特許 6948265 クラステリンアイソフォームの特異的検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6948265

(24)【登録日】2021年9月22日

(45)【発行日】2021年10月13日

(54)【発明の名称】クラステリンアイソフォームの特異的検出

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20210930BHJP

   G01N 33/566 20060101ALI20210930BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20210930BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20210930BHJP

   C07K 16/44 20060101ALN20210930BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 D

   G01N33/53 S

   G01N33/566

   G01N33/543 521

   !C07K16/18

   !C07K16/44

【請求項の数】30

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-556249(P2017-556249)

(86)(22)【出願日】2016年4月29日

(65)【公表番号】特表2018-515762(P2018-515762A)

(43)【公表日】2018年6月14日

(86)【国際出願番号】US2016030075

(87)【国際公開番号】WO2016176565

(87)【国際公開日】20161103

【審査請求日】2019年4月8日

(31)【優先権主張番号】62/155,175

(32)【優先日】2015年4月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】300004500

【氏名又は名称】アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(72)【発明者】

【氏名】クウィン，ジョン ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】イェラミッリ，マーシー，ヴイエスエヌ

【審査官】 三好 貴大

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５４１０６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３２４４７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Juan D. Garcia-Martinez et al.，Urinary clusterin as a renal marker in dogs，Journal of Veterinary Diagnostic Invenstigation，米国，2012年，24(2)，301-306

【文献】 Jeffrey Dvergsten et al.，Expression of clusterin in human renal diseases，Kidney International，米国，1994年，45(3)，828-835

【文献】 Alan Kang-Wai Mu et al.，Identification of O-glycosylated proteins that are aberrantly excreted i the urine of patients with early stage ovarian cancer，International Journal of Molecular Sciences，米国，2013年，14(4)，7923-7931

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｃ０７Ｋ １６／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

腎臓特異的クラステリンを検出する方法であって、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、試料とを接触させること、ならびに腎臓特異的クラステリンと、前記クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体を検出することを含んでなる、方法。

【請求項2】

前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子が１つ以上のレクチンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子が、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合する分子である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上のレクチンが、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記１つ以上のレクチンが、インゲンマメ白血球凝集素（ＰＨＡ−Ｌ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、ＷＧＡ１、ＷＧＡ２、ＷＧＡ３、インゲンマメ凝集素−Ｅ（ＰＨＡ−Ｅ）、トマトレクチン（ＬＥＬ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）、インゲンマメ凝集素（ＰＳＡ）、ジャカリンレクチン、ＬＣＡレクチン（レンズマメ）、アメリカデイゴレクチン（ＥＣＬ）、トウゴマレクチン（ＲＣＡ）、ＳＢＡレクチン（ダイズ）、ＣＯＮＡレクチン（コンカナバリン）、またはドリコスレクチン（ＤＢＡ）である請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントが支持体に固相化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記試料および腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない検出可能にラベルされた１つ以上の分子が、前記支持体に加えられている、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない検出可能にラベルされた１つ以上の分子がレクチンである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子が支持体に固相化されている、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記試料および検出可能にラベルされた１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、前記支持体に加えられている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子がレクチンである、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記１つ以上の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子、または両方が、検出可能な標識で標識されている、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記１つ以上のレクチンが血清クラステリンおよび血漿クラステリンに特異的に結合しない、請求項２に記載の方法。

【請求項14】

前記試料が尿試料である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記検出することが、ラテラルフローアッセイ、化学発光標識サンドイッチアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、凝集アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ゲル電気泳動免疫アッセイ法、免疫組織化学アッセイ、放射免疫定量アッセイ（ＲＩＡ）、無標識のバイオセンサーアッセイ、または免疫放射定量アッセイからなる群より選択される方法によって達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記抗体が、血漿クラステリン、血清クラステリン、組換えクラステリン、腎臓特異的クラステリン、またはＭＤＣＫ由来クラステリンに特異的に結合する請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記腎臓特異的クラステリンが、ヒト、ネコ、またはイヌのものである請求項１に記載の方法。

【請求項18】

哺乳類の腎疾患、腎障害、または腎損傷を検出するための方法であって、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、哺乳類の試料を接触させること、ならびに腎臓特異的クラステリンと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体を検出することを含んでなり、前記複合体の検出が、前記哺乳類が腎疾患、腎障害、または腎損傷を有することを示す、方法｛但し、ヒトに対する医療行為を除く｝。

【請求項19】

前記哺乳類が非ヒト哺乳類であり、前記哺乳類が腎疾患、腎障害、または腎損傷を有する場合に、腎治療または腎治療薬を前記哺乳類に施行することをさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記腎疾患が尿路感染症である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記哺乳類が、ヒト、ネコ、またはイヌである、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

腎臓特異的クラステリンアイソフォームを血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォームと識別する方法であって、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび前記腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、前記血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させること、ならびに前記腎臓特異的クラステリンアイソフォームと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、前記腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、前記血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない前記１つ以上の分子との複合体を検出することを含んでなる、方法。

【請求項23】

前記血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォームが、ヒト、ネコ、またはイヌのクラステリンアイソフォームである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

腎臓特異的クラステリン分子と、腎臓特異的クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンと結合し、血清クラステリンまたは血漿クラステリンと結合しない１つ以上のレクチンとを含んでなる複合体。

【請求項25】

１つ以上の腎臓特異的クラステリン分子と、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、血清クラステリンまたは血漿クラステリンと結合しない１つ以上の分子とを含んでなる、請求項２４に記載の複合体。

【請求項26】

固体支持体に固相化される請求項２４に記載の複合体。

【請求項27】

クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上の腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子を含んでなるキット。

【請求項28】

前記１つ以上の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、前記腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子、または両方が、検出可能な標識で標識されている、請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

前記検出可能な標識が、酵素、酵素結合体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性元素、直接的可視標識、または磁性粒子である、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

腎臓特異的クラステリンおよび腎臓特異的クラステリンアイソフォームの検出を向上させる方法であって、１つ以上の腎臓特異的クラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメント、および腎臓特異的クラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合し、非腎臓特異的で、血液由来のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる、方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の参照】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０１５年４月３０日に出願された米国特許出願第６２／１５５，１７５号の優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。

【背景技術】

【0002】

クラステリンまたはアポリポタンパク質Ｊは７５〜８０ｋＤａのジスルフィド結合ヘテロ二量体タンパク質である。クラステリンは、精子成熟、脂質輸送、補体阻害、組織リモデリング、膜リサイクリング、ストレスタンパク質の安定化、およびアポトーシスの阻害の促進を含む多くの生理的プロセスに関与している。クラステリンは腎近位および遠位尿細管損傷の間に過剰発現し、さまざまながん腫で認められ、且つ腎障害において増加している。

【0003】

血漿、血清、および尿を含むさまざまな体液でクラステリンを測定するために開発および市販されている免疫アッセイがいくつかある。腎臓特異的クラステリンは腎損傷または腎疾患のマーカーとして使用することができる。しかし、感染症、外傷、新生物、炎症、ならびにカテーテル挿入および膀胱穿刺の間の偶発的な混入に起因して、尿試料に血液が混入することはよくみられることである。それは獣医学においてより深刻な問題である。健康な集団では、クラステリンの血清濃度（６０〜１００μｇ／ｍｌ）は尿中の濃度（＜１００ｎｇ／ｍｌ）と比べて１０００倍高い。血液混入は非腎臓特異的クラステリンアイソフォームを尿にもたらす。したがって、血液から血清クラステリンが混入することによって腎臓特異的クラステリンアイソフォームの定量が影響を受けないことを確実することが重要である。そうし損なうと、結果として尿クラステリンアッセイの偽陽性試験結果なることがありうる。生体試料中のクラステリンアイソフォームを識別するための方法が当該技術分野において必要である。

【発明の概要】

【0004】

本発明は第１のクラステリンアイソフォームを特異的に検出する方法を提供する。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび第１のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。第１のクラステリンと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、第１のクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体が検出される。

【0005】

また、本発明は腎臓特異的クラステリンを検出する方法を提供する。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。腎臓特異的クラステリンと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体が検出される。腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子は、１つ以上のレクチンまたは１つ以上のＮ−アセチルグルコサミンに特異的に結合する分子であることができる。１つ以上のレクチンは、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンであることができる。レクチンは、インゲンマメ白血球凝集素（ＰＨＡ−Ｌ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）、ＷＧＡ１、ＷＧＡ２、ＷＧＡ３、ｓＷＧＡ、インゲンマメ凝集素−Ｅ（ＰＨＡ−Ｅ）、トマトレクチン（ＬＥＬ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）、インゲンマメ凝集素（ＰＳＡ）、またはドリコスレクチン（ＤＢＡ）とすることができる。

【0006】

１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントは支持体に固相化することができる。試料および腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない検出可能に標識された１つ以上の分子（レクチンとすることができる）は支持体に加えることができる。

【0007】

腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子（レクチンとすることができる）は支持体に固相化することができる。試料および検出可能にラベルされた１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントは支持体に加えることができる。

【0008】

１つ以上の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、もしくは血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子、または両方は検出可能な標識で標識することができる。

【0009】

１つ以上のレクチンは、血清クラステリンおよび血漿クラステリンに特異的に結合しないレクチンであることができる。試料は尿試料とすることができる。検出は、ラテラルフローアッセイ、化学発光標識サンドイッチアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、凝集アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ゲル電気泳動免疫アッセイ法、免疫組織化学アッセイ、放射免疫定量アッセイ（ＲＩＡ）、無標識のバイオセンサーアッセイ、または免疫放射定量アッセイからなる群より選択される方法によって達成することができる。抗体は、血漿クラステリン、血清クラステリン、組換えクラステリン、腎臓特異的クラステリン、またはＭＤＣＫ由来クラステリンに特異的に結合できる。腎臓特異的クラステリンは、ヒト、ネコ、またはイヌのものであることができる。

【0010】

本発明の他の実施形態は、哺乳類の腎疾患、腎障害、または腎損傷を検出する方法を提供する。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、哺乳類の試料を接触させることを含んでなる。腎臓特異的クラステリンと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体が検出される。複合体が検出された場合、哺乳類は腎疾患、腎障害、または腎損傷を有する。哺乳類が腎疾患、腎損傷、または腎障害を有する場合、腎治療法または腎治療薬が哺乳類に施行される。腎疾患は尿路感染症であり得る。哺乳類は、ヒト、ネコ、またはイヌとすることができる。

【0011】

本発明の他の実施形態は、１つ以上のクラステリンアイソフォームを他のタイプのクラステリンアイソフォームと識別する方法を提供する。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。クラステリンの１つ以上のアイソフォームと、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントと、１つ以上のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子との複合体が検出される。１つ以上のクラステリンアイソフォームは腎臓特異的クラステリンであることができ、他のクラステリンアイソフォームは、例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリンであることができる。１つ以上のクラステリンアイソフォームは、ヒト、ネコ、またはイヌクラステリンアイソフォームであり得る。

【0012】

本発明の他の実施形態は、１つ以上のクラステリン分子、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および１つ以上のレクチンを含んでなる複合体を提供する。複合体は、１つ以上の腎臓特異的クラステリン分子、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子を含んでなることができる。複合体はいずれのタイプの固体支持体にも固相化することができる。複合体は、複合体の１つ以上の分子と結合できる１つ以上の検出可能な標識をさらに含んでなることができる。

【0013】

本発明の他の実施形態は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来の、非腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子を含んでなるキットを提供する。１つ以上の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子、または両方は検出可能な標識で標識される。検出可能な標識は、酵素、酵素結合体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性元素、直接的可視標識（direct visual label）、または磁性粒子であることができる。

【0014】

本発明の他の実施形態は、クラステリンおよびクラステリンアイソフォームの検出を向上させる方法を提供する。該方法は、１つ以上のクラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメントおよびクラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合する１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。１つ以上のクラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメントとクラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合する１つ以上の分子との複合体は、感度、特異性、または両方が向上して検出される。

【0015】

したがって、本発明は、１つ以上の第２のクラステリンアイソフォームが第１の特異的クラステリンアイソフォームの検出および／または定量を妨げないような、随意に１つ以上の第２のクラステリンアイソフォームの存在下で第１の特異的クラステリンアイソフォームを検出および／または定量する方法および組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１Ａ〜Ｂは、正常イヌ血清をさまざまに希釈してスパイクした正常な（すなわち、健康な）イヌの尿中のクラステリンレベルを示す。

【図2】図２は、クラステリンのレクチン固相への結合を示す。

【図3】図３は、全血と血清の両方における、市販のクラステリンＥＩＡと腎臓特異的クラステリン免疫アッセイとの比較を示す。

【図4】図４は、イヌゲンタマイシンモデルの尿中の腎臓特異的クラステリンの測定を示す。

【図5】図５は、炎症または虚血によって誘発される活動性腎障害のイヌの尿中の腎臓特異的クラステリンの測定を示す。

【図6】図６は、尿路感染症（ＵＴＩ）の患者の腎臓特異的クラステリンの測定を示す。

【図7】図７は、ネコクラステリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色およびウェスタンブロットを示す。パネルＡ：ＡＴＣＣ由来のＭＤＣＫ細胞株およびＣＲＦＫ細胞株の細胞培養上清の銀染色。Ｂ：抗クラステリンイヌモノクローナル抗体の反応性を示すウェスタンブロットであり、レーン２および３はＭＤＣＫ（イヌ）クラステリン、レーン４および５は血漿（イヌ）クラステリン、ならびにレーン６および７はＣＲＦＫ（ネコ）クラステリンである。

【図8】図８は、さまざまなストレス条件下で培養した細胞におけるヒトクラステリン発現を示す。

【図9】図９は、ＭＤＣＫ（レーン２、４）、ＨＥＫ２９３細胞上清（レーン３）、および陽性対照組換えイヌクラステリンベータ鎖抗原（レーン５）のクラステリンに結合するウサギ抗ベータ鎖クラステリンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本明細書で使用される場合、単数形「１つ（a）」、「１つ（an）」、および「その（the）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り複数の指示対象を含む。数値に伴う「約」という用語は、その数値のプラスマイナス５％またはそれ未満の範囲でその数値が変動する可能性があることを意味する。

【0018】

腎臓特異的クラステリンは、イヌ、ネコ、およびヒトなどの哺乳類において腎障害の間に増加し、且つ腎障害の結果として増加する急性腎障害（ＡＫＩ）バイオマーカーである。バイオベンダー社の市販ＥＩＡキットが血清と尿の両方のイヌクラステリンの定量に利用可能である。最近の研究はリーシュマニア症のイヌでこのキットを用いてバイオマーカーの有効性を実証した。しかし、血清中の高濃度のクラステリンのため尿試料への血清の混入は偽陽性の結果をもたらす可能性がある。尿試料への血清の混入は、血清クラステリンによる混入に起因して腎臓特異的クラステリンの検出の特異性を欠く結果となる。

【0019】

一般的な総クラステリン測定の偽陽性の問題を示すのに、陰性のイヌ尿試料を、市販キット（バイオベンダー社）を用いて値を代入し、次いで陰性イヌ血清（０．００２％〜１０体積％）でスパイクした。結果として生じた混合物を市販キットで分析した。得られた結果を下表に示す。

【0020】

【表1】

【0021】

市販のキットのカットオフ値は約７０ｎｇ／ｍｌである。総クラステリン（すべてのアイソフォーム）が測定される場合、裸眼では見えない微量の血液または従来の検尿（ディップスティック）では検出できない微量の血液でさえ、偽陽性を生じさせる可能性がある。これは、少しでも血液混入がある患者試料は、誤った臨床診断につながる偽陽性の可能性が上がるので非常に慎重に評価する必要があることを意味する。本発明は、体液中のクラステリンの特異的アイソフォームを同定する、例えば、血清クラステリンに干渉されることなく腎臓特異的クラステリンの有無および／または量を決定する方法を提供する。すなわち、本発明を使用して、他のクラステリンアイソフォームの存在下で特異的なクラステリンアイソフォーム、例えば、腎臓特異的クラステリンを検出および／または定量することができる。

【0022】

すべてのクラステリンアイソフォームの一次構造には高い相同性がある。しかし、相異なるクラステリンアイソフォームの間には翻訳後修飾パターンの違いがあると考えられている。クラステリンアイソフォームの特異的なオリゴ糖構造は、組織源、生理学的状態、病態、および種に関連する。本発明の方法は、患者試料（例えば、尿試料）中に存在する特有のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎障害特異的クラステリンアイソフォーム）を検出する方法の開発にこれらの違いをうまく活用する。

【0023】

クラステリンアイソフォーム
本明細書において使用される場合、「クラステリンアイソフォーム」は、グリコシル化されている、遺伝子スプライシングまたは重複事象の産物であるクラステリン分子である（例えば、Rizzi et al., Adv. Cancer Res. 104:9 (2009); Prochnow et al., PLOS One, 8:e75303 (2013)を参照されたい）。クラステリンアイソフォームは、核型、細胞質型、および分泌型を含む。また「クラステリンアイソフォーム」は、例えば、特異的な組織タイプでの発現、特異的な生理学的状態での発現、特異的な種タイプでの発現、特異的な病態での発現に起因するか、または細胞損傷の状態の下で、差次的にグリコシル化されているクラステリンの型であるクラステリングリコ型を含んでなる。

【0024】

「腎臓特異的クラステリン」または「腎臓特異的クラステリンアイソフォーム」は、腎臓系（すなわち、腎臓、尿管、尿道、および膀胱）で産生される、腎臓系、例えば、尿に存在する可能性があるクラステリンである。しかし、少量の腎臓特異的クラステリンは、血液、血清、または血漿に漏れる可能性がある。腎障害、腎損傷、および／または腎疾患のない動物およびヒトと比較して、腎障害、腎損傷、および／または腎疾患をもつ動物およびヒトの尿を含む腎臓系には、腎臓特異的クラステリンレベルが増加して存在する可能性がある。

【0025】

「血清クラステリン」および「血漿クラステリン」は、心臓、肝臓、および肺などの組織で合成され循環に放出される、血液、血漿、またはその画分のクラステリンアイソフォームである。「血清クラステリン」および「血漿クラステリン」は、腎臓系に由来する腎臓特異的クラステリンも、腎臓系に由来し、後に循環血、血清、血漿、またはその画分に漏れた腎臓特異的クラステリンも含まない。非腎臓特異的クラステリンアイソフォームは、腎臓系（例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリン）で産生されないクラステリンアイソフォームである。血液由来クラステリンアイソフォームは、循環血、血漿、血清、またはその画分に存在するものである。

【0026】

分泌クラステリンは初期タンパク質前駆体から作られ、前分泌ｐｓＣＬＵ（〜６０ｋＤａ）、グリコシル化を多く受け、次いで小胞体（ＥＲ）で切断される。結果として生じるアルファペプチド鎖およびベータペプチド鎖は、成熟分泌ヘテロ二量体タンパク質（〜７５〜８０ｋＤａ）の形で５つのジスルフィド結合で結合されている。

【0027】

クラステリンのグリコシレーションは、異なるアイソフォームのクラステリンによって異なる。例えば、腎臓特異的クラステリンおよび血清クラステリンまたは血漿クラステリンは相異なるグリコシレーションパータンをもつことができる。このクラステリンのアイソフォーム間のグリコシレーションの違いは、クラステリンのあるアイソフォームをクラステリンの他のアイソフォームと識別するのに使用することができる。

【0028】

クラステリンアイソフォームは、例えば、哺乳類、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、サル、および他の動物において、本発明の方法を用いて識別することができる。識別は、例えば、１つ以上の第２のタイプのクラステリンアイソフォームの存在下で第１のクラステリンアイソフォームの存在または不在を決定することを含む。

【0029】

抗体
本発明の抗体はクラステリンに特異的に結合する抗体分子またはその抗原結合性フラグメントである。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはサルのクラステリンに特異的であることができる。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、どのタイプのクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン、血漿クラステリン、または血清クラステリン）に対しても特異的であることができる。本発明の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する。その他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、クラステリンの１つ以上のアイソフォーム、クラステリンのすべてのアイソフォーム、血清クラステリン、または血漿クラステリンに特異的に結合する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、一価抗体、二価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、または抗体の抗原もしくは特異的結合性フラグメントであることができる。抗体の抗原結合性フラグメントまたは特異的結合性フラグメントは、完全な抗体の抗原結合部位または可変領域を含んでなる完全な抗体の部分である。抗原結合抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｖ_LもしくはＶ_H領域またはＶ_L領域およびＶ_H領域を含んでなるフラグメント、ならびにＦ_vフラグメントが挙げられる。

【0030】

本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むいずれの抗体クラスとすることもできる。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、腎臓特異的クラステリン分子、血漿クラステリン分子、または血清クラステリン分子などのクラステリン分子の１つ以上のエピトープに結合する。抗体は、好適な実験動物において生体内で作製でき、または組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで作製することができる。抗体を調製し、特徴づける手段するは当該技術分野において周知である。例えば、Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37:7-56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12:125-68 (1992)を参照されたい。例えば、ポリクローナル抗体は、クラステリン分子またはクラステリン分子の一部をヒトもしくは他の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ロバ、またはウマなどの動物に投与することによって作製することができる。免疫した動物の血清が採取され、抗体は、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた後にアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにかけることによって血漿から精製される。ポリクローナル抗体を作成および加工する方法は当該技術分野において公知である。

【0031】

「特異的に結合する」または「に特異的な」とは、第１の抗原、例えば、クラステリンまたはその部分が、他の非特異的な分子に比べて大きいアフィニティーで抗体またはその抗原結合性フラグメントを認識し、それに結合することを意味する。非特異的な分子は第１の抗原と共通するエピトープを共有しない抗原である。本発明の実施形態では、非特異的な分子はクラステリンアイソフォームでなく、且つクラステリンに関連しない。例えば、非特異的な抗原と比べて効率的に結合する第１の抗原（例えば、クラステリン分子）に対して作製された抗体は、第１の抗原に特異的に結合すると称することができる。本発明の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、１０⁷ｌ／ｍｏｌ以上の結合親和力Ｋ_aで結合するときクラステリン分子またはその部分に特異的に結合する。本発明では、抗体または抗原結合性フラグメントはクラステリンの２つ以上のアイソフォームに特異的に結合することができ、またはクラステリンの１つのアイソフォーム、例えば、腎臓特異的クラステリンにのみに特異的に結合することができる。特異的な結合は、当該技術分野において周知である方法論を用いて、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量アッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタンブロットアッセイで調べることができる。

【0032】

本発明の抗体は、キメラ抗体（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号を参照されたい）、ヒト化抗体（例えば、Jones et al., Nature 321:522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593 (1992)を参照されたい）、イヌ化抗体、イヌ抗体、ヒト抗体であることができる。ヒト抗体は、例えば、直接的な不死化、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウス、またはトリメラ方法論によって作製することができ、例えば、Reisener et al., Trends Biotechnol. 16:242-246 (1998)を参照されたい。

【0033】

クラステリン分子を検出するためのアッセイは、１個の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたは１個以上の抗体もしくはフラグメント（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または１０個以上の抗体）を用いることができる。クラステリン用のアッセイには、例えば、クラステリンエピトープに特異的なモノクローナル抗体、１つのクラステリン分子のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の組合せ、相異なるクラステリンのエピトープに特異的なモノクローナル抗体、同一クラステリンエピトープに特異的なポリクローナル抗体、相異なるクラステリンエピトープに特異的なポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せを使用することができる。アッセイプロトコールは、例えば、標識抗体を用いて、例えば、競合、直接反応、またはサンドイッチタイプアッセイに基づくことができる。

【0034】

本発明の抗体は、例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、金属コロイド標識、放射性同位体標識、および生物発光標識を含む当該技術分野において公知であるどのタイプの標識でも標識することができる。

【0035】

クラステリンに特異的に結合する抗体としては、例えば、９Ｈ７、３Ａ４、２Ｆ２、クラステリンのアルファ鎖に特異的な抗体、クラステリンのベータ鎖に特異的な抗体、抗クラステリン尿アイソフォーム、Ｈｓ−３；３Ｒ３−２；ＣＬＩ−９；１Ａ１１；２Ｆ１２；Ａ４；７Ｄ１；３Ｒ３／２、クラステリンＣ末端抗体、クラステリンアイソフォームＩ抗体、ＣＬＵ（ＡＡ１〜３３３）（Ｎ末端）抗体、ＣＬＵ Ｎ末端（ＡＡ７９〜９９）抗体、ＣＬＵ（ＡＡ３１２〜３２５）抗体、ＣＬＵ（ＡＡ４４〜５８）抗体、ＣＬＵ（ＡＡ４０２〜５０１）抗体、ＣＬＵ（ＡＡ７５〜５０１）抗体、ＣＬＵ（ＡＡ３１２〜３２５）抗体；抗体ＬＳ−Ｂ６７５９、抗体ＬＳ−Ｂ３７６２、抗体ＬＳ−Ｂ２９３７およびＬＳ−Ｂ２８５２、抗体１６Ｂ５が挙げられる。抗体は、腎臓特異的クラステリンに、または腎臓特異的クラステリンと他の型のクラステリン（例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリン）との両方に特異的に結合することができる。

【0036】

レクチン
レクチンは、特異的な単糖またはオリゴ糖構造（炭水化物）を認識し、結合するタンパク質である。通常、レクチンは炭水化物ユニットに対する２つ以上の結合部位を含有する。あるレクチンの炭水化物結合特異性は、炭水化物に結合するアミノ酸残基によって決まる。レクチンの炭水化物に対する結合強度は、分子の相互作用の数とともに増加する可能性がある。レクチンの炭水化物に対する結合の解離定数は、Ｋ_dが約１０^-5〜１０^-7である。「特異的に結合する」または「に特異的な」とは、第１のレクチン、例えば、ＷＧＡが、他の非特異的なタイプの炭水化物に比べて強いアフィニティーで特異的なタイプの炭水化物（例えば、ＷＧＡについてはＮ−アセチルグルコサミン）を認識し、結合することを意味する。特異的なタイプの炭水化物は特異的なクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリンまたは種特異的クラステリン）と関連し、１つ以上の他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血清クラステリン）と顕著には関連しない。例えば、非特異的な炭水化物に比べて第１の特異的なタイプの炭水化物に効率的に結合するレクチンは、第１の特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合すると称することができる。本発明の実施形態では、レクチンが、非特異的な炭水化物の結合に比較して約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上低いＫ_dで第１の特異的なタイプの炭水化物に結合するとき、レクチンは非特異的な炭水化物に比べて第１の特異的なタイプの炭水化物に効率的に結合する。本発明の実施形態では、レクチンが約１０^-5〜１０^-7の解離定数Ｋ_dで結合するとき、レクチンは特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合する。本発明では、レクチンは２つ以上の特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合することができ、または１つの特異的なタイプの炭水化物にのみ特異的に結合することができる。

【0037】

レクチンは、例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、金属コロイド標識、放射性同位体標識、および生物発光標識を含む当該技術分野において公知であるどのタイプの標識でも標識することができる。

【0038】

本発明の実施形態では、腎臓特異的クラステリンに特異的に結合し、血漿または血清クラステリンに特異的に結合しないレクチンが使用される。本発明の実施形態では、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンが本発明で有用である。そのようなレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（小麦胚芽凝集素）、ＷＧＡ１、ＷＧＡ２、ＷＧＡ３、ｓＷＧＡ、ＤＳＬレクチン（シロバナヨウシュチョウセンアサガオレクチン）、マンノース結合レクチン、ＰＨＡ−Ｌ（インゲンマメ白血球凝集素）、ＰＨＡ−Ｅ（インゲンマメ赤血球凝集素）、およびＬＥＬ（トマトレクチン）が挙げられる。使用できる他のレクチンとしては、例えば、ジャカリン、ＳＴＬレクチン（ジャガイモ）、ＬＣＡレクチン（レンズマメ）、ＰＳＡレクチン（インゲンマメ凝集素）、ＥＣＬレクチン（アメリカデイゴ）、ＲＣＡレクチン（トウゴマ）、ＤＢＡレクチン（ドリコス）、ＳＢＡレクチン（ダイズ）、およびＣＯＮＡレクチン（コンカナバリン）が挙げられる。レクチンは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から市販されている。

【0039】

ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはサルのクラステリンアイソフォームの炭水化物に特異的に結合するレクチンを使用することができる。また、１つ以上の血漿、血清、または腎臓クラステリンアイソフォームに特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームに結合しないレクチンも使用することができる。

【0040】

第１のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない分子
本発明の実施形態では、第１のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリンまたは種特異的クラステリン、例えば、イヌ、ネコ、またはヒト腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子を本発明のアッセイに使用することができる。他のクラステリンアイソフォームは、例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリンであることができる。例では、腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子を本発明のアッセイに使用することができる。そのような分子としては、例えば、上で論じたレクチンおよびＮ−アセチルグルコサミンに特異的に結合する分子が挙げられる。

【0041】

「特異的に結合する」または「に特異的な」とは、第１の分子が、第１のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリンまたは種特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、１つ以上の他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しないことを意味する。第１の分子は、第１のクラステリンアイソフォームで生じ、１つ以上の第２のクラステリンアイソフォームで顕著に生じない特異的なタイプの炭水化物（例えば、細菌のキチン結合ドメイン３タンパク質のＮ−アセチルグルコサミン、そこにおいて、Ｎ−アセチルグルコサミンは、腎臓特異的クラステリンアイソフォームで生じ、血清クラステリンアイソフォームで顕著に生じない炭水化物である）を他の非特異的な炭水化物と比べて強いアフィニティーで認識し、結合する。例えば、非特異的な炭水化物に比べて第１の特異的なタイプの炭水化物に効率的に結合する第１の分子は、第１の特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合すると称することができる。

【0042】

本発明の実施形態では、第１のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない第１の分子は、非特異的な炭水化物への結合に比較して約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％以上低いＫ_dで第１の特異的なタイプの炭水化物に結合するとき、非特異的な炭水化物に比べて第１の特異的なタイプの炭水化物に効率的に結合する。他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない第１の分子とは、その分子が、第１のクラステリンアイソフォームの特異的な炭水化物部分を介して特異的に結合し、第２のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合せず、その結果、第１のクラステリンアイソフォームへの結合が第２のクラステリンアイソフォームの存在下で検出および／または定量でき、第２のクラステリンアイソフォームの存在が第１のクラステリンアイソフォームの検出および／または定量を著しく妨げないことを意味する。本発明の実施形態では、第１の分子が約１０^-5〜１０^-7の解離定数Ｋ_dで結合するとき、第１の分子は特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合する。本発明では、第１の分子は２つ以上の特異的なタイプの炭水化物に特異的に結合することができ、または１つの特異的なタイプの炭水化物にのみ特異的に結合することができる。

【0043】

本発明の実施形態では、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合する１つ以上の分子が、腎臓特異的クラステリンに特異的に結合するのに使用することができる。Ｎ−アセチルグルコサミンに結合する１つ以上の分子としては、例えば、野生型ＷＧＡ（小麦胚芽凝集素）、変異型のＷＧＡ（例えば、ＷＧＡ１、ＷＧＡ２、ＷＧＡ３、Parasuraman et al. J. Mol. Recognit. (2014) 27:482-92を参照されたい）、大麦レクチン（ＢＬ）、米レクチン、セイヨウイラクサ凝集素（Uritica dioica agglutinin, ＵＤＡ）、ヘベイン、インゲンマメキチナーゼ（ＰＶＣ）、ポテト傷害誘導性タンパク質１（potato wound-inducible protein 1, ＷＩＮ１）、ポテト傷害誘導性タンパク質２（potato wound-inducible protein 2, ＷＩＮ２）、ジャガイモキチナーゼ（ＳＴＣ）、タバコキチナーゼ（ＴＣ）、ポプラ傷害誘導性タンパク質（poplar wound-inducible protein, ＰＯＰ）、（例えば、コレラ菌（Vibrio cholera）、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella onedensis）、シェワネラ・バルティカ（Shewanella baltica）、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fascheri）、ビブリオ・タペティス（Vibrio tapetis）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）、エルシニア・アルドバーエ（Yersinia aldovae）の）細菌Ｎ−アセチルグルコサミン結合タンパク質Ａ（ＧｂｐＡ）、ＣＢＰ７０、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）Ｐｆ１２０、Ｐｆ８３、およびＰｆ４５ ＧｌｃＮＡｃ結合タンパク質、アルセノフォナス・ナソニエア（Arsenophonus nasonieae）ｎ−アセチルグルコサミン結合タンパク質、（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バークホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria）の）細菌キチン結合ドメイン３タンパク質、タマリンドのＮ‐アセチルグルコサミンキチナーゼ様レクチン、シロイヌナズナの師部タンパク質２（phloem protein 2, ＰＰ２、ＰＰ２−１Ａ１）、ストレプトマイセス・オリバセオビリディス（Streptomyces olivaceoviridis）ＮｇｃＥ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体関連タンパク質（urokinase plasminogen activation receptor-associated protein）／ＥＮＤＯ１８０、アメロゲニン、ならびに弱毒化マウスサイトメガロウイルスが挙げられる。

【0044】

アッセイ
本発明の方法は、生体試料または実験室試料などの試験試料中のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリンまたは種特異的クラステリン、例えば、イヌ、ヒト、またはネコの腎臓特異的クラステリン）を検出するのに使用することができる。試験試料は潜在的に（１）腎臓特異的クラステリン、（２）腎臓特異的クラステリンおよび血清クラステリン、（３）腎臓特異的クラステリンおよび１つ以上のタイプの他の非腎臓特異的クラステリン、（４）１つ以上のタイプの他の非腎臓特異的クラステリンを含むものであり得、または（５）クラステリンを含まないものであり得る。生体試料としては、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、サル、またはヒトなどの哺乳類の組織、尿、血液、血清、血漿、唾液、喀痰、糞便、脳脊髄液、羊水、または創傷滲出液を挙げることができる。試験試料は、未処理であってもよく、または沈殿させられていても、分画されていても、分離されていても、希釈されていても、濃縮されていても、精製されていてもよい。本発明の実施形態では、腎臓特異的クラステリンは血液、血漿、または血清に漏れて、そこで検出することができる。

【0045】

本発明の方法は、クラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合する分子（例えば、レクチン）と組み合わせてクラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメントを用いるアッセイを提供することによってクラステリンおよびクラステリンアイソフォームの検出を向上させるのに使用することができる。該方法は、１つ以上のクラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメントおよびクラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合する１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。１つ以上のクラステリン抗体またはその特異的結合性フラグメントとクラステリンの１つ以上の炭水化物部分に特異的に結合する１つ以上の分子との複合体は、感度、特異性、または両方が向上して検出される。感度または特異性は、約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以上向上することができる。

【0046】

ある実施形態では、本発明の方法は、特異的クラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリンまたは種特異的クラステリン）を検出するのに使用することができる。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する１つ以上の他の分子（例えば、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない分子）を、腎臓特異的クラステリンと、抗体またはその抗原結合性フラグメントと、腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する１つ以上の他の分子との複合体が形成できる条件下で試験試料と、接触させることを含んでなる。複合体はその後検出される。複合体の存在は腎臓特異的クラステリンの存在を示す。複合体が存在しないことは腎臓特異的クラステリンが存在しないことを示す。当業者は、複合体結合を検出するのに使用されるアッセイおよび条件に精通している。複合体は、例えば、１つ以上の腎臓特異的クラステリン分子、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体、および腎臓特異的クラステリンに特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンに特異的に結合しない１つ以上の他の分子は含んでなることができる。他の型のクラステリンは、例えば、血液由来の、非腎臓特異的クラステリンアイソフォームであることができる。複合体の量を決定することができ、疾患の重症度を確立するのに用いることができる。

【0047】

本発明のアッセイは、例えば、腎臓特異的クラステリンを他のタイプのクラステリンアイソフォームと識別する、試料中の腎臓特異的クラステリンを検出する、試料中の腎臓特異的クラステリンを定量する、１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン、血清クラステリン、血漿クラステリン、種特異的クラステリンアイソフォーム）を他のクラステリンアイソフォームと識別する、試料中のクラステリンアイソフォームを定量する、または試料中の特異的クラステリンアイソフォームを検出するのに使用することができる。

【0048】

本発明の実施形態は、１つ以上のクラステリンアイソフォームを他のタイプのクラステリンアイソフォームと識別する方法を提供する。該方法は、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子と、試料を接触させることを含んでなる。クラステリンの１つ以上のアイソフォーム、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子を含んでなる複合体が検出される。１つ以上のクラステリンアイソフォームは、哺乳類、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはサルクラステリンアイソフォームであることができる。

【0049】

競合アッセイを本発明の方法で使用することができる。例えば、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントを支持体に固相化することができる。検出可能に標識されたレクチンに結合された腎臓特異的クラステリンおよび腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する非標識のレクチンで処理された試料が支持体に加えられる。１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合していない検出可能に標識されたレクチン−腎臓特異的クラステリンの量が検出される。１つ以上の抗体または抗原結合性フラグメントに結合していない検出可能に標識されたレクチン−腎臓特異的クラステリンの量は、試料中の腎臓特異的クラステリンの量に比例する。代替的に、１つ以上の抗体または抗原結合性フラグメントに結合していない検出可能に標識されたレクチン−腎臓特異的クラステリンは洗い落とされ、残留する検出可能に標識されたレクチン−腎臓特異的クラステリンが検出される。代替的に、アッセイは支持体に固相化しているクラステリンアイソフォームに特異的に結合する１つ以上のレクチンで始めることができる。クラステリンに特異的に結合する１つ以上の検出可能に標識された抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合された腎臓特異的クラステリンは、腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する非標識の抗体で処理された試料とともに支持体に加えられる。検出は上記のように達成される。

【0050】

本発明の方法は、例えば、腎疾患または腎損傷の疑いがあるヒトまたは哺乳類から試験試料を得ることによって、腎疾患、腎障害、または腎損傷の診断または検出に使用することができる。該方法は、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体および１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）に特異的に結合しない１つ以上の分子と、哺乳類の試料を接触させることを含んでなる。当業者は複合体の形成を可能にし、その形成に適した条件を知っている。腎臓特異的クラステリンと、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体と、クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する他のクラステリンアイソフォームに特異的に結合しない１つ以上の分子との複合体が検出される。複合体が検出された場合、哺乳類は腎疾患、腎障害、または腎損傷と診断される。複合体の量は当該技術分野において公知であるいずれの方法論でも決定することができる。対照試料で形成されるレベルより高いレベルは、腎損傷、腎障害、または腎疾患を示す。対照試料は、腎臓特異的クラステリンを含有しない試料、または腎疾患、腎障害、もしくは腎損傷のないヒトまたは哺乳類で見られるレベルで腎臓特異的クラステリンを含有する試料のいずれかである。両方のタイプの対照試料がアッセイで使用することができる。哺乳類に腎疾患または腎損傷がある場合、腎治療法または腎治療薬を哺乳類に施行することができる。

【0051】

ある実施形態では、イヌ腎臓特異的クラステリンは、１つ以上のクラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のＰＨＡ−Ｌ、ＷＧＡ、ｓＷＧＡ、ＳＴＬ、ＬＥＬ、ＰＨＡ−Ｅ、またはＤＳＬレクチンで検出することができる。ある実施形態では、ネコ腎臓特異的クラステリンは、１つ以上のクラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のジャカリン、ＥＣＬ、ＬＣＡ、ＲＣＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＷＧＡ、ＰＳＡ、ＤＳＬ、ＤＢＡ、ＰＨＡ−Ｌ、ＳＢＡ、またはＣＯＮＡレクチンで検出することができる。ある実施形態では、ネコおよびイヌ腎臓特異的クラステリンは、１つ以上のクラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のＷＧＡ、ｓＷＧＡ、ＤＳＬ、ＰＨＡ−Ｌ、またはＰＨＡ−Ｅレクチンで検出することができる。ある実施形態では、ヒトおよびネコ腎臓特異的クラステリンは、１つ以上のクラステリン抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のＰＳＡまたはＤＢＡレクチンで検出することができる。

【0052】

腎損傷、腎障害、および腎疾患としては、例えば、急性腎障害（ＡＫＩ；３か月未満の血液検査および尿検査もしくは組織像のいかなる異常を含む腎損傷の機能的かつ構造的障害もしくは徴候）、進行もしくは悪化する急性腎障害、初期ＡＫＩ、軽度ＡＫＩ、中等度ＡＫＩ、重症ＡＫＩ、慢性腎臓病（chronic renal/kidney disease）、糖尿病性腎症、急性尿細管壊死、急性間質性腎炎、糸球体腎症、糸球体腎炎、近位尿細管損傷および遠位尿細管損傷、腎血管炎、腎動脈の閉塞、腎虚血障害、腫瘍崩壊症候群、横紋筋融解症、尿路閉塞、腎前性高窒素血症、腎静脈血栓症、心腎症候群、肝腎症候群、肺腎症候群、腹部コンパートメント症候群、尿路感染症、上部尿路感染症、下部尿路感染症、腎毒性薬剤による損傷、膀胱がん、腎臓がん、泌尿器がん、または造影剤による腎障害が挙げられる。

【0053】

本発明の方法は、腎疾患、腎障害、および腎損傷を既知の方法（例えば、血清クレアチニンアッセイ）に比べて早期に検出することができる。本発明の方法は、腎疾患、腎障害、および腎損傷の発症の約５日、４日、３日、２日、１日、またはそれ未満のうちに腎疾患、腎障害、および腎損傷を検出することができる。

【0054】

本発明の実施形態では、１つ以上の抗体、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血清クラステリン、血漿クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子、または両方に結合されている酵素結合体または他の検出可能な標識などの検出可能な標識が検出可能な反応を触媒または形成するとき、複合体が検出される。随意に、シグナル生成化合物を含んでなる１つ以上の検出可能な標識は、検出可能な標識複合体の形成を可能にする条件下で複合体に適用することができる。検出可能な標識複合体は、クラステリン、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメント、クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子、および１つ以上の検出可能な標識分子を含んでなる。検出可能な標識複合体が検出される。随意に、１つ以上の抗体またはクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子は、検出可能な標識複合体の形成前に検出可能な標識でラベルすることができる。該方法は随意に陽性対照群または陰性対照を含んでなることができる。

【0055】

また、クラステリン、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子を含んでなる複合体は、標識または検出可能な標識試薬を必要としない方法を用いても検出することができる。例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー、コーニングＥＰＩＣ（商標）バイオセンサー、または比色共鳴反射（colorimetric resonant reflectance）バイオセンサーが使用されて、標識することなく本発明の複合体を検出することができる。

【0056】

本発明の１つの実施形態は、１つ以上のクラステリン分子、クラステリンと特異的に結合する１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメント、および１つ以上のレクチンを含んでなる複合体を含んでなる。複合体は、１つ以上の腎臓特異的クラステリン分子、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体または抗原結合性フラグメント、および腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に結合しない１つ以上の分子を含んでなることができる。複合体は随意に、複合体のいずれかの構成要素に共有結合的または非共有結合的に結合される１つ以上の検出可能な標識を含んでなることができる。複合体は固体支持体に固相化することができる。

【0057】

本発明の実施形態では、クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体は固相または基材に固相化される。試験試料は基材に加えられる。腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子は、試験試料が基材に加えられる前、試験試料とともに、または試験試料が基材に加えられた後に基材に加えられる。腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子は検出可能に標識することができる。洗浄ステップを基材への各添加の前に行うことができる。検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識と反応するように加えられた発色団または酵素基質を介して直接的に検出または間接的に検出することができる。検出可能な反応（例えば、発色）が進む。反応を止め、検出可能な反応は、例えば、分光光度計を用いて定量することができる。このタイプのアッセイは試験試料中の腎臓特異的クラステリンの量を定量することができる。

【0058】

本発明の実施形態では、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子は固相または基材に付けられる。試験試料は基材に加えられる。腎臓特異的クラステリンに特異的に結合する１つ以上の抗体は、試験試料が基材に加えられる前、試験試料とともに、または試験試料が基材に加えられた後に、基材に加えられる。１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、検出可能に標識することができる。洗浄ステップを基材への各添加の前に行うことができる。抗体標識は、例えば、検出可能な標識と反応するように基材に加えられた発色団または酵素基質を介して直接的に検出または間接的に検出することができる。検出可能な反応（例えば、発色）が進む。検出可能な反応を止め、反応は、例えば、分光光度計を用いて定量することができる。このタイプのアッセイは試験試料中の腎臓特異的クラステリンの量を定量することができる。

【0059】

本発明の実施形態では、第２のクラステリンアイソフォーム（または複数の他のクラステリンアイソフォーム）をより良好に検出するために、試料から第１のクラステリンアイソフォーム（または複数のクラステリンアイソフォーム）を枯渇させる。試料は、第１のクラステリンアイソフォームに特異的に結合する１つ以上のレクチンと接触し、その結果１つ以上のレクチンと１つ以上の第１のクラステリンアイソフォームとの複合体が形成される。１つの例では、ＤＣ−ＳＩＧＮレクチンは、精液クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合するが、血清クラステリンの炭水化物部分に結合しない。代替的に、試料は、第１のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、第２のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と接触し、その結果、第１のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合し、第２のクラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、１つ以上の第１のクラステリンアイソフォームとの複合体が形成することができる。次いで、複合体は随意に、例えば、沈殿によって試料から除去することができる。第２のクラステリンのためのアッセイは、例えば、本発明のいずれのアッセイを用いても行うことができる。代替的に、第２のクラステリンアイソフォームのためのいずれのアッセイも、第１のクラステリンアイソフォームが試料から枯渇した時点で行うことができる（例えば、試料を１つ以上のクラステリン特異的抗体と接触させることおよびクラステリン／抗体複合体の検出）。２つの抗体を用いるサンドイッチアッセイまたは１つの抗体を用いる直接アッセイを使用することができる。

【0060】

本発明の実施形態では、腎臓特異的クラステリンをより良好に検出するために、試料から非腎臓特異的クラステリンを枯渇させる。試料は、１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム（例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォーム）に特異的に結合する１つ以上のレクチンと接触し、その結果１つ以上のレクチンと１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォームとの複合体が形成される。ＷＧＡは血漿クラステリンに結合せず、腎臓特異的クラステリンに結合する。代替的に、試料は、非腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と接触し、その結果、非腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分アイソフォームに特異的に結合し、腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子と、１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォームとの複合体が形成することができる。次いで、複合体は試料から除去することができる。腎臓特異的クラステリンのためのアッセイは、例えば、本発明のいずれのアッセイを用いても行うことができる。代替的に、腎臓特異的クラステリンのためのいずれのアッセイも、非腎臓特異的クラステリンアイソフォームが試料から枯渇した時点で行うことができる（例えば、試料を１つ以上のクラステリン特異的抗体と接触させることおよびクラステリン／抗体複合体の検出）。２つの抗体を用いるサンドイッチアッセイまたは１つの抗体を用いる直接アッセイを使用することができる。

【0061】

本発明のアッセイとしては、限定されないが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、ウェスタンブロッティング、ＩＦＡ、放射免疫定量アッセイ（ＲＩＡ）、赤血球凝集アッセイ（ＨＡ）、凝集アッセイ、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、およびマイクロタイタープレートアッセイ（マイクロタイタープレートの１つ以上のウェルで行われるいずれのアッセイ）を含む競合、直接反応、またはサンドイッチタイプアッセイに基づいたものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１つのアッセイは、可逆フロークロマトグラフィー結合アッセイ（reversible flow chromatographic binding assay）、例えば、ＳＮＡＰ（商標）アッセイを含んでなる。米国特許第５，７２６，０１０号を参照されたい。

【0062】

アッセイは固相、基材、もしくは支持体を用いることができ、または免疫沈降もしくは支持体を用いない他のいずれの方法によって行うことができる。固相、基材、または支持体が使用される場合、１つ以上の抗体、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子、またはその組合せは、マイクロタイターウェル、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、カラム、マトリックス、膜、ガラス、ポリスチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、マグネタイト、合成または天然繊維から成る繊維マット（例えば、ガラスもしくはセルロース系材料またはポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステルなどの熱可塑性ポリマー）、粒子材料から成る焼結構造体（例えば、ガラスもしくはさまざまな熱可塑性ポリマー）、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホンなどから構成されるキャスト膜フィルム（一般に天然で合成）などの支持体または基材に直接的または間接的に付けられる。本発明の実施形態では、基材は焼結され、多孔性ポリエチレンとして一般に知られているポリエチレンの微粒子、例えば、Ｃｈｒｏｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（アルバカーキ、ニューメキシコ州）の１０〜１５マイクロメートル（micron）多孔性ポリエチレンである。これらの基材材料のすべては、フィルム、シート、またはプレートなどの好適な形状で使用することができ、または紙、ガラス、プラスチックフィルム、もしくは織物などの適切な不活性担体にコーティングもしくは結合もしくはラミネートされてもよい。抗体、タンパク質、およびレクチンを固相に固相化する好適な方法としては、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合性相互作用などが挙げられる。

【0063】

１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のクラステリンアイソフォーム（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない抗体、レクチン、または分子は、分子がその選択的結合活性を保持するように、例えば、吸着によって、または共有結合によって固体支持体に固定することができる。随意に、分子の結合部位がアクセス可能な状態で残るようにスペーサー基を含むことができる。固相化された分子は、唾液、血清、喀痰、血液、尿、糞便、脳脊髄液、羊水、創傷滲出液、または組織を含む生体試料などの試料のクラステリン分子に結合するのに使用することができる。

【0064】

複合体（例えば、以下の１つ以上の複合体：（１）クラステリン、抗体またはその抗原結合性フラグメント、１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的アイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない分子；（２）検出可能な標識、クラステリン、抗体またはその抗原結合性フラグメント、１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子）の形成は、例えば、放射測定、比色分析、蛍光定量、サイズ分離、バイオセンサー法、沈殿法、または標識を用いない方法によって検出することができる。随意に、複合体の検出は検出可能な標識に結合している二次抗体の添加によって行うことができる。複合体に結合するシグナル生成化合物を含んでなる検出可能な標識は上記の方法を用いて検出でき、発色物質、酵素結合体などの触媒、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光組成物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウム、およびルミノールなどの化学発光化合物、放射性元素、直接的可視標識、ならびに補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。酵素結合体としては、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は決定的には重要ではないが、単独または１つ以上のさらなる物質と併せてシグナルを発生できることになる。

【0065】

複合体の形成は、試験試料中の１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の存在を示す。本発明の方法は試験試料中の１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の量または数量を示すことができる。酵素結合体などの多くの検出可能な標識では、存在するクラステリンの量は生成されたシグナルに比例する。試験試料のタイプに応じて、試験試料は、好適なバッファー試薬で希釈したり、濃縮したり、または一切の操作なしに固相と接触させることができる。例えば、クラステリンの有無および／または量を決定するために、試験試料を希釈または濃縮することができる。

【0066】

また、本発明のアッセイは、腎疾患、腎障害、または腎損傷の改善の経過をモニターするのにも使用することができる。対象の検査試料中の腎臓特異的クラステリン増加または減少を測定することによって、疾患または損傷の改善を目的とした特定の治療計画が有効か否かを決定することができる。

【0067】

キット
さらに本発明は、腎臓特異的クラステリンを検出するためのアッセイキット（例えば、製品）を含んでなる。キットは、本発明の１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメント、１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿クラステリン、血清クラステリン、または血液由来、非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子、ならびに抗体、１つ以上の他の分子、および試料中のクラステリンの特異的結合を決定するための組成物を含んでなることができる。これらの構成要素は１つ以上の検出可能な標識を含んでなることができ（すなわち、検出可能な標識は１つ以上の構成要素に固相化することができる）、または検出可能な標識は別に用意することができる。キットは、本発明の１つ以上の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび１つ以上のクラステリンアイソフォーム（例えば、腎臓特異的アイソフォーム）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子を含有する装置、ならびに、例えば、哺乳類の腎疾患、腎障害、または腎損傷の特定にこれらの分子を使用するための取扱説明書を含んでなることができる。キットは、１つ以上の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントを含む支持体、またはクラステリンの１つ以上のアイソフォーム（例えば、腎臓特異的クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリン（例えば、血漿もしくは血清クラステリン）の炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子を含む支持体、または支持体に固相化された両者を含んでなることができる。またキットは、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子およびキットの抗体が、腎疾患、腎障害、または腎損傷を特定するのに使用できることを示すラベルを含んでなる包装材料を含んでなることができる。当業者に既知のバッファー、対照（例えば、腎臓特異的クラステリンといった陽性対照；血漿クラステリン、血清クラステリン、またはバッファーといった陰性対照）などの他の構成要素をそのような検査キットに含むことができる。本発明の、腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、他のアイソフォームのクラステリンの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の他の分子、抗体、アッセイ、およびキットは、例えば、患者における腎疾患、腎障害、または腎損傷の個々の事例の診断および腎疾患、腎障害、または腎損傷の疫学研究に有用である。

【0068】

またキットは、１つ以上のレクチンと１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォームとでの複合体の形成のための１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォーム（例えば、血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォーム）に特異的に結合する１つ以上のレクチンを含んでなることができる。またキットは、１つ以上の非腎臓特異的クラステリンアイソフォームと１つ以上の分子との間での複合体形成のための非腎臓特異的クラステリンの炭水化物部分に特異的に結合し、腎臓特異的クラステリンアイソフォームの炭水化物部分に特異的に結合しない１つ以上の分子を含んでなることができる。

【0069】

本明細書においていずれに言及されている特許、特許出願、および他の科学文書または技術文書は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書で具体的に開示されていない、いずれの要素または複数の要素、限定または複数の限定の不在下において適切に実行することができる。よって、例えば、本明細書の各例では、「含んでなること（comprising）」、「から本質的になること（consisting essentially of）」、および「からなること（consisting of）」という用語は、それらの通常の意味を保持しつつ、他の２つの用語のいずれかと置換しうる。使用されている用語および表現は限定の用語としてではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、図示および記載された特徴のいずれの等価物またはその一部を除外する意図はなく、さまざまな修正が、特許請求されている本発明の範囲内で可能であることが理解される。よって、本発明は実施形態によって具体的に開示されているが、本明細書で開示された概念の随意の特徴、修正、変形が当業者によって用いられ、そのような修正および変形は明細書および添付の請求項によって規定された本発明の範囲内にあると見なされることが理解されるべきである。

【0070】

くわえて、本発明の特徴または態様が代替案のマーカッシュ群または他のグルーピングの点から記載されている場合、それによって本発明はマーカッシュ群または他の群のいずれの個々の構成要素または構成要素の部分群（subgroup）の点からも記載されていることを当業者なら理解するであろう。

【0071】

以下は例示目的でのみ提供され、上記で大まかに記載された本発明の範囲を限定することを意図されていない。

【実施例】

【0072】

実施例１
血液混入
正常イヌ血清を陰性尿（すなわち、健康なイヌの尿）にスパイクし、クラステリンの量を市販のクラステリンＥＩＡ（バイオベンダー社）を用いて測定した。図１Ａ〜Ｂに示されるように、１：１０００希釈（１ｍｌに１μｌ）においてでさえも顕著なクラステリンレベルが測定される。したがって、血清クラステリンまたは血漿クラステリンアイソフォームのいかなる検出も排除する一方で、腎臓特異的クラステリンアイソフォームが検出できることが重要である。

【0073】

実施例２：材料
クラステリン分子の単離
イヌクラステリンの配列を使用して、組換えヒスチジンタグ付きイヌクラステリン分子を発現するベクター（ライフテクノロジーズ社）を設計および合成した。タンパク質を発現および精製した後、配列をＬＣ−ＭＳで確認した。本明細書においてこの分子を組換えクラステリンまたはヒスチジンタグ組換えクラステリンと呼ぶ。

【0074】

血漿クラステリンは３０頭のイヌのプールした血漿からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞由来クラステリン（腎臓特異的クラステリンである）を、ＭＤＣＫ細胞を１２５ｍｌのＴフラスコ中で３７℃、７．５％ＣＯ₂にて抗生物質を含む１×ＭＥＭ補充培地でコンフルエント状態まで培養することによって得た。上清を回収し、クラステリンを、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗クラステリンカラムに通してアフィニティー精製した。

【0075】

腎臓特異的クラステリンは腎臓に急性損傷の疑いがあるイヌからプールした尿からアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

【0076】

抗体調製
血漿由来クラステリンに対するポリクローナル抗血清をウサギで作製した。モノクローナル抗体は複数の型のクラステリンを免疫原として用いてマウスで生成した（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｓｅ，Ｉｎｃ社、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）。さまざまな型には、組換え全分子クラステリン、クラステリンのアルファ鎖、クラステリンのベータ鎖、血漿由来クラステリン、ＭＤＣＫ由来クラステリン、および（腎臓特異的クラステリンである）尿由来クラステリンが含まれた。

【0077】

免疫アフィニティークロマトグラフィー
組換えクラステリンを使用してウサギを免疫した。抗クラステリンＩｇＧをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。抗組換えクラステリンＩｇＧ抗体を使用してイヌ血漿プールから天然血漿クラステリンをアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。モノクローナル抗体はマウスを血漿クラステリンで免疫することによって作製し、結果として得た抗クラステリンＩｇＧ抗体をプロテインＡクロマトグラフィーで精製した。

【0078】

検出抗体
抗クラステリン（血漿固有）モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を標準的なＳＭＣＣ化学（サーモ−ピアス社）によって西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。

【0079】

クラステリン標準
ＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ）の培養上清またはプールしたイヌ血漿からクラステリンをアフィニティークロマトグラフィーで精製した。結果として得たクラステリンをＬＣＭＳで定量した。値（ｍｇ／ｍｌ）を代入し、標準曲線および対照を作成した。

【0080】

実施例３：一般的なクラステリンアッセイプロトコール
アッセイバッファー（１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ（商標）（ポリソルベート）２０）を含有する１×ＰＢＳ）で５００ｎｇ／ｍｌの標準を連続希釈してクラステリンの標準曲線を作成した。尿試料をアッセイバッファーで１：１００に希釈して、プレート上で１００μｌを２つ組で周囲温度にて１時間インキュベーションした。３回洗った後、ＰｅｔＣｈｅｋ（商標）バッファー（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、１００μｌの、西洋ワサビペルオキシダーゼでラベルした抗クラステリン抗体を周囲温度で３０分間インキュベーションした。上記のように３回洗った後、５０μｌのＴＭＢ基質（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加え、５分間発色させた。１００μｌの酸（１Ｎ ＨＣＬ）を添加することによって発色反応を止めた。すぐにプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0081】

クラステリンコーティングプレート
マイクロタイタープレートを、５μｇ／ｍｌの血漿クラステリン、ＭＤＣＫ由来クラステリン、組換えヒスチジンタグクラステリン、およびＢＳＡで、０．０５Ｍ炭酸塩バッファー、ｐＨ９．５中にて４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（商標）（ポリソルベート）２０（０．１％）で３回洗った後、プレートをＰＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロックした。さらにＰＢＳＴで３回洗った後にプレートを真空下で４時間乾燥した。

【0082】

レクチンコーティングプレート
ビオチン標識レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）をＰＢＳ、ｐＨ７．４中に５μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌをストレプトアビジンでコーティングされたプレート（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）のウェルに加えた。４℃で一晩結合させた後、プレートをＰＢＳＴで３回洗った。プレートはすべて、使用するまで４℃で保存、乾燥した。

【0083】

実施例４：クラステリンレクチン特異性
クラステリンでコーティングしたマイクロタイタープレートをＰＢＳＴ中１μｇ／ｍｌのビオチン標識レクチンで１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗った後、１００μｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジンをプレート振とう器上で周囲温度にて３０分間インキュベーションした。ＰＢＳＴでさらに３回洗った後、１００μｌのＴＭＢ基質を加え、５分間インキュベーションし、１００μｌの１Ｎ ＨＣＬで反応を止めた。プレートを４５０で読んだ。

【0084】

【表2】

【0085】

表２に、クラステリン調製物の特異的なレクチンに対する反応性をＯ．Ｄ．４５０ユニットで示す。ＯＤ＞０．５をレクチンに対する陽性反応として使用した。非グリコシル化されたタンパク質、ヒスチジンタグクラステリン、およびＢＳＡの結合が値＜０．４Ｏ．Ｄ．ユニットという結果になったので、このＯ．Ｄ．を選んだ。ＭＤＣＫ／血漿結合の比をとり、比＞２．０をさらなる特徴付けに選んだ。４つのレクチン、ＰＨＡ−Ｅ、ＰＨＡ−Ｌ、ＷＧＡ、およびＬＥＬがこの基準を満たした。小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）をさらなる特徴付けに選んだ。

【0086】

実施例５：腎臓特異的クラステリンの検出の実現可能性
さまざまな型のクラステリン（ＭＤＣＫ由来クラステリン、天然血漿クラステリン、および組換えヒスチジンタグクラステリン）をアッセイバッファーに連続希釈し、ＨＲＰ標識抗クラステリンモノクローナル抗体で検出した。図２は、用量依存的にＭＤＣＫ由来クラステリン調製物のみが結合することを示す。炭水化物をもたないヒスチジンタグを付けた組換えクラステリンおよび炭水化物を含有する天然血漿クラステリンは、試験したどの濃度でもレクチン固相に結合しない。

【0087】

腎臓特異的クラステリンに対するレクチンの特異性
天然血漿クラステリン、ＭＤＣＫ由来クラステリン、および尿由来クラステリン試料をアッセイバッファーに１μｇ／ｍｌに希釈し、相異なるレクチン固相上で抗クラステリンＨＲＰモノクローナル抗体を用いて検出した。下記表３は、ＭＤＣＫ由来クラステリンおよび尿から精製したクラステリンのみがＷＧＡ固相に結合することを示す。サクシニル化ＷＧＡ（ｓＷＧＡ）に対する結合の減少があり、シアル酸残基は結合に関与していないことを示唆した。

【0088】

【表3】

【0089】

血漿由来クラステリンはレクチン固相に結合できないので、ポリクローナル抗クラステリン抗体およびモノクローナル抗クラステリン抗体はともに、複数のレクチン固相に結合されたＭＤＣＫ由来クラステリンに結合でき、血漿源由来のクラステリンに結合しない。ＷＧＡは腎臓特異的クラステリン（ＭＤＣＫ由来および尿）に特異的である。

【0090】

次いで、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体によって固相に捕捉されたクラステリン抗原についてレクチンをスクリーニングした。３Ａ４モノクローナル抗体、９Ｈ７モノクローナル抗体、２Ｅ２モノクローナル抗体、２Ｆ２モノクローナル抗体、抗アルファ鎖クラステリンポリクローナル抗体、抗ベータ鎖クラステリンポリクローナル抗体、または抗尿クラステリンポリクローナル抗体を固相に固相化した。ＭＤＣＫ由来クラステリンまたは血漿由来クラステリン（１μｇ／ｍｌ）を、ビオチン標識したＷＧＡ、ｓＷＧＡ、Ｐｈａ−Ｌ、Ｐｈａ−Ｅ、またはバッファー対照とともに固相に加えた。結果を表４に示す。

【0091】

【表4】

【0092】

モノクローナル抗体、および９Ｈ７ポリクローナルクラステリン抗ベータ鎖、およびポリクローナルクラステリン抗尿が、最も良好な感度を示す。ＷＧＡ、Ｐｈａ−Ｌ、Ｐｈａ−Ｅは特異的にＭＤＣＫ由来クラステリンに結合し、特異的に血漿由来クラステリンに結合しなかった。

【0093】

ＷＧＡ（５μｇ／ｍｌ）、ｓＷＧＡ（５μｇ／ｍｌ）、ポリクローナル抗血漿クラステリン抗体、またはバッファーを固相に結合させた。血漿由来クラステリン（１μｇ／ｍｌ）、ＭＤＫＣ由来クラステリン（１μｇ／ｍｌ）、尿由来クラステリン（１μｇ／ｍｌ）、またはバッファーを加えた。結果を表５に示す。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたモノクローナル抗体９Ｈ７（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。特異的結合が検出された。ＭＤＣＫ由来クラステリンおよび尿由来クラステリンは、固相化されたＷＧＡに特異的に結合し、９Ｈ７抗体によって検出された。血漿由来クラステリンは、固相化されたＷＧＡに特異的に結合せず、９Ｈ７抗体によって検出されなかった。結果を表５に示す。

【0094】

【表5】

【0095】

新鮮に調製した血清を尿にスパイクし、サンドイッチ免疫複合体の形成を、固相化されたＷＧＡレクチンおよびｓＷＧＡレクチンを含んでなる固相を用いて調べた。レクチンおよび腎臓特異的クラステリン複合体がＨＲＰ結合９Ｈ７モノクローナル抗体で検出された。結果を表６に示す。ＭＤＣＫ由来クラステリンが尿にスパイクされた場合のみ、複合体（ＷＧＡ、腎臓特異的クラステリン、および抗体）が形成され、血清が尿に０．１〜１０％スパイクされた場合は、顕著な反応性がないことを結果は示唆する。したがって、血清クラステリンはそのアッセイで検出されない。

【0096】

【表6】

【0097】

ヒスチジンタグ組換えクラステリン、血漿由来クラステリン、およびＭＤＣＫ由来クラステリン試料を、ＤＤＴを用いて還元してクラステリンのアルファ鎖とベータ鎖を分離させるか、または非還元のまま残した。ウェスタンブロットでは、モノクローナル抗体９Ｈ７はＭＤＣＫ由来クラステリンと血漿由来クラステリンの両方に結合することを示した。しかし、ＷＧＡレクチンは非還元または還元ＭＤＣＫ由来クラステリンにのみ結合する。表７を参照されたい。ＷＧＡは、非還元または還元ヒスチジンタグ組換えクラステリンにも、非還元または還元血漿由来クラステリンにも結合しなかった。

【0098】

【表7】

【0099】

実施例６：血尿症の猟犬（Field Dogs）におけるクラステリンレベル
健康なイヌの尿を血液の有無についてＵＡディップスティック（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）で調べた。腎臓特異的クラステリンレベルを製造業者の取扱説明書（Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）に従って市販のクラステリンＥＩＡを用いて測定した。下に示されるように（表８）、尿に検出可能な血液がない健康なイヌはクラステリンのレベルが基準範囲（７０ｎｇ／ｍｌ）内であった一方で、血液混入があったイヌ（試料５〜８）はクラステリンレベルが１０〜１００倍正常基準範囲を超えていた。この結果は、尿中の血液の存在が高いクラステリン測定結果をもたらし、偽陽性につながりうることを示す。

【0100】

【表8】

【0101】

実施例７：腎臓特異的クラステリン免疫アッセイの特異性
血漿から精製したイヌクラステリンに対して作製したモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ、カッパ）および小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を用いて腎臓特異的クラステリン免疫アッセイ（ＫＳＣＩ）を設計した。ＷＧＡをマイクロタイタープレートのウェルにコーティングした。モノクローナル抗体をＨＲＰで標識した。ＫＳＣＩの特異性を示すために、健康なイヌの新鮮な全血または血漿をバッファーにスパイクし、ＫＳＣＩと市販のクラステリンＥＩＡ（バイオベンダー社）アッセイの両方を用いて分析した。

【0102】

図３に示されるように、クラステリンは全血でも血清でも市販のクラステリンＥＩＡによって高濃度で検出されたが、ＫＳＣＩでは検出されなかった。高い割合の健康なイヌおよびネコの尿試料に血液混入があることを考慮すると、クラステリンを正確に測定する唯一の方法は腎臓特異的クラステリン免疫アッセイを使用することである。

【0103】

実施例８：イヌゲンタマイシンモデルにおける腎臓特異的クラステリン
腎臓特異的クラステリンをイヌゲンタマイシンモデルの尿で測定した（図４）。該モデル系では、イヌに５日間、毎日４０ｍｇ／ｋｇのゲンタマイシンを与えた。このイヌモデルでは、血清クレアチニンが試験を通してずっと本質的に変わらなかった一方で、尿中の腎臓特異的クラステリンは急速に増加し、投与終了時には、ベースラインの約５倍に達し、１１日目にはベースラインの約１０倍でピークとなった。このことから、活動性腎障害に関して、血清クレアチニンと比べて腎臓特異的クラステリンのほうが、より早期で且つより感度の高いマーカーであることが示された。

【0104】

実施例９：活動性腎臓障害の患者における腎臓特異的クラステリン
腎臓特異的クラステリンを炎症または虚血によって誘発された活動性腎障害で病院に受診したイヌの尿で測定した（図５）。データは、健康な患者と活動性腎障害と診断されたものとの間の腎臓特異的クラステリンの濃度の明らかな隔たりを示す。結論として、腎臓特異的クラステリンは、感度が高く且つ特異的な活動性腎障害のマーカーである。

【0105】

実施例１０：尿路感染症患者における腎臓特異的クラステリン
腎臓特異的クラステリンを尿路感染症（ＵＴＩ）のネコおよびイヌで測定した（図６）。腎臓特異的クラステリンレベルはＵＴＩ患者のサブセットで劇的に増加した。腎臓特異的クラステリンはＵＴＩのマーカーである。

【0106】

実施例１１：ネコにおける腎臓特異的クラステリン
ネコクラステリンはネコ腎臓ＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）から単離した。可溶性ネコクラステリンの分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロッティングおよびレクチンスクリーニングアレイを用いて行った。

【0107】

イヌ腎臓細胞株およびネコ腎臓細胞株（それぞれ、ＭＤＣＫおよびＣＲＦＫ）からの上清ならびにイヌ血漿から精製したクラステリン調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ニトロセルロースにブロットした。ブロットをイヌクラステリンに対して作製した抗クラステリンモノクローナル抗体でプローブした。結果（図７）は、モノクローナル抗体はＣＲＦＫによって産生されたネコクラステリンと交差反応したことを示す。よって、モノクローナル抗体は、ツーサイト（two site）免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットでネコ腎臓クラステリンの検出に使用することができる。

【0108】

ネコの臨床試料に対するレクチンのスクリーニング
ビオチン標識レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ社）をＰＢＳＴ（０．０１％ツイーン２０（商標）（ポリソルベート））中で１μｇ／ｍｌで、ストレプトアビジンでコーティングされたプレートに４℃にて一晩コーティングした。プレートを３回洗い、血漿からアフィニティー精製したネコクラステリン（１μｇ／ｍｌ）または１：１０に希釈したネコの臨床尿を周囲温度で１時間インキュベーションした。３回洗った後、ＨＲＰで標識した、イヌクラステリンに対して作製したモノクローナル抗体（２５０ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、上記のように３０分間インキュベーションした。さらに３回洗った後、１００μｌのＴＭＢを加え、５分間発色させた後、１００μｌの１Ｎ ＨＣＬを加えて反応を止めた。吸光度を４５０ｎｍで読んだ。結果を表９に示す。

【0109】

【表9】

【0110】

１２個のレクチン（太字）がネコクラステリンおよび抗クラステリンモノクローナル抗体とサンドイッチを形成することができた。図に示されるように、ＷＧＡはネコクラステリンに結合する。よって、ＫＳＣＩアッセイを使用してイヌもネコもクラステリンを検出することができる。

【0111】

レクチンフォーマット（format）を用いた臨床試料中の尿クラステリンの検出
地域動物病院を受診していたネコから尿を採取し、１：１００に希釈し、ＫＳＣＩアッセイに供した。図に示されるように、動物はアッセイの範囲の典型となり、イヌ用に開発したＫＳＣＩアッセイがネコ臨床試料と交差反応することを示す（＜ＬＯＤ＝検出の限界未満；＞ＵＬＯＱ＝定量の上限超）。表１０を参照されたい。

【0112】

【表10】

【0113】

実施例１２：ヒトにおける腎臓特異的クラステリン
付着性ヒト胎児上皮腎細胞株ＨＥＫ２９３、イヌ腎細胞株ＭＤＣＫ、およびミドリサル腎上皮細胞株ベロ（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）を供給元の取扱説明書に従って培養した。細胞がコンフルエントな状態に達したとき、細胞を腎毒性薬物、ゲンタマイシン０．２ｍｇ／ｍｌを用いてストレスをかけるか、４０℃で加熱するか、または熱と薬物との組合せで処理するかした。上清を採り、市販のヒトクラステリンＥＬＩＳＡ（バイオベンダー社）で細胞の反応性を調べた。その結果（表１１）はＥＬＩＳＡがＨＥＫ２９３細胞に発現するクラステリンと反応することを示す。

【0114】

【表11】

【0115】

腎細胞株に、腎毒性薬物であるゲンタマイシン０．２ｍｇ／ｍｌ、４０℃の熱、２４時間、または薬物（０．２ｍｇ／ｍｌ）と熱（４０℃、２４時間）との組み合わせでストレスをかけた。上清を１：１００に希釈し、ヒトクラステリンＥＬＩＳＡ（バイオベンダー社）を行った。図８で下に示されるように、イヌ腎細胞対照（ＭＤＣＫ）で反応性は見られなかった。ミドリザル腎ベロ細胞株ではわずかな反応性が見られた。ヒト細胞株、ＨＥＫ２９３は最も強い反応性を示した。このことから、ＨＥＫ２９３細胞株がさまざまな条件で培養されたときにヒトクラステリンを分泌することが確かめられた。

【0116】

ヒト腎発現クラステリンと反応する抗体
ツーサイトＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）を開発するために、組換えイヌクラステリンに対して作製したモノクローナルおよびポリクローナル抗イヌクラステリン抗体のライブラリーをスクリーニングしてそれらの抗体のヒトクラステリンへの結合を決定した。その結果は、組換えイヌクラステリンに対する抗クラステリン抗体の複数がヒトクラステリンに結合できることを示した。ウェスタンブロットによる確認、図９は、ウサギ抗ベータ鎖クラステリンが、ＭＤＣＫ（レーン２、４）、ＨＥＫ２９３細胞上清（レーン３）、および陽性対照組換えイヌクラステリンベータ鎖抗原（レーン５）由来のクラステリンに結合することを示す。

【0117】

ヒトクラステリンＥＬＩＳＡ
プレートを１０μｇ／ｍｌの精製抗ベータ鎖クラステリンポリクローナル抗体で４℃にて一晩コーティングした。プレートを３回洗い、０．１％ＢＳＡで一晩ブロックし、最後に３回洗った。プレートを真空下で２時間乾燥し、使用するまで４℃で保存した。ヒト腎細胞株およびＭＤＣＫ（イヌ）対照の上清をＰＢＳで１：１０に希釈し、１００μｌを２つ組でウェルに入れた。上清を周囲温度で１時間振盪しながらインキュベーションした。３回洗った後、ＰＢＳ中で１００μｌのビオチン標識レクチン（１μｇ／ｍｌ）を加え、上記のように１時間インキュベーションした。さらに３回洗った後、プレートをＰＢＳ中でストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５０００）と３０分間インキュベーションした。最後に３回洗った後、プレートを１００μｌ ＴＭＢ基質で５分間発色させ、反応を１００μｌの１Ｍ ＨＣＬで止めた。吸光度を４５０ｎｍで読んだ。表１２を参照されたい。２つのレクチン（ＰＳＡ、ＤＢＡ）がヒトクラステリンおよびイヌ抗ベータ鎖ポリクローナル抗体とサンドイッチを形成することを示した。

【0118】

【表12】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】