特許 6947372 炎症性腸疾患を抑制する抗体および該抗体を含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6947372

(24)【登録日】2021年9月21日

(45)【発行日】2021年10月13日

(54)【発明の名称】炎症性腸疾患を抑制する抗体および該抗体を含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20210930BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210930BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210930BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210930BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20210930BHJP

   C12N 5/20 20060101ALN20210930BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210930BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20210930BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P1/04

   A61P43/00 105

   !C07K16/24

   !C12N5/20

   !C12P21/08

   !C12N15/13

【請求項の数】6

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-103265(P2016-103265)

(22)【出願日】2016年5月24日

(65)【公開番号】特開2016-222656(P2016-222656A)

(43)【公開日】2016年12月28日

【審査請求日】2019年5月14日

(31)【優先権主張番号】特願2015-106658(P2015-106658)

(32)【優先日】2015年5月26日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２６年１１月２６日パシフィコ横浜（横浜市西区みなとみらい１−１−１）において開催された第３７回日本分子生物学会年会にて発表

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02055

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02056

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02057

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02058

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】592068200

【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】浅野 謙一

(72)【発明者】

【氏名】田中 正人

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２７３０８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／００２５７６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／００１５４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 腸管センチネルを標的とした炎症性腸疾患治療法の開発, 「炎症の慢性化機構の解明と制御」研究領域 領域活動・評価報告書−平２６年度終了研究課題− (2014) <https://www.jst.go.jp/kisoken/presto/evaluation/posteriori/h26/JST_P08_inflam_2014.pdf>

【文献】 Crit. Care Med. (2002) vol.30, no.5(Suppl.), p.S214-S219

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ＣＤ１６９抗体を含む、炎症性腸疾患治療用の医薬組成物。

【請求項2】

前記ＣＤ１６９が、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ＣＤ１６９が、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ＣＤ１６９が、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記抗体が、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記抗体が、モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組み換え抗体または抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、炎症性腸疾患を抑制する抗体および該抗体を含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ（ＩＢＤ））は、再発と寛解を繰り返しながら徐々に悪化する慢性の腸疾患で、クローン病と潰瘍性大腸炎に分類される。
腸管免疫は、有害な病原性微生物の侵入を排除すると同時に、腸内常在菌や食物などの有益物質に対しては過剰に反応しないよう巧妙に調節されているが、ＩＢＤでは、遺伝的要素や生活習慣等、何らかの原因により腸内細菌に対する寛容が破綻し、異常活性化した免疫細胞が持続的な炎症と組織破壊を惹起すると考えられている。腸炎の発症と炎症の蔓延化には、マクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞が重要な役割を担うと考えられている。しかしながら、粘膜固有層に常在する自然免疫細胞は複数の亜集団で構成される混成集団で、個々の機能も腸炎における役割もほとんどわかっていない。

【0003】

炎症性腸疾患の主な症状としては、全身倦怠感、体重減少、下痢、腹痛、貧血などが挙げられる。炎症性腸疾患は再発と寛解を繰り返しながら、徐々に進行することが多く、大腸がんのリスクファクターとしても重要である。

【0004】

炎症性腸疾患の治療薬としては、副腎皮質ホルモン、salazosulfapyridineおよびmesalazineなどの抗炎症剤、ＡＺＡおよび６−ＭＰなどの免疫調節薬、抗菌薬であるメトロニダゾール、ならびに抗ＴＮＦ−α抗体が使用されてきた。しかしながら、これらはいずれも本疾患に特異的な治療薬ではない。また、抗ＴＮＦ−α抗体は、感染防御に不可欠なサイトカインであるＴＮＦ−α自体の働きを抑制するため、日和見感染症など重篤な副作用を合併する危険がある。
以上の理由から、副作用を低減しつつも、炎症性腸疾患を特異的に抑制する治療法の開発が望まれるが、これまでに本疾患形成に関与する有用なターゲット細胞も分子も見つかっていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、炎症性腸疾患を抑制する抗体および該抗体を含む医薬組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

腸管粘膜近傍に常在するマクロファージは、ＩＬ−１０依存的に腸内細菌に対する免疫寛容を維持していると考えられているが、常在菌との平和的共存状態と病原菌の侵入とを識別する分子学的および細胞学的機序はほとんど明らかになっていない。
本発明者らは、鋭意研究の結果、腸管粘膜近傍に常在するマクロファージのうち、ＣＤ１６９マクロファージが消化管粘膜固有層に常在し、炎症性腸疾患の病態形成に重要な役割を担うことを見出した。第一に、ＣＸ３ＣＲ１陽性マクロファージが粘膜固有層全体に均一に分布するのに対し、ＣＤ１６９マクロファージは粘膜直下にはほとんど存在せず、その大部分が粘膜筋板側に偏在していることを見出した。第二に、ＣＤ１６９マクロファージを消失したマウスでは、デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（ＤＳＳ）誘導性腸炎の臨床症状が劇的に改善することを見出した。また、これらのマウスでは腸管粘膜に浸潤するＬｙ６Ｃ高発現炎症性マクロファージが顕著に減少していたが、一方で、好中球、好酸球、樹状細胞の数には大きな変動は認められなかった。

【0007】

上記の結果から、本発明者らはＣＤ１６９マクロファージが腸管上皮の損傷と、それに伴う腸管細菌の侵入とに応答して何らかのシグナル分子を産生し、炎症性マクロファージを動員する可能性があると考え、本発明を完成するに至った。

【0008】

即ち、本発明の第１の側面は：
（１）ＣＤ１６９を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体
に関する。
本発明の一態様は：
（２）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ１６９またはその相同分子を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する、（１）に記載の抗体；
（３）配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するＣＤ１６９またはその相同分子を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する、（１）又は（２）に記載の抗体
である。

【0009】

また、本発明者らは、更なる鋭意研究の結果、ＣＤ１６９マクロファージの遺伝子発現の網羅的解析により、腸炎発症時にはＣＣＬ８遺伝子がＣＤ１６９マクロファージ選択的に強発現することを新たに見出した。
従って、本発明の一態様は：
（４）サイトカインＣＣＬ８に結合する抗体
である。
また、本発明の好適な態様は：
（５）配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するサイトカインＣＣＬ８またはその相同分子に結合する、（４）に記載の抗体；
（６）配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカインＣＣＬ８またはその相同分子に結合する、（４）または（５）に記載の抗体；
（７）配列番号６で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１〜７６位のアミノ酸の領域において、又は、配列番号８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、１〜７８位のアミノ酸の領域においてエピトープを認識する、（４）〜（６）のいずれか１項に記載の抗体；

【0010】

（８）配列番号９で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の抗体；
（９）配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体；
（１０）配列番号１５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の抗体；
（１１）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の抗体；

【0011】

（１２）ヒト化抗体またはヒト抗体である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体；
（１３）モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組み換え抗体または抗イディオタイプ抗体である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体；
（１４）ハイブリドーマ１７Ｄ６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５５）、
ハイブリドーマ１Ｄ５株（ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５６）、
ハイブリドーマ２Ｇ６株（ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５７）または
ハイブリドーマ１０Ｃ７株（ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５８）
から産生される、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体
である。

【0012】

（１５）（１）〜（１４）のいずれか１項に記載の抗体を含む、医薬組成物
に関する。
また、本発明の好ましい態様は：
（１６）炎症性腸疾患治療用の、（１５）に記載の医薬組成物。

【0013】

更に本発明の第３の側面は：
（１７）哺乳類において炎症性腸疾患を治療または予防する方法であって、
（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の抗体を、治療的に有効な量で前記哺乳類に投与することを含む方法
に関する。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、炎症性腸疾患を抑制することができる抗体または該抗体を含んだ医薬組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】腸管粘膜上皮の損傷のメカニズムの概略と本発明に基づく治療戦略を示す。

【図2】マウス消化管ＣＤ１６９マクロファージの局在（左図）と粘膜の構造（右図）を示す。

【図3】ＣＤ１６９マクロファージを消失させたＤＳＳ誘導性腸炎のマウスおよびＤＳＳ誘導性腸炎の野生型マウスにおける体重変化のモニター結果を示す。

【図4】ナイーブマウス（グレー）、腸炎を誘導した野生型マウス（黒）およびＣＤ１６９マクロファージ消失マウス（白）の大腸における炎症細胞数を示す。

【図5】ＣＤ１６９陽性マクロファージ（Ｒ１）及びＣＤ１６９陰性細胞（Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４）におけるメッセンジャーＲＮＡ発現量の変化を示す。腸炎誘導時にＣＤ１６９マクロファージ（Ｒ１）で強発現する遺伝子群（左図）と発現の低下する遺伝子群（右図）とをヒートマップで示す。

【図6】ナイーブ及び腸炎誘導時のＲ１−Ｒ４核細胞集団におけるＣＣＬ８メッセンジャーＲＮＡ発現量を示す。

【図7】ハイブリドーマの作製手順を示す。

【図8】細胞移動アッセイの概要とそれを用いた抗ＣＣＬ８抗体選別方法を示す。

【図9】細胞移動アッセイでチャンバー下層に移動した細胞数を示す。

【図10】抗ＣＣＬ８抗体およびＤＳＳの投与のタイミングを示す。

【図11】ＤＳＳ誘導性腸炎のマウスに抗ＣＣＬ８抗体を投与した場合の体重変化のモニター結果を示す。

【図12】抗体投与群および抗体非投与群の盲腸−大腸の肉眼所見を示す。

【図13】抗体投与群および抗体非投与群の大腸粘膜組織を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明は、炎症性腸疾患を抑制する抗体および該抗体を含む医薬組成物に関する。

【0017】

具体的に、本発明の第１の側面は、ＣＤ１６９を発現する細胞、好ましくはＣＤ１６９を表面に発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体である。例えば、ヒトＣＤ１６９前駆体のアミノ酸配列およびマウスＣＤ１６９前駆体のアミノ酸配列はそれぞれ、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０７５５５６およびＮＰ＿０３５５５６に開示されている。ヒトＣＤ１６９前駆体のアミノ酸配列およびマウスＣＤ１６９前駆体のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１および３に示す。

【化1】

【化2】

また、ヒトＣＤ１６９のアミノ酸配列およびマウスＣＤ１６９のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号２および４に示す。

【化3】

【化4】

本発明において、「ＣＤ１６９」には、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意図する。断片とは、ＣＤ１６９ポリペプチドの任意の領域を含むペプチドであり、天然のＣＤ１６９ポリペプチドの機能を有していなくてもよい。また、「ＣＤ１６９」には、更にＣＤ１６９相同分子およびその断片も含まれるものとする。ＣＤ１６９相同分子には、天然のＣＤ１６９と例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、非常に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるものとする。

【0018】

ここで、本発明において「抗体」の語には、抗体そのものに加え、当該抗体の断片、特に抗原結合断片も含むものとする。当該断片には例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ドメイン抗体などが含まれるものとする。さらに、本発明の抗体は複数の抗原に対して特異的に結合する多特異性抗体であってもよい。また、本発明の抗体には例えば、ハイブリドーマを使用して産生されたものの他、遺伝子組み換え技術を使用して作製された組み換えポリペプチドも含まれるものとする。
「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＤＣ））」と同義であり、標的細胞の表面抗原に結合した抗体のＦｃ部分に、Ｆｃγレセプター保有細胞が、Ｆｃγレセプターを介して付着し、標的細胞を殺傷、消失または不活性化する活性をいう。ここで、本発明における前記標的細胞は、ＣＤ１６９を表面に発現する細胞である。
ＣＤ１６９マクロファージは、腸管上皮の損傷と、それに伴う腸管細菌の侵入に応答して何らかのシグナル分子を産生し、炎症性マクロファージを動員すると考えられ、前記抗体は、ＣＤ１６９を表面に発現する細胞に特異的に結合してＣＤ１６９を表面に発現する細胞を殺傷、消失または不活性化することにより炎症性腸疾患を治療または予防することができる。

【0019】

本発明の抗体は、一態様において、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、非常に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ１６９またはその相同分子を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する。当該抗体は好ましくは、配列番号１〜４のいずれかで示されるアミノ酸配列と、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、非常に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ１６９またはその相同分子を、表面に発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する。
更に、本発明の抗体は、一態様において、配列番号１〜４のいずれかで示されるＣＤ１６９またはその相同分子を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する。当該抗体は好ましくは、配列番号１〜４のいずれかで示されるＣＤ１６９またはその相同分子を、表面に発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害活性を有する。

【0020】

ＣＤ１６９マクロファージは、サイトカインの一種であるＣＣＬ８を産生する。例えば、ヒトＣＣＬ８は、９９個のアミノ酸からなるＣＣＬ８前駆体から、１〜２３個のアミノ酸からなるシグナル配列が切断され、７６個のアミノ酸からなる成熟型のＣＣＬ８ポリペプチドとして細胞外に分泌される。
ヒトＣＣＬ８前駆体のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００５６１４に開示されている。ヒトＣＣＬ８前駆体のアミノ酸配列およびヒトＣＣＬ８の成熟型のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号５および配列番号６に示す。

【化5】

【化6】

また、例えば、マウスＣＣＬ８は、９７個のアミノ酸からなるＣＣＬ８前駆体から、１〜１９個のアミノ酸からなるシグナル配列が切断され、７８個のアミノ酸からなる成熟型のＣＣＬ８ポリペプチドとして細胞外に分泌される。マウスＣＣＬ８前駆体のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０６７４１８に開示されている。マウスＣＣＬ８前駆体のアミノ酸配列およびマウスＣＣＬ８の成熟型のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号７および配列番号８に示す。

【化7】

【化8】

腸炎発症時には、ＣＣＬ８遺伝子がＣＤ１６９マクロファージに選択的に強発現していることから、ＣＣＬ８は、ＣＤ１６９マクロファージによって産生され、炎症性の単球を動員することによって腸炎を誘発する可能性があると考えられる。従って、本発明の一態様は、サイトカインＣＣＬ８に結合する抗体である。炎症性の単球を動員して腸炎を誘発すると考えられるＣＣＬ８ポリペプチドに抗体を結合させることにより、腸炎の誘発を抑制することができる。

【0021】

本発明において、「ＣＣＬ８ポリペプチド」とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意図する。断片とは、ＣＣＬ８ポリペプチドの任意の領域を含むペプチドであり、天然のＣＣＬ８ポリペプチドの機能を有していなくてもよい。また、「ＣＣＬ８ポリペプチド」には、更にＣＣＬ８相同分子およびその断片も含まれるものとする。ＣＣＬ８相同分子には、天然のＣＣＬ８ポリペプチドと例えば５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上、特に好ましくは７０％以上、非常に好ましくは７５％以上、さらに特に好ましくは８０％以上、さらに非常好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれるものとする。

【0022】

従って、本発明の一態様において、前記抗体は、配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するサイトカインＣＣＬ８またはその相同分子に結合する。また、好ましくは、前記抗体は、配列番号６または配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカインＣＣＬ８またはその相同分子に結合する。
更に詳細には、前記抗体は、配列番号６で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち１〜７６位のアミノ酸の領域において、又は、配列番号８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち１〜７８位のアミノ酸の領域においてエピトープを認識する。
本発明において、「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの体内において、抗原性および／または免疫原生を有するＣＣＬ８ポリペプチドの部分ペプチドを意味する。抗原性を有するＣＣＬ８の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ等、当業者に既知の方法により決定することができる。エピトープは例えば、以下の方法によって決定することができる。まず、公知のオリゴペプチド合成技術を用い、ＣＣＬ８ポリペプチドの様々な部分構造を作製する。具体的には、ＣＣＬ８ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを検討し、大まかな認識部位を決定した後に更に短いペプチドを合成して、それらとの反応性を調べることによって決定することができる。

【0023】

本発明の抗体としては例えば、下記で説明する１７Ｄ６、１Ｄ５、１０Ｃ７および２Ｇ６が挙げられる。
１７Ｄ６は、配列番号６または８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、例えば１〜２０位、好ましくは１〜１７位、より好ましくは１〜１５位、さらに好ましくは１〜１４位、最も好ましくは１〜１３位のアミノ酸領域においてエピトープを認識する。
１Ｄ５は、配列番号６または８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、例えば１〜１５位、好ましくは１〜１０位、より好ましくは１〜７位、さらに好ましくは１〜５位、最も好ましくは１〜４位のアミノ酸領域においてエピトープを認識する。
１０Ｃ７は、配列番号６または８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、例えば１〜１５位、好ましくは１〜１０位、より好ましくは１〜７位、さらに好ましくは１〜５位、最も好ましくは１〜４位のアミノ酸領域においてエピトープを認識する。
２Ｇ６は、配列番号６で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、例えば３〜７６位、好ましくは５〜７６位、より好ましくは１０〜７６位、さらに好ましくは１５〜７６位、最も好ましくは２０〜７６位のアミノ酸領域においてエピトープを認識する。また、２Ｇ６は、配列番号８で示されるサイトカインＣＣＬ８ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、例えば３〜７８位、好ましくは５〜７８位、より好ましくは１０〜７８位、さらに好ましくは１５〜７８位、最も好ましくは２０〜７８位のアミノ酸領域においてエピトープを認識する。

【0024】

本発明に係る抗体は例えば、以下のような相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。
配列番号９で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３。

【0025】

また、本発明の抗体には、
配列番号９で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む抗体が包含される。

【0026】

更に、本発明に係る抗体には、
配列番号９で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む抗体；
配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む抗体；および
配列番号９で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ３と、
配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１と、
配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ２と、
配列番号１４で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ３と
を含む抗体
が包含される。

【0027】

また、本発明に係る抗体は例えば、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域とを含む。

【0028】

本発明に係る抗体には、
配列番号１５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む抗体；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む抗体；
配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む抗体；および
配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記重鎖可変領域と、
配列番号１６で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む前記軽鎖可変領域と
を含む抗体
が包含される。

【0029】

更に、本発明の抗体は例えば、モノクローナル抗体、標識抗体、二価抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組み換え抗体または抗イディオタイプ抗体である。

【0030】

本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合、当該分野で既知の方法によって作製することができる。本発明のモノクローナル抗体の作製方法の一例を以下に詳述するが、これに限定されるものではない。

【0031】

（１）抗体産生細胞の調製
抗原であるＣＤ１６９またはＣＣＬ８ポリペプチドと、当業者に周知のアジュバント、例えばフロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス、ラットまたはハムスターを被免疫動物とするのが好ましい。

【0032】

また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＲ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、ラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗｉｓｔａｒ等が、またハムスターの場合はＡｒｍｅｎｉａ等を用いることができる。これらのげっ歯類は例えば日本クレア、日本チャールスリバー等実験動物飼育販売業者より入手することができる。

【0033】

また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。

【0034】

ＣＤ１６９またはＣＣＬ８によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ． ＩＩ． ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。

【0035】

これらの免疫法のうち、好適なものは例えば以下の通りである。
まず、抗原または抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。ただし、免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般に、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間であり、好ましくは、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間である。また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
追加免疫は、上記の抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばラットの場合には、０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。

【0036】

上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。なお、その際に血清抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。例えばＥＬＩＳＡ法によるラット血清抗体価の測定は、以下に記載するような手順により行うことができる。

【0037】

まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識抗体を加えてラット抗体に結合させ、洗浄後、該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
これらの脾臓細胞又はリンパ節細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）に従って行うことができる。例えば、脾臓細胞の場合には、細胞を細切してステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。

【0038】

（２）骨髄腫細胞の調製
細胞融合に用いる骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ細胞」とも称する）には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。

【0039】

すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等から入手することができる。

【0040】

これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ＦＢＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０^７以上の細胞数を確保しておく。

【0041】

（３）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ． ＩＩ． ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ． ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。このような方法としては、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。

【0042】

例えば、上記化学的方法は下記の通り実施される。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。

【0043】

（４）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。

【0044】

（５）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ，Ｂ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。

【0045】

あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択することができる。

【0046】

このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株の例としては、ハイブリドーマ１７Ｄ６株、ハイブリドーマ１Ｄ５株、ハイブリドーマ２Ｇ６株およびハイブリドーマ１０Ｃ７株を挙げることができる。ハイブリドーマ１７Ｄ６株、ハイブリドーマ１Ｄ５株、ハイブリドーマ２Ｇ６株およびハイブリドーマ１０Ｃ７株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に２０１５年５月２２日付けで寄託されている。
ハイブリドーマ１７Ｄ６株は１７Ｄ６の名称で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５５（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５５）が付与され、ハイブリドーマ１Ｄ５株は１Ｄ５の名称で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５６（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５６）が付与され、ハイブリドーマ２Ｇ６株は２Ｇ６の名称で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５７（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５７）が付与され、ハイブリドーマ１０Ｃ７株は１０Ｃ７の名称で受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５８（受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０２０５８）が付与されている。
なお、本明細書中においては、ハイブリドーマ１７Ｄ６が産生する抗体を、「１７Ｄ６」といい、ハイブリドーマ１Ｄ５が産生する抗体を、「１Ｄ５」といい、ハイブリドーマ２Ｇ６が産生する抗体を、「２Ｇ６」といい、ハイブリドーマ１０Ｃ７が産生する抗体を、「１０Ｃ７」という。従って、本発明の抗体には、ハイブリドーマ１７Ｄ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５５）、ハイブリドーマ１Ｄ５株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５６）、ハイブリドーマ２Ｇ６株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５７）またはハイブリドーマ１０Ｃ７株（ＮＩＴＥ Ｐ−０２０５８）から産生される抗体も包含される。

【0047】

（６）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。スクリーニングには当該分野で既知の方法を使用することができる。

【0048】

抗体価の測定は、例えば上記（１）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法により行うことができる。上記の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。

【0049】

また、クローニングを完了したハイブリドーマは、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地で数回継代した後、正常培地に換えて培養することができる。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。
この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。

【0050】

また、同系統のマウス、あるいは免疫不全マウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。

【0051】

たとえば、ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０^６〜１０^７個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水にたまったところでマウスより腹水を採取する。この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。

【0052】

上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法、すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等で精製することができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。このようにして得られるモノクローナル抗体は、ポリペプチドＣＤ１６９またはＣＣＬ８に対して高い抗原特異性を有する。

【0053】

（７）モノクローナル抗体の検定
このようにして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法が挙げられる。

【0054】

オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。

【0055】

本発明の抗体には、更に、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、国立医薬品食品衛生研究所生物薬品部ホームページhttp://www.nihs.go.jp/dbcb/mabs.htmlまたは和氣秀徳「抗体医薬」，岡山医学会雑誌，第１２１巻，Ａｕｇｕｓｔ ２００９，第１１９−１２２ 頁等に記載の既知の方法を用いて製造することができる。

【0056】

キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体が挙げられ、例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５，（１９８４）参照）。

【0057】

ヒト化抗体としては、ＣＤＲのみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，９６９−９７３，（１９９４）参照）。

【0058】

さらに、ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，；Ｋｕｒｏｉｗａ， Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。

【0059】

本発明の第２の側面は、上記抗体を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、好ましくは、炎症性腸疾患治療用の医薬組成物である。炎症性腸疾患には、クローン病、潰瘍性大腸炎等が含まれる。
本発明の医薬組成物は、薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を更に含んでもよい。

【0060】

上記医薬組成物の投与経路は、治療に最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与または非経口投与であってよい。非経口投与としては、気道内投与、直腸内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、腹腔内投与等が挙げられる。
上記医薬組成物の投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤、顆粒剤等、当該分野で公知の投与形態が挙げられる。マウスの静脈内投与の場合は例えば、１回５０〜１００マイクログラム程度が投与される。また、投与回数は例えば、１週間に１〜３回程度である。

【0061】

更に、本発明の第３の側面は、哺乳類において炎症性腸疾患を治療または予防する方法であって、上記抗体を、治療的に有効な量で前記哺乳類に投与することを含む方法に関する。ここで、炎症性腸疾患に関する「治療」の語には、炎症性腸疾患を治療することに加え、炎症性腸疾患を抑制または軽減することを含むものとする。ここで、哺乳類には、ラット、マウス、ハムスター、サルおよびヒトが含まれる。

【0062】

本発明によれば、炎症性腸疾患に作用する因子に特異的に作用することができ、それ故、望まれない副作用を軽減して炎症性腸疾患を抑制することができる。

【実施例】

【0063】

動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から、Ｗｉｓｔａｒラットはオリエンタル酵母から購入したものを用いた。ＣＤ１６９−ＤＴＲマウスは、申請者の研究グループで作製したものを用いた。ＣＸ３ＣＲ１^ｇｆｐマウス（Ｊｕｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＸ（３）ＣＲ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，４１０６−１４（２０００）参照）は、Ｄ．ＬｉｔｔｍａｎおよびＳ．Ｊｕｎｇ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｓｒａｅｌ）からご提供いただいたものを使用し、特定病原菌無感染環境（ＳＰＦ）で飼育した。
マウスを用いた実験は全て、東京薬科大学の動物実験委員会、または、理化学研究所、免疫・アレルギー科学総合研究センター（ＲＣＡＩ）の動物実験委員会により承認されており、適用可能なガイドラインおよび規則に則って行われた。

【0064】

病理組織学的検索
肛門側結腸を、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。パラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＧＦＰの検出のため、４％パラホルムアルデヒド／４％スクロース／０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で１時間固定した組織を、ＯＣＴで急速凍結させた。Ｆ４／８０またはＣＤ１６９の検出には、固定せず免疫組織化学を行った。１４μｍ厚さの凍結切片を乾燥させ、ＰＢＳで水和した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、０．８％Ｈ_２Ｏ_２／ＰＢＳでクエンチした。内因性ビオチンを、ビオチンブロッキングシステム（Ｄａｋｏ，ＣＡ）でブロックした後、ＴＮ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ／１．５％ ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）または２％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ，Ｊａｐａｎ）／１．５％ ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ／０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳでブロックした。それらの切片を、ビオチン化抗ＣＤ１６９（Ｍ７）、抗Ｆ４／８０（ＣＩ：Ａ３−１）又は抗ＧＦＰ（ａｂ６９３１３）抗体でインキュベートし、さらにＴＳＡビオチンシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＡ）を用いて増感した。免疫染色した凍結切片は蛍光顕微鏡（ＢＺ−８１００またはＢＺ−Ｘ７００，Ｋｅｙｅｎｃｅ，Ｊａｐａｎ）で観察した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＡｐｏｐＴａｇ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣＡ）を用いて行った。上皮からＣＸ３ＣＲ１^＋またはＣＤ１６９^＋細胞までの距離を、Ｉｍａｇｅ Ｊ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）で定量化した。
その結果、ＣＸ３ＣＲ１マクロファージが粘膜固有層全体に均一に分布するのに対し、ＣＤ１６９マクロファージは粘膜直下には認められず、ほとんどが粘膜筋板側に偏在していることが示された（図２参照）。

【0065】

粘膜固有層（ＬＰ）細胞の調製
既存のプロトコル（Ｗｅｉｇｍａｎｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｎｉｃ ｔｉｓｓｕｅ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２３０７−１１（２００７）参照）に若干の改変を加え粘膜固有層細胞を調製した。
結腸の内容物を、ＰＢＳで数回洗浄し、長軸方向に切り開いた。２〜３ｃｍの結腸片を、２％ＦＢＳ／２０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２を添加したＨＢＳＳ中で１５分間、３７℃でインキュベートした。それらの組織をＰＢＳ中で洗浄し、ＥＤＴＡを洗い落とし、スパチュラをスライドさせることによって残存する上皮層を除去した。組織を約５ｍｍにミンチし、２％ＦＣＳ、１５０μｇ／ｍＬ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ、５００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ），１％ Ｄｉｓｐａｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ），１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎａｃａｌａｉ，Ｊａｐａｎ），１％ ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩに懸濁し、３７℃で４０分間インキュベートした。酵素処理した細胞液を、７０μｍ Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で濾過し、ＲＰＭＩ／２％ＦＣＳ／１％ペニシリン・ストレプトマイシンで洗浄した。全ＬＰ細胞をＦｃブロッカー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）でインキュベートした後、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１Ｃ発現細胞を磁気ビーズによって分取した。一部の実験では、セルソーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡまたはＳＨ８００，ＳＯＮＹ，Ｊａｐａｎ）によってさらに細かく分画化した。単核細胞は４０％および８０％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた密度勾配法で分取した。

【0066】

＜ＣＤ１６９マクロファージ非存在下での腸炎の改善＞
（１）ＤＳＳ誘導性結腸炎
野生型マウスおよびＣＤ１６９マクロファージがいないマウス（ＣＤ１６９−ＤＴＲマウス）それぞれに、３．０〜３．５％のＤＳＳ（ＭＷ５０００，Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を含んだ飲用水を７日間、その後、通常の飲用水を経口投与した。毎日または１日置きに、ＤＳＳの投与から１４日間、体重をモニターした。一部の実験では、２５ｎｇ／体重ｇのＤＴ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を、ＤＳＳの投与１日前および３日前に腹腔内投与した。
体重変化のモニター結果を図３に示す。ＣＤ１６９マクロファージを消失したマウスでは、ＤＳＳ誘導性腸炎の臨床症状が劇的に改善した。
（２）フローサイトメトリー
ＬＰ細胞を、Ｆｃブロッカー（２．４Ｇ２）でインキュベートし、その後、抗体混合液で染色した。用いた抗体、およびそのクローンを以下に記載する。抗Ｆ４／８０（ＣＩ：Ａ３−１），抗ＣＤ１６９（Ｍ７），抗Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４），抗Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８），抗Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ（Ｅ５０−２４４０）。ビオチン化したラットＩｇＧ２ｂ（ＲＴＫ４５３０）を、抗ＣＤ１６９のアイソタイプコントロールとして用いた。死細胞を除外するため、７ＡＡＤを細胞懸濁液に添加した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）によって細胞を分析した。
これらのマウスでは腸管粘膜に浸潤するＬｙ６Ｃ高発現炎症性マクロファージ数が顕著に減少していた。しかしながら、好中球、好酸球に大きな変動は認められなかった（図４参照）。

【0067】

以上の結果は、ＣＤ１６９マクロファージが腸管上皮の損傷と、それに伴う腸内細菌の侵入に応答して何らかのシグナル分子を産生し、炎症性マクロファージを動員する可能性を示唆する。

【0068】

＜ＣＤ１６９マクロファージに由来する腸炎憎悪物質の探索＞
（１）マイクロアレイ分析
ＣＤ１６９^＋およびＣＤ１６９⁻骨髄性細胞を、ＷＴナイーブマウスまたは４日間３．５％ＤＳＳを投与した結腸炎マウスのＬＰから、セルソーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）を用いて精製した。ＣＤ１６９，ＣＤ１１ｂ,ＣＤ１１ｃ分子の発現レベルの違いによりＬＰ細胞をＲ１〜Ｒ４に４分画した。Ｒ１はＣＤ１６９マクロファージ、Ｒ２は好中球、好酸球および炎症マクロファージ、Ｒ３は好酸球と常在マクロファージ、Ｒ４は樹状細胞に相当する。分画細胞の純度は約９０％であった。分画骨髄性細胞から抽出した全ＲＮＡが、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０ Ａｒｒａｙ ｃｈｉｐにハイブリダイズした。Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて遺伝子発現ヒートマップを作成した（図５参照）。

【0069】

（２）定量的ＰＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
結腸組織またはＬＰマクロファージ由来の全ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ若しくはＭｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）又はＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって抽出した。ｃＤＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型にＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）によってｑＲＴ−ＰＣＲを行った。一部の実験では、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮｕＧＥＮ，ＣＡ）を用いてＲＮＡを増幅した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）で行った。発現レベルを、βアクチンまたは１８リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）で標準化し、特に明記しない限り、ナイーブコントロールに対するｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎとして表示した（図６参照）。

【0070】

以上の結果から、腸炎発症時にＣＤ１６９マクロファージに、サイトカイン遺伝子ＣＣＬ８が選択的に強発現していることを同定した。

【0071】

＜抗体ＣＣＬ８モノクローナル抗体の作製＞
（１）モノクローナル抗体の作製
抗ＣＤ１６９抗体を作製するため、ＣＤ１６９分子を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウィスターラットに３回腹腔内投与した。初回免疫時には、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ，ＧＡ）も投与した。脾細胞をＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＮＳＯ^ｂｃｌ２骨髄腫細胞に融合させた（Ｒａｙ，Ｓ．＆Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｔｏ ｓａｍｐｌｅ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｐｌｅｎｉｃ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｄｅｓｔｉｎｅｄ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１，５５４８−５１（１９９４）参照）。ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）および１％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含んだＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、ハイブリドーマ細胞を選択した。ＷＲ−ＣＤ１６９細胞（ＣＤ１６９分子を定常的に発現するＷＲ１９Ｌ細胞）に発現したＣＤ１６９分子に対する抗体を安定的に産生する２つのクローン（Ｍ４およびＭ７）を、フローサイトメトリーによって選別した。抗ＣＣＬ８抗体作製のため、アジュバント中に乳化されたＣＣＬ８ペプチド（１〜１３：ＥＫＬＴＧＰＤＫＡＰＶＴＣ）を、ウィスターラットの足蹠に、皮下投与した。上述した方法で、リンパ節細胞と骨髄腫細胞を融合し、約１６００のハイブリドーマを作製した。ＣＣＬ８タンパク質を特異的に検出する抗体産生ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法で選別した（図７参照）。

【0072】

（２）マウスＣＣＬ８ ＥＬＩＳＡの構築
抗ＣＣＬ８抗体（ＭＡＢ７９０，Ｒ＆Ｄ，ＭＮ）を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固相化した。Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）で２時間ブロックした後、Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔで２倍希釈したマクロファージ培養上清を各ウェルにアプライし、室温で２時間インキュベートした。プレートを１時間、１．２５μｇ／ｍｌのビオチン化ラットＩｇＧ抗ＣＣＬ８（ｃｌｏｎｅ １２Ｇ８，申請者の研究室で作製したもの）でインキュベートした後、ＨＲＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎで３０分間インキュベートした。最後に、基質溶液（ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ，ＫＰＬ，ＭＤ）を各ウェルに添加し、発色した。２Ｍ硫酸によって反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ，ＣＡ）によって測定した。

【0073】

（３）細胞移動アッセイ
抗ＣＣＬ８抗体の遊走阻害活性を、５μｍ ｐｏｒｅ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて評価した。５ｘ１０^５ 個のＷＥＨＩ−３細胞(マウス単球系細胞株）を、トランスウェルのチャンバー上層に、６００μｌの無血清ＲＰＭＩまたは１００ｎＭのケモカイン（ＣＣＬ８）添加無血清ＲＰＭＩをチャンバー下層に入れ、単球の遊走を促進した。４時間後、チャンバー下層に移動した細胞を計数した（図８参照）。ＣＣＬ８による単球の遊走阻害活性を有する抗ＣＣＬ８抗体を選別した。

【0074】

＜抗体ＣＣＬ８抗体によるマウス炎症性腸疾患の抑制＞
（１）ＤＳＳ誘導性腸炎
マウスに、３．０〜３．５％のＤＳＳ（ＭＷ５０００，Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を含んだ飲用水を７日間経口投与し、その後、通常の飲用水に切り替えた。毎日または１日置きに、ＤＳＳの投与から１４日間、体重をモニターした。一部の実験では、２５ｎｇ／体重ｇのＤＴ（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＳＳの投与１日前および３日前に腹腔内投与した。
ＣＣＬ８の機能を生体内で阻害するため、１００μｇの抗ＣＣＬ８抗体（クローン１７Ｄ６、申請者の研究室で作製したもの）をＤＳＳ投与３日および４日後に静脈内投与した（図１０参照）。
体重変化のモニター結果を図１１に示す。ＣＣＬ８に対する中和抗体を投与したマウスでは、中和抗体を投与しなかったマウスに比較して体重減少などの臨床症状が改善した。この実験結果は、上記中和抗体を投与することにより、ＤＳＳ誘導性腸炎を抑制できることを示す。
（２）病理組織学的検索
上記「病理組織学的検索」の項で述べた方法に準じて、抗体を投与したマウス（以下、「抗体投与群」という。）と投与しなかったマウス（以下、「抗体非投与群」という。）について組織破壊の程度を検討した。結果を図１２および１３に示す。
図１２から、抗体投与群のマウスでは、腸管短縮が軽度で、血便等も抑制されていた。更に、図１３からは、抗体投与群のマウスの腸では、絨毛構造が維持され、組織の破壊が抑制されているのに対し、抗体非投与群のマウスの腸では、上皮がほぼ完全に脱落し、絨毛構造が破壊されていることがわかった。

【0075】

＜抗ＣＣＬ８抗体可変領域のアミノ酸配列の解析＞
抗ＣＣＬ８抗体可変領域のアミノ酸配列の解析は、Duebel et al. J Immunol Methods. 1994 Sep 30;175(1):89-95. (1994)に記載の方法に従って行った。以下に可変領域のアミノ酸配列の解析の一例を記載する。
ハイブリドーマ（１７Ｄ６）から全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡから逆転写でｃＤＮＡを作成した。そのｃＤＮＡを鋳型に、免疫グロブリンＧの重鎖および軽鎖の、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む可変領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
（重鎖）
Bi3b：
［配列番号17］AGGT(C/G)(A/C)AACTGCAG(C/G)AGTC(A/T)GG
Bi4：
［配列番号18］CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT
（軽鎖）
Bi6：
［配列番号19］GGTGATATCGTGAT(A/G)AC(C/A)CA(G/A)
Bi5c：
［配列番号20］GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC

【0076】

増幅したＰＣＲ断片の重鎖をＰｓｔ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで、軽鎖をＥｃｏＲ Ｖ／ＢａｍＨＩで制限酵素処理した。これを、同じ制限酵素で切断したプラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋）のマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌に形質転換した。
大腸菌からプラスミドを精製し、挿入したＰＣＲ断片をＤＮＡシークエンスし、アミノ酸配列を決定した。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３相当部分の決定はインターネットに公開されている解析システム：ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ． ｅｔ． ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６，Ｗ５０３−５０８（２００８）．ＰＭＩＤ：１８５０３０８２）を利用して行った。

【0077】

重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２および重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示し、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２および軽鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示す。
また、重鎖可変領域の配列を配列番号１５に、軽鎖可変領域の配列を配列番号１６に示す。

【化9】

【化10】

【化11】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]