特許 6945557 光学走査顕微鏡および検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6945557

(24)【登録日】2021年9月16日

(45)【発行日】2021年10月6日

(54)【発明の名称】光学走査顕微鏡および検査方法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20210927BHJP

   G01N 21/17 20060101ALI20210927BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/00

   G01N21/17 A

【請求項の数】16

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2018-559780(P2018-559780)

(86)(22)【出願日】2017年5月12日

(65)【公表番号】特表2019-517027(P2019-517027A)

(43)【公表日】2019年6月20日

(86)【国際出願番号】EP2017061470

(87)【国際公開番号】WO2017194742

(87)【国際公開日】20171116

【審査請求日】2020年1月29日

(31)【優先権主張番号】102016108987.7

(32)【優先日】2016年5月13日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】511079735

【氏名又は名称】ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣＭＳ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン シューマン

(72)【発明者】

【氏名】アルブレヒト ヴァイス

(72)【発明者】

【氏名】トビアス バウアー

(72)【発明者】

【氏名】コーネル ペーター ゴンシオア

【審査官】 岡田 弘

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０６７５２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５１７６８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１９１４９６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ ２１／００

Ｇ０２Ｂ ２１／０６−２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光学走査顕微鏡（１，２，３）であって、
前記光学走査顕微鏡（１，２，３）は、光源（１００）から出発する光源区間（１００〜１０３）、偏光依存性の第１のビームスプリッタ（１０５ａ）および偏光依存性の第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）、ならびに、前記偏光依存性の第１のビームスプリッタ（１０５ａ）と前記偏光依存性の第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）との間の第１の光学チャネル（２１）および第２の光学チャネル（２２）を有する照明装置（２０）を備え、
・前記光源区間（１００〜１０３）は、第１の時間範囲では主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光を含み、第２の時間範囲では主としてもしくは専ら第２の主偏光方向の光を含む第１の照明光ビーム（２０３）を放射するように構成されており、
・前記第１のビームスプリッタ（１０５ａ）は、前記第１の主偏光方向の光の少なくとも大部分を前記第１の光学チャネル（２１）へガイドし、前記第２の主偏光方向の光の少なくとも大部分を前記第２の光学チャネル（２２）へガイドするように構成されており、
・前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）は、前記第１の光学チャネル（２１）からの前記第１の主偏光方向の光と、前記第２の光学チャネル（２２）からの前記第２の主偏光方向の光と、から第２の照明光ビーム（２０４）を形成するように構成されており、
・各前記光学チャネル（２１，２２）は、前記第１の光学チャネル（２１）からの前記第１の主偏光方向の光と、前記第２の光学チャネル（２２）からの前記第２の主偏光方向の光と、をそれぞれ異なる集束角度で放射するように構成されている、
光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項2】

前記光源区間（１００〜１０３）は、前記第１の照明光ビーム（２０３）をコリメートして放射するように構成されている、
請求項１記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項3】

前記第１のビームスプリッタ（１０５ａ）の上流に第１の光学素子（１０４）が配置されており、前記第１の光学素子（１０４）は、前記第１の照明光ビーム（２０３）をフォーカシングしかつ集束させて前記第１のビームスプリッタ（１０５ａ）へ入射させるように構成されている、
請求項２記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項4】

前記第１の光学チャネル（２１）は、光の少なくとも大部分を発散させて前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）へ入射させるように構成されており、
前記第２の光学チャネル（２２）は、光の少なくとも大部分をコリメートして前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）へ入射させるように構成されている、
請求項３記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項5】

前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）の下流に第２の光学素子（１０８）が配置されており、前記第２の光学素子（１０８）は、前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）によって発散して放射される光をコリメートしかつ前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）によってコリメートされて放射される光をフォーカシングするように構成されている、
請求項４記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項6】

対物レンズ収容部（１１）内に取り付け可能でありかつ対物レンズ位置（１０）において位置決め可能であって、後側対物瞳（１０９）を含む対物レンズ（１２）が設けられており、
前記第２の光学素子（１０８）は、前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）からコリメートされて出射される光を前記後側対物瞳（１０９）の平面へフォーカシングするように構成されている、
請求項５記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項7】

前記第２の光学チャネル（２２）内にベルトランレンズ装置（１０６ａ，１０６ｂ）の少なくとも一部が用意されている、
請求項１から６までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項8】

前記照明装置（２０）内に前記第１の主偏光方向の光によりオルソスコピックビーム路（２００）が形成され、前記第２の主偏光方向の光によりコノスコピックビーム路（２０１）が形成される、
請求項１から７までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項9】

前記第１の時間範囲の前記第１の主偏光方向の光と、前記第２の時間範囲の前記第２の主偏光方向の光と、を含む前記第１の照明光ビーム（２０３）を放射するために、切り替え可能な遅延素子（１０２）が用意されている、
請求項１記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項10】

前記照明装置（２０）は、走査ユニット（１０３）を含む、
請求項１から９までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項11】

前記第１の光学チャネル（２１）に沿って複数の光学素子（１０４，１０８）が用意されており、前記複数の光学素子（１０４，１０８）は、走査装置（１０３）の１つもしくは複数の実偏向点または虚偏向点を対物瞳（１０９）内またはその近傍へ結像するガリレオ望遠鏡を形成するように構成および配置されている、
請求項１から１０までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項12】

前記第１の光学チャネル（２１）内かつ／または前記第２の光学チャネル（２２）内に光学シャッタが配置されている、
請求項１から１１までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項13】

前記第１のビームスプリッタおよび前記第２のビームスプリッタ（１０５ａ，１０５ｂ）ならびに前記第１の光学チャネル（２１）および前記第２の光学チャネル（２２）は、前記光学走査顕微鏡（１，２，３）から取り出し可能な挿入部材に配置されている、
請求項１から１２までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項14】

広視野顕微鏡に部分モジュールとして適合させるための手段を含む、
請求項１から１３までのいずれか１項記載の光学走査顕微鏡（１，２，３）。

【請求項15】

光学走査顕微鏡（１，２，３）を用いて試料を検査する方法であって、
前記光学走査顕微鏡（１，２，３）は、光源区間（１００〜１０３）、偏光依存性の第１のビームスプリッタ（１０５ａ）および偏光依存性の第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）、ならびに、前記第１のビームスプリッタ（１０５ａ）と前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）との間の第１の光学チャネル（２１）および第２の光学チャネル（２２）を有する照明装置（２０）を備え、
・前記光源区間（１００〜１０３）を用いて、第１の時間範囲では主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光を含み、第２の時間範囲では主としてもしくは専ら第２の主偏光方向の光を含む第１の照明光ビーム（２０３）を放射し、
・前記第１のビームスプリッタ（１０５ａ）を用いて、前記第１の主偏光方向の光の少なくとも大部分を前記第１の光学チャネル（２１）へガイドし、前記第２の主偏光方向の光の少なくとも大部分を前記第２の光学チャネル（２２）へガイドし、
・前記第２のビームスプリッタ（１０５ｂ）を用いて、前記第１の光学チャネル（２１）からの前記第１の主偏光方向の光と、前記第２の光学チャネル（２２）からの前記第２の主偏光方向の光と、から第２の照明光ビーム（２０４）を形成し、
・前記第１の光学チャネル（２１）を用いた第１の偏光状態の光と、前記第２の光学チャネル（２２）を用いた第２の偏光状態の光と、をそれぞれ異なる集束角度で放射する、
方法。

【請求項16】

請求項１から１４までのいずれか１項記載の走査顕微鏡（１，２，３）を使用する、
請求項１５記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、各独立請求項の上位概念記載の光学走査顕微鏡および対応する検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

今日の機能生理学では、しばしば生物系における動的プロセスの研究が関心対象となっている。当該研究では、顕微鏡検査試料の空間的かつ時間的なインタラクション手段またはマニピュレーション手段に中心的意義がある。このために、ＦＲＡＰ（光褪色後蛍光回復法）、ＦＬＩＰ（光褪色蛍光減衰法）、Uncaging法および光活性化法などのプロセスが公知である。こうしたプロセスでは、検査すべき試料がマニピュレーションのために典型的にはフォーカシングされたレーザービームによって走査され、その際に（オルソスコピックビーム路で使用される）走査装置が使用される。

【0003】

また、光学カット手段を備えた広視野顕微鏡における実験経過を検出することが所望されている。このための手段として、例えば、対物レンズの入射瞳へレーザービームをフォーカシングし、これにより対物野の面状の照明を達成するＴＩＲＦ顕微鏡検査（全反射蛍光顕微鏡検査）が挙げられる。こうした照明は、入射瞳でのレーザービームの位置によって定められる、調整可能な角度において行われる。試料カバーガラスと水性試料との界面を通らない伝搬の生じる角度で照明が行われると、全反射が生じ、界面がエバネセント波によって薄く照明される。照明角度を正確に調整するには、入射瞳でのレーザービームの位置を制御する装置が不可欠である。この場合にも（コノスコピックビーム路で使用される）走査装置を利用することができる。

【0004】

さらなる詳細については、関連技術文献、例えば、ＴＩＲＦ顕微鏡検査に関するD.Axelrod, Traffic 2, 764頁−774頁（2001）、共焦点顕微鏡の走査装置を用いた顕微鏡検査試料の走査ベースのマニピュレーションに関するE.A.J.Reits, Nat.Cell Biol.3, E145頁−E147頁（2001）を参照されたい。入射瞳でのレーザービームの位置決めについては、例えば独国特許出願公開第１０２００６０３３３０６号明細書（ＤＥ１０２００６０３３３０６Ａ１）を参照されたい。

【0005】

オルソスコピックビーム路とコノスコピック光路とを切り替えるために、例えば、米国特許第７１８７４９４号明細書（ＵＳ７１８７４９４Ｂ２）によれば、オルソスコピック走査装置のビーム路内にベルトランレンズ装置を移動させ、これによりコノスコピック走査装置を実現することができる。ただし、このことには、ミラー、プリズムおよびレンズ装置の機械的運動が複雑であり、しかも、課題提起において要求される、関連の生物的タイムスケールを下回る、例えば１０ｍｓ未満の切り替え時間に対して不適合であるという欠点がある。

【0006】

米国特許第７５７３６３５号明細書（ＵＳ７５７３６３５Ｂ２）には、走査装置そのものを用いた切り替えが記載されている。ただし、ここに記載されている方法は複雑なミラー装置を必要とする。なぜなら、走査顕微鏡ユニットが複数回の反射をともなうコノスコピックビーム路において利用され、このことが相応の装置を複雑にし、取り扱いを困難にするからである。

【0007】

欧州特許第１７５２８０９号明細書（ＥＰ１７５２８０９Ｂ２）から、オルソスコピック照明ビーム路とコノスコピック照明ビーム路との統合装置が公知である。しかし、これは、コノスコピック照明においてつねに対物瞳の一部しかアクセス可能でないという欠点を有する。

【0008】

独国特許出願公開第１０２０１３２２２５６２号明細書（ＤＥ１０２０１３２２２５６２Ａ１）から、オルソスコピックビーム路およびコノスコピックビーム路を形成できる照明装置が公知である。ここではリングミラーが使用される。リングミラーの中央部すなわちその非反射領域または相応の切欠を通って入射する照明光ビームが、オルソスコピックビーム路を形成するために用いられる。リングミラーの周部すなわちその反射領域に入射する照明光ビームは、コノスコピックビーム路を形成するために用いられる。よって、この場合も、それぞれオルソスコピックビーム路またはコノスコピックビーム路を形成するビーム路断面の一部しか利用することができない。

【0009】

こうした背景から、本発明で提起する課題は、殊に、瞳でのレーザービームの監視および顕微鏡の対物野におけるレーザービームの走査の双方を同一の走査ユニットにより行えるようにすることである。また、走査ユニットの２種の用途の切り替えを高速に行い、これにより約１００Ｈｚの典型的な撮像速度のもとで顕微鏡検査による生体細胞実験において中断が生じないようにする。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明によれば、各独立請求項の特徴を有する光学走査顕微鏡およびこうした走査顕微鏡を用いて試料を検査する方法が提案される。有利な各構成は、各従属請求項および以下の説明の対象となっている。

【0011】

本発明は、走査顕微鏡においていずれの時点でもオルソスコピックビーム路およびコノスコピックビーム路の双方を利用可能状態に維持し、偏光性のビーム分割によりこれら２つのビーム路の切り替えを実現するという基本的思想を基礎としている。２つのビーム路の組み合わせも偏光光学手段により実現する。

【0012】

本発明は、こうした背景から、光源から出発する光源区間、偏光依存性の第１のビームスプリッタおよび第２のビームスプリッタ、ならびに第１のビームスプリッタと第２のビームスプリッタとの間の第１の光学チャネルおよび第２の光学チャネルを有する照明装置を備えた光学走査顕微鏡を提案する。光学走査顕微鏡の光源区間には、公知のタイプの走査ユニットが組み込まれるが、これは基本的に公知であって、さらに以下でも説明する。

【0013】

ここで「偏光依存性のビームスプリッタ」（英語：Polarizing Beam Splitter, PBS；所定の構造形態で地域によっては「偏光プリズム」とも称される）をいう場合、これは、種々の偏光方向の光をそれぞれ異なって偏向する光学素子であると理解されたい。例えば、偏光ビームスプリッタは、第１の偏光方向の光を偏向せずに通過させ、これに対して、異なる第２の偏光方向の光を、構造形状および光学材料によって定められる角度で偏向させることができる。偏光ビームスプリッタについての技術知識およびここでの基礎となる物理的基礎に関しては、簡明性のために、関連技術文献、例えば、Bennett,J.M.: Polarizers, Kapitel 3, in: Bass,M.E. et al.(Hrsg.): Handbook of Optics. Fundamentals, Techniques & Design, Band 2, New York: McGraw-Hill, 2.Auflage 1995を参照されたい。

【0014】

ここで提案している光学走査顕微鏡では、光源区間が、第１の主偏光方向の光および第２の主偏光方向の光を含む第１の照明光ビームを放射するように構成される。

【0015】

ここで、「第１の主偏光方向の光」または「第２の主偏光方向の光」とは、本発明においては、主としてもしくは専ら、第１の偏光方向もしくは第２の偏光方向で生じる光波またはこれらの偏光方向がそれぞれ例えば±１０℃、±５℃または±１℃の狭く限定された角度領域にある光波を含む光であると理解される。不完全な偏光状態により、１つもしくは複数の別の偏光方向においても僅かな成分が生じうる。相応の光が「主としてもしくは専ら」第１の偏光方向または第２の偏光方向で生じる光波を含むという表現は、ここでは、例えば異なる偏光方向の光が２５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満しか生じないことを表す。第１の偏光方向および第２の偏光方向は、相互に直交するように配向されている。この場合、直交する配向状態は、２つの偏光方向で生じる円偏光の光および直線偏光の光の双方を含む。

【0016】

ここで、第１の主偏光方向の光および第２の主偏光方向の光は、本発明では、同時に、すなわち１つの時点で同一の照明光ビームとして形成可能である。この場合、照明光ビームは、直交する主偏光方向の線形結合に相当する偏光状態の相応の照明光を含む。ただし、照明光ビームは、順次にも、すなわち第１の主偏光方向についで第２の主偏光方向でも放射可能であり、このことは以下でも説明する。後者の場合、照明光ビームは、第１の時間範囲では主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光を含み、第２の時間範囲では主としてもしくは専ら第２の主偏光方向の光を含む。また、当該光はここでは必ずしも完全に偏光されていなくてよい。異なる偏光方向の残留光を消去するために、例えば、後述する光学シャッタを備えた装置を使用することができる。

【0017】

本発明の基本的思想、すなわちオルソスコピックビーム路およびコノスコピックビーム路を同時に用意するという思想は、第１のビームスプリッタと第２のビームスプリッタとの間でそれぞれ異なる光学チャネルを使用することにより実現される。このために、本発明の走査顕微鏡の第１のビームスプリッタは、第１の照明光ビームの第１の主偏光方向の光の少なくとも大部分が第１のチャネルでガイドされ、第１の照明光ビームの第２の主偏光方向の光の少なくとも大部分が第２のチャネルでガイドされるように構成される。したがって、第１のビームスプリッタでは、第１の主偏光方向の光または第２の主偏光方向の光のそれぞれ異なる「処理」が行われる。

【0018】

よって、光源区間と第１のビームスプリッタとの間で共通のビーム路区間を走行する照明光ビームは、偏光に依存して、第１のチャネル内または第２のチャネル内をガイドされる。こうした手段により、例えば２つのチャネルの異なる光学長さのみによって既に、かつ／または２つのチャネル内の異なる光学素子によって、第１のチャネルの光が第２のチャネルの光とは異なって制御可能となる。

【0019】

本発明により２つのチャネル内をガイドされる、第１の主偏光方向の光または第２の主偏光方向の光は、続いて、再び共通のビーム路区間内をガイドされる。このために、本発明によれば、第２のビームスプリッタは、第１のチャネルからの第１の主偏光方向の光と、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光と、から第２の照明光ビームを形成するように構成される。

【0020】

ここで、例えば光源区間により、第１の時間範囲において、主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光を含む照明光ビームが放射される場合、この光は主としてもしくは専ら第１のチャネルへ入射し、そこから第２のビームスプリッタへ入射する。ついで、第２のビームスプリッタが、主としてもしくは専ら第１のチャネルからの光から、第２の照明光ビームを形成する。こうした手段により、第２の照明光ビームは、主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光を含む。当該光源区間により、主としてもしくは専ら第２の主偏光方向の光を含む照明光ビームが放射される第２の時間範囲では、この光は第１のビームスプリッタを介して主としてもしくは専ら第２のチャネル内へ入射し、そこから第２のビームスプリッタへ入射する。こうした手段により、第２のビームスプリッタは、主としてもしくは専ら、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光から、第２の照明光ビームを形成する。

【0021】

これに対して、光源区間により、照明光ビームが第１の主偏光方向の光および第２の主偏光方向の光を同時に含む状態で放射される場合、第１の主偏光方向の光は第１のビームスプリッタを介して主としてもしくは専ら第１のチャネルへ入射し、第２の主偏光方向の光は主としてもしくは専ら第２のチャネルへ入射する。第１の主偏光方向の光および第２の主偏光方向の光の双方が同時に第１のチャネルおよび第２のチャネルからビームスプリッタへ入射して、これにより第２の照明光ビームが第１の主偏光方向および第２の主偏光方向で同時に形成され、場合により望ましくない結果をまねくことを回避するため、第１のチャネル内および／または第２のチャネル内に、それぞれ、第１のチャネルまたは第２のチャネルの一方をそのつど光学的にブロックする適切な光学シャッタを形成することができる。こうした手段によっても、第２のビームスプリッタを用いて、２つの主偏光方向のうちつねに一方のみの光から第２の照明光ビームが形成されることを保証できる。

【0022】

既述のように、本発明によれば、上記の２つの光学チャネルが、第１のチャネルからの第１の主偏光方向の光と、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光と、をそれぞれ異なる集束角度で放射するように構成される。

【0023】

例えば、第１のチャネルは、第１の主偏光方向の光を発散性の光ビームまたは光束の形態で放射するように構成可能であり、第２のチャネルは、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光をコリメート光ビームの形態で放射するように構成可能である。このために、既述のように、それぞれ異なる光学距離および／またはそれぞれ異なる光学素子が２つのチャネルに設けられる。なお、基本的には、オルソスコピックビーム路およびコノスコピックビーム路の並列での用意は、ここで説明したのとは別の方式でも可能であり、以下に説明する。

【0024】

有利には、相応の走査顕微鏡では、光源区間は、第１の照明光ビームがコリメート光束の形態で形成されるように、すなわち光源が無限へ向かって結像されるように構成される。また、２つの異なるチャネルにより、走査ユニットが後にオルソスコピックビーム路に沿って対物瞳へ結像されて、そこから対物側のテレセントリック対物レンズを通して無限へ向かって結像され、その際に、光源が試料（対物レンズの前方焦点面）へ結像される構成、または走査ユニットがコノスコピックビーム路に沿って試料へ結像され、その際に光源が無限内にとどまる構成のいずれかが可能である。

【0025】

有利には、第１のビームスプリッタの上流に第１の光学素子が配置されており、この第１の光学素子は、コリメート光束の形態で形成された照明光ビームを集束光束の形態で第１のビームスプリッタへ入射させるように構成される。本発明において、有利には、第１のビームスプリッタは集束制御特性を有さないので、集束光束の形態で第１のビームスプリッタへ入射する光は、そこから集束状態でも既述のチャネルへガイドされる。第１の光学素子は、最も単純な場合、例えば、場合により適切な光学コレクタ手段を含む集光レンズの形態で形成することができる。第１の光学素子は、照明光ビームのコリメート光束を第１の光学素子の像側の平面へフォーカシングする。こうした手段により、第１の光学素子を用いてフォーカシングされた光は第１の光学素子の焦点を超えた先で発散し、このようにして、さらなる光学制御部なしに、例えば第１のチャネルから発散光束の形態で当該光を出射させ、第２のビームスプリッタへ入射させることができる。第２の光学チャネルでは、焦点を超えた先で発散する相応の光束を、適切な光学素子および偏向装置により偏向し、コリメートして第２のチャネルから出射させ、第２のビームスプリッタへ入射させることができる。このために特に、独国特許出願公開第１０２０１３２２２５６２号明細書（ＤＥ１０２０１３２２２５６２Ａ１）から公知のように、ベルトランレンズ装置の一部を第２のチャネル内に設けることができる。ベルトランレンズ装置の残りの部分は、有利には、後述する第２の光学素子によって形成され、この第２の光学素子は、第２のビームスプリッタを超えた先に配置される、例えばチューブレンズである。

【0026】

既述のように、有利には、第１のチャネルは、光の少なくとも大部分を発散させて第２のビームスプリッタへ入射させるように構成され、第２のチャネルは、有利には、光の少なくとも大部分をコリメートして第２のビームスプリッタへ入射させるように構成される。第１のチャネルが主としてもしくは専ら第１の主偏光方向の光をガイドするので、この光は第１のチャネルから発散光束の形態で出射され、第２のビームスプリッタへ入射する。これに対して、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光は、コリメート光束の形態で第２のビームスプリッタへ入射する。相応の光は、第２のビームスプリッタを通過した後、それぞれ所望の方式で光学的に制御可能である。

【0027】

有利には、特に第２のビームスプリッタの下流に既述の第２の光学素子が配置され、この第２の光学素子は、第２のビームスプリッタから発散して放射される光を（主としてもしくは専ら第１の主偏光方向で）コリメートし、第２のビームスプリッタから発散して放射される光を（主としてもしくは専ら第２の主偏光方向で）フォーカシングするように構成される。特に、第２の光学素子は、走査顕微鏡のチューブレンズであってよい。

【0028】

相応に特に、コリメート光を対物レンズに入射させることができ、ここで、当該コリメート光が後側対物瞳へ入射する際の角度を走査ユニットによって変化させることができる。こうした手段により、走査照明および試料マニピュレーションを実行可能である。コリメート光束を第２のビームスプリッタから後側対物瞳へフォーカシングして、走査ユニットによって後側対物瞳での横方向焦点位置を制御することにより、例えばエバネセント照明を実現できる。これにより、対物レンズがここでのコリメート光束の出射角度、ひいては試料へのまたは浸漬媒体もしくはカバーガラスと試料との界面への光束の入射角度が制御される。

【0029】

したがって特に有利には、本発明は、対物レンズ収容部に取り付け可能でありかつ対物位置において位置決め可能であって、後側対物瞳を含む対物レンズを備え、第２の光学素子が第２の主偏光方向の光を後側対物瞳の平面へフォーカシングするように構成された、光学走査顕微鏡に関連する。これに対して、第２の光学素子によってコリメートされた第１の主偏光方向の光は、後側対物瞳を通ってコリメート形態で入射する。

【0030】

同様に既述のように、光源区間により、第１の主偏光方向の光と第２の主偏光方向の光とを同時に形成することができるか、または第１の主偏光方向の光を第１の時間範囲で形成し、第２の主偏光方向の光を第２の時間範囲で形成することができる。後者の場合、好ましくは、使用される光源区間により、第１の主偏光方向の光と第２の主偏光方向の光との高速の切り替えが行われる。

【0031】

第１の主偏光方向の光と第２の主偏光方向の光との相応の高速の切り替えのために、有利には、切り替え可能な遅延素子が用いられる。当該切り替え可能な遅延素子は、例えば、光源区間のビーム路内へ傾動可能にまたはビーム路内へ回動可能に配置された遅延プレート、例えば半波長板または相応の複数のプレートを含むことができる。なお、遅延素子として電気光学装置および／または音響光学装置および／または液晶ベースで実現される装置を使用すると特に有利である。偏光の光を形成する相応の素子は従来技術から基本的に公知であり、これについては関連技術文献を参照することができる。

【0032】

これに対して、基本的に同様に可能な構成として、それぞれ異なる２つの偏光レーザーの光を用いて第１の照明光ビームに統合することにより、または一方の主偏光方向に沿った光の不充分な偏光、例えば偏光光学モジュールの不完全性により、光源区間を通してそれぞれ異なる２つの主偏光方向を有する光が同時に放射される場合、相応の遅延素子に代えてまたはこれに加えて、高速のシャッタをチャネルの一方または双方に設けることができる。このケースで第１のチャネルからの第１の主偏光方向を有する光が必要となるときにはつねに、第２のチャネルが相応のシャッタによって阻止され、逆も同様である。相応の高速のシャッタは、例えば同期回転する複数の絞りもしくは複数の絞りセグメント、複数のアイリス絞り、複数の高速ＬＣＤ装置、複数の電気光学素子および／または複数の音響光学素子の形態で構成可能である。

【0033】

本発明の特に好ましい実施形態による光学走査顕微鏡では、第１のチャネルに沿って、走査装置の１つもしくは複数の実偏向点または虚偏向点を対物瞳内またはその近傍へ結像するガリレオ望遠鏡を形成するように構成および配置された光学素子が用意される。「実偏向点または虚偏向点」とは、ここでは、相応の走査ユニット上で光源の光が空間的に限定されて（「点状に」）偏向され、これにより走査光ビームが形成される点をいう。実偏向点とは、相応の偏向点が実際に設けられている素子、例えばミラーによって形成されることをいい、「虚」偏向点とは、空間における相応の素子の像である。

【0034】

本発明の照明装置が取り外し可能に構成され、特に第１のビームスプリッタおよび第２のビームスプリッタならびにこれらのビームスプリッタの間に形成された第１のチャネルおよび第２のチャネルが走査顕微鏡から取り外し可能な挿入部材に配置される場合、特に有利である。有利には、光学走査顕微鏡は、広視野顕微鏡に部分モジュールとして適合させるための手段を含む。

【0035】

本発明は、光源区間、偏光依存性の第１のビームスプリッタおよび第２のビームスプリッタ、ならびに第１のビームスプリッタと第２のビームスプリッタとの間の第１の光学チャネルおよび第２の光学チャネルを有する照明装置を備えた光学走査顕微鏡を用いて試料を検査する方法もカバーする。

【0036】

本発明の方法では、光源区間を用いて第１の主偏光方向の光および第２の主偏光方向の光を含む第１の照明光ビームを放射し、第１のビームスプリッタを用いて第１の主偏光方向の光の少なくとも大部分を第１のチャネルへガイドし、第２の主偏光方向の光の少なくとも大部分を第２のチャネルへガイドし、第２のビームスプリッタを用いて、第１のチャネルからの第１の主偏光方向の光と、第２のチャネルからの第２の主偏光方向の光と、から第２の照明光ビームを形成し、第１のチャネルを用いた第１の偏光状態を有する光と第２のチャネルを用いた第２の偏光状態を有する光とをそれぞれ異なる集束角度で放射させるように構成される。

【0037】

特に、相応の方法において、上で詳しく説明した走査顕微鏡を用いることができる。相応の方法の特徴および利点については上の明示的説明を参照されたい。

【0038】

本発明のさらなる利点および構成は、説明および添付図から得られる。

【0039】

上述および下述の特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、それぞれ提示した組み合わせのみならず、他の組み合わせにおいてもまたは単独でも使用可能であることが理解される。

【0040】

本発明を、実施例に即して概略的に図示し、以下に図を参照しながら説明する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】本発明の一実施形態による、照明装置を備えた走査顕微鏡のビーム路を示す簡単化された概略図である。

【図2】本発明の一実施形態による、照明装置を備えた走査顕微鏡のビーム路を示す簡単化された概略図である。

【図3】本発明の一実施形態による、照明装置を備えた走査顕微鏡のビーム路を示す簡単化された概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

図中、相互に対応する要素には同じ参照番号を付してある。見取りやすさのために繰り返しての説明は省略する。

【0043】

図１〜図３には、それぞれ、本発明の一実施形態による、照明装置を備えた走査顕微鏡のビーム路が簡単化された概略図で示されている。ここで、図１〜図３に示されている実施形態は、複数の共通の素子を含み、以下ではまず図１を参照しながらこれらを説明する。当該説明は他の図にも該当する。

【0044】

図１に示されている走査顕微鏡は、ここでは全体として大幅に概略的な図示となっているが、破線で囲まれて参照番号１を付されており、対物レンズ位置１０で、対物レンズ収容部１１内に収容された対物レンズ１２を含んでいる。種々のタイプの対物レンズ収容部、例えば対物レンズ回転器、リニア対物レンズ交換機構およびこれらに類似のものを設けることができる。対物レンズ１２の対物瞳には参照番号１０９が付されている。

【0045】

相応の走査顕微鏡の照明装置には、全体として参照番号２０が付されている。オルソスコピックビーム路は参照番号２００で、コノスコピックビーム路は参照番号２０１（破線）で示されている。ここで、オルソスコピックビーム路２００およびコノスコピックビーム路２０１は、照明装置２０またはその内部に実現されているビーム路の所定の共通の区間を共通に延在し、これに対して第１の光学チャネル２１内および第２の光学チャネル２２内を相互に別個に延在する。第１のチャネル２１および第２のチャネル２２は、ここでは、それぞれ偏光依存性の第１のビームスプリッタ１０５ａと偏光依存性の第２のビームスプリッタ１０５ｂとの間に形成されている。

【0046】

オルソスコピックビーム路２００とコノスコピックビーム路２０１とを切り替えるために、光源１００によって形成された照明光ビームの、例えば相互に直交する２つの主偏光方向が用いられる。このために、偏光照明光を相応に予め形成する相応の光源１００を用いることができる。光源１００は、例えば、レーザー光源、または偏光を行う光ファイバもしくは適切な偏光素子、または未偏光の光用の、相応の偏光素子を含む光源であってよい。

【0047】

相応の光源１００によって形成された照明光ビームの主偏光方向の切り替えは、ここでは大幅に簡単化されて参照番号１０２で示されている種々の装置によって実現することができる。例えば、相応の装置１０２は機械的に高速に切り替え可能な遅延素子（例えば半波長板）を含むことができ、この遅延素子は好ましくは、ビーム路または照明光ビームが小さなビーム径および一定のビーム位置を有する箇所に配置されている。例えば、相応の遅延素子または相応の装置１０２は、ファイバコリメータとここでは簡単化されて参照番号１０１で示されているビーム拡大装置との間に配置することができる。

【0048】

相応の装置１０２によって主偏光方向を切り替える別の手段として、例えば、従来技術から基本的に公知の音響光学素子、電気光学素子または液晶素子が挙げられる。

【0049】

図１に示されている本発明の実施形態では、光源１００、装置１０２、ビーム拡大装置１０１およびスキャン装置１０３から形成される光源区間が、つねに、第１の主偏光方向の光または第２の主偏光方向の光のいずれかを供給している。これとは異なる実施形態は例えば図３を参照して説明する。

【0050】

スキャン装置または走査ユニット１０３は、それ自体公知の形式で構成されており、例えば傾動可能なミラー、回動可能なプリズムおよび／または同様に基本的に従来技術から公知の音響光学手段を含む。したがって、全体として、光源区間１００〜１０３により、ここでは参照番号２０３で示されている照明光ビームが形成され、この照明光ビームは、選択的に第１の主偏光方向または第２の主偏光方向を有し、図示の例ではコリメート形態で走査ユニット１０３から放射される。

【0051】

続いて、照明光ビーム２０３は、１つもしくは複数のレンズから成る第１の光学素子１０４を通過し、この第１の光学素子１０４によってフォーカシングされる。第１の主偏光方向または第２の主偏光方向を有する照明光ビーム２０３は、フォーカシングされてまたは集束されて偏光依存性の第１のビームスプリッタ１０５ａへ入射する。偏光依存性の第１のビームスプリッタ１０５ａの当該境界層では、第２の主偏光方向の光が、ここでは破線のコノスコピックビーム路２０１の形態で示されているように反射され、これに対して第１の主偏光方向の光は偏向されずに境界層を通過する。

【0052】

このようにして、偏向依存性の第１のビームスプリッタ１０５ａは、第１の主偏光方向を有する光を第１の光学チャネル２１へガイドし、第２の主偏光方向を有する光を第２の光学チャネル２２へガイドする。第１のチャネル２１または第２のチャネル２２のそれぞれの焦点を超えた先では、第１の偏光状態の光または第２の偏光状態の光がそれぞれ発散して走行する。図示の例では、第１の主偏光方向を有する光が、ここではオルソスコピックビーム路２００で示されているように第１のチャネル２１へ入射し、この第１のチャネルから発散して出射し、偏光依存性の第２のビームスプリッタ１０５ｂへ入射する。この場合、シャッタ１１０により、偏光依存性の第２のビームスプリッタへのエラー光の入射を防止することができる。

【0053】

図１に示されている実施形態では、第１のチャネル２１に、別の光学素子は設けられていない。これに対して、第２の光学チャネル２２には、別の光学素子１０６ａ，１０６ｂが設けられている。第２のチャネル２２内を走行する、第２の偏光状態を有する光は、さらに偏向素子１０７ａ，１０７ｂを介して偏向される。光学素子１０６ａ，１０６ｂにより、第２の主偏光方向を有する光は第２のチャネル２２においてコリメートされ、コリメート形態で偏光依存性の第２のビームスプリッタ１０５ｂへ入射する。

【0054】

相応に、第１の主偏光方向を有する光は、第１のチャネル２１から、偏光依存性の第２のビームスプリッタ１０５ｂを通過した後、発散してそこから出射し、これに対して、第２の主偏光方向を有する光は、第２のチャネル２２から、第２のチャネルおよび偏光依存性の第２のビームスプリッタ１０５ｂを通過した後、コリメートされてそこから出射する。第２の光学素子１０８、例えばチューブレンズを用いて、第２の光学チャネルからの第２の主偏光方向を有するコリメート光をフォーカシングでき、これに対して、第１の光学チャネルからの第１の主偏光方向を有する光はコリメート可能である。第２の光学素子１０８は、既述の光学素子１０６ａ，１０６ｂとともにベルトランレンズを形成する。第１の光学チャネル２１および第２の光学チャネル２２の構成ならびに上述したレンズの配置により、第１の主偏光方向を有する光は、対物レンズ１２の後側対物瞳１０９内へコリメート形態で入射可能となり、これに対して第２の主偏光方向を有する光は、対物レンズ１２の後側対物瞳１０９内へフォーカシング可能となる。第２の光学素子１０８は、第１の光学素子１０４とともに、スキャン装置１０３によって生じる１つもしくは複数の実偏向点または虚偏向点を対物瞳１０９内またはその近傍へ結像するガリレオ望遠鏡を形成する。

【0055】

対物レンズ１２の先に配置された試料の蛍光の検出は、従来の広視野蛍光顕微鏡によって行うことができる。ここで説明している実施形態の照明装置２０は、こうした広視野蛍光顕微鏡では、蛍光照明ビーム路の適切な箇所に挿入され、取り外し可能に構成することができる。特に有利には、光学素子１０６ａ，１０６ｂ，１０８から形成されるベルトランレンズ装置は可変のフォーカシング部を有し、この可変のフォーカシング部により、例えば種々の対物レンズまたは１つのフォーカシング回転器が利用される場合、対物瞳１０９の種々の機械的位置でのフォーカシングが可能である。特に有利には、上述したように例えばチューブレンズの形態で構成可能な第２の光学素子１０８を、相応にフォーカシング可能なベルトランレンズ装置において一定に支持でき、これにより照明装置２０の交換時にもこれを取り外す必要なく、さらに素子１０４，１０８から形成されるガリレオ望遠鏡の無限焦点も保持される。

【0056】

図２に示されている走査顕微鏡２の実施形態は、シャッタ１１０が存在しない点で、図１に示されている実施形態と異なる。当該シャッタにより、上述したように、図１に示されている走査顕微鏡１の実施形態では、理想的でない偏光に起因するエラー光の除去が可能である。ただし、光源区間１００〜１０３により既に充分な偏光の光が形成されることから当該除去が必要ない場合、当該付加的なシャッタ１１０を省略することもでき、これにより顕微鏡２の機械的構成を簡単化することができる。

【0057】

図３に示されている走査顕微鏡３の実施形態では、図１，図２に示されている実施形態で設けられていた可変の遅延素子または相応の装置１０２が設けられていない。これに代えて、第１のチャネル２１および第２のチャネル２２の双方に高速のシャッタ素子１１０，１１１が設けられている。光源区間１００〜１０３または光源１００は、この場合、例えば固定の偏光状態を有する照明光を形成し、この照明光は、２つの直交する主偏光方向の光の線形結合である。したがって、偏光依存性の第１のビームスプリッタ１０５ａにより、２つのチャネル２１，２２の照明光が偏向される。２つのチャネル２１，２２のシャッタ１１０，１１１を交互に用いることにより、選択的にビーム路をブロックし、このようにしてそれぞれ唯一のチャネルを通して光を対物レンズ１２へ導波することができる。もちろん、シャッタ１１０，１１１を相応に駆動することにより、２つのチャネル２１，２２の双方を通る光または双方とも通らない光を形成することもできる。

【符号の説明】

【0058】

１，２，３ 走査顕微鏡
１０ 対物レンズ位置
１１ 対物レンズ収容部
１２ 対物レンズ
２０ 照明装置
２１ 第１の光学チャネル
２２ 第２の光学チャネル
１００ 光源
１０１ ビーム拡大装置
１０２ 遅延素子
１０３ 走査ユニット
１０４ 第１の光学素子
１０５ａ，１０５ｂ 偏光依存性のビームスプリッタ
１０６ａ，１０６ｂ 別の光学素子
１０７ａ，１０７ｂ ビーム偏向素子
１０８ 第２の光学素子
１０９ 対物レンズの入射瞳
１１０，１１１ シャッタ
２００ オルソスコピックビーム路
２０１ コノスコピックビーム路
２０３ 第１の照明光ビーム
２０４ 第２の照明光ビーム

【図1】

【図2】

【図3】