は、ＭＥＦフィーダーからのＣＭ（前記）、ｈＥＳＣ用のＳｔｅｍＰｒｏ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｍＴｅＳＲ−１無血清培地（Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかである。培地を１日１回交換する。静止コロニー培養物を、コラゲナーゼ（Choo et al, 2004）もしくはｔｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる酵素処理により、またはＳｔｅｍＰｒｏ ＥＺＰａｓｓａｇｅ幹細胞継代ツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる機械的剥離により、週１回継代する。

【0433】

実施例８．細胞培養：３Ｄマイクロキャリア培養
分散２Ｄコロニー培養から得た、または液体窒素保存（２Ｄコロニー培養から得た２００ｘ２００μｍの組織、または細胞−マイクロキャリア集合体として）から直接得た細胞懸濁液を、０．１〜０．３ｘ１０^６／ｍｌの濃度でマイクロキャリア懸濁液（４ｍｇ／ｍｌ）に接種する。

【0434】

ある態様においては、より均一な培養を確実にするために、細胞接種物をマイクロキャリア懸濁液に添加する前に１００および５００μｍメッシュのふるいでふるい分けする。細胞を３７oＣ／５％ ＣＯ_２において、非付着型の６ウェル皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で
、静止状態または１００もしくは５００ｒｐｍの撹拌状態で（ＩＫＡ Ｏｒｂｉｔａｌ Ｓｈａｋｅｒ）培養する。用いる培地はＭＥＦ−ＣＭまたは規定培地である。培地を１日１回交換する。

【0435】

コラゲナーゼもしくはｔｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓを用いる酵素処理の後、または反復ピペッティングによる機械的解離の後、培養物を分割比率１：２〜１：１０で週１回継代する。マイクロキャリア培養から２Ｄコロニー培養への再播種は、集密状態の細胞−マイクロキャリア集合体を、８ｍｌの培地を含むｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍの組織培養ペトリ皿上に置き、７日間培養することにより行なう。

【0436】

別途記載しない限り、すべてのマイクロキャリア培養および２Ｄコロニー培養が、表面にｍａｔｒｉｇｅｌコーティングをもち、６ウェルプレート内で５ｍｌの培地を１日１回交換して実施される。

【0437】

実施例９．成長速度、代謝および倍増時間
マイクロキャリアに付着した細胞を核計数法で計数することにより、細胞の成長をモニターする。ｈＥＳＣ培養物（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで処理し、４０ミクロンメッシュのスクリーンに通した後のもの）の単一細胞懸濁液を、細胞生存率（トリパンブルー排除法）の測定およびフローサイトメトリー分析に用いる。

【0438】

指数成長期の比成長速度を推定するために、細胞数−対−時間のグラフをプロットする。これから次の方程式を用いて倍増時間（ｔ_ｄ）を計算する：ｔ_ｄ＝ｌｎ（２）／μ；式中のμは比成長速度（ｈｒ^−１）である。細胞の代謝をモニターするために、上清試料についてグルコース、グルタミン、ラクテートおよびアンモニアの濃度（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ １００ Ｐｌｕｓ）、アミノ酸濃度（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ）、ならびにｐＨを、１日１回測定する。

【0439】

実施例１０．フローサイトメトリー
ｈＥＳＣ集団における細胞外抗原ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、および細胞内転写因子Ｏｃｔ−４の発現レベルを、フローサイトメトリーを用いて免疫蛍光により評価する。トリプシンまたはｔｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓを用いて細胞を単一細胞懸濁液として収穫し、４０μｍのふるい（ＢＤ）により濾過し、固定し、透過処理し（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、下記に対する一次抗体と共にインキュベートする：ＳＳＥＡ−４（１：１希釈、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｂａｎｋ，ＭＣ−８１３−７０）、ＴＲＡ−１−６０（１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＭＡＢ４３６０／４３８１）およびＯｃｔ−４（１：２０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。

【0440】

次いで細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、１：５００希釈したＦＩＴＣ共役型ヤギα−マウス抗体（ＤＡＫＯ）と共に暗所でインキュベートする。インキュベーションの後、細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）での分析のために１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。すべてのインキュベーションを室温で１５分間実施する。

【0441】

実施例１１．インビトロ分化
インビトロでｈＥＳＣの分化を誘導するために、ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３細胞をク
ランプとして収穫し、胚様体（ＥＢ）として８日間、ＥＢ培地（８０％のＫＯ−ＤＭＥＭ、２０％のＦＣＳ、２５Ｕ／ｍｌのペニシリン、２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、および０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール）中において非付着型懸濁培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養する。

【0442】

続いて、ＥＢをトリプシンで解離させ、ゼラチン処理した培養皿上においてＥＢ培養中でさらに１４日間平板培養する。
実施例１２．ＲＮＡの分離および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｈＥＳＣからＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌから）を用いて全ＲＮＡを分離し、紫外線分光光度法（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）により定量する。１μｇの全ＲＮＡについて、オリゴｄＴプライマーおよびＩｍＰｒｏｍ ＩＩ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて標準的な逆転写反応を実施する。

【0443】

３胚葉由来の分化マーカーであるアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アミラーゼ、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）、ケラチン−１５、心神経冠誘導体１（ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ １）（ＨＡＮＤ１）およびＭｓｈホメオボックスホモログ１（ＭＳＸ１）に対して特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する。増幅のために用いたサイクリングパラメーターは、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の、３０サイクルである。７２℃で１０分間の最終延長がこれに続く。

【0444】

増幅生成物を１％アガロースゲル上において臭化エチジウムで染色して視覚化する。
実施例１３．ＳＣＩＤマウスモデル
２Ｄ培養物、再平板培養物、または３Ｄマイクロキャリア集合体のいずれかからの４００〜５００万の細胞を機械的解離により収穫し、ＰＢＳに再懸濁し、無菌２２Ｇ注射針で４週令の雌ＳＣＩＤマウスの後足筋肉内へ注射する。

【0445】

注射後９〜１０週目に腫瘍を発生した動物を屠殺し、腫瘍を切除し、１０％ホルマリン中に固定する。腫瘍をパラフィンに埋め込み、薄切し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色後に組織学的に検査する。

【0446】

実施例１４．核型判定
１ｍｌのＫＯ−培地中に希釈したコルセミド溶液と共に３７℃／５％ ＣＯ_２で１５〜１６時間のインキュベーションにより、活発に成長しているｈＥＳＣ培養を分裂中期段階で停止させる。細胞遺伝学的分析をｔｈｅ ＫＫ Ｗｏｍｅｎ’ｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（シンガポール）に外注する。

【0447】

実施例１５．スピナー培養
シリコーン処理した（Ｓｉｇｍａｃｏｔｅ，ＳＬ２ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１００ｍｌ Ｂｅｌｌｃｏ スピナーフラスコに、ｈＥＳＣを３ｘ１０^５細胞／ｍｌの密度で５ｍｇ／ｍｌのマイクロキャリアに、初期体積２５ｍｌで、撹拌せずに、３７℃および５％ ＣＯ_２の制御インキュベーター内で接種する。

【0448】

反応器内の体積を新鮮な馴化培地で５０ｍｌに増大させ、接種後１２時間、３０ｒｐｍで撹拌する。消費された培地の８０％を１日１回取り出し、新鮮な馴化培地と交換する。細胞計数および代謝産物分析のために試料を１日１回採取する。

【0449】

実施例１６．ｈＥＳＣ培養物の接種、継代および品質管理
マイクロキャリアに接種した２Ｄコロニー培養物は多分化能性マーカーを発現し、高い
生存率を示した（データは示していない）；これを続いてマイクロキャリア上へ継代する。１００または５００ミクロンのふるいを通し、そしてマイクロキャリア上に再接種したｈＥＳＣ（ＨＥＳ−３細胞系）マイクロキャリア培養物は、７日間の培養後、多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の高い発現を保持する。

【0450】

図６Ａは、１００ミクロンふるい処理についてのマーカーの発現を示す。同様に、ピペッティングにより機械的に解離させ、続いて１：１０希釈で新たなマイクロキャリア上に接種したマイクロキャリア上のｈＥＳＣも、７日間の培養後、多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の高い発現を示す（図６Ｂ）。

【0451】

ＴｒｙｐＬＥによるマイクロキャリアからのｈＥＳＣの酵素解離は、対照２Ｄコロニー培養と類似レベルのＯｃｔ−４発現（約６０％）ならびに高レベルのＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現を７日間の培養後に示し、６ウェルプレートのウェル当たり約４００万細胞／ｍｌを達成する（図６Ｃおよび図６Ｄ）。両方法により継代した細胞の生存率は＞９０％である（データは示していない）。

【0452】

７日後のマイクロキャリアの目視観察は、ｈＥＳＣが大きなクラスターの集合体を形成していることを示す。図７Ａに２つの異なる倍率で示したこれらの集合体中に分化した嚢胞性（ｃｙｓｔｉｃ）領域がないことに注目されたい。７日後の一般的な対照２Ｄコロニー培養物を左に示し、プレートが完全に覆われていることが示される（図７Ａ）。

【0453】

図７Ｂは、ｈＥＳＣが１日目に効率的に付着し、６日後に拡散してセルロースマイクロキャリアをコロニー化していることを２種類の倍率で示す。
図８Ａはおよび図８Ｂは、多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０がそれぞれ継代５および９で８０％〜９０％以上発現していることを、マイクロキャリア上で成長させたｈＥＳＣについて示し、この新規なプラットホーム上での培養が安定であることが示される。

【0454】

図８Ｃ、図８Ｄおよび図８Ｅは、マイクロキャリア上で継代したｈＥＳＣの他の一連の反復実験を示し、それらが２Ｄコロニー対照培養と比較して継代４および６で多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０を安定に発現していることを指摘する（すべてのマーカーについて＞８０〜９０％）。一般に、６ウェルプレート当たり達成された細胞総数は、２Ｄコロニー対照培養におけるわずか２００〜４００万／ウェルと比較してマイクロキャリア培養においては７００〜８００万／ウェルである。

【0455】

図９のマイクロキャリア培養物の組織学的分析は、ｈＥＳＣがセルロースビーズ（位相差において暗い物体）の周りで成長していることを示す。ＤＡＰＩ（青色）は細胞の核を染色し、一方、多分化能性表面マーカーＴＲＡ−１−６０（赤色）がマイクロキャリア上のｈＥＳＣにより発現している。最初の２列はｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアおよびＭＥＦ−ＣＭ上で成長したｈＥＳＣを示し、この場合、細胞はマイクロキャリアの周りに良好に分布し、ＴＲＡ−１−６０を強く発現している；最後の２列はｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないそのままのマイクロキャリア上でＭＥＦ−ＣＭ培地中において成長したｈＥＳＣを示し、この場合、ＴＲＡ−１−６０の発現の強さはより低い。

【0456】

図１０Ａは、ｈＥＳＣをマイクロキャリアから２Ｄコロニー培養へ再播種して、多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の高発現レベルを保持しうることを示す（＞９５％）。マイクロキャリアからの細胞が拡散して表面にコロニー形成し、ｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍ組織培養ペトリ皿上で２０００万細胞を達成した（図１０Ｂ）。

【0457】

実施例１７．ｈＥＳＣ培養物の凍結
図１１Ａは、凍結ｈＥＳＣコロニーをマイクロキャリア上へ直接融解することができ、これが細胞を速やかに捕獲することを示す。７日後、細胞は高レベルのＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳを発現し、６ウェルプレートのウェル当たり５ｍｌ中で約４２０細胞に達する。

【0458】

あるいは、ｈＥＳＣをマイクロキャリア上で凍結し、かつ融解することができる。この場合、融解後の部分的な細胞死のためｈＥＳＣをより長期間培養した（１４日間）後、それらは正常な成長を回復する。図１１Ｂに示すように、ｈＥＳＣは同様に高レベルのＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０を発現し、６ウェルプレートのウェル当たり５ｍｌ中で約７００万細胞に達する。

【0459】

実施例１８．Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地および規定培地における成長速度および代謝
ｈＥＳＣを６７万細胞／ウェルで、培地５ｍｌ中に２０ｍｇ／ｍｌのマイクロキャリアを入れた６ウェルプレートに接種する。対照２Ｄコロニー培養にも同じ細胞数で接種する。

【0460】

図１２に示すように、表面限界のため５日目にウェル当たり約４００万細胞のピークに達し、６日目にはウェル当たり３００万細胞に低下した２Ｄコロニー対照と比較して、マイクロキャリア培養物は指数速度で成長して６ウェルプレートのウェル当たり８００万細胞以上に達した。ｐＨプロフィールは、両培養とも６または７日目までに約６．５への低下を示すが、この低下は２Ｄコロニー対照培養の方がより激しい。

【0461】

図１３は、グルタミンおよびグルコースの消費プロフィールがマイクロキャリア培養と２Ｄコロニー培養について実質的に等しいこと、および両培養についてラクテートおよびアンモニアの産生プロフィールも同様であることを示す。

【0462】

しかし、グルタミンおよびグルコースの比消費率は、２Ｄコロニー培養と比較してマイクロキャリア培養においてはるかに低く（約半分）、これはマイクロキャリア培養における、より効率的な代謝を指摘する。同様に、図１４に示すように、マイクロキャリア培養におけるラクテートおよびアンモニアなど老廃物の比産生率は２Ｄコロニー培養と比較してはるかに低い。

【0463】

図１５は、マイクロキャリア培養が指数速度で成長してウェル当たり８００万細胞以上に達することを、２Ｄ対照培養と比較して（この場合はウェル当たり２００万細胞に達したにすぎない）確認する反復実験である。成長速度は、マイクロキャリアに２Ｄコロニー培養から接種するか、あるいは他のマイクロキャリア培養から接種するかにかかわらず、同等である。倍増時間は３３時間であり、これは普通の対照培養に類似する。この場合、２Ｄコロニー培養はより長い５８時間の倍増時間に達した。ｐＨプロフィールは、これら３条件について傾向がきわめて類似し、５日目後にｐＨ６．６への急激な低下を伴う（特に２Ｄコロニー培養について）ことを示す。

【0464】

図１６に示すように、最初の２日間を除いて、グルタミンおよびグルコースの消費プロフィールはマイクロキャリアと２Ｄコロニー培養についてきわめて類似し、両培養についてラクテートおよびアンモニアの産生プロフィールも同様である。

【0465】

先の実験と同様に、グルタミンおよびグルコースの比消費率は、２Ｄコロニー培養と比較してマイクロキャリア培養においてはるかに低く、これはマイクロキャリア培養における、より効率的な代謝を指摘する。

【0466】

図１７は、最初の３日間を除いて、グルコースおよびグルタミンの消費が、２Ｄコロニー培養から接種したマイクロキャリア培養についてマイクロキャリア培養から接種したマイクロキャリア培養よりわずかに高いように思われることを示す。ラクテートおよびアンモニアなど老廃物の比産生率も、特に５日目後、２Ｄコロニー培養と比較してマイクロキャリア培養においてより低い。アミノ酸プロフィールの分析は、グルタミン、アルギニン、セリン、シスチン、バリン、メチオニン、リジン、イソロイシン、ロイシン、およびフェニルアラニンが消費され、これに対しプロリン、グルタミン酸およびアラニンがｈＥＳＣにより産生されることを示す（データは示していない）。

【0467】

図１８は、マイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣが、多分化能性マーカー、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０を、ＳｔｅｍＰｒｏについては継代５で、ｍＴｅＳＲ−１については継代４で発現し続けることを示す；これらは両方とも市販の無血清規定培地である。成長速度、グルコース、グルタミン、ラクテート、アンモニア、およびアミノ酸の代謝を、これら２種類の培地について測定する。

【0468】

実施例１９．キャリアのコーティング（ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸など）。
５種類の特定のコーティングを、ｈＥＳＣ成長のための標準的なコーティングｍａｔｒｉｇｅｌと比較した代替物として試験する。これらは、２種類のヘパラン硫酸源：ウシ腎臓由来のものおよびブタ由来の高速移動画分、２種類のヒアルロン酸源：ウシガラス体液由来のものおよび連鎖球菌由来のもの、ならびにデキストラン硫酸である。

【0469】

他の２つの陰性対照、すなわちＭＥＦ−ＣＭおよびＫＯ培地でコートしたマイクロキャリアも比較する。
図１９に示す最初の結果は、ヒアルロン酸がｍａｔｒｉｇｅｌに対する最も有望な代替物であるけれどもｍａｔｒｉｇｅｌは７日間の成長後になおより高い細胞数を可能にすることを示す。ｈＥＳＣはこれらの特定のコーティング上で３種類の多分化能性マーカーを発現し続ける（データは示していない）。

【0470】

表Ｅ１は、マイクロキャリア上の３タイプのコーティング（コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸およびヒアルロン酸）がｈＥＳＣの成長を支持し、ウェル当たり１．２×１０^６細胞を達成しうることを示す；これらは、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ（ＫＯ）血清代替物またはＭＥＦ−ＣＭのみでコートした対照（これらはウェル当たり約０．４×１０^６細胞を達成した）より良好である。これは、図１９に示すウェル当たり２×１０^６細胞に達したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアに匹敵する。

【0471】

【表1】

[この文献は図面を表示できません]

【0472】

表Ｅ１．キャリアのコーティング；ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸；対照：ＫＯ＝４．３ Ｅ５細胞／ウェル；ＣＭ＝４．４ Ｅ５細胞／ウェル。ｈＥＳＣの成長を支持しうる、マイクロキャリア上の３タイプのコーティング、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸およびヒアルロン酸は、ウェル当たり５０〜１２Ｏ万細胞を達成した。Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ（ＫＯ）血清代替物または馴化培地（ＣＭ）のみでコートした対照は、ウェル当たり５０万細胞未満を達成した。

【0473】

マイクロキャリアを他の細胞外マトリックス、たとえばコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンでコートし、前記の実験を反復する。
実施例２０．１００および１５０ｒｐｍにおける撹拌
同様に、ｈＥＳＣをマイクロキャリア上で６ウェルプレート内において培養し、１００および１５０ｒｐｍで撹拌する。マイクロキャリアは、１００ｒｐｍで１日目に互いに集合し、６日目に種々のサイズのクランプを形成する；嚢胞性領域は見られず、ｈＥＳＣが多分化能性のままであることが示される（図２０）。

【0474】

Ｏｃｔ−４発現は、それぞれ図２１Ａおよび図２１Ｂにおいて、１００および１５０ｒｐｍで５６％および６８％にまで部分的にダウンレギュレーションされるが、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０は継代１において両方の条件で高度に発現し続ける。

【0475】

図２２において、マイクロキャリアは１５０ｒｐｍで１日目にはより緻密なクランプとして互いに集合し、６日目にはより小さなクランプとして成長し続ける（１００ｒｐｍのマイクロキャリア培養と比較して）；嚢胞性領域は見られず、ｈＥＳＣが多分化能性のままであることが示される。図２３に示すように、１５０ｒｐｍ培養では継代１と比較して継代２において、Ｏｃｔ−４発現は５７．５％で部分的にダウンレギュレーションされ、表面マーカーＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０を発現する細胞集団のパーセントはそれぞれ７５％および７０％で、より低い。それにもかかわらず、ｈＥＳＣはこの撹拌速度で成長することができる。

【0476】

図２４は、第２の細胞系（ＨＥＳ−２）のＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、継代２の静止培養および１５０ｒｐｍ培養で成長させたマイクロキャリアについて類似することを示す。図２５は、７継代の連続継代中におけるＨＥＳ−２細胞系の細胞総数を、対照２Ｄコロニー培養、静止、１００ｒｐｍおよび１５０ｒｐｍ条件におけるマイクロキャリアにおいて示す。対照２Ｄコロニー培養において成長したｈＥＳＣは、ルーティン
にウェル当たり２００〜３００万細胞を達成した。

【0477】

静止マイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣはウェル当たり最高で６００万細胞を達成できたのに対し、１００ｒｐｍで撹拌したｈＥＳＣはウェル当たり最高で８００万細胞を達成できた。１５０ｒｐｍでは成長が最適ではなく、細胞は５週目を超えて継代することができなかった。図２６Ａ、図２６Ｂおよび図２６Ｃは、静止マイクロキャリアおよび１００ｒｐｍ条件で撹拌したマイクロキャリアにおける多分化能性マーカーＯｃｔ−４（４２〜５０％）、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０（両方とも９０％を超える）の発現レベルが安定であり、２Ｄコロニー対照培養にきわめて類似したレベルに保持されることを、継代５のＨＥＳ−２系について示す。

【0478】

実施例２１．キャリアの電荷−ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｑ５３
ＤＥ５３は、別途記載しない限り、すべての実験にルーティンに用いるマイクロキャリア上の電荷である。第三級アミンの低電荷（ＤＥ５２）、高電荷（ＤＥ５３）、および第四級アミンの高電荷（ＱＡ５２）のセルロースマイクロキャリアを、それらがｈＥＳＣの培養を支持する能力について試験し、表Ｅ２に示すように本質的にそれらはすべての電荷で同等な細胞数を達成しうることを示す。

【0479】

下記の表Ｅ２は、それらがｈＥＳＣの培養を支持する能力について試験した低、中および高電荷のセルロースマイクロキャリアは、本質的に同等な細胞数をすべての電荷で達成しうることを示す。意外にも、継代２において、より高く荷電したマイクロキャリアＱＡ５２は１３００万細胞を上回る異常に高い細胞数を達成した。ＤＥ５３は別途記載しない限り、すべての実験にルーティンに用いるマイクロキャリア上の電荷である。

【0480】

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【0481】

表Ｅ２．７日目の細胞数。注釈：セルロースマイクロキャリア上、Ｐ０およびＰ１についての接種密度８Ｅ５細胞／ウェル。３種類の電荷のセルロースマイクロキャリアを３継代、連続継代し、ｈＥＳＣがウェル当たり２６０〜１３４０万細胞の細胞数を達成するこ
とが示される。

【0482】

継代２において、より高荷電のマイクロキャリアＱＡ５２は、ウェル当たり１３００万細胞を上回る高い細胞数を達成した。図２７Ａ、図２７Ｂおよび図２７Ｃに示すように、継代３において、低、中および高電荷のセルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣについて、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現は継続して安定であり、同等である。

【0483】

実施例２２．キャリアのサイズおよび形状−球形カーボンおよび東ソー・ビーズ（種々の直径）
５および７日目について、ＤＡＰＩ核染色およびＴＲＡ−１−６０多分化能性マーカーにより示すように、ミクロ多孔質（ＳＭ１０１０）カーボンマイクロキャリアは表面にｈＥＳＣを付着させ、成長させることができる；図２８Ａおよび図２８Ｂに示す。

【0484】

図２９は、２５万細胞の細胞数を達成した対照２Ｄコロニー培養と比較して、フィブロネクチンでコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリアがより高いウェル当たり３０万細胞の細胞数を達成したことを示す。

【0485】

位相差で視覚化した、およびＤＡＰＩまたはＴＲＡ−１−６０で染色した、３、５および７日目のカーボンマイクロキャリアを、図３０、図３１および図３２に示す；ｈＥＳＣはフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質マイクロキャリア上に後日の方がより均一に拡散し、マイクロキャリアを互いに集合させることが指摘される。

【0486】

フィブロネクチンコートしたカーボンマイクロキャリアから７日目に収穫したｈＥＳＣの３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＳＳＥＡ−４（すべて９０％を超える発現）のＦＡＣＳプロフィールを図３３に示す。

【0487】

第２のｈＥＳＣ細胞系ＨＥＳ２もフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で成長し、２Ｄコロニー対照と類似の細胞数を達成し（図３４Ａ）、９５％を超える高い生存率を維持する。両条件からの細胞が約８０％の類似レベルのＯｃｔ−４を発現し続ける（図３４Ｂ）。

【0488】

Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア（ＳＨ１０１０）は２Ｄコロニー対照と類似の細胞数を達成できるのに対し、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア（ＳＭ１０１０）は同様な性能を示さなかった（図３５）。

【0489】

図３６は、ＳＨ１０１０マイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣが７日後になお多分化能性であることを示す；９０％を超える集団が多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０を発現していたからである。

【0490】

図３７は、ｈＥＳＣがＳＨ１０１０マイクロキャリアの大部分の表面領域を覆ったのに対し、表示ＳＭ１０１０をもつマイクロキャリアについては付着した細胞がより少ないことを示す。

【0491】

図３８は、ＳＨ１０１０マイクロキャリア上で１５日間培養したｈＥＳＣが、７日間成長させた２Ｄコロニー対照培養と類似の細胞数を達成したことを示す。
図３９は、Ｏｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０多分化能性マーカーが接種後１５日間発現し続けることを示す。

【0492】

図４０は、マイクロキャリア培養の供給を２倍体積のＭＥＦ−ＣＭで増加させると、１倍体積を供給したマイクロキャリアと比較して細胞数がわずかに増加したことを示す。
図４１は、ビーズ上で２倍体積のＭＥＦ−ＣＭを供給して培養したｈＥＳＣによる多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現が９０％を超えることを示す。

【0493】

図４２は、ＤＡＰＩ、ファロイジンおよびＴＲＡ−１−６０染色により指摘されるように、ｈＥＳＣがマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上に良好に分布していることを示す。

【0494】

図４３Ａおよび４３Ｂは、第２細胞系ＨＥＳ２を用いた反復実験を示す；これも同様にＳＨ１０１０マクロ多孔質マイクロキャリア上での培養に成功し、ウェル当たり約６５〜７０万細胞の２Ｄコロニー対照と類似する細胞数を達成した。

【0495】

図４４は、ＨＥＳ−２の多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現がＳＨ１０１０マイクロキャリア上で７日間の培養後になお高いことを示す。
図４５は、ＨＥＳ−２ ＧＦＰ細胞が１日目から７日目までマイクロキャリア上に均一に拡散することを示す。図４６Ａに示すように、ｈＥＳＣを接種したマクロ多孔質マイクロキャリアは、高速混合（３０分毎）および低速混合（２時間毎）でｈＥＳＣの成長をウェル当たり約６０〜８０万細胞に到達させることができる；これは２Ｄコロニー対照により７日後に達成されたウェル当たり約１２００万細胞より低い。

【0496】

しかし、培養をマイクロキャリア上で１２日間まで延長すると、細胞数をウェル当たり約１２００万細胞に到達させることができた。図４６Ｂに示すように、多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０もマイクロキャリアについて対照と対比して８５％以上、安定であるように思われる。

【0497】

前記の実験を親水性の東ソー・マイクロキャリア上で成長しているｈＥＳＣについて実施し、関連データを測定する。
実施例２３．マイクロキャリア上での共培養およびフィーダー
図４７Ａは、静止培養における、ｈＥＳＣを接種したセルロースマイクロキャリア間にあるフィーダーを含む球形Ｃｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアを示し、一方、図４７Ｂは、ｈＥＳＣを接種したセルロースマイクロキャリア間にあるフィーダーを含むポリリジンコートした東ソー・マイクロキャリアを示す。

【0498】

図４８Ａおよび図４８Ｂは、３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０が、それぞれＣｙｔｏｄｅｘおよびポリリジンコートした東ソー両方のマイクロキャリア共培養において培養したｈＥＳＣによって高発現することを示す。表Ｅ３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ、ポリリジンコートした東ソー、およびＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダーと、ＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣとの３種類の共培養方法において達成された細胞数が、７日後にウェル当たり２６０〜５５０万細胞の範囲にあることを示す。これらの数値は、一般にウェル当たり２００万細胞を達成する２Ｄコロニー培養より高い。

【0499】

下記の表Ｅ３は、３種類の共培養方法で達成された細胞数が７日後に２６０〜５５０万細胞の範囲にあることを示す。

【0500】

【表3】

[この文献は図面を表示できません]

【0501】

表Ｅ３．３種類の異なるマイクロキャリア上のフィーダーとセルロースＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養；７日後の細胞数について。対照２Ｄコロニー培養＝２×１０^６細胞／ウェル。３種類の異なるマイクロキャリア上のフィーダーとセルロースＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養。細胞数は７日後にウェル当たり２６０〜５５０万細胞の範囲にあった。

【0502】

実施例２４．スピナー培養
図４９は、５０ｍｌスピナー培養で、ｈＥＳＣがセルロースマイクロキャリア上において指数速度で成長し、３０万細胞／ｍｌを接種した５日後に３６０万細胞／ｍｌに達したことを示す；これは、１７０万細胞／ｍｌに達した静止マイクロキャリア培養、および９０万細胞／ｍｌに達したにすぎない２Ｄコロニー対照より、有意に高い。

【0503】

実施例２５．核型
図５０は、細胞系ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３の両方がマイクロキャリア培養において、約２４の集団倍増と同等の連続６継代後に、正常な核型をもつことを示す。

【0504】

実施例２６．ＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養のための、東ソー、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＤＥ５３マイクロキャリア上へのフィーダーの接種
不活性化したフィーダー（ＭＥＦ）を、まず東ソー、Ｃｙｔｏｄｅｘ １またはＤＥ５３マイクロキャリア上へ接種した。２４時間後、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上のｈＥＳＣを、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭにＫｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物、グルタミン、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸原液および塩基性ＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したものからなる増殖培地中での培養に導入した。

【0505】

マイクロキャリア培養に接種するための細胞は、集密状態のｍａｔｒｉｇｅｌコート組織培養プレートから採取され、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ＥＺＰａｓｓａｇｅ（商標）ツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて収穫された。マイクロキャリア培養に１〜３×１０^５細胞／ｍｌの細胞濃度で接種した。

【0506】

実施例２７．Ｃｙｔｏｄｅｘ １、３およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリアの調製
Ｃｙｔｏｄｅｘ １および３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ならびにＨｉｌｌｅｘ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を製造業者のプロトコルに従って調製した；これは、水和、すすぎ、および高圧蒸気滅菌によるマイクロキャリアの殺菌からなっていた。ｍａｔｒｉｇｅｌによるコーティングは、ＤＥ５３セルロースマイクロキャリアの場合と同じ方法で実施された。５ｍｇのマイクロキャリアを、ｍａｔｒｉｇｅｌ原液３３μｌを含有するＫＯ培地１ｍｌでコートした。コートしていないマイクロキャリアおよびｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアの両方の培養に、１〜３×１０^５細胞／ｍｌの細胞濃度で接種した。

【0507】

実施例２８．ＤＥ５３およびＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上の細胞外マトリックス（ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、１型、４型コラーゲン、ラミニン）のコーティング
セルロースマイクロキャリア上の細胞外マトリックス（ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸）のコーティングはこれらの条件に従った：
ヘパリン：０．４４ｍｇヘパリン／ｍｇ ＤＥ５３（１：１０希釈と同等）
コンドロイチン：０．９１ｍｇコンドロイチン／ｍｇ ＤＥ５３（１：１０希釈と同等）
ヒアルロン酸：０．０１６ｍｇヒアルロン酸／ｍｇ ＤＥ５３（１：１０希釈と同等）
他の細胞外マトリックスと組み合わせてヒアルロン酸およびヘパリンでコートしたマイクロキャリアについては、下記の条件を用いた：
フィブロネクチン：２０μｇ／ｍｇ ＤＥ５３
ラミニン：２μｇ／ｍｇ ＤＥ５３
Ｉ型コラーゲン：２０μｇ／ｍｇ ＤＥ５３
ＩＶ型コラーゲン：２０μｇ／ｍｇ ＤＥ５３
Ｃｙｔｏｄｅｘ ３実験については、下記のコーティング濃度を用いた：
ラミニン：２〜４μｇ／ｍｇ Ｃｙｔｏｄｅｘ ３
フィブロネクチン：２０μｇ／ｍｇ Ｃｙｔｏｄｅｘ ３
実施例２９．ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの継代２３までの連続継代
図５１は、２３継代、継代したセルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣが、２Ｄコロニー培養において成長したｈＥＳＣの成長速度より高いそれらの成長速度を保持することを示す。一般に、マイクロキャリア培養における継代に際しての分割比率は１：１０であり、２Ｄコロニー培養については１：４である。したがって、２３回目の継代までに、マイクロキャリア培養において達成できる細胞総数に１０ ｌｏｇの差が生じる。図５２は、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、それぞれ９４０万および７１０万細胞／ウェルの高い細胞密度をもつ継代１５および１６で、安定な状態を維持することを示す。図５３はさらに、継代２１〜２３、および２Ｄコロニー培養上へ再播種した場合の、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現を示し、これらのマーカーの発現は高くかつ安定な状態を維持する。

【0508】

実施例３０．セルロースマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの特性分析（核型判定、胚様体のＲＴ−ＰＣＲ、およびテラトーマ形成）
図５４は、ＨＥＳ−３のマイクロキャリア培養が継代２２および２５に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。図５５は、ＨＥＳ−２のマイクロキャリア培養も継代１４に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。継代３および２７のマイクロキャリア培養からのｈＥＳＣを胚様体に分化させると、それらは内胚葉（アミラーゼおよびＧＡＴＡ６）、外胚葉（ケラチンおよびニューロフィラメントＮＦ）および中胚葉（ＭＳＸ１およびＨＡＮＤ１）の遺伝子により表わされる３胚葉の細胞を形成することができた；図５６を参照。図５７に示すように、３胚葉の細胞についてテラトーマも
形成された。

【0509】

実施例３１．アミノ酸代謝データを含むｈＥＳＣの無血清培地セルロースマイクロキャリア培養
図５８は、２種類の無血清培地ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣのマイクロキャリア培養を示す；２．７×１０^５細胞の接種後、細胞数はそれぞれ２００万および１５０万に達した。ｐＨが約６．７に低下したことは７日間にわたる活発な細胞成長を指摘する。図５９は、ｍＴｅＳＲ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｔｅｍＰＲＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）マイクロキャリア培養の成長速度および倍増時間を比較する。ｍＴｅＳＲ１は、ＳｔｅｍＰＲＯの４９時間と対比して２５時間のより速やかな倍増時間をもつことが観察された。図６０は、２種類の無血清培地についてグルコースおよびグルタミンの消費ならびにラクテートおよびアンモニア産生の代謝を比較する。グルコースおよびグルタミンの比消費率ならびにアンモニアの比産生率は２種類の培地について類似するように思われる；ただし、ＳｔｅｍＰＲＯ培地中のＧｌｕｔａｍａｘからグルタミンが産生する初期を除く。しかし、ラクテート産生率はＳｔｅｍＰＲＯマイクロキャリア培養と比較してｍＴｅＳＲ１の場合の方が高い（図６１）。ナトリウムイオンおよびカリウムイオンも増加し、これは消費済み培地のオスモル濃度増大に関与し、ｍＴｅＳＲ１はより高いオスモル濃度をもつ（図６２）。

【0510】

表１に、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯの両方の培地中で消費されたアミノ酸および産生されたアミノ酸をまとめる。消費されたアミノ酸は、アルギニン、シスチン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびセリンであった。産生されたものは、アラニン、グルタミン酸およびプロリンであり、一方、残りは有意に変化しなかった。表２は、それぞれＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中でｈＥＳＣにより消費および産生されたアミノ酸の個々のレベルに関するより詳細な情報を提示する。このデータにより、アルギニン、シスチン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびセリンが最も有意に消費され、アラニン、グルタミン酸およびプロリンが最も有意に産生されたアミノ酸であることが確認される。図６３は、ＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中での３日間にわたる２０種類のアミノ酸の濃度変化を示し、これから個々のアミノ酸の比消費率を計算することができ、それらを図６４ａおよび図６４ｂに示す。これから分かるように、意外にも大部分のアミノ酸はこれら２種類の培地中で消費されにくい。

【0511】

図６５は、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中でのマイクロキャリア培養の反復実験を示し、両培地とも７日間の終了時に１００万細胞の類似の細胞数に達した。ｍＴｅＳＲ１におけるｐＨ低下はＳｔｅｍＰＲＯ培地より低い点まで達するように思われる。図６６は、マイクロキャリア培養においてｍＴｅＳＲ１がＳｔｅｍＰＲＯ培地（３５時間）と比較してより速やかな２３時間の倍増時間をもつことを確認する。

【0512】

実施例３２．２種類のｈＥＳＣ細胞系のスピナーフラスコ、セルロースマイクロキャリア培養
図６７は、ＨＥＳ−３細胞系の２回目のスピナーフラスコ培養を示し、この場合も１回目のスピナーフラスコ実験に匹敵する約３５０万細胞／ｍｌの細胞密度を７日目までに達成することができる。この場合も、これらの細胞密度は静止マイクロキャリア培養および２Ｄコロニー培養より有意に高い。図６８は、２回目のスピナーフラスコ培養について、グルコースおよびグルタミンの消費ならびにラクテートおよびアンモニアの産生を示す。これらの濃度をグルコースおよびグルタミンの体積消費率および比消費率、ならびにラクテートおよびアンモニアの体積産生率および比産生率に換算し、図６９に示す。図７０は、馴化培地を供給する前と後の各日の急激なｐＨ低下を示し、各日のオスモル濃度の上昇も示す。図７１は、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が
３および４日目に高い状態のままであることを示し、一方、図７２に示すように、ｈＥＳＣの形態は４および５日目にマイクロキャリア上で緻密な集合体として保持される。

【0513】

図７３は、２５ｒｐｍで撹拌するスピナーフラスコ培養においてマイクロキャリア上で成長した他の細胞系ＨＥＳ−２を示し、これは約５５時間の倍増時間で２５０万細胞／ｍｌを達成することができた。細胞のＦＡＣＳ分析は、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、スピナー培養の開始時に２Ｄコロニー対照と同等であったことを示す（図７４）。図７５に示すように、これらのマーカーの発現は、ピーク細胞密度に達した５および７日目に、対照静止培養と同等に高い状態を維持していた。図７６に示すように、ｈＥＳＣは５および７日目にマイクロキャリアの周りに大きな細胞集合体を形成している。

【0514】

マイクロキャリアによるピナーフラスコ培養はバイオリアクター中でｈＥＳＣを拡張するスケール調節可能な方法であることが証明された。図７７に示すように、１００ｍｌのスピナーフラスコにおいて３５０万細胞／ｍｌの密度が達成されれば、これはそれぞれ２００万細胞／ｍｌを含む臓器培養皿（ＯＣＤ）１７５個においてｈＥＳＣを生成するのと同等であろう。

【0515】

実施例３３．球形またはＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダーとＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で成長するｈＥＳＣとの共培養
セルロースＤＥ５３上のｈＥＳＣを球形Ｃｙｔｏｄｅｘおよび東ソー・マイクロキャリア上のフィーダーとの共培養において支持できるかどうかも判定した。コートしていないマイクロキャリアにフィーダー細胞を付着させ、ｈＥＳＣをＭａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアに付着させた。図７８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ上のマウスフィーダー、およびフィーダーでコートしたポリリジンコート 東ソー・ビーズと一緒に、セルロースＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣと共培養して成長した、セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣの写真を示す。表３は、２種類の球形マイクロキャリア上のフィーダーとの共培養、ならびにセルロースＤＥ５３マイクロキャリア上での共培養における、Ｐ０およびＰ１継代のｈＥＳＣの細胞密度を示す。細胞数は、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣ対照と同等であった。図７９は、ｈＥＳＣと、それぞれＣｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダーとの３種類の共培養物について、Ｐ１におけるＦＡＣＳを示す。ＤＥ５３と共培養したＣｙｔｏｄｅｘ ３、およびＤＥ５３の共培養について、３種類の多分化能性マーカーの高発現レベルがみられた。表４は、３種類の共培養物中のｈＥＳＣの細胞数が、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上の対照と比較して約２倍高いことを示す。図８０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダーとの３種類の異なる共培養物における、継代２における３種類の多分化能性マーカーの強い発現を示す；これらはｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアを用いた対照と同等またはより良好である（図８１）。

【0516】

実施例３４．小型および大型球形の東ソー・マイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養
次いで、別の小型および大型球形の東ソー・マイクロキャリアがｈＥＳＣの成長を長期間にわたって支持できるかを調べた。

【0517】

表５は、小型（１０ミクロン）大型（６５ミクロン）両方の東ソー・マイクロキャリア（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの）が、Ｐ０およびＰ１においてｈＥＳＣの成長を支持したことを示す。図８２は、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現がこれら４条件で継代Ｐ１において高かったことを示す。図８３は、ポリリジン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度のもの。ｈＥＳＣは、３０倍希釈ｍａｔｒｉｇｅｌ濃
度で最大の細胞集合体を形成した。図８４は、プロタミン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度のもの。この場合も、３０倍希釈したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたビーズがより大きなｈＥＳＣ集合体を形成した。

【0518】

実施例３５．ｍａｔｒｉｇｅｌを含む大型の東ソー・マイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養
表６および図８５は、ポリリジンコートおよびプロタミンコートした両方の東ソー・ビーズ（６５μｍ）の細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、４継代。継代４までにｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むビーズのみは生存したが、ビーズにカップリングしたｍａｔｒｉｇｅｌを含むものおよびｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものは継代３後は成長しなかった。”カップリング”は、ポリリジンコートおよびプロタミンコートしたビーズにＭａｔｒｉｇｅｌを添加した際に直ちに行われ、次いで使用のために数週間にわたって保存された。”コーティング”のためには、培養する週の間のみＭａｔｒｉｇｅｌを新たにビーズに添加した。図３６は、ポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、Ｐ１。Ｏｃｔ４発現は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないマイクロキャリアについて最低であった。図８７は、プロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、Ｐ１。この場合も、Ｏｃｔ４発現は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないマイクロキャリアについて最低であった。図３８は、Ｐ２において、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上でｈＥＳＣの多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現がより良好であることを示す。同様に図８９は、Ｐ２において、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上でｈＥＳＣの多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現がより良好であることを示す。図９０は続いて、Ｐ３において、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上でｈＥＳＣの多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現がより良好であることを示す。図９１は、Ｐ３において、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上でｈＥＳＣの多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現が最高であることを示す。継代４において、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートした大型ポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で、ｈＥＳＣは未分化集合体をなお形成し続ける（図９２）。図９３は、継代４における、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジンおよびプロタミン−マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示す。図９４は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で５継代成長させたｈＥＳＣの比較的安定な細胞数を示す。図９５は、継代５における、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むポリリジンおよびプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示し、一方、図９６は、Ｐ５におけるｈＥＳＣ集合体を示す。

【0519】

図９７および図９８に示すように、継代６と７の間で、マイクロキャリア濃度を１００万細胞当たり４８，０００ビーズにさらに最適化すると、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジンおよびプロタミン両方の 東ソー・マイクロキャリアについて多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現がより高いレベルに回復した。

【0520】

実施例３６．ラミニンコーティングおよびフィブロネクチンコーティングを含むＣｙｔｏｄｅｘ ３（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの）上でのｈＥＳＣ培養
Ｃｙｔｏｄｅｘ ３は細胞培養に一般的に用いられているので、それの性能をＤＥ５３および 東ソー・マイクロキャリアと比較した。さらに、コーティングを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３を単独で静止および撹拌条件でのｈＥＳＣの培養に使用できるとＴｅｒｓｔ
ｅｇｇｅら（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００７／０２６４７１３
Ａ１）は主張している。

【0521】

表７は、成長したｈＥＳＣの細胞数がＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で比較的安定であったことを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたものとｍａｔｒｉｇｅｌを含まないもの、非撹拌条件および撹拌条件で３継代培養。しかし、図９９に示すように、継代５によれば、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたマイクロキャリアのみが、撹拌（１００および１２０ｒｐｍの両方）および非撹拌の両方の条件でｈＥＳＣの成長を可能にした。コートしていないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアにおいては、細胞数の急激な減少が生じる。図１００に示すように、次いで継代７によれば、撹拌しないｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上でのみｈＥＳＣは生存し続け、継代９にまで成長した。

【0522】

図１０１は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアをｈＥＳＣがほとんどコートしていないことを示す。図１０２は、１００ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの大きなクラスターを示す。これに対し、図１０３および図１０４は、それぞれ非撹拌および撹拌条件におけるｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上のｈＥＳＣのより集密な成長を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上では、Ｐ３により多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ分析がダウンレギュレーションされる（図１０５）。しかし、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアについては、Ｐ９においてすら、３種類すべてのマーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳがなお強く発現している（図１０６）。図１０７は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上で撹拌条件において成長したｈＥＳＣは、Ｐ３により多分化能性マーカーがダウンレギュレーションされることを示す；このダウンレギュレーションは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３についても、撹拌条件において継代Ｐ３によりみられる（図１０８）。

【0523】

図１０９に示すように、継代１３により、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ
３マイクロキャリアは、静止条件では３種類の多分化能性マーカーを強く発現するｈＥＳＣをなお支持することができる。これに対し、ラミニンおよびフィブロネクチンでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３は、継代６においてＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０マーカーの部分的なダウンレギュレーションを示す。この実験は、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンをもつｍａｔｒｉｇｅｌをシミュレートするために実施された。さらに、図１１０において、ｈＥＳＣの核型判定は、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３上で１１継代後に正常な４６ＸＸ核型を示した。

【0524】

実施例３７．Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの）上でのｈＥＳＣ培養
いずれのコーティングも含まない荷電マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア単独についても、それらがｈＥＳＣを支持する能力を評価した。この場合も、以前のＣｒｏｏｋらによる特許は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないこれらのマイクロキャリアが単独でｈＥＳＣ培養を静止培養において３〜５継代支持することができると主張している（ＷＯ ２００８／００４９９０ Ａ２）。同グループによるその後の刊行物(Phillips et al, 2008)は、彼らが各継代で３倍拡張を達成し得たにすぎず、Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリア上では継代６により多分化能性マーカーは保持されたけれどもｈＥＳＣを拡張できなかったことを明らかにした。

【0525】

図１１１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １上で成長しているｈＥＳＣを示す：ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの；ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ上
のｈＥＳＣはコートしていないマイクロキャリアと比較してより大きな集合体として成長する。図１１２は、Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリア上で成長しているｈＥＳＣを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの。Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリアは培地からフェノールレッドを吸着し、互いに集合する傾向がある。ｈＥＳＣは、これらのマイクロキャリア（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものまたは含まないもの）への付着がより劣る。図１１３は、これら２タイプのマイクロキャリア上のｈＥＳＣの細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの、撹拌するものと撹拌しないもの、３継代後。３継代後に、撹拌を伴うＣｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア培養において細胞数は減少する傾向があり、継代できないので中断された。しかし、図１１４に示すように、これらのマイクロキャリア（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの）の静止（または非撹拌）培養は、継代９まで継代できたが、最終細胞数は継代７後に減少する傾向があった。図１１５は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア（ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの）上で成長したｈＥＳＣの平均細胞濃度および平均拡張倍率をまとめる。平均して、ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＣｙｔｏｄｅｘ １上ではより高い細胞濃度が達成され、これはセルロースマイクロキャリアに匹敵した。

【0526】

図１１６は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリアが、コートしていないマイクロキャリアより実際に集密状態であることを示す；ただし、Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリアは培地からのフェノールレッドで赤色に着色し続ける。図１１７は、３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４の、これら４条件の継代６における代表的なプロットを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアは、コートしていないマイクロキャリアより良好な性能をもつ。図１１８は、これら４条件について種々の継代における３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４のＦＡＣＳ分析をまとめる；これらのマーカーは継代６後に低下することが指摘され、ただし、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ １は１０継代後に最も安定な条件であった。他方、ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＨｉｌｌｅｘは、これらのマーカーの低下を示した；おそらく、マイクロキャリアへのフェノールレッドの吸着によるものであろう。継代１３により、ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＣｙｔｏｄｅｘ １上で培養したｈＥＳＣのみが３種類の多分化能性マーカーをなお発現し、これに対し他の３つのマイクロキャリア条件はこれらの３マーカーの発現レベルの低下により示されるように、分化していた（図６９）。これら４つのマイクロキャリア条件についての核型は継代７において正常であった（図１２０）。

【0527】

実施例３８．ｈＥＳＣ培養のためのＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上における種々の細胞外マトリックスコーティング
さらに、別の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をｍａｔｒｉｇｅｌの代替物としてマイクロキャリア上でｈＥＳＣを支持するために使用できるかを調べた。

【0528】

表８は、セルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣの７日後の細胞数を示す；種々のコーティング、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパリン（ＨＳ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）をそれらの最初の原液濃度から１：１０〜１：８０希釈したものを含む；ＫＯ培地および馴化培地（ＣＭ）のコーティングで成長した対照と比較；継代Ｐ０。表９に示すように、継代Ｐ１において、ｈＥＳＣの細胞数は３種類すべてのコーティングについて１００万細胞／ウェルを超え、ＫＯ培地のコーティングを含む対照と類似する。図１２１は、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヒアルロン酸のコーティングについて、Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；図１２２のＫＯ培地を含むコーティングと比較。定性的に、試験した３種類のコーティングのうち、１：１０希釈したヒアルロン酸を含むコーティングがｈＥＳＣを支持するのに好ましいものであると思われる；ＨＡコーティングによれば３種類の多分化能性マーカー
のダウンレギュレーションが最も少ないからである。

【0529】

フィブロネクチンを含むこれらのＥＣＭの他の組合わせも試験し、継代Ｐ０およびＰ１において達成された細胞数を表１０に示す。フィブロネクチンを含むＨＡがＰ１において最良の細胞成長を可能にすると思われた。図１２３および１２４は、種々の組合わせのＥＣＭ（フィブロネクチン、ＨＡおよびヘパリン塩（ＨＳ））でコートしたセルロースマイクロキャリアの写真を示す；これらは緻密な細胞集合体を形成し続け、集合体の周りに明らかな嚢胞性領域はない。しかし、図１２５および１２６に示すように、多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０についてのＦＡＣＳを実施した際に、これらのＥＣＭ組合わせについて、Ｐ１によりこのマーカーの有意のダウンレギュレーションが生じた。

【0530】

さらに他のＥＣＭ、たとえばＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンも、ｈＥＳＣの支持について試験し、表１１は種々のＥＣＭ組合わせを用いて達成されたＰ１〜Ｐ３の細胞数を示す。これらの細胞数を図１２７にも示す；これは、種々のＥＣＭ上で各継代について細胞数のおおまかな減少傾向を示す。

【0531】

図１２８は、セルロースマイクロキャリア上にコートした種々の組合わせのＥＣＭとＨＡについて、ｈＥＳＣの形態を示す。同様に図１２９は、セルロースマイクロキャリア上にコートした種々の組合わせのＥＣＭとＨＳについて、ｈＥＳＣの形態を示す。一般にＨＡとの組合わせは、マイクロキャリア上にＨＳとの組合わせより緻密なｈＥＳＣ集合体をもつ。図１３０において、ＨＡは単独でもＨＳ単独より緻密な集合体を支持すると思われる。また図１３１は、ＨＡとＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンとの組合わせが、ＨＳとのＥＣＭ組合わせより緻密な細胞集合体を形成するように思われることを示す。最後に、ＨＡ、ＨＳおよび他の４種類のＥＣＭをすべて含むマトリックスもｈＥＳＣを支持することが図１３１に示される。

【0532】

図１３２〜１３５は、表１１に記載するように、セルロースマイクロキャリア上の種々の組合わせのＥＣＭ上で、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が３継代後に発現し続けることを示す。しかし、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアと比較して、これらのマーカーのレベルのある程度のダウンレギュレーションが生じる。

【0533】

実施例３９．ｈＥＳＣ培養のためのＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上のヒアルロン酸
ＨＡはｈＥＳＣを支持するためにｍａｔｒｉｇｅｌに対する代替ＥＣＭとして最も有望であると思われたので、細胞をＨＡコートしたセルロースマイクロキャリア上で多数継代、継代した。図１３６に示すように活発な成長、ならびに多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現（図１３７）が３継代（継代４〜６）継続し、これらは対照２Ｄコロニー培養に匹敵した。図１３８は、ＨＡコートしたマイクロキャリア上で、継代８および９においてＴＲＡ−１−６０の高い発現が継続することを示す。最後に、図１３９は、ＨＡコートしたセルロースマイクロキャリア上で継代６において成長した緻密なｈＥＳＣ集合体の形態を２つの異なる倍率で示す。

【0534】

実施例４０．マイクロキャリア上でのヒトｉＰＳ細胞の成長および伝播
実施例４０．１
ヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０）細胞を、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア２０ｍｇ／ウェル（４ｍｇ／ｍｌ）上で、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（５ｍｌ／ウェル）を含むＭＥＦ調整ＫＯ培地中での懸濁培養において培養した。フィーダー細胞上で２Ｄ培養において８回継代し、続いてＭａｔｒｉｇｅｌ上で２Ｄ培養において５継代適応させたｉＰＳ（ＩＭＲ９０）細胞（ｉＰＳ ＩＭＲ９０ＰＭＧＰ５）から、セルロースマ
イクロキャリアに接種した。

【0535】

図１６２は、セルロースマイクロキャリア上でのヒトｉＰＳ細胞の集密成長を示す。図１６３および１６４は、継代３から１０まで週１回の継代でｉＰＳ細胞を培養するのに成功し、継代１０においてＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現が保持されていたことを示す。細胞成長は活発であり、３００〜８００万細胞／ｍｌの細胞密度が各継代後に達成された。

【0536】

実施例４０．２ 無血清培地ｍＴｅＳＲ１中でのヒトｉＰＳ細胞のマイクロキャリア培養
２種類のヒトｉＰＳ細胞系を、無血清培地ｍＴｅＳＲ１中で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたセルロースマイクロキャリア上において２または３週間にわたって連続継代した。図１８６は、細胞数の増加、ならびに多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびｍＡｂ８４の安定発現を示す。

【0537】

Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたセルロースマイクロキャリア上でヒトｉＰＳ細胞（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ、日本）の連続継代を達成した。
実施例４１．マイクロキャリア上での心筋細胞分化
種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コーティングをもつマイクロキャリアを用いて、ｈＥＳＣが心筋細胞へ分化する能力を調べた。種々のＥＣＭコーティングを用いて細胞の拡張および分化を調べた。種々の培地補充物を用いて同様に分化を調べた。マイクロキャリアからマイクロキャリアへのｈＥＳＣの接種に続いて、同様に分化を調べた。

【0538】

実施例４１．１ 分化
ＤＥ５３セルロースマイクロキャリアを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチンのいずれかひとつにコートした（図１６５）。東ソー ６５マイクロキャリアをプロタミン誘導体化し、場合によりラミニン中にコートした（図１６５）。マイクロキャリアを、各ＥＣＭで、低温室内において撹拌下に一夜コートした。翌日、各ウェル（５ｍｌ）に、コラゲナーゼ処理して掻き取った２Ｄコロニー培養物から２．５ｘ１０^６細胞／ウェルを接種した。次いでプレートを接種後１時間、撹拌下に保持した。

【0539】

培養物中に形成された集合体に、馴化培地（ＣＭ）およびｂＦＧＦを２日間供給し、培地を１日１回交換した。３日目に、ＭＡＰキナーゼ阻害薬ＳＢ２０３５８０（５μＭ）を含むｂＳＦＳ分化用培地に培養を切り換えた。培養物をｂＳＦＳで１時間洗浄し、阻害薬を含むｂＳＦＳ培地を分化実験期間中、週３回（月曜、水曜、金曜）交換した。用いた細胞はＨＥＳ−３ ｐ３３ｋＫ４６であった。

【0540】

図１６６および１６７は、すべてのコートした被験マイクロキャリアについて拍動領域が得られたことを示す。マイクロキャリア上のＥＢの集合体は、マイクロキャリアを用いずに作製したＥＢより大きかった。図１６７は、マイクロキャリア上の拍動ＥＢの数が１９日間にわたって増加することを示す。ラミニンおよびフィブロネクチンのコーティングは拍動領域の生成において特に良好であったのに対し、マイクロキャリアの不存在下では拍動性ＥＢがなかった。

【0541】

実施例４１．２ 拡張および分化
分化したｈＥＳＣがマイクロキャリア上で拡張するかを判定するために、下記のマイクロキャリアコーティングを試験した：
１．コートしていないセルロースＤＥ５３
２．ラミニン（２０μｇ）を１５ｍｇのセルロースＤＥ５３上に一夜コートしたもの
３．ＭａｔｒｉｇｅｌをセルロースＤＥ５３上にコートしたもの。

【0542】

２Ｄ培養物（コラゲナーゼ処理し、掻き取ったもの）から１．６ｘ１０^６細胞／ウェルの接種率を用いた。集合体が形成されるまで（３日間）培養物にＣＭを供給し、ｂＳＦＳで１時間洗浄し、その後、分化用培地＋ＳＢ２０３５８０（５μＭ）に切り換えた。拍動および細胞数を求めるために２ウェルのサンプリングを０、４、７および１２日目に実施した。用いた細胞はＨ３ ｐ３３ｋＫ５０であった。１４日目の集合体を図１６８に示す。図１６９は、分化の開始後７および１３日目に得た細胞数から平均して、マイクロキャリア上の種々のＥＣＭコーティング上で細胞が２〜５倍拡張したことを示す。

【0543】

ラミニンおよびフィブロネクチンのコーティング（１〜３マイクログラム／グラム（セルロース））が拍動性胚様体のパーセントに及ぼす影響も調べた。図１８４は、ラミニンコーティングが、フィブロネクチンコートしたマイクロキャリアまたはコートしていないマイクロキャリアと比較して、より良好な細胞付着をもたらし、したがって増加した数の拍動性集合体をもたらすことを示す。

【0544】

実施例４１．３ 種々の培地補充物を用いた分化
広範な培地および補充物を、それらが分化に及ぼす影響についてスクリーニングした。
ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア（３ｍｇ／ｍｌ，６ウェルプレート内）を、ＣＭ中において静止条件で２時間コンディショニングした。次いでそれらに２Ｄ培養から収穫したｈＥＳＣ（コラゲナーゼおよび４方向のスクレーパー）を３ｘ１０^６細胞／ウェルで接種した。接種後、培養物を１５分間撹拌（１００ｒｐｍ）した後、静止条件に切り換えた。

【0545】

培養物をＣＭ中で２日間、集合体として形成させ、ｂＳＦＳで洗浄し、次いで分化用培地＋ＳＢ２０３５８０（５μＭ）および種々の培地補充物（０．１％ ＨｙＳｏｙ，１％
ＢＳＡ，１ｘ脂質混合物、またはこれらの組合わせ−図１７０を参照）に切り換えた。用いた細胞はＨ３ ｐ３３ｋＫ４７であった。

【0546】

図１７１は、コートしていないマイクロキャリア上での心筋細胞形成の増強に対する培地補充物の影響を示す。コートしていないマイクロキャリアにおける補充物なしのｂＳＦＳ単独と比較して、試験したすべての培地補充物が心筋細胞の形成を増強した。

【0547】

図１８５は、ラミニンコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣについて、化学的に規定された脂質、ビタミンまたはダイズ水解物の培地補充物の存在下で、拍動性胚様体または心筋細胞の数が有意に増大したことを示す。

【0548】

実施例４１．４ 種々の培地補充物を用いたマイクロキャリアからマイクロキャリアへ接種したｈＥＳＣについての分化
ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア（３ｍｇ／ｍｌ）を６ウェルプレート内においてＣＭ中で４時間コンディショニングし、１．６ｘ１０^６細胞／ウェルを接種した。培養物を１時間撹拌（１００ｒｐｍ）した後、静止条件に切り換えた。

【0549】

ＣＭ中で４日間、培養物は集合体を形成し、次いでｂＳＦＳ分化用培地＋ＳＢ２０３５８０（５μＭ）および種々の添加物（図１７２を参照）、または脂質補充物を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋ＳＢ２０３５８０（５μＭ）のいずれかに切り換えた。用いた細胞はＨ３ ｐ３３ｋＫ３０ｐ２であった。

【0550】

図１７２は、コートしていないマイクロキャリア培養において、補充物を含まないｂＳＦＳ単独と比較して、脂質混合物、ＢＳＡおよびＨｙ−Ｓｏｙ添加物がすべて、独立して拍動性集合体の総数を増大させたことを示す。

【0551】

実施例４１．５ 陰電荷をもつマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの分化
陰電荷をもつ微粒状カルボキシメチルセルロースＣＭ５２マイクロキャリア（２０ｍｇ／ウェル，４ｍｇ／ｍｌ）にＨＥＳ−３細胞を接種し、懸濁培養および継代した。分化は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含む場合および含まない場合について、継代１内で大きな嚢胞性領域により示された（データは示していない）。細胞密度は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上の方がコートしていないマイクロキャリアより高かった。これは、陰電荷をもつマイクロキャリアはｈＥＳＣの多分化能性成長を支持しない可能性があるけれどもｈＥＳＣの分化を支持しうることを指摘する。

【0552】

実施例４１．６ 以後の分析のための集合体からの効率的な細胞収穫
直接酵素処理（たとえばトリプシンまたはＴｒｙｐｌｅ）により、ｈＥＳＣをマイクロキャリア培養物から収穫することができる。

【0553】

【表4】

[この文献は図面を表示できません]

【0554】

コラゲナーゼによる前処理および酵素処理（トリプシン）を伴う２工程プロトコルはマイクロキャリアからのｈＥＳＣの収穫を増大させることが分かった。

【0555】

【表5】

[この文献は図面を表示できません]

【0556】

マイクロキャリアから心筋細胞を収穫するために、コラゲナーゼによる前処理、およびトリプシンまたはＴｒｙｐｌｅによる酵素処理を伴う２工程プロトコルは収穫効率を改善することが分かった。

【0557】

【表6】

[この文献は図面を表示できません]

【0558】

実施例４１．７ ヒトｉＰＳ細胞ＩＭＲ９０の胚様体形成および心筋細胞分化
ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたセルロースＤＥ５３上における継代１３のヒトｉＰＳ細胞を、ＥＢ培地（ＫＯ基礎培地＋２０％血清＋非必須アミノ酸）へのマイクロキャリアの移
植により懸濁液中で１４日間分化させ、続いてゼラチンコートした６ｃｍの組織培養皿上で７日間、再び平板培養した。幾つかの拍動性集合体がみられた。拍動性集合体のうち２つをさらに観察するために、ゼラチンでコートした新たな６ｃｍの皿へ移植した。２３日後、すべての拍動性クランプがなお活発に拍動していた。

【0559】

実施例４１．７ 追加の分化実験
ラミニンコートしたマイクロキャリア上で培養したＨＥＳ−２ ｈＥＳＣ（２マイクログラム／ｍｇマイクロキャリア）を用いて、１８日目の試料で拍動性集合体（３重試験）を生成させるのに成功した。

【0560】

ラミニンコートしたマイクロキャリア上で培養したｉＰＳ ＥＳ４ＳＫＩＮ細胞（１マイクログラム／ｍｇマイクロキャリア）を用いて、８日目の試料で拍動性集合体を生成させるのに成功した。

【0561】

ヒトｉＰＳ包皮細胞は、無血清培地中においてラミニンコートしたセルロースマイクロキャリア上で１２日目に２５％の拍動性胚様体を形成した。
実施例４１．８ 内胚葉系列への分化
ｈＥＳＣ−Ｍａｔｒｉｇｅｌコートマイクロキャリア懸濁培養物をスピナーフラスコ内で撹拌（４０ｒｐｍ）することにより、また６ウェルプレート内での撹拌（１２０ｒｐｍ）によっても、ｈＥＳＣを内胚葉系列（たとえば膵島細胞、肝細胞、肺）へ分化させた。内胚葉遺伝子ＧＡＴＡ６およびアルファフェトプロテインのアップレギュレーションと共に、多分化能性マーカーＯｃｔ４、Ｍａｂ８４およびＴｒａ−１−６０のダウンレギュレーションがみられた。図７３（実施例３２）に示した結果と合わせて考慮すると、これらの結果は、細胞の培養および細胞の多分化能性／多能性状態の維持のためにはより低速の撹拌を使用できること、ならびに分化を誘導するためにはより高速の撹拌を使用できることを指摘する。

【0562】

実施例４２．マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞由来の間葉性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞を分化させて、臨床的に適応する間葉性幹細胞（ＭＳＣ）を再現性をもって供給することがLian et al (Derivation of Clinically Compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells 2007;25:425-436)に記載されている
。彼らは、ｈＥＳＣをトリプシン処理し、フィーダー支持体なしにＦＧＦ２およびＰＤＧＦ ＡＢを補充した培地中で伝播させ、続いてＣＤ１０５＋およびＣＤ２４−細胞を選別することにより、ｈＥＳＣから類似性が高くかつ臨床的にコンプライアントなＭＳＣ集団を再現性をもって生成させるために使用できるプロトコルを記載している。得られたＭＳＣは骨髄ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）に顕著に類似し、ＭＳＣを同定するために一般に用いられる形態、表現型および機能規準を満たした；すなわち、線維芽細胞表現型をもつ接着性の単層、表面抗原プロフィール、すなわちＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａ＋、ＣＤ４９ｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−およびＣＤ４５−、ならびに脂肪形成、軟骨形成および骨形成を含めた分化能。Lianらは、彼らのＭＳＣを生成させるためにＨｕｅｓ９およびＨ１ ｈＥＳＣの使用を記載している。

【0563】

本発明者らはLianらのプロトコルを用いて、ｈＥＳＣ由来のＭＳＣを生成させ、コートしていないマイクロキャリア上でこれらのＭＳＣを培養および継代して、ｈＥＳＣの分化により得られた細胞、特にｈＥＳＣ由来の成体幹細胞の培養の連続的な培養、成長および継代を支持するためにマイクロキャリアを使用できることを確認した。

【0564】

実施例４２．１ スピナーフラスコにおけるマイクロキャリア濃度の変更
Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアに、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣを種々のマイクロキャリア濃度（１．５、３および５キャリア／ｍｌ）で接種し、４０ｒｐｍで撹拌するスピナー
培養において５０％の培地を３日毎に交換して培養した。図１７４および１７５は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を示す。試験した最低のマイクロキャリア濃度を用いて最良の成長が得られた。

【0565】

実施例４２．２ スピナーフラスコにおける細胞接種濃度の変更
Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアに、広範な濃度のｈＥＳＣ由来ＭＳＣ細胞（５〜１４細胞／マイクロキャリア）を３ｍｇ／ｍｌのマイクロキャリアにおいて４０ｒｐｍで撹拌するスピナー培養に接種し、５０％の培地を３日毎に交換した。図１７６および１７７は、出発細胞濃度が高いほど高い最終細胞密度が得られたことを示す。

【0566】

実施例４２．３ 単層培養とマイクロキャリア培養の比較
Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上でのｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を、単層培養におけるｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長と比較した；培地を１日１回交換した。図１７８および１７９は、マイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣ由来ＭＳＣがより速やかな倍増時間およびより高い細胞密度を達成したことを示す。

【0567】

実施例４２．４ マイクロキャリア上でのｈＥＳＣ由来ＭＳＣの継代
ｈＥＳＣ由来ＭＳＣをＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で２方法により継代した：
（ｉ）５０％の新たなマイクロキャリアを添加；または
（ｉｉ）細胞をｔｒｙｐｌＥ酵素で脱着し、続いて新たなマイクロキャリアを添加；
すべての培養に１日１回供給した。図１８０および１８１は、両方の場合とも細胞は類似の倍増時間および細胞密度を３継代にわたって達成したことを示す。図１８２および１８３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で前記の２方法により継代した場合の１０日目におけるｈＥＳＣ由来ＭＳＣによる５種類のＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ２９およびＣＤ４４の陽性発現、ならびにＣＤ３４およびＣＤ４５の陰性発現を示す。

【0568】

実施例４３．ＳｔｅｍＰＲＯ培地における供給バッチ培養
図１８７は、ＳｔｅｍＰＲＯ培地を用いたマイクロキャリア懸濁培養におけるｈＥＳＣの細胞密度に対する制御した低グルコース供給（１日１回、２ｇ／ｌ）の結果を、ＳｔｅｍＰＲＯのみを１日１回供給した培養と比較して示す。低グルコース供給はより高い細胞密度をもたらした。

【0569】

ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地ではラクテート産生の低下およびｐＨ制御の改善もみられた。
参考文献

【0570】

【表7-1】

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【0571】

【表7-2】

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【0572】

【表7-3】

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【0573】

【表7-4】

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【0574】

【表7-5】

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【0575】

【表7-6】

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【0576】

【表7-7】

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【0577】

【表7-8】

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【0578】

【表7-9】

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【0579】

本明細書に記述した出願および特許、ならびに前記のそれぞれの出願および特許（訴訟中のそれぞれの出願および特許を含む）において引用または参照された各文献（”出願中引用文献”）、ならびにそれぞれの出願および特許ならびにいずれかの出願中引用文献に引用または記述されたいずれかの製品についての製造業者の指示またはカタログを、本明細書に援用する。さらに、本明細書に引用したすべての文献、および本明細書に引用した文献において引用または参照されたすべての文献、および本明細書に引用または記述したいずれかの製品についての製造業者の指示またはカタログを、本明細書に援用する。

【0580】

本発明の範囲および精神から逸脱しない、本発明の方法およびシテスムの多様な改変および変更が当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい態様に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載した本発明をそのような特定の態様に不当に限定すべきではないこと、および本発明の範囲内でそれらに対する多数の改変および追加をなしうることを理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の専門家に明らかな、本発明を実施するために記載した様式の多様な改変が、特許請求の範囲に含まれるものとする。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、独立請求項の特徴と従属請求項の特徴との多様な組合わせを行なうことができる。
発明の態様
［態様１］幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性である方法。
［態様２］幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、態様１に記載の方法。
［態様３］幹細胞が霊長類またはヒトのものである、態様１または２に記載の方法。
［態様４］工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代、または少なくとも７継代、または少なくとも１０継代反復する、態様１〜３のいずれかに記載の方法。
［態様５］マイクロキャリアがロッド形である、態様１〜４のいずれかに記載の方法。
［態様６］マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、態様１〜５のいずれかに記載の方法。
［態様７］マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、態様１〜５のいずれかに記載の方法。
［態様８］マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、態様１〜５のいずれかに記載の方法。
［態様９］マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、態様１〜８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、態様１〜８のいずれかに記載の方法。
［態様１１］マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
［態様１２］マイクロキャリアが陽電荷を有する、態様１〜１１のいずれかに記載の方法。
［態様１３］マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、態様１〜１２のいずれかに記載の方法。
［態様１４］マイクロキャリアが親水性である、態様１〜１３のいずれかに記載の方法。
［態様１５］マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、態様１〜４または６〜１４のいずれかに記載の方法。
［態様１６］工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、態様１〜１５のいずれかに記載の方法。
［態様１７］各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、態様１〜１６のいずれかに記載の方法。
［態様１８］工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、態様１〜１７のいずれかに記載の方法。
［態様１９］工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている、態様１〜１８のいずれかに記載の方法。
［態様２０］工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックス中にコートされている、態様１〜１９のいずれかに記載の方法。
［態様２１］工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１と第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しない、態様１〜２０のいずれかに記載の方法。
［態様２２］工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である、態様１〜２１のいずれかに記載の方法。
［態様２３］工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する、態様１〜２２のいずれかに記載の方法。
［態様２４］該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、態様１〜２３のいずれかに記載の方法。
［態様２５］フィーダー細胞もマイクロキャリアに付着している、態様１〜２４のいずれかに記載の方法。
［態様２６］培養がさらに、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着したフィーダー細胞を含む、態様１〜２４のいずれかに記載の方法。
［態様２７］態様１〜２６のいずれかに記載の方法により得られる多分化能性幹細胞。
［態様２８］さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、態様１〜２６のいずれかに記載の方法。
［態様２９］該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、態様２８に記載の方法。
［態様３０］該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、態様１〜２６のいずれかに記載の方法。
［態様３１］さらに、多分化能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、態様１〜２６のいずれかに記載の方法。
［態様３２］第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、態様３１に記載の方法。
［態様３３］第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、態様３１に記載の方法。
［態様３４］第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、態様３１〜３３のいずれかに記載の方法。
［態様３５］第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、態様３１〜３３のいずれかに記載の方法。
［態様３６］該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、態様３１〜３５のいずれかに記載の方法。
［態様３７］第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、態様３６に記載の方法。
［態様３８］第３マトリックスが第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一である、態様３６に記載の方法。
［態様３９］第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、態様３６〜３８のいずれかに記載の方法。
［態様４０］第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、態様３６〜３８のいずれかに記載の方法。
［態様４１］態様２８〜４０のいずれかに記載の方法により得られる分化した細胞。
［態様４２］分化した細胞を培養して胚様体を形成させる、態様２８〜４０のいずれかに記載の方法。
［態様４３］態様４２に記載の方法により得られる胚様体。
［態様４４］幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、培養物がフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞がヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である方法。
［態様４５］幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
［態様４６］幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、態様４５に記載の方法。
［態様４７］幹細胞が霊長類またはヒトのものである、態様４５または４６に記載の方法。
［態様４８］マイクロキャリアがロッド形である、態様４５〜４７のいずれかに記載の方法。
［態様４９］第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、態様４５〜４８のいずれかに記載の方法。
［態様５０］第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、態様４５〜４８のいずれかに記載の方法。
［態様５１］第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、態様４５〜５０のいずれかに記載の方法。
［態様５２］第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、態様４５〜５０のいずれかに記載の方法。
［態様５３］該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、態様４５〜５２のいずれかに記載の方法。
［態様５４］第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、態様５３に記載の方法。
［態様５５］第３マトリックスが第１および第２マトリックスの１つと同一である、態様５３に記載の方法。
［態様５６］第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、態様５３〜５５のいずれかに記載の方法。
［態様５７］第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、態様５３〜５５のいずれかに記載の方法。
［態様５８］幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
［態様５９］幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、態様５８に記載の方法。
［態様６０］幹細胞が霊長類またはヒトのものである、態様５８または５９に記載の方法。
［態様６１］マイクロキャリアがロッド形である、態様５８〜６０のいずれかに記載の方法。
［態様６２］マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、態様５８〜６１のいずれかに記載の方法。
［態様６３］マトリックスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、態様５８〜６１のいずれかに記載の方法。
［態様６４］マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、態様５８〜６１のいずれかに記載の方法。
［態様６５］マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、態様５８〜６４のいずれかに記載の方法。
［態様６６］マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、態様５８〜６４のいずれかに記載の方法。
［態様６７］マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、態様５８〜６６のいずれかに記載の方法。
［態様６８］マイクロキャリアが陽電荷を有する、態様５８〜６７のいずれかに記載の方法。
［態様６９］マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、態様５８〜６８のいずれかに記載の方法。
［態様７０］マイクロキャリアが親水性である、態様５８〜６９のいずれかに記載の方法。
［態様７１］マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、態様５８〜６０または６２〜７０のいずれかに記載の方法。
［態様７２］多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
［態様７３］工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、態様７２に記載の方法。
［態様７４］さらに、工程（ｉｉ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、態様７２または７３に記載の方法。
［態様７５］該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、態様７４に記載の方法。
［態様７６］該方法が、工程（ｉｉ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、態様７２〜７５のいずれかに記載の方法。
［態様７７］多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
［態様７８］工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、態様７７に記載の方法。
［態様７９］態様７２、７３、７７または７８のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞。
［態様８０］さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、態様７７または７８のいずれかに記載の方法。
［態様８１］該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、態様８０に記載の方法。
［態様８２］該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、態様７７〜８１のいずれかに記載の方法。
［態様８３］さらに、多能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、態様７７に記載の方法。
［態様８４］態様７４〜８３のいずれかに記載の方法により得られる分化した細胞。
［態様８５］多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
［態様８６］工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面が第１マトリックス中にコートされている、態様８５に記載の方法。
［態様８７］幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
［態様８８］幹細胞が成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞である、態様７２〜８７のいずれかに記載の方法。
［態様８９］マイクロキャリアがロッド形である、態様７２〜８８のいずれかに記載の方法。
［態様９０］マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、態様７２〜８９のいずれかに記載の方法。
［態様９１］マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、態様７２〜８９のいずれかに記載の方法。
［態様９２］マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、態様７２〜８９のいずれかに記載の方法。
［態様９３］マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、態様７２〜９２のいずれかに記載の方法。
［態様９４］マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、態様７２〜９２のいずれかに記載の方法。
［態様９５］マイクロキャリアが陽電荷を有する、態様７２〜９４のいずれかに記載の方法。
［態様９６］マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、態様７２〜９５のいずれかに記載の方法。
［態様９７］工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、態様７２〜９６のいずれかに記載の方法。
［態様９８］各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、態様７７〜９７のいずれかに記載の方法。
［態様９９］工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、態様７７〜９８のいずれかに記載の方法。
［態様１００］霊長類またはヒトの幹細胞の伝播および／または分化のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用であって、マイクロキャリアがＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される使用。
［態様１０１］マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、態様１００に記載の使用。
［態様１０２］マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、態様１００に記載の使用。
［態様１０３］多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切なマイクロキャリアであって、マイクロキャリアがセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を含み、マイクロキャリアが細長い形状を有し、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法を有し、マイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされ、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着しているマイクロキャリア。
［態様１０４］マイクロキャリアがロッド形である、態様１０３に記載のマイクロキャリア。
［態様１０５］マトリックスコーティングが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む、態様１０３または１０４に記載のマイクロキャリア。
［態様１０６］細胞が多分化能性細胞である、態様１０３〜１０５のいずれかに記載のマイクロキャリア。
［態様１０７］多分化能性細胞が霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、態様１０３〜１０６のいずれかに記載のマイクロキャリア。
［態様１０８］マイクロキャリアが陽電荷を有する、態様１０３〜１０７のいずれかに記載のマイクロキャリア。
［態様１０９］マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、態様１０３〜１０８のいずれかに記載のマイクロキャリア。
［態様１１０］５０μｍ〜４００μｍの最長寸法を有する、態様１０３〜１０９のいずれかに記載のマイクロキャリア。
［態様１１１］それに多分化能性細胞または多能性細胞が付着したそれぞれ態様１０３〜１１０のいずれかに記載の２以上のマイクロキャリアを含む、集合体。
［態様１１２］多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、態様１０３〜１１０のいずれかに記載のマイクロキャリアの使用。
［態様１１３］多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、態様１０３〜１１０のいずれかに記載のマイクロキャリアの使用。
［態様１１４］多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するのに適切な条件下で態様１０３〜１１０のいずれかに記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
［態様１１５］多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下で態様１０３〜１１０のいずれかに記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。

【図1A】

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【図1B】

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【図1C】

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【図1D】

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【図2】

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