特許 6948595 α−ヒドロムコン酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6948595

(24)【登録日】2021年9月24日

(45)【発行日】2021年10月13日

(54)【発明の名称】α−ヒドロムコン酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/44 20060101AFI20210930BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210930BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20210930BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/44ZNA

   C12N1/21

   C12N15/52 Z

【請求項の数】6

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2017-537999(P2017-537999)

(86)(22)【出願日】2017年5月30日

(86)【国際出願番号】JP2017020019

(87)【国際公開番号】WO2017209103

(87)【国際公開日】20171207

【審査請求日】2020年5月14日

(31)【優先権主張番号】特願2016-108640(P2016-108640)

(32)【優先日】2016年5月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】磯部 匡平

(72)【発明者】

【氏名】河村 健司

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 正照

(72)【発明者】

【氏名】山田 勝成

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−３１９５９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−１４０６７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭４８−０６７４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２１５５８６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養する工程を含み、前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されている、α−ヒドロムコン酸の製造方法。

【請求項2】

前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａである、請求項１に記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。

【請求項3】

前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２−オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種または２種以上の炭素源を含む、請求項１又は２に記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。

【請求項4】

前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導物質を含む培地で培養する、請求項１〜３のいずれかに記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。

【請求項5】

３−ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物であって、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されていることを特徴とする、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物。

【請求項6】

前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａである、請求項５に記載のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を利用したα−ヒドロムコン酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

α−ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）−ｈｅｘ−２−ｅｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）は、炭素数６、分子量１４４．１３のジカルボン酸である。α−ヒドロムコン酸は多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、α−ヒドロムコン酸の末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。

【0003】

微生物を利用したα−ヒドロムコン酸の製造方法に関連する報告としては、スクシニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを出発原料とした天然には存在しない微生物によるアジピン酸を製造する方法の過程で、アジピン酸生合成経路の中間体として３−ヒドロキシアジピン酸（３−ヒドロキシアジペート）が酵素反応によって脱水し（３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼによる脱水反応）、α−ヒドロムコン酸（ヘキサ−２−エンジオエート）が生成しうるとの報告がある（特許文献１、図３）。

【0004】

また、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｒｇａ ａｄｉｐｉｃａがアジピン酸を分解し増殖するのに伴い、１７日間で０．８６ｍｇ／Ｌのα−ヒドロムコン酸が生成する例が報告されている（非特許文献１）。

【0005】

また、特許文献２には、生体触媒や微生物を用いたアジピン酸、アジピン酸エステル又はアジピン酸チオエステルの製造方法が記載されており、中間化合物としてα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）エステルまたはα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）チオエステルが記載されている。α−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）エステルまたはα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）チオエステルは、３−ヒドロキシアジピン酸エステルまたは３−ヒドロキシアジピン酸チオエステルの脱水によって調製されると記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２００９／１５１７２８号

【特許文献2】国際公開第２００９／１１３８５３号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０００ Ｍａｒ；５０ Ｐｔ ２：６３９−４４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

特許文献１には、アジピン酸を製造できるように人為的に改良した微生物において、製造対象であるアジピン酸の中間体として３−ヒドロキシアジピン酸（３−ヒドロキシアジペート）が酵素反応によって脱水し、α−ヒドロムコン酸（ヘキサ−２−エンジオエート）が生成しうることについての記載はあるが、３−ヒドロキシアジピン酸からα−ヒドロムコン酸への３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼによる脱水反応の直接的証拠は一切確認されておらず、実際に微生物の代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。さらに、当業者にとって３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼなる酵素は周知のものではないため、特許文献１の記載に従ってスクシニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを出発原料としてα−ヒドロムコン酸を製造することはできなかった。

【0009】

また、非特許文献１には自然界に存在する微生物によってα−ヒドロムコン酸が生成することの報告はあるものの、その生産性は著しく低いものであり、α−ヒドロムコン酸の製造方法であるとは言えるものではない。

【0010】

特許文献２ではα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）エステルまたはα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）チオエステルからα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）を得る方法は記載されておらず、α−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）チオエステルの具体例としての５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡ（２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ）からα−ヒドロムコン酸（２，３−デヒドロアジピン酸）を得る方法も記載されていない。

【0011】

このように、実際のところ微生物の代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を製造する方法は存在していなかった。そこで本発明では、微生物の代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を製造する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を製造することができるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が自然界に存在することを見出し、以下の本発明に到達した。

【0013】

すなわち本発明は、次の（１）〜（６）から構成される。
（１）α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養する工程を含み、前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されている、α−ヒドロムコン酸の製造方法。
（２）前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａである、（１）に記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。
（３）前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２−オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種または２種以上の炭素源を含む、（１）又は（２）に記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。
（４）前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導物質を含む培地で培養する、（１）〜（３）のいずれかに記載のα−ヒドロムコン酸の製造方法。
（５）３−ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物であって、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されていることを特徴とする、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物。
（６）前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａである、（５）に記載のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物。

【発明の効果】

【0014】

本発明により、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物の代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を得ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明のα−ヒドロムコン酸の製造方法は、α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養する工程を含むことを特徴とする。より詳しくは、α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養することによって、該微生物の代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を製造することを特徴とする。

【0016】

α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａあるいはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａが挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が代謝経路を利用してα−ヒドロムコン酸を製造しうるメカニズムについては明らかではないが、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物は排出する余剰汚泥を低減させた排水処理方法に利用されていることもあり（特開２００２−１８４６９号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づきα−ヒドロムコン酸を生成することが推定される。

【0017】

上記のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物は、いずれも自然界に存在するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物として公知のものであり、土壌等の自然環境から単離することができる。また、ＮＢＲＣ等の微生物分与機関から購入することもできる。

【0018】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物は、α−ヒドロムコン酸の生産性が増大するように公知の手法にしたがって遺伝子を組換えたものであってもよく、また、人為的変異手段により変異させたものであってもよい。

【0019】

本発明では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物培養した際に、４８時間以内に培養液上清中に１．０ｍｇ／Ｌ以上のα−ヒドロムコン酸を生産できるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を、α−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物として使用することが好ましい。より好ましくは、遺伝子変異処理や、遺伝子組換えが施されていない野生型の状態で、培養液上清中に１．０ｍｇ／Ｌ以上のα−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物である。

【0020】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、４８時間以内に培養液上清中に１．０ｍｇ／Ｌ以上のα−ヒドロムコン酸を生産できるかどうかについては、以下の方法により判断する。
Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物の培養上清中に含まれるα−ヒドロムコン酸の生産量は、以下の方法により測定する。

【0021】

対象となるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物をｐＨ７に調整した前培養培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに対象となるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養する。得られた前培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄した菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁し、懸濁液０．５ｍＬをｐＨ６．５に調整した本培養液（培地組成：コハク酸 １０ｇ／Ｌ、グルコース １０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム １ｇ／Ｌ、リン酸カリウム ５０ｍＭ、硫酸マグネシウム ０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄 ０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム ０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス １．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加して３０℃で４８時間培養し、４８時間までの本培養液を経時的に分取する。

【0022】

本培養液より菌体を遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析する。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析条件は以下のとおりである。ＨＰＬＣには、１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＭＳ／ＭＳには、Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を用いることができる。また、カラムには、Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いることができる。
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム：長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
ＭＳ／ＭＳ分析条件：
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。

【0023】

本発明では、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を、通常の微生物が代謝し得る炭素源を含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。ここで、本発明における「代謝」とは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が代謝しうる炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。

【0024】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が代謝し得る炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。

【0025】

また、上記に挙げた糖類以外にも、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が生育に利用可能な炭素源であれば好ましく用いることができる。例えば、酢酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、２−オキソグルタル酸、ピルビン酸等のカルボン酸、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロパンジオールなどの多価アルコール類、炭化水素、脂肪酸、油脂などが挙げられ、好ましくは、コハク酸、２−オキソグルタル酸、グリセロールである。

【0026】

上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。具体的には、これら炭素源の中でも糖類、コハク酸、２−オキソグルタル酸、グリセロールからなる群より選択される１種または２種以上を代謝することで効率よくα−ヒドロムコン酸を製造することができる。培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができ、好ましくは５ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌである。

【0027】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌである。

【0028】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。

【0029】

α−ヒドロムコン酸を製造するためのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、使用するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。

【0030】

上記に示した培地および培養条件で、本発明で用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた培養によりα−ヒドロムコン酸を製造することができるが、α−ヒドロムコン酸を製造するために必要な代謝経路を活性化した状態で前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養することで、より効率的にα−ヒドロムコン酸を製造することができる。

【0031】

前記代謝経路を活性化する方法は特に限定されないが、例えば、α−ヒドロムコン酸を製造するための代謝経路中の酵素遺伝子（群）の発現量を増大させる方法、α−ヒドロムコン酸を製造するための代謝経路を活性化する物質（以下、誘導物質ともいう。）を含む培地で前記微生物を培養することで前記酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法、および公知の手法に従って遺伝子を組換えたり、遺伝子変異処理などの育種技術によって、前記酵素遺伝子（群）を改変したりして、前記酵素遺伝子（群）がコードする酵素（群）の活性を増大させる方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行っても良いし、組み合わせてもよい。

【0032】

前記酵素遺伝子（群）の発現量を増大させる方法としては、例えば、遺伝子改変技術により、本発明に用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物内において細胞内に存在する前記酵素遺伝子（群）のコピー数を増加させる方法、前記遺伝子（群）のコーディング領域周辺の機能性領域を改変する方法などが挙げられ、前記遺伝子（群）のコピー数を増加させる方法が好ましい。

【0033】

誘導物質を含む培地で、本発明に用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を培養して、前記酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法に用いる誘導物質としては、α−ヒドロムコン酸の製造に必要な代謝経路が活性化される物質であれば特に限定されないが、例えば、３−オキソアジピルＣｏＡを中間体としてより炭素数の少ない化合物へと代謝される芳香族化合物、炭素数６以上の脂肪族化合物、およびそれらと構造が類似した化合物を用いることができる。このような化合物の例は、例えばＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのデータベースを用いて知ることができ、具体的には、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸、テレフタル酸、プロトカテク酸、カテコール、バニリン、クマル酸、フェルラ酸などが挙げられ、フェルラ酸、ｐ−クマル酸、安息香酸が好ましい。

【0034】

上記の誘導物質はα−ヒドロムコン酸製造に用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物に応じて単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記誘導物質はα−ヒドロムコン酸製造の前段階としてＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を増殖させるために行う培養（前培養）に用いる培地に含まれていてもよいし、α−ヒドロムコン酸製造に用いる培地に含まれていてもよい。１種または２種以上の誘導物質が培地中に含まれる場合、誘導物質の濃度（複数の誘導物質が含まれる場合には、それらの合計濃度）は、特に限定されないが、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌである。

【0035】

公知の手法に従って遺伝子を組換えたり、遺伝子変異処理などの育種技術によって、前記酵素遺伝子（群）を改変したりして、前記酵素遺伝子（群）がコードする酵素（群）の活性を増大させる方法としては、遺伝子組換えの手法を用いて前期酵素遺伝子（群）を本発明で用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物に導入する方法が好ましい。

【0036】

前記酵素遺伝子（群）に該当する遺伝子の具体例としては、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。本発明では、３−ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有する酵素の活性を強化することによって、より効率的にα−ヒドロムコン酸を製造することができる。

【0037】

上記活性を有する酵素であれば特に限定されないが、具体的には、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、β−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、β−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ Ｃ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ−ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、２−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｏｘｏｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ Ｃ−ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｂｅｔａ−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｋｅｔｏａｃｙｌ ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｋｅｔｏａｃｙｌ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｏｘｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｏｘｏａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、６−ｏｘｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｂｅｔａ−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｋｅｔｏａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ３−ｏｘｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｏｘｏａｃｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｐｒｏ−３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ、３−ｏｘｏ−５，６−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｓｕｂｅｒｙｌ−ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅなどを好ましく用いることができる。また、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ２．３．１．−に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体例としては、ＥＣ２．３．１．１７４、ＥＣ２．３．１．９、ＥＣ２．３．１．１６、ＥＣ２．３．１．２２３に分類される酵素が挙げられる。

【0038】

また、機能未知の遺伝子配列によってコードされるタンパク質が、上記の酵素に該当するかどうかについては、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのサイトでＢＬＡＳＴ検索を行い、当該酵素に該当するかどうかを推定することができる。

【0039】

遺伝子組換えの手法を用いて、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有する酵素をコードする遺伝子をＳｅｒｒａｔｉａ属微生物へ導入し、本発明で用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性を強化する場合、当該酵素をコードする遺伝子の遺伝子源となる生物は特に限定されず、天然に存在する微生物から採取した遺伝子、人工的に合成された遺伝子、微生物から採取した遺伝子を本発明のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物で発現しやすいようコドンの使用頻度を最適化させた遺伝子などを用いることができる。

【0040】

スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の遺伝子源となる微生物は、特に限定されないが、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属微生物、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属微生物、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属微生物が挙げられ、好ましくは、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物であり、さらに好ましくは、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。

【0041】

本発明において、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性を強化したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物とは、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）が、当該酵素の活性を強化していないコントロールと比較して増大しているＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を指す。コントロールには、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の発現系が、遺伝的に改変されていない状態であるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いる。

【0042】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の比活性は、Ｓｅｒａｔｔｉａ属微生物を培養し、無細胞抽出液（ＣＦＥ）を調製して、ＣＦＥを酵素溶液として用いて測定する。酵素溶液の調製方法は以下のとおりである。

【0043】

ｐＨ７に調整した前培養培地（培地組成：トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）５ｍＬに活性測定の対象となるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養する。得られた前培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離して上清を取り除く操作を３回行い、菌体を洗浄する。洗浄した菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁し、懸濁液０．５ｍＬをｐＨ６．５に調整した本培養液（培地組成：コハク酸 １０ｇ／Ｌ、グルコース １０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム １ｇ／Ｌ、リン酸カリウム ５０ｍＭ、硫酸マグネシウム ０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄 ０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム ０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス １．２５ｇ／Ｌ）５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養する。

【0044】

得られた本培養液５ｍＬを遠心により集菌後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １００ｍＭ、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ １ｍＭからなるＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁し、得られた懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、超音波破砕機を用い４℃で菌体を破砕する。得られた菌体破砕液を遠心して、上清として回収した無細胞抽出液（ＣＦＥ）を酵素液とする。

【0045】

比活性は、上記の方法により調製した酵素液を用いて、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡの縮合反応により生じる３−オキソアジピルＣｏＡに対して基質特異性を有するＮＡＤＨ依存型３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを反応系内に過剰量存在させたときに、３−オキソアジピルＣｏＡの還元に伴うＮＡＤＨの消費速度を測定し、式１に従って算出する。式１において、酵素液濃度（ｍｇ／ｍｌ）は、酵素液中のタンパク質濃度である。

【0046】

【数1】

【0047】

具体的な算出方法は以下のとおりである。酵素反応溶液Ａ（組成：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ４０ｍＭ、ＮＡＤＨ ０．８ｍＭ、ＤＴＴ ２ｍＭ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＰａａＨ）４．４μｇ）２５μＬに酵素液５０μＬを混合し、３０℃で２ｍｉｎインキュベートする。その後、酵素反応溶液Ｂ（組成：アセチルＣｏＡ ２ｍＭ、スクシニルＣｏＡ ０．４ｍＭ）２５μＬを入れた状態で予め３０℃でプレインキュベートした石英セルに上記の酵素反応溶液Ａと酵素液の混合液を全量添加し、すばやく混合し反応液とする。調製した反応液の３０℃での３４０ｎｍにおける吸光度の減少の値を分光光度計で測定し、得られたΔ３４０の値を、式（１）に従って計算し、比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）を算出する。酵素液中のタンパク質濃度は、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）などを用いて測定することができる。分光光度計は、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００Ｐｒｏ（ＧＥヘルスケア社製）を用いることができる。

【0048】

上記の方法以外にも、より効率的にα−ヒドロムコン酸を製造するためには、本発明で用いるＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の代謝経路のうち、α−ヒドロムコン酸の副生成物の生合成経路中の酵素遺伝子機能を破壊する方法なども用いることができる。

【0049】

Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物の培養物中に、α−ヒドロムコン酸が回収可能な量まで生産された後、生産されたα−ヒドロムコン酸を回収することができる。生産されたα−ヒドロムコン酸の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、α−ヒドロムコン酸を培養物から単離することができる。より具体的には、好ましい回収方法として、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去してα−ヒドロムコン酸の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化によりα−ヒドロムコン酸および／またはα−ヒドロムコン酸の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などによりα−ヒドロムコン酸および／またはα−ヒドロムコン酸の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加してα−ヒドロムコン酸エステルとした後、蒸留操作によりα−ヒドロムコン酸エステルを回収後、加水分解によりα−ヒドロムコン酸を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0050】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

【0051】

（参考例１）α−ヒドロムコン酸の調製
後述の実施例の分析に用いたα−ヒドロムコン酸は化学合成により準備した。まず、コハク酸モノメチルエステル１３．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）に超脱水テトラヒドロフラン１．５Ｌ（和光純薬株式会社製）を加え、攪拌しながらカルボニルジイミダゾール１６．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した。この懸濁液にマロン酸モノメチルエステルカリウム塩１５．６ｇ（０．１ｍｏｌ）および塩化マグネシウム９．５ｇ（０．１ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した後、４０℃で１２時間攪拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を０．０５Ｌ加え、酢酸エチルにより抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：５）で分離精製することで、純粋な３−オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル１３．１ｇを得た。収率７０％。

【0052】

得られた３−オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル１０ｇ（０．０５ｍｏｌ）にメタノール０．１Ｌ（国産化学株式会社製）を加え、攪拌しながら水素化ホウ素ナトリウム２．０ｇ（０．０５ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）を添加し、室温で１時間攪拌した。次いで、５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液０．０２Ｌを添加し、室温で２時間攪拌した。反応終了後、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨ１に調整し、ロータリーエバポレーターで濃縮後、水で再結晶することで、純粋なα−ヒドロムコン酸７．２ｇを得た。収率９５％。
α−ヒドロムコン酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル：
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ２．４８（ｍ、４Ｈ）、δ５．８４（ｄ、１Ｈ）、δ６．９６（ｍ、１Ｈ）。

【0053】

（実施例１）α−ヒドロムコン酸生産試験
表１に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物（いずれも微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）のα−ヒドロムコン酸の生産能を調べた。トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７に調整した培地５ｍＬに、それぞれのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。その培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離したのち上清を完全に取り除くことで菌体を洗浄する操作を３回行ったのち、菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。

【0054】

（α−ヒドロムコン酸の定量分析）
本培養液より菌体を遠心分離した上清を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるα−ヒドロムコン酸の定量分析は以下の条件で行った。
ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。

【0055】

培養上清中に蓄積したα−ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果をそれぞれ表１に示す。これらの結果から、いずれのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物もα−ヒドロムコン酸の生産能を有することを確認することができた。

【0056】

【表1】

【0057】

（実施例２）誘導物質を用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表２に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、誘導物質として、前培養培地にフェルラ酸、ｐ−クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例１と同様条件で前培養、本培養を行い、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２に示す。これらの結果から、前培養培地に誘導物質を添加することによって、α−ヒドロムコン酸の生産量が向上することがわかった。

【0058】

【表2】

【0059】

（実施例３）２種類の炭素源を用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表３に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例２と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表３に示した化合物をそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例２と同様の条件にて培養し、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表３に示す。これらの結果から、グルコースとコハク酸以外を炭素原として培養しても、α−ヒドロムコン酸を効率よく生産できることがわかった。

【0060】

【表3】

【0061】

（実施例４）様々な濃度の２種類の炭素源を用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表４に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例２と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表４に示した濃度の化合物をそれぞれ含む培地にて実施例２と同様の条件にて４８〜１２０時間培養し、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表４に示す。これらの結果から、炭素源の添加割合を変更しても、α−ヒドロムコン酸を生産できることがわかった。

【0062】

【表4】

【0063】

（実施例５）単一の炭素源を用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表５に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例１と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源としてコハク酸、グルコース、グリセロールのいずれか１種類を１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表５に示す。さらに、同様の実験について、前培養培地のみ実施例２に変更して行い、前培養培地に誘導物質を添加した場合のα−ヒドロムコン酸の生産量について、表６に示す。これらの結果から、単一の炭素源を用いた場合でも、α−ヒドロムコン酸を生産できること、また、単一の炭素源を用いた場合も、誘導物質を前培養培地に添加することで、α−ヒドロムコン酸の生産量が向上することがわかった。

【0064】

【表5】

【0065】

【表6】

【0066】

（実施例６）様々な濃度のフェルラ酸を誘導物質として用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表７に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例２から５で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、フェルラ酸を表７に示した濃度になるよう実施例１の前培養培地に添加し、前培養を行った。それ以外は実施例１と同様の条件で前培養、本培養を行い、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表７に示す。これらの結果から、フェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、α−ヒドロムコン酸の生産量が向上することがわかった。

【0067】

【表7】

【0068】

（実施例７）様々な濃度のｐ−クマル酸を誘導物質として用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表８に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例２から５で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ−クマル酸を表７に示した濃度になるよう実施例１の前培養培地に添加し、前培養を行った。それ以外は、実施例１と同様の条件で前培養、本培養を行い、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表８に示す。これらの結果から、ｐ−クマル酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合も、α−ヒドロムコン酸の生産量が向上することがわかった。

【0069】

【表8】

【0070】

（実施例８）安息香酸を誘導物質として用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表９に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を対象に、実施例２から５で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、安息香酸を２．５ｍＭとなるように実施例１の前培養培地に添加し、前培養を行った。それ以外は、実施例１と同様の条件で前培養、本培養を行い、培養上清中のα−ヒドロムコン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表９に示す。これらの結果から、安息香酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合も、α−ヒドロムコン酸の生産量が向上することがわかった。

【0071】

【表9】

【0072】

（実施例９）α−ヒドロムコン酸の製造例
実施例１でα−ヒドロムコン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物であることが確認できたＳ．ｇｒｉｍｅｓｉｉ ＮＢＲＣ１３５３７を、ＬＢ培地５ｍＬに一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した。該培養液２ｍＬをトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．５ｍＭを含む培地１００ｍＬに添加し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。前培養液を２００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムで実施例１と同様に３回洗浄したのち、菌体を１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液１０ｍＬをグルコース１００ｇ／Ｌおよびコハク酸２０ｇ／Ｌを炭素源とする実施例１記載の培地１００ｍＬに添加し、３０℃で１２０時間振とう培養した。該培養液より菌体を遠心分離した上清を、実施例１と同様にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した結果、培養上清中に蓄積したα−ヒドロムコン酸の濃度は４６ｍｇ／Ｌであった。

【0073】

次に培養上清を減圧濃縮し、α−ヒドロムコン酸の濃度が４２０ｍｇ／Ｌの濃縮液を１１ｍＬ得た。この濃縮液を、分取装置を連結したＨＰＬＣに注入し、α−ヒドロムコン酸の標品と一致する溶出時間の画分を採取した。この作業を１０回繰り返し、培養液中の不純物が除去されたα−ヒドロムコン酸水溶液を得た。なお、α−ヒドロムコン酸の採取に用いた分取ＨＰＬＣは以下の条件にて行った。
ＨＰＬＣ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ２０Ａ（株式会社島津製作所製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ２５０ｍｍ、内径１０ｍｍ、粒径４μｍ
移動相：５ｍＭ ギ酸水溶液／アセトニトリル＝９８／２
流速：４ｍＬ／分
注入量：１ｍＬ
カラム温度：４５℃
検出器：ＵＶ−ＶＩＳ（２１０ｎｍ）
分取装置：ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ社製）。

【0074】

続いてα−ヒドロムコン酸水溶液を減圧濃縮し、３．８ｍｇの結晶を得た。結晶を１Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、得られた結晶がα−ヒドロムコン酸であることを確認できた。

【0075】

（参考例２）炭素源を添加しない培養
表２に示したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いて、グルコースおよびコハク酸を添加しない組成の培地を用いた他は実施例１と同様の条件で培養し、α−ヒドロムコン酸の定量分析をした結果、培養上清中にα−ヒドロムコン酸は検出されなかった。これらの結果から、実施例１〜８でＳｅｒｒａｔｉａ属微生物が生産したα−ヒドロムコン酸は、グルコース、コハク酸、アラビノース、２−オキソグルタル酸、キシロースまたはグリセロールを炭素源とする代謝により得られたものであることがわかった。
（参考例３）α−ヒドロムコン酸の生産能を有さない微生物
表１０に示した微生物のα−ヒドロムコン酸の生産能を確認するべく、実施例１と同様の条件で培養し、α−ヒドロムコン酸の定量分析をした結果、いずれも検出限界以下となり、培養上清中にα−ヒドロムコン酸は検出されなかった。なお、検出限界は０．１ｍｇ／Ｌである。

【0076】

【表10】

【0077】

（実施例１０）Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ由来のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素遺伝子発現用プラスミドの構築
ＢＬＡＳＴ検索の結果により、Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９が有する配列番号４の遺伝子配列がスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素である３−ｏｘｏａｄｉｐｙｌ ＣｏＡ ｔｈｉｏｌａｓｅ（ＰｃａＦ）をコードしていることが推定された。上記遺伝子の発現のためにプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＳｐｐｃａＦを構築した。Ｓｅｒｒａｔｉａ属で自立複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（ＭＥ Ｋｏｖａｃｈ， （１９９５）， Ｇｅｎｅ １６６： １７５−１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩを得た。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ１６５５のゲノムを鋳型としてｇａｐＡ遺伝子のＯＲＦ上流域２００ｂ（配列番号１）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２，３）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２／ＸｈｏＩ を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐＡとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐＡをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐＡ／ＳｃａＩ を得た。Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９のゲノムを鋳型としてスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素遺伝子のＯＲＦ（配列番号４）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号５，６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐＡ／ＳｃａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＳｐｐｃａＦとした。

【0078】

（実施例１１）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２のスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素を発現させるために、Ｃｏｒｉｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムを鋳型としてａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子（ｐｃａＦ）のＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３４５０、ＧＩ番号１９５５３５９１）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号７，８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＰｇａｐＡ／ＳｃａＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＣｇｐｃａＦとした。

【0079】

（実施例１２）Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物へのプラスミド導入
実施例１０および１１で構築したプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＳｐｐｃａＦ、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＣｇｐｃａＦおよびコントロールとしてベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２を表１１に示すＳｅｒｒａｔｉａ属微生物にエレクトロポレーション（ＮＭ Ｃａｌｖｉｎ， ＰＣ Ｈａｎａｗａｌｔ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７０ （１９８８）， ｐｐ． ２７９６-２８０１）で導入した。形質転換したセラチア属微生物は、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天培地上で３０℃に保温し、１〜２日間生育させた。

【0080】

（実施例１３）スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性測定
実施例１２で得られたセラチア属微生物の形質転換体を用いて、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の比活性を比較した。

【0081】

（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＰａａＨの過剰発現および精製
スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性測定に用いるＰａａＨの過剰発現および精製を行った。まずｐＣＤＦ−１ｂをＢａｍＨＩで切断し、ｐＣＤＦ−１ｂ／ＢａｍＨＩを得た。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ１６５５のゲノムを鋳型としてｐａａＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３、ＧＩ番号９４５９４０）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号９，１０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ−１ｂ／ＢａｍＨＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ−１ｂ：ＥｃｐａａＨとした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にｐＣＤＦ−１ｂ：ＥｃｐａａＨを導入し、得られた形質転換体をストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢで好気的に培養し（３７℃）、ＯＤ６００が０．３付近の時点でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、ｐａａＨの発現を誘導した（好気的、３７℃、一晩）。遠心分離後の菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で懸濁し、氷冷しながら超音波ホモジナイザーで細胞を破砕したのち、遠心分離した上清を無細胞抽出液として回収した。得られた無細胞抽出液をＨｉｓ Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３Ｋ（Ｍｅｒｃｋ社製）で遠心した濃縮液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で希釈し、ＰａａＨ酵素溶液（０．３１ｍｇ／ｍＬ）とした。酵素濃度はＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて決定した。

【0082】

（ｂ）酵素液の調製
下記に示した組成の前培養培地５ｍＬに、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されていないＳｅｒｒａｔｉａ属微生物として、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２が導入された表１１に記載のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物と、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性が強化されたＳｅｒｒａｔｉａ属微生物としてｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２：：ＣｇｐｃａＦが導入された表１１に記載のＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した。その培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離したのち上清を完全に取り除くことで菌体を洗浄する操作を３回行ったのち、菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の本培養培地５ｍＬに添加し、３０℃で３時間振とう培養した。

【0083】

上記培養液５ｍＬを遠心により集菌後、下記のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー１ｍＬに懸濁した。上記菌体懸濁液にガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）を加え、Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ（ＴＯＭＹ社製）を用い４℃で菌体を破砕した。上記のようにして菌体を破砕した後、遠心して得られる上清の無細胞抽出液（ＣＦＥ）を酵素液として以下の実験に用いた。

【0084】

（ｃ）スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性測定
（ｂ）で得られたＣＦＥ中のタンパク質濃度を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により測定した。次に、以下に示す組成の酵素反応溶液Ａ２５μＬおよびＣＦＥ５０μＬを混合し、インキュベートした（３０℃、２ｍｉｎ）。その後、酵素反応溶液Ｂ２５μＬを入れた状態で予め３０℃でプレインキュベートした石英セルに酵素反応溶液ＡとＣＦＥを含む上記の溶液を全量添加し、すばやく混合し活性測定を開始した（３０℃）。３４０ｎｍにおける吸光度の減少を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００Ｐｒｏ ＧＥヘルスケア社製）で測定し、得られたΔ３４０の値を式（１）にあてはめ、それぞれ比活性を算出した。算出結果を表１１に示す。

【0085】

これらの結果から、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素を導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物株では、非導入株に比べて当該比活性が向上することがわかった。

【0086】

前培養培地：
トリプトン１０ｇ／Ｌ
酵母エキス５ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ
ｐＨ７。

【0087】

本培養培地：
コハク酸 １０ｇ／Ｌ
グルコース １０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム １ｇ／Ｌ
リン酸カリウム ５０ｍＭ
硫酸マグネシウム ０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄 ０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン ２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム ０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム １．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン ２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス １．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。

【0088】

Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １００ｍＭ
ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ １ｍＭ。

【0089】

酵素反応溶液Ａ：
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ２００ｍＭ
ＭｇＣｌ２ ４０ｍＭ
ＮＡＤＨ ０．８ｍＭ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰａａＨ ４．４μｇ。

【0090】

酵素反応溶液Ｂ：
アセチルＣｏＡ ２ｍＭ
スクシニルＣｏＡ ０．４ｍＭ

【0091】

【表11】

【0092】

（実施例１４）遺伝子組換えによりスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素を発現させたＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いたα−ヒドロムコン酸生産試験
表１２に示した、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物および、実施例１２で作成した遺伝子組換えによりスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素を導入したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物のα−ヒドロムコン酸の生産能を調べた。トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含み、ｐＨ７に調整した培地５ｍＬに、それぞれのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。その培養液０．２５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で２４時間振とう培養し、本培養を行った。
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
カナマイシン２５μｇ／ｍＬ
ｐＨ６．５。

【0093】

本培養液より菌体を遠心分離した上清を、実施例１と同様にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて分析した。培養上清中に蓄積したα−ヒドロムコン酸の定量分析を行った結果をそれぞれ表１２に示す。

【0094】

これらの結果から、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の導入株では非導入株と比べてα−ヒドロムコン酸の蓄積濃度が向上することがわかった。したがって、本実施例と実施例１２の結果よりスクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素活性の強化によりα−ヒドロムコン酸を効率よく製造することができることがわかった。

【0095】

【表12】

【0096】

（実施例１５）
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９由来ＰｃａＦの酵素活性の確認
実施例１０でクローニングした配列番号４の遺伝子配列がコードするＰｃａＦが、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有していることを確認した。
（ａ）Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ由来ＰｃａＦの過剰発現および精製
ｐＲＳＦ−１ｂをＳａｃＩで切断し、ｐＲＳＦ−１ｂ／ＳａｃＩを得た。Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９のゲノムを鋳型としてｐｃａＦ遺伝子のＯＲＦ（配列番号４）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１１，１２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＲＳＦ−１ｂ／ＳａｃＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＲＳＦ−１ｂ：ＳｐｐｃａＦとした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にｐＲＳＦ−１ｂ：ＳｐｐｃａＦを導入し、得られた形質転換体をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢで好気的に培養し（３７℃）、ＯＤ６００が０．３付近の時点でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度が１ｍＭとなるよう添加し、ｐｃａＦの発現を誘導した（好気的、３７℃、一晩）。遠心分離後の菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で懸濁し、氷冷しながら超音波ホモジナイザーで細胞を破砕したのち、遠心分離した上清を無細胞抽出液として回収した。得られた無細胞抽出液をＨｉｓ Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３Ｋ（Ｍｅｒｃｋ社製）で遠心した濃縮液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で希釈し、ＰｃａＦ酵素溶液（０．５２ｍｇ／ｍＬ）とした。酵素濃度はＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて決定した。

【0097】

（ｂ）スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する酵素の活性測定
ＰｃａＦ酵素溶液を酵素液として、実施例１３と同様の手順にて酵素活性測定を行った。測定の結果、比活性は０．１７０Ｕｎｉｔ／ｍｇであり、精製された酵素は、スクシニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡから３−オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有していることが確認できた。

【産業上の利用可能性】

【0098】

本発明によれば、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物を利用してα−ヒドロムコン酸を製造することができる。得られたα−ヒドロムコン酸は各種ポリマー原料として利用することができる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]