特許 6947533 植物におけるコード配列の発現レベルを制御するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ（ｎ）挿入物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6947533

(24)【登録日】2021年9月21日

(45)【発行日】2021年10月13日

(54)【発明の名称】植物におけるコード配列の発現レベルを制御するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ（ｎ）挿入物の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20210930BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20210930BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/82 150Z

   A01H5/00 AZNA

【請求項の数】5

【外国語出願】

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2017-94173(P2017-94173)

(22)【出願日】2017年5月10日

(62)【分割の表示】特願2015-18851(P2015-18851)の分割

【原出願日】2008年11月28日

(65)【公開番号】特開2017-148071(P2017-148071A)

(43)【公開日】2017年8月31日

【審査請求日】2017年6月9日

【審判番号】不服2019-12665(P2019-12665/J1)

【審判請求日】2019年9月24日

(73)【特許権者】

【識別番号】511131147

【氏名又は名称】エンプレサ ブラジレイラ デ ペスキサ アグロペクアリア−エンブラパ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100173107

【弁理士】

【氏名又は名称】胡田 尚則

(72)【発明者】

【氏名】フガンティ，レナータ

(72)【発明者】

【氏名】ネポムセーノ，アレクサンドレ リマ

(72)【発明者】

【氏名】マルセリーノ，フランシスマール コレア

(72)【発明者】

【氏名】シルバ，ジョアン フラビオ ベロッソ

(72)【発明者】

【氏名】マリン，シルバナ レジーナ ロシェンバーシュ

(72)【発明者】

【氏名】シルベイラ，セサル アウグスト

(72)【発明者】

【氏名】ビネック，エリゼウ

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 中島 庸子

【審判官】 安居 拓哉

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第７１２６０４１号明細書

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２年，Ｖｏｌ．１９，ｐ．９８５−１０００

【文献】 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８年，Ｖｏｌ．３７，ｐ．８８５−８９６

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N 15/00

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大豆植物における対象遺伝子の発現レベルを上方制御する方法であって、
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメントを含む発現カセットを用いて大豆植物細胞を安定に形質転換することであって、ここで前記プロモーターエレメントが、「ＡＴ」ヌクレオチド配列の９〜３２個の反復からなる挿入物を含み、ここで前記プロモーターエレメントが、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatct agaaggttgt agaagactag ctagaacgta cgtattcgtg tggagaagtc ctgaagttta tcgaatcatc taaaactgct aaaatagcaa acaacattat attgtaaaca atatttttct ggaacataca agagtatcct ttcacttcct ttaaatacct cgagtgtccc cattgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttctgatg tttttgctta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；又は、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatctagaa ggttgtagaa gactagctag aacgtacgta ttcgtgtgga gaagtcctga agtttatcga atcatctaaa actgctaaaa tagcaaacaa cattatattg taaacaatat ttttctggaa catacaagag tatcctttca cttcctttaa atacctcgag tgtccccatt gac
であり；
（ｉｉ）大豆植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された大豆植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）（ｉ）のカセットがそのゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック大豆植物を再生し；及び
（ｉｖ）前記トランスジェニック大豆植物に、線虫ストレスを適用すること、
を含み、ここで、前記トランスジェニック大豆植物は、線虫ストレスを適用しない場合と比較して、対象遺伝子がより高い遺伝子発現レベルを示す前記方法。

【請求項2】

前記線虫ストレスに用いられる線虫が、根こぶ（ｇａｌｌ）線虫であるメロイドギネ・ジャワニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

発現カセットであって、大豆植物を形質転換し、前記発現カセットで形質転換された大豆植物に線虫ストレスを適用することによって、対象遺伝子の発現レベルを上方制御するための発現カセットであって、対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメントを含み、ここで前記プロモーターエレメントが「ＡＴ」ヌクレオチド配列の９〜３２個の反復からなる挿入物を有し、ここで前記プロモーターエレメントが、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatct agaaggttgt agaagactag ctagaacgta cgtattcgtg tggagaagtc ctgaagttta tcgaatcatc taaaactgct aaaatagcaa acaacattat attgtaaaca atatttttct ggaacataca agagtatcct ttcacttcct ttaaatacct cgagtgtccc cattgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttctgatg tttttgctta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；又は、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatctagaa ggttgtagaa gactagctag aacgtacgta ttcgtgtgga gaagtcctga agtttatcga atcatctaaa actgctaaaa tagcaaacaa cattatattg taaacaatat ttttctggaa catacaagag tatcctttca cttcctttaa atacctcgag tgtccccatt gac
である、発現カセット。

【請求項4】

前記線虫が、根こぶ線虫であるメロイドギネ・ジャワニカである、請求項３に記載の発現カセット。

【請求項5】

遺伝子的に改変された大豆植物を得るための方法であって、
前記方法は：
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメントを含む発現カセットを用いて大豆植物細胞を安定に形質転換することであって、ここで前記プロモーターエレメントが、「ＡＴ」ヌクレオチド配列の９〜３２個の反復からなる挿入物を含み、ここで前記プロモーターエレメントが、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatct agaaggttgt agaagactag ctagaacgta cgtattcgtg tggagaagtc ctgaagttta tcgaatcatc taaaactgct aaaatagcaa acaacattat attgtaaaca atatttttct ggaacataca agagtatcct ttcacttcct ttaaatacct cgagtgtccc cattgac；
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttctgatg tttttgctta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatctag aaggttgtag aagactagct agaacgtacg tattcgtgtg gagaagtcct gaagtttatc gaatcatcta aaactgctaa aatagcaaac aacattatat tgtaaacaat atttttctgg aacatacaag agtatccttt cacttccttt aaatacctcg agtgtcccca ttgac；又は、
gaattctgaa attgggtctt tttgtgggca ctttttgatg tttttgttta agttactgta ctgtgggcca caaaacgtat agatcaaagt agtaataata atattgatta aatgatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatctagaa ggttgtagaa gactagctag aacgtacgta ttcgtgtgga gaagtcctga agtttatcga atcatctaaa actgctaaaa tagcaaacaa cattatattg taaacaatat ttttctggaa catacaagag tatcctttca cttcctttaa atacctcgag tgtccccatt gac
であり；
（ｉｉ）大豆植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された大豆植物細胞を培養し；及び
（ｉｉｉ）安定に遺伝子的に改変された大豆植物を再生する
ことを含み、
前記遺伝子的に改変された大豆植物は線虫ストレスを適用することによって前記対象遺伝子を過剰発現するものである、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ある種の制限内にあって、人工的に上方制御（上流）又は下方制御（下流）され得る、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するために、プロモーター領域配列における特定点におけるＡＴ_(n)挿入物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子のプロモーター領域は、一般には、遺伝子転写開始部位から上流に１〜１００及び２００塩基対を有するＤＮＡ配列に含まれ、典型的には、１以上の転写因子結合部位を含み、及び／又はそれに隣接している。全ての遺伝子は、転写開始部位の上流（上側）及び下流（下側）に転写調節を有する。転写因子は、これらの調節配列を認識及び結合し、転写されたメッセンジャーＲＮＡの合成を制御する。これらの配列には、プロモーター、エンハンサー及び調節配列が含まれる。プロモーターは、遺伝子構築物において使用され、構成様式において、遺伝子を過剰発現させ、阻害し、若しくはその発現を調節するために、遺伝子工学の手段によって操作され、ある種の環境によって誘導され得る。

【0003】

遺伝子を過剰発現させるための種々の技術は、現在、バイオテクノロジーの分野において利用可能であり、そのうち、主な技術は、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）から単離された、構成的プロモーター３５Ｓを含む発現カセットの構築物を含む。しかしながら、遺伝子構築物におけるこのプロモーターの使用にはいくつかの例外がある。短鎖ウイスルＤＮＡ、及び植物ゲノムへのその挿入物の使用により、植物に感染しているウイルスゲノム間、又はより正確には、メッセンジャーＲＮＡ転写物間に、遺伝子組換えの潜在的なリスクの存在が実験的に明らかになった。このリスクは、新規なウイルス株、できればより悪性のタイプの創生に至る。

【0004】

プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶは、偶然的であると考えられ、全ての植物において、及び緑藻類、酵母、大腸菌において効果的に機能する。それは、他の植物及び動物ウイルスのプロモーターと共通して、相互交換できる対を有するモジュラー構造を有する。また、それは組換えホットスポットを有し、他の組換えホットスポットに類似した組換えプロセスに関与する複数の誘因物によって位置づけられ、トランスジェニック植物においてしばしば用いられる、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のＴ−ＤＮＡベクターの境界が含まれる。このホットスポットは、分割し、他のＤＮＡに結合する傾向にあり、それにより、遺伝子の水平移動及び組換えプロセスの可能性を増加させる。したがって、侵襲的な外来性ＤＮＡのゲノムへの挿入、野生型ウイルスと比較して、いくつかの選択的利点を貢献する場合に安定であるだけである、休眠ウイルスの再活性化及び新規ウイルスの発生に起因して、潜在的なリスクは突然変異生成及び発癌である。

【0005】

内因性ホモロガスの発現の部分的若しくは完全転写イベント及び／又は阻害は、プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶを用いて観察された（Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２ ２９１−２９９）。この不活性化は、メチル化及びエピジェネティックな変化を伴う複雑な機構に起因して起こる（Ｒｅｎｃｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：５３−６４；Ｎｅｕｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１；Ｍｅｙｅｒ ＆ Ｈｅｉｄｍａｎｎ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４３：３９０−３９９；Ｔｈｉｅｒｒｙ ＆ Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０７５−１０８３）。メチルトランスフェラーゼ又はエピジェネティックな変化に関与する他の酵素にある種の配列を指示する現実の機構は未知のままであるが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ間の依存したホモロガスの相互作用の関与を示唆するという仮説がある（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１２２−１２３）；Ｍａｔｚｋｅ ＆ Ｍａｔｚｋｅ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７：６７９−６８５）。

【0006】

文献では、ＣａＭＶ遺伝子が、感染ウイルスのゲノムで組換えられたキャノーラ（ｃａｎｏｌａ）染色体に組み込まれ、新規な複数の悪性ウイルスを生じさせたことを証明するデータがある。ＣａＭＶウイルス間のこれらの組換えはプロモーター領域を含み（Ｖａｄｅｎ ＆ Ｍｅｌｃｈｅｒ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１１１）、ＤＮＡとＤＮＡとの間、又はＲＮＡとＲＮＡとの間で起こる場合があり、しばしば、親の対応物よりも重度である感染を生じさせる（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ５：４８，１９９２）。

【0007】

さらに、プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶの使用は、通常、全タンパク質の１％より低い比率で内因性遺伝子の生成物の発現をもたらす。このプロモーターにおけるいくつかの改善、例えば、ある配列の重複やエンハンサーの追加は、その発現を増加させたが、いくつかの用途については、内因性遺伝子生成物の発現レベルはさらに増加させる必要がある。

【0008】

一般に、生物的ストレス及び非生物的ストレスへの耐性の特徴に関して、遺伝子操作された植物を得るために、構成的プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶを用いて行われた実験では、この耐性はいくつかのケースでは増加するが、このプロモーターの使用から導かれる望ましくない効果の１つは、植物の大きさの減少であり、植物の成長及び発育が通常影響され、形質転換された植物種とは無関係に小植物に至る（Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．２８７−２９１）。

【0009】

したがって、植物成長における遅延などのある種の負の効果が起こる可能性があるが、遺伝子発現を調節するストレス誘導性プロモーターの使用のようなストラテジーはこのような効果を妨げるか又は軽減する場合がある。

【0010】

別の作業では、Ｇｅｌｖｉｎら（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃｅｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）は、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の２つの遺伝子：オパインシンターゼ（ｏｃｓ）及びマンノパインシンターゼ（ｍａｓ）の配列を調節する種々の組み合わせを用いて構築された、いくつかのプロモーターによって検出されるＧＵＳの発現を分析した。そして、種々の組み合わせのうち、ｍａｓ活性化エレメントとｍａｓプロモーター領域を用いて融合されたｏｃｓ遺伝子活性化配列の３反復によって形成されたハイブリッドプロモーターは、「（Ａｏｃｓ）３ＡｍａｓＰｍａｓ」と呼ばれ、プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓを含む細胞と比較した場合、１０倍大きいＧＵＳマーカー遺伝子の、形質転換タバコ細胞の発現レベルにおいて提示された。この新規なプロモーターは、形質転換効率に影響を及ぼさなかったが、しかし、高レベルのマーカー遺伝子発現は、より大きな比率の形質転換細胞の同定を促進した。発現レベルは、葉、根、及び種々の細胞型において高かった。また、このプロモーターは、マニオク（ｍａｎｉｏｃ）及びエンドウ植物において非常に活性があり、２つの穀物はアグロバクテリウム種を用いて形質転換することが困難であった。このグループは、さらにこのプロモーター「（Ａｏｃｓ）３ＡｍａｓＰｍａｓ」を用いて、タバコ及びコーン植物に導入された（１８時間後）遺伝子の迅速転写の研究における成功を記載し、プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓによって調節された発現とは異なり、その活性は弱く、この時期内での遺伝子発現のいずれの検出も可能にしない。

【0011】

遺伝子構築物における遺伝子の過剰発現に対してストレス誘導性プロモーターを用いるというさらなるオプションがあり、これに関して、アラビドプシス・タリアーナ（Ａｒａｂｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から単離されたプロモーターｒｄ２９は、非生物的ストレスに対して良好な耐性を有する植物のサーチに最も使用されている。概して、これらの遺伝子構築物は、通常、干ばつ、塩分、並びに低温及び高温などの環境ストレスに応答した遺伝子発現を調節するファミリーＤＲＥＢ（脱水応答エレメント結合）の遺伝子に融合される。異なる植物種を使用したいくつかの作業では、誘導されたストレスプロモーターを用いた遺伝子形質転換の結果として、非生物的ストレスにより耐性な植物が報告された（Ｏｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，３４：８６８−８８７；Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４５（３）：３４６−３５０）。

【0012】

Ｆｕｇａｎｔｉら（２００４）は、シスト線虫に耐性であり、影響を受けやすい大豆遺伝子型を用いた。この文献には、シスト線虫に耐性な大豆遺伝子型の支援選択に使用された分子マーカーに関する初期データが含まれる。しかしながら、ＤＮＡ配列のレベル又はこの遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの発現に関して、試験された個体間の分子相違のいかなるタイプも検出されなかった。

【0013】

Ｆｕｇａｎｔｉ（Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｒｉｎａ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｅｓｔａｄｕａｌ ｄｅ Ｌｏｎｄｒｉｎａ］，２００４）は、耐性菌株の選択を示し、ここでは、対象遺伝子を含むゲノム領域の耐性遺伝子及び分子的特徴のある遺伝子と関連した分子マーカーを用いた。この研究では、遺伝子プロモーターにおけるＡＴ_(n)挿入物のサイズとそのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の得られたレベルとの間の可能な相関を示す定性的及び定量的データが開示されていない。本発明は、ある種の数のＡＴ_(n)挿入物がプロモーター領域に挿入されているという条件で、いずれかの発現レベルと調節し、及び／又は上方制御若しくは下方制御する能力を提案する。このような提案はこの研究には示されておらず、試験されていない。

【0014】

Ｆｕｇａｎｔｉ（ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｉｎｇａ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｅｓｔａｄｕａｌ ｄｅ Ｍａｒｉｎｇａ］，２００７）は、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域内の異なるサイズのＡＴ_(n)挿入物と、種々の非生物的ストレス及び生物的ストレス（寒さ、暑さ、干ばつ、塩、線虫の幼虫による感染）に反応したその発現レベルとの間の可能な相関を示す定量的及び定性的データを示した。しかしながら、コード領域が、生物的ストレス及び非生物的ストレスの不存在及び／又は存在下、異なるＡＴ_(n)サイズを含むプロモーター領域に融合されてもよい、任意の遺伝子の発現レベルを上方制御又は下方制御する可能性は、示されず、及び検討されていない。

【0015】

特許文献米国第２００５０５９６２３号は、選択された細胞に発現される、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターに融合した、治療遺伝子の発現を調節するために、超音波の制御された応用を用いて、局所発熱を使用する方法を提供する。提案された発明は、遺伝子配列において、全ての形質転換された細胞において発現された種々のサイズのＡＴ_(n)挿入物を有する熱ショックタンパク質のプロモーター領域に融合した任意の遺伝子の発現レベルを調節し、及び上方制御又は下方制御することを目的とする。生物的ストレス又は非生物的ストレスは植物全体に適用されてもよい。同一物がそのプロモーター領域に挿入されることを条件として、遺伝子発現の調節におけるＡＴ挿入物の役割、及び任意の遺伝子発現を制御するためのツールとしてその使用の可能についてのいずれの指示も開示されていない。

【0016】

特許文献米国第２００３１９０７０６号は、遺伝子産物（タンパク質）の総量の増加を促進する、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列に融合された内因性遺伝子に関する。プロモーター活性を有するこの領域は、窒素を化合した塩基の置換及び欠失を含む変異変更から生成させた。本発明は、ｍＲＮＡの合成を誘導するために必要される全ての遺伝子エレメントを含む、完全な遺伝子プロモーターの使用を必要とする。遺伝子発現の調節は、遺伝子のプロモーター領域におけるランダム突然変異というよりはむしろ、ＡＴ_(n)挿入物のサイズに従って分化されたレベルをもたらすことは、本発明において明らかである。

【0017】

特許文献欧州第１９３０４２３号は、発現レベルが他の従来のプロモーターによって調節されない、異種タンパク質を生成するためのシステムにおいて使用される、異なる最終サイズに分けられた熱ショックタンパク質のプロモーター領域を開示する。発現を活性化するために、非生物的又は化学的な特定のストレスが使用される。本発明は、試験された遺伝子型において既存のバリエーション、文献ＥＰ１９３０４２３において使用された１０００ｂｐより小さい断片を用い、これは、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域において検出される。このバリエーションは、プロモーターの特定領域における異なる数のＡＴ（ｎ）挿入物によって提供され、ＡＴ（ｎ）挿入物に依存した３１２ｂｐ（ＡＴ₉）と３５８ｂｐ（ＡＴ₃₃）の間にサイズバリエーションをもたらす。

【0018】

特許文献米国第５９２９３０２号は、葉及び花托などの組織において、成熟時に遺伝子発現を制御する一過性の組織特異的なプロモーターを使用する。プロモーターは、キメラ遺伝子を発現するために、ラズベリーにおけるｄｒｕ遺伝子自体から、又はそのホモログから単離された。このプロモーターと、特異的な遺伝子、例えば、色及び香りの変化を制御する遺伝子、植物細胞プロセスを修飾する酵素又は触媒産物の遺伝子、生成物がエチレン合成に影響を及ぼす遺伝子、代替の真菌調節遺伝子、並びにスクロース蓄積遺伝子との組み合わせを示唆している。本発明は、全ての細胞において、及び植物のライフサイクル全体を通じて、いずれかの遺伝子の発現を変更するために、その遺伝子のプロモーター領域における変更を有する。遺伝子産物の発現レベルのバリエーションは、プロモーターへの種々の数のＡＴ_(n)挿入物と相関し、結果として、異なるサイズのプロモーターと相関する。本発明は、これらの変更を含む任意の遺伝子発現を調節することを提案する。

【0019】

したがって、本発明は、遺伝子を過剰発現する科学論文において利用可能な現在既存の全ての方法とは異なるため、革新的である。そうするために、本発明は、多数及び少数の繰り返しを有するＡＴ配列の挿入を用い、遺伝子発現のレベルの調節を可能にし、それを増加又は減少させることができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ_(n)挿入物の使用に関する。また、本発明は、大豆胚を形質転換するために、ＧＵＳタンパク質に融合した、異なる数のＡＴ挿入物を有する遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現カセットに関する。

【0021】

本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを制御する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内のＡＴ_(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）（ｉ）のカセットがそのゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック植物を再生する
ことを含み、ここで、該トランスジェニック植物は、対照植物と比較した場合に、異なるレベルの遺伝子発現を示す。

【0022】

さらに、本発明は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域に連結された異なる数のＡＴ挿入物を有する２つのプロモーター領域を含む発現カセットを提供する。

【0023】

本発明の別の態様では、ＡＴ_(n)−挿入物を含む遺伝子的に改変された植物を得るための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内にＡＴ_(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）安定に遺伝子的に改変された植物を再生する
ことを含む前記方法。

【0024】

結果は、ある種の遺伝子の発現レベルが、遺伝子工学的ツールを介して、プロモーター領域内にＡＴ_(n)繰り返し塩基を挿入することによって、ある種の制限内で、人工的に上方制御（上流）又は下方制御（下流）され得る。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】耐性親試料ＰＩ５９５０９９、感受性親試料ＢＲＳ１３３、並びに耐性集団（試料０１〜試料０５）及び感受性試料（試料０６〜試料１０）の個体において、マイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６の増幅を用いたアガロースゲルを示す。矢印は、感受性親におけるマーカー増幅によって生じたバントを示し、また感受性集団におも見られる。

【図2】ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号：Ｍ１１３１７）から利用可能である遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列を示す。下線、プライマーｐＳｏｙＨｓｐＰｓｔＩ Ｆ及びｐＳｏｙＨｓｐ−ＢａｍＨＩ Ｒは、プロモーター領域の増幅断片を規定する。点のボックスではＡＴ_(n)挿入物、灰色ボックスではコード配列の開始コドン（ＡＴＧ）と停止コドン（ＴＡＡ）である。

【図3】遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋの受入番号：Ｍ１１３１７）の配列を示す。灰色ボックスではコード配列を規定する開始コドン（ＡＴＧ）と停止コドン（ＴＡＡ）、点ボックスではプロモーター領域中のＡＴ（ｎ）挿入物を強調し、下線は、遺伝子の完全な配列決定のために設計されたプライマーｐＳｏｙＨｓｐＰｓｔＩ ＦとＳｏｙＨＳＰ Ｃｌ Ｒである。

【図4】ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号：Ｍ１１３１７）から利用可能な遺伝子の完全配列に基づいて設計されたプライマーｐＳｏｙＨｓｐ ＡｌｅＩ ＦとｐＳｏｙＨｓｐ ＮｃｏＩ Ｒを用いた遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の増幅を示す。ラダーは１００ｐｂと５００ｐｂである。

【図5】ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号：Ｍ１１３１７）から利用可能な遺伝子の完全配列に基づいて設計されたプライマーｐＳｏｙＨＳＰ ＰｓｔＩ ＦとｐＳｏｙＨＳＰ Ｃｌ Ｒを用いて完全遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの増幅を示す。ラダーは１００ｐｂと５００ｂｐである。

【図6】プロモーター領域を規定するプライマーｐＳｏｙＨＳＰＰｓｔＩ ＦとｐＳｏｙＨＳＰＢａｍＨＩ Ｒのセットを用いた、耐性親個体ＰＩ５９５０９９、感受性親ＢＲＳ１３３、感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓの個体、並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体の増幅によって生じた遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の配列のアラインメントを示す。プライマーは、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋの受入番号：Ｍ１１３１７）の完全配列に基づいて規定された。点のボックスではＡＴ_(n)挿入物である。ボックスではおそらくＴＡＴＡ−ボックスである。白字を有する黒いボックスは、コンセンサス配列５’ＡＧＧＡＡｎｎＴＴＣＴ３’の熱ショックエレメント（ＨＳＥ）の１つである。白字を有する灰色ボックスでは、コア５’ＣＴｎＧＡＡｎｎＴＴＣｎＡＧ３’を有する別のコンセンサス配列５’ｃＴＴＣｔａＧＡＡｇｃＴＴＣｔａＧＡＡｇ３’である。

【図7】ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の配列と比較した、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域とコード配列の開始の間に存在する遺伝子配列を示し、研究の材料は、感受性（ＢＲＳ１３３）と耐性（ＰＩ５９５０９９）、感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓの個体、並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体である。灰色ボックスのヌクレオチドはコード領域の転写開始部位のコドンＡＴＧを強調する。

【図8A】ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の配列と比較した、研究中の全ての材料の感受性親ＢＲＳ１３３と耐性ＰＩ５９５０９９、感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓの個体、並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体由来の遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのコード配列のアラインメントを示す。灰色ボックスのヌクレオチドはコード領域を規定するＡＴＧ開始コドン及びＴＡＡ熱転写コドンを強調する。

【図8B】ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の配列と比較した、研究中の全ての材料の感受性親ＢＲＳ１３３と耐性ＰＩ５９５０９９、感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓの個体、並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体由来の遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのコード配列のアラインメントを示す。灰色ボックスのヌクレオチドはコード領域を規定するＡＴＧ開始コドン及びＴＡＡ熱転写コドンを強調する。

【図9】ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の配列と比較した、研究中の全ての材料の感受性親ＢＲＳ１３３と耐性ＰＩ５９５０９９、感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓの個体、並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体由来の遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのコード配列によってコードされたアミノ酸配列のアラインメントを示す。

【図10】Ｍ．ジャワニカに耐性及び感受性試料を用いて、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋの受入番号：Ｍ１１３１７）の断片から構築したプローブ（３２６ｐｂ）を用いて行ったリボヌクレアーゼ保護を示す。上部の数は使用された試料に同等である：感受性親（ＢＲＳ１３３）と耐性（ＰＩ５９５０９９）とＭ．ジャワニカの卵を用いて接種（２及び４）された処理、キットの陽性対照（５−矢印で指示）、ＲＮａｓｅ酵素の対照、設計されたプローブ（６）、並びにＲＮａｓｅの未消化（７）である。

【図11】シスト線虫Ｍ．ジャワニカの接種及び非接種の処理における耐性（ＰＩ５９５０９９）と感受性（ＢＲＳ１３３）親における遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの相対的定量化を示す。ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の完全配列を用いて、プログラムＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアｖ２０を用いて設計されたプライマーＳＯＹＨＳＰ ＰＳＣ ＦとＳｏｙＨＳＰ ＰＳＣ ＲによるリアルタイムＰＣＲによってデータを得た。定量化は、２^-ΔΔCt法を用いて行った。遺伝子ｒＲＮＡ １８Ｓは、ゲージとして規定及び非接種試料として使用された。試料は、ＳＹＢＲ法を用いた３つの独立した稼働において３点測定において増幅された。

【図12】シスト線虫Ｍ．ジャワニカの接種及び非接種の処理における感受性集団２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓの個体；並びに耐性集団ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６の個体における遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの相対的定量化（ｘ）を示す。ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な遺伝子（受入番号：Ｍ１１３１７）の完全配列を用いて、プログラムＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアｖ２０を用いて設計されたプライマーＳＯＹＨＳＰ ＰＳＣ ＦとＳｏｙＨＳＰ ＰＳＣ ＲによるリアルタイムＰＣＲによってデータを得た。定量化は、２^-ΔΔCt法を用いて行った。遺伝子ｒＲＮＡ １８Ｓは、ゲージとして規定及び非接種試料２５６−Ｓとして使用された。試料は、ＳＹＢＲ法を用いた３つの独立した稼働において３点測定において増幅された。

【図13】酵素β−グルクロニダーゼをコードするＧｕｓレポーター遺伝子、遺伝子Ａｈａｓ及びプロモーターａｃｔ２を例示する、プラスミドｐＡＧ１の図式的モデルを示す。また、制限マップを示す。

【図14】試験された材料：ＢＲＳ１３３、ＰＩ５９５０９９、２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６を用いて得られた発現カセットの全ての構築物の、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域のＰＣＲを介した増幅を示す。反応は、３６３ｐｂの断片を増幅するプライマーｐＳｏｙＨｓｐＰＳＴＩ ＦとｐＳｏｙＨＳＰＢａｍＨＩ Ｒを用いて行われ、次にアガロースゲル（１．０％）の電気泳動によって分離した。試料ＢＲＳ１３３とＪＦ７０５６の増幅反応はＰＣＲ中に濃縮した。

【図15】試験された材料：ＢＲＳ１３３、ＰＩ５９５０９９、２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６を用いて得られた発現カセットの全ての構築物の、プラスミドｐＡＧ１に存在する遺伝子Ａｈａｓの部分のＰＣＲを介した増幅を示す。反応は、６５４ｐｂの断片を増幅するプライマーＡｈａｓ１ ＦとＡｈａｓ２ Ｒを用いて行われ、次にアガロースゲル（１．０％）の電気泳動によって分離した。

【図16】試験された材料：ＢＲＳ１３３、ＰＩ５９５０９９、２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６を用いて得られた発現カセットの全ての構築物の、プラスミドｐＡＧ１に存在する末端領域ＮｏｓのＰＣＲを介した増幅を示す。反応は、２００ｐｂの断片を増幅するプライマーＮｏｓ１ ＦとＮｏｓ３ Ｒを用いて行われ、次にアガロースゲル（１．０％）の電気泳動によって分離した。

【図17】非生物的ストレス及び生物的ストレスの試験プラークの構造を例示する図式的モデルを示し、それに、異なる発現カセットで形質転換された、シスト線虫、ＢＲＳ１３３及びピンタド（Ｐｉｎｔａｄｏ）（斑点）に感受性である品種の大豆胚を与えた。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−感受性親起源のプロモーター領域を用いて構築された発現カセットで形質転換された胚、ｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＢＲＳ１３３；Ｒ−耐性集団の個体起源のプロモーター領域を用いて構築された発現カセットで形質転換された胚、ｐＡＧ２／プロモーター領域ＧｍＨＳＰ ＪＦ７０２７。

【図18】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクス（ｂｉｏｂａｌｉｓｔｉｃｓ）によって形質転換され、２時間、４時間及び２４時間、２５℃の温度で熱ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図19】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２時間、４時間及び２４時間、３５℃の温度で熱ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図20】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２時間、４時間及び２４時間、４５℃の温度で熱ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図21】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２時間、４時間及び２４時間、４℃の温度で熱ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図22】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２時間、４時間及び２４時間、１５℃の温度で熱ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図23】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２４時間、２００ｍＭ、４００ｍＭ濃度のＮａＣｌ₂の塩に供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図24】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２時間、４時間及び６時間、温室中で３７℃でペーパーフィルターに胚を維持しながら干ばつストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３とピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図25】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２０００〜３０００Ｊ₂／ｍＬの接種のよる生物的ストレスに供された大豆の品種ＢＲＳ１３３の胚で行った組織化学的試験を示す。試料は、２４時間、４８時間及び７２時間、病原体と接触し続けた。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【図26】シスト線虫ジャワニカに感受性であり、発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨｓｐ ＢＲＳ１３３とｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７を用いてバイオバリティクスによって形質転換され、２０００〜３０００Ｊ₂／ｍＬの接種のよる生物的ストレスに供された大豆の品種ピンタド（斑点）の胚で行った組織化学的試験を示す。試料は、２４時間、４８時間及び７２時間、病原体と接触し続けた。青色ドットは陽性反応を指示する。ＣＮ−負の対照、形質転換されていない胚；ＣＰ−正の対照、プラスミドｐＡＧ１で形質転換された胚；Ｓ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３で形質転換された感受性胚；Ｒ−発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換された耐性胚。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ_(n)挿入物の使用に関する。集団における耐性及び感受性の個体のうちで、熱ショックタンパク質（Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ）の発現レベルについて比較し、定量的ＰＣＲあたりの最大発現レベルは、プロモーター領域における最大ＡＴ挿入物を含む個体に存在していた。大豆胚を形質転換するために、ＧＵＳタンパク質に融合した異なる数のＡＴ挿入物をとともに、遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現カセットを構築した。本発明の実験結果により、ある種の遺伝子の発現レベルは、遺伝子工学的ツールを介して、プロモーター領域内にＡＴ_(n)繰り返し塩基を挿入することによって、ある種の制限内で人工的に情報制御（上流）又は下方制御（下流）され得たことが示唆される。したがって、本発明において開発された技術は、ＡＴ_(n)繰り返し挿入物がプロモーター領域の配列内の特異的な点で挿入されるという条件で、遺伝子の発現レベルの調節を可能にする。

【0027】

線虫メロイドギネ・ジャワニカに耐性な大豆遺伝子型の支援された選択における使用のための分子マーカーを特定しようとする従来の研究に基づいて、Ｆ結合基のマイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６は、試験された集団について高い有意性を示し、根におけるシストの特徴的数について説明し、表現型バリエーションは４３％、記入尺度法でそのバリエーションの７０％を示した。このマーカーによって増幅した断片は、感受性個体にのみ存在し、耐性個体では存在しないことを指摘するのは重要である。

【0028】

このマーカーを配列決定し、その後、遺伝子バンクに寄託された核酸の他の配列との類似性について探索され、この配列は、低分子量の熱ショックタンパク質（Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ）のプロモーター領域と高い相同性を示し、大豆に見出され、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号：Ｍ１１３１７）で寄託された。ＧｅｎＢａｎｋで利用可能であるこの遺伝子の完全な配列を用いて、新しいプライマー対は、両方の遺伝子型における断片を増幅するために設計された。

【0029】

このストラテジーは成功し、断片は、感受性個体と耐性個体の両方で得られた。得られた断片の全てをクローニング及び配列決定し、また、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの同じプロモーター領域と相同性を示した。しかしながら、配列のアラインメントは、感受性植物と比較した場合、耐性植物は、ＡＴ_(n)繰り返しによって特徴付けられる、マイクロサテライトのより大きな挿入物を遺伝子のプロモーター領域に有していた。このようにして、耐性親ＰＩ５９５０９９起源の断片は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列と比較した場合に、１５及び１３のＡＴのさらなる繰り返しを示した。他方、感受性親ＢＲＳ１３３起源の断片は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である配列よりも６回少ないＡＴ繰り返しを有する。これらの結果は、配列決定もされたこの異種交配に起因した集団の耐性及び感受性の個体について繰り返された。

【0030】

また、アラインメントは、増幅された断片の全ては、マイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６のプライマーに相補的な配列を有することを示した。これを達成した場合、次に以下の疑問が生じる：マイクロサテライトプライマーのアニーリング領域が高い確立で存在するとしても、増幅が初期に耐性な植物に生じなかったのか？１つの可能性は、例えばヘアーピンなどのある種の三次構造の形成を与える、耐性個体においてより多数のＡＴ繰り返しであり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼを増幅プロセス中にプライマーがアニーリングすることを困難にし、結論として、これらの植物においてアンプリコンの形成を阻害したのであろう。

【0031】

この遺伝子のプロモーター領域内のマイクロサテライトの挿入は、これらの個体においてのみマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６が増幅したことから、感受性植物においてそれを非活性化すると考えられた。しかしながら、研究は、全ての試料はマイクロサテライトの挿入を示したことを表し、おそらくは、それは線虫に対する大豆の応答において干渉している可能性があるプロモーター領域内にＡＴ繰り返し数である。遺伝子のプロモーター領域への繰り返し配列のより多くの又はより少ない挿入の存在が、このプロモーターによって調節されるタンパク質を非活性化し、活性化し、又はその発現レベルを変更する場合がある。

【0032】

文献によると、熱ショックタンパク質の遺伝子発現の調節において繰り返しされるこれらのＡＴ−エレメントの主な機能の１つは、転写開始部位へのＲＮＡポリメラーゼのアクセスを促進することであり、さらに、転写の誘導に関与する、熱ショックタンパク質の結合を促進するためにヒストンを排除することである。文献によれば、熱ショックタンパク質は、細胞内で分子シェペロンとして作用し、新生ポリペプチド鎖を確立し、それらの正しいフォールディングを支援し、タンパク質及び／又は変性した膜を再確立し、さらにシグナル伝達において重要な役割を果たす。

【0033】

したがって、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域への挿入の長さがＭ．ジャワニカによって影響される耐性及び感受性個体におけるタンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現レベルを変更するという仮説を調べるために、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した。結果は、全ての個体は、耐性である又は感受性であるかに関係なく、そして、処置に関わらず、線虫を接種されるか又はされないかに関係なく、タンパク質を発現することを示した。遺伝子制御におけるＡＴ配列の生物学的機能、及びプロモーター内の繰り返し数に関する個体間に存在する差異により、リボヌクレアーゼ保護アッセイは、異なる個体において遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現鎖を示すと考えられたが、なお、その結果は、理論的には、線虫による感染に応答して、この遺伝子の発現に差異がないことを示し、少なくとも使用された技術によって検出可能なレベルではなかった。

【0034】

これらの結果を確認する試みにおいて、新たな研究は、遺伝子発現レベルを定量するための正確かつ精密な技術であるリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて案出された。親ＢＲＳ１３３（感受性）及びＰＩ５９５０９９（耐性）、さらに、この異種交配に由来する感受性集団の個体（２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ）並びに耐性集団の個体（ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６）に線虫を接種した。メロイドギネ・ジャワニカで接種された及び接種されていない処置の根は、ＲＮＡの抽出に回収され、全ｃＤＮＡ合成は、その後、相対的定量のためのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用された。

【0035】

結果は、全ての耐性の親個体ＰＩ５９５０９９、その集団のＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は、シスト線虫で接種処理された遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのより高い発現を提示することが示された。この集団のこれらの個体は、配列決定において、遺伝子のプロモーター領域内のより高いＡＴ_(n)繰り返しを示したのと同じである。我々の仮説は、線虫によって感染させた場合、細胞内のシャペロンの機能を有するその転写を活性化する、耐性植物の遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−ＬのプロモーターのＡＴリッチ領域と相互作用するある種の因子を生成するということである。ＡＴ領域などの因子の相互作用に感受性のある植物において、それはこのような激しいやり方で生じなく、これは、タンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現レベルが線虫に感受性のある植物においてより低いことを意味する。

【0036】

本発明の技術を通じて、プロモーター領域の特定の点における異なるサイズのＡＴ挿入物を含む、異なる遺伝子の発現レベルを制御することが可能となる。また、ＡＴ挿入のサイズに比例して、プロモーター領域に存在する、遺伝子を過剰発現又は低発現するＧＭ植物を開発することが可能となる。

【実施例】

【0037】

生物材料
構築物は、根こぶ（ｇａｌｌ）線虫であるメロイドギネ・ジャワニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）にそれぞれ耐性であり、影響を受けやすい大豆遺伝子型の親ＰＩ５９５０９９及びＢＲＳ１３３を用いて生じさせた。この高配から、Ｆ４世代において、感受性集団の個体２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、並びに耐性集団である個体ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６を選択し、本試験に用いた。

【0038】

また、線虫に感受性である品種ピンタド（Ｐｉｎｔａｄｏ）は、異なる試料から構築され、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）のプロモーター領域における異なるＡＴ_(n)を含む発現カセットを用いて大豆胚の形質転換工程において、粒子衝突を介して用いられた。

【0039】

実施例１：プロモーター及び完全遺伝子の単離及び特徴付け
マイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６プライマーを用いて感受性材料の増幅断片の初期配列決定から得た遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの完全配列を用いて、初期に、感受性遺伝子型だけがマイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６を増幅したことを考慮して、分析中の全ての遺伝子型におけるバンドを得るために、新規なプライマーセットを設計した（図１）。

【0040】

プライマー（ｐＳｏｙＨｓｐ ＡｌｅＩ Ｆ ５’ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＧＴ Ｇ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’；ｐＳｏｙＨｓｐ ＮｃｏＩ Ｒ ５’ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＴＴ３’）は、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の開始において合成され、後のクローニング用に制限部位を付した。図２は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列におけるプライマーアニーリング部位を示す。

【0041】

より新しいプライマーセット（ｐＳｏｙＨＳＰ ＰｓｔＩ Ｆ ５’ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’；ＳｏｙＨＳＰＣＬ Ｒ ５’ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＣＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＴ３’）を設計し、これは、コード領域のプロモーターの開始から終止コドンまでの全遺伝子を増幅し、根こぶ線虫であるＭ．ｊａｖａｎｉｃａに感受性である遺伝子型と耐性である遺伝子型との間のプロモーター良識のＡＴ_(n)挿入物以外に、遺伝子配列における他の相違の存在を確認するためであった。図３は、完全な遺伝子を増幅し、配列決定するために設計された、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列におけるプライマーアニーリング部位を示す。

【0042】

種子由来のゲノムＤＮＡを全ての分析された試料から抽出した。各々の分析した試料からの約５０ｍｇの種子は、カミソリの刃で薄片にスライスし、１．５ｍＬマイクロチューブに回収し、３００μＬの抽出緩衝液を添加した。材料を粉砕し、さらに７００μＬの抽出緩衝液を添加した。以下の表に示されたプロトコールに従って抽出緩衝液を調製した：
表１：ゲノムＤＮＡ抽出緩衝液の調製に使用された試薬：

【0043】

【表1】

【0044】

３０秒〜１分間、ボルテックスを用いて溶液をホモジナイズし、４分間、１６，０００×ｇで室温にて遠心分離した。懸濁液を新しい１．５ｍＬチューブに移し、前回と同じ条件で新たに遠心分離工程に提供し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。

【0045】

タンパク質を排除するために、０．１ｍｇのプロテイナーゼＫと０．０１ｍＭのＣａＣｌ₂を試料に添加し、水浴中で３７℃にて９０分間インキュベートした。９００μＬの冷イソプロパノールを添加し、２分間インキュベーション後、７分間、１６，０００×ｇで遠心分離を行った。上清を捨て、ペレットを９０分間乾燥させた。４０μｇ／μＬのＲＮａｓｅ Ａを含む３００μＬのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ ０．５Ｍ、ｐＨ８．０）にペレットを再懸濁させ、ＲＮＡを排除するために、もう一度、水浴中で３７℃にて９０分間、試料をインキュベートした。次に、新たに沈殿工程を行い、最終的に、ＤＮＡペレットを３００μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、分光偏光計を用いて定量し、その質及び完全性を０．８％アガロースゲルにおいて確認した。

【0046】

全ての耐性試料及び感受性試料から、プロモーター領域と完全遺伝子配列を増幅するために、ＰＣＲ反応をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーを用いて行い、３０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０×反応緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭのＫＣｌ、及び４００μＬの超純水）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．３ｍＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び５μＭの各ＦとＲプライマーから構成され、超純水を用いて最終体積を１０μＬにして完了した。

【0047】

ＤＮＡ試料を増幅するために使用した熱サイクルプログラムは、以下のように構成される：９４℃で７分間の初期変性段階、続く、９４℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長の３０サイクル。７２℃で７分間のサイクルを最終に行った。増幅生成物を１％アガロースゲルで分離し、１×ＴＢＥ緩衝液（１０８ｇ Ｔｒｉｓ塩基、５５ｇボロン酸、４０ｍＬのＥＤＴＡ ０．５Ｍ ｐＨ８．０、及び蒸留水、最終体積を１Ｌとして完了する）を用いて調製され、エチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍＬ）で染色した。Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ ＤＣ２９０システムを用いてイメージを得た。

【0048】

増幅した断片（図４及び５）は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いて、製造業者の使用説明書に従って抽出された。ＤＮＡを精製後、−２０℃にて保存した。次に、ＤＮＡを定量し、断片とプラスミドベクターとの間の連結反応をＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。連結反応は以下の構成であった：２μＬ超純水；１μＬ塩溶液（７μＬの塩溶液の希釈：２１μＬの超純水）；１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）ベクター及び２μＬ（約１０ｎｇ）の精製バンド。試料を室温にて５分間インキュベートした。

【0049】

得られたベクターは、エレクトロポレーションを通じて、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ菌株）細胞形質転換のために使用された。エレクトロコンピテント細胞を調製し、グリセロールストックからプレートストリーキングを通じて単離されたコロニーを得た。次に、５個の単一コロニーは、一晩、１０ｍＬのＬＢ培地−Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（１Ｌの蒸留水に対して、トリプトファン、酵母エキス及びＮａＯＨの２０ｇ混合物）中で３７℃にて２００ｒｐｍで培養された（プレ接種）５ｍＬのプレ接種は、ＯＤ５００が０．５〜０．７に到達するまで、３７℃にて３００ｒｐｍ回転した５００ｍＬのＬＢ培地に添加された。この期間後、氷上で２０分間、細胞をインキュベートし、無菌状態で、氷で予め冷やした２５０ｍＬ遠沈管に移した。４，２７８×ｇで１５分間、４℃での遠心分離工程を行い、上清を捨て、ペレットを冷却した１０％グリセロールの５００ｍＬ中に再懸濁させた。同じ条件下で新たに遠心分離を行い、上清を捨て、ペレットを冷却した１０％グリセロールの２５０ｍＬに再懸濁させた。もう一度、遠心分離工程を行い、ペレットを冷却した１０％グリセロールの２０ｍＬに再懸濁させた。溶液を５０ｍＬの滅菌チューブに移し、３９９７×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離を行った。最終行程として、ペレットを冷却した１０％グリセロールの１ｍＬ〜２ｍＬに再懸濁させた。エレクトロコンピテント細胞を５００μＬのマイクロチューブに分注し、−８０℃の冷凍庫で保存した。

【0050】

２．５ｋＶ、２５μＦに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）エレクトロポレーター、及び２００又は４００オームに設定したパルスコントローラーでエレクトロポレーションを行った。２μＬの連結反応物及び１００μＬのエレクトロコンピテント細胞を用いた。細胞救出は、１５ｍＬの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて、１ｍＬのＳＯＣ培地 （０．５ｇ酵母エキス、２ｇトリプトファン、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄、２０ｍＭグルコース、及び９６ｍＭの蒸留水）中の細菌懸濁液を培養し、３７℃にて１時間２００ｒｐｍでインキュベートすることによって得られた。この期間後、３００μＬのエレクトロポレーションした細胞は、アンピシリン（１００μｇ／３０ｍＬ）を補足し、ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ（５０μｌのＩＰＴＧ−イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド０．１Ｍ、及び１０μＬのＸ−Ｇａｌ− −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（５０ｍｇ／ｍＬ）／プレート）を含む固体ＬＢ培地に播種した。プレートを３７℃にて、一晩、コロニー増殖のためにインキュベートした。組換えコロニーの選択はｌａｃＺシステムを用いて行い、組換えコロニーは、白いコロニーを示し、非組換えコロニーは青いコロニーを示す。これは、ｌａｃＺ遺伝子産物と基質（Ｘ−Ｇａｌ）との反応の得られる生産物に起因している。

【0051】

次に、断片のクローニング及びサイズを確認するために、プラスミドＤＮＡ抽出物は、１ｍＬのＣＧ培地−サイクルグロー（１００ｍＬの水に対して４ｇの市販混合物）及び１００μＬ／ｍＬのアンピシリン（５０ｍＬのＣＧ培地に対して５０μＬのアンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ））を含む、９６ウェルマイクロプレート中に単一の白色コロニーの接種によって実施された。プレートを密封し、３７℃にて３２０ｒｐｍで２２時間、材料をインキュベートした。

【0052】

プラスミド抽出を進める前に、成長細菌の永続培養を得て、一晩増殖させたＣＧ培地７５ｍｌと５０％無菌グリセロールを滅菌プレートに含む。この培養物を−８０℃で超冷凍庫にて保存し、ストックとした。

【0053】

ミニプレップを続行し、細胞の堆積物を得るために、マイクロプレートを６分間、１，３１０×ｇ、１０℃で遠心分離した。上清を捨て、吸収ペーパー上にプレートを素早く逆さにした。次に、２００μＬのＧＥＴ（２０％グルコース、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４及び５００ｍＬに満たすための水）を各植えるに添加し、プレートを密封し、２分間、ボルテックスを用いて激しく振とうし、細胞を再懸濁させた。新たに９分間、１，３１０×ｇ、１０℃の遠心分離を行い、上清を捨て、吸収ペーパー上にプレートを素早く逆さにし、乾燥させた。

【0054】

ＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む６５μＬのＧＥＴをマイクロプレートの各ウェルに添加した。全ての材料は、ボルテックスを用いて再懸濁させ、「Ｕ」底のプレートに移した。次に、各ウェルに６５μＬのＮａＯＨ ０．２Ｎ／ＳＤＳ １％（０．５ｍＬ ＮａＯＨ ４Ｍ＋１ｍＬ ＳＤＳ １０％＋超純水、１０ｍＬの体積になるようにする）を添加した。この溶液は、使用される工程の直前に調製された。プレートを密封し；材料を５〜１０分間の反転により混合し、１０分間室温にてインキュベートした。接着シールに溶液が残らなくなるまで、数秒の迅速遠心分離を行った。

【0055】

各ウェルに、４℃で保存した３Ｍ酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）６０ｍＬを添加し、プレートを密封し、材料を１０回反転することによって混合し、１０分間のインキュベートを氷上で行った。１５分間、１，３１０×ｇ、４℃の遠心分離工程を行い、８０μＬの上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（ＭＡＧＶ Ｎ２２）プレートに移し、２５０μＬの「Ｖ」底ポリプロピレン製マイクロプレートの上部に予め固定した。プレートを５分間、１，３１０×ｇ、４℃にて遠心分離し、又は全容積が底プレート（Ｖ底）に移されるまで行われた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）プレートを取り出し、捨て、「Ｖ」底プレートに移されるろ過された溶液に８０μＬのイソプロパノールを添加した。

【0056】

「Ｖ」底プレートをアルコール耐性接着剤を用いて密封し、材料を反転して混合した。４５分、１，３１０×ｇ、４℃の遠心分離工程を行い、上清をプレートを反転することによって捨て、１５０μＬの冷７０％エタノールを各試料に添加した。プレートを再度、５分間、１，３１０×ｇ、４℃にて遠心分離し、上清を捨てた後、吸収ペーパー上にプレートを反転させ、素早く８２×ｇ、４℃でスピンダウンした。プレートをペーパータオルで覆い、６０分間室温にて乾燥させ、最終的には、ＤＮＡを３０μＬの超純水に再懸濁させた。プレートを密封し、プラスミドＤＮＡの完全な溶出のために室温にて一晩インキュベートした。この期間の経過後、プラスミドＤＮＡを含むプレートを−２０℃の冷凍庫に保存した。

【0057】

試料は、配列決定のために調製される前に、挿入物の存在及びそのサイズを確認するために、制限酵素を用いて消化反応に供された。消化反応物は、１．５μＬの試薬３酵素緩衝液；０．５μＬのＥｃｏＲＩ（１０Ｕ／μＬ）；５μＬのプラスミドＤＮＡ（約１０ｎｇ）及び８μＬの超純水から構成させ、３７℃で２時間インキュベートした。この期間の経過後、反応物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動に供した。

【0058】

断片は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００（Ａｐｐｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キャピラリーシークエンサーによって配列決定され、この場合、ＤＮＡ二本鎖の両配向に基づいて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）キットを使用し、異なる反応物と異なる配列決定実験、Ｍ１３Ｒ及びＦプライマーを用いた。配列決定反応は、各試料から１．５μＬのＤＮＡをプレート上に置き、以下の表に記載のプロトコールに従って調製した反応混合物の８．５μＬを用いた。

【0059】

表２：配列決定反応のために使用した反応混合物の調製に用いた試薬

【0060】

【表2】

【0061】

配列決定反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍサーモサイクラーを以下の条件で行った：９６℃で２分間；９６℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、及び６０℃で４分間の３０サイクル。最終的に、ＤＮＡ沈殿のための反応は、各試料に７５％のイソプロパノールを８０μＬ添加して行い、次に、１５分間、室温にてインキュベートし、遮光し、４５分間、１，３１０×ｇの遠心分離を行った。

【0062】

上清を捨て、１００μＬの７０％エタノールを用いてペレットを洗浄し、次に、１５分間、１，３１０×ｇの遠心分離工程を行った。上清を捨て、室温にて、遮光し、ペレットを乾燥させた。配列決定機械における試料適用について、１０μＬのｈｉ−ホルムアミドにペレットを再懸濁させ、次に、ＤＮＡ変性を引き起こすために、９５℃、５分間、サーモサイクラーで使用をインキュベートした。ＤＮＡの再アニーリングを回避するために、プレートを即座に氷に移し、その後、配列決定機械に置いた。

【0063】

プロモーター領域及び完全な遺伝子領域の配列決定後、生物学的配列の配列データベースサーチを行い、得られた断片と既知のＤＮＡ、及びタンパク質配列の間の類似性を検証した（図６）。これを達成するために、プログラムＢＬＡＳＴｎとＢＬＳＡＴｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いた。ヌクレオチド配列（図７及び図８）並びにアミノ酸配列（図９）のアラインメントはまた、適切なソフトウェア、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ １０．０．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．），ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて行った。

【0064】

実施例２：遺伝子発現の調節研究−ＲＰＡ
親遺伝子型ＰＩ５９５０９９（耐性）及びＢＲＳ１３３（感受性）をＲＰＡ実験のために選択した。大豆に存在する熱ショックタンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）の完全配列から、プライマーセットをコード配列に対して設計した（ＲＰＡ２ Ｆ ５’ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＡ３’及びＲＰＡ２ Ｒ ５’ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＧＣ ＴＡＡ ＴＣＴ ＧＡＡ３’）。

【0065】

分析した親試料由来の種子ＤＮＡ抽出物、ＰＣＲを通じた断片の増幅、ＰＣＲにより生じた生成物のクローニング及び配列決定は、前述の項目において従前に詳述されたプロトコールに従って行われた。

【0066】

親ＰＩ５９５０９９（耐性）及びＢＲＳ１３３（感受性）由来の総ＲＮＡは、２つの異なる処置（Ｍ．ジャワニカ線虫卵の接種及び非接種）に供された大豆根から抽出された。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キットを用いて抽出を行った。すり鉢と乳棒を用いて液体窒素中で根を粉砕し、オートクレーブしたファルコンチューブに移し、ドラフトで保存し、これは２０ｍＬのトリゾールを含む。ホモジナイゼーション後、試料を５分間、室温（１５〜３０℃）にて試料をインキュベートした。１ｍＬのトリゾールの各々に対して０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、１５秒の激しい撹拌後、溶液を室温（１５〜３０℃）にてさらに３分間インキュベートした。次に、１２．２４０×ｇ、１５分間、４℃の遠心分離工程を行った。ＲＮＡを含む液相を新しいファルコンチューブに移し、最初に使用したトリゾール１ｍＬの各々に対して、０．５ｍＬのイソプロパノールを用いて沈殿させた。溶液を室温（１５〜３０℃）で１０分間インキュベートした。１２．２４０×ｇ、１０分間、４℃の新たな遠心分離工程を行った。チューブの底に形成したペレットには沈殿したＲＮＡが含まれる。全上清を取り除き、ＲＮＡペレットを７５％エタノール（使用したトリゾール１ｍＬの各々に対して１ｍＬエタノール）を用いて洗浄した。溶液を４．２８５×ｇ、５分間、４℃で遠心分離を行い、再度、全上清（エタノール）を除いた。ペレットを溶解するために、４００μＬのＤＥＰＣ水を添加した（必要に応じて、ペレットを溶解するために温度を５０〜６０℃に上昇させた）。抽出後、総ＲＮＡを分光偏光計で定量した；その完全性を２％アガロースゲルで検証し、最後に、−８０℃で超冷凍庫で保存した。

【0067】

初期に、対象の断片を含むプラスミドを線状化した。３０．６μＬのＤＥＰＣ水、４μＬの緩衝液、１μｇの精製プラスミド、０．４μＬのＢＳＡ、及び１μＬの制限酵素ＡｐａＩを含む反応物を３７℃、２時間、サーモサイクラーでインキュベートした。この期間の経過後、プラスミドは、１体積のフェノールを用いて精製され、ボルテックスを用いて２分間混合され、１１．７５０×ｇ、１０分間、４℃の遠心分離工程に供された。次に、水相を回収し、酢酸アンモニウム（ＮＨ₄ＯＡｃ）を添加して、最終濃度を０．５Ｍにした。３体積の冷９５％エタノールを添加し、溶液を−２０℃にて１時間インキュベートした。１１．７５０×ｇ、４℃、１５分間の新たな遠心分離工程を行い、上清を注意深く捨てた。チューブを開け；ペレットを５分間乾燥させ、次に、３０μＬのＤＥＰＣ水に再懸濁させ、−２０℃にて冷凍庫で保存した。

【0068】

プローブを得ること
プローブを得るための転写反応は、ＭＡＸＩＳｃｒｉｐｔ（商標）インビトロ転写（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）キットを用いて行った。ＲＮＡポリメラーゼＴ７とＰ³²−標識したホスフェートジデオキシヌクレオチド（ＣＴＰ）を用いた。最初に、全てのキット試薬を解凍し、氷上で維持した。ただし、室温に保存しなければならないＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ緩衝液（登録商標）は除く。全最終体積２０μＬを用いた転写反応は、１．５ｍＬマイクロチューブで、室温にて、以下の表に記載のプロトコールに従って行った。

【0069】

表３：放射活性プローブの転写反応に使用される試薬

【0070】

【表3】

【0071】

次に、全ての試薬をマイクロチューブ中で穏やかに混合し、反応物を３７℃にて１移管、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。２ＵのＤＮａｓｅ Ｉ ＲＮａｓｅフリーを添加し、反応物を１５分間、３７℃にてインキュベートした。１体積のゲルローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、０．０２５％ブロモフェノールブルー、０．０２５％キシレンシアノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５ＳＤＳ）を反応物に添加し、チューブを３〜５分間、８５〜９５℃で加熱し、全試料を５％ポリアクリルアミドゲル、尿素８Ｍ、１×ＴＢＥ緩衝液上に適用した。

【0072】

１２．０１ｇの尿素、３．１２ｍＬの４０％アクリルアミド：ビス−アクリルアミド（１９：１）及び２．５ｍＬの１０×ＴＢＥを用いて、最終体積が２５ｍＬのゲルを調製した。ゲルの最終体積が超えるのを避けるために少量の水をさらに添加した。尿素を溶解するために、ヒーターを備えた磁気撹拌システム中で溶液を維持し、その後、冷却し；シリンダーに移し、最終体積のゲルをＤＥＰＣ水で満たした。次に、１２．５μＬのＴＥＭＥＤを添加し、最後に１５６．２μＬの１０％過硫酸アンモニウムを添加した。

【0073】

この溶液を即座にガラスプレートに適用し、ウェルコム（ｗｅｌｌ ｃｏｍｂ）を置き、プレートを動かすことなしに重合をさせた。ガラスプレート及び電気泳動チャンバーを洗浄し、ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて処理することからなる、これらの材料の前処理を施すことができる。より小さなプレート上で、１〜３ｍＬのＲｅｐｅｌをドラフト中で提供し、５〜１０分間、プレートを乾燥させることができる。この処理は、電気泳動後のゲル除去を促進する。

【0074】

電気泳動を行う前に、プレートを洗浄し、過剰の尿素を排除し、ウェルコムの除去後、注射器の助けでランニング緩衝液を用いてウェルを洗浄した。チャンバーに対して所定電圧を用いたゲルの２０〜３０分の予備駆動を行い、その後、使用を適用した。プローブのサイズに従って、約２時間の電気泳動を２００〜３００ボルトで行った。

【0075】

全長プローブだけをゲル精製した。これを達成するために、電気泳動後、プレート開け、ゲルをプラスチックフィルムで覆い、バンド位置の同定をガイドするために記されたオートラジオグラフィーフィルムを約１時間晒した。次に、フィルムを５分間、暗室中で、現像液に浸して現像し、過剰分を除き、洗浄のために約３分間水に浸し、最後に固定溶液中に５分浸した。次に、フィルムを水に浸し、空気乾燥させた。フィルムとゲルを並べて、全長転写物の位置を特定した。ゲルの対象領域を取り出し、３５０ｍＬの溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）を含むマイクロチューブに移した。プローブを含むチューブを４℃にて一晩インキュベートし、プローブ再生を最大にし、それをハイブリダイゼーションする時まで２０℃で保存した。プローブを標識するためのキットは、その質をモニターするための正の対照を与えた。

【0076】

２５０ｂｐのラットβ−アクチン遺伝子の挿入物を含む対照ＤＮＡ、直線化されたｐＴＲＩＰＬＥｓｃｒｉｐｔプラスミドからプローブを合成し、ラット肝臓総ＲＮＡにハイブリダイズした。それらもキットに与えられた。２つの対照チューブは、酵母総ＲＮＡのみを含み、ＲＮａｓｅ酵素の活性を検証するために使用された。このようにして、酵素陽性対照チューブはＲＮａｓｅと緩衝液を含み、一方、陰性対照チューブは酵素を含まない緩衝液だけを含んだ。

【0077】

試料ハイブリダイゼーションと消化
ＨｙＳｐｅｅｄ（商標）ＲＰＡ−Ｈｙｇｈ−スピードハイブリダイゼーション・リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）キットを用いて、リボヌクレアーゼ保護アッセイは（ＲＰＡ）を行った。各マイクロチューブに対して、標識プローブを総ＲＮＡ（２０ｍｇ）に（高い比活性を有する、約１００〜８００ｐｇの２５０ｎｔ又は１〜１０ｆｍｏｌの２〜８×１０４ｃｐｍ）添加した。また、３０ｍｇの酵母総ＲＮＡを試料に添加し、最終５０ｍｇ／試料を得た。１０ｍＬの酵母総ＲＮＡ（５０ｍｇ）を含む２つの他の酵素対照チューブを得て、１つは、プローブ陽性対照としてラット肝臓総ＲＮＡを含んだ。プローブ＋試料を共沈させるために、０．５ＭのＮＨ₄ＯＡｃと３体積の冷９５％エタノールを添加し、ホモジナイゼーション後、チューブを１５分間−２０℃でインキュベートした。最大速度（最小８．１６０×ｇ）で５分間、４℃にて遠心分離工程を行った。上清を除去し、ペレットを乾燥させた。１０ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄハイブリダイゼーション緩衝液（登録商標）（予め９５℃に加熱）を各試料に添加し、このチューブを即座に９５℃（水浴又はサーモサイクラー）でインキュベートした。ペレットを溶解するために、試料を数秒間ボルテックスし、９５℃に戻した。ペレットを完全に溶解後、チューブを９５℃で３分間、６８℃で１０分間インキュベートした。温度を６８℃に維持しなければならず、移動工程は３０秒以下でなければならない。最初に、ＨｙＳｐｅｅｄ ＲＮａｓｅ消化緩衝液（登録商標）を解凍し、ＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１と緩衝液の混合物（１：１００希釈−９９ｍＬの緩衝液中の１ｍＬ ＲＮａｓｅ）を各試料に対して、１００ｍＬの適切な体積で調製し、室温にて保存した。１００ｍＬの混合ＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１＋緩衝液を各試料、及び酵母総ＲＮＡだけを含む対照チューブに添加し、酵素を含まない１００ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄ ＲＮａｓｅ消化（登録商標）緩衝液を１つのチューブに添加し、酵素を含む完全な混合物を他の対照チューブに添加した。試料をボルテックスし、３７℃にて３０分間、消化させるためにインキュベートした。１５０ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄインキュベーション／沈殿緩衝液（登録商標）を試料に添加し、素早くボルテックスし、チューブを１５分間、−２０℃の冷凍庫でインキュベートした。消化後、試料を１５分間、最大速度、４℃にて遠心分離し、上清を除去し、ゲルローディング緩衝液（通常９〜１０ｍＬの体積）中に再懸濁させた。ピペットによるホモジナイゼーション後、チューブを３〜４分間、９０〜９５℃に加熱し、再生を避けるために即座に氷に移した。５％ポリアクリルアミドゲル、８Ｍ尿素に試料を適用し、１×ＴＢＥ緩衝液に希釈し、２００〜３００ボルトで約２時間の電気泳動を行い、保護された断片を分離した。電気泳動後、前述のプロトコールに詳述されたフィルム露光及び現像について標準的な手法を行った（図１０）。

【0078】

実施例３：遺伝子発現−ＲＴ−ｑＰＣＲ−温室に設定された実験
遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーターの発現試験については、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、材料ＰＩ５９５０９９、ＢＲＳ１３３、２５６−Ｓ、２５９−Ｓ、２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は由来の種子は、成長チャンバーで発芽ペーパー上に播種され、８日後、苗をプラスチック容器に移した。温室で、これらの苗は、発生Ｊ２の感染段階で幼虫のメロイドギネ・ジャワニカで感染させた。使用された線虫集団は、品種Ｄｏｋｏ由来の大豆植物から得た。根からの線虫卵抽出物は、０．５％次亜塩素酸塩溶液中で３０秒間、ブレンダーを用いて材料を挽くことによって得られた。根を水中で洗浄し、排除サイズ５００を有するミニスクリーンを用いて卵を回収した。その後、遊離（ｆｒｅｅ）卵懸濁液を２６℃に設定した孵化チャンバーに移し、２４時間ごとに、ジャワニカ（Ｊ２）を回収して、冷蔵室に保存した。ジャワニカＪ２をＰｅｔｅｒｓチャンバーで定量した。ピペットの助けを得て、６６４のＪ２／ｍｌ（植物あたり）を接種し、接種の第１、３及び６日後に、試験中の８個の材料の各々の３つの大豆植物由来の根をバルクで回収し、ジャワニカで接種されたものと接種されていないもの（対照処理）について液体窒素に移した。ＲＮＡ抽出実験の開始まで、根を超冷凍庫（−８０℃）で保存した。

【0079】

ＲＴ−ｑＰＣＲプライマー設計
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー（ＳｏｙＨｓｐＰＳＣ Ｆ ５’ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＧＡ Ａ３’；ＳｏｙＨｓｐＰＳＣ Ｒ５’ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＴＣ３’）は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）の配列ｐｏｓ終止コドン（ＴＡＡ−ヌクレオチド位置８８４）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．０（Ａｐｐｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プログラムで設計された。これらのプライマーは、約８０ｂｐの断片を増幅するために使用された。プライマーを設計するためにＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムに適用された選択されたパラメータは、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ（１２０ｂｐはＲＴ−ＰＣＲに推奨される）のアンプリコン長、４０％〜６０％のＣＧ含量、最大では一列に４個のＧ塩基、５８℃〜６０℃のプライマーＴｍ（融解温度）、ＦとＲプライマー間のＴｍの最大相違が１℃であり、一列に最大４個の同一塩基を避けるべきである。その後、プライマー二量体の形成を分析するために、プログラムＯＭＩＧＡを使用し、３’末端の６遊離塩基の最小の存在を観察した。

【0080】

ｃＤＮＡ合成用の総ＲＮＡ入手
リアルタイムＰＣＲ実験を行うために、総ＲＮＡをトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて抽出した。最初に、１ｍＬのトリゾール／試料をファルコンチューブに分注し、５５℃に加熱した。試料の植物組織を液体窒素中でホモジナイズし、０．１ｇを窒素に維持されたチューブに分注された。その後、１ｍＬの加熱したトリゾールを試料に添加し、１分間ボルテックスし、素早くスピンダウンし、２分間５５℃にてインキュベートした。試料を４℃、２０分間、１６．０００×ｇで遠心分離し、２００μＬのクロロホルムを含むチューブに上清を移し、残渣を捨てた。試料を振とうし、室温（２２〜２５℃にて）２分間インキュベートし、次に、１６．０００×ｇ、３０分間、４℃にて遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、８ＭのＬｉＣｌを１／３体積添加した。振とう後、チューブをフリーザー中で−８０℃、１時間インキュベートした。溶液を解凍するために、チューブを４０℃の水浴中に１〜３分維持し、１６．０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離した。上清を除去し、捨て、ＲＮＡを含むペレットを妨げることを避ける各試料に４００μＬの７５％エタノールを添加し、チューブを穏やかに反転した。４℃、５分間、１６．０００×ｇの遠心分離工程を行い、上清を除去し、完全に捨てた。１００μＬの超純水をペレットに添加し、チューブを穏やかに軽く叩いて、ペレットを溶解した（ペレットが迅速に溶解しない場合、さらに１００μＬの超純水を添加することができるが、次の工程で酢酸ナトリウムとイソプロパノールの体積を２倍にすべきである）。次に、１０μＬの酢酸ナトリウム（３Ｍ）と１００μＬのイソプロパノールを添加し、チューブを穏やかに反転した。試料を−８０℃で３０分間インキュベートし、水浴に３７℃で１〜３分間移し、１６．０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離した。上清を除去し、４００μＬの７０％エタノールを添加し、もう一度、チューブを１６．０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離した。上清を除去し、捨て、１０分間、ペレットをベンチで乾燥させた。最後に、５０μＬの超純水（又はペレットがすぐに溶解しない場合には１００μＬ）を添加し、ペレットと溶液を３７℃にて１０分間加熱し、ペレットの溶解を促進した。ＲＮＡを定量し、−８０℃のフリーザー中に保存した。逆転写反応に関して、ＲＮＡを希釈し、ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素（モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス：Ｍ−ＭＬＶ）を用いて行われた。このようにして、１．５ｍｇの総ＲＮＡをマイクロチューブに分注し、ＤＥＰＣ水を最終体積９ｍＬまで添加し、６ｍＭのランダムプライマーを反応に添加し、次に８０℃にて３分間インキュベーションした。この期間の経過後、チューブを氷上で冷却し、１４ｍＬの混合物を試料に添加した。この混合物は、以下の表に記載されたプロトコールに従って調製された。

【0081】

表４：ｃＤＮＡ合成用の混合物調製に使用された試薬
試薬 反応あたりの体積
５×第１鎖緩衝液６ｍＬ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） ４ｍＬ
ＤＴＴ（０．１Ｍ） ２ｍＬ
逆転写酵素 ２ｍＬ

【0082】

反応物をサーモサイクラーを用いて、３７℃にて１時間インキュベートし、その後、１０分、６５℃の工程を行った。ｃＤＮＡを−２０℃にて保存した。

【0083】

ＲＴ−ｑＰＣＲ
ＰＣＲ反応は、サーモサイクラー７３００リアルタイムシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＳＹＢＥＲ（登録商標）グリーンｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キットを用いて行われた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍによって推奨されるように、増幅効率曲線は、標的遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌと内因性対照遺伝子ｒＲＮＡ １８Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｘ０２６２３．１）（試料標準化のために使用される）について行われた。実験プレートは、両方の遺伝子について３点測定で試料を用いて設定された。曲線は傾きを与え、それは、プライマーの増幅効率を計算するために使用され、両遺伝子について類似し、１００％（値１）に近くなければならない。相対的定量化のための増幅反応は、分析された試料の各々について回収の３日からｃＤＮＡのバルクを用いて行われた。別々の実験において、親使用について２つのリアルタイムＰＣＲ実験、及び集団試料について２つを行った。親菌株ＢＲＳ１３３とＰＩ５９５０９９、及び感受性集団由来の６個の得られた個体、２５９−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、並びに耐性ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は、線虫接種処理及び非接種処理について分析された。反応は３点測定で行い、８．０μＬの超純水、０．５μＬのＲＯＸ、１２．５μＬのＳＹＢＥＲ（登録商標）グリーンｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ及び２μＬのバルクＤＮＡ（約１．５μｇ）から成っていた。増幅反応のサイクリングパラメータは以下の通りであった：５０℃にて２分間；９５℃にて２分間；次に、９５℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、及び７２℃にて３０秒の４５サイクル。データを伸長工程（７２℃）にて回収した。相対的定量化を結論付けた後、プライマー二量体の形成、非特異的（ｉｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃ）増幅、可能なエラー及び汚染を検証するために、解離曲線を行った。ＲＴ−ＰＣＲ−によって生じたデータの解釈は、ＳＤＳ−配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ソフトウェアを用いて行われた。

【0084】

これらの分析では、相対的遺伝子発現（ＲＱ）の計算を個別に行い、較正（値１）として、非接種試料を用いて、線虫接種処理及び非接種処理について、別々に試料を比較した。ＲＱ値はΔＣｔ法を用いて計算した。このようにして、遺伝子発現のレベル（ＲＱ）は、各処理の標的試料のＣｔを内因性対照Ｃｔで差し引くことによって計算し、ΔＣｔを生じさせる。この値は、対照試料のΔＣｔから差し引かれ（較正−値１）、ΔΔＣｔの値を得る。ＲＱは式２−ΔΔＣｔを通じて得られる。ここで、２は標的遺伝子効率（１００％＝１）の合計と、１００％効率曲線で得られた内因性対照（１００％＝１）の合成に対応する（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。標的遺伝子及び内因性遺伝子の効率は、１００％に近くなければならないが、必ずしもそうでなくてもよいが、それらはより低くてもよく、しかしながら、それらは近くなければならない。そして、この場合、式２−ΔΔＣｔの値２は、標的遺伝子と内因性遺伝子の効率の合計によって置換される。根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカによる接種及び非接種の治療における親菌株ＢＲＳ１３３及びＰＩ５９５０９９の分析について、非接種の試料ＰＩ５９５０９９を較正（値１Ｘ）として使用し、感受性群（２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ）の分析及び耐性集団（ＪＦ７００２、ＪＦ２０２７及びＪＦ７０５６）について、非接種の感受性試料２５６−Ｓを較正試料として使用した。この材料は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域の配列決定において、低数のＡＴ（ｎ）挿入物を示したという事実に起因して選ばれた。

【0085】

実施例４：Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における、異なるサイズのＡＴ（ｎ）挿入物を含む発現カセット構築物
耐性個体はＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における高数のＡＴ（ｎ）挿入物を示し、これらの個体は、ＲＴ−ＰＣＲに供された場合、根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカで接種されると、高レベルのこの遺伝子発現を示すことが確認されると、発現カセットをＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における、異なる数のＡＴ挿入物を含むように構築されるように決定された。これらの構築物の利用の目的は、これらのプロモーターは、ＡＴ（ｎ）挿入物とともに、他の遺伝子の発現を誘導し、またそれらの遺伝子の応答、異なるストレスによるそれらの活性化若しくは非活性化を評価することができる。粒子衝突を用いて、線虫感受性品種ＢＲＳ１３３とＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆胚を形質転換するためにカセットを使用した。得られた構築物において、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーターは、異なるストレスへの胚の曝露後、組織化学的アッセイを介した発現を有するＧｕｓ遺伝子前に位置している。

【0086】

８個の分析された試料であるＢＲＳ１３３、ＰＩ５９５０９９、２５６−Ｓ、２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ２０２７及びＪＦ７０５６のプロモーター領域を含む発現カセットを得て、全体で９６カセット（各材料について１２個）であった。しかしながら、ただ２つの構築物をこの試験の次の工程に使用し、それは、ＡＴ（９）である、より少ない数の挿入物を有する感受性親ＢＲＳ１３３由来の増幅されたプロモーター領域を含むカセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３と、ＡＴ（３２）を有する耐性集団ＪＦ７０２７由来の個体からの増幅されたプロモーター領域を含むカセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７であった。プラスミドｐＡＧ１は発現カセットを構築するための鋳型として選ばれた。設計されたストラテジーは、プラスミドに存在するアクチン遺伝子由来のａｃｔ２プロモーターの除去、及び感受性親菌株ＢＲＳ１３３と、耐性集団ＪＦ７０２７の個体である、分析されるべき材料由来の増幅されたプロモーターの挿入であった。また、このプラスミドは、それらのカセットを用いた形質転換プロセスが上手くいく場合に、組織化学的アッセイを通じて、トランスジェニック胚における視覚化によって許可さえる、β−グルクロニダーゼ酵素をコードするレポーター遺伝子Ｇｕｓを示す。また、プラスミドｐＡＧ１は、６５３位における突然変異により、除草剤Ｉｍａｚａｐｙｒ（２−［４，５−ジヒドロ−４−メチル−４−（１−メチルエチル）−５−オキソ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−３−ピリジンカルボン酸）（Ｔｕ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｗｅｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ）が属するクラスに含まれる除草剤イミダゾリノンに対する耐性を与えるシロイヌナズナ由来の酵素のアセト乳酸ピルビン酸リアーゼ（ＡＨＡＳ）−アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードするａｌｓ／ａｈａｓ遺伝子のプロモーター（ａｈａｓ ５）、コード配列（ａｈａｓ）及びターミネーター（ａｈａｓ ｔ）を含む。このようにして、この遺伝子は、形質転換後、除草剤含有培地において陽性植物の選択を可能にする。図１３はプラスミドマップを示す。このストラテジーを発展させるために、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを用いてプラスミドＤＮＡ抽出を行った。このようにして、単一コロニーは、抗生物質アンピシリン（０．５ｍｇ）を含む２〜５ｍＬのＬＢ培地に植菌され、３７℃にて８時間、２００ｒｐｍで回転させながらインキュベートした（プレ接種物）。１ｍＬのプレ接種物を５００ｍＬのＬＢ／アンピシリン培地に移し、３７℃にて１２〜２０時間、２００ｒｐｍで回転させながらインキュベートした。２５０ｍＬチューブに細胞を分注し、５．０００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離し、上清を捨て、１５ｍＬの細胞再懸濁液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１９ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ）にペレットを完全に再懸濁させた。１５ｍＬの細胞溶解溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加し、反転して混合し、溶液を２０分間、室温でインキュベートした。次に、１５ｍＬの中和溶液（１．３２Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４．８）を添加し、溶液を反転して混合し、白色フレークの形成をもたらし、溶解物は粘性が低かった。沈殿した材料は、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞残屑及びＳＤＳを含む。１４．０００×ｇ、１５分間、室温での遠心分離工程を行い、上清は、Ｗｈａｔｍａｎ １フィルターペーパーを含むシリンダーでろ過された。体積を測定し、５０ｍＬ遠沈管に移し、室温の０．５体積のイソプロパノールを添加し、反転して混合した。１４．０００×ｇ、１５分間、室温での新たな遠心分離工程を行い、上清を捨て、ペレットを２ｍＬのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。このＤＮＡを含む溶液に、１０ｍＬのＷｉｚａｒｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製レジン（登録商標）を添加し、レジン＋ＤＮＡの混合物は、真空ポンプに連結されたＭａｘｉｃｏｌｕｍｎに移された。真空にし、２５ｍＬのカラム洗浄溶液（８０ｍＭ酢酸カリウム、８．３ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０μＭのＥＤＴＡ、５５％エタノール）を添加し、さらに真空にした。５ｍＬの８０％エタノールをＭａｘｉｃｏｌｕｍｎに適用し、真空にし、その後、全体咳のエタノールをカラムに通過させ、さらに１分間真空を維持した。次に、Ｍａｘｉｃｏｌｕｍｎを５０ｍＬファルコンチューブに移し、１．３００×ｇで５分間遠心分離した。レジンを乾燥させるために、真空をさらに５分間行った。最後に、Ｍａｘｉｃｏｌｕｍｎをキットから与えられるチューブに移し、１．５ｍＬの予熱した水（６５℃〜７０℃）をカラムに添加した。１分経過後、ＤＮＡを溶出するために、遠心分離工程（１．３００×ｇ、５分間、室温）を行った。抽出後、プラスミドＤＮＡを定量し、１％アガロースゲルにおいてその完全性を検証した。ａｃｔ２プロモーター切り出し（−１０００ｂｐ）について、制限酵素消化を行った。第１段階では、ｐＡＧ１を酵素Ｐｓｔ１とＮｏｔ１による二重消化に供した。この消化により、約５．５００ｂｐ（ａｌｓ／ａｈａｓ遺伝子のプロモーター−ａｈａｓ ５、コード配列−ａｈａｓ及びターミネーター−ａｈａｓ ｔに対応する）と６．５００ｐｂ（Ｇｕｓ遺伝子、ａｃｔ２プロモーター及びプラスミド骨格、Ｏｒｉ及びＮｏｓに対応する）の２つの断片を得た。消化反応物は、１０μＬのプラスミドＤＮＡ（約１．５μｇ）、２μＬのＲｅａｃｔ ２緩衝液、５．０μＬのＰｓｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）、及び３μＬの超純水から構成された。チューブを３７℃にて２時間、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。この期間の経過後、さらに２μＬのＰｓｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）を溶液に添加し、３７℃にて２時間、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。同じマイクロチューブで、Ｎｏｔ１を用いた反応を行い、３．５μＬのＮｏｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）、１．５μＬのＲｅａｔ ２緩衝液及び２μＬのＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した。新たに２時間、３７℃のインキュベートし、この期間の経過後、さらに２μＬのＮｏｔ１酵素を添加した。３７℃のサーモサイクラーを用いて反応を一晩維持した。ｐＡＧ１消化した断片を０．８％アガロースゲルにおいて分離し、前述のプロトコールに従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いてゲルを抽出した。消化の第２工程では、より大きな断片（６．５００ｐｂ）は、ａｃｔ２プロモーターの切り出しのために制限酵素ＢａｍＨＩで消化された。反応物は、０．５μＬのＢａｍＨＩ酵素、１５μＬのＲｅａｃｔ ３緩衝液、１２μＬのＤＮＡ消化断片、及び１μＬの超純水から構成された。サーモサイクラーを用いて、マイクロチューブを２時間、３７℃にてインキュベートした。この期間の経過後、さらに０．５μＬのＢａｍＨＩ酵素を添加し、反応物をさらに３７℃にて一晩インキュベートした。断片を０．８％アガロースゲルにおいて分離し、より大きな断片（Ｇｕｓ遺伝子、プラスミドＤＮＡ、Ｏｒｉ及びＮｏｓに対応する）は、製造業者の使用説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いてゲル精製した。親菌株ＢＲＳ１３３と耐性個体ＪＦ７０２７から異なる増幅されたプロモーターを含む発現カセット構築物を得るために、連結反応は、１１μＬの超純水、それぞれ試験した試料からの２μＬ（約１０ｎｇ）のＡｈａｓ断片、１μＬ（約１０ｎｇ）のＧｕｓ断片、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌプロモーター由来の１μＬ（約１０ｎｇ）の精製されたバンド、４μＬのリガーゼ緩衝液及び１μＬのＴ４リガーゼ酵素を混合して行った。反応を一晩、１４℃にてインキュベートした。２つの選択した試料由来のプロモーター領域断片は、プライマーｐＳｏｙＨｓｐＰｓｔＩ Ｆ（５’ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’）及びｐＳｏｙＨｓｐＢａｍＨＩ Ｒ（５’ＣＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＴＴ３’）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅された。プライマーにおいて設計及び合成された制限酵素部位により、ａｃｔ２プロモーターを従前に位置したのと同じ位置で正しい配向のＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーターのクローニングが可能になった。前述のプロトコールに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＤＨ１０Ｂ菌株は、カセットの連結反応を用いてエレクトロポレートされ、ＬＢ培地中で一晩、３７℃にて増殖させた。得られたコロニーから、特定のプライマーを用いた一連のＰＣＲ増幅、制限酵素を用いた消化反応は、構築物のクローニングが成功したことを検証するために行われた。発現カセットが得られたという成功を証明するこの工程後、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマー、ｐＡＧ１プラスミドの、Ａｈａｓ遺伝子（６５４ｂｐ）については（Ａｈａｓ１ Ｆ５’ＡＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＣ３’；Ａｈａｓ２ Ｒ５’ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＧ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＧ３’）、及びＮｏｓターミネーターについては（Ｎｏｓ１ Ｆ５’ＧＡＡ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＧＣ ＣＧＧ ＴＣＴ ＴＧ３’； Ｎｏｓ３ Ｒ５’ＴＴＡ ＴＣＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡ３’）を用いてＰＣＲ反応は、全ての得られた試料を用いて行われた。図１４、１５及び１６は、それぞれ、得られた発現カセットの各々の１２試料のＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の増幅、Ａｈａｓの一部及びＮｏｓ領域の一部を示す。

【0087】

実施例５：一時的発現又はＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）活性の研究
粒子衝突を介したトランスジェニック植物の取得
発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＢＲＳ１３３及びｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＪＦ７０２７を用いて形質転換されたトランスジェニック植物を得るために、最初に、プラスミドＤＮＡ抽出を前述のプロトコールに従って行った。この手法により、バイオバリティクス法、遺伝子銃法又は粒子衝突を介した形質転換手法に使用されるのに十分な多量のプラスミドＤＮＡが得られた。この手法では、植物中の遺伝材料の導入は、微粒子を用いて行われ、通常、内因性ＤＮＡで被覆された、０．４〜０．２ｍｍの直径を有する金又はタングステンでできている。粒子を対象のＤＮＡ分子で被覆し、高圧下でのヘリウムガス放電によって引き起こされる衝撃波により高速で加速し、発射する。標的細胞又は組織に衝突した場合、破壊することなしに細胞壁及び原形質膜を貫通し（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）、内因性ＤＮＡは、細胞液の作用によって微粒子から解離し、植物ゲノムに組み込まれなければならない。インビトロで培養され、再生された後、これらのトランスジェニック組織又は細胞は、遺伝子改変された植物を生じる（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ ａｎｄ Ａｒａｇａｏ（２００１），Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．３（３）：１１３−１２１；Ｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３：４１０−４１８）。

【0088】

種子除染
根こぶ線虫にともに感受性である品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆種子を用いた。計量後、種子は、７０％エタノールで１０分間、その後、１％ナトリウム（Ｖ／Ｖ）で２０分間の浸漬により除染された。層流フード中で、オートクレーブした蒸留水で種子を３回洗浄し、種子の２倍量の水に埋め込み、約１６時間〜１８時間、水和のために浸漬し続けた。

【0089】

胚の単離及び衝突用の支持プレートの調製
除湿機及び低い部屋の湿度にするエアコンを用いて、水和された種子から胚を単離した。無菌した鉗子及び外科用ブレードの助けにより、種子を切開し、胚軸を除き、乾燥を避けるため、蒸留水を含むペトリディッシュに移した。次に、実体顕微鏡の助けにより、葉原基を切り出し、頂端分裂組織領域を露呈した。層流フード中のフィルターペーパーに胚を移し、過剰な水を取り除き、それは、屈折する粒子に対する障壁として振る舞う形質転換効率を低下させることができる。衝突について、１６ｍｍ径の中心塩（デッドゾーン）は、無菌鉗子を用いて、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ）、３％スクロース及び０．８％フィタゲル（ｐＨ５．７）を含む小さなペトリディッシュ中に設計された。実体顕微鏡の助けにより、プレート中の溝に胚を配置し、頂端分裂組織領域を上に向けた。担体メンブレン支持体及び支持シリンダーを火で滅菌し、４つの破壊メンブレンセットを別々にし、使用するまでイソプロパノール中に浸漬し続けた。担体メンブレンをそれらの支持体中に集めた。

【0090】

タングステン微粒子の滅菌及び洗浄
遠沈管において、６０ｍｇのＭ１０タングステン微粒子を計量し、それは、約１００回の発射には十分な材料である。この遠沈管に、１０ｍＬの７０％エタノールを添加した；溶液を激しくホモジナイズし、撹拌機上で、動きを維持するには十分な速度で１５分間維持した。１５．０００ｇで５分の遠心分離工程を行い、微粒子沈下の阻害を避けるために、マイクロピペットの助けにより、上清を除去し、捨てた。１ｍＬの滅菌蒸留水をこのチューブに添加し、混合物を撹拌機を用いて激しくホモジナイズし、もう一度１５．０００ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、洗浄工程を２回繰り返した。最終洗浄し、上清を捨てた後、微粒子を１ｍＬの５０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）中に再懸濁した。

【0091】

タングステン微粒子のＤＮＡコーティング
１．５ｍＬの遠沈管に、５０μＬの微粒子懸濁液を分注し、ホモジナイゼーションのために１５分間ソニケーターに供し、このようにして、微粒子の凝集を避け、均一な沈殿を可能にした。最小６μｇに同等なＤＮＡを上清に添加し、マイクロピペットの助けにより、穏やかにホモジナイズした。５０μＬのＣａＣｌ₂（２．５Ｍ）を溶液に添加し、穏やかにホモジナイズした後、２０μＬのスペルミジンを添加した。さらにホモジナイゼーション後、適合したチューブ撹拌機で、溶液を１０分間、室温にて、穏やかに回転させながらインキュベートした。チューブを１０秒間、最大速度で沈降させ、上清を注意深く除去し、捨て、微粒子の再懸濁液を避けた。１５０μＬの１００％エタノールを添加した；溶液を激しくホモジナイズし、１０秒間、最大速度（スピン）でもう一度遠心分離した。上清を除去し、洗浄工程をもう一度繰り返した。上清を捨てた後、最終洗浄で、２４μＬの１００％エタノールは、激しくホモジナイズされた試料に添加された。最後に、上清の３．２μＬのアリコートは、メンブレン支持体上に予め配置された各担体メンブレンの中心領域に適用された。各沈殿は、ＤＮＡで被覆された微粒子を含む６個の担体メンブレンを調製するには十分である。微粒子の適用後、シリカゲルを含むプレート上でメンブレンを即座に保存し、解剖チャンバーに維持した。それは、５０％を超える空気の相対湿度の状態へのＤＮＡ被覆された微粒子の曝露が凝集を可能するためであり、結果として、外来遺伝子発現の頻度を減少させる。

【0092】

遺伝子銃の使用及び衝突実験
いくつかの変更を加えたが、Ａｒａｇａｏら（Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．４２：１２９８−１３０２（２００２））によって開発されたプロトコールに従って、根こぶ線虫に感受性である品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆種子胚の分裂組織部位を発射の標的とした。衝突前、層流フードを７０％エタノールで清潔にし、ＵＶ照射（１５分間）により滅菌した。保持スクリーン、胚を含むペトリディッシュ、４つセットであり、イソプロパノールに浸漬した破壊メンブレン、及び外来ＤＮＡを含む担体メンブレンをオペレーターの近くに維持した。ヘリウムガスシリンダーのバルブを開け、圧力を１．２００ｐｓｉに設定した。その後、破壊メンブレンセット（３００ｐｓｉ／メンブレン）は、高圧ヘリウムガスチャンバーの遠端に配置し、密封スクリューをきつく閉め、高圧チャンバーを反転させ、真空チャンバーにフィットさせた。衝突されるべき材料を含むプレートを配置し、支持体シリンダー上に、ＤＮＡ被覆された微粒子を含む、保持スクリーン及び担体メンブレン支持体も配置した。注意深く、支持体シリンダーを配置し、真空チャンバーを閉めた。圧力が２７ｐｏｌ／Ｈｇに到達するまで、チャンバー内で真空を可能にする値を緩やかに開け、このとき、このバルブを閉じた。高圧チャンバー内にヘリウムガスを押し込めるバルブを開き、破壊膜がヘリウムガスの存在により曲がりを示したとき、引き金を押すことによって発射した。発射後、バルブを閉じ、一方、高圧チャンバーからのヘリウムガスを放出するバルブを開いた。その後、真空を開放するバルブをゆっくり開け、衝突される胚を含むプレートを装置から取り出した。各衝突では、これらの工程を繰り返した。各衝突後、大部分の胚を異なるプレートに移し、非生物的及び生物的ストレスに供した。しかしながら、いくつかの胚は、ＢＡＰ ５ｍｇ／ｍＬ（ベンジルアミノプリン）３％スクロース、０．６％寒天（ｐＨ）を添加したＭＳ培地を含むプレートに移し、その中で、再生誘導のために、１８時間維持され、２８℃で光から保護された。

【0093】

トランスジェニック胚の選択
トランスジェニック細胞と非トランスジェニック細胞との識別は、個別に又は同じ形質転換ベクター中の対象遺伝子に連結して、酵素活性を有するタンパク質を発現する選択遺伝子を植物ゲノムに導入することにより行うことができる。作用様式に従って、マーカー遺伝子は、抗生物質への耐性を付与する遺伝子、除草剤への耐性を付与する遺伝子、及びポジティブ選択を有するマーカー遺伝子として分類される（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ ａｎｄ Ｄｕｓｉ （１９９９），Ｉｎ：ＴＯＲＲＥＳ，Ａ．Ｃ；ＣＡＬＤＡＳ，Ｌ．Ｓ．；ＢＵＳＯ，Ｊ．Ａ．Ｅｄ．Ｃｕｌｔｕｒａ ｄｅ ｔｅｃｉｄｏｓ．ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｇａｏ ｇｅｎｅｔｉｃａ ｄｅ Ｐｌａｎｔａｓ．Ｂｒａｓｉｌｉａ：Ｅｍｂｒａｐａ−ＳＰＩ／Ｅｍｂｒａｐａ−ＣＮＰＨ，１９９９．ｐ．６７９−７３５．ｖ．２）。遺伝子ａｈａｓは、除草剤への耐性を付与する遺伝子に分類される。この遺伝子は、アセトヒドロキシル酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素の改変形態をコードし、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）としても知られている。この配列の６５３位への変異により、アスパラギンによるセリンの置換をもたらし、改変酵素を生じさせ、除草剤クラスのイミダゾリノンによって認識されない。この遺伝子で形質転換された分裂組織細胞は、選択分子の分裂組織部位への全体の転移及び内因性ＡＨＡＳ酵素の不活性化の基づくプロセスにおいて、除草剤Ｉｍａｚａｐｙｒの存在下で選択される。選択剤は頂端分裂組織に局在するため、非トランスジェニック細胞は死滅し、植物に生育するトランスジェニック細胞の生存が支持される（Ａｒａｇａｏ ａｎｄ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ（２００２），Ｊ．Ｐ．Ｐｈｙｓｉｏ，１４（Ｉ））。このようにして、再生後、いくつかの胚は、選択培地ＭＳ、３＆スクロース、０．１５μＭのＩｍａｚａｐｙｒ除草剤、０．８％寒天及びＢ５ビタミン（ｐＨ５．７）を含むプラスチックカップに移され、約４５日間、成長チャンバーで、２８℃にて、１６時間の光周期で生育された。光強度は５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１であり、相対湿度は８０％を超えた。次に、再生された植物は、オートクレーブされた砂：バーミキュライト（１：１）を含むプラスチックカップに移され、栄養溶液（ｐＨ６．６）で加筆された。後に、順化のために、カップをプラスチックバックで覆い、必要に応じて栄養溶液で散水し、さらに２８〜３０日間、成長チャンバーで生育した。順化のこの器官の経過後、プラスチックバッグを取り除き、特異的プライマーを用いたＰＣＲ技術を介して、分子分析及び陽性植物の特定のために試料回収が可能な限り、通常に発育させることができた。

【0094】

種々のストレスに供されたトランスジェニック胚を用いた実験
根こぶ線虫に感受性であり、種々の発現カセット（親感受性株ＢＲＳ１３３（Ｓ−ｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＢＲＳ１３３）及び耐性集団ＪＦ７０２７由来の個体（Ｒ−ｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＪＦ７０２７）から増幅されたＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域を含む）で形質転換された大豆品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の胚は、生物的ストレス、この場合は、Ｍ．ジャワニカのジャワニカＪ２による接種、及び非生物的ストレス、例えば、熱、冷却、塩分及び脱水（干ばつ）に供された。非トランスジェニック胚（ＣＮ−負の対象）及びｐＡＧ１プラスミドのみで形質転換した胚（ＣＰ−正の対象）を同じ処置に供した。熱ストレスを適用し、胚を２５℃（室温）、３５℃及び４５℃（温室中）にて維持した。４℃（冷蔵庫）及び１５℃（温室）の処理は冷却ストレスに用いた。これらのストレスは、２時間、４時間、及び２４時間の時点で溶液中で胚に適用された。脱水（干ばつ）は、温室にて３７℃にて行い、フィルターペーパー上で２時間、４時間、及び６時間の時点で維持した。塩分ストレスについては、胚は、２００ｍＭ及び４００ｍＭのＮａＣｌ濃度で２４時間維持された。生物的ストレスは、２４時間、４８時間、及び７２時間、Ｊ２発生段階（２．０００〜３．０００のＪ２／ｍＬ）で線虫を含む溶液で胚を維持することによって行われた。図１７は、ストレスをどのように適用したかを示す。

【0095】

種々の発現カセットを用いて形質転換され、種々のストレスに供された胚における組織化学的アッセイ
Ｇｕｓ遺伝子の発現産物は、組織化学的アッセイを通じて、植物組織におけるその酵素的活性を検出することによって、選択のマーカーレポーターとして使用され得る。この定量的方法は、ｂ−グルクロニダーゼ酵素によって、酸素の存在下で不溶性の青色沈澱物をもたらす二量体を生じさせる、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）基質の開裂に基づいている。この方法論は、組織特異性、プロモーターの単離、トランスジェニック植物の同定、及び移動条件に関する遺伝子発現制御研究を補助する（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ（１９９８），Ｉｎ：Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ，Ａ．Ｃ．Ｍ．；Ｃａｒｎｅｉｒｏ，Ｖ．Ｔ．Ｃ．（ｅｄ．）．Ｍａｎｕａｌ ｄｅ ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｃａｏ ｇｅｎｅｔｉｃａ ｄｅ ｐｌａｎｔａｓ．Ｂｒａｓｉｌｉａ：Ｅｍｂｒａｐａ − ＳＰＩ／Ｅｍｂｒａｐａ−Ｃｅｎａｒｇｅｎ，１９９８，ｐ．１４３−１５４；Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ，１０１：１−６））。このようにして、種々のカセットで形質転換され、その後に種々のストレスに供された、２つの遺伝子型であるＢＲＳ１３３とＰｉｎｔａｄｏの胚をプレートに移し、試料を覆うには十分な体積でＸ−Ｇｌｕｃ反応緩衝液を添加した。この緩衝液は、８５ｍＬのジメチルホルムアミド中に８．５ｍｇのＸ−Ｇｌｕｃを希釈することによって調製された。リン酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４−５０ｍＭ ｐＨ７．０）は、１７ｍＬ、最後は１７ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の体積に添加された。この溶液を調製後、冷蔵庫で保存した。胚及び緩衝液を含むプレートを密封し、暗所中、温室にて３７℃で約１６時間インキュベートした。その後、緩衝液を取り除き、１ｍＬの７０％エタノールを添加して、反応を停止させた。試料を実体顕微鏡（ＳＱＺ−ＤＳ４−ＢＩ（Ｔｅｃｎｉｖａｌ））下で分析し、画像を獲得して結果を書面にした。組織化学的アッセイは、ストレスに供した後、試薬Ｘ−Ｇｌｕｃが実施さえると、品種ＢＲＳ１３３はより強い応答を示すことが示され、これは、青色スポットが明確であり、形質転換された細胞を示す制限された領域において視認されるためである。この不溶性の青色沈澱物は、β−グルクロニダーゼをコードする構築カセットに存在するＧｕｓ遺伝子反応産物であり、この酵素は、Ｏ２の存在下で沈殿する二量体を形成するＸ−Ｇｌｕｃ基質と反応する。品種Ｐｉｎｔａｄｏからの胚アッセイ結果を分析する場合、ストレスの大部分において、正の青色スポットは検出されなかった。この品種では、内因性ＧＵＳ発現がより高く、完全な青色胚をもたらし、その結果が分析と干渉する。大豆胚のバックグランド内因性ＧＵＳ活性は以前の研究において報告されていた。Ｈｕ及び共同研究者（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：１−５，１９９０）は、５３の種々の植物種を分析し、葉、果実部分、種子及び胚における固有のＧＵＳ活性を試験した。この研究では、大豆は、新鮮な果実由来の成熟胚と脱水された種子の成熟胚において、強力な正の染色を示し、内因性ＧＵＳ活性の結果を示した。このようにして、熱ストレスは、温室中で２時間、４時間、及び２４時間、２５℃、３５℃、及び４５℃の温度にトランスジェニック胚を供することによって適用された。図１８、１９及び２０は、それぞれ、試験された両品種に対するこれらの処置を示す。冷却ストレスは、冷蔵庫及び温室中で、２時間、４時間、及び２４時間、４℃及び１５℃の温度にトランスジェニック胚を供することによって適用された（図２１及び２２）。このストレスについて、組織化学的反応の陽性青色スポットに関する、品種間の相違は、Ｐｉｎｔａｄｏ胚においてより非常に顕著であり、それらは構造的に青色であり、内因性ＧＵＳ活性に起因している。従前の文献（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：１−５）に記載されている。もう一度、品種ＢＲＳ１３３由来の胚は、組織化学的アッセイに対してより良好な応答を示し、それは、この品種が選択されるものであり、この研究の次の工程で使用されなければならないことを示す。塩分ストレス実験は、対照としての水、２００ｍＭ、４００ｍＭの濃度のＮａＣｌ濃度に２４時間、トランスジェニック胚を維持することによって行われた。品種ＢＲＳ１３３由来の胚は、このアッセイに正に応答し続け、制限された領域で青色スポットを示し、以前のストレスとは相違し、品種Ｐｉｎｔａｄｏは明らかでありかつ検出可能な応答を示さなかった。図２３はそれらの結果を示す。干ばつストレスは、フィルターペーパー上に３７℃で胚を配置し、温室中で２時間、４時間、及び６時間維持することによって適用された。もう一度、品種ＢＲＳ１３３は、組織化学的アッセイに陽性応答を示し、一方、品種Ｐｉｎｔａｄｏは、再度、陰性応答を示した。後者は、図２４に示される通り、内因性ＧＵＳ発現の結果として、胚の非特異的な青色染色を示した。根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカの感染段階であるジャワニカＪ２を用いて、品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の胚への感染は生物的ストレスを構築した。約２０００〜３０００のＪ２／ ｍＬをトランスジェニック試料とともにインキュベートし、２４時間、４８時間及び７２時間維持した。結果は、品種ＢＲＳ１３３（図２５）は、組織化学的アッセイの陽性の青色スポットを示したことを表し、これは、カセット発現が満足いくように起きたことを示す。この時間を経過したとき、胚は、それらの局面が改変され、赤茶色を示し、対照試料を含むことを示している。この変化は、７２時間後により視認され、感染時に、ホルモン及び物質を注射する染色の感染形態によって胚を攻撃することによって引き起こすことができ、それは、宿主植物の根において起こるのと同じように、細胞改変を可能にする。しかしながら、Ｒと命名された胚は、耐性カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換されたものであり、影響が少ないという局面を有し、７２時間で接種された試料は、元の局面を維持し、白色であり、これは、どうも、より高い数のＡＴ（ｎ）繰り返しで、耐性集団ＪＦ７０２７からの個体由来のＧｍｈｓｐ１７．β−Ｌ遺伝子のプロモーター領域を含むカセットが、おそらく、より高い発現レベルのシャペロンにより、病原体攻撃に対するより良好な応答を示すことを示唆している。Ｐｉｎｔａｄｏ由来の胚はまた、Ｊ２線虫の接種により生物的ストレスに供された場合、構成的に青色に染色される組織化学的アッセイに対して負の応答に加えて、色の変化の応答を示し、４８時間から、特に７２時間からより顕著であった。図２６は結果を示す。

【0096】

生物的ストレス及び非生物的ストレスに供された後、組織化学的アッセイはマーカー遺伝子Ｇｕｓの存在を検出した、品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏに対する示された結果から結論付けることがえきるが、しかし、高い内因性活性も、特に品種Ｐｉｎｔａｄｏにおいて観察され、異なる材料が形質転換プロセスへの明確な応答を示したことを示唆している。

【0097】

Ｇｕｓ発現はまさに形質転換の証拠として考えられると言及するには価値があるが、植物ゲノムへのＧｕｓ遺伝子の組込みの決定的証拠としては不十分である（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９９０），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ７９：１２９−１３４）。内因性ＤＮＡ配列の組込みの決定的証拠は、分子生物学的技術を介して、特異的プローブを用いてゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションによって与えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]