特許 6948145 蛍光画像分析装置、蛍光画像の画像処理方法及びコンピュータプログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6948145

(24)【登録日】2021年9月22日

(45)【発行日】2021年10月13日

(54)【発明の名称】蛍光画像分析装置、蛍光画像の画像処理方法及びコンピュータプログラム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20210930BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20210930BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20210930BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20210930BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20210930BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/34 B

   C12Q1/06

   G01N21/64 F

   G01N33/48 M

   G01N33/48 P

   C12M1/00 A

【請求項の数】19

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2017-80851(P2017-80851)

(22)【出願日】2017年4月14日

(65)【公開番号】特開2018-174827(P2018-174827A)

(43)【公開日】2018年11月15日

【審査請求日】2020年2月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】松本 翔平

(72)【発明者】

【氏名】シャラマ シュルティ

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／００７２１９５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１６−５０７２２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１４６７３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２０５１７３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０３１７３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／０９３１３０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１０／１５０４６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０１９２９９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１０−５００５７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２００９−００７４１５５（ＫＲ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０３６７３５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００８−５１８５８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２００８−００６３２８０（ＫＲ，Ａ）

【文献】 BMC Blood Disorders (2009), Vol.9, No.4, pp.1-6

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ

Ｃ１２Ｑ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料に光を照射する光源と、
前記光が照射されることにより蛍光を発する前記細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像された前記蛍光画像を画像処理する処理部と、
前記処理部により画像処理された前記蛍光画像を表示する表示部と、を備え、
前記処理部は、
前記標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、
画素値が変更された前記蛍光画像を前記表示部に表示する表示処理と、を実行するように構成され、
前記処理部は、前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更するように構成されている、
蛍光画像分析装置。

【請求項2】

標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料に光を照射する光源と、
前記光が照射されることにより蛍光を発する前記細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像された前記蛍光画像を画像処理する処理部と、
前記処理部により画像処理された前記蛍光画像を表示する表示部と、を備え、
前記処理部は、
前記標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、
画素値が変更された前記蛍光画像を前記表示部に表示する表示処理と、を実行するように構成され、
前記処理部は、前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の大きい画素ほど減少率を大きくして画素値を減少させるように、輝点の画素値を変更するように構成されている、
蛍光画像分析装置。

【請求項3】

標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料に光を照射する光源と、
前記光が照射されることにより蛍光を発する前記細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像された前記蛍光画像を画像処理する処理部と、
前記処理部により画像処理された前記蛍光画像を表示する表示部と、を備え、
前記処理部は、
前記標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、
画素値が変更された前記蛍光画像を前記表示部に表示する表示処理と、を実行するように構成され、
前記処理部は、前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素ごとの画素値の大小関係を維持したまま画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更するように構成されている、
蛍光画像分析装置。

【請求項4】

前記撮像部は、第１蛍光標識で標識された標的部位を含む第１蛍光画像と、第２蛍光標識で標識された標的部位を含む第２蛍光画像とを撮像し、
前記処理部は、
前記抽出処理において、前記第１蛍光画像における複数の輝点及び第２蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出し、
前記変更処理において、前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像のそれぞれから抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更し、
画素値が変更された前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像を合成する画像合成処理をさらに実行するように構成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項5】

前記第１蛍光画像の標的部位がＢＣＲ遺伝子座であり、前記第２蛍光画像の標的部位がＡＢＬ遺伝子座である、請求項４に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項6】

前記処理部は、
前記第１蛍光画像及び前記第２蛍光画像の一方の蛍光画像から抽出した輝点の画素値に基づいて、他方の蛍光画像から抽出した輝点の画素値を調整し、前記第１蛍光画像の輝点の画素値と前記第２蛍光画像の輝点の画素値とを同レベルに補正する調整処理をさらに実行するように構成されている、請求項４または５に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項7】

前記処理部は、
前記変更処理において、画素ごとの画素値の大小関係を維持したまま各輝点の画素値を変更するように構成されている、請求項１又は請求項２に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項8】

前記処理部は、
抽出した前記複数の輝点の画素値を前記輝点外の領域の画素値よりも相対的に増加させる強調処理をさらに実行するように構成されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項9】

前記処理部は、
前記強調処理において、前記輝点外の領域の画素値を減少させるように構成されている、請求項８に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項10】

前記撮像部は、核を含む蛍光画像を撮像し、
前記処理部は、
前記抽出処理において、前記核を含む前記蛍光画像における核領域を、細胞ごとにさらに抽出するように構成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項11】

前記処理部は、前記核を含む蛍光画像と前記標的部位を含む蛍光画像とを合成する画像合成処理をさらに実行するように構成されている、請求項１０に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項12】

試料が流れるフローセルをさらに備え、
前記光源は、前記フローセルを流れる試料に光を照射するように構成されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項13】

入力部をさらに備え、
前記処理部は、前記撮像部により撮像された前記蛍光画像について、画像処理後の蛍光画像及び画像処理前の蛍光画像のうち、前記入力部により選択された蛍光画像を前記表示部に表示するように構成されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の蛍光画像分析装置。

【請求項14】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像を処理する蛍光画像の画像処理方法において、
標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する工程と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する工程と、を含み、
前記画素値を変更する工程は、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更する、
画像処理方法。

【請求項15】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像を処理する蛍光画像の画像処理方法において、
標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する工程と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する工程と、を含み、
前記画素値を変更する工程は、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の大きい画素ほど減少率を大きくして画素値を減少させるように、輝点の画素値を変更する、
画像処理方法。

【請求項16】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像を処理する蛍光画像の画像処理方法において、
標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する工程と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する工程と、を含み、
前記画素値を変更する工程は、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素ごとの画素値の大小関係を維持したまま画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更する、
画像処理方法。

【請求項17】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像の画像処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
前記画像処理は、 標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、を含み、
前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更する、
コンピュータプログラム。

【請求項18】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像の画像処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
前記画像処理は、 標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、を含み、
前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素値の大きい画素ほど減少率を大きくして画素値を減少させるように、輝点の画素値を変更する、コンピュータプログラム。

【請求項19】

細胞内の標的部位を蛍光色素により標識するための前処理が施された複数の細胞を含む試料を測定して取得される細胞の蛍光画像の画像処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムであって、
前記画像処理は、 標的部位を含む前記蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、
抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、を含み、
前記変更処理において、前記蛍光画像から抽出した画素値が異なる複数の輝点について、画素ごとの画素値の大小関係を維持したまま画素値を増加させるように、輝点の画素値を変更する、
コンピュータプログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、蛍光画像分析装置、蛍光画像の画像処理方法及びコンピュータプログラムに関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１には、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）の検出にフローサイトメータ等を適用する際の細胞の処理方法が記載されている。ＦＩＳＨ法は、はじめに、細胞の核内に存在する標的部位の塩基配列に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせる前処理を施し標的部位を蛍光標識する。続いて、蛍光標識プローブから生じた蛍光シグナル（輝点）を検出する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２００５−５１５４０８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ＦＩＳＨの蛍光画像は、蛍光顕微鏡及びイメージングフローサイトメータ等で撮像される。しかし、前処理のばらつきによって、同じ蛍光標識プローブを用いた場合であっても、１枚の蛍光画像の中で輝点毎に明るさが異なる場合がある。また、フローサイトメータでは、フローセル内で細胞が立体的形状をとるため、輝点が核の表面に存在しているか、核の中心付近に存在しているか等の光が照射された時の輝点の位置（深さ）によって、撮像された１枚の蛍光画像内において複数の輝点のそれぞれの明るさが異なる場合がある。このように、フローサイトメータで細胞の蛍光画像を撮像すると１枚の蛍光画像において、輝点の明るさがばらつくことがあるため、オペレータがフローサイトメータで撮像されたＦＩＳＨの蛍光画像において輝点の有無の確認する際に、暗い輝点を検出できない場合がある。

【0005】

さらに、マルチカラーＦＩＳＨ法では緑色の蛍光色素を標識したプローブと赤色の蛍光色素を標識したプローブを使用して、２つのプローブが隣接して結合し黄色の蛍光を発する融合輝点の有無を検出する。具体的には、緑色の蛍光色素を撮像した蛍光画像と、赤色の蛍光色素を撮像した蛍光画像とを重ね合わせて融合輝点を検出する。しかし、上述のように、フローサイトメータで撮像した１枚の蛍光画像内では、複数の輝点の明るさにばらつきが生じることがある。このため、フローサイトメータを使用して撮像したマルチカラーＦＩＳＨの蛍光画像において融合輝点を確認する際に、例えばある赤色の輝点が暗く、そこに隣接する緑色の輝点が明るい場合、２枚の蛍光画像を重ね合わせた際に、赤色の輝点が緑色の輝点に隠れてしまい、オペレータが融合輝点であると判別できないといった問題がある。

【0006】

本発明は、１枚の蛍光画像に明るい輝点及び暗い輝点が存在する場合においても両輝点の画素値を同レベルに補正することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の第１の態様は、蛍光画像分析装置に関する。本態様に係る蛍光画像分析装置（１）は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）に光を照射する光源（１２０〜１２３）と、光が照射されることにより蛍光を発する細胞の蛍光画像を細胞ごとに撮像する撮像部（１６０）と、撮像部（１６０）により撮像された蛍光画像を画像処理する処理部（１１）と、処理部（１１）により画像処理された蛍光画像を表示する表示部（１３）と、を備え、処理部（１１）は、標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、抽出した前記複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、画素値が変更された前記蛍光画像を前記表示部に表示する表示処理と、を実行する。

【0008】

本発明の第２の態様は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）を測定して取得される細胞の蛍光画像を画像処理する蛍光画像の画像処理方法に関する。本態様に係る画像処理方法は、標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出工程と、抽出した複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更工程と、を含む。

【0009】

本発明の第３の態様は、標的部位を蛍光色素により標識した複数の細胞を含む試料（１０）を測定して取得される細胞の蛍光画像の画像処理を、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムに関する。本態様に係るコンピュータプログラムは、画像処理が、標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を、細胞ごとに抽出する抽出処理と、抽出した複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する変更処理と、を含む。

【0010】

本発明の上記第１〜第３の態様によれば、輝点を抽出した細胞の蛍光画像において、高画素値の明るい輝点、低画素値の暗い輝点が混在していても、変更処理（変更工程）により、暗い輝点は、明るい輝点との画素値の差が小さくなるよう画素値が増強される。そのため、１枚ごとの蛍光画像の画像観察において、オペレータ等が暗い輝点を目視で認識しやすくなる。加えて、変更処理（変更工程）により、蛍光画像ごとに暗い輝点が明るい輝点との画素値の差が小さくなるよう増強されることで、複数の蛍光画像を合成した合成画像の解析において、各蛍光画像の輝点が重なった融合輝点は複数の輝点がそれぞれ画素値の差が小さくなった状態で重ね合わされる。そのため、融合輝点であるかの判別が容易となるので、オペレータ等が目視で融合輝点を検出しやすくなる。よって、本発明によれば、１枚の蛍光画像に、高画素値の明るい輝点、低画素値の暗い輝点が混在していても、各蛍光画像の画像観察における輝点の確認や、複数の蛍光画像の合成画像の解析における融合輝点の検出を容易に行うことができる。

【発明の効果】

【0011】

本発明によると、１枚の蛍光画像に明るい輝点及び暗い輝点が存在する場合においても、両輝点の画素値を同レベルに補正することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】蛍光画像分析装置の一実施形態の構成を示す概略図である。

【図2】（ａ）は、蛍光画像分析装置により取得される第１画像〜第３画像及び明視野画像を例示する図であり、（ｂ）は、蛍光画像分析装置が行う核領域の抽出を説明するための模式図であり、（ｃ）及び（ｄ）は、蛍光画像分析装置が行う輝点の抽出を説明するための模式図である。

【図3】処理部の動作を説明するフローチャートである。

【図4】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、陰性パターン、陽性パターン１〜３の輝点の情報を説明するための模式図である。

【図5】（ａ）は、第１輝点の抽出処理後の第１画像の模式図であり、（ｂ）は、第１輝点の強調処理後の第１画像の模式図であり、（ｃ）は、第１輝点の画素値の変更処理後の第１画像の模式図である。

【図6】（ａ）は、第２輝点の抽出処理後の第２画像の模式図であり、（ｂ）は、第２輝点の強調処理後の第２画像の模式図であり、（ｃ）は、第２輝点の画素値の変更処理後の第２画像の模式図である。

【図7】（ａ）は、第１輝点の強調処理後の第１画像及び第２輝点の強調処理後の第２画像の合成画像の模式図であり、（ｃ）は、第１輝点の画素値の変更処理後の第１画像及び第２輝点の画素値の変更処理後の第２画像の合成画像の模式図である。

【図8】（ａ）は、図７（ｂ）の第１画像及び第２画像の合成画像に第３画像を合成した合成画像の模式図であり、（ｂ）は、図７（ｃ）の第１画像及び第２画像の合成画像に第３画像を合成した合成画像の模式図である。

【図9】画素値の変更処理における関数式の例を説明する図である。

【図10】測定装置の他の例の構成を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。以下の実施形態は、細胞の核内に存在する標的部位（標的配列）と、前記標的配列と相補的な配列を有する核酸配列を含み蛍光色素により標識された核酸プローブ（以下、単にプローブという）とをハイブリダイズさせる前処理が施された試料を測定し、試料中の複数の細胞について細胞ごとに取得された蛍光画像の分析を行う装置に、本発明を適用したものである。

【0014】

本実施態様の一例は、Fluorescence In Situ Hybridization (ＦＩＳＨ)法による染色体異常の分析を、例えばフローサイトメータ（例えば、イメージングフローサイトメータ）、蛍光顕微鏡等において行う。以下の実施形態では、一例として、核酸中の標的部位を２２番染色体にあるＢＣＲ遺伝子および９番染色体にあるＡＢＬ遺伝子とし、フローサイトメータを使用して、ＦＩＳＨ法によって、慢性骨髄性白血病に見られる９番染色体と２２番染色体との間における転座（ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、フィラデルフィア染色体とも呼ばれる：ｔ（９；２２）（ｑ３４．１２；ｑ１１．２３））を有する細胞を測定及び分析する態様を示す。蛍光画像分析装置において検出される染色体異常は、（ＦＩＳＨ）法によって検出できる限り制限されない。染色体異常としては、転座、欠失、逆位、重複等を挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＡＬＫ遺伝子等の遺伝子座に関連する染色体異常を挙げることができる。

【0015】

また、以下の実施形態では、測定対象となる細胞は、有核細胞である限り制限されない。例えば被験者から採取された検体中の有核細胞を挙げることができ、好ましくは血液検体中の有核細胞である。本明細書等において試料は、プローブとハイブリダイズした標的部位を含む検体由来の細胞を含む、測定に供される細胞浮遊液である。試料には複数の細胞が含まれる。複数の細胞とは、少なくとも１０^２個以上、好ましくは１０^３個以上、より好ましくは１０^４個以上、さらに好ましくは１０^５個以上、さらにより好ましくは１０^６個以上である。

【0016】

本態様において、異常細胞とは染色体異常を有する細胞を意味する。異常細胞の例としては、がん細胞等の腫瘍細胞を挙げることができる。好ましくは、白血病等の造血器腫瘍細胞、肺癌等のがん細胞である。

【0017】

図１は、本実施形態の蛍光画像分析装置１の概略構成を示す。図１に示す蛍光画像分析装置１は、測定装置１００と、蛍光画像を画像処理するための画像処理装置２００とを備えており、前処理装置３００による前処理により調製された試料１０を測定し、分析を行う。

【0018】

オペレータは、被検者から採取した血液検体に対してフィコール等の細胞分離用媒体を用いて遠心分離等を行って、測定対象細胞である有核細胞を回収する。有核細胞の回収にあたっては、遠心分離による有核細胞の回収に代えて溶血剤を用いて赤血球等を溶血させることにより有核細胞を残してもよい。前処理装置３００は、遠心分離等により得られた有核細胞浮遊液と試薬とを混合させるための混合容器、有核細胞浮遊液と試薬を混合容器に分注するための分注ユニット、混合容器を加温するための加温部等を含む。前処理装置３００は、被検者から採取した細胞内の標的部位を蛍光色素により標識する工程と、細胞の核を核染色用色素により染色する工程と、を含む前処理を行って試料１０を調製する。具体的には、標的部位を蛍光色素により標識する工程では、前記標的配列と、前記標的配列と相補的な配列を有する核酸配列を含み蛍光色素により標識されたプローブとをハイブリダイズされる。

【0019】

ＦＩＳＨ法は、１以上の蛍光色素を使用して染色体上の標的部位を検出する。好ましくはＦＩＳＨ法は、２以上の蛍光色素を使用して第１の染色体上の標的部位と第２の染色体上の標的部位を検出する（「染色体」を修飾する「第１」及び「第２」は染色体番号を意味しない、包括的な数の概念である）。例えば、ＢＣＲ遺伝子座とハイブリダイズするプローブは、ＢＣＲ遺伝子座の塩基配列に相補的な配列を有する核酸が、波長λ１１の光が照射されることにより波長λ２１の第１蛍光を生じる第１蛍光色素によって標識されたものである。このプローブを使うことで、ＢＣＲ遺伝子座が、第１蛍光色素によって標識される。ＡＢＬ遺伝子座とハイブリダイズするプローブは、ＡＢＬ遺伝子座の塩基配列に相補的な配列を有する核酸が、波長λ１２の光が照射されることにより波長λ２２の第２蛍光を生じる第２蛍光色素によって標識されたものである。このプローブを使うことで、ＡＢＬ遺伝子座が、第２蛍光色素によって標識される。核は、波長λ１３の光が照射されることにより波長λ２３の第３蛍光を生じる核染色用色素によって染色される。波長λ１１、波長λ１２及び波長λ１３はいわゆる励起光である。

【0020】

より具体的には、前処理装置３００は、脱水により細胞が収縮しないよう細胞を固定する処理、プローブを細胞内に導入できる大きさの穴を細胞に開ける膜透過処理、細胞に熱を加える熱変性処理、標的部位とプローブとをハイブリダイゼーションさせる処理、細胞から不要なプローブを除去する洗浄処理、および、核を染色する処理を含んでいる。

【0021】

測定装置１００は、フローセル１１０と、光源１２０〜１２３と、集光レンズ１３０〜１３３と、ダイクロイックミラー１４０〜１４１と、集光レンズ１５０と、光学ユニット１５１と、集光レンズ１５２と、撮像部１６０と、を備えている。フローセル１１０の流路１１１には、試料１０が流される。

【0022】

光源１２０〜１２３は、フローセル１１０を流れる試料１０に光を照射する。光源１２０〜１２３は、例えば半導体レーザー光源により構成される。光源１２０〜１２３からは、それぞれ波長λ１１〜λ１４の光が出射される。

【0023】

集光レンズ１３０〜１３３は、光源１２０〜１２３から出射された波長λ１１〜λ１４の光をそれぞれ集光する。ダイクロイックミラー１４０は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を屈折させる。ダイクロイックミラー１４１は、波長λ１１及びλ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を屈折させる。こうして、波長λ１１〜λ１４の光が、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０に照射される。なお、測定装置１００が備える半導体レーザー光源の数は１以上であれば制限されない。半導体レーザー光源の数は、例えば、１、２、３、４、５又は６の中から選択することができる。

【0024】

フローセル１１０を流れる試料１０に波長λ１１〜λ１３の光が照射されると、細胞を染色している蛍光色素から蛍光が生じる。具体的には、波長λ１１の光がＢＣＲ遺伝子座を標識する第１蛍光色素に照射されると、第１蛍光色素から波長λ２１の第１蛍光が生じる。波長λ１２の光がＡＢＬ遺伝子座を標識する第２蛍光色素に照射されると、第２蛍光色素から波長λ２２の第２蛍光が生じる。波長λ１３の光が核を染色する核染色用色素に照射されると、核染色用色素から波長λ２３の第３蛍光が生じる。フローセル１１０を流れる試料１０に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の透過光は、明視野画像の生成に用いられる。例えば、実施形態では、第１蛍光は緑色の光の波長帯域であり、第２蛍光は赤色の光の波長帯域であり、第３蛍光は青色の光の波長帯域である。

【0025】

集光レンズ１５０は、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０から生じた第１蛍光〜第３蛍光と、フローセル１１０の流路１１１を流れる試料１０を透過した透過光とを集光する。光学ユニット１５１は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット１５１の４枚のダイクロイックミラーは、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部１６０の受光面上において分離させる。集光レンズ１５２は、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを集光する。

【0026】

撮像部１６０は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部１６０は、第１蛍光〜第３蛍光と透過光とを撮像して第１蛍光〜第３蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、透過光に対応した明視野画像とを、撮像信号として画像処理装置２００に出力する。第１蛍光〜第３蛍光に対応する蛍光画像を、以下、それぞれ「第１画像」、「第２画像」、「第３画像」と称する。「第１画像」、「第２画像」及び「第３画像」は、輝点の重なりを分析するため同じ大きさであることが好ましい。「第１画像」、「第２画像」及び「第３画像」は、カラー画像であってもよいし、グレースケール画像であってもよい。

【0027】

図２（ａ）は、蛍光画像の例である。図２（ａ）の第１画像において黒く点状に見える部分は、第１蛍光の輝点、すなわち第１蛍光色素で標識された標的部位を示す。第２画像において第１画像ほどではないが核を示す淡い灰色の中に濃い灰色の点が認められる。これは、第２蛍光の輝点、すなわち第２蛍光色素で標識された標的部位を示す。第３画像では、略円形の核の領域が黒く表されている。明視野画像では、実際の細胞の状態を観察できる。なお、図２（ａ）の各画像は、前処理後の白血球をスライドガラス上に配置して顕微鏡で観察したものを例として示す画像であり、蛍光画像は生データ（ローデータ）では、蛍光強度が高いほど白く、蛍光強度が低いほど黒く撮像される。図２（ａ）の第１〜第３画像は、撮像された生データの階調を反転させグレースケールで表したものである。上記のようにフローセル１１０を流れる試料１０を撮像部１６０により撮像した場合は、細胞が互いに分離した状態で流路１１１を流れるため、蛍光画像および明視野画像は、細胞ごとに取得されることになる。

【0028】

図１に戻って、画像処理装置２００は、ハードウェア構成として、処理部１１と、記憶部１２と、表示部１３と、入力部１４と、を備える。処理部１１は、プロセッサ（ＣＰＵ）により構成される。記憶部１２は、処理部１１の各種処理の作業領域に使用する読み出し及び書き込み可能メモリ（ＲＡＭ）、コンピュータプログラム及びデータを記憶する読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）及びハードディスク等により構成される。処理部１１及び記憶部１２は、汎用コンピュータで構成することができる。ハードディスクは、コンピュータ内に含まれていてもよいし、コンピュータの外部装置として置かれてもよい。表示部１３は、ディスプレイにより構成される。入力部１４は、マウス、キーボード、タッチパネル装置等により構成される。処理部１１は、バス１５を介して記憶部１２との間でデータを伝送し、インターフェース１６を介して表示部１３、入力部１４、測定装置１００との間でデータの入出力を行う。

【0029】

処理部１１は、ＲＯＭやハードディスクに記憶されている各種コンピュータプログラムをＲＡＭに読み出して実行することにより、測定装置１００による試料１０の測定により取得された細胞の蛍光画像の処理を行い、表示部１３、入力部１４などの動作を制御する。具体的に、処理部１１は、標的部位を含む蛍光画像における複数の輝点を細胞ごとに抽出し、抽出した複数の輝点について、各輝点の画素値に応じてそれぞれの輝点の画素値を変更する。

【0030】

なお、本明細書における「画素値」とは、画像の各画素に割り当てられたディジタル値を指し、特に、カメラからの出力画像（いわゆる生画像）においては、撮像対象物体の輝度がディジタル信号に変換された値を指す。

【0031】

以下、試料１０の撮像により取得された細胞の蛍光画像を画像処理するための処理手順を規定したコンピュータプログラムに基づき、処理部１１により実行される蛍光画像の画像処理方法の一例について、図３を参照して説明する。なお、当該コンピュータプログラムは、予め記憶部１２に格納されているが、例えばＣＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な可搬型記録媒体（図示せず）からインストールしてもよいし、例えば外部のサーバ（図示せず）からネットワーク（図示せず）を介してダウンロードしてインストールしてもよい。

【0032】

図３に示すように、処理部１１は、画像取得ステップＳ１、輝点及び核領域の抽出ステップＳ２、輝点の強調ステップＳ３、画素値の調整ステップＳ４、画素値の変更ステップＳ５、画像合成ステップＳ６、画像表示ステップＳ７で各処理を行う。

【0033】

まず、処理部１１はＳ１において、撮像部１６０により撮像された生データを階調反転、グレースケール表示された第１〜第３画像を取得する。処理部１１は、取得した第１〜第３画像を記憶部１２に記憶させる。

【0034】

次に、処理部１１はＳ２において、第１画像における第１蛍光の輝点（第１輝点）、第２画像における第２蛍光の輝点（第２輝点）、及び、第３画像における核領域を抽出する。

【0035】

具体的に、図２（ｂ）〜（ｄ）を用いて説明すると、図２（ｂ）の左端に示す第３画像、図２（ｃ）の左端に示す第１画像、及び、図２（ｄ）の左端に示す第２画像は、フローセル１１０を流れる１つの細胞から取得されたものである。

【0036】

図２（ｂ）の左端に示すような第３画像が取得された場合、処理部１１は、はじめに第３画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｂ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。縦軸の画素数は、画素の個数を示している。なお、画像の画素数は、特に限定されるものではないが、例えば横５１個×縦５１個である。また、１画素あたりの空間分解能も特に限定されるものではない。そして、処理部１１は、図２（ｂ）のグラフにおいて画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｂ）の右端において破線で示すように、核領域として抽出する。

【0037】

次に、図２（ｃ）の左端に示すような第１画像が取得された場合、処理部１１は、第１画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｃ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。そして、処理部１１は、図２（ｃ）のグラフにおいて、例えば大津法に基づいて輝点とバックグランドとの境界として画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｃ）の右端において破線で示すように、第１輝点として抽出する。なお、第１画像から第１輝点を抽出する場合に、極端に小さい輝点、極端に大きい輝点を除外する。輝点の大きさは、第１画像における輝点の面積（輝点に含まれる画素の数）で表すことができる。また、核領域の位置と、第１画像から抽出した輝点の位置とを比較し、核領域に含まれない輝点を除外する。これにより、第１画像から第１輝点が抽出され、第１輝点の数、位置が導出される。

【0038】

次に、図２（ｄ）の左端に示すような第２画像が取得された場合、第１画像の場合と同様、処理部１１は、第２画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の各画素における画素値に基づいて、図２（ｄ）の中央に示すように画素値及び画素数のグラフを作成する。そして、処理部１１は、図２（ｃ）のグラフにおいて、画素値の閾値を設定し、閾値よりも大きい画素値を有する画素が分布する範囲を、図２（ｄ）の右端において破線で示すように、第２輝点として抽出する。なお、第２画像から第２輝点を抽出する場合に、極端に小さい輝点、極端に大きい輝点を除外する。輝点の大きさは、第２画像における輝点の面積（輝点に含まれる画素の数）で表すことができる。また、核領域の位置と、第２画像から抽出した輝点の位置とを比較し、核領域に含まれない輝点を除外する。これにより、第２画像から第２輝点が抽出され、第２輝点の数、位置が導出される。

【0039】

各画像における核領域及び各輝点の位置は、例えば各画像を構成する横（ｘ方向）ｍ個×縦（ｙ方向）ｎ個の画素について座標情報（ｘ，ｙ）を予め定め、核領域及び各輝点に含まれる複数の画素の座標情報に基づき計測できる。

【0040】

なお、処理部１１は、図２（ｂ）〜（ｄ）の中央に示すようなグラフを作成することなく、上記のような手順に沿って、演算により、第１画像、第２画像及び第３画像から、それぞれ第１輝点、第２輝点及び核領域を抽出してもよい。また、輝点の抽出は、正常とされる輝点の分布波形と判定対象の領域との整合の度合いを判定し、整合の度合いが高い場合に、判定対象の領域を輝点として抽出してもよい。処理部１１は、第３画像から核領域を抽出することにより細胞を検出したが、明視野画像に基づいて細胞を検出してもよい。明視野画像に基づいて細胞が検出される場合、第３画像の取得を省略することもできる。本実施形態における輝点とは、蛍光画像に生じる小さな蛍光の点を意味している。より具体的には、輝点とは、輝点の中心点（最も画素値（蛍光強度）が高い画素の位置）を意味している。なお、輝点の抽出は、例えば輝点として指定された画素以外の画素の色階調をバックグラウンドと同じレベルに変換する等して行うことができる。

【0041】

図３に戻って、次に処理部１１は、Ｓ３において、第１画像及び第２画像のそれぞれについて、抽出した複数の第１輝点及び第２輝点の画素値を、当該輝点以外の領域（バックグランド）よりも相対的に増加させることで、輝点の強調を行う。

【0042】

ここで、まず、細胞が異常細胞であるか否かの判定方法について説明する。

【0043】

図４（ａ）は、染色体異常を有していない正常細胞の輝点の配置例（陰性パターン）を例示し、図４（ｂ）〜（ｄ）は異常細胞の輝点の配置例（陽性パターン）を例示している。なお、図４（ａ）〜（ｄ）のいずれにおいても、各画像には第３画像を重ね合わせた状態で表示している。

【0044】

図４（ａ）に示すように、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座の転座等の染色体に異常が生じていない場合、それぞれの遺伝子は１つの核内に１対ずつ、各対立遺伝子が独立して存在する。したがって、第１画像において、第１輝点は１つの核領域内に２つ存在する。また、第２画像において、第２輝点は１つの核領域内に２つ存在する。この場合、同じ大きさで撮像された第１画像と第２画像とを重ね合わせて合成すると、合成画像においては、２つの第１輝点と２つの第２輝点とが、１つの核領域内に重ならずに存在することになる。そのため、図４（ａ）に示すように核領域内に第１輝点及び第２輝点が２つずつ存在する細胞は、染色体異常が認められない、すなわち染色体異常が陰性の正常細胞であると判定する。

【0045】

一方で、図４（ｂ）に示すように、転座によりＡＢＬ遺伝子座の一部が９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に２点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に３点存在する。この場合に、第１画像と第２画像とを合成すると、合成画像においては、１つの第１輝点と、２つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった１つの第４蛍光（本実施形態では黄色）の輝点（融合輝点）とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図４（ｂ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子とＡＢＬ遺伝子について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

【0046】

また、図４（ｃ）に示すように、転座によりＢＣＲ遺伝子座の一部が２２番染色体に移動し、ＡＢＬ遺伝子の一部が９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に３点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に３点存在する。この場合に、第１画像と第２画像とを合成すると、合成画像においては、１つの第１輝点と、１つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった２つの融合輝点とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図４（ｃ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

【0047】

また、図４（ｄ）に示すように、転座によりＡＢＬ遺伝子が座９番染色体に移動している場合、第１画像において、第１輝点は核内に２点存在し、第２画像において、第２輝点は核内に２点存在する。この場合に、第１画像と第２画像を合成すると、合成画像において、１つの第１輝点と、１つの第２輝点と、第１輝点及び第２輝点が互いに重なった１つの融合輝点とが、１つの核内に存在することになる。そのため、図４（ｄ）に示すように各輝点が存在する細胞は、ＢＣＲ遺伝子座とＡＢＬ遺伝子座について転座が生じている、すなわち染色体異常が陽性の異常細胞であると判定する。

【0048】

このように、第１画像及び第２画像を合成した合成画像における各輝点の位置、数に基づき、細胞ごとに染色体異常を有する異常細胞であるかどうかを判定することができる。なお、第１輝点、第２輝点及び融合輝点は、各画像やその合成画像において、色の情報で示すことで、オペレータ等が表示部１３を視認して第１輝点、第２輝点及び融合輝点を認識しやすくすることができる。つまり、各画像をグレースケールで表示することに代えて、第１画像では各画素の色をその画素値に基づき第１蛍光の緑色の色階調（ＲＧＢ値）で表示することで、緑色（第１蛍光）で光る領域を第１輝点と認識できる。また、第２画像では各画素の色をその画素値に基づき第２蛍光の赤色の色階調（ＲＧＢ値）で表示することで、赤色（第２蛍光）で光る領域を第２輝点と認識できる。さらに、第１画像及び第２画像を重ねた合成画像では、緑色（第１蛍光）の第１輝点と赤色（第２蛍光）の第２輝点とが重なる融合輝点が存在すると、融合輝点の各画素のＲＧＢ値の組み合わせに基づき、黄色（第４蛍光）で光る領域を融合輝点と認識できる。よって、細胞が異常細胞であると、核領域に、緑色（第１蛍光）の第１輝点と、赤色（第２蛍光）の第２輝点と、黄色（第４蛍光）の融合輝点とが存在する。

【0049】

ここで、第１画像及び第２画像から抽出される各輝点は、図５（ａ）及び図６（ａ）に示すように、明るい輝点、暗い輝点が含まれる。例えば、図５（ａ）では、第１画像に３つの第１輝点２Ａ〜２Ｃが存在しているが、２つの第１輝点２Ａ，２Ｂは明るく表示されている一方、１つの第１輝点２Ｃは暗く表示されている。一方、図６（ａ）では、第２画像に３つの第２輝点３Ａ〜３Ｃが存在しているが、１つの第２輝点３Ａは明るく表示されている一方、２つの第２輝点３Ｂ，３Ｃは暗く表示されている。なお、輝点の明暗は、ここでは輝点の大きさ（面積）で表している。図５（ａ）及び図６（ａ）に示すように、暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃは、各画像においてバックグランド２Ｄ，３Ｄとの明暗の差が小さいため、オペレータ等が視認し難く、暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃを認識できずに見落としやすい。そのため、処理部１１は、輝点の強調処理により、第１画像及び第２画像における微弱な蛍光の暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃを明瞭にし、各画像において暗い輝点を認識しやすくしている。

【0050】

輝点の強調処理では、例えば、図５（ｂ）及び図６（ｂ）に示すように、第１画像及び第２画像のバックグランド２Ｄ，３Ｄに位置する各画素の画素値を所定の画素値に減少させることで、第１輝点２Ａ〜２Ｃ及び第２輝点３Ａ〜３Ｃの画素値をバックグランド２Ｄ，３Ｄの画素値よりも相対的に増加させることができる。また、第１画像及び第２画像の第１輝点２Ａ〜２Ｃ及び第２輝点３Ａ〜３Ｃに位置する各画素の画素値を所定の係数で乗算等して増加させることで、第１輝点２Ａ〜２Ｃ及び第２輝点３Ａ〜３Ｃの画素値をバックグランド２Ｄ，３Ｄの画素値よりも相対的に増加させることができる。さらには、第１画像及び第２画像の各画素の画素値を、第１画像及び第２画像の第１輝点２Ａ〜２Ｃ及び第２輝点３Ａ〜３Ｃに位置する各画素ほど大きな係数で乗算等して増加させる、あるいは、バックグランド２Ｄ，３Ｄに位置する各画素ほど小さな係数で乗算等して減少させることで、第１輝点２Ａ〜２Ｃ及び第２輝点３Ａ〜３Ｃの画素値をバックグランド２Ｄ，３Ｄの画素値よりも相対的に増加させることができる。

【0051】

処理部１１は、輝点の強調処理後の第１輝点及び第２輝点が強調された第１画像及び第２画像を記憶部１２に記憶させる。

【0052】

図３に戻って、次に処理部１１は、Ｓ４において、第１画像及び第２画像の一方の蛍光画像から抽出した輝点の画素値に基づいて、他方の蛍光画像から抽出した輝点の画素値を調整する。具体的には、第１画像の第１輝点の画素値と、第２画像の第２輝点の画素値とに差がある場合に、両輝点の画素値の最高値を一致させる。例えば、画素値の最高値が低い一方の画像の輝点に位置する各画素の画素値を所定の係数で乗算等して増加させることで、両輝点の画素値の最高値を一致させることができる。また、画素値の最高値が低い画像の輝点に位置する各画素の画素値を所定の第１係数で乗算等して増加させるとともに、画素値の最高値が高い画像の輝点に位置する各画素の画素値を第１係数より小さい所定の第２係数で乗算等して増加させることで、両輝点の画素値の最高値を一致させることができる。

【0053】

第１画像及び第２画像を合成したときに、緑色（第１蛍光）の第１輝点と赤色（第２蛍光）の第２輝点とが重合する融合輝点において、一方の輝点の画素値と他方の輝点の画素値とに大きな差があると、融合輝点が黄色（第４蛍光）で表示されないおそれがある。例えば、緑色（第１蛍光）の第１輝点の画素値が赤色（第２蛍光）の第２輝点の画素値よりも大幅に大きいと、融合輝点が緑色（第１蛍光）に近い色となって黄色（第４蛍光）には見え難くなる。これでは、オペレータ等が融合輝点を視認しても、融合輝点として認識せずに第１輝点と誤認してしまう。そのため、処理部１１は、画素値の調整処理により、第１画像の第１輝点の画素値及び第２画像の第２輝点の画素値を同レベルに補正し、緑色（第１蛍光）の第１輝点と赤色（第２蛍光）の第２輝点とが重合した融合輝点が黄色（第４蛍光）で表示されるようにして、融合輝点を認識しやすくしている。

【0054】

処理部１１は、画素値の調整処理後の第１輝点及び第２輝点の画素値が調整された第１画像及び第２画像を記憶部１２に記憶させる。

【0055】

図３に戻って、次に処理部１１は、Ｓ５において、第１画像及び第２画像のそれぞれについて、抽出した複数の第１輝点及び第２輝点の画素値を、各輝点の画素値に応じて変更する。

【0056】

図５（ａ）及び図６（ａ）に示すように、第１画像及び第２画像から抽出される各輝点２Ａ〜２Ｃ，３Ａ〜３Ｃのうち、暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃは、各画像において観察者が視認し難く、見落としやすい。例え輝点の強調処理後の各画像においても、図５（ｂ）及び図６（ｂ）に示すように、暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃは明るい輝点２Ａ〜２Ｂ,３Ａ〜３Ｂよりも観察者が視認し難い。そのうえ、暗い輝点２Ｂ〜２Ｃ，３Ｃと明るい輝点２Ａ,３Ａ〜３Ｂとの間で画素値の差が大きいと、第１画像及び第２画像を合成したときに、例えば第２画像の暗い赤色（第２蛍光）の輝点３Ｂが第１画像の明るい緑色（第１蛍光）の輝点２Ｂと重なり合って融合輝点となる場合に、図７（ａ）に示すように、融合輝点４Ｂが明るい第１輝点の緑色（第１蛍光）に近い色となって黄色には見え難くなる。そのため、オペレータ等が融合輝点として認識せずに、他の輝点と誤認しやすい。

【0057】

よって、処理部１１は、画素値の変更処理により、第１画像及び第２画像のそれぞれについて、画素値が異なる複数の輝点を、それぞれ異なる変更率で輝点の画素値を変更する。変更率は、増加率及び減少率を含む。例えば、図５（ｃ）及び図６（ｃ）に示すように、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させる。これにより、画素値の小さい暗い輝点２Ｃ，３Ｂ〜３Ｃについて、画素値の大きい明るい輝点２Ａ〜２Ｂ,３Ａ〜３Ｂよりも、その画素値を増加させて明るくして、暗い輝点２Ｃ，３Ｂ〜３Ｃを認識しやすくしている。また、図８は、第１画像、第２画像及び第３画像を合成した合成画像であるが、第１画像及び第２画像の輝点２Ａ〜２Ｃ，３Ａ〜３Ｃを第３画像の核領域５に重ねた場合にも、図８（ａ）及び図８（ｂ）の比較から分かるように、画素値の小さい暗い輝点２Ｃ，３Ｂ〜３Ｃを背景の核領域５に紛れることなく認識しやすくしている。そのうえ、処理部１１は、画素値の大きい明るい輝点２Ａ〜２Ｂ，３Ａとの画素値の差を小さくして、第１画像及び第２画像を合成したときに、図７（ｂ）及び図８（ｂ）と図７（ａ）及び図８（ａ）との比較から分かるように、緑色（第１蛍光）の第１輝点２Ｂと赤色（第２蛍光）の第２輝点３Ｂとが重合した融合輝点４Ｂがより黄色（第４蛍光）に近い色で表示されるようにして、融合輝点４Ｂを認識しやすくしている。

【0058】

画素値の変更処理は、所定の規則、つまりは、各画像における各輝点に含まれた画素の画素値を、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして増加させるとの規則に従っていれば、いかなる方法で画素値を変更してもよく、画素値の変更方法は特に限定されない。なお、画素値の変更処理においては、各輝点に含まれた画素ごとの画素値の大小関係を維持したままで、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させることが好ましい。また、各輝点に含まれた画素値の変更対象の画素の中で、最高画素値を有する画素については、画素値を増加させずに維持することが好ましい。これにより、変更処理の後の各画像においても、元々の輝点間での明るさの強弱を再現できる。

【0059】

画素値の変更処理としては、例えば図９（ａ）に示すように、変更対象の画像に含まれる各画素について、変更前画素値ｘを、以下の数式１により、変更後画素値ｙに変更することができる。なお、以下の数式１及び図９（ａ）では、変更前画素値ｘ及び変更後画素値ｙともに、その最高画素値は変更前の画素の最高画素値Ｍであり、この最高画素値Ｍで画素値の範囲０〜Ｍを０〜１に規格化して表している。数式１及び図９（ａ）によると、変更前画素値ｘが閾値Ｔｈよりも小さい画素については、変更後画素値ｙが変更前画素値ｘと同じになり、画素値が変更されずに維持される。一方で、変更前画素値ｘが閾値Ｔｈよりも大きい画素については、所定の関数式により、画素値の大小関係が維持されたままで、画素値の小さい画素ほど大きい増加率で画素値が増加される。閾値Ｔｈを各輝点に含まれる画素の画素値の最低画素値に設定することで、各輝点の画素値だけを、その画素値に応じて変更することができる。

【0060】

［数１］
ｙ＝ｘ^γ 但しｘ≧Ｔｈ，γ＜１
ｙ＝ｘ 但しｘ＜Ｔｈ

【0061】

また、画素値の変更処理としては、その他に、図９（ｂ）に示すように、変更対象の画像に含まれる各画素について、変更前画素値ｘを、以下の数式２により、変更後画素値ｙに変更することができる。なお、以下の数式２及び図９（ｂ）においても、変更前画素値ｘ及び変更後画素値ｙともに、その最高画素値は変更前の画素の最高画素値Ｍであり、この最高画素値Ｍで画素値の範囲０〜Ｍを０〜１に規格化して表している。数式２及び図９（ｂ）によっても、変更前画素値ｘが閾値Ｔｈよりも小さい画素については、変更後画素値ｙが変更前画素値ｘと同じになり、画素値が変更されずに維持される。一方で、変更前画素値ｘが閾値Ｔｈよりも大きい画素については、所定の関数式により、画素値の大小関係が維持されたままで、画素値の小さい画素ほど大きい増加率で画素値が増加される。閾値Ｔｈを各輝点に含まれる画素の画素値の最低画素値に設定することで、各輝点の画素値だけを、その画素値に応じて変更することができる。

【0062】

［数２］
ｙ＝（１−ｂ）ｘ＋ｂ 但しｘ≧Ｔｈ
ｙ＝ｘ 但しｘ＜Ｔｈ

【0063】

なお、画素値の変更処理は、関数式による計算処理に置き換えて、上述した規則に従った所定のルックアップテーブルを用いた参照処理により、画素値を変更することもできる。

【0064】

処理部１１は、画素値の変更処理後の第１輝点及び第２輝点の画素値が変更された第１画像及び第２画像を記憶部１２に記憶させる。

【0065】

図３に戻って、次に処理部１１は、Ｓ６において、上述した輝点を抽出しかつ画像処理を行った第１画像及び第２画像、さらに、核領域を抽出した第３画像を合成する。処理部１１は、画像合成により、第１画像及び第３画像の合成画像、第２画像及び第３画像の合成画像、第１画像及び第２画像の合成画像、第１画像、第２画像及び第３画像の合成画像など、複数種の合成画像を作成することができる。なお、上述した複数種の合成画像の全てを必ずしも作成する必要はない。処理部１１は、作成した各合成画像を記憶部１２に記憶させる。

【0066】

最後に処理部１１は、Ｓ７において、上述した輝点を抽出しかつ画像処理を行った第１画像及び第２画像、核領域を抽出した第３画像、さらには、画像合成した各合成画像を表示部１３に表示させる。なお、処理部１１は、上述した画像の全てを必ずしも表示部１３に表示する必要はなく、オペレータ等に選択された必要な画像だけを表示部１３に表示させることができる。

【0067】

オペレータ等は、表示部１３に表示された各画像を観察し、各画像における輝点の色、数に基づいて、細胞ごとに異常細胞であるか否かを確認する。

【0068】

本発明によれば、オペレータ等が表示部１３に表示された細胞の蛍光画像を観察する際に、まず、輝点を抽出した第１画像及び第２画像において、輝点の強調処理により、各輝点内の各画素の画素値が輝点外のバックグランド内の各画素の画素値よりも相対的に増強されている。よって、各画像から低画素値の暗い輝点が抽出されたとしても、この暗い輝点をオペレータ等が目視で認識しやすくなる。また、第１画像及び第２画像において、画素値の変更処理により、低画素値の暗い輝点が、高画素値の明るい輝点との画素値の差が小さくなるよう増強されるので、暗い輝点をオペレータ等が目視でさらに認識しやすくなる。加えて、第１画像及び第２画像において、画素値の変更処理により、暗い輝点が明るい輝点との画素値の差が小さくなるよう増強されるので、第１画像及び第２画像の合成画像では、融合輝点が、第１輝点と第２輝点とがそれぞれ画素値の差が小さくなった状態で重ね合わされる。よって、融合輝点が第４蛍光の黄色あるいは黄色に近い色で表示されるので、オペレータ等が目視で融合輝点を検出しやすくなる。なお、第１画像の第１輝点と第２画像の第２輝点との間の画素値の調整処理により、第１画像及び第２画像の合成画像で融合輝点をより第４蛍光の黄色で表示することができるので、オペレータ等が目視で融合輝点をさらに検出しやすくなる。

【0069】

このように、本発明によれば、１枚の蛍光画像に、高画素値の明るい輝点、低画素値の暗い輝点が混在していても、画像観察における輝点の確認や、２枚の蛍光画像の合成画像の解析における融合輝点の検出を容易に行うことができる。よって、細胞ごとに正常細胞であるか異常細胞であるかの判定を容易にかつ高精度に行うことができる。

【0070】

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上述した本実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である

【0071】

例えば、上述した本実施形態では、処理部１１は、図３のＳ５の画素値の変更処理において、各蛍光画像（第１画像及び第２画像）における各輝点の画素値を、画素値の小さい画素ほど増加率を大きくして画素値を増加させている。これにより、各蛍光画像における暗い輝点と明るい輝点との画素値の差を小さくしている。しかし、画素値の変更処理の方法はこれに限られるものではなく、例えば、各蛍光画像における各輝点の画素値を、画素値の大きい画素ほど減少率を大きくして画素値を減少させることで、各蛍光画像における暗い輝点と明るい輝点との画素値の差を小さくしてもよい。

【0072】

また、上述した本実施形態では、処理部１１は、撮像部１６０により撮像された各蛍光画像（第１画像及び第２画像）について、画像処理後の蛍光画像を表示部１３に表示している。しかし、画像処理後の蛍光画像及び画像処理前の蛍光画像のうち、入力部１４により選択されたいずれかの蛍光画像を表示部１３に表示してもよい。つまり、処理部１１による画像処理前の第１画像、第２画像、第３画像、及び、これらのうちの少なくとも２つを組み合わせた合成画像を表示部１３に表示してもよい。

【0073】

また、上述した本実施形態では、処理部１１は、図３の蛍光画像を画像処理するための処理手順において、Ｓ４で複数の蛍光画像の間で輝点の画素値の調整処理を行った後、Ｓ５で各蛍光画像の複数の輝点の画素値の変更処理を行っているが、このＳ４の画素値の調整処理を、Ｓ５の画素値の変更処理の後に行ってもよい。また、処理部１１は、Ｓ４の画素値の調整処理を必ずしも行う必要はなく、省略してもよい。

【0074】

また、処理部１１は、図３の蛍光画像を画像処理するための処理手順において、Ｓ２で蛍光画像から輝点の抽出処理を行った後、Ｓ３で蛍光画像における輝点の強調処理を行っているが、このＳ３の輝点の強調処理を、Ｓ４の画素値の調整処理の後、もしくは、Ｓ５の画素値の変更処理の後に行ってもよい。また、処理部１１は、Ｓ３の輝点の強調処理を必ずしも行う必要はなく、省略してもよい。

【0075】

また、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１において、図１に示す測定装置１００を、図１０に示す蛍光顕微鏡を含む測定装置４００に代えてもよい。

【0076】

図１０に示す測定装置４００は、光源４１０〜４１２と、ミラー４２０と、ダイクロイックミラー４２１〜４２２と、シャッター４３０と、１／４波長板４３１と、ビームエキスパンダ４３２と、集光レンズ４３３と、ダイクロイックミラー４３４と、対物レンズ４３５と、ステージ４４０と、集光レンズ４５０と、撮像部４５１と、コントローラ４６０〜４６１と、を備えている。ステージ４４０には、スライドガラス４４１が設置される。スライドガラス４４１には、前処理装置３００で前処理により調製された試料１０（図１に示す）が載せられる。

【0077】

光源４１０〜４１２は、それぞれ、図１に示す光源１２０〜１２２と同様である。ミラー４２０は、光源４１０からの光を反射する。ダイクロイックミラー４２１は、光源４１０からの光を透過し、光源４１１からの光を反射する。ダイクロイックミラー４２２は、光源４１０〜４１１からの光を透過し、光源４１２からの光を反射する。光源４１０〜４１２からの光の光軸は、ミラー４２０とダイクロイックミラー４２１〜４２２により、互いに一致させられる。

【0078】

シャッター４３０は、コントローラ４６０により駆動され、光源４１０〜４１２から出射された光を通過させる状態と、光源４１０〜４１２から出射された光を遮断する状態とに切り替える。これにより、試料１０に対する光の照射時間が調整される。１／４波長板４３１は、光源４１０〜４１２から出射された直線偏光の光を円偏光に変換する。プローブに結合している蛍光色素は、所定の偏光方向の光に反応する。よって、光源４１０〜４１２から出射された励起用の光を円偏光に変換することにより、励起用の光の偏光方向が、蛍光色素が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、蛍光色素に効率良く蛍光を励起させることができる。ビームエキスパンダ４３２は、スライドガラス４４１上における光の照射領域を広げる。集光レンズ４３３は、対物レンズ４３５からスライドガラス４４１に平行光が照射されるよう光を集光する。

【0079】

ダイクロイックミラー４３４は、光源４１０〜４１２から出射された光を反射し、試料１０から生じた蛍光を透過する。対物レンズ４３５は、ダイクロイックミラー４３４で反射された光を、スライドガラス４４１に導く。ステージ４４０は、コントローラ４６１により駆動される。試料１０から生じた蛍光は、対物レンズ４３５を通り、ダイクロイックミラー４３４を透過する。集光レンズ４５０は、ダイクロイックミラー４３４を透過した蛍光を集光して、撮像部４５１の撮像面４５２に導く。撮像部４５１は、撮像面４５２に照射された蛍光の像を撮像し、蛍光画像を生成する。撮像部４５１は、たとえばＣＣＤ等により構成される。

【0080】

コントローラ４６０〜４６１と撮像部４５１とは、図１に示す処理部１１と接続されており、処理部１１は、コントローラ４６０〜４６１と撮像部４５１とを制御し、撮像部４５１により撮像された蛍光画像を受信する。なお、撮像部４５１により撮像される蛍光画像は、図１に示すようにフローセル１１０が用いられる場合とは異なり、図２（ａ）に示すように細胞が密接した状態となっている場合がある。このため、処理部１１は、取得した蛍光画像を、細胞の核ごとに分割する処理、又は、蛍光画像において１つの細胞の核に対応する領域を設定する処理等を行う。

【0081】

この図１０に示す測定装置４００においても、本実施形態と同様、３つの蛍光画像（第１画像〜第３画像）を取得できるため、各蛍光画像を画像処理して合成画像を生成することで、オペレータ等が細胞ごとに正常細胞であるか異常細胞であるかの判定を容易にかつ高精度に行うことができる。

【0082】

また、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１において、処理部１１をインターフェース１６を介して前処理装置３００との間でデータの入出力可能に接続してもよい。

【0083】

また、上述した画像処理装置２００の処理部１１による蛍光画像を画像処理するための処理手順を規定したコンピュータプログラムを記憶させた記憶媒体も提供することができる。

【0084】

また、上述した本実施形態の蛍光画像分析装置１においては、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子を分析しているが、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子の他、ＦＩＳＨ法によって融合輝点を検出できる染色体転座としては、ＡＭＬ１／ＥＴＯ（ＭＴＧ８）融合遺伝子（ｔ（８；２１））、ＰＭＬ／ＲＡＲα融合遺伝子（ｔ（１５；１７））、ＡＭＬ１（２１ｑ２２）転座、ＭＬＬ（１１ｑ２３）転座、ＴＥＬ（１２ｐ１３）転座、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子（ｔ（１２；２１））、ＩｇＨ（１４ｑ３２）転座、ＣＣＮＤ１（ＢＣＬ１）／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（１１；１４））、ＢＣＬ２（１８ｑ２１）転座、ＩｇＨ／ＭＡＦ融合遺伝子（ｔ（１４；１６））、ＩｇＨ／ＢＣＬ２融合遺伝子（ｔ（１４；１８））、ｃ−ｍｙｃ／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（８；１４））、ＦＧＦＲ３／ＩｇＨ融合遺伝子（ｔ（４；１４））、ＢＣＬ６（３ｑ２７）転座、ｃ−ｍｙｃ（８ｑ２４）転座、ＭＡＬＴ１（１８ｑ２１）転座、ＡＰＩ２／ＭＡＬＴ１融合遺伝子（ｔ（１１；１８）転座）、ＴＣＦ３／ＰＢＸ１融合遺伝子（ｔ（１；１９）転座）、ＥＷＳＲ１（２２ｑ１２）転座、ＰＤＧＦＲβ（５ｑ３２）転座等を挙げることができる。

【0085】

また、他の実施形態の例として、ＡＬＫ遺伝子座の染色体異常を挙げることができる。陽性パターンでは、ＡＬＫ遺伝子が切断されているため、融合輝点が１個のみとなる（対立遺伝子の一方のみが切断された場合）か、融合輝点が認められなくなる（対立遺伝子の両方が切断された場合）。この陰性パターンと陽性パターンは、ＡＬＫ遺伝子の他、ＲＯＳ１遺伝子、ＲＥＴ遺伝子でも同じである。

【0086】

さらに、他の実施形態の例として、第５番染色体長腕（５ｑ）が欠失する染色体異常を挙げることができる。例えば、第１蛍光標識プローブは第５番染色体長腕に結合し、第２蛍光標識プローブは第５番染色体のセントロメアと結合するように設計する。陰性パターンでは、第５番染色体のセントロメアの数と第５番染色体長腕の数は同じであるため、第１蛍光標識プローブの輝点（第１輝点）と第２蛍光標識プローブの輝点（第２輝点）は、相同染色体の数を反映し２個ずつ存在する。陽性パターンでは、第５番染色体の一方又は両方に長腕の欠失が起り、第１輝点の数が１個のみ又は０個となる。この陰性パターンと陽性パターンは、他の染色体の短腕又は長腕の欠失でも同じである。他の染色体の長腕欠失の例として、第７番染色体、及び第２０番染色体の長腕欠失を挙げることができる。また、この他、同様の陽性パターン及び陰性パターンを示す例として、７ｑ３１（欠失）、ｐ１６ （９ｐ２１欠失解析）、ＩＲＦ−１（５ｑ３１）欠失、Ｄ２０Ｓ１０８（２０ｑ１２）欠失、Ｄ１３Ｓ３１９（１３ｑ１４）欠失、４ｑ１２欠失、ＡＴＭ（１１ｑ２２．３）欠失、ｐ５３（１７ｐ１３．１）欠失等を挙げることができる。

【0087】

さらにまた、他の実施形態の例として、第８番染色体トリソミーを挙げることができる。第１蛍光標識プローブは例えば第８番染色体のセントロメアと結合する。陽性パターンは第１輝点が３個となる。陰性パターンは、第１輝点が２個となる。このような輝点パターンは第１２番染色体トリソミーでも同様である。さらに、第７番染色体モノソミーでは、例えば第７番染色体のセントロメアと結合する第１蛍光標識プローブを用いた場合、陽性パターンは第１輝点が１個となる。陰性パターンは、第１輝点が２個となる。

【符号の説明】

【0088】

１ 蛍光画像分析装置
１０ 試料
１１ 処理部
１２ 記憶部
１３ 表示部
１４ 入力部
１００ 測定装置
１２０〜１２３ 光源
１６０ 撮像部
２００ 画像処理装置
３００ 前処理装置
４００ 測定装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】