特許 6954711 真正膵臓前駆細胞の単離

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6954711

(24)【登録日】2021年10月4日

(45)【発行日】2021年10月27日

(54)【発明の名称】真正膵臓前駆細胞の単離

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20211018BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20211018BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0775

   C12N5/077

【請求項の数】16

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2017-555508(P2017-555508)

(86)(22)【出願日】2016年4月21日

(65)【公表番号】特表2018-512886(P2018-512886A)

(43)【公表日】2018年5月24日

(86)【国際出願番号】EP2016058920

(87)【国際公開番号】WO2016170069

(87)【国際公開日】20161027

【審査請求日】2019年3月4日

(31)【優先権主張番号】15164999.3

(32)【優先日】2015年4月24日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516376341

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ コペンハーゲン

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100211199

【弁理士】

【氏名又は名称】原田 さやか

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】アメリ， ジャクリーン

(72)【発明者】

【氏名】センブ， ヘンリック

【審査官】 長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２６３８９６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０３／０８７３４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０３０９７６９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 STEM CELLS, 2013, Vol.31, p.2432-2442

【文献】 PLOS ONE, 2014, Vol.9, No.12, e115421, p.1-21

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７７５

Ｃ１２Ｎ ５／０７７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための方法であって、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、ＰＤＸ１^＋ＮＫＸ６−１^＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋ＮＫＸ６−１^＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程とを具備し、
前記第３のマーカーがＧＰ２であり、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得る方法。

【請求項2】

前記細胞集団を、ＰＤＸ１⁻細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋細胞について前記細胞集団を富化させること、及び／又はＰＤＸ１^＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋細胞について前記細胞集団を富化させることをさらに具備する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を製造する方法であって、前記富化された細胞集団は少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞を含み、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、ＰＤＸ１^＋ＮＫＸ６−１^＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋ＮＫＸ６−１^＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程とを具備し、
前記第３のマーカーがＧＰ２であり、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得る方法。

【請求項4】

前記細胞集団を、ＰＤＸ１⁻細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋細胞について前記細胞集団を富化させること、及び／又はＰＤＸ１^＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１^＋細胞について前記細胞集団を富化させることをさらに具備する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体又はその断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のマーカーがＣＤ４９ｄである、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のリガンドは、ＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体又はその断片である、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項8】

前記第２のマーカーは、ＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項9】

前記第２のリガンドは、ＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される標的に対して向けられる抗体又はその断片である、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項10】

前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体又はその断片である、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項11】

前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体又はその断片であり、また前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体又はその断片である、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項12】

前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体又はその断片であり、前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体又はその断片であり、また前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体又はその断片である、請求項２又は４に記載の方法。

【請求項13】

前記真正膵臓前駆細胞は、ヒト万能性幹細胞のような分化できる細胞に由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記分化できる細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（ｈＩＰＳＣ）、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）及びナイーブヒト幹細胞（ＮｈＳＣ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記分化できる細胞は、個体から単離された細胞に由来する、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団の少なくとも一部のインスリン産生細胞への分化を誘導する工程、及び該インスリン産生細胞を単離する工程から選択される工程を更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は真正膵臓前駆細胞を単離するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

インスリン依存性糖尿病の細胞療法による治療は、ヒト膵島と同様に機能でき、機能できると思われる膵臓細胞の無制限数の産生によって促進される。従って、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に由来するこれら膵臓細胞型を産生すること、及びそのような細胞を精製するための信頼できる方法が必要とされている。例えば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来するインスリン産生β細胞の使用は、ドナー膵臓由来の細胞を利用する現在の細胞療法を凌駕する大幅な改善を提供する。現在、ドナー膵臓由来の細胞を利用した１型または２型糖尿病のような真性糖尿病に対する細胞療法は、移植に必要な高品質の膵島細胞の不足によって制限される。例えば、一人の１型糖尿病患者のための細胞療法には、約８×１０^８個の膵島細胞を必要とする（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４３：２３０−２３８；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ， ２００１ａ， Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １５：２４１− ２６４；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ， ２００１ｂ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２２：８６１）。従って、移植を成功させるのに十分な島細胞を得るためには、少なくとも二つ健康なドナー器官が必要とされる。

【0003】

従って、胚性幹（ＥＳ）細胞は、初期胚における万能性細胞生物学及び分化の基礎をなすメカニズム研究のための強力なモデルシステムを代表すると共に、哺乳動物の遺伝子操作のための機会を提供し、またその結果としての商業的、医学的及び農業的応用を提供する。更に、ＥＳ細胞の適切な増殖及び分化は、潜在的に、細胞損傷または機能不全に起因した疾患を治療するための移植に適した、無限の細胞源を生成するために使用することができる。初期原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞、インビボまたはインビトロで誘導されたＩＣＭ／胚盤葉、インビボまたはインビトロで誘導された原始外胚葉、原始生殖細胞（ＥＧ細胞）、奇形癌細胞（ＥＣ細胞）、及び脱分化または核移植により誘導された万能性細胞を含む、他の万能性細胞及び万能性細胞株もまた使用することができる。
従って、真正膵臓前駆細胞の単離方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する真正膵臓前駆細胞を単離するための方法を提供する。該方法は、ＰＤＸ１及び／またはＮＫＸ６．１発現細胞に特異的なマーカーの使用、またはＰＤＸ１を発現しない細胞に特異的なマーカーの使用に基づいている。そのような方法によって得られる細胞集団、ならびに代謝障害を治療するためのそれらの使用もまた提供される。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1A】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ｅＧＦＰ）を、ｈＰＳ細胞株ＨＵＥＳ−４におけるＰＤＸ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入した。ＢＤプライマーはＷＴアレルを増幅し、ＡＣプライマーは全てのトランスジェニッククローンを増幅し、またＡＤプライマーは標的アレル（３’ＨＡ）を増幅する。

【図1B】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。Ｎｅｏ／Ｆ及びＥｘ３／Ｒプライマー（断片サイズ５，１ｋｂ）を用いた４つの個々のクローン（レーン１及び４：遺伝子ターゲティングについて陽性のクローン；レーン２）についての、４つのターゲッティング事象の代表的なＰＣＲスクリーニングを示す。ＰＤＸ１遺伝子座に組み込まれたレポーターカセットを含むＰＤＸＩ ｅＧＦＰ ＢＡＣを陽性対照（ＢＡＣ）として使用した。

【図1C】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。３つの異なるｈＰＳ細胞株において得られた相対的なターゲッティング効率を示す表。

【図1D】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。１３日目における標的ＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＥＳ細胞株の、蛍光画像及び対応する位相コントラスト画像が示されている。スケールバー＝１００μｍ。

【図1E】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。１６日目における内因性ＰＤＸ１発現（赤色）のＧＦＰ（緑色）との共局在を示す、ＰＤＸ１−ＧＦＰ標的細胞株の免疫蛍光画像。スケールバー＝５０μｍ。

【図1F】ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング。１７日目におけるＰＤＸ１−ｅＧＦＰ＋細胞集団の免疫蛍光分析。有意な数のＧＦＰ＋／ＰＤＸ１＋細胞がＮＫＸ６−１及びＳＯＸ９を同時発現した。大部分のＰＤＸ１＋細胞もまた、ＥＣＡＤ及びＨＥＳ１を発現した（データは示さず）。スケールバー＝５０μｍ。

【図2A】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。ｈＰＳＣを２つの異なる分化プロトコルに従って分化させ、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する膵臓前駆細胞（プロトコルＡ（ＰＥ））、またはＰＤＸ１を発現するがＮＫＸ６−１を欠く後部前腸細胞（プロトコルＢ（ＰＦＧ））の何れかを得た。

【図2B】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。膵臓内胚葉（ＰＥ）を生成する「プロトコルＡ」と呼ばれる分化プロトコルを描写する概略図。

【図2C】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。プロトコルＡに従って処理したｈＰＳＣにおける、１７日目のｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−画分のＦＡＣＳ単離。

【図2D】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。選別したｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞の遺伝子発現分析は、プロトコルＡで得たｅＧＦＰ＋細胞における膵臓内胚葉マーカー（重要ものはＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１）の顕著な富化を示した。データは平均発現±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示す。グラフは、１７日目において対照試料（ｅＧＦＰ−細胞）で検出されたものと比較して倍の増加を表す。対照試料は任意に１の値に設定した。

【図2E】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。後部前腸細胞を生成する「プロトコルＢ」と称する分化プロトコルを描写する概略図。

【図2F】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。プロトコルＢに従って分化されたｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞（１７日目）のＦＡＣＳ単離。

【図2G】インビトロで分化されたＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＰＳＣの分析。選別されたｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞の遺伝子発現分析により、ＰＤＸ１、ＥＣＡＤ、ＨＮＦ６及びＳＯＸ９のような後部前腸のマーカーはｅＧＦＰ＋細胞において富化されたのに対して、ＮＫＸ６−１及びＭＮＸ１は何れもが、プロトコルＢにより得られたｅＧＦＰ＋細胞において有意にアップレギュレートされないことが示された。データは平均発現±ＳＥＭ（ｎ＝２〜４）として示されている。グラフは、１７日目において対照試料（ｅＧＦＰ−細胞）で検出されたものと比較して倍の増加を表している。対照試料は任意に１の値に設定された。

【図3A】インビトロで誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）対ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞（ＰＦＧ）の遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析を行った。膵臓前駆細胞（ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋）、後部前腸細胞（ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−）、及びＧＦＰ−細胞において示差的に発現される遺伝子の階層的クラスタリング。

【図3B】インビトロで誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）対ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞（ＰＦＧ）の遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析を行った。１７日目に、ＰＰＣ対ＧＦＰ−、ＰＰＣ対ＰＦＧ、及びＰＦＧ対ＧＦＰ−細胞においてアップレギュレートされた遺伝子の分布を示すベン図（Ｖｅｎｎ Ｄｉａｇｒａｍ）。

【図3C】インビトロで誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）対ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞（ＰＦＧ）の遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析を行った。Ａにおいて描写された３つの比較分析で示差的に発現された遺伝子の階層的クラスタリング（平均発現レベルが示されている）。バーは、関連遺伝子を有するサブクラスタを示す：合計で９個の異なるサブクラスタが作成された。サブクラスタ３ａは、新規細胞表面マーカーＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）を含むＧＦＰ−細胞集団に富む遺伝子を示すのに対して、サブクラス５は、これも新規細胞表面マーカーＧＰ２を含んだ膵臓前駆細胞（ＧＦＰ＋細胞画分）に富む遺伝子を示す。サブクラス６は、ＣＤＨ１（ＥＣＡＤ）、ＥＰＣＡＭ、Ｆ３（ＣＤ１４２）及び新規細胞表面マーカーＦＯＬＲ１のようなＮＫＸ６−１発現（Ｆ２ＧＦＰ＋及びＧＦＰ＋細胞）に関係なく、ＰＤＸ１＋細胞において富化された遺伝子を示す。

【図3D】インビトロで誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞（ＰＰＣ）対ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞（ＰＦＧ）の遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析を行った。ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞における遺伝子の富化を示す遺伝子オントロジ（ＧＯ）分析。代表的なＧＯカテゴリーが示され、−ｌｏｇ（ｐ値）に対してプロットされる。

【図4A】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。

【図4B】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。ＭＥＦｓ（ｄ１７）上で培養した分化したｈＰＳＣに対して実施された選択された細胞表面マーカーＧＰ２及びＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）のフローサイトメトリー分析は、ＧＰ２がＧＦＰ＋細胞で高度に発現されたのに対して、ＣＤ４９ｄはＧＦＰ−細胞において富化されたことを確認した。より詳細に言えば、ｄ１７において大部分のＧＦＰ−細胞（７０〜７２％）はＣＤ４９ｄを発現したが、６４〜７６％のＧＦＰ＋細胞はＧＰ２を共発現した。重要なことに、ＧＦＰ−細胞の僅かな画分（３〜７％）のみがＧＰ２を発現し、ＧＦＰ＋細胞は基本的にほとんど（１〜２％）ＣＤ４９ｄを発現しなかった。

【図4C】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。選別された細胞集団の遺伝子発現分析は、ＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−選別細胞集団において、膵臓内胚葉マーカー及び新規細胞表面マーカーが高度に富化されたことを示した。

【図4D】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。ＧＰ２及びＣＤ４９ｄの発現を、フィーダーフリー系で培養した遺伝子的にタグ付けされていない細胞株ＨＵＥＳ−４においてフローサイトメトリーにより分析した。

【図4E】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。ＧＰ２＋ＣＤ４９ｄ−、ＣＤ４９ｄ＋ＧＰ２−及びＧＰ２−ＣＤ４９ｄ−細胞画分を選別し、遺伝子発現パターンを分析した。膵臓内胚葉マーカー、例えばＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＭＮＸ１、ＮＫＸ６−１、並びに新規細胞表面マーカーＧＰ２及びＦＯＬＲ１は、ＧＰ２＋ＣＤ４９ｄ−細胞画分において有意に富化された。ＧＰ２−ＣＤ４９ｄ−細胞画分中の残りのＰＤＸ１＋細胞は、低レベルのＮＫＸ６−１のみを発現し、ＧＰ２がＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞について特異的に富化することを確認する。

【図4F】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。非造血細胞及び非内皮細胞（ＣＤ４５−ＣＤ３１−）に対してゲーティングされた、ヒト胎児膵臓（９．１ＷＤ）におけるＧＰ２及びＣＤ４９ｄ発現のフローサイトメトリー分析。

【図4G】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。ＦＡＣＳ選別されたＧＰ２＋及びＣＤ４９ｄ＋（ＣＤ４５−ＣＤ３１−に対してゲーティングされたもの）細胞集団におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現のｑＰＣＲ分析は、ＧＰ２＋対ＣＤ４９ｄ＋細胞において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−の有意な富化を示した。結果は、対照遺伝子ＨｐｒｔまたはＧａｐｄｈの発現に対して任意単位（ＡＵ）で提示される。^＊Ｐ＝０．０２３、及び^＊＊Ｐ＝０．０１０。ＮＤ＝非検出。

【図4H】ｈＰＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓内胚葉で発現した新規細胞表面マーカー。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ画分の原形質膜または細胞外領域に局在する遺伝子の富化を示すヒートマップ。矢印は、異なる細胞集団において富化された選択された細胞表面マーカーを示す。８．７ＷＤでのＧＰ２＋（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−）及びＣＤ４５＋／ＣＤ３１＋細胞におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現のフローサイトメトリー分析。９１％のＧＰ２＋（ＰＤＸ１＋）細胞がＮＫＸ６．１を共発現した。ＣＤ４５＋ＣＤ３１＋細胞を、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現のネガティブ対照として使用した。ＦＡＣＳプロットは、３つの独立した実験の代表である。この結果は、ＧＰ２がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を同時発現する膵臓前駆細胞を特異的にマークすることを示す我々の以前の所見を裏付けている。

【図5A】分化したｈＰＳＣにおけるＦＯＬＲ１発現の特徴付け。ＭＥＦ上で培養されたＰＤＸｅＧ細胞株における、ＣＤ４９ｄと組み合わせたマーカーＦＯＬＲ１のＦＡＣＳ分析。

【図5B】分化したｈＰＳＣにおけるＦＯＬＲ１発現の特徴付け。ＦＯＬＲ１−／＋ＣＤ４９ｄ＋、ＣＤ４９ｄ−／ＦＯＬＲ１＋、及びＧＦＰ＋／ＦＯＬＲ１−細胞分画を選別し、遺伝子発現パターンを分析した。

【図5C】分化したｈＰＳＣにおけるＦＯＬＲ１発現の特徴付け。フィーダーフリー系で培養した遺伝子的にタグ付けされていない細胞株ＨＵＥＳ４における、ＦＯＬＲ１及びＣＤ４９ｄのＦＡＣＳ分析。

【図5D】分化したｈＰＳＣにおけるＦＯＬＲ１発現の特徴付け。ｑＰＣＲ分析は、ＦＯＬＲ１−Ｃｄ４９ｄ＋、ＦＯＬＲ１−Ｃｄ４９ｄ−、及びＦＯＬＲ１＋Ｃｄ４９ｄ−細胞に対しても実施された。ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＭＮＸ１、及びＮＫＸ６−１のような膵臓内胚葉マーカー及び新規な細胞表面マーカーのＧＰ２及びＦＯＬＲ１は、ＦＯＬＲ１＋ＣＤ４９ｄ−細胞画分において有意に富化された。データは、平均発現±ＳＥＭとして示されている。グラフは、１７日目に対照試料（ｅＧＦＰ−細胞）で検出されたものと比較して倍の増加を表す。ＦＯＬＲ１はＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋及びＰＤＸ１／ＮＫＸ６−１−細胞の両方で発現するので、それはＰＰＣ類のマーキングにおいてＧＰ２のように特異的／効果的ではなく、結果的に、ＦＯＬＲ１−ＣＤ４９ｄ−細胞画分は依然としてＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１発現細胞を含んでいる。

【図6A】独立の以前に公表された分化プロトコルを用いたＧＰ２の検証。Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３．により公表された分化プロトコルの若干改変されたバージョンに従い、ｈＰＳＣ由来の膵臓前駆細胞を誘導するためのスキーム。

【図6B】独立の以前に公表された分化プロトコルを用いたＧＰ２の検証。ＰＤＸｅＧ細胞株を用い、ＧＦＰ及びＧＰ２の発現に基づいて分化したｈＰＳＣを選別し、ｑＰＣＲにより分析した。

【図6C】独立の以前に公表された分化プロトコルを用いたＧＰ２の検証。選別された集団のｑＰＣＲ分析：ＧＰ２−ＧＦＰ−細胞、ＧＰ２−ＧＦＰ＋細胞、及びＧＰ２＋ＧＦＰ＋細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現細胞が、ＧＰ２−ＧＦＰ＋細胞と比較してＧＰ２＋ＧＦＰ＋細胞画分において有意に富化されていることを示した。このデータにより、ＧＰ２を使用して、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を同時発現するヒト膵臓前駆細胞を、異種細胞培養物から単離し得ることが確認される。

【図7A】膵臓前駆細胞の精製のための、以前に公表された細胞表面マーカーの特徴付け。ＭＥＦ上で培養されたＰＤＸｅＧレポーター細胞株における、以前に同定された細胞表面マーカーＣＤ１４２及びＣＤ２００のフローサイトメトリー分析。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞の大部分がＣＤ１４２及びＣＤ２００で染色され、これらマーカーは異種細胞培養物中でＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞を認識するのに十分に特異的ではないことを示している。

【図7B】膵臓前駆細胞の精製のための、以前に公表された細胞表面マーカーの特徴付け。遺伝子的にタグ付けされていない細胞株（ＨＵＥＳ４）が、フィーダーフリーの培養系において、Ｒｅｚａｎｉａら（２０１３）により公表された分化プロトコルの僅かに改変されたバージョンに従って分化され、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１４２、及びＣＤ２００と組み合わせてＧＰ２で染色された。

【図7C】膵臓前駆細胞の精製のための、以前に公表された細胞表面マーカーの特徴付け。異なる選別された集団（ＧＰ２−、ＧＰ２＋、ＣＤ１４２＋、及びＣＤ２００＋）のｑＰＣＲ分析により、ＧＰ２＋細胞において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の有意な富化を確認した。これらの結果は、ＧＰ２が、以前に公表されたマーカーＣＤ１４２及びＣＤ２００と比較して、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞を標識化することにおいて優れていることを示している。

【図8A】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。細胞表面マーカーＣＤ４９ｄ及びＧＰ２で解離及び染色される膵臓前駆細胞へのｈＰＳＣの分化を示す概略図。

【図8B】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。再プレーティングされたＦＡＣＳ選別したＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−膵臓前駆細胞を、インスリン発現細胞へと分化させるために適用された分化プロトコルを示す表。Ｆｏｒ：フォルスコリン（１０μＭ）、Ａｌｋｉ：Ａｌｋ５阻害剤（４．５μＭ）、Ｎｉｃ：ニコチンアミド（１０ｍＭ）、Ｒｏｃｋｉ：Ｒｏｃｋ阻害剤（１０−１５μＭ））、ＤＦ１２：ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｂ２７：Ｂ２７サプリメント。

【図8C】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。分化したｈＰＣＳの、１８日目におけるＧＰ２及びＣＤ４９ｄ染色を示すＦＡＣＳプロット。

【図8D】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。遺伝子的にタグ付けされていない細胞株ＨＵＥＳ４から単離された分化したＧＰ２＋（ＣＤ４９ｄ−）ＰＰＣ細胞及びＧＰ２ｌｏｗ（ＣＤ４９ｄ−）細胞は、ＧＰ２＋（ＣＤ４９ｄ−）細胞において、Ｃペプチド＋細胞の有意な富化を示す。

【図8E】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。インスリン発現細胞に分化された、精製及び再プレーティングされたＧＰ２＋（ＣＤ４９ｄ−）膵臓前駆細胞（遺伝子的にタグ付けされていない細胞株ＨＵＥＳ４から単離された）の免疫蛍光分析。

【図8F】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。１８日目の、Ｇｐ２ｌｏｗ対ＧＰ２＋細胞におけるＣＰＥＰ発現細胞の割合。

【図8G】精製されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣの、グルコース応答性インスリン発現細胞への分化。分化したＧＰ２＋（ＣＤ４９ｄ−）細胞において、静的グルコース刺激インスリン分泌アッセイ（ＧＳＩＳ）により、ヒトＣペプチドの放出を測定した。結果は、高濃度のグルコースでの刺激がＣペプチドの統計的に有意な増加をもたらすことを示し、主要なトリガー経路（Ｋ−ＡＴＰチャンネル依存性）がＧＰ２＋ＰＰＣ−由来β細胞において機能することを示した。

【図9A】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。細胞周期の種々の段階を示す概略図。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9B】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。１１日目からの分化したｈＰＳＣを、対照及びＣＤＫＮ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に試料を採取し、ウエスタンブロット分析により分析した。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9C】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。未熟ＧＰ２＋膵臓前駆細胞からなるｈＰＳＣにおけるＣＤＫＮ１αのノックダウンは、１４日目までにＧ２／Ｍ期の細胞数の有意な増加をもたらす。この増加は、Ｇ０／Ｇ１細胞の数の減少と相関しており、ｐ２１のレベルを低下させることにより、細胞のＧ０／Ｇ１から増殖状態（Ｇ２／Ｍ）への移行が促進されることを示唆する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9D】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。未熟ＧＰ２＋膵臓前駆細胞からなるｈＰＳＣにおけるＣＤＫＮ１αのノックダウンは、１４日目までにＧ２／Ｍ期の細胞数の有意な増加をもたらす。この増加は、Ｇ０／Ｇ１細胞の数の減少と相関しており、ｐ２１のレベルを低下させることにより、細胞のＧ０／Ｇ１から増殖状態（Ｇ２／Ｍ）への移行が促進されることを示唆する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9E】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。未熟ＧＰ２＋膵臓前駆細胞からなるｈＰＳＣにおけるＣＤＫＮ１αのノックダウンは、１４日目までにＧ２／Ｍ期の細胞数の有意な増加をもたらす。この増加は、Ｇ０／Ｇ１細胞の数の減少と相関しており、ｐ２１のレベルを低下させることにより、細胞のＧ０／Ｇ１から増殖状態（Ｇ２／Ｍ）への移行が促進されることを示唆する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9F】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。より成熟したＧＰ２＋膵臓前駆細胞がｈＰＳＣ培養物中に存在するときに、ｐ２１が後の時点（１７日目）でノックダウンされれば、増殖効果は消失する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9G】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。より成熟したＧＰ２＋膵臓前駆細胞がｈＰＳＣ培養物中に存在するときに、ｐ２１が後の時点（１７日目）でノックダウンされれば、増殖効果は消失する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9H】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。より成熟したＧＰ２＋膵臓前駆細胞がｈＰＳＣ培養物中に存在するときに、ｐ２１が後の時点（１７日目）でノックダウンされれば、増殖効果は消失する。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図9I】ＣＤＫＮＩのノックダウンは、増殖するＧＰ２＋ＰＰＣの有意な増加をもたらす。１４日目からｓｉＲＮＡで処理されたｈＰＳＣの免疫蛍光分析は、ＣＤＫＮ１ａのノックダウンから７２時間後の、Ｋｉ６７＋細胞の有意なアップレギュレーションを明らかにする。これらのデータは、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αノックダウンが、インビトロ培養の際のＧＰ２＋ｈＰＰＣのプールを拡大するために利用され得るとの証拠を提供する。

【図10】インスリン産生細胞へのｈＥＳＣの分化の中間段階を示す概略図。新規な細胞表面マーカーであるＧＰ２、ＦＯＬＲ１及びＣＤ４９ｄは、ＰＥ期において膵臓前駆細胞を単離するために使用することができる。これらの膵臓前駆細胞は、腺房、腺管、及び膵臓を含む内分泌細胞へと分化する能力を有する。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本発明は、特許請求の範囲に規定された通りである。

【0007】

本発明者らは、真の膵臓前駆細胞の単離に有用な新規マーカーを同定した。

【0008】

正常β細胞と機能特性を共有するｈＰＳＣ由来のグルコース応答性インスリン産生細胞を生成する最近の成功（Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）によって、Ｉ型糖尿病の細胞ベースの治療の実施は手の届く現実となった。このアプローチの治療上の成功は、ｈＰＳＣ誘導体の生産をスケールアップする能力に依存する。臓器修復及び疾患回復に必要とされる機能的細胞の数は、患者当たり１０^９のオーダーと推計された（Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｋｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。従って、分化戦略は、工業規模での量産に適合させる必要がある。現在のところ、グルコース応答性インスリン産生細胞の生成には、腫瘍形成傾向を有する未分化のｈＰＳＣを開始細胞集団として使用する、面倒で複雑な多段階プロトコルが必要とされる。β細胞の生成のためにより多くの成熟細胞が使用される戦略を確立することにより、細胞治療に使用する最終細胞調製物の腫瘍誘発細胞による潜在的な汚染が防止され、より安全で再現性のある製造手順が達成され得る。しかし、膵臓分化における後期ステージの細胞集団を精製するために使用され得るステージ特異的表面マーカーが不足している。

【0009】

正常な胚発生の際に、転写因子である膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）及びＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６−１）の共発現により認識される高度に増殖性のヒト及びマウスの膵臓前駆細胞は、膵臓上皮の適切な増殖を担っており、外分泌細胞、腺管細胞、及び内分泌細胞を含む全ての膵臓細胞型を生じる。結局、膵臓前駆細胞は、β細胞のようなホルモン産生内分泌細胞の生成のための理想的な開始集団として役立つ可能性がある。更に、以前の刊行物は、膵臓前駆細胞の富化が移植時の奇形腫形成のリスクを低下させるという見解を支持している。ｈＰＰＣの単離は、組織特異的細胞表面分子を使用して得ることができ、実際に、ｈＰＳＣ由来の膵臓細胞集団のためのマーカー（膵臓前駆細胞についてはＣＤ１４２、内分泌細胞についてはＣＤ２００／ＣＤ３１８）が報告されている（Ｋｅｌｌｙ ２０１１）。しかしながら、著者が指摘しているように、膵臓前駆細胞マーカーＣＤ１４２が富化された集団は専ら膵臓前駆細胞で構成されているわけではないので、この分子の特異性には疑問が残る。従って、前駆細胞集団を富化するための、新しいより特異的なマーカーの必要性は依然として満たされるべく残されている。

【0010】

組織特異的レポーター細胞株の作製は、膵臓特異的細胞表面マーカーを同定するプロセスを支援することができるであろう。従って、ｈＰＳＣからの純粋なＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞の単離を可能にするために、遺伝子ターゲッティングによって、ＰＤＸ１−ｅＧＦＰレポーター細胞株（ＰＤＸｅＧ）を樹立した。遺伝子ツールとしてＰＤＸｅＧレポーター細胞株を使用することにより、ＰＤＸ１＋細胞の異なる亜集団を単離して、ｈＰＰＣの単離のための新規な細胞表面マーカーの同定を可能にするゲノムワイドな発現解析を行うことができた。より詳細に言えば、前腸内胚葉細胞から真の膵臓前駆細胞を分離することを可能にする３つの新規な細胞表面マーカー：即ち、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋ｈＰＰＣの単離のためのマーカーとしての糖タンパク質２（ザイモジェン顆粒膜）（ＧＰ２）、ＰＤＸ１−細胞画分を標識するネガティブ選別マーカーとしてのインテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４またはＣＤ４９ｄ）、及び最後に第３のマーカー、即ち、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞を認識する葉酸受容体１（成人）（ＦＯＬＲ１）を同定した。

【0011】

これらのマーカーの特異性は、ヒト胎児膵組織を用いて実証された。更に、簡略化され且つ定義された分化戦略を用いて、ＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−膵臓前駆細胞は、内分泌細胞に成熟し、且つグルコース応答性のインスリン産生細胞に分化する能力を保持することを示す。最後に、ｓｉＲＮＡスクリーニング、マイクロアレイにより同定された候補遺伝子のターゲッティングを行い、ｈＰＰＣの増殖に関与する新しい遺伝子を見出した。要するに、本発明者らは、Ｉ）ｈＰＰＣの単離のための新規な細胞表面マーカーと、ＩＩ）単離されたｈＰＰＣからグルコース応答性インスリン産生細胞を得るための簡略化された明確な分化戦略と、ＩＩＩ）ｈＰＰＣがインビトロでどのように増殖されるかについての新規な洞察を提供し、ｈＰＰＣの更に深い特徴付けを可能にするだけでなく、糖尿病の更なる細胞置換療法のためにこれら前駆細胞を増殖させるための新規な戦略の開発促進を可能にする。

【0012】

従って、第１の態様において、本発明は、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための方法を提供し、該方法は
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0013】

更なる態様において、本発明は、真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を生成するための方法に関し、前記富化された細胞集団は、少なくとも７０％真正膵臓前駆細胞を含む。

【0014】

更に別の態様において、本発明は、少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団に関する。

【0015】

更に別の態様において、本発明は、本明細書に開示される方法により得ることができる、真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団に関する。

【0016】

更に別の態様において、本発明は、それを必要とする個体の代謝障害の治療のための、本明細書に開示された方法により得ることができる、真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団に関する。

【0017】

更に別の態様において、本発明は、それを必要とする個体において代謝障害を治療する方法であって、本明細書に記載の細胞集団を提供する工程を含む方法に関する。

【0018】

定義
＜抗体＞．「抗体」の用語は、血清の機能的成分を表し、しばしば分子の集合（抗体または免疫グロブリン）または１分子（抗体分子または免疫グロブリン分子）の何れかを意味する。抗体分子は、特異的な抗原決定基（抗原または抗原性エピトープ）に結合するかまたは特異的抗原決定基（抗原または抗原エピトープ）と反応することができ、これは次に免疫学的エフェクター機構の誘導を導き得る。個々の抗体分子は、通常は単一特異性とみなされ、抗体分子の組成は、モノクローナル（即ち、同一の抗体分子からなる）か、またはポリクローナル（即ち、同じ抗原または別個の異なる抗原上の同一または異なるエピトープと反応する異なる抗体分子からなる）である。各抗体分子は、それが対応する抗原に特異的に結合することを可能にするユニークな構造を有し、全ての天然抗体分子は、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖の同じ全体的基本構造を有する。抗体は、集合的に免疫グロブリンとしても知られている。本明細書中で使用される抗体（複数可）には、最も広い意味で使用され、またそのままの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体及び一本鎖抗体、並びに抗体の結合性断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片、並びに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのような多量体形態が含まれる。

【0019】

＜抗原＞．抗原は、少なくとも１つのエピトープを含む分子である。抗原は、例えばポリペプチド、多糖類、タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質であり得る。

【0020】

＜真正膵臓前駆細胞＞．「真正膵臓前駆細胞」または「真の膵臓前駆細胞」の用語は、本明細書では、腺房、腺管、及びインスリン産生細胞のような内分泌系統を含む、全ての膵臓系統に分化することができる細胞を言う。

【0021】

＜胚体内胚葉＞．本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」または「ＤＥ」とは、腸管の細胞または腸管由来の器官に分化できる多分化能細胞を言う。特定の実施形態によれば、胚体内胚葉細胞及びそれに由来する細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト細胞である。幾つかの実施形態において、胚体内胚葉細胞は、一定のマーカーを発現し、または有意に発現しない。幾つかの実施形態においては、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬｌ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱｌ、ＣＭＫＯＲｌ、ＣＥＲ及びＣＲＩＰｌから選択される１以上のマーカーが胚体内胚葉細胞で発現される。他の実施形態において、ＯＣＴ４、ＨＮＦ４Ａ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７は、胚体内胚葉細胞において有意には発現されない。胚体内胚葉細胞はＰＤＸ−１を発現しない。

【0022】

＜分化細胞可能なまたは分化した細胞＞．本明細書で使用するとき、「分化可能な細胞」または「分化した細胞」または「ｈＥＳ由来の細胞」との語句は、以下に詳細に定義するように、万能性、多能性、少能性または単能性の細胞を指称することができる。一定の実施形態において、前記分化可能な細胞は、万能性の分化可能な細胞である。より具体的な実施形態において、前記万能性の分化可能な細胞は、胚性幹細胞、ＩＣＭ／表皮細胞、原始外胚葉細胞、始原生殖細胞、及び奇形癌細胞からなる群から選択される。１つの特定の実施形態において、前記分化可能な細胞は、哺乳動物の胚性幹細胞である。更に特定の実施形態において、前記分化可能な細胞はヒト胚性幹細胞である。一定の実施形態はまた、前記細胞が本明細書で定義するように分化可能であるという条件で、動物内の任意の供給源由来の分化可能な細胞を想定する。例えば、前記分化可能な細胞は、胚もしくはその中の任意の始原胚層、胎盤もしくは絨毛組織、またはより成熟した組織、例えば限定するものではないが脂肪、骨髄、神経組織、乳房組織、肝臓組織、膵臓、上皮、呼吸器、性腺及び筋肉組織を含む成人幹細胞から採取することができる。特定の実施形態において、前記分化可能な細胞は胚性幹細胞である。他の特定の実施形態において、前記分化可能な細胞は成体幹細胞である。更に他の特定の実施形態において、前記幹細胞は、胎盤由来または絨毛由来の幹細胞である。

【0023】

＜分化＞．本明細書で使用する「分化」の用語は、それが由来する細胞型よりも更に分化した細胞型の産生を意味する。従って、この用語は、部分的及び最終的に分化した細胞型を包含する。同様に、「ｈＥＳＣから産生された」「ｈＥＳＣから誘導された」「ｈＥＳＣから分化された」「ｈＥＳ由来細胞」及び同等の表現は、ｈＥＳＣからのインビトロ及びインビボでの分化した細胞型の産生を言う。

【0024】

＜胚性＞．本明細書中で使用される場合、「胚性」とは、単一の接合体で始まり、発生した配偶子細胞以外の分化万能性細胞または分化全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる、生物の発生段階の範囲をいう。配偶子融合により誘導される胚に加えて、「胚」の用語は体細胞核移植により誘導される胚を意味する。

【0025】

＜発現レベル＞．本明細書中で使用されるとき、「発現レベル」の用語は、転写物（ｍＲＮＡ）のレベル、または特定の遺伝子もしくはタンパク質のタンパク質レベルをそれぞれ指称することができる。従って、発現レベルは、転写レベルまたはタンパク質レベルを決定することによって、当該分野で既知の方法により決定することができる。転写レベルは、限定されるものではないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイに基づく方法のような方法により、転写物の量を定量することによって測定することができる。タンパク質レベルは、ウエスタンブロット及び免疫染色のような方法により測定できるが、これらに限定されない。

【0026】

＜ヒト胚性幹細胞＞．ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚の未分化の内細胞塊に由来する。これらの細胞は万能性であり、３つの一次胚葉の全ての誘導体、即ち外胚葉、内胚葉及び中胚葉に分化することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。本明細書中で使用するとき、「ヒト万能性幹細胞」（ｈＰＳ）の用語は、任意の供給源に由来し得、適切な条件下で、３種の胚層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の全ての誘導体である異なる細胞型のヒト子孫を産生できる細胞を意味する。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、及び／または組織培養において３つの胚葉全ての同定可能な細胞を形成する能力を有し得る。ヒト万能性幹細胞の定義には、文献において屡々ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と称されるヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｈｅｉｎｓ ｅｔ．ａｌ． （２００４）参照）、並びに誘導万能性幹細胞（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：５８５８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｅｌｌ １３１ （５）：８６１参照）が含まれる。本明細書に記載の種々の方法及び他の実施形態は、種々の供給源からのｈＰＳ細胞（ｈＰＳＣ）を必要とし、または利用し得る。例えば、使用に適したｈＰＳ細胞は、発生中の胚から得ることができる。それに加えて、または代替的に、適切なｈＰＳ細胞は、胚の破壊を必要としない方法（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８）によって、樹立された細胞株及び／またはヒト誘導万能性幹（ｈｉＰＳ）細胞から得ることができる。

【0027】

本明細書中で使用するとき、「ｈｉＰＳ細胞」とはヒト誘導万能性幹細胞を言う。本明細書で使用する「胚盤胞由来幹細胞」の用語はＢＳ細胞と呼ばれ、ヒト形態は「ｈＢＳ細胞」と称される。文献では、該細胞は胚性幹細胞、より具体的にはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と呼ばれることが多い。従って、本発明において使用される万能性幹細胞は、例えばＷＯ０３／０５５９９２及びＷＯ２００７／０４２２２５に記載されているように胚盤胞から調製された胚性幹細胞であってよく、または市販のｈＢＳ細胞または細胞株であってもよい。しかし、本発明においては、任意のヒト万能性幹細胞を使用できることが更に想定され、これにはＹｕ， ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００７及びＹｕ ｅｔ ａｌ ２００９に開示されたように、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８のような特定の転写因子で成体細胞を処理することにより万能性細胞に再プログラムされる、分化した成体細胞が含まれる。

【0028】

＜不活性化＞：本明細書では、「不活性化」という用語は、細胞内の所与のタンパク質の機能の不活性化に関連して使用され、機能の喪失を得るための細胞の操作を意味する。不活性化は、当技術分野で知られているように、例えばタンパク質の機能を阻害できる阻害剤を使用することによって達成することができる。不活性化は、当該タンパク質をコードする遺伝子の突然変異または欠失によっても達成され得る。当業者に知られているように、例えばｓｉＲＮＡを使用することによるサイレンシングを用いて不活性化を達成することもできる。不活性化は、一時的または永続的であってよい。不活性化は、可逆的または不可逆的であってよい。例えば、細胞集団を阻害剤と共にインキュベーションすることは、阻害剤が有効または存在する限り、典型的には一時的な不活性化をもたらす。環境から該阻害剤を除去することは、一般的に、不活性化の軽減をもたらす。同様に、ｓｉＲＮＡは、典型的には、それらが発現または存在する限りでのサイレンシング効果を有するのみである。他方、遺伝子の欠失または突然変異は典型的には永続的な不活性化をもたらすが、当業者は、欠失または突然変異の影響を逆転させる方法（例えば遺伝子編集方法による）を知るであろう。

【0029】

＜誘導万能性幹細胞＞：誘導万能性幹細胞（またはｉＰＳＣ）は、再プログラミングによって成体細胞から直接得ることができる（Ｔａｋａｓｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。ｉＰＳＣはタンパク質によって誘導され、従って、タンパク質誘導万能性幹細胞（ｐｉＰＳＣ）と呼ばれる

【0030】

＜リガンド＞．本明細書で使用するとき、「リガンド」とは、細胞上のマーカーまたは標的もしくは受容体もしくは膜タンパク質、または試料または溶液中の可溶性検体に対して、特異的に結合または交差反応する部分または結合パートナーをいう。細胞上の標的にはマーカーが含まれるが、これに限定されない。そのようなリガンドの例には、限定されるものではないが、細胞抗原に結合する抗体、可溶性抗原に結合する抗体、既に細胞もしくは可溶性抗原に結合した抗体に結合する抗原；可溶性の糖鎖または糖タンパク質もしくは糖脂質の一部である糖鎖部分に結合するレクチン；またはそのような抗体及び抗原の結合できる機能的断片；細胞標的または可溶性分析物の標的核酸配列に十分に相補的で、該標的配列または分析物配列に結合する核酸配列、既に前記細胞マーカーもしくは標的もしくは可溶性分析物に結合したリガンド核酸配列に対して十分相補的な核酸配列、またはビオチンもしくはアビジンのような化学的またはタンパク質的化合物が含まれる。リガンドは、アッセイフォーマット、例えば抗体親和性クロマトグラフィーによって指示されるように、可溶性であることができ、または捕捉媒体上に固定化される（即ち、ビーズに合成的に共有結合される）ことができる。本明細書で定義されるように、リガンドには、１以上の特異的な細胞マーカーまたは標的または可溶性分析物を検出し、及びこれと反応する種々の物質が含まれるが、これらに限定されない。

【0031】

＜マーカー＞．本明細書中で使用するとき、「マーカー」、「エピトープ」、「標的」、「受容体」またはその均等物は、観察または検出され得る任意の分子を指称することができる。例えば、マーカーには、特定の遺伝子の転写物のような核酸、膜タンパク質のような遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物であるポリペプチド、糖タンパク質、糖鎖、糖脂質、脂質、リポタンパク質、または小分子（例えば、１０，０００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が含まれ得るが、これらに限定されない。「細胞表面マーカー」は、細胞表面に存在するマーカーである。

【0032】

＜多能性細胞＞．本明細書中で使用するとき、「多能性」または「多能性細胞」とは、限られた数の他の特定の細胞型を生じ得る細胞型を言う。多能性細胞は、１以上の胚性細胞の運命に関与しており、従って、万能性細胞とは対照的に、３つの胚葉系統の各々、並びに胚体外細胞を生じることはできない。

【0033】

＜ナイーブ幹細胞及びプライミングされた幹細胞＞．幾つかのタイプの細胞に分化できるが、既にある程度は予め決定されているプライミング幹細胞とは異なり、ナイーブ幹細胞は任意の種類の細胞へと発生する能力を有している。ナイーブ幹細胞はマウスに存在することが知られているが、ヒトナイーブ幹細胞は最近になって記載されていたに過ぎない（Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。ナイーブ幹細胞は、ＥＲＫシグナリングなしで連続的に自己複製することができ、表現型的に安定で、核型的に手付かずで完全である。それらはインビトロで分化し、インビボで奇形腫を形成する。代謝は、ＥＳＣにおけると同様に、ミトコンドリア呼吸の活性化で再プログラミングされる。ヒト細胞の万能性状態は、Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４に記載されているように、ＮＡＮＯＧ及びＫＬＦ２の２つの成分の短期発現により再設定できる。ナイーブＰＳＣは、胚盤胞の内部細胞塊と多くの特性を共有しているのに対して、プライミングされたＰＳＣは、より進んだ原腸形成期の胚の胚盤葉上層細胞に似ている。マウスでは、ナイーブ状態は胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）によって表され、プライミングされた状態は上胚幹細胞（ＥｐｉＳＣ）によって表される。ヒトにおいては、胚盤胞由来のＥＳＣは、最近までｍＥＳＣのヒト同等物とみなされてきた。しかし、理論に束縛されるものではないが、平坦な形態、増殖因子に対する依存性、またはＸ染色体不活性化のような複数の特性に基づけば、ｈＥＳＣ（及びヒト誘導万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）はｍＥＳＣによりもマウスＥｐｉＳＣに近く、従って万能性のナイーブな状態よりもプライミングされた状態に対応している可能性が高い（Ｔｅｓａｒ ｅｔ ａｌ． ２００７；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ ２０１０）。

【0034】

＜天然に存在する抗体＞．「天然に存在する抗体」の用語は、抗原を認識して結合することができ、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの同一の重鎖（Ｈ）及び２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含むヘテロ四量体糖タンパク質を言う。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略記する）及び重鎖定常領域（本明細書ではＣ_Ｈと略記する）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記する）及び軽鎖定常領域（本明細書ではＣ_Ｌと略記する）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は更に、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存された領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域に細分化することができる。抗体は、幾つかの同一のヘテロ四量体を含み得る。

【0035】

＜膵臓前駆細胞または多能性膵臓前駆細胞＞．前駆細胞は、特定のタイプの細胞に分化することをコミットされた細胞である。従って、膵臓前駆細胞は多能性であり、分化して膵臓の全ての細胞型を生じさせることができる。

【0036】

＜部分的に成熟した細胞＞．本明細書中で使用するとき、「部分的に成熟した細胞」とは、当該表現型の少なくとも１つの特徴、例えば、同じ器官または組織由来の成熟細胞の形態またはタンパク質発現を示す細胞をいう。幾つかの実施形態は、例えばβ細胞のような膵臓型細胞などの分化可能細胞を産生できる、任意の動物由来の分化可能細胞を使用することを想定している。分化可能な細胞が採取される動物は、脊椎動物もしくは無脊椎動物、哺乳動物もしくは非哺乳動物、ヒトもしくは非ヒトであることができる。動物供給源の例には、霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ及びブタが含まれるが、これらに限定されない。

【0037】

＜万能性細胞＞．「万能性」とは、細胞が３つの胚葉系統のそれぞれを生じさせることができることを意味する。しかしながら、万能性細胞は、生物全体を生産することはできない可能性がある。特定の実施形態では、出発材料として使用される万能性細胞は、ヒト胚性幹細胞を含む幹細胞である。万能性細胞は、発達の異なる段階の胚から細胞を外植することにより誘導することができる。ＰＳＣ（万能性幹細胞）は、それが胚発生の際の何れの段階にあるかに応じて、２つの異なる状態、即ち、ナイーブな状態及びプライミングされた状態に分類することができる。

【0038】

＜幹細胞＞．幹細胞は、特殊化された細胞に分化することができ、また分割してより多くの幹細胞を産生できる未分化細胞である。幹細胞の用語には、胚性幹細胞、成体幹細胞、ナイーブ幹細胞及び誘導万能性幹細胞が含まれる。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、及び末梢分化細胞を含む子孫細胞を産生するために、単一細胞レベルにおいて自己複製及び分化の両方を行うそれらの能力によって定義される。幹細胞はまた、インビトロにおいて、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から種々の細胞系統の機能的細胞に分化する能力、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じさせる能力、及び胚盤胞への注射後には全部ではないにしろ、実質的に殆どの組織に寄与する能力を特徴とする。幹細胞は、その発生能により、（１）全能性、即ち全ての胚性及び胚体外性細胞型を生じさせることを意味する；（２）万能性、即ち全ての胚細胞型を生じさせることを意味する；（３）多能性、即ち細胞系統の或るサブセットを生じることができるが、特定の組織、器官または生理学的系の範囲内では全部のサブセットを生じることができることを意味する（例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、少能性前駆細胞に限定された血液細胞、及び血液の正常な成分である全ての細胞型及び要素（例えば血小板）を生じることができる）；（４）少能性、即ち多能性幹細胞よりも更に限定された細胞系統のサブセットを生じさせ得ることを意味する；（５）単能性、即ち単一の細胞系統を生じることができることを意味する（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。

【0039】

＜全能性幹細胞＞：この用語は、３つの胚葉系統及び胚外系統の全部のような、任意の及び全てのタイプのヒト細胞を生じさせる可能性を有する細胞を指す。それは機能的生物全体を生じることができる。

【0040】

本開示において、任意の遺伝子またはタンパク質の名称は、任意の種の遺伝子またはタンパク質を指すことができる。例えば、ＰＤＸ１またはＰｄｘ１は互換的に使用され、マウスＰｄｘ１またはヒトＰＤＸ１または別の種のＰｄｘ１の何れかを意味することができる。

【0041】

本開示において、遺伝子またはタンパク質名の後の「−」記号は、当該遺伝子またはタンパク質が発現されないことを意味し、遺伝子またはタンパク質名の後の「＋」記号は、当該遺伝子またはタンパク質が発現されることを意味する。従って、ＰＤＸ１−またはＰＤＸ１−細胞は、ＰＤＸ１を発現しない細胞であり、ＰＤＸ１＋またはＰＤＸ１＋細胞は、ＰＤＸ１を発現する細胞である。

【0042】

＜真正膵臓前駆細胞の単離方法＞
本開示の目的は、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための方法を提供することであって、該方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0043】

＜真正膵臓前駆細胞＞
膵臓では、幾つかの異なるタイプの膵臓細胞が見出され得る。膵臓細胞には、例えば、多能性膵臓前駆細胞、腺管／腺房前駆細胞、完全に分化した腺房／外分泌細胞、腺管／内分泌前駆細胞、内分泌前駆細胞、初期内分泌細胞、及び／または完全に分化した内分泌細胞が含まれる。内分泌細胞へと向かうｈＰＳＣの異なる段階を図１０に示す。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する膵臓内胚葉前駆細胞は、腺房細胞、腺管細胞または内分泌細胞に分化する能力を有する。「真正膵臓前駆細胞」または「真の膵臓前駆細胞」の用語は、本明細書では、腺房細胞、腺管細胞及びインスリン産生細胞のような内分泌細胞を含む全ての膵臓系統に分化することができる細胞を言う。

【0044】

膵臓の早期内分泌細胞は、膵臓内分泌ホルモン（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチド）の１つの発現を開始したが、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される完全に成熟した膵臓内分泌細胞の全ての特徴は共有していない細胞である。これらの細胞は、Ｎｇｎ３を消失させたが、グルコースに対する応答性のような成人膵臓のランゲルハンス島に見出される完全に分化した膵臓内分泌細胞の特徴の全部を共有してはおらず、膵臓内分泌ホルモン（インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリン）の一つについては陽性である内分泌細胞であり得る。

【0045】

膵臓内分泌細胞または膵臓ホルモン産生細胞は、次のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンの少なくとも１つを発現できる細胞である。

【0046】

「膵臓の完全に分化した内分泌細胞」（「完全に分化した内分泌細胞」、「膵臓成熟内分泌細胞」、「膵臓内分泌細胞」または「膵臓成人内分泌細胞」とも呼ばれる）は、成人膵臓のランゲルハンス島に見られる完全に分化した膵臓内分泌細胞の全ての特徴を共有する細胞である。

【0047】

本明細書に開示される方法は、膵臓内胚葉段階で膵臓前駆細胞を単離するために使用することができる。これらの細胞は、例えばβ細胞及び／またはインスリン産生細胞のような膵臓ホルモン産生細胞へと更に分化する能力を有し得る。このインスリン産生細胞は、グルコースに対して応答性であり得る。しかしながら、本方法により得られた細胞は、任意のタイプの膵臓細胞へと分化することができる。

【0048】

＜マーカー及びリガンド＞
インスリンプロモーター因子１としても知られるＰＤＸ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス１）は、膵臓の発達及びβ細胞の成熟に必要な転写因子である。胚発生において、ＰＤＸ１は胚体内胚葉の後部前腸領域における細胞集団によって発現され、ＰＤＸ１＋上皮細胞は膵臓芽の発生を生じさせ、最終的には膵臓の全部―その外分泌細胞集団、内分泌細胞集団及び腺管細胞集団―の発生を生じさせる（図１１）。Ｐｄｘ１は、β細胞の成熟にも必要であり：発生するβ細胞はＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１及びインスリンを同時発現し、β細胞の成熟に必要なスイッチであるＭａｆＢのサイレンシング及びＭａｆＡの発現をもたらすプロセスのためにも必要である。ＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞はまた、Ｈｌｘｂ９、Ｈｎｆ６、Ｐｔｆｌａ及びＮｋｘ６−１（ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−６．１）を同時発現し、またこれら前駆細胞は最初の膵芽を形成し、更に増殖し得る。膵臓内分泌細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１（ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞）を発現する。

【0049】

本方法は、ＰＤＸ１を発現しない細胞（ＰＤＸ１−細胞）に特異的な表面マーカーの同定に基づく一方、他のマーカーはＰＤＸ１を発現する細胞（ＰＤＸ１＋）に特異的であると同定され、更に他のマーカーはＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する細胞に特異的なものとして同定された。そのようなマーカーに結合できる分子は、本明細書では「リガンド」と称し、真の膵臓前駆細胞を単離するために使用することができる。

【0050】

従って、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0051】

細胞集団は、第１及び／または第２及び／または第３のリガンドの何れかに対して同時に、または後続の工程において曝露され得ること、及びこれらのステップが任意の順序で実施され得ることが理解されるであろう。幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、第１、第２または第３のリガンドのうちの１つだけに曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は、第１、第２または第３のリガンドのうちの２つまたは３つに曝露される。幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、第１、第２及び第３のリガンドに同時に曝露される。幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、別々の工程で第１リガンド及び第２リガンドに曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は、別々の工程で第１リガンド及び第３リガンドに曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は、第１のリガンド及び第２または第３のリガンドに同時に曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は第１のリガンドに曝露され、別の工程で第２及び第３のリガンドに同時に曝露される。他の実施形態では、前記細胞集団は、第１及び第２または第３リガンドに同時に曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は、第１及び第２のリガンドに同時に曝露され、別の工程で第３のリガンドに曝露される。他の実施形態において、前記細胞集団は、第１及び第３のリガンドに同時に曝露され、別の工程で第２のリガンドに曝露される。

【0052】

＜開始細胞集団＞
第１の工程においては、少なくとも一つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団が提供され、ここでの真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する。

【0053】

幾つかの実施形態において、前記開始細胞集団は、少なくとも５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも１０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも１５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも２０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも２５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも３０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも３５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも４０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも４５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも５０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも５５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも６０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも６５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞を含んでいる。

【0054】

前記富化された集団に含まれる真正前駆細胞の画分を決定するためには、免疫染色またはフローサイトメトリー法などの当分野で既知の方法を用いることができるが、これらに限定されない。

【0055】

理論に拘泥するものではないが、前記開始細胞集団における真正膵臓前駆細胞の割合は、ＧＰ２の発現によって推定することができる。従って、幾つかの実施形態において、開始細胞集団は、ＧＰ２を発現する少なくとも５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも１０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも１５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも２０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも２５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも３０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも３５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも４０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも４５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも５０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも５５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも６０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも６５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも７０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも７５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも８０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも８５％の細胞を含む。ＧＰ２発現は、当該分野で公知の方法、例えば免疫染色法、フローサイトメトリー法、または転写レベルの定量測定によって決定することができる。

【0056】

同様に、理論に拘泥するものではないが、開始細胞集団におけるＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞の割合は、ＧＰ２の発現によって推定することができる。従って、幾つかの実施形態において、開始細胞集団は、ＧＰ２を発現する少なくとも５％の細胞、ＧＰ２を発現する少なくとも１０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも１５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも２０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも２５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも３０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも３５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも４０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも４５％の細胞、ＧＰ２を発現する少なくとも５０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも５５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも６０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも６５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも７０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも７５％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも８０％の細胞、例えばＧＰ２を発現する少なくとも８５％の細胞を含む。ＧＰ２発現は、当該分野で公知の方法、例えば免疫染色法、フローサイトメトリー法、または転写レベルの定量測定によって決定することができる。

【0057】

幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、限定されるものではないが哺乳動物、例えばヒトのような個体から誘導または単離され得る。

【0058】

幾つかの実施形態において、前記細胞は、万能性幹細胞のような分化可能な細胞、例えばヒト万能性幹細胞（ｈＰＳＣ）に由来する。ｈＰＳＣには、ヒト誘導万能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びナイーブなヒト幹細胞（ＮｈＳＣ）が含まれる。

【0059】

一実施形態において、膵臓細胞を含む細胞集団は、胎児膵臓を含む膵臓から得られる。本発明の幾つかの態様において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、胎児膵臓または成人膵臓を含む膵臓から得られる。一態様において、前記膵臓はヒトのような哺乳動物由来である。

【0060】

別の実施形態において、膵臓細胞を含む前記細胞集団は体細胞集団である。幾つかの実施形態において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。本発明の更なる態様において、前記体細胞集団は、胚様幹細胞（ＥＳＣ、例えば万能性細胞、またはヒトＥＳＣの場合はｈＥＳＣ）に脱分化するように誘導されている。そのような脱分化した細胞はまた、誘導万能性幹細胞（ＩＰＳＣ、或いはヒトＩＰＳＣについてはｈＩＰＳＣ）と呼ばれる。

【0061】

更に別の実施形態では、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、ＥＳＣまたはｈＥＳＣである。一実施形態において、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、ＥＳＣまたはｈＥＳＣから得られる。幾つかの実施形態において、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、例えばＥＳＣ様細胞のような万能性細胞の集団である。

【0062】

幾つかの実施形態において、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団の分化は、当該分野で既知の方法によって誘導される。例えば、分化は、胚様体及び／または単層細胞培養物、またはそれらの組み合わせにおいて誘導され得る。

【0063】

本発明の一態様において、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団は、哺乳動物起源である。本発明の１つの態様において、前記少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団はヒト由来である。本発明の幾つかの態様において、細胞集団は、膵臓内分泌系統に分化している。

【0064】

本発明の一態様において、前記膵臓細胞を含む細胞集団は、１以上の供与された膵臓から得られる。本明細書に記載の方法は、供与された膵臓の年齢に依存しない。従って、胚から成人までの年齢範囲のドナーから単離された膵臓材料を使用することができる。

【0065】

ドナーから膵臓を採取したら、典型的には、それは様々な方法を用いて培養するために、個々の細胞または小細胞群を生じるように処理される。そのような方法の１つは、採取された膵臓組織を洗浄し、酵素消化のために調製することを必要とする。酵素処理は、採取した組織の実質がより小さな単位の膵臓細胞材料に解離されるように、結合組織を消化するために使用される。採取した膵臓組織は、採取された器官の全体構造から膵臓細胞材料、基礎構造及び個々の膵臓細胞を分離するために、１以上の酵素で処理される。コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、リパーゼ調製物及び他の酵素は、本明細書に開示された方法での使用が想定される。

【0066】

単離された原料物質は、本方法を実施する前に、１以上の所望の細胞集団を富化するために更に処理することができる。幾つかの態様において、未分画の膵臓組織は、一旦培養のために解離されると、それ以上分離することなく本発明の培養方法に直接使用することもできる。しかしながら、未分画の膵臓組織は、一旦培養のために解離されると、更に分離することなく本発明の培養方法において直接使用することができ、中間細胞集団を生じるであろう。一実施形態において、前記単離された膵臓細胞材料は、密度勾配（例えば、ナイコデンツ、フィコール、またはパーコール）を介した遠心分離によって精製される。ドナー源から採取された細胞の混合物は、典型的には不均一であり、従って、アルファ細胞、β細胞、デルタ細胞、腺管細胞、腺房細胞、通性前駆細胞、及び他の膵臓細胞型を含むであろう。

【0067】

典型的な精製手順は、単離された細胞材料の多くの層またはインターフェースへの分離をもたらす。典型的には、２つのインターフェースが形成される。上側のインターフェースは島細胞に富んでおり、典型的には１０〜１００％の島細胞を懸濁液中に含んでいる。

【0068】

第２のインターフェースは、典型的には、島細胞、腺房細胞及び腺管細胞を含む細胞の混合集団である。最下層は勾配の底部に形成されたペレットである。この層は、典型的には主に腺房細胞、幾つかのトラップされた島細胞、及び一部の腺管細胞を含む。線管ツリー成分（Ｄｕｃｔａｌ ｔｒｅｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）は、更なる操作のために別々に収集することができる。

【0069】

更なる操作のために選択される画分の細胞構成成分は、選択される勾配の画分及び各単離の最終結果に依存して変化するであろう。膵島細胞が所望の細胞型である場合、単離された画分内の膵島細胞の適切に富化された集団は、少なくとも１０％〜１００％の膵島細胞を含むであろう。他の膵臓細胞型及び濃度もまた、富化の後に採取することができる。例えば、本明細書に記載した培養方法は、使用した精製勾配に依存して、前記第二のインターフェースから、前記ペレットから、または他の画分から単離された細胞と共に用いることができる。
いる。

【0070】

一実施形態において、中間の膵臓細胞培養物が、島細胞に富む（上部）画分から生成される。しかしながら、これに加えて、膵島細胞、腺房細胞及び腺管細胞、または腺管ツリー構成要素、腺房細胞、及び幾つかのトラップされた膵島細胞の混合細胞集団をそれぞれ含む、より不均一な第２のインターフェース及び底部層画分もまた、培養に用いることができる。両方の層が、本明細書に記載の富化された真正膵臓前駆細胞集団を生じさせることができる細胞を含有するが、各層は、開示された方法での使用に特別な利点を有し得る。

【0071】

一実施形態において、前記細胞集団は幹細胞の集団である。別の実施形態において、前記細胞集団は、膵臓内分泌系統に分化した幹細胞集団である。一実施形態において、前記細胞集団は、胚の破壊を伴わずに得られる幹細胞の集団である。胚を破壊することなく幹細胞を得るための方法は、当該分野で知られている（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。

【0072】

幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、Ｄ’Ａｍｏｕｒ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００６）；Ｊｉａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００７）；及びＫｒｏｏｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ （２０１２， ２０１４）， Ｆｅｌｉｃｉａ Ｗ． Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ （２０１４）に記載されたプロトコルによって例示される。

【0073】

体細胞から、またはＥＳ様細胞のような万能性細胞に脱分化するように誘導された体細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、Ａｏｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｊｉａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００７）， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００７），Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ （２００６）， ａｎｄ Ｗｅｒｎｉｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００７）に記載されたプロトコルによって例示される。他のプロトコルは、Ｄ’Ａｍｏｕｒ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００６）、またはＫｒｏｏｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． （２００８）によって記述されている。

【0074】

分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）またはそれほど特殊化されていない細胞が、例えば神経細胞または筋肉細胞のような特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化された細胞または分化誘導された細胞とは、前記系統の細胞内でより特殊化された（「コミットされた」）地位を獲得した細胞である。分化のプロセスに適用される場合、「コミットされた」の用語は、分化経路において、正常な環境下では特定の細胞型または細胞型のサブセットにまで分化し続け、また正常な環境下では異なる細胞型への分化、またはより低い分化細胞型への逆戻りができない点にまで分化が進んだ細胞を意味する。脱分化とは、細胞が細胞系統内の特殊化の程度が低い（またはコミットされた）地位に戻る過程をいう。本明細書で用いるとき、細胞の系統とは細胞の遺伝性、即ち、それが何れの細胞から来たものか、及びそれが如何なる細胞を生じるのかを定義する。細胞の系統は、該細胞を発生及び分化の遺伝的スキーム内に置く。系統特異的マーカーとは、興味ある系統の細胞の表現型に特異的に関連する特性を意味し、コミットされていない細胞の興味ある系統へ分化を評価するために使用することができる。

【0075】

幾つかの態様において、本明細書で使用される「分化する」または「分化」とは、細胞が未成熟状態から未成熟度が低い状態へと進行する過程を意味する。別の態様において、本明細書で使用される「分化する」または「分化」とは、細胞が未分化状態から分化状態に、または未成熟状態から成熟状態へと進行する過程をいう。例えば、未分化の膵臓細胞は増殖して、ＰＤＸ１のような特徴的マーカーを発現することができる。初期の未分化胚性膵細胞は増殖して、ＰＤＸ１のような特徴的マーカーを発現することができる。一実施形態では、成熟または分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵内分泌ホルモンを分泌する。幾つかの実施形態において、成熟または分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌する。一実施形態において、例えば、成熟β細胞はインスリンを高レベルで分泌する。幾つかの実施形態において、例えば、成熟β細胞はグルコースに応答して高レベルでインスリンを分泌する。細胞の相互作用及び成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うか、または分化細胞のマーカーを獲得するに伴って生じる。一実施形態において、単一のマーカーの消失または獲得は、細胞が「成熟または分化した」ことを示すことができる。幾つかの実施形態において、単一マーカーの消失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化した」ことを示すことができる。「分化因子」の用語は、インスリン産生β細胞をも含む成熟内分泌細胞への分化を増強するために、膵臓細胞に添加される化合物を言う。例示的な分化因子には、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エキセンディン−４、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様成長因子−１、神経成長因子、表皮成長因子、血小板由来成長因子、及びグルカゴン様ペプチド１が含まれる。一実施形態において、前記細胞の分化には、１以上の分化因子を含む培地で細胞を培養することが含まれる。

【0076】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を分析して、出発集団の細胞の少なくとも１つが、膵臓内分泌系統に特徴的で、且つＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＭＡＦＡ、ＭＡＦＢ、ＡＲＸ、ＢＲＮ４、ＰＡＸ４及びＰＡＸ６、ＧＬＵＴ２、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）からなる群から選択されるマーカーを発現するかどうかを同定する。幾つかの実施形態において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される。一実施形態において、膵臓内分泌細胞は以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰＰの少なくとも１つを発現することができる。幾つかの実施形態において、膵臓内分泌細胞は以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＰ及びグレリンの少なくとも１つを発現することができる。本発明における使用に適切なものは、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１態様において、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。或いは、前記膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。

【0077】

一実施形態において、前記膵臓内分泌細胞は、前記β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞はＰＤＸ１を発現し、更に、次の転写因子、即ちＮＧＮ３、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ６−１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＦＯＸＡ２、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６の少なくとも１つを発現してもよい。一実施形態では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞はβ細胞である。一実施形態において、前記膵臓内分泌細胞は、マーカーＮＫＸ６−１を発現する細胞である。本発明の別の態様において、前記膵臓内分泌細胞は、マーカーＰＤＸ１を発現する細胞である。本発明の更なる態様において前記、膵臓内分泌細胞は、マーカーＮＫＸ６−１及びＰＤＸ１を発現する細胞である。

【0078】

ＰＤＸ１は、膵臓の発生に関与するホメオドメインの転写因子である。Ｐａｘ−４はβ細胞特異的因子であり、Ｐａｘ−６は膵島細胞（特異的）転写因子である；両方とも膵島発生に関与している。Ｈｎｆ−３β（ＦｏｘＡ２としても知られている）は、転写因子の肝臓核因子ファミリーに属し、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン及び２つの短いカルボキシ末端ドメインを特徴とする。ＮｅｕｒｏＤは、神経新生に関与する塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。Ｎｇｎ３は、塩基性ループ−ヘリックス−ループ転写因子のニューロゲニンファミリーのメンバーである。本明細書中で使用されるＮＫＸ２−２及びＮＫＸ６−１は、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのメンバーである。島−１またはＩＳＬ−１は、ＬＩＭ／ホメオドメインファミリーの転写因子であり、発生中の膵臓で発現される。ＭＡＦＡは、膵臓で発現される転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に関与する遺伝子の発現を制御する。ＮＫＸ６−１及びＰＤＸ１は、成人の膵臓（例えば、腺房、腺管及び内分泌細胞）に見られる全ての細胞型に発生し得る初期の膵臓多能性細胞において、ＰＴＦ１αと同時発現される。この細胞集団内には、一時的にＮＧＮ３をも発現する細胞が見出される。ある細胞がＮＧＮ３を発現し、または発現していると、それは内分泌系統の一部となり、後でランゲルハンス島を形成する内分泌細胞（一つのタイプはインスリン産生β細胞である）が生じる。ＮＧＮ３が存在しない場合、膵臓発生の際に内分泌細胞は形成されない。発生の進行に伴い、ＮＫＸ６−１及びＰＤＸ１は、膵臓のより中心のドメインに同時発現され、次いでこれらはＰＴＦ１ａを発現しなくなり、ＮＫＸ６−１及びＰＤＸ１陽性細胞がもはや腺房細胞を生じなくなる。このＮＫＸ６−１及びＰＤＸ１陽性の細胞集団内では、かなりの数の細胞が一過性にＮＧＮ３を同時発現し、発生初期のように内分泌系統についてそれらをマーキングする。

【0079】

一実施形態において、真正膵臓前駆細胞は分化できる細胞から誘導される。特定の実施形態において、前記分化できる細胞はヒト万能性幹細胞である。幾つかの実施形態において、前記分化できる細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（ｈＩＰＳＣ）、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）及びナイーブヒト幹細胞（ＮｈＳＣ）からなる群から選択される。

【0080】

分化できる細胞は、個体から単離された細胞から誘導され得る。

【0081】

Ｐ２１とも呼ばれるＣＤＫＮ１ａ及びＰ１６とも呼ばれるＣＤＫＮ２ａは、細胞周期特異的遺伝子である。ＣＤＫＮ１ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１またはＣＤＫ相互作用タンパク質１）は、ＣＤＫ２及びＣＤＫ１の複合体を阻害するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤である。従って、ＣＤＫＮ１はＧ１期及びＳ期における細胞周期進行のレギュレーターとして機能する。ＣＤＫＮ２ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａ、多発腫瘍抑制剤１）は腫瘍抑制タンパク質である。それは、Ｇ１期からＳ期への細胞の進行を減速させることにより細胞周期調節において重要な役割を果たし、従って、癌の予防に関与する腫瘍抑制因子として作用する。

【0082】

本発明者らは、驚くべきことに、開始細胞集団におけるＣＤＫＮ１ａまたはＣＤＫＮ２ａの不活性化が、特に開始細胞集団がＰＤＸ１発現膵臓前駆細胞である場合には、Ｇ２／Ｍ期に対応する複製状態における細胞集団の侵入を容易にすることを見出した。出発細胞集団におけるＣＤＫＮ１ａまたはＣＤＫＮ２ａの不活性化はまた、Ｓ期における細胞集団の侵入を促進し得る。従って、ＣＤＫＮ１ａまたはＣＤＫＮ２ａの不活性化は、増殖された膵臓前駆細胞から成熟β細胞を得るために有用であり得る。

【0083】

幾つかの実施形態において、出発細胞集団におけるＣＤＫＮ１ａ及び／またはＣＤＫＮ２ａの発現は不活性化される。幾つかの実施形態において、出発細胞集団はＰＤＸ１を発現する膵臓前駆細胞の集団である。開始細胞集団は、上記の集団の何れであってもよい。当業者は、ＣＤＫＮ１ａ及び／またはＣＤＫＮ２ａの発現を不活性化する方法を知っている。これは例えば、公知の遺伝子編集法により、対応する遺伝子を突然変異または欠損させることによって行うことができる。或いは、ＣＤＫＮ１ａ及び／またはＣＤＫＮ２ａの発現を防止するために、ｓｉＲＮＡなどのサイレンシング手段を使用してもよい。或いは、ＣＤＫＮ１ａ及び／またはＣＤＫＮ２ａの正確な機能を阻害する阻害剤を使用してもよい。

【0084】

＜リガンド＞
少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団が与えられた後に、前記集団は、ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに暴露され、前記第１のリガンドに結合しない細胞が選択される。このネガティブ分離は、ＰＤＸ１＋細胞に富んだ細胞集団をもたらす。該細胞集団を、ＰＤＸ１＋細胞に特異的なマーカーに結合する第二のリガンド及び／またはＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第三のリガンドに曝露させて、第２及び／または第３のリガンドに結合する細胞が選択される。第１のリガンド並びに第２及び／または第３のリガンドの各々への暴露は、同時にまたは別々の工程で行えることが理解されるであろう。

【0085】

従って、一実施形態において、前記細胞集団は、ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露される。第１のリガンドに結合しない細胞が選択された後、ＰＤＸ１＋細胞に富化した細胞集団を、ＰＤＸ１＋細胞に特異的なマーカーに結合する第二のリガンド及び／またはＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第三のリガンドに暴露させて、第２及び／または第３のリガンドに結合する細胞が選択される。

【0086】

別の実施形態において、前記細胞集団は、第１のリガンド、第２のリガンド及び／または第３のリガンドに同時に暴露され、第１のリガンドには結合しないが、第２及び／または第３のリガンドに結合する細胞が選択される。

【0087】

本明細書中に開示されるリガンドの各々は、マーカー、即ちＰＤＸ１＋細胞、ＰＤＸ１−細胞またはＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的なマーカーに対して特異的に結合または交差反応する部分である。「リガンド」または「リガンド（複数）」の用語は、第１、第２または第３のリガンドの何れかを指す一般的な用語として使用される。

【0088】

前記リガンドは、抗体またはその断片であってよく、ここでの抗体またはその断片は、ある種の細胞に特異的なマーカーを認識及び結合することができる。該抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。従って、幾つかの実施形態において、前記第１、第２及び第３のリガンドの少なくとも１つは、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその断片である。他の実施形態において、前記第１、第２及び第３のリガンドの少なくとも２つはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその断片である。他の実施形態において、前記第１、第２及び第３のリガンドは、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその断片である。

【0089】

幾つかの実施形態において、前記リガンドが結合するマーカーは細胞表面マーカーである。

【0090】

本明細書中に記載の実施形態で使用されるリガンド及び／または抗体は、幾つかの実施形態においては、検出可能な標識と連結され得る。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標識」または「検出可能な標識」とは、例えば、放射性、蛍光性、発光性、化学発光性、生物学的もしくは酵素的なタグ、または当該分野で標準的に使用される標識を意味する。本明細書に記載する一定の実施形態において有用な成分への結合のための検出可能なラベルは、診断アッセイ技術の当業者に既知で、且つ容易に入手可能な多くの組成物の中から容易に選択することができる。幾つかの実施形態において、前記標識は、直接的または間接的に検出可能な信号を与えることができる、単独で、または他の分子またはタンパク質と協働して作用する小さな化学分子であることができる。好ましい実施形態において、前記マーカーまたは標的は、アッセイにおいて使用される種々のリガンドまたは競合する分析物と関連付けられる。本明細書に記載の試薬、リガンド、競合する検体、または捕捉媒体は、使用される特定の検出可能な標識または標識系によって限定されない。幾つかの場合、前記検出可能な標識は、細胞表面またはビーズの屈折率を含むことができる。検出可能な標識は、核酸、抗体のようなポリペプチド、または小分子に接合され得るか、或いは結合され得るものである。例えば、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、合成の後に、ビオチン化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組み込むこと、または幾つかの同様の手段（例えば、ビオチンのタンパク質誘導体をＲＮＡに光架橋する）に続いて、標識されたストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリンに結合されたストレプトアビジン）または同等のものを付加することにより、標識することができる。或いは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブが使用される場合、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、及びその他を核酸に結合させることができる。抗体のようなポリペプチドに接合できる検出可能な標識の非限定的な例には、放射性標識、例えば^３Ｈ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^６４Ｃｕ、^７６Ｂｒ、^８６Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、または^１７７Ｌｕ、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、発蛍光団、発色団、化学発光剤、キレート錯体、染料、金コロイドまたはラテックス粒子が含まれる。

【0091】

一実施形態において、特定の標識は、レーザーによる励起に際して特定波長の検出可能なシグナルを放出することにより検出を可能にする。フィコビリンタンパク質、タンデム色素、一定の蛍光タンパク質、小化学分子、及び他の手段により検出可能な特定の分子は全て、フローサイトメトリー分析のための標識と考えることができる。例えば、「蛍光プローブ及び研究用化学品のハンドブック」（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ． （１９９６））に列挙されている標識を参照されたい。例えばビリプロテインとの接合により直接標識された抗体分子のようなリガンドは、各々が概ねフルオレセインに匹敵した吸光度及び量子収率備えた３４個もの関連発色団を有することができる。明細書に記載の特定の実施形態において有用なビリプロテインの例は、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン、好ましくはＲ−フィコエリトリンである。フィコエリトリン（ＰＥ）は、現在入手可能な最も明るい蛍光染料の１つである。

【0092】

本明細書に記載の一定の方法の構成要素に直接的に接合でき、或いは、当該方法に追加の数の標識されたリガンドを加えるためにビリプロテインまたはタンデム色素と共に使用できる更に他の標識には、励起時に５５０ｎｍ未満の波長で発光する小分子が含まれる。従って、本明細書中で使用するとき、「小分子」標識またはその均等物は、ビリプロテインの発光と重複しないそのような分子を意味する。そのようなマーカーの一例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。追加の色を提供するために、この方法で使用できる更に他の標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）として知られるタンパク質である。また、一定の実施形態では、紫外光による励起の際に発光する標識が有用である。

【0093】

検出可能な標識はまた、基質と相互作用して検出可能なシグナルを生成する酵素；または抗体結合もしくは適切に標識されたリガンドへの結合により検出可能なタンパク質であることができる。アッセイにおいて比色シグナルを明らかにするために様々な酵素系が作用し、例えば、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＦＩＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、及びヘキソキナーゼは、ＡＴＰ、グルコース及びＮＡＤ＋と反応してＮＡＤＨを生成するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせて用いられ、該ＮＡＤＨの生成は３４０ｎｍ波長での増加した吸光度として検出される。着色ラテックス微小粒子のような更に別の標識は、それにより染料が包埋され、阻害剤配列またはリガンドとの接合体を形成し、生じる複合体の存在を示す視覚的信号を与えるものであり、一定の実施形態に記載の幾つかのアッセイのために適用することができる。使用できる他の標識系には、ナノ粒子または量子ドットが含まれる。従って、本明細書に記載の方法には、任意の数の従来使用されている追加の標識システムを適合させることができる。当業者は、標識系の選択及び／または実施にはルーチンの実験のみが含まれることを理解する。上記の標識及びマーカーは、既知の供給源から商業的に入手することができる。

【0094】

本明細書中で使用される場合、「固体マトリックス」または「固相捕獲媒体」は、その細胞集団サンプルからの分離を可能にする任意のマトリックスまたは培地、例えば生理学的適合性のビーズをいう。このようなマトリックスまたは媒体の特徴には、屈折率、サイズ、光散乱強度、または独特の蛍光的特徴を提供する蛍光検出色素を坦持することが含まれる。このようなビーズは、当技術分野では慣用的に入手可能である。例えば、固相捕捉媒体の１つのサブセットには、サイズが約０．２〜約５．０μｍ（即ち、コロイドサイズ）のポリスチレンビーズ等の安定なコロイド粒子が含まれる。このようなポリスチレン基質またはビーズは、市販のビーズのように、アルデヒド及び／または硫酸官能基を含むことができる。

【0095】

＜第１のリガンド＞
真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離する本発明の方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0096】

従って、少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団であって、該真正膵臓前駆細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する細胞集団を提供した後に、該細胞集団を、ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露して、前記第１のリガンドに結合しない細胞が選択され、それによってＰＤＸ１発現細胞（ＰＤＸ１＋）を富化させる。

【0097】

前記第１のリガンドは、上記で述べたリガンドであってよい。幾つかの実施形態において、前記第１のリガンドは、細胞表面マーカーを認識して結合できるリガンドである。幾つかの実施形態において、前記細胞表面マーカーはＣＤ４９ｄである。幾つかの実施形態において、前記第１のリガンドは、ＣＤ４９ｄに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはその断片である。前記第１のリガンドは、上記で詳述したように、例えば、第１のリガンドに結合しない細胞の選択を容易にするために、標識に接合することができる。

【0098】

第前記１のリガンドに結合しない細胞の選択は、フローサイトメトリーのような当該分野で公知の方法によって実施することができる。従って、幾つかの実施形態において、前記第１のマーカーの発現は、フローサイトメトリーによって検出され得る。

【0099】

＜第２のリガンド＞
当該方法は、更に、前記開始集団（または上記で述べた第１のリガンドでの選択後の、ＰＤＸ１を発現しない細胞）をＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露し、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択することを含み、それによってＰＤＸ１＋細胞が富化された細胞集団を得る。その結果として、真正膵臓前駆細胞が富化された集団が得られる。該富化された集団は、特に、後部前腸ＰＤＸ１＋細胞について富化され得る。

【0100】

前記第２のリガンドは、上記で述べたリガンドであることができる。幾つかの実施形態において、前記第２のリガンドは、細胞表面マーカーを認識して結合できるリガンドである。幾つかの実施形態において、前記第２のリガンドは、ＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される第２の標的を認識し、結合することができる。幾つかの実施形態において、前記第二のリガンドは。ＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される第二の標的に対して向けられるモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはその断片である。前記第２のリガンドは、上記で詳述したように、例えば前記第２のリガンドに結合する細胞の選択を容易にするために、標識に接合させることができる。好ましい実施形態において、前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識して結合することができる。

【0101】

前記第２のリガンドに結合する細胞の選択は、フローサイトメトリーのような当該分野で公知の方法によって実施することができる。従って、幾つかの実施形態において、前記第２のマーカーの発現はフローサイトメトリーによって検出され得る。

【0102】

細胞集団の前記第２のリガンドへの曝露は、前記第１のリガンドへの曝露及び任意に前記第３のリガンドへの曝露と同時に起こり得るか、または別個の工程で起こり得る。

【0103】

＜第３のリガンド＞
当該方法は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の両方を発現する真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るために、前記細胞集団を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露する工程を含み、該第３のリガンドに結合する細胞を選択する工程を含んでよい。前記第２のリガンドへの曝露の代わりに、前記第３のリガンドへの曝露を行ってもよい。幾つかの実施形態において、前記細胞集団は前記第１及び前記第３のリガンドに暴露され、該リガンドへの暴露は同時にまたは別々の工程で生じることができる。他の実施形態において、前記細胞集団は、前記第１、第２及び第３のリガンドに曝露され、ここでの前記リガンドへの暴露は同時または別々の工程で生じることができる。その結果として、真正膵臓前駆細胞が富化された集団が得られる。

【0104】

前記第３のリガンドは、上記で述べたリガンドであってよい。幾つかの実施形態において、前記第３のリガンドは、細胞表面マーカーを認識して結合できるリガンドである。幾つかの実施形態において、前記第３のリガンドは第３の標的を認識して結合することができ、ここでの前記第３の標的はＧＰ２、ＳＣＮ９Ａ、ＭＰＺ、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＫＣＮＩＰ１、ＣＡＬＢ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６−２及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記第３の標的はＧＰ２である。幾つかの実施形態において、前記第３のリガンドは、ＧＰ２、ＳＣＮ９Ａ、ＭＰＺ、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＫＣＮＩＰ１、ＣＡＬＢ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される第３の標的に対して向けられるモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその断片である。好ましい実施形態において、前記第３のリガンドは、ＧＰ２に対して向けられるモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはその断片である。第３のリガンドは、上記で述べたように、例えば前記第３のリガンドに結合する細胞の選択を容易にするために標識に接合されてよい。

【0105】

第３のリガンドに結合する細胞の選択は、フローサイトメトリーのような当該分野で既知の方法により行うことができる。従って、幾つかの実施形態において、前記第３のマーカーの発現は、フローサイトメトリーによって検出され得る。

【0106】

従って、幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、
・前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される第２のマーカーを認識してこれに結合し、
・前記第３のリガンドは、ＧＰ２、ＳＣＮ９Ａ、ＭＰＺ、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＫＣＮＩＰ１、ＣＡＬＢ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される第３のマーカーを認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0107】

幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び
ｂ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、
・前記第３のリガンドは、ＧＰ２、ＳＣＮ９Ａ、ＭＰＺ、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＫＣＮＩＰ１、ＣＡＬＢ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６．２及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される第３のマーカーを認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0108】

こうして、幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、
・前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される第２のマーカーを認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0109】

こうして、幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、
・前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識してこれに結合し、
・前記第３のリガンドはＧＰ２を認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0110】

幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、
・前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0111】

幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第３のリガンドは、ＧＰ２を認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0112】

幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
前記第３のリガンドは、ＧＰ２を認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0113】

幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための本方法は、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び
ｂ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、ここで、
・前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識してこれに結合し、
・前記第３のリガンドは、ＧＰ２を認識してこれに結合し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得るものである。

【0114】

インスリン産生β細胞のようなホルモン産生β細胞を生成させるための方法には、フローサイトメトリーまたは他の類似の方法によって単離し、且つフォルスコリン、Ａｌｋ５阻害剤、ノギン、ニコチンアミドで処理したＧＰ２陽性細胞を選別することが含まれることが理解されるであろう。ＲＯＣＫ阻害剤が、選別後に２４〜４８時間添加され得る。

【0115】

＜真正膵臓前駆細胞集団＞
本発明の方法は、真正膵臓前駆細胞が富化された集団を提供する。

【0116】

一実施形態において、真正膵臓前駆細胞が濃縮された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞は、更に分化する能力を有する。真正膵臓前駆細胞が富化された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞は、膵臓ホルモン産生細胞へと更に分化する能力を有し得る。幾つかの実施形態において、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも１つは、インスリン産生細胞である。幾つかの実施形態において、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも１つは、グルコースに対して応答性である。幾つかの実施形態において、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも１つはインスリン産生細胞であり、これはまたグルコースに対して反応性である。幾つかの実施形態において、真正膵臓前駆細胞が富化された前記細胞集団の少なくとも１つの細胞は、インスリンを産生する膵島細胞を生じさせることができる。

【0117】

幾つかの実施形態において、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも１つは、Ｙａｐ１阻害剤の不存在下でインキュベートされた細胞集団と比較して、インスリン、Ｃペプチド、Ｉｎｓｍ−１、Ｉｓｌ−１、ＭａｆＡ及びＭａｆＢのうち少なくとも１つの増大した発現を有している。一実施形態において、前記膵臓ホルモン産生細胞は成熟β細胞である。

【0118】

インスリン産生β細胞のようなホルモン産生β細胞を得るための別の方法は、本方法によって単離された細胞を、ベルテポルフィンのようなＹａｐ１阻害剤で処理する工程を含んでいる。このような方法は、同日付けで出願された「インスリン産生細胞の生産方法」（発明者Ａｎａｎｔ Ｍａｍｉｄｉ及びＨｅｎｒｉｋ Ｓｅｍｂ、出願人：コペンハーゲン大学）と題された同時係属中の特許出願に記載されている。

【0119】

ＹＡＰ１（Ｙｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、発達、成長、修復、及びホメオスタシスに関与するＨｉｐｐｏシグナリング経路下流の核エフェクターである。ベルテポルフィンは、Ｙａｐ１活性を阻害できる小分子である。

【0120】

分化可能な少なくとも１つの細胞を含む膵臓前駆細胞集団が上記のように提供された後、該細胞集団は、Ｙａｐ１阻害剤の存在下でインキュベートすることができる。幾つかの実施形態において、該Ｙａｐ１阻害剤はベルテポルフィンである。

【0121】

幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、０．１〜１０μｇｍＬの濃度、例えば０．２〜９μｇ／ｍＬ、例えば０．３〜８μｇ／ｍＬ、例えば０．４〜７μｇ／ｍＬ、例えば０．５〜６μｇ／ｍＬ、例えば０．６〜５μｇ／ｍＬ、例えば０．７〜４μｇ／ｍＬ、例えば０．８〜３μｇ／ｍＬ、例えば０．９〜２μｇ／ｍＬ、例えば１μｇ／ｍＬの濃度のベルテポルフィンの存在下でインキュベートされる。一実施形態において、細胞集団は、１μｇｍＬのベルテポルフィンの存在下でインキュベートされる。

【0122】

幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも９日間、例えば少なくとも１０日間、ベルテポルフィンの存在下でインキュベートされる。幾つかの実施形態において、ベルテポルフィンの存在下でのインキュベーションは、５日間に亘って行われる。

【0123】

幾つかの実施形態では、ＣＤＫＮ１ａ及び／またはＣＤＫＮ２ａは、出発細胞集団において不活性化される。一実施形態では、ＣＤＫＮ１ａが不活性化される。別の実施形態では、ＣＤＫＮ２ａが不活性化される。別の実施形態では、ＣＤＫＮ１ａ及びＣＤＫＮ２ａの両方が不活性化される。別の実施形態では、ＣＤＫＮＩａ及びＣＤＫＮ２が、連続的に不活性化される。即ち、ＣＤＫＮＩａ及びＣＤＫＮ２ａの一方が第１段階で不活性化され、ＣＤＫＮＩａ及びＣＤＫＮ２ａの他方が第２段階で不活性化される。第１段階と第２の段階は、時間的に重なり合うか、または独立している。

【0124】

＜真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を生成する方法＞
真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を生成するための方法もまた開示され、前記付加された細胞集団は少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含んでいる。一実施形態において、当該方法は上記で述べた通りである。

【0125】

従って、幾つかの実施形態において、前記方法は、少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７１％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７２％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７３％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７４％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７６％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７７％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７８％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７９％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８１％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８２％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８３％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８４％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８６％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８７％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８８％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８９％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含んだ、真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を製造するためのものである。

【0126】

前記富化された集団に含まれる真正前駆細胞の割合を決定するためには、当該技術において既知の方法、例えば免疫染色及び／またはフローサイトメトリー法を用いることができるが、これらに限定されない。

【0127】

＜真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団＞
本明細書にはまた、少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団が開示される。幾つかの実施形態において、当該細胞集団は、上記の方法の何れかによって得ることができる。

【0128】

従って、幾つかの実施形態において、前記真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団は、少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７１％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７２％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７３％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７４％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７６％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７７％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７８％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７９％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８１％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８２％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８３％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８４％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８６％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８７％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８８％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８９％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含んでいる。

【0129】

前記富化された集団に含まれる真正前駆細胞の割合を決定するためには、当該技術において既知の方法、例えば免疫染色及び／またはフローサイトメトリー法を用いることができるが、これらに限定されない。

【0130】

＜代謝障害の治療＞
本明細書では、それを必要とする個体における代謝障害の治療のための、本明細書に開示された方法の何れかにより得られる真正膵臓前駆細胞を含んだ細胞集団もまた開示される。

【0131】

本明細書に記載の細胞集団は、代謝障害の治療のために使用することができる。真正膵臓前駆細胞を含むこのような細胞集団は、例えばβ細胞前駆体に富む細胞集団を単離できるように、記載された真正前駆細胞について富化することができる。これは、上記で述べたようにして、例えば、上記に詳述したリガンド結合性マーカーの使用及びフローサイトメトリーによる単離によって行うことができる。これらの単離された細胞は、使用前には保存することができ、または直ちに使用することもできる。該細胞は、更に分化させることができる。所望の特性を備えた細胞集団が得られたら、該細胞は、それを必要とする個体に移植される。一例として、このような細胞ベースの療法は、糖尿病を患っている個体におけるインスリン産生β細胞の移植するために有用であり、それによってインビボでのインスリン産生を回復させることができる。開始細胞集団が患者自身から誘導されるならば、移植された細胞の拒絶のような有害な免疫反応のリスクを低減することができる。インスリン産生β細胞を患者に移植する代わりに、本明細書に記載の方法により得られる細胞のような、真正膵臓前駆細胞を移植することもできる。

【0132】

本明細書で使用する「代謝障害」の用語は、内分泌疾患、栄養障害及び代謝性疾患を指すものと解釈される。好ましくは、該障害は膵臓障害に関連する。代謝障害の例は、１型糖尿病及び２型糖尿病を含む真性糖尿病である。

【0133】

一般に糖尿病と呼ばれる真正糖尿病は、長期に亘って血糖レベルが高い一群の代謝性疾患である。１型糖尿病、２型糖尿病及び妊娠糖尿病を含む幾つかのタイプの糖尿病が存在する。１型糖尿病は、膵臓におけるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の喪失を特徴とし、インスリン欠乏症をもたらす。２型糖尿病はインスリン抵抗性を特徴とし、比較的低いインスリン分泌と組み合わされ得る。インスリンに対する身体組織の反応性の欠如には、インスリン受容体が関与すると考えられている。２型糖尿病に似ている妊娠糖尿病は、全ての妊娠の約２〜１０％で生じる。糖尿病のタイプはまた、インスリン依存性真性糖尿病、非インスリン依存性真性糖尿病、栄養失調関連真性糖尿病、または不特定真性糖尿病に分類することができる。

【0134】

本明細書中に開示される方法は、真正膵臓駆細胞が富化された細胞集団を得るために使用することができる。従って、幾つかの実施形態では、それを必要とする個体において代謝障害を治療するための細胞集団が提供される。幾つかの実施形態において、前記代謝障害は、インスリン依存性真性糖尿病、非インスリン依存性真性糖尿病、栄養失調関連真性糖尿病または不特定の真性糖尿病のような真性糖尿病からなる群から選択される。

【0135】

幾つかの実施形態において、代謝障害の治療のための細胞集団は上記の方法によって得られる：即ち、
・真正膵臓前駆細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する場合に、少なくとも一つの該真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに暴露し、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について富化し；ここでの前記第３のリガンドはＧＰ２を認識してこれに結合する方法；または
・真正膵臓前駆細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する場合に、少なくとも一つの該真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに暴露し、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋細胞について富化し；またＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに暴露し、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について富化し、ここで前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識してこれに結合し、また前記第３のリガンドはＧＰ２を認識してこれに結合する方法；または
・真正膵臓前駆細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する場合に、少なくとも一つの該真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を、ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに暴露し、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋細胞について富化し；またＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに暴露し、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋細胞について富化し；また、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに暴露し、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択することにより、前記細胞集団をＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について富化し、ここで前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄを認識してこれに結合し、前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１を認識してこれに結合し、また前記第３のリガンドはＧＰ２を認識してこれに結合する方法；または
・本明細書の何処かに記載した任意の方法である

【0136】

一つの態様では、それを必要とする個体における代謝障害の治療方法であって、本明細書に記載の方法により得られる真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を提供する工程を含む方法が提供される。

【0137】

幾つかの実施形態において、本方法は、前記富化された細胞集団の少なくとも一部を、前記代謝障害に罹患している個体に移植する工程を含む。

【0138】

幾つかの実施形態において、前記富化された細胞集団は、移植に先立って更に分化され得る。従って、同日付で提出された「インスリン産生細胞の製造方法」と題する同時係属中の特許出願（発明者Ａｎａｎｔ Ｍａｍｉｄｉ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉｋ Ｓｅｍｂ、出願人：コペンハーゲン大学）に記載されているように、真正膵臓前駆細胞は更に、移植前にインスリン産生細胞に分化されてよく、または移植前に成熟インスリン産生β細胞に分化されてよい。他の実施形態において、前記富化された細胞集団は、膵島内に見出される内分泌細胞へと更に分化される。幾つかの実施形態において、前記富化された細胞集団は、ＭａｆＡの増大した発現を有するインスリン産生β細胞へと更に分化される。好ましくは、前記インスリン産生β細胞は、成熟した及び／またはインスリン応答性のものである。

【0139】

前記富化された細胞集団を更に分化させるための方法は、当業者に利用可能である（Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。一実施形態において、この方法は、分化できる少なくとも１つの細胞を含む膵臓前駆細胞集団を提供する工程と；前記細胞集団をＹａｐ１阻害剤の存在下でインキュベートする工程を含み；それによってインスリン産生β細胞が富化されたな細胞集団を得るものである。一実施形態において、前記Ｙａｐ１阻害剤はベルテポルフィンである。

【0140】

分化可能な少なくとも１つの細胞を含む膵臓前駆細胞集団が上記のように提供された後、該細胞集団はＹａｐ１阻害剤の存在下でインキュベートすることができる。幾つかの実施形態において、該Ｙａｐ１阻害剤はベルテポルフィンである。

【0141】

幾つかの実施形態において、前記細胞集団は、０．１〜１０μｇ／ｍＬの濃度、例えば０．２〜９μｇ／ｍＬ、例えば０．３〜８μｇ／ｍＬ、例えば０．４〜７μｇ／ｍＬ、例えば０．５〜６μｇ／ｍＬ、例えば０．６〜５μｇ／ｍＬ、例えば０．７〜４μｇ／ｍＬ、例えば０．８〜３μｇ／ｍＬ、例えば０．９〜２μｇ／ｍＬ、例えば１μｇ／ｍＬの濃度のベルテポルフィンの存在下でインキュベートする。一実施形態では、前記細胞集団を、１μｇ／ｍＬのベルテポルフィンの存在下でインキュベートする。

【0142】

幾つかの実施形態において、前記細胞集団は少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも８日間、例えば少なくとも９日間、例えば少なくとも１０日間、ベルテポルフィンの存在下でインキュベートされる。幾つかの実施形態において、前記ベルテポルフィンの存在下でのインキュベーションは５日間行われる。

【0143】

幾つかの実施形態では、このように更に分化された細胞を単離することができる。幾つかの実施形態において、この単離された細胞、または更に分化した細胞を含む細胞集団は、前記代謝障害に罹患している個体に移植される。

【0144】

＜実施例＞
実施例１
序論
糖尿病の治癒には、既に破壊されたβ細胞塊の修復と共に、β細胞の自己免疫的破壊の予防が必要である。治療は、インスリン産生細胞の再生または移植の何れかであろう。その固有の万能性及び理論的に無制限の供給のために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）はβ細胞置換療法の魅力的な供給源となっている。この戦略は、移植後の奇形腫形成のリスクを克服することに依存する。精製されたｈＥＳＣ誘導体の移植は、腫瘍原性のリスクを最小限に抑えることができるであろう。この研究において、ターゲッティングされるＰＤＸ１−ｅＧＦＰレポーター細胞株を開発することにより、ｈＥＳＣ由来ＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞の深い分析を行った。本発明者らは、ｈＥＳＣ由来ＰＤＸ１＋β細胞前駆体の単離のための、新規な細胞表面マーカーを同定した。具体的には、膵臓前駆体に対応するＧＦＰ＋画分におけるＧＰ２及びＦＯＬＲ１の富化、及びＧＦＰ−画分におけるＣＤ４９ｄの富化を示す。これら新規な細胞表面マーカーを組み合わせるか、またはそれらを個別に使用することにより、インビトロでの分化の際に誘導された異種細胞集団から、真のβ細胞前駆体を単離することができる。これらの新規抗体は、精製された膵臓前駆細胞からのインスリン産生細胞の生成、並びに糖尿病細胞補充療法のための純粋な膵臓前駆細胞集団の更なる培養及び移植を容易にするだけでなく、ヒト膵臓発生の更なる研究を可能にする。機能的なグルコース応答性インスリン分泌細胞は、インビトロ分化戦略によってはこれまで得られていないが、糖尿病マウスモデルでは、膵臓前駆細胞及びインビトロで誘導されたインスリン発現細胞を移植することによって原理の証明が得られており、ここでは前記の前駆細胞／未熟のインスリン＋細胞が、マウスにおいて糖尿病を逆転させる能力を有するグルコース応答性インスリン産生細胞へと分化及び成熟する（Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００８， Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。この概念は、幹細胞由来β細胞の無限の供給源を提供するので、糖尿病に罹患した患者の治療のための魅力的なモデルになっている。しかし、このビジョンが実現できるようになる前に、２つの大きな懸念／障害を取り除かなければならない：即ち、（１）異種細胞集団の移植によって奇形腫形成が生じる、及び（２）移植細胞は、その後の免疫拒絶を回避するために保護されなければならないことである。移植前の膵臓前駆細胞の精製は、奇形腫形成のリスクを低減できることが示され／確立されている。この富化は、組織特異的レポーター細胞株または細胞表面マーカーの使用によって得ることができる。膵臓前駆細胞の単離のために利用可能なヒトレポーター細胞株の欠如が、膵臓特異的細胞表面マーカーの同定を妨げてきた。ヒト細胞表面マーカーの同定に関連した幾つかの僅かな刊行物では、初代ヒト膵臓または膵島画分を材料源として利用している。２０１１年に、Ｋｅｌｌｙらは、市販の抗体のフローサイトメトリーに基づくスクリーニングを行うことによって、膵臓前駆細胞及び内分泌細胞を同定するための３つの表面マーカーを報告した。ＣＤ１４２は、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞の細胞表面マーカーとして同定され、またＣＤ２００またはＣＤ３１８は内分泌細胞の表面マーカーとして同定された。別のグループ（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１１）は、追加のマーカーＣＤ２４が、ＰＤＸ１＋前駆細胞の新規マーカーであるべきことを報告した。しかし、ＣＤ２４は、未分化ｈＥＳＣ及び初期内胚葉から膵臓内胚葉への分化過程においてその発現が検出されたため、ＰＤＸ１＋前駆細胞の適切なマーカーではないことが後で示された（Ｎａｕｊｏｋ ａｎｄ Ｌｅｎｚｅｎ、２０１２）。Ｋｅｌｌｙらによって行われた抗体スクリーニングでは、ＣＤ２４の広範な発現パターンも観察された。実際に、これら公表された細胞表面マーカーの発現パターンを我々のスクリーニングで調べたところ、マーカーＣＤ２４、ＣＤ２００について、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞画分の間の有意な発現変化を観察することはできなかった。加えて、代わりにＣＤ３１８が、ＧＦＰ−細胞において有意に富化された。ＣＤ１４２／Ｆ３は、転写レベルではＧＦＰ＋細胞において（ＧＦＰ−細胞と比較して）比較的富化されたが、ＣＤ１４２抗体による染色では、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞集団の両方においてＣＤ１４２発現が示された。これらの観察は、組織特異的レポーター細胞株を使用せずに特定の細胞表面マーカーを同定することの困難さを強調／例示している。

【0145】

ｈＥＳＣからの純粋なＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞の単離を可能にするために、遺伝子ターゲッティングによってＰＤＸ１レポーター細胞株を樹立した。これはマウスＥＳ細胞では達成されているが（Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ｈＥＳＣではこれまで公表されていない。更に、このレポーター細胞株は、ｈＥＳＣ由来の膵臓前駆細胞の単離及び更なる特徴付けを可能にするだけでなく、ヒト膵臓前駆細胞の発生を研究するための新規なツールでもある。

【0146】

本研究では、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞の単離のための新規細胞表面マーカーとしてＧＰ２を、ＰＤＸ１−細胞画分の細胞表面マーカーとしてＣＤ４９ｄを同定し、ネガティブ選択を可能にした。追加の細胞表面マーカーであるＦＯＬＲ１もまた同定された。ＧＰ２とは対照的に、このマーカーはより広範な染色パターンを有し、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−前駆細胞をも標識する。

【0147】

これらのマーカーは、以前に公表されたマーカーとは対照的に、異種細胞培養体からの膵臓前駆細胞の富化を可能にし、また他の遺伝子的にタグ付けされていないヒトＥＳ細胞株からのＰＤＸ１＋β細胞前駆体の単離を可能にするので、糖尿病治療法の開発にとって極めて価値がある。

【0148】

実施例２：ヒトＰＤＸ１遺伝子座へのｅＧＦＰのターゲッティング
ｈＥＳＣにおける膵臓内胚葉形成をモニターするために、膵臓発生及びβ細胞機能に不可欠な転写因子である膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）組換えを用いてターゲッティングした（図１Ａ）。ヒトＰＤＸ１遺伝子を含むＢＡＣを、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕのゲノムブラウザを用いて同定した。ｅＧＦＰ−ｌｏｘｐ−Ｓｖ４０−Ｎｅｏ−ｌｏｘｐレポーターカセットを、ＰＤＸ１開始コドンの上流に直接挿入した。ターゲティングベクターを細菌プラスミド中に回収し、ネオマイシンカセットをＣＲＥリコンビナーゼにより切り出して、１２．５ｋｂ及び３．５ｋｂの相同性アームを含む最終ターゲティングベクターを作製した。特に、Ｎｅｏカセットの切除は、ｅＧＦＰ発現を得るために決定的に重要であった。ＨＵＥＳ−４細胞株を線状化ターゲティングベクターと共にエレクトロポレーションし、薬剤耐性コロニーが現れるまでＧ４１８で２週間処理した。３５３個のクローンのスクリーニングにより、４つの正しくターゲッティングされたクローンが得られた（図１Ｂ及び１Ｃ）。ターゲッティングされたクローンにおけるＰＤＸ１−ｅＧＦＰの発現を確認するために、以前に発表された分化プロトコル（Ａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の改変版を使用した（図１Ｃ）。ｈＥＳＣを、アクチビンＡ及びＷｎｔ３ａ（ＭＥＦ上で培養したｈＥＳＣ上で使用）またはＣｈｉｒ（「ＤＥＦ−ＣＳＴＭ」培地、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ幹細胞、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢで培養したｈＥＳＣ上で使用）に暴露して、最終的な内胚葉誘導を促した（ステージ１）。このステージの後に、レチノイド酸（ＲＡ）を３日間（ステージ２）、次いでＦＧＦ２（場合によってはノギンで）を残りの日数の間に添加して、後部前腸及び膵臓前駆細胞を誘導した（ステージ３）。１３日目の標的ＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＥＳ細胞株の蛍光及び対応する位相差画像を図１Ｄに示す。１７日目に、細胞の５０〜７０％がＰＤＸ１−ｅＧＦＰを規則的に発現する。クローンＰＤＸｅＧＩの免疫染色は、ｅＧＦＰがＰＤＸ１と共に高度に共局在していることを示した（図１Ｅ）。これらの結果は、レポーター細胞系ＰＤＸ１−ｅＧＦＰが、ｈＥＳＣ分化の際のＰＤＸ１発現をモニターするために使用できることを確認する。ステージ３細胞（ｄ１７）の免疫染色により、タンパク質レベルにおいて、膵臓前駆細胞におけるＮＫＸ６−１、ＥＣＡＤ、ＨＥＳ１及びＳＯＸ９の発現が確認された（図２Ｆ）

【0149】

実施例３：インビトロで分化したＰＤＸ１−ｅＧＦＰ ｈＥＳＣの分析
以前に発表した分化プロトコル（Ａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）を改変し、それを実施例２に記載のＰＤＸ１−ｅＧＦＰレポーター細胞株と組み合わせることにより、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を同時発現し（プロトコルＡ（ＰＥ））、またはＰＤＸ１のみを発現しながらＮＫＸ６−１を発現しない（プロトコルＢ（ＰＦＧ））異なる亜集団をＦＡＣＳ選別することができた（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｄ）。ＦＡＣＳ選別したｅＧＦＰ＋及びｅＧＦＰ−細胞集団の遺伝子発現プロファイルを評価するために、様々な膵臓関連遺伝子のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより定量した（図２Ｃ及び２Ｆ）。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＥＣＡＤ、ＭＮＸ１、ＨＮＦ６、及びＳＯＸ９の発現は全て、ｅＧＦＰ−細胞ｖｓ．プロトコルＡ（ＰＥ）で得られたｅＧＦＰ＋細胞において有意にアップレギュレートされた（図２Ｄ）。しかし、プロトコルＢ（ＰＦＧ）で得られたｅＧＦＰ＋細胞では、ＭＮＸ１も、より重要なことには、ＮＫＸ６−１も有意にアップレギュレートされなかった（図２Ｇ）。これらの結果は、プロトコルＡ（ＰＥ）で得られたｅＧＦＰ＋細胞は膵臓前駆細胞であるが、プロトコルＢ（ＰＦＧ）で得られたｅＧＦＰ＋細胞は後部前腸（内胚葉）細胞であることを示唆する。ステージ３細胞（ｄ１７）の免疫染色により、タンパク質レベルで、膵臓前駆細胞におけるＮＫＸ６−１、ＥＣＡＤ、ＨＥＳ１及びＳＯＸ９の発現が確認された（図２Ｆ）。

【0150】

実施例４：インビトロで誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞ｖｓ．ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞の遺伝子発現プロファイルを比較するために、マイクロアレイ分析を実施した。
膵臓前駆細胞を富化させるために役立つ特定の細胞表面マーカーを同定するために、ＰＤＸ１＋前腸内胚葉（ＰＦＧ）及びＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓内胚葉（ＰＰＣ）に対応する、２つの異なるＰＤＸ１＋亜集団の遺伝子発現パターンを比較するマイクロアレイ分析を実施した。詳細に言えば、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１細胞（ＰＦＧ＋と称する）を、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞（ＰＰＣと称する）及び対応するＧＦＰ−細胞と比較した（図３Ａ）。また、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１−細胞（Ｆ２ ＧＦＰ＋）、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞（ＲＦＮ ＧＦＰ＋）、及び対応するＰＤＸ１−／ＧＦＰ−細胞（ＲＦＮ ＧＦＰ−）の遺伝子発現パターンを比較した。分析を単純化するために、０．００５未満のｐ値及び１．４を超える倍数変化を有する遺伝子のみを、更なる分析のために選択した。これらのカットオフ値は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の発現値に基づいて決定した。これら遺伝子の階層的クラスタリングにより、各群において異なる遺伝子が富化されることが明らかになった。詳細に言えば、ＰＰＣ細胞ｖｓ．ＰＦＧ細胞においては３８２個の遺伝子がアップレギュレート／富化され、ＰＰＣ＋ｖｓ．ＧＦＰ−細胞においては６９８個の遺伝子がアップレギュレートされた。更に興味深いことに、ＰＰＣ細胞（ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の発現を特徴とする膵臓前駆細胞）では１１５個の遺伝子が特異的にアップレギュレートされたが、ＰＦＧ及びＧＦＰ−細胞ではダウンレギュレートされた（図３Ｂ）。各群の全ての反復の平均発現に対して階層的クラスタリングを適用することにより、９個の異なるサブクラスが作成された（図３Ｃ）。

【0151】

実施例５：ｈＥＳＣ由来のＰＤＸ１＋膵臓内胚葉において発現される新規な細胞表面マーカー。
サブクラスタ３ａ、５及び６において列挙された遺伝子の中で、新規な細胞表面マーカー、即ち、ＧＦＰ−細胞において富化されたインテグリンアルファ４（ＩＴＧＡ４またはＣＤ４９ｄ）（サブクラスタ３ａ）、ＮＫＸ６−１発現とは無関係にＰＤＸ１＋細胞を認識するフォリック受容体１（ＦＯＬＲ１）（サブクラスタ６）、及びＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋膵臓前駆細胞に特異的に富化された糖タンパク質２（チモーゲン顆粒膜）（ＧＰ２）（サブクラスタ５）を同定した。ＧＰ２、ＦＯＬＲ１、及びＣＤ４９ｄは、ＰＤＸｅＧ細胞由来のＰＰＣを精製するために、フローサイトメトリーによって検証された（図４Ａ）。候補遺伝子をフローサイトメトリーにより検証して、ｈＥＳＣ由来膵臓前駆細胞の精製のための細胞表面マーカーを同定した。市販抗体の入手可能性に基づいて、糖タンパク質２（チモーゲン顆粒膜）（ＧＰ２）、葉酸受容体１（成人）（ＦＯＬＲ１）及びＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）を選択し、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ａは、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−画分において、原形質膜または細胞外領域に局在した遺伝子の富化を示す。図４Ｂ及び図５Ａは、ＭＥＦ上で培養された分化されたｈＥＳＣ（１７日目）に対して行われた、選択された細胞表面マーカーＧＰ２、ＣＤ４９ｄ（ＩＴＧＡ４）、及びＦＯＬＲ１のフローサイトメトリー分析を示しており、ＧＰ２及びＦＯＬＲ１がＧＦＰ＋細胞において高度に発現されたのに対して、ＣＤ４９ｄはＧＦＰ−細胞において富化されたことが確認される。より具体的言えば、１７日目のＧＦＰ−細胞の大部分（７０〜７２％、約７１％）がＣＤ４９ｄを発現したのに対して、６４〜７６％（約７６％）のＧＦＰ＋細胞がＧＰ２を共発現した。重要なことに、ＧＦＰ−細胞の僅かな部分（３〜７％、約３％）のみがＧＰ２を発現し、また基本的にＧＦＰ＋細胞でＣＤ４９ｄを発現したものは殆どなかった（１〜２％、約１％）。ＦＯＬＲ１及びＣＤ４９ｄを用いた同時染色は、ＣＤ４９ｄについて同じ染色パターンを示し、１７日目のＧＦＰ−細胞の７０〜７３％（約７０％）がＣＤ４９ｄを発現したのに対して、ＧＦＰ＋細胞の４１〜６２％（約６２％）がＦＯＬＲ１を発現した（図５Ａ）。

【0152】

選別された細胞集団の遺伝子発現分析は、膵臓内胚葉マーカー及び新規の細胞表面マーカーが、ＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−及びＦＯＬＲ１＋／ＣＤ４９ｄ−選別された細胞集団において高度に濃縮されていることを示した（図４Ｃ及びＤ）。

【0153】

ＧＰ２発現に依存した細胞集団における遺伝子発現（図４Ｃ）の相対値を表１に示す。

【表1】

【0154】

ＦＯＬＲ１発現に依存した細胞集団における遺伝子発現（図４Ｄ）の相対値を表２に示す。

【表2】

【0155】

全体として、これらのデータは、ＣＤ４９ｄがＧＦＰ−細胞において排他的に発現され、ＧＰ２がＧＦＰ＋細胞の大部分をマーキングすることを示す。しかしながら、ＧＰ２とは対照的に、ＦＯＬＲ１はＧＦＰ＋細胞のマイナーな部分をマーキングし、ＧＰ２を、ＰＤＸ１＋膵臓前駆細胞を認識するためのより特異的なマーカーにしている。

【0156】

実施例６：フィーダーフリー系で培養された遺伝子的にタグ付けされていない細胞株における新規細胞表面マーカーの特徴付け。
同定した細胞表面マーカーが遺伝子改変されていない細胞株でも使用できるかどうかを調査し、新たに同定されたマーカーを検証するために、フィーダーフリーの条件で培養した遺伝子改変されていない細胞株ＨＵＥＳ４細胞を使用して、ＣＤ４９ｄ、ＧＰ２、及びＦＯＬＲ１の発現をフローサイトメトリーにより特徴付けした。またＨＵＥＳ−４細胞系を用いて、ＰＤＸ１−ｅＧＦＰ細胞株を生成させた（図４Ｃ及び５Ｃ）。一般に、我々の分化プロトコルは、ＭＥＦ上での培養と比較して、規定されたフィーダーフリー培養系において高い効率で働き、その結果、非常に少ないＣＤ４９ｄ＋細胞が観察される。

【0157】

以下の亜集団を、１７日目から、分化したｈＥＳＣにおいてｑＰＣＲにより選別し、特徴付けした：ＣＤ４９ｄ＋／ＧＰ２、ＧＰ２−／ＣＤ４９ｄ−、及びＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−（図４Ｄ）。膵臓マーカーのＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、ＭＮＸ１は全て、ＣＤ４９ｄ＋／ＧＰ２−及びＧＰ２−／ＣＤ４９ｄ−細胞と比較して、ＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−細胞において有意に富化された。重要なこととして、ＧＰ２−ＣＤ４９ｄ−細胞ではＰＤＸ１が依然として検出されていたが、これらの細胞はＮＫＸ６−１及びＧＰ２の低い発現を有しており、これらの細胞がＰＤＸ１＋後部前腸細胞であることを示した。更に、ＧＰ２発現の欠如は、ＦＯＬＲ１がＧＰ２−／ＣＤ４９ｄ−細胞において依然として発現されるとの所見と併せて、ＦＯＬＲ１がより広範に発現するのに対してＧＰ２は膵臓前駆細胞を特異的に標識することを示している。ＣＤ４９ｄ＋／ＦＯＬＲ１−、ＦＯＬＲ１−／ＣＤ４９ｄ−、及びＦＯＬＲ１＋ＣＤ４９ｄ−亜集団の遺伝子発現分析（図５Ｄ）により、ＦＯＬＲ１＋／ＣＤ４９ｄ−細胞では全ての膵臓マーカーが実際に富化されたのに対して、ＦＯＬＲ１−ＣＤ４９ｄ−細胞は、依然としてＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１発現細胞を含んでおり、膵臓前駆細胞を認識／標識することにおいて、ＦＯＬＲ１はＧＰ２よりも幾分低い特異性を有することが示された。

【0158】

従って、これらのデータによって、ＧＰ２及びＦＯＬＲ１は、それらが規定されたフィーダーフリー培養系において、またはＭＥＦ上で誘導されたかどうかとは無関係に、ｈＥＳＣ由来のＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞を特異的にマーキングすることが示される。全体的に、我々のデータは、ＧＰ２がｈＰＳＣ由来のＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋ＰＰＣを特異的にマーキングするのに対して、ＦＯＬＲ１はＮＫＸ６−１発現を欠くｈＰＰＣ及びｈＰＦＣの両方を認識することを示している。

【0159】

ＦＯＬＲ１の発現（図５Ｄ）に依存した細胞集団における遺伝子発現の相対値を表３に示す。

【表3】

【0160】

ＧＰ２の発現（図５Ｃ）に依存した細胞集団における遺伝子発現の相対値を表４に示す。

【表4】

【0161】

実施例７：ヒト胎児膵臓における新規細胞表面マーカーＧＰ２及びＣＤ４９ｄの検証。
ＧＰ２及びＣＤ４９ｄマーカーを検証するために、及びＧＰ２もまたインビボで役割を果たすかどうかを検証するために、９．１ＷＤのヒト胎児膵臓を使用して、ＧＰ２及びＣＤ４９ｄの発現を調べた。ヒト胎児膵臓のフローサイトメトリー分析を行った。ｈＰＳＣに匹敵して、ヒト胎児膵臓ではＧＰ２発現とＣＤ４９ｄ発現の間に重複は存在しなかった（図４Ｅ）。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の発現を、ＦＡＣＳ選別されたＧＰ２＋及びＣＤ４９ｄ＋細胞集団において分析した。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１は、ＧＰ２＋細胞において有意に富化され、対照として使用されたＣＤ４５＋／ＣＤ３１＋造血細胞及び内皮細胞での発現は検出されなかった（図４Ｇ）。

【0162】

全体的に、これらの結果は、ＧＰ２＋細胞が、ｈＥＳＣ及びヒト胎児膵臓の両方において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現を特徴とする膵臓前駆細胞をマーキングし、ＧＰ２はインビトロのｈＰＳＣ及びインビボのヒト胎児膵臓の両方からＰＰＣを単離するために利用できることを示す。

【0163】

実施例８：独立かつ以前に公表された分化プロトコルを用いたＧＰ２の検証。
我々の知見を裏付けるために、ＰＤＸｅＧ細胞株を、Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ． ２０１３により公表された従来の分化プロトコルの僅かに改変したバージョンに従って分化させ（図６Ａ）、異なる亜集団をＧＰ２及びＧＦＰ発現に基づいて選別した（図６Ｂ）。我々のプロトコルで観察されたのとは対照的に、Ｒｅｚａｎｉａのプロトコルは、ＧＦＰ＋／ＧＰ２−細胞及びＧＦＰ＋／ＧＰ２＋細胞からなる異種細胞集団を生じる（図６Ｂ）。遺伝子発現解析により、ＧＰ２＋ＧＦＰ＋細胞は、ＰＰＣ関連遺伝子ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、ＳＯＸ９、ＧＰ２及びＰＴＦ１ａについて有意に富化されたが、ＧＰ２−ＧＦＰ−細胞は高レベルのＣＤ４９ｄを発現した（図６Ｃ）。ＦＯＬＲ１の最高レベルはＧＰ２−ＧＦＰ＋細胞で観察されたが、ＦＯＬＲ１もまた、ＧＰ２＋／ＧＦＰ＋及びＧＰ２−／ＧＦＰ−細胞で発現された（図６Ｃ）。総合すると、これらの知見は上記に示したデータと共に、培養系または分化プロトコルとは独立して、不均一な分化培養からＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋ｈＰＰＣを単離するために利用できる。

【0164】

実施例９：膵臓前駆細胞の精製のために現在利用可能な細胞表面マーカーの特徴付け。
最後に、ＭＥＦ上で培養され、「プロトコルＰＥ」に従って分化されたＰＤＸｅＧレポーター細胞株を用いて、以前に報告された細胞表面マーカーＣＤ１４２、ＣＤ２００（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）の発現パターンを調べた（図７Ａ）。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞の大部分はＣＤ１４２及びＣＤ２００で染色され、これらの表面マーカーは膵臓前駆細胞集団を忠実にはマーキングしないことを示している。Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ． ２０１３により公表された独立したフィーダーフリーの分化プロトコルを、遺伝子改変されていない細胞株ＨＵＥＳ４と組み合わせて適用することにより、以前に公表したＣＤ１４２及びＣＤ２００と並行して、新規な細胞表面マーカーの特異性を評価した。これらの結果は、ＧＰ２が、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋ＰＰＣを標識することにおいて優れていることを明瞭に示している（図７Ｂ、Ｃ）。

【0165】

ＭＥＦ上で培養されたＰＤＸｅＧレポーター細胞株（図７Ａ）で以前に同定された細胞表面マーカーＣＤ１４２及びＣＤ２００のフローサイトメトリー分析は、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞の大部分が、ＣＤ１４２及びＣＤ２００で染色されることを示した。従って、これらのマーカーは、異種幹細胞培養物においてＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋細胞を認識するために十分に特異的ではない。

【0166】

総合すると、これらの知見により、前記新規な細胞表面マーカーＧＰ２、Ｃｄ４９ｄ、及びＦＯＬＲ１は、ｈＥＳＣ由来の膵臓前駆細胞を単離するために使用できること、また以前に公表されたＣＤ２００及びＣＤ１４２は、膵臓前駆細胞の認識においてＧＰ２またはＦＯＬＲ１ほど特異的ではないことが示される。

【0167】

実施例１０：精製ＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−ＰＰＣのインスリン発現細胞への分化／精製ＧＰ２＋ｈＰＰＣのβ細胞系統への系統的潜在能力。
単離されたＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−膵臓前駆細胞がインスリン発現細胞に分化する能力を有することを示すために、これらの細胞をＦＡＣＳ選別後に再プレーティングした（図８Ａ）。この再プレーティング実験は、遺伝子的にタグ付けされていない細胞株ＨＵＥＳ４を用いて行った（図８）。精製したＰＰＣを、フィブロネクチンでコーティングしたプレート上に再プレーティングし、フォルスコリン、ＡＬＫｉ、ノギン及びニコチンアミドの存在下で更に分化させた。最初の２４〜４８時間は、選別後の生存率を高めるためにＲｏｃｋ阻害剤を添加した（図８Ｂ）。これらの培養物中には非常に少数のＣＤ４９ｄ＋細胞が出現するので、ＧＰ２＋及び限られた数のＧＰ２低発現細胞を選別した（図８Ｃ）。

【0168】

分化したＧＰ２＋（Ｃｄ４９ｄ−）細胞は、ＧＰ２^ｌｏｗ（ＣＤ４９ｄ−）細胞と比較してＣＰＥＰ＋細胞の有意な富化を示した（図８Ｄ）が、これはＣＰＥＰ＋細胞／ＤＡＰＩ領域の定量によっても確認された（図８Ｆ）。

【0169】

分化したＧＰ２＋／ＣＤ４９ｄ−細胞の免疫蛍光分析を図８Ｅに示す。最後に、ＧＰ２＋ＰＰＣ由来の細胞に対するグルコース刺激インスリン分泌分析により、これらの細胞もグルコース応答性であることが確認された（図５Ｇ）。従って、我々の改変されたプロトコルを使用することにより、ＧＰ２＋ＰＰＣは、グルコース応答性モノホルモンＣペプチド（ＣＰＥＰ）＋細胞へと分化させることができる。

【0170】

実施例１１：ＣＤＫＮ１ａサイレンシングは、ＧＰ２＋ヒト膵臓前駆細胞の増殖を促進する。
我々のマイクロアレイ分析に基づいて、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６−１＋ＰＰＣが富化された遺伝子類の中に、幾つかの細胞周期特異的な遺伝子、特にＣＤＫＮＩα及びＣＤＫＮ２αを見出した。これらの遺伝子が、膵臓前駆細胞の増殖を制御する細胞周期機構における重要な（関与する）標的であるかどうかを調べるために、異なる時点の膵臓前駆細胞において、選択された標的のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを行った。実際、初期膵臓前駆細胞におけるＣＤＫＮ１αのノックダウン（図９Ｂ）は、Ｇ２／Ｍ期における増殖性膵臓前駆細胞の数を有意に上昇させた（＞６０％の増加が観察された、データは示さず）（図９Ｃ−Ｅ）。成熟ＧＰ２＋膵臓前駆細胞においてＣＤＫＮ１αノックダウンが実施された場合には、この増殖効果は存在しなかった（図９Ｆ−Ｈ）。予想した通り、Ｋｉ６７による免疫蛍光染色により、ＣＤＫＮ１ａがノックダウンされた初期膵臓前駆細胞において、Ｋｉ６７＋細胞の顕著な増加が確認された（図９I）。

【0171】

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Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３１（１１）：２４３２−４２
Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （３２）：１１２１−３３．
Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４３：２３０−２３８
Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ． （２００１ａ） Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １５：２４１− ２６４
Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ． （２００１ｂ） Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３２２：８６１
Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ （２０１０） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２４（２０）：２２３９−６３
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ （２００６） Ｃｅｌｌ． ２００６ Ａｕｇ ２５；１２６（４）：６６３−７６
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｅｌｌ １３１ （５）：８６１
Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｅｌｌ． １５８（６）： １２５４−１２６９
Ｔｅｓａｒ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ ４４８（７１５０）：１９６−９
Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ． ６；２８２（５３９１）：１１４５−７．
Ｗｅｒｎｉｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔｕｒｅ． ４４８（７１５１）：３１８−２４
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：５８５８
Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ ３２４

【0172】

＜付記項目＞
１．真正膵臓前駆細胞が富化された集団を単離するための方法であって、
ｉ）少なくとも１つの真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備し、
それによって真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を得る前記方法。
２．項目１に記載の方法であって、前記第１、第２及び第３のリガンドのうち少なくとも一つは、抗体またはその断片である前記方法。
３．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である前記方法。
４．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１、第２及び第３のリガンドのうちの少なくとも一つは、前記真正膵臓前駆細胞の細胞表面マーカーに結合する前記方法。
５．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１、第２及び第３のリガンドのうちの少なくとも一つは、標識に接合される前記方法。
６．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１、第２及び第３のマーカーのうちの少なくとも一つの発現が、フローサイトメトリーにより検出される前記方法。
７．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞はフローサイトメトリーにより除去または選択される前記方法。
８．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１のリガンドは、ＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
９．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第２のリガンドは、ＦＯＬＲ１、ＣＤＨ１／ＥＣＡＤ、Ｆ３／ＣＤ１４２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される標的に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１０．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第２のリガンドは、ＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１１．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第３のリガンドは、ＧＰ２、ＳＣＮ９Ａ、ＭＰＺ、ＮＡＡＬＡＤＬ２、ＫＣＮＩＰ１、ＣＡＬＢ１、ＳＯＸ９、ＮＫＸ６−２及びＮＫＸ６−１からなる群から選択される標的に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１２．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第３のリガンドは、ＧＰ２に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１３．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体またはその断片であり、また前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１４．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体またはその断片であり、前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体またはその断片であり、また前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
１５．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記真正膵臓前駆細胞は、ヒト万能性幹細胞のような分化できる細胞に由来する前記方法。
１６．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記分化できる細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（ｈＩＰＳＣ）、ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）及びナイーブなヒト幹細胞（ＮｈＳＣ）からなる群から選択される前記方法。
１７．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記分化できる細胞は、個体から単離された細胞に由来する前記方法。
１８．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、真正膵臓前駆細胞が富化された前記細胞集団の少なくとも一つの細胞は、更に分化する能力を有する前記方法。
１９．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、真正膵臓前駆細胞が富化された前記細胞集団の少なくとも一つの細胞は、膵臓ホルモン産生細胞へと更に分化する能力を有する前記方法。
２０．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも一つの細胞は、インスリン産生細胞及び／またはグルコースに対して反応性である前記方法。
２１．先行する項目の何れか１項に記載の方法であって、前記膵臓ホルモン産生細胞の少なくとも一つの細胞は、インスリン産生島細胞を生じることができる前記方法。
２２．真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団を製造する方法であって、前記富化された細胞集団は少なくとも７０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含む前記方法。
２３．項目２２の方法であって、
ｉ）真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団を提供し、ここでの該真正膵臓前駆細胞はＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を発現する工程と；
ｉｉ）前記細胞集団を、
ａ）ＰＤＸ１−細胞に特異的な第１のマーカーに結合する第１のリガンドに曝露させて、前記細胞集団から前記第１のリガンドに結合しない細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｂ）ＰＤＸ１＋細胞に特異的な第２のマーカーに結合する第２のリガンドに曝露させて、前記第２のリガンドに結合しない細胞から前記第２のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋細胞について前記細胞集団を富化させ；
及び／または
ｃ）ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞に特異的な第３のマーカーに結合する第３のリガンドに曝露させて、前記第３のリガンドに結合しない細胞から前記第３のリガンドに結合する細胞を選択し、それによりＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞について前記細胞集団を富化させる工程を具備する前記方法。
２４．項目２２または２３の方法であって、前記第１のリガンドはＣＤ４９ｄに対して向けられる抗体またはその断片であり、前記第２のリガンドはＦＯＬＲ１に対して向けられる抗体またはその断片であり、前記第３のリガンドはＧＰ２に対して向けられる抗体またはその断片である前記方法。
２５．少なくとも５０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含んだ細胞集団。
２６．項目１〜２１の何れか１項の方法により得られる真正膵臓前駆細胞を含んだ細胞集団。
２７．項目２６に記載の細胞集団であって、該細胞集団は少なくとも５０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含む前記細胞集団。
２８．それを必要としている個体における代謝性障害の治療のための、項目１〜２１の何れか１項の方法により得られる真正膵臓前駆細胞を含む細胞集団。
２９．請求項２８に記載のそれを必要としている個体における代謝性障害の治療のための細胞集団であって、該細胞集団は少なくとも５０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも７５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８０％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも８５％の真正膵臓前駆細胞、例えば少なくとも９０％の真正膵臓前駆細胞を含む前記細胞集団。
３０．それを必要としている個体における代謝性障害の治療のための、項目２５〜２９の何れか１項に記載の真正膵臓前駆細胞が富化された細胞集団。
３１．項目３０の細胞集団であって、前記代謝性障害は、インスリン依存性真性糖尿病、非インスリン依存性真性糖尿病、栄養失調関連真正糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病または不特定真性糖尿病のような真正糖尿病である前記細胞集団。
３２．それを必要としている個体における代謝性障害の治療方法であって、項目２５〜２９の何れか１項に記載の細胞集団を提供する工程を含む方法。
３３．項目３２に記載の方法であって、更に、前記細胞集団の少なくとも一部を前記個体に移植する工程を含む方法。
３４．項目３２〜３３の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記細胞集団の少なくとも一部のインスリン産生細胞への分化を誘導する工程、及び任意に、該インスリン産生細胞を単離する工程を含む方法。
３５．項目３２〜３４の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞集団の少なくとも一部のインスリン産生β細胞への分化を誘導する工程が、前記細胞集団の少なくとも一部をＹａｐ１存在下でインキュベートし、それによりインスリン産生β細胞が富化された細胞集団を得る工程を含む前記方法。
３６．項目３５に記載の方法であって、前記Ｙａｐ１阻害剤がベルテポルフィンである前記方法。
３７．項３２〜３６の何れか１項に記載の方法であって、前記インスリン産生β細胞は、Ｙａｐ１阻害剤の非存在下でインキュベートされた細胞と比較して、ｌｎｓｍ−１、ｌｓｌ−１、ＭａｆＡ及びＭａｆＢのうち少なくとも１つの増大した発現を有する前記方法。
３８．項目３２〜３７の何れか１項に記載の方法であって、前記インスリン産生β細胞は、前記細胞集団がＹａｐ１阻害剤の非存在下でインキュベートされたときに得られた細胞におけるインスリン領域と比較して、増大したインスリン領域を有する前記方法。
３９．項目３２〜３６の何れか１項に記載の方法であって、該方法は更に、前記インスリン産生細胞を前記個体に移植する工程を含む前記方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C-1】

【図4C-2】

【図4D】

【図4E-1】

【図4E-2】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図5C】

【図5D-1】

【図5D-2】

【図6A】

【図6B】

【図6C-1】

【図6C-2】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図10】