特許 6944698 Ｉ型アレルギー疾患治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6944698

(24)【登録日】2021年9月15日

(45)【発行日】2021年10月6日

(54)【発明の名称】Ｉ型アレルギー疾患治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210927BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210927BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20210927BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 N

   A61K39/395 U

   A61P37/08

   !C07K16/00

【請求項の数】3

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2017-109784(P2017-109784)

(22)【出願日】2017年6月2日

(65)【公開番号】特開2018-203656(P2018-203656A)

(43)【公開日】2018年12月27日

【審査請求日】2020年1月15日

(73)【特許権者】

【識別番号】502285457

【氏名又は名称】学校法人順天堂

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】平野 隆雄

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 Int. Arch Allergy Immunol., 2002, Vol.128, p.24-32

【文献】 Int. Arch Allergy Immunol., 1988, Vol.85, p.47-54

【文献】 Eur J Immunol., 1991, Vol.21, p.1543-1548

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントを有効成分とするＩ型アレルギー疾患治療薬。

【請求項2】

前記Ｆａｂフラグメントが、マスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２を認識して直接結合する請求項１記載のＩ型アレルギー疾患治療薬。

【請求項3】

前記抗ＩｇＥ抗体が、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である請求項１又は２記載のＩ型アレルギー疾患治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｉ型アレルギー疾患の特異的治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｉ型アレルギー疾患においては、ＩｇＥがマスト細胞や好塩基球上の高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ１）に結合し、アレルゲンがそのＩｇＥに結合・架橋形成を起こすことにより、これらの細胞からヒスタミン、セロトニン等の化学伝達物質を放出する。これらの化学伝達物質により血管拡張や血管透過性亢進などが起こり、種々のアレルギー症状が生じる。代表的な疾患として、じんましん、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック等が知られている。

【0003】

Ｉ型アレルギー疾患である難治性喘息の治療薬として抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブが市販されている。オマリズマブは、ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体であり、血中のフリーのＩｇＥを除去することによりマスト細胞等の表面にある高親和性受容体（ＦｃεＲ１）とＩｇＥ量を減少させることによりマスト細胞の活性化を抑制するとされている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】ゾレア（登録商標）添付文書

【非特許文献2】Int. Arch Allergy Immunol 85:47-54(1988)

【非特許文献3】Int. Arch Allergy Immunol 128: 24-32 (2002)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

オマリズマブは、マスト細胞表面のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ１）の結合部位とされるＩｇＥ分子のＦｃε３を認識する抗ＩｇＥ抗体である。従ってオマリズマブは、ＩｇＥのＦｃεＲ１の結合部位を認識するため、マスト細胞上に既に固着しているＩｇＥには結合出来ない。それ故、血液中のフリーのＩｇＥを除去することにより、マスト細胞に結合するＩｇＥ量を減少させ、マスト細胞の活性化を抑制することによって、間接的にＩ型アレルギー反応を減弱させるということがその作用機序である。また、オマリズマブはＩｇＧで分子量約１５万の２分子（ダイマー）であるため、マスト細胞上のＩｇＥ分子と結合し、架橋形成によりアナフィラキシーショックを誘導する可能性があることが指摘されている。既に文献ではアナフィラキシーショックの副作用が報告されている。

【0006】

従って、従来の抗ＩｇＥ抗体（オマリズマブ）とは異なる作用機序による新たなＩ型アレルギー疾患治療薬の開発が望まれている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで本発明者は、種々の抗ＩｇＥ抗体を作製し、その作用を検討してきたところ、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（ＨＭＫ−１２）が、前記オマリズマブ同様にマスト細胞上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ１）の結合部位とされるＩｇＥ分子のＦｃε３を認識する抗ＩｇＥ抗体であることを見出し、先に報告した（非特許文献２、３）。そしてさらに検討を続けたところ、これと異なる別のモノクローナル抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥ認識部位がＩｇＥのＦｃεＲＩが結合する部位ＩｇＥ−Ｆｃε３（オマリズマブやＨＭＫ−１２の認識部位）と全く異なるＩｇＥ−Ｆｃε２である抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントの作製に成功した。この新たな抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントを用いれば、マスト細胞に結合しているＩｇＥに直接結合して、アレルゲンによる架橋形成を介したＩ型アレルギー反応を直接阻害するため、強力にアレルギー症状を抑制する。またＦａｂフラグメントであるため、これ自体が架橋形成することがなく、分子量も約５万と小さく安全性も良好であることを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。

【0009】

〔１〕ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントを有効成分とするＩ型アレルギー疾患治療薬。
〔２〕前記Ｆａｂフラグメントが、マスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２を認識してマスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２と直接結合する〔１〕記載のＩ型アレルギー疾患治療薬。
〔３〕前記抗ＩｇＥ抗体が、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である〔１〕又は〔２〕記載のＩ型アレルギー疾患治療薬。
〔４〕Ｉ型アレルギー疾患治療薬製造のための、ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントの使用。
〔５〕前記Ｆａｂフラグメントが、マスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２を認識してマスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２と直接結合する〔４〕記載の使用。
〔６〕前記抗ＩｇＥ抗体が、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である〔４〕又は〔５〕記載の使用。
〔７〕Ｉ型アレルギー疾患を治療するための、ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメント。
〔８〕前記Ｆａｂフラグメントが、マスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２を認識してマスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２と直接結合する〔７〕記載のＦａｂフラグメント。
〔９〕前記抗ＩｇＥ抗体が、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である〔７〕又は〔８〕記載のＦａｂフラグメント。
〔１０〕ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントの有効量を投与することを特徴とするＩ型アレルギー疾患の治療方法。
〔１１〕前記Ｆａｂフラグメントが、マスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２を認識してマスト細胞上のＩｇＥのＦｃε２と直接結合する〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記抗ＩｇＥ抗体が、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明の抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメント（Ｆａｂ−６ＨＤ５）は、ＩｇＥのＦｃε２を認識し、マスト細胞に結合しているＩｇＥのＦｃε２に直接結合して、アレルゲンによる架橋形成を介したＩ型アレルギー反応を直接阻害するため、従来の血中フリーのＩｇＥを除去することによる治療薬（オマリズマブ）に比べて極めて強力かつ持続的にＩ型アレルギー症状を阻害し、Ｉ型アレルギー疾患治療薬として有用である。また、本発明はＦａｂフラグメントであるので分子量が小さく、副作用の危険性も少ない。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】β−ヘキソサミニダーゼ放出に対する作用を示す。

【図2】フローサイトメトリー結果を示す。

【図3】フローサイトメトリー結果を示す。

【図4】ウェスタンブロットの結果を示す。

【図5】ウェスタンブロットの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のＩ型アレルギー疾患治療薬の有効成分は、ＩｇＥのＦｃε２を認識して当該部位に結合するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントである。
従来、Ｉ型アレルギー疾患治療薬として用いられている抗ＩｇＥ抗体であるオマリズマブはＩｇＥ分子のＦｃε３（ＩｇＥのマスト細胞表面上のＩｇＥ受容体（ＦｃεＲ１）への結合部位）を認識する抗体である。血液中のフリーのＩｇＥを除去することにより、マスト細胞に結合するＩｇＥ量を減らして間接的にＩ型アレルギー反応を阻害するものであり、直接マスト細胞上に結合したＩｇＥに作用するものではない。これに対し、本発明で用いるモノクローナル抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントは、Ｆｃε３でなくＦｃε２を認識することから、マスト細胞に結合しているＩｇＥに直接結合して、アレルゲンによる架橋形成を介したＩ型アレルギー反応を直接阻害するため、強力かつ持続的にＩ型アレルギー症状を抑制できる。

【0013】

このようなモノクローナル抗ＩｇＥ抗体としては、ハイブリドーマ ６ＨＤ５が産生するモノクローナル抗ＩｇＥ抗体が挙げられる（非特許文献２、３）。

【0014】

ハイブリドーマ ６ＨＤ５は、非ヒト動物（ＳＤラット）に抗ジニトロフェノール（ＤＮＰ）ＩｇＥモノクローナル抗体（Ｂ５３：ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）のＩｇＥを免疫してハイブリドーマ ６ＨＤ５を作成する。例えば、マウス由来モノクローナル抗ＤＮＰＩｇＥ（Ｂ５３）のＩｇＥをラット免疫して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを細胞融合させて得られたハイブリドーマである。

【0015】

感作抗原としては、抗ＤＮＰＩｇＥ（Ｂ５３）を用いる。感作抗原で免疫される非ヒト動物としては、例えばラットが用いられる。

【0016】

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

【0017】

このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付す。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

【0018】

前記免疫細胞と融合すべき親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｎｏｌ １９７９；１２３：１５４８−１５５０）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９７６；６：５１１−５１９）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９７８；２７６：２６９−２７０）等が好適に使用される。

【0019】

前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８１；７３：３−４６）等に準じて行うことができる。

【0020】

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を使用することもできる。

【0021】

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することもできる。

【0022】

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

【0023】

このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

【0024】

ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば感作抗原として用いたＩｇＥを用いたＥＬＩＳＡによって、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体を選抜することができる。

【0025】

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

【0026】

当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

【0027】

また、本発明の抗ＩｇＥ抗体は、ラット抗マウスＩｇＥの実験系であるが、キメラ化又はヒト化したものとすることもできる。また抗ＩｇＥ抗体としてはＩｇＧが好ましい。

【0028】

本発明の抗ＩｇＥ抗体を産生するハイブリドーマ ６ＨＤ５は、例えば非特許文献２及び３の記載に従って製造することができる。

【0029】

抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントは、例えば非特許文献３の記載に準じて抗ＩｇＥ抗体をプロテアーゼ処理した後、プロテインＡカラムを用いてＦｃフラグメントを除去することにより得ることができる。プロテアーゼとしては、パパインを用いることができる。

【0030】

本発明の抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントは、後記実施例に示すように、Ｆｃε３ではなく、Ｆｃε２を認識し、マスト細胞に結合しているＩｇＥに直接結合して、アレルゲンによる架橋形成を介したＩ型アレルギー反応を直接阻害する。また、本発明の抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントの抗アレルギー作用は、強力かつ持続的である。さらに、Ｆａｂフラグメントであることから、分子量が小さく、副作用の危険性も少ない。従って、本発明の抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントは、種々のＩ型アレルギー疾患治療薬として有用である。

【0031】

本発明のＩ型アレルギー疾患治療薬の対象となるＩ型アレルギー疾患としては、じんましん、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシーショック等が挙げられる。

【0032】

本発明のＩ型アレルギー疾患治療薬の投与形態としては、点眼剤、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤等が挙げられる。このうち、注射剤が特に好ましい。これらの医薬組成物の形態とするには、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。そのような担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、本発明化合物（１）と混合して使用される。

【0033】

さらに、本発明の医薬組成物中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％である。

【0034】

本発明のＩ型アレルギー疾患治療薬の投与量は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／週〜３週であるのが好ましい。

【実施例】

【0035】

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

【0036】

実施例１（６ＨＤ５の製造）
ＳＤラットに抗ＤＮＰＩｇＥ（Ｂ５３：Ｂａｌｂ／ｃマウス由来）をＦＣＡとともに免疫した後、ハイブリドーマの手法によりＲａｔ抗ｍｏｕｓｅＩｇＥのモノクローナル抗ＩｇＥ抗体をクローニングにて作成したものが６ＨＤ５である（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８５：４７−５４（１９８８））。

【0037】

実施例２（Ｆａｂフラグメントの製造）
ラットＩｇＧ抗マウスＩｇＥ抗体をパパイン処理して分子量約５万のＦａｂフラグメントを作成した（ｍａｒｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：２４−３２（２００２）。得られた抗ＩｇＥ抗体のＦａｂフラグメントをＦａｂ−６ＨＤ５と称する。

【0038】

実施例３（ＰＣＡ反応）
Ｆａｂ−６ＨＤ５のｉｎ ｖｉｖｏ受身アナフィラキシー反応（ＰＣＡ）を検討した。すなわち、雌性ＳＤラットを使用した。各群２匹の剃毛した皮膚の数ヶ所に抗ＤＮＰＩｇＥ（ＳＰＥ−７）又は抗ＴＮＰＩｇＥ（１４２ａ）を１００ｎｇ／０．１ｍＬを皮内投与した。２４時間後に、Ｆａｂ−６ＨＤ５、６ＨＤ５、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２、ＨＭＫ−１２、ラットＩｇＧ及び抗κ抗体を同じ部位に注射した。第２回注射の２時間後に、０．５％エバンスブルー色素生理食塩液１ｍＬ、及びＤＮＰ−ＢＳＡ又はＴＮＰ−ＢＳＡ １ｍｇ／ｍＬを静脈内投与した。３０分後に青色部の直径を測定した。
その結果、表１に示したとおり、Ｆａｂ−６ＨＤ５は最も低濃度の１．２５μｇ／ｍＬの濃度でＰＣＡ反応を抑制し、他の抗体群６ＨＤ５は２．５μｇ／ｍＬ、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２と、ＨＭＫ−１２は１０μｇ／ｍＬの濃度でＰＣＡ反応を抑制した。コントロールであるＲａｔ ＩｇＧはＰＣＡ反応を抑制しなかった。この結果により、分子量４万のＦａｂ−６ＨＤ５が２価の分子量１８万の６ＨＤ５より抑制力が強いこと、他の抗ＩｇＥ抗体であるＨＭＫ−１２より抑制力が強いことが示された。このことは６ＨＤ５とＨＭＫ−１２のＩｇＥ分子に対する結合部位が異なることが起因している可能性ある。
他の特異性を持つＩｇＥでも同様のＰＣＡの阻止が得られるかを目的として、ａｌｌｏｔｙｐｅ及び抗原特異性の異なるＡｎｔｉ−ＴＮＰ ＩｇＥ（１００ｎｇ，１４１ａ）を用いた実験を行った。同様にＦａｂ−６ＨＤ５が強くＰＣＡ反応を抑制したが、陽性コントロールであるＦａｂ−ａｎｔｉ−κとＲａｔ ＩｇＧはＰＣＡ反応を阻止しなかった。Ｆａｂ−ａｎｔｉ−κがＰＣＡ反応を阻止しない事実は、この抑制はｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎが関与してないことを示している。

【0039】

【表1】

【0040】

実施例４（ＰＣＡ反応に対するＦａｂ−６ＨＤ５の持続効果）
このＦａｂ−６ＨＤ５のＰＣＡ抑制効果がどのくらい持続するかをｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｓｔｕｄｙで検討した。
Ｄａｙ ０にａｎｔｉ−ＤＮＰ ＩｇＥを皮膚感作した後、Ｄａｙ １ にＦａｂ−６ＨＤ５を濃度依存的にＩｇＥを感作した部位に皮内投与する。同日の２時間後に抗原＋エヴァンスブルーで惹起（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した群（ｄａｙ １ ｇｒｏｕｐ：Ｄａｙ １）とＤａｙ １０に惹起した群（ｄａｙ １０ ｇｒｏｕｐ：Ｄａｙ １０）について検討した。
その結果、表２に示すように、Ｄａｙ １群では、Ｆａｂ−６ＨＤ５の０．６３μｇ／ｍＬの濃度でＰＣＡ反応を抑制し、Ｄａｙ １０群０．３２μｇ／ｍＬの濃度でＰＣＡ反応を抑制した。この結果はＦａｂ−６ＨＤ５が少なくとも１０日間持続的に、ＰＣＡ反応において、Ｉ型アレルギー反応の阻止を持続出来ることを示している。Ｄａｙ １０群の結果は、前もってＦａｂ−６ＨＤ５を投与しておくと、Ｉ型アレルギー反応を予防出来ることを示している。即ち、花粉症など既知のアレルゲンに暴露される前にＦａｂ−６ＨＤ５を投与しておくとアレルギー反応を回避出来るという予防治療が期待出来る。またＤａｙ １群では抗体投与２時間後にＰＣＡ反応を抑制していることにより、急性のＩ型アレルギー疾患であるアナフィラキシーショックに対しても有効性が期待出来る。

【0041】

【表2】

【0042】

実施例５（β−ヘキソサミニダーゼ放出に対する作用）
Ｆａｂ−６ＨＤ５によるＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−ヘキソサミニダーゼ放出の抑制をみた。
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を１晩で培養した後ＩｇＥ（ＳＰＥ−７）濃度１μｇ／ｍＬ１６時間培養し細胞に固着させる。その後、インヒビターとしてＦａｂ−６ＨＤ５を濃度依存性（０，１．２５、２．５、５．０、１０μｇ／ｍＬ）加え、抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ）添加後にβ−ヘキソサミニダーゼの放出の抑制を測定した。
図１に示すように、Ｆａｂ−６ＨＤ５が濃度依存性にβ−ヘキソサミニダーゼの放出を抑制しているいることが示された。Ｂａｎｉｙａｓｈらは種々のｐｅｐｓｉｎ処理のＦａｂ’ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉ−ＩｇＥがＩｇＥのＲＢＬ／２Ｈ３細胞上ＦｃεＲ１の結合部位を認識している抗体であり、この抗体とＩｇＥ共存下で細胞からのセロトニン放出を抑制することを報告している（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９８４ １４：７９９−８０７）。しかし、ＲＢＬ／２Ｈ３細胞にＩｇＥを固着した後に、化学伝達物質の放出を抑制した報告は初めてであり、これはＦａｂ−６ＨＤ５がＩｇＥ−ＦｃεＲ１の競合阻害でないことを示している。

【0043】

実施例６（フローサイトメトリー）
Ｆａｂ−６ＨＤ５のＩｇＥに対する結合部位を調べるために、フローサイトメトリーを用い次の実験を行った。
ＲＢＬ／２Ｈ３をＦＩＴＣ−ＳＰＥ−７（ａｎｔｉ−ＤＮＰ ＩｇＥ^ｂ：ＩｇＥ．λ、κ）及びＦＩＴＣ−１４２ａ（ａｎｔｉ−ＴＮＰ ＩｇＥ^ａ：ＩｇＥ，κ）と種々の抗体群（ａｎｔｉ−λ、ａｎｔｉ−κ、Ｆａｂ−６ＨＤ５、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２、Ｒａｔ ＩｇＧ）＋ＰＥ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ａｎｔｉ−ｒａｔ ＩｇＧ（二次抗体）との組み合わせにて２重染色を行い、ＲＢＬ／２Ｈ３上のＩｇＥ分子に対して抗体群が結合の程度を共発現により観察した。
図２及び３に示すように、陽性コントロールであるＳＰＥ−７^＋、λ^＋細胞は８４．６７％陽性であったＳＰＥ−７^＋、Ｆａｂ−６ＨＤ５^＋細胞は９１．１％陽性であった。それに反して、ＳＰＥ−７^＋、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２^＋は６４．７％であった。陰性コントロールであるＳＰＥ−７^＋ｒａｔ ＩｇＧ^＋は３．９５％であった。また、１４２ａ（ａｎｔｉ−ＴＮＰ ＩｇＥ^ａ（ＩｇＥ，κ）を用いた実験においても同様の結果を得た。即ち、陽性コントロールである１４２ａ^＋、κ^＋陽性細胞は９３．４％、１４２ａ＋、Ｆａｂ−６ＤＨ５＋細胞は８２．２％であったが、１４２ａ^＋、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２^＋細胞は４３．０％であった。陰性コントロールである１４２ａ＋、Ｒａｔ ＩｇＧ＋は０．６４％であった。
またＦＩＴＣ−ＩｇＥ（ＳＰＥ−７，１４１ａ）と各種抗体群（ａｎｔｉ−λ、ａｎｔｉ−κ、Ｆａｂ−６ＨＤ５，Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２，Ｒａｔ ＩｇＧ）をあらかじめ１時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、ＲＢＬ／２Ｈ３と培養してＩｇＥと各種抗体との競合阻害をみた。Ａｓ ｓｈｏｗｎ Ｆｉｇ １ｂに示すように、陽性コントロールであるＳＰＥ−７＋、λ＋細胞は９２．３％陽性であった（１）。ＳＰＥ−７＋、Ｆａｂ−６ＨＤ５＋細胞は９０．２％陽性であった。それに反して、ＳＰＥ−７＋、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２＋は強力に阻害し４．０５％であった。陰性コントロールであるＳＰＥ−７^＋ｒａｔ ＩｇＧ^＋は３．９５％であった。
１４２ａ（ａｎｔｉ−ＴＮＰ ＩｇＥａ（ＩｇＥ，κ）を用いた実験においても同様の結果を得た。即ち、陽性コントロールである１４２ａ＋、κ＋陽性細胞は８８．８％、１４２ａ＋、Ｆａｂ−６ＤＨ５＋細胞は９７．７％であったが、１４２ａ＋、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２＋細胞は強く阻害し１．０９％であった。陰性コントロールである１４２ａ＋、Ｒａｔ ＩｇＧ＋は０．５８％であった。
上記の結果は、Ｆａｂ−６ＨＤ５がマスト細胞上に固着しているＩｇＥと結合していることを示し、一方、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２はマスト細胞上のＦｃεＲ１とＩｇＥの結合部位近傍を認識しているため図２ではＩｇＥ＋、Ｆａｂ−ＨＭＫ−１２＋は６４．７％、４３．０％でｄｉｍに染色され、図３ではＨＭＫ−１２がＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を阻害するためにＩｇＥ＋ＨＭＫ−１２＋細胞が殆ど検出できないことが判明した。ＦＩＴＣ−ＩｇＥのマスト細胞への結合がＦａｂ−ＨＭＫ−１２によって阻止され、ＨＭＫ−１２＋ＩｇＥ＋細胞が検出されなかったと考えられる。

【0044】

実施例７（ウェスタンブロット）
Ｆａｂ−６ＨＤ５のＩｇＥにたいする結合部位をさらに詳細に検索するためにＩｇＥ産生ハイブリドーマをクローニングし、ＩｇＥのＦｃ部分の断片ＩｇＥ（ＣＨ１−４）を作製した。Ｆａｂ−６ＨＤ５を用いて、ウェスタン・ブロットを行うと６ＨＤ５はＣＨ１、ＣＨ３、ＣＨ４には反応せず、ＣＨ２とのみ強く反応した（図４及び図５）。この結果、Ｆａｂ−６ＨＤ５はＩｇＥＣε２に結合し、オマリズマブの認識部位であるＩｇＥのＦｃεＲ１への結合部位（ＩｇＥε３）とは異なることが判明した。

【0045】

モノマーである分子量約５万の（Ｆａｂ−６ＨＤ５）は、マスト細胞上のＩｇＥ（ＦｃεＲＩ−Ｂｕｎｄ ＩｇＥ）のＩｇＥＣε２に直接結合することにより、Ｉ型アレルギー反応をＩｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにも強く抑制することが判明した。今まで、抗ＩｇＥ抗体のアレルギー抑制機序としてはすべてＩｇＥとＦｃＲＩの結合阻害によるものである。
本発明のＦａｂ−６ＨＤ５は、全く新しい機序、即ちマスト細胞上のＩｇＥＣε２に直接結合することににより強力にＩ型アレルギー反応を阻止する抗体である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】