特許 6954893 ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6954893

(24)【登録日】2021年10月4日

(45)【発行日】2021年10月27日

(54)【発明の名称】ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20211018BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20211018BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20211018BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20211018BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20211018BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0775

   A61K35/28

   A61P9/00

   A61P29/00

   A61P37/00

【請求項の数】12

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2018-509460(P2018-509460)

(86)(22)【出願日】2017年3月30日

(86)【国際出願番号】JP2017013389

(87)【国際公開番号】WO2017170925

(87)【国際公開日】20171005

【審査請求日】2020年2月28日

(31)【優先権主張番号】62/315,098

(32)【優先日】2016年3月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000115991

【氏名又は名称】ロート製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】池山 芳史

(72)【発明者】

【氏名】津田 智博

(72)【発明者】

【氏名】宇野 栄子

(72)【発明者】

【氏名】湯本 真代

(72)【発明者】

【氏名】吉野 みほ子

【審査官】 長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３２３７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０５４２５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５０００１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−０６０８４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０１８７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 LUCA, Antonella De et al.，Role of the EGFR Ligand/Receptor System in the Secretion of Angiogenic Factors in Mesenchymal Stem C，Journal of Cellular Physiology，2011年，Vol. 226，p. 2131-2138

【文献】 LI, Mingfen et al.，Mesenchymal stem cells suppress CD8+ T cell-mediated activation by suppressing natural killer group，Clinical and Experimental Immunology，2014年，Vol. 178，p. 516-524

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７７５

Ａ６１Ｋ ３５／２８

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、有意に高く発現する間葉系幹細胞。

【請求項2】

ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である、請求項１記載の間葉系幹細胞。

【請求項3】

臍帯又は脂肪由来である、請求項１又は２記載の間葉系幹細胞。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか１項記載の間葉系幹細胞を含む、医薬組成物。

【請求項5】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、有意に高く発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の７０％以上である、請求項４記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、有意に高く発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の９０％以上である、請求項４又は５記載の医薬組成物。

【請求項7】

癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項４から６のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項8】

上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はＩＬ−１が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、請求項４から７のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項9】

バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、請求項８記載の医薬組成物。

【請求項10】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、有意に高く発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製方法。

【請求項11】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢの細胞表面マーカーを、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、有意に高く発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。

【請求項12】

上記疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される、請求項１１記載の調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、生体の細胞又は組織を利用した医薬品の開発や、再生医療の研究が進み、注目されている。このうち、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、臓器再生技術又は創薬スクリーニングツールとして研究が加速されている。一方、骨髄、脂肪組織、臍帯等から体性幹細胞（間葉系幹細胞）を分離して利用する細胞療法は、再生医療の中でも、病気等によって損傷を受けた組織を修復するための体性幹細胞の本来の機能を利用するものであるため、より実現性の高いものとして注目され、研究が進められている。体性幹細胞（間葉系幹細胞）は、一般的には、全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化することが知られている。

【0003】

また、体性幹細胞（間葉系幹細胞）は、上述のような損傷を受けた組織を修復させる効果だけでなく、各種疾患に対する治療効果を有することも知られている。例えば、臍帯組織に由来する体性幹細胞（間葉系幹細胞）には、移植提供者に対して組織適合性不適合な移植受容者における、逆免疫反応（ＧＶＨＤ）を抑制する効果があること（特許文献１参照）、特定の臍帯組織由来間葉系幹細胞は、パーキンソン病の治療のために使用できること（特許文献２参照）、さらに、特定の臍帯組織由来間葉系幹細胞には、循環器系の疾患に対する治療効果があること（特許文献３参照）が知られている。しかし、これらの間葉系幹細胞の治療効果は、十分とは言えない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２００９−５１９９７８号公報

【特許文献2】特表２００８−５２５４８９号公報

【特許文献3】特表２００７−５２８７０５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、各種疾患に対して優れた治療効果を奏する新規の間葉系幹細胞及びその間葉系幹細胞を含んだ新規の医薬組成物、並びにそれらの調製方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ある特定の間葉系幹細胞を含む医薬組成物が、各種疾患に対して優れた治療効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。

【0007】

（１）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞。
（２）ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６陽性である、（１）記載の間葉系幹細胞。
（３）臍帯又は脂肪由来である、（１）又は（２）記載の間葉系幹細胞。
（４）（１）から（３）のいずれか記載の間葉系幹細胞を含む、医薬組成物。
（５）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の７０％以上である、（４）記載の医薬組成物。
（６）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞の比率が、医薬組成物の含む間葉系幹細胞全体の９０％以上である、（４）又は（５）記載の医薬組成物。
（７）癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために用いられる、（４）から（６）のいずれか記載の医薬組成物。
（８）上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はＩＬ−１が関与する疾患の予防又は治療のために用いられる、（４）から（７）のいずれか記載の医薬組成物。
（９）バリア機能の低下が、上皮又は内皮細胞層におけるタイトジャンクション機能の低下に起因する、（８）記載の医薬組成物。
（１０）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製方法。
（１１）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法。
（１２）疾患が、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される、（１１）記載の医薬組成物の調製方法。
（１３）ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞を用いる、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患の予防又は治療方法。
（１４）
ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞を用いる、上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患、又はＩＬ−１が関与する疾患の予防又は治療方法。

【発明の効果】

【0008】

ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、マクロファージ等の免疫細胞からの炎症性サイトカイン産生を抑制する作用や、バリア機能亢進作用に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。そのため、ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する間葉系幹細胞を含む本発明の医薬組成物は、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患等の種々の疾患に対する優れた治療効果を示す。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明の間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。

【図2】本発明の間葉系幹細胞の細胞表面マーカー発現を示す図である。

【図3】本発明の間葉系幹細胞の培養上清中のデコリン、オステオプロテゲリン、ＭＭＰ１の濃度を示す図である。

【図4】本発明の間葉系幹細胞の、酸化ストレス耐性能を示す図である。

【図5】本発明の間葉系幹細胞の培養上清のバリア機能亢進活性を示す図である。

【図6】本発明の間葉系幹細胞の炎症性サイトカイン産生抑制効果を示す図である。

【図7】本発明の間葉系幹細胞の骨細胞への分化の様子を示した写真の図である。

【図8】本発明の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の様子を示した写真の図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明のＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカー（以下、「特定マーカー」ともいう）を高発現する間葉系幹細胞は、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制作用やバリア機能亢進作用に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。このような特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた治療効果を奏する。以下に、本発明における特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞、それを含む医薬組成物等について説明する。

【0011】

［特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞］
本発明において間葉系幹細胞とは、骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有し、この分化能を維持したまま増殖できる細胞を意味する。例えば骨髄、脂肪、血液、骨膜、真皮、臍帯、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、筋肉、子宮内膜、真皮、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来の間葉系幹細胞が挙げられ、好ましくは臍帯由来、脂肪由来、骨髄由来の間葉系幹細胞であり、より好ましくは臍帯由来の間葉系幹細胞である。ここで、「由来」とは、上記細胞が供給源である組織から獲得され、成長、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された細胞であることを示す。なお、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、上記間葉系幹細胞の集合体であり、互いに異なる特性を有する複数種の間葉系幹細胞が含まれていてもよいし、実質的に均一な間葉系幹細胞の集合体であってもよい。

【0012】

本発明における間葉系幹細胞は、被検体由来である自家性細胞であってもよいし、同種の別の対象に由来する他家性細胞であってもよい。好ましくは他家性細胞である。

【0013】

「特定マーカーを高発現する」とは、間葉系幹細胞が特定マーカー遺伝子を高発現していること、若しくは特定マーカータンパクを高発現していること、又はその両方を高発現していることをいう。すなわち、間葉系幹細胞がＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーの遺伝子及び／又はタンパクを高発現していることをいう。「高発現」とは、従来の間葉系幹細胞と比較して特定マーカーの発現が高いことをいう。ここで、従来の間葉系幹細胞としては、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地又はＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地（ＬＬ−００３４）で培養した間葉系幹細胞が例として挙げられる。したがって、本発明における間葉系幹細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−α培地又はＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地（ＬＬ−００３４）で培養した間葉系幹細胞と比較して、特定マーカー遺伝子及び／又はタンパクの発現が有意に高く、好ましくはタンパク発現強度が１．５倍〜１，０００倍、より好ましくは２倍〜２００倍、さらに好ましくは５倍〜１００倍、特に好ましくは１０倍〜５０倍である。上記タンパク発現強度は、例えば特異的抗体を用いたＦＡＣＳ解析等により確認することができる。

【0014】

本発明の間葉系幹細胞は、ＥＧＦＲ及びＭＩＣ−ＡＢからなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを高発現する。すなわち、本発明の間葉系幹細胞は、少なくとも、ＥＧＦＲ、ＭＩＣ−ＡＢのうちのいずれか１つを高発現し、好ましくは、これら２種を高発現する。

【0015】

ＥＧＦＲは、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、細胞の増殖や成長を制御する上皮成長因子（ＥＧＦ）を認識し、シグナル伝達を行う受容体である。この受容体は、チロシンキナーゼ型受容体で、細胞膜を貫通して存在する分子量１７０ｋＤａの糖タンパクであり、ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１とも呼ばれる。ＥＧＦＲの発現は上皮系、間葉系、神経系起源の多様な細胞でみられる。細胞膜上にあるこの受容体に上皮成長因子（ＥＧＦ）が結合すると、受容体は活性化し、細胞を分化、増殖させる。ＥＧＦＲは、細胞の分化、発達、増殖、維持の調節に重要な役割を演じていることが知られている。

【0016】

例えば、間葉系幹細胞の骨、脂肪への分化に、ＥＧＦＲを介したシグナルが重要な役割を果たしていること（J.Cell.Mol.Med.Vol,17,No.9,2013,pp.1160-1172，PLOS ONE, December 2012,Volume7,Issue 12,e50099，Biochemical and Biophysical Research Communications 371,2008,pp.866-871）、間葉系幹細胞においてＥＧＦＲシグナル経路を活性化することにより、神経細胞への分化が促進されること（BMB Rep. 2013; 46(11): pp.527-532，Neurochemistry International 62 ,2013, pp.418-424）、ＭＳＣの生存維持のためにＥＧＦＲからのシグナルが重要な役割を果たすこと（Stem Cells Translational Medicine,2016,5,pp.1580-1586）、ＣＯＰＤ患者の肺など、組織損傷が起きている部位における、ＭＳＣによる創傷治癒効果は、ＥＧＦＲを活性化することにより増強すること（Respiratory Research (2016) 17:3）などが報告されている。

【0017】

ＭＩＣ−ＡＢは、ＭＨＣクラスＩ関連分子であるＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢのことをいい、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ；ＮＫ細胞活性化受容体）のリガンドとして機能する分子である。ＭＩＣ−ＡＢは主に上皮系の細胞や、多くの腫瘍細胞に発現していることが知られている。腫瘍細胞は可溶性のＭＩＣＡを分泌して、免疫細胞表面のＮＫＧ２Ｄの機能を抑制することにより抗腫瘍応答を減少させるという報告もある（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ， ｖｏｌ．２， ８１３， ２００２）。また、ＭＩＣＢは、ＮＫＧ２Ｄのストレス誘導性リガンドであり、ＮＫ細胞によるウイルス感染細胞や腫瘍細胞の傷害において重要な役割を担っている分子であることも知られている。

【0018】

本発明の間葉系幹細胞は、上記特定マーカーを高発現するという特徴に加えて、例えば、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）による表面マーカー発現、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来型ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、タンパク質アレイ、サイトカイン等のタンパク質分泌（例えば、血漿凝固解析、ＥＬＩＳＡ、サイトカインアレイ）、代謝産物（メタボローム解析）、本分野で知られている他の方法等によって、特徴付けられてもよい。本発明における特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、例えば、以下のような特徴を有する。

【0019】

（特定マーカー以外の表面マーカーの発現）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、未分化性の指標となるＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６を発現している。

【0020】

（特定マーカー以外の遺伝子発現）
本発明における特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、特定マーカー遺伝子に加えて、他の遺伝子発現の有無によって特徴付けられてもよい。本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞が発現している遺伝子としては、例えば、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１、ＡＮＫＲＤ１、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５、ＳＬＣ１４Ａ１等が挙げられる。特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１、ＡＮＫＲＤ１、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５及びＳＬＣ１４Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子を発現していることが好ましい。より好ましくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、さらに好ましくは６種以上、７種以上、８種以上、９種以上の、特に好ましくは、上記の全ての遺伝子を発現している。

【0021】

また、特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、ＭＴ１Ｘ、ＮＩＤ２、ＣＰＡ４、ＤＫＫ１及びＡＮＫＲＤ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子が高発現であってもよい。好ましくは２種以上、３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは上記の全ての遺伝子が高発現である。さらに、ＴＩＭＰ３、ＭＭＰ１、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＩＧＦＢＰ５及びＳＬＣ１４Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種の遺伝子が低発現であってもよい。好ましくは２種以上、３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは上記の全ての遺伝子が低発現である。ここで、遺伝子が高発現又は低発現とは、特定マーカー陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、各遺伝子発現が増強している場合又は低下している場合をいう。具体的には、例えば、臍帯由来間葉系幹細胞としてＬｉｆｅＬｉｎｅ社のＵＣ−ＭＳＣ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０）を用いた場合、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社の推奨培地で培養した場合の各遺伝子発現強度と比較することができる。

【0022】

なお、このときの各遺伝子の発現は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、細胞から常法によりｍＲＮＡを調製し、発現の有無や程度を確認したい遺伝子についてｑＲＴ−ＰＣＲを行い、それぞれの遺伝子発現を解析することができる。

【0023】

ＭＴ１Ｘは、システインリッチな低分子量タンパクであり（分子量５００〜１４，０００Ｄａ）、ゴルジ体の膜に局在している。ＭＴ１Ｘの機能の詳細は不明であるが、抗酸化タンパクとして、酸化ストレスに対する防御機構に関与している可能性が示唆されている。また、ＭＴ１Ｘは細胞の未分化性の指標となるタンパクであるとも言われている。本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞がＭＴ１Ｘを発現していることの効果として、細胞が酸化ストレス耐性を獲得していることが挙げられ、疾患の治療に用いる場合に、よりダメージに強い細胞である点で好ましい。

【0024】

ＮＩＤ２は、ラミニンγ１鎖に結合し、ラミニンをＩＶ型コラーゲンに結びつけることで基底膜の形成と維持に関与しているタンパクである。中枢神経組織内におけるほとんどの基底膜に発現している。本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞がＮＩＤ２を発現していることの効果としては、筋肉細胞（特に、骨格筋、心筋）への分化能が向上している可能性が考えられる。

【0025】

ＣＰＡ４は、タンパク質のＣ末端アミノ酸を切断するタンパク分解酵素のひとつである。また、ＣＰＡ４は前立腺癌マーカーとしても知られるタンパクであり、癌の悪性度に比例して発現が上昇することが知られている。活発に増殖する未分化性の高い細胞において発現が上昇している傾向があることから、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞がＣＰＡ４を発現していることは、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞が未分化性及び増殖性が高いことを示唆していると言える。

【0026】

ＡＮＫＲＤ１は、間葉系幹細胞の他、心筋、平滑筋、線維芽細胞、肝星細胞等に発現しているタンパクであり、分化の過程や、ストレスに関与して作用する転写因子である。多くの心疾患に関与していることが判明している。また、創傷治癒過程にある線維芽細胞や肝障害時の肝星細胞において発現が上昇すること、ＡＮＫＲＤ１を欠失させたマウスでは傷の治りが遅れること等が知られている（Ｓｕｓａｎ Ｅ． Ｓａｍａｒａｓ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ｎｏ． １， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５， Ｉｎｇｅ Ｍａｎｎａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５）。また、ＭＭＰ１０，１３等の細胞外基質分解酵素の発現を制御する核内因子である（Ｋａｒｉｎｎａ Ａｌｍｏｄｏｖａｒ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ． ＭＣＢ ２０１４）。よって、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞がＡＮＫＲＤ１を発現していることの効果としては、心筋細胞への分化能向上や創傷治癒効果亢進、線維化組織の細胞外基質のリモデリングに関与する等の可能性が考えられる。

【0027】

ＤＫＫ１は、Ｗｎｔシグナル阻害剤として機能するタンパクであり、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路の抑制化に寄与していると考えられている。そのため、骨分化に関しては促進的方向に作用して骨分化能を向上させる。骨粗しょう症においては発現が低下することが知られている。一方、細胞の未分化性維持及び増殖には良い影響を与えていると考えられており、胎児発達にも寄与していることも知られている。

【0028】

ＴＩＭＰ３（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ３）は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３の活性化を抑制する。さらに、ＭＭＰ３はその他の多くのＭＭＰの活性化に関与していることから、ＴＩＭＰ３は広範なＭＭＰの抑制因子として機能する。また、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を抑制することで血管新生を抑制することや、アポトーシス促進シグナルとして働くことが知られている。

【0029】

ＭＭＰ１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンを対象に分解するタンパク質である。主要なＥＣＭを対象にしていることから、細胞分裂や細胞遊走の際に働くことが知られている。炎症反応によって発現が増加することが知られており、炎症時の組織破壊やリモデリングに関与している。

【0030】

オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）は、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）のデコイ受容体で、ＲＡＮＫを介したＮＦ−κＢシグナルの活性化を阻害する。骨芽細胞、線維芽細胞、肝細胞などから産生され、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害する。オステオプロテゲリンの局所投与により骨形成が促進されたり、逆にノックダウンにより骨粗鬆症を生じるという報告がある。

【0031】

ＩＧＦＢＰ−５は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質で、ほとんどのＩＧＦはＩＧＦＢＰと結合した状態で存在している。ＩＧＦＢＰの機能として、ＩＧＦシグナルを増強することが挙げられる。また、ＴＮＦＲ１の遺伝子発現を促進するほか、ＴＮＦＲ１タンパク質に対してアンタゴニスト的に働くことで、ＴＮＦαシグナルを抑制することが知られている。また、乳癌細胞で、ＩＧＦＢＰ−５が細胞接着、生存率の増加を促進し、細胞遊走を抑制することが報告されている。

【0032】

ＳＬＣ１４Ａ１は、尿素トランスポーターであり、腎臓で発現が高く、細胞内の尿素濃度のコントロールを行っている。間葉系幹細胞でも発現していることは示されており、特に軟骨分化時に発現低下することが報告されている。

【0033】

（マイクロＲＮＡ発現）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、ｍｉＲＮＡの発現の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明の間葉系幹細胞が発現しているｍｉＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ等が挙げられる。本発明の間葉系幹細胞は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡを発現していることが好ましい。より好ましくは２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上の、さらに好ましくは７種以上、８種以上、９種以上、１０種以上、１１種以上、１２種以上の、特に好ましくは、上記の全てのマイクロＲＮＡを発現している。

【0034】

また、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡが低発現となる傾向であり、かつｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐからなる群より選択される少なくとも１種のマイクロＲＮＡが高発現となる傾向であることが好ましい。ここで、マイクロＲＮＡが低発現とは、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞と比較して、低発現であることをいう。また、逆にマイクロＲＮＡが高発現とは、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞と比較して、高発現であることをいう。具体的には、例えば、臍帯由来間葉系幹細胞としてＬｉｆｅＬｉｎｅ社のＵＣ−ＭＳＣ（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０）を用いた場合、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社の推奨培地で培養した場合の各マイクロＲＮＡ発現強度を基準とすることができる。

【0035】

なお、このときのマイクロＲＮＡの発現は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、細胞から常法によりｍＲＮＡを調製し、ｑＲＴ−ＰＣＲもしくは市販のマイクロＲＮＡアレイ等により、細胞中のマイクロＲＮＡ発現を解析することができる。マイクロＲＮＡの発現量の判定は、処方培地で培養して得られた細胞における各種マイクロＲＮＡ発現量を、従来の培地や推奨培地等で培養して得られた細胞におけるそれぞれのマイクロＲＮＡ発現量で除した値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ値）を算出して行うことができる。

【0036】

（サイトカイン分泌）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、サイトカイン分泌の有無によってさらに特徴付けられてもよい。本発明の間葉系幹細胞が分泌しているサイトカインとしては、例えば、デコリン、オステオプロテゲリン、ＭＭＰ１等が挙げられる。本発明の間葉系幹細胞は、デコリン、オステオプロテゲリン及びＭＭＰ１からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインを分泌していることが好ましく、少なくとも２種のサイトカインを分泌していることがより好ましく、３種全てのサイトカインを分泌していることがさらに好ましい。

【0037】

また、本発明の間葉系幹細胞は、デコリンの分泌量が多く、かつオステオプロテゲリン及びＭＭＰ１の分泌量が少ないことが好ましい。ここで、各因子の分泌量が多い又は少ない、の判断は、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞におけるそれぞれの因子の産生量（培養上清中の濃度）と比較することにより行うことができる。

【0038】

なお、サイトカインの分泌量（培養上清中の濃度）は、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。

【0039】

デコリンは、スモールロイシンリッチプロテオグリカンファミリーで最もよく知られている因子の一つである。生体内ではユビキタスに発現し、コラーゲン線維の集合や細胞の増殖などに関与していることが知られている。本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞においてデコリンの分泌が上昇していることの効果としては、炎症部位、損傷部位における組織修復効果、組織における細胞増殖促進効果等が期待できる。

【0040】

オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）は、遺伝子発現の項において記載した通り、破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ）のデコイ受容体で、ＲＡＮＫを介したＮＦ−κＢシグナルの活性化を阻害する。骨芽細胞、線維芽細胞、肝細胞などから産生され、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を阻害する。オステオプロテゲリンの局所投与により骨形成が促進されたり、逆にノックダウンにより骨粗鬆症を生じるという報告がある。

【0041】

ＭＭＰ１（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ １）は、遺伝子発現の項において記載した通り、間質コラゲナーゼであり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型コラーゲンのへリックス部位を特異的に切断し、組織破壊や組織再構築に関与する酵素である。本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞においてＭＭＰ１の分泌が、特定マーカー陰性細胞と比較して低いことの効果としては、炎症部位、損傷部位における組織修復効果等が期待できる。

【0042】

（分化の方向性）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、骨、脂肪、軟骨への分化能を有する。それぞれの分化能については、当業者に公知の分化誘導条件により上記間葉系幹細胞集団を培養して、判断することができる。

【0043】

骨細胞への分化誘導法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、以下のような方法により誘導できる。即ち、本発明の間葉系幹細胞を数日間培養した後、培地中にＦＢＳ等の血清、デキサメタゾン、β−グリセロールホスフェート（β−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含まれた分化培養液に懸濁して播種する。なお、上記分化培養液としては、市販の骨細胞分化用培地を用いてもよい。このような市販の骨分化用培地としては、例えば、ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ （タカラバイオ社，Ｄ１２１０９）等が挙げられる。骨分化のための培養では、分化培養用播種から２４時間〜７２時間程度の後に培地交換を行い、以後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

【0044】

脂肪細胞への分化誘導方法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、レチノイン酸を添加した培養液で数日間浮遊培養した後、インシュリン及びトリヨードサイロニン（Ｔ３）を添加した培養液で培養する。また、従来この種の細胞の培養に用いられる培養条件を利用することができ、例えば、培地の種類、組成物の内容、組成物の濃度、及び培養温度等に関して特に制限はない。また、培養期間は、典型的には２１日を超えない期間培養をするのが好ましいが、３０日〜４０日程度培養を継続することも可能である。具体的には、以下のような方法により脂肪細胞を誘導できる。即ち、本発明の間葉系幹細胞を数日間培養した後、脂肪細胞分化用培地に懸濁してクラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて播種する。上記分化用培地としては、例えば、ヒト間葉系幹細胞用脂肪細胞分化用培地：ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＬ−００５０）、 ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ， ＬＬ−００５９）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社，Ｄ１２１０７）等が挙げられる。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から２４〜７２時間程度の後に培地交換を行い、以後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

【0045】

軟骨細胞への分化誘導法としては、従来から用いられている誘導方法を用いることができ、特に限定されないが、典型的には、本発明の間葉系幹細胞をコラーゲンゲル等と混合してゲル化し、ＤＭＥＭ等の培地に、デキサメタゾン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ）、ＴＧＦ−β３（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β３）、ＩＴＳプラスプレミックス（ＩＴＳ ｐｌｕｓ ｐｒｅｍｉｘ）（インシュリン、トレンスフェリン、亜セレン酸の混合物）が含まれた分化培養液を添加して培養することができる。１週に２〜３回程度培養液を交換しながら３週間程度培養する。具体的には、以下のような方法により軟骨細胞を誘導できる。即ち、本発明の間葉系幹細胞を数日間培養した後、軟骨分化用培地に懸濁して、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、マイクロマス法を用いて播種する。上記軟骨分化用培地としては、例えば、ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ｗ／ｏ Ｉｎｄｕｃｅｒｓ（タカラバイオ社，Ｄ１２１１０）等が挙げられる。その後、３〜４日毎に培地交換を行い、２週間〜１ヶ月程度培養する。

【0046】

上記の分化誘導方法にて得られた細胞は、生化学的アプローチ或いは形態観察により分化した細胞の種類を確認することができる。例えば、顕微鏡による細胞観察、種々の細胞染色法、ハイブリダイゼーションを用いたノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法等のさまざまな確認方法によって分化した細胞の種類を特定することができる。

【0047】

脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞は、その細胞の形状からは判定が困難であるが、細胞内脂質を染色する（例えばＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法により赤く染色できる。）ことにより脂肪細胞の存在を確認することができる。また、細胞をアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）染色を行うことにより骨細胞の存在を確認することができる。また、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色、サフラニンＯ染色、又はトルイジンブルー染色を行うことにより軟骨細胞の存在を確認することができる。

【0048】

本発明の間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化能を有するが、特に脂肪細胞、骨細胞への分化能が、従来の培地によって培養された間葉系幹細胞集団と比較して顕著に向上している。

【0049】

（酸化ストレス耐性）
本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞と比較して、ロテノン等による酸化ストレスによるダメージを受けにくい。即ち、特定マーカー陽性である間葉系幹細胞と、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞に対して、同じ濃度のロテノンで処理し、細胞のＶｉａｂｉｌｉｔｙ（％）を比較すると、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞は、ロテノンの濃度依存的にＶｉａｂｉｌｉｔｙが顕著に低下するのに対して、本発明の間葉系幹細胞は、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙの低下が抑えられ、細胞によっては、ほぼ１００％のＶｉａｂｉｌｉｔｙとなる場合もある。

【0050】

［特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製］
特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、臍帯、脂肪組織、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、特定マーカーに特異的に結合する抗体（抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＭＩＣ−ＡＢ抗体）を用いて、特定マーカー陽性細胞をセルソーター、磁気ビーズ等で分離することにより取得することができる。また、後述する処方培地を用いる培養により、間葉系幹細胞における特定マーカー発現を誘導、増強することで、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を効率的に取得することもできる。この誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の７０％以上が特定マーカー陽性であることが好ましく、８０％以上が特定マーカー陽性であることがより好ましく、９０％以上が特定マーカー陽性であることがさらに好ましく、実質的に特定マーカー陽性の均一な細胞集団であることが特に好ましい。以下に、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。

【0051】

本発明における特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製方法としては、例えば以下のような方法を用いることができる。すなわち、（Ａ）間葉系幹細胞を含む組織を、酵素等で処理する工程、（Ｂ）上記酵素処理により得られた細胞懸濁液を適切な培養培地に懸濁して付着培養を行う工程、（Ｃ）浮遊細胞を除去する工程、（Ｄ）間葉系幹細胞を培養する工程等を含む方法により、間葉系幹細胞を取得、培養することができる。各工程について以下に、詳細に説明する。

【0052】

（Ａ）間葉系幹細胞を含む組織を、酵素等で処理する工程において、臍帯等の間葉系幹細胞を含む組織は、生理食塩水（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））等を用いて、攪拌して沈降させること等により洗浄する。この操作により、上記組織に含まれる夾雑物を組織から除去することができる。残存する細胞は、さまざまなサイズの塊として存在するので、細胞そのものの損傷を最小限に抑えながら解離させるため、洗浄後の細胞塊を、細胞間結合を弱めるか、又は細胞間結合を破壊する酵素（例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン等）で処理することが好ましい。使用する酵素の量及び処理期間は、使用される条件に依存して変わるが、当技術分野の技術常識の範囲で行うことができる。このような酵素処理に代えて、又は併用して、細胞塊を、機械的な攪拌、超音波エネルギー、熱エネルギー等の他の処理法で分解することができるが、細胞の損傷を最小限に抑えるため、酵素処理のみで行うことが好ましい。酵素を用いた場合、細胞に対する有害な作用を最小限に抑えるために、酵素による処理後は、培地等を用いて酵素を失活させることが望ましい。

【0053】

上記工程により得られる細胞懸濁物は、凝集状の細胞のスラリー又は懸濁物、並びに各種夾雑細胞、例えば赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を含む。したがって、続いて凝集状態の細胞とこれらの夾雑細胞を分離、除去してもよいが、後述する浮遊細胞等除去工程により、除去可能であることから、当該分離、除去は割愛しても良い。夾雑細胞を分離、除去する場合、細胞を上清と沈殿に強制的に分ける遠心分離によって達成することができる。得られた夾雑細胞を含む沈殿は、適切な溶媒に懸濁させる。懸濁状の細胞には、赤血球を含む恐れがあるが、後述する個体表面への接着による選択により、赤血球は除外されるため、溶解する工程は必ずしも必要ではない。赤血球を選択的に溶解する方法として、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地又は低張培地中でのインキュベーション等、当技術分野で周知の方法を使用することができる。溶解後、例えば濾過、遠心沈降、又は密度分画によって溶解物を所望の細胞から分離してもよい。

【0054】

次に（Ｂ）上記酵素処理により得られた細胞懸濁液を適切な培養培地に懸濁して付着培養を行う工程において、懸濁状の細胞において、間葉系幹細胞の純度を高めるために、１回もしくは連続して複数回洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。この他にも、細胞を、細胞表面マーカープロファイルを基に、又は細胞のサイズ及び顆粒性を基に分離しても良い。この工程において、特定マーカータンパクを発現している細胞のみを、セルソータ―、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離してもよい。

【0055】

再懸濁において用いる培地は、間葉系幹細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、例えば、動物細胞用の基礎培地に、血清及び／又は血清代替物等を添加して作製することができる。また、間葉系幹細胞の培養に適した培地として市販されているものを用いてもよい。なお、本発明においては間葉系幹細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いるため、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。特に異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地が好ましい。

【0056】

上記基礎培地の組成は、培養するべき細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等が挙げられる。

【0057】

血清は、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等があるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、０．５％〜１５％、好ましくは、５％〜１０％を添加しても良い。
基礎培地に加える上記血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール等が挙げられる。

【0058】

上記基礎培地には、必要に応じて、さらにアミノ酸、無機塩類、ビタミン類、増殖因子、抗生物質、微量金属類、幹細胞分化誘導剤、抗酸化剤、炭素源、塩、糖、糖前駆体、植物由来加水分解物、サーファクタント、アンモニア、脂質、ホルモン、緩衝剤、指示薬、ヌクレオシド、ヌクレオチド、酪酸、有機物、ＤＭＳＯ、動物由来生成物、遺伝子誘導剤、細胞内ｐＨの調節剤、ベタイン、浸透圧保護剤、鉱物、等の物質を添加しても良いが、これらの物質に限定されない。これらの物質の使用濃度は特に限定されず、通常の哺乳動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

【0059】

上記アミノ酸としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

【0060】

上記無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

【0061】

上記ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

【0062】

その他、基礎培地に添加できる具体的な物質としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等の増殖因子；ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ブラストサイジン、クロラムフェニコール、アモキシシリン、バシトラシン、ブレオマイシン、セファロスポリン、クロルテトラサイクリン、ゼオシン及びピューロマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン等が挙げられる。

【0063】

本発明における間葉系幹細胞に好適な無血清培地としては、市販の無血清培地が挙げられる。例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社等から間葉系幹細胞用として予め調製された培地として提供されているもの等が挙げられる。

【0064】

続いて、間葉系幹細胞を分化させずに培養容器等の固体表面上で、上述の適切な培地を使用して、適切な細胞密度及び培養条件で培養する。固体表面を有する培養容器の形状は特に限定されないが、シャーレやフラスコ等が好適に用いられる。本発明における間葉系幹細胞の培養条件は、それぞれの間葉系幹細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの細胞に適していれば特に限定されず、細胞の様子を見ながら、従来と同様に行うことができる。

【0065】

（Ｃ）浮遊細胞を除去する工程において、培養容器の固体表面に非付着状態の浮遊細胞及び細胞の破片等を除去し、生理食塩水（例えばリン酸緩衝食塩水；ＰＢＳ）等を用いて付着細胞を洗浄する。本発明では、最終的に培養容器の固体表面に付着した状態で留まる細胞を、間葉系幹細胞の細胞集団として選択することができる。

【0066】

次に、（Ｄ）間葉系幹細胞を培養する工程を行う。培養方法は、それぞれの細胞に適した方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。通常、３０℃〜３７℃の温度、２％〜７％ＣＯ_２環境下、５％〜２１％Ｏ_２環境下で行われる。また、間葉系幹細胞の継代の時期及び方法もそれぞれの間葉系幹細胞に適していれば特に限定されず、間葉系幹細胞の形態を観察しながら、従来と同様に行うことができる。培養に用いる培地としては、工程（Ｂ）と同様のものを用いることができる。なお、細胞の全培養期間に渡って無血清培地等を用いて行われてもよい。

【0067】

上記（Ｄ）工程の培養によって得られた間葉系幹細胞から、特定マーカータンパクを発現している細胞のみを、セルソータ―、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離する（Ｅ）工程をさらに含むことが好ましい。（Ｅ）工程により、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を効率的に取得することができる。

【0068】

なお、上記（Ｂ）工程以降の工程において、例えば以下の処方培地を採用することにより、間葉系幹細胞における特定マーカー発現を誘導、増強し、効率的に特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を取得することもできる。

【0069】

［間葉系幹細胞用の処方培地］
特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を効率的に取得するために用いる培地としては、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分と、動物細胞培養用基礎培地とを含有する培地（処方培地）が挙げられる。処方培地は、これらの成分を含有することで、間葉系幹細胞において特定マーカーの発現を誘導又は促進すると共に、間葉系幹細胞の未分化性を長期に渡って維持しながら培養することができる。また、処方培地は、間葉系幹細胞を長期に渡って良好な細胞状態を維持しながら、効率的に増殖させることができる。さらに、処方培地は、増殖因子及びステロイド性化合物からなる群より選択される少なくとも１種の成分をさらに含有することが好ましい。以下に、処方培地が含む成分について詳細に説明する。

【0070】

（ＰＴＥＮ阻害剤）
本発明においてＰＴＥＮ阻害剤とは、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ Ｔｅｎｓｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｄｅｌｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０）遺伝子、又はＰＴＥＮタンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ＰＴＥＮ遺伝子は、染色体上の１０ｑ２３．３に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。ＰＴＥＮタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファチジルイノシトール ３，４，５−トリフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ３）の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。ＰＩＰ３は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）により細胞内で合成され、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／ ＡＫＴの活性化を引き起こす。ＰＴＥＮは、このＰＩＰ３の脱リン酸化反応を担い、フォスファチジルイノシトール ４，５−ビスフォスフェイト（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＩＰ２）に変換する作用があるとされている。従って、ＰＴＥＮは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系を負に制御する。ＰＴＥＮの活性が阻害されると、細胞内にＰＩＰ３が蓄積し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ情報伝達系が活性化する。

【0071】

本発明におけるＰＴＥＮ阻害剤としては、バナジウムを含む化合物が好ましく、例えばｐＶ（ｐｈｅｎｂｉｇ）（ジカリウムビスペロキソ（フェニルビグアニド）オキソバナデート）、ＨＯｐｉｃ（ｂｐＶ）（ジカリウムビスペロキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル）オキソバナデート）、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ三水和物（（ＯＣ−６−４５） Ａｑｕａ （３−ヒドロキシ−２−ピリジンカルボキシラート−ｋａｐａＮ１，ｋａｐａＯ２）［３−（ヒドロキシ−ｋａｐａＯ）−２−ピリジンカルボキシラート（２−）−ｋａｐａＯ２］オキソ−バナジン酸（１−）， 水素三水和物）等が挙げられる。これらのうち、ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯｐｉｃ、ｐＶがより好ましい。ＶＯ−ＯＨＰｉｃ、ＨＯｐｉｃ、ｐＶのいずれでも十分な効果が得られるが、ｐＶがさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0072】

処方培地におけるＰＴＥＮ阻害剤の培地中の濃度としては、本発明の効果の観点から、１０ｎＭ〜１０μＭが好ましく、５０ｎＭ〜１μＭがより好ましく、１００ｎＭ〜７５０ｎＭがさらに好ましく、２５０ｎＭ〜７５０ｎＭが特に好ましい。

【0073】

（ｐ５３阻害剤）
本発明においてｐ５３阻害剤とは、ｐ５３遺伝子又はｐ５３タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ５３遺伝子は、染色体上の１７ｐ１３．１に位置し、腫瘍抑制遺伝子としても知られている。ｐ５３タンパク質は、転写因子として作用し、多様な生理活性を有する。

【0074】

本発明におけるｐ５３阻害剤としては、例えばオルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質等が挙げられる。これらのうち、オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質が好ましい。オルトバナジン酸ナトリウム、ピフィスリン−α、ＭＤＭ２タンパク質のいずれでも十分な効果が得られるが、ピフィスリン−αがより好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0075】

処方培地におけるｐ５３阻害剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１００ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、５００ｎＭ〜５００μＭであることがより好ましく、１μＭ〜１００μＭであることがさらに好ましい。

【0076】

（ｐ３８阻害剤）
本発明においてｐ３８阻害剤とは、ｐ３８遺伝子又はｐ３８タンパク質の作用を阻害する機能を有するすべての物質をいう。ｐ３８は、セリン／スレオニンキナーゼであるＭＡＰキナーゼ （Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ）の１つである。ＭＡＰキナーゼは、外界刺激を伝達するシグナル分子、細胞増殖、分化、遺伝子発現、アポトーシス等への関与が明らかにされている。

【0077】

本発明におけるｐ３８阻害剤としては、例えばＳＢ２０３５８０（Ｍｅｔｈｙｌ［４−［４−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）、ＢＩＲＢ７９６（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ；１−［５−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−２−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−３−ｙｌ］−３−［４−（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）−１−ｎａｐｈｔｈｙｌ］ｕｒｅａ）、ＬＹ２２２８８２０（５−［２−（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−５−（４−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｙｌ］−３−（２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）−３Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ａｍｉｎｅ ｄｉｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＶＸ−７０２（２−（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−６−［（２，６−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＰＨ−７９７８０４（Ｎ，４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−［３−ｂｒｏｍｏ−４−［（２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＴＡＫ−７１５（Ｎ−［４−［２−Ｅｔｈｙｌ−４−（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｙｌ］−２−ｐｙｒｉｄｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＶＸ−７４５（５−（２，６−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｔｈｉｏ］−６Ｈ−ｐｙｒｉｍｉｄｏ［１，６−ｂ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎ−６−ｏｎｅ）、及びＳｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌ（（２Ｒ）−３−［８−［（２，４−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−５−ｏｘｏ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ａ，ｄ］ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｅｎｅ−３−ｙｌｏｘｙ］−１，２−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）等が挙げられる。これらのうち、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌが好ましい。ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＢＩＲＢ７９６、ＬＹ２２２８８２０、ＶＸ−７０２、ＰＨ−７９７８０４、ＴＡＫ―７１５、ＶＸ−７４５、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ−Ｌのいずれを用いても十分な効果が得られるが、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０がより好ましく、ＳＢ２０３５８０がさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0078】

処方培地におけるｐ３８阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜５００ｎＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜２５０ｎＭであることがさらに好ましい。

【0079】

（Ｗｎｔシグナル活性化剤）
本発明においてＷｎｔシグナル活性化剤とは、Ｗｎｔシグナルを活性化させるすべての物質をいう。Ｗｎｔは、分泌性の細胞間シグナル伝達タンパク質で、細胞内シグナル伝達に関与している。このシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化、運動、初期胚発生時の体軸形成や器官形成等の機能を制御している。Ｗｎｔシグナル経路では、Ｗｎｔが細胞に作用することにより、いくつかの別々の活性化される細胞内シグナル伝達機構が含まれる。Ｗｎｔシグナル経路にはβ−カテニンを介して遺伝子発現を制御するβ−カテニン経路、細胞の平面内極性を制御するＰＣＰ（ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ， 平面内細胞極性）経路、Ｃａ２^＋の細胞内動員を促進するＣａ２^＋経路等が知られている。本明細書において、Ｗｎｔシグナル活性化剤とは、そのいずれの経路を活性化するものであってもよい。

【0080】

本発明におけるＷｎｔシグナル活性化剤には、Ｗｎｔ−３ａのように、カテニン依存性の活性化剤、Ｗｎｔ−５ａのようにカテニン非依存性の活性化剤のいずれも含まれる。この他に、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、補体分子Ｃ１ｑ等を用いることもできる。これらのうち、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ、ＬｉＣｌ、補体分子Ｃ１ｑが好ましく、いずれを用いても十分な効果が得られるが、ＬｉＣｌ、補体分子Ｃ１ｑがより好ましく、ＬｉＣｌがさらに好ましい。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0081】

処方培地におけるＷｎｔシグナル活性化剤の濃度は、本発明の効果の観点から、１μＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、１０μＭ〜１０ｍＭであることがより好ましく、１００μＭ〜１ｍＭであることがさらに好ましく、１００μＭ〜５００μＭであることが特に好ましい。

【0082】

（ＲＯＣＫ阻害剤）
本発明においてＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の作用を阻害するすべての物質をいう。Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。Ｒｈｏキナーゼは、筋肉等の収縮、細胞増殖、細胞遊走及び他の遺伝子発現誘導等の生理機能に関与している。

【0083】

本発明におけるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えばＹ−２７６３２〔（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ〕、Ｋ−１１５（リパスジル塩酸塩水和物）、Ｆａｓｕｄｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（塩酸ファスジル；〔ＨＡ１０７７／１−（５−Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ〕）等が挙げられる。これらのうち、Ｙ−２７６３２、Ｋ−１１５、塩酸ファスジルが好ましく、これらのいずれを用いても十分な効果が得られるが、中でもＹ−２７６３２がより好ましい。

【0084】

処方培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１０μＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがより好ましく、５０ｎＭ〜５００ｎＭであることがさらに好ましい。

【0085】

処方培地は、これらのＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも２種の成分を含むが、本発明の効果の観点から、いずれか３種の成分を含むことが好ましく、いずれか４種の成分を含むことがより好ましく、５種全てを含むことがさらに好ましい。上記２種の成分の組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤及びｐ５３阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤及びｐ３８阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤及びｐ３８阻害剤；ｐ５３阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ｐ５３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。上記３種の成分の組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びｐ３８阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。上記４種の成分と組み合わせとしては、上記５種の成分のいずれを組合わせてもよく、具体的には、ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＷｎｔシグナル活性化剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ５３阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ＰＴＥＮ阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤；ｐ５３阻害剤、ｐ３８阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせである。

【0086】

（増殖因子）
処方培地における増殖因子としては、当業者に公知のいずれの増殖因子でも用いることができる。代表的には、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）等が挙げられるがこれに限定されず、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。さらにアルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン、フェツイン等も例示される。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0087】

処方培地における増殖因子の濃度としては、増殖因子の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、１ｎＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、１０ｎＭ〜１０ｍＭであることがより好ましい。

【0088】

（ステロイド性化合物）
処方培地におけるステロイド性化合物としては、当業者に公知のいずれのステロイド性化合物でも用いることができる。代表的には、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、コルチゾール、ハイドロコルチゾン等のステロイドホルモンを使用することができるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

【0089】

処方培地におけるステロイド性化合物の濃度としては、ステロイド性化合物の種類によって適宜適切な濃度が採用される。一般的には、本発明の効果の観点から、０．１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましく、１ｎＭ〜１００μＭであることがより好ましく、１０ｎＭ〜１μＭであることがさらに好ましい。

【0090】

（動物細胞培養用基礎培地）
本発明における動物細胞培養用基礎培地とは、動物細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。ここで、動物細胞とは、哺乳類細胞、特にはヒト細胞を指す。本発明における動物細胞培養用基礎培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。動物細胞培養用基礎培地には、必要に応じて、微量栄養促進物質、前駆物質等の微量有効物質を配合してもよい。このような動物細胞培養用基礎培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２及びＦ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、特にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が好ましく用いられるがこれに限定されない。

【0091】

動物細胞培養用基礎培地には、アミノ酸類、無機塩類、ビタミン類及び炭素源や抗生物質等の添加剤を添加することができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。

【0092】

アミノ酸類としては、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等が挙げられる。

【0093】

無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。

【0094】

ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。

【0095】

その他、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β−グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５−アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２−メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ−アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’−一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン、アルブミン、牛血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、Ｌｉｐｉｄ混合物、ＩＴＳＥ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム、及びエタノールアミン）混合物等を添加してもよい。

【0096】

処方培地の調製方法は、特に限定されず、従来公知の常法に従って調製することができる。例えば、室温で、又は必要に応じて加温して、動物細胞培養用基礎培地に上述した各成分を添加・混合して得られる。

【0097】

処方培地は液体であることが好ましいが、必要に応じてゲル状、寒天培地等の固形状の培地としてもよい。処方培地によれば、培養表面が表面処理されている、又は表面処理されていない培養容器若しくは培養用担体に間葉系幹細胞を播種してインキュベートすることができる。

【0098】

［医薬組成物］
本発明の医薬組成物は、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を含むことを特徴とする。特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞は、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制作用やバリア機能亢進作用に優れると共に、酸化ストレスに対する耐性もあり、ダメージを受け難い細胞である、といった特性を有する。また、未分化性を維持していると同時に、分化条件下では目的の機能を有する細胞に効率よく分化することができる。このような特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を含む本発明の医薬組成物は、種々の疾患に対する優れた治療効果を奏する。本発明の医薬組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞に加えて、その他の成分を含んでいてもよい。

【0099】

本発明の医薬組成物は、間葉系幹細胞集団を含み、この一部又は全部が特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞である。特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞については、上述の通りである。本発明の医薬組成物が含む間葉系幹細胞集団のうち特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞が占める割合は高いほど好ましい。上記割合は、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。

【0100】

［医薬組成物の調製方法］
本発明は、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む、疾患の予防又は治療のために用いられる医薬組成物の調製方法も含む。上記疾患としては、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患からなる群より選択される疾患が挙げられる。

【0101】

本発明の医薬組成物の調製方法は、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程を含む。上記特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導する工程で採用される方法としては、間葉系幹細胞における特定マーカー発現を誘導、増強できる方法であれば特に限定されない。例えば、上述の処方培地を用いて間葉系幹細胞における特定マーカータンパクの発現を誘導する方法も好ましい方法として例示される。上記処方培地を用いた培養によると、間葉系幹細胞集団の６０％以上を特定マーカー陽性細胞に誘導することができ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは実質的に均一な特定マーカー陽性細胞とすることができる。

【0102】

また、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を濃縮、分離選別する工程で採用される方法としては、例えば、上述のような、特定マーカーを特異的に認識する抗体を用い、セルソーター、磁気ビーズ等を用いる方法が挙げられる。これらの方法によると、特定マーカータンパクを細胞表面に発現している間葉系幹細胞を選択的に濃縮、分離選別することができる。

【0103】

本発明の医薬組成物は、上述の「特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を誘導、濃縮又は分離選別する工程」により取得した、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞に加えて、本発明の効果を損なわない範囲であれば、特定マーカー陰性の間葉系幹細胞、その他の細胞を含んでいてもよく、その用途や形態に応じて、常法に従い、薬学的に許容される担体や添加物を含有させてもよい。このような担体や添加物としては、例えば、等張化剤、増粘剤、糖類、糖アルコール類、防腐剤（保存剤）、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、キレート剤、油性基剤、ゲル基剤、界面活性剤、懸濁化剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、発泡剤、流動化剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、抗酸化剤、甘味剤、酸味剤、着色剤、呈味剤、香料又は清涼化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な成分として例えば次の担体、添加物等が挙げられる。

【0104】

［本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞及び医薬組成物の用途］
（培養上清のバリア機能亢進作用）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞の培養上清は、従来の間葉系幹細胞の培養上清と比較して、より優れた細胞のバリア機能亢進効果を示す。即ち、本発明における特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の培養上清は、炎症によって障害を受けた細胞のバリア機能を回復させる顕著な効果を有するため、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。

【0105】

（抗炎症作用）
特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞は、炎症状態において、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生を抑制する効果を有する。この効果は、特定マーカー陰性の従来の間葉系幹細胞と比較して、有意に高いものである。そのため、本発明の特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、炎症に関連する疾患の治療に好適に用いることができる。また、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞又はその培養上清は、化粧品用組成物、食品用組成物等としても用いることもできる。

【0106】

特定マーカーを高発現する本発明の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物を細胞医薬品として用いることができる疾患としては、例えば、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患及び腎疾患等が挙げられる。具体的には、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、変形性関節症、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、腎不全、狼瘡、膵炎、アレルギー、線維症、貧血、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、化学療法／放射線関連合併症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、アレルギー性結膜炎、糖尿病性網膜症、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、喘息、石綿症、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、ＨＩＶ関連悪液質、大脳マラリア、強直性脊椎炎、らい病、肺線維症、線維筋痛、食道癌、胃食道逆流症、バレット食道、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、虫垂癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌等が挙げられる。

【0107】

上記疾患のうち、本発明の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物は、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、骨疾患、肺疾患、肝疾患に対して好適に用いられる。具体的には、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、膵炎、アレルギー、線維症、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、アレルギー性結膜炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、強直性脊椎炎、肺線維症、食道癌、胃食道逆流症、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、虫垂癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌に対して好適に用いられる。

【0108】

本発明の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物を細胞医薬品として用いることができる疾患としては、上記疾患のうち、特に、上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患（癌、前癌性症状等）、又はＩＬ−１が関与する疾患（炎症性疾患、免疫疾患等）が、好ましい疾患として挙げられる。

【0109】

本発明の医薬組成物を医薬品として用いる場合の投与方法としては、特に制限されないが、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等が好ましく、中でも、血管内投与がより好ましい。

【0110】

本発明の医薬組成物の用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の医薬組成物の剤形等によって異なり得るが、十分な予防又は治療効果を奏する観点から、その量は多い方が好ましく、一方、副作用を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。通常、成人に投与する場合には、細胞数として、５ｘ１０^２〜１ｘ１０^１２個／回、好ましくは１ｘ１０^４〜１ｘ１０^１１個／回、より好ましくは１ｘ１０^５〜１ｘ１０^１０個／回である。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。また、通常、成人に投与する場合には、体重当たりの細胞数として、１ｘ１０〜５ｘ１０^１０個／ｋｇ、好ましくは１ｘ１０^２〜５ｘ１０^９個／ｋｇ、より好ましくは１ｘ１０^３〜５ｘ１０^８個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。

【0111】

本発明は、特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞、又は特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞を含む医薬組成物を用いることを特徴とする、疾患の予防又は治療方法を含む。上記疾患としては、例えば、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、代謝疾患、心血管疾患、骨疾患、胃腸疾患、肺疾患、肝疾患、腎疾患等が挙げられる。これらのうち、本発明の予防又は治療方法は、癌、前癌性症状、炎症性疾患、免疫疾患、神経変性疾患、骨疾患、肺疾患、肝疾患に対して好適に用いられる。具体的には、軟骨分解、関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、痛風、乾癬、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、膵炎、アレルギー、線維症、自己免疫性肝炎、Ｃ型肝炎、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、セリアック病、非特異性大腸炎、アレルギー性結膜炎、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎アレルギー性鼻炎、珪肺、慢性閉塞性肺疾患、慢性肉芽腫性炎症、嚢胞性線維症、糸球体腎炎、脈管炎、皮膚炎、強直性脊椎炎、肺線維症、食道癌、胃食道逆流症、胃癌、十二指腸癌、小腸癌、虫垂癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌に対して好適に用いられる。特に、上皮若しくは内皮のバリア機能の低下に起因する疾患（癌、前癌性症状等）、又はＩＬ−１が関与する疾患（炎症性疾患、免疫疾患等）に対してより好適に用いられる。

【実施例】

【0112】

次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0113】

＜特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の調製＞
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地（以下、単に「推奨培地」ともいう）にて馴化した後、推奨培地又は下記組成の処方培地^＊に交換し、２〜３日おきに継代しながら培養を続けた。

【0114】

処方培地^＊：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬ アスコルビン酸、４ｍｇ／ｍＬ ヒト組換え型アルブミン、１ｍｇ／ｍＬ ウシ胎児フェチュイン、２０．５ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、４．９ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｉｐｉｄｓ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）、ＩＴＳＥ（１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、５．５μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、６．７ｎｇ／ｍＬＳｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、２μｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、２ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、０．０１８μＭ プロゲステロン、１００ｎＭ ハイドロコルチゾン、２５０μＭ ＬｉＣｌ（Ｗｎｔ活性化剤）、１００ｎＭ Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）、１０μＭ Ｐｉｆｉｔｈｒｉｎ−ａ（ｐ５３阻害剤）、５００ｎＭ ＶＯ−ＯＨ Ｐｉｃ（ＰＴＥＮ阻害剤）、１００ｎＭ ＳＢ２０３５８０（ｐ３８阻害剤）を添加して調製した培地

【0115】

＜特定マーカーを高発現する間葉系幹細胞の確認及び解析＞
（ＦＡＣＳ解析）
処方培地中、推奨培地中で培養して得られたそれぞれの間葉系幹細胞（ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）について、ＦＡＣＳにてＥＧＦＲ、ＭＩＣ−ＡＢの発現を解析した。結果を図１に示す。また、細胞の未分化性を確認する目的で、ＦＡＣＳにて細胞表面マーカー（ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、１０５及びＣＤ１６６）の発現を解析した。結果を図２に示す。さらに、処方培地で培養して得られた間葉系幹細胞は、上記特定マーカー以外に、ＣＤ４９ｆ、β２ミクログロブリン、ＨＬＡ−ＡＢＣを発現していることを、ＦＡＣＳ解析により確認した（データは示していない）。

【0116】

図１に示す通り、処方培地で培養して得られた間葉系幹細胞は、ＥＧＦＲ、ＭＩＣ−ＡＢを高発現しており、推奨培地で培養して得られた間葉系幹細胞と比較して、その発現がより増強していることがわかった。また、図２に示す通り、処方培地で培養して得られた間葉系幹細胞は、未分化マーカーであるＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、１０５及びＣＤ１６６の発現は維持されていることが確認できた。さらに、データは示していないが、処方培地で培養して得られた間葉系幹細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ−αで培養して得られた間葉系幹細胞と比較しても、ＥＧＦＲの発現がより増強していることがわかった。

【0117】

（特定マーカー発現間葉系幹細胞の細胞内のｍｉＲＮＡ発現量）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、処方培地に培地交換した。２〜３日おきに継代を行い、培地交換から８日目の細胞を回収した。回収した細胞から上記試験と同様の方法によりｍＲＮＡを調製し、ｍｉＲＮＡアレイ（ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ ａｒｒａｙ；ＭＩＨＳ−１０５Ｚ及びＭＩＨＳ−１１７Ｚ（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ及びＦｉｂｒｏｓｉｓ、ＱＩＡＧＥＮ社製）により、細胞中のｍｉＲＮＡ発現を解析した。対照としては、推奨培地で継続して培養して得られた細胞を用いた。結果の解析は、処方培地で培養して得られた特定マーカー発現間葉系幹細胞における各種ｍｉＲＮＡ発現量を推奨培地で培養して得られた対照細胞におけるそれぞれのｍｉＲＮＡ発現量で除した値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ値）により行った。同様の実験を２回行った。

【0118】

合計で約１５０種のｍｉＲＮＡについて解析した結果、処方培地で培養した特定マーカー発現間葉系幹細胞は、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐを発現していた。また、処方培地で培養した特定マーカー発現間葉系幹細胞において、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣと比較して発現が特に増加する傾向にあるｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−５ｐが挙げられ、発現が特に低下する傾向にあるｍｉＲＮＡとして、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、 ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐが挙げられた。

【0119】

（特定マーカー発現間葉系幹細胞の培養上清へのサイトカイン分泌）
（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、処方培地に交換した。培地交換から８日間培養後に播種し直し、翌日０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＡＭ／Ｆ１２に交換し、２日後（４８時間後）、培養上清を回収した。回収した培養上清中のＤｅｃｏｒｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＭＭＰ１量をＥＬＩＳＡにて測定した。対照としては、推奨培地で継続して培養して得られた細胞の培養上清を用いた。結果を図３示す。

【0120】

図３に示す通り、処方培地で培養した特定マーカー発現間葉系幹細胞（実施例）の培養上清中には、Ｄｅｃｏｒｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＭＭＰ１が含まれており、推奨培地で培養した対照のＵＣ−ＭＳＣ（比較例）の培養上清と比較して、Ｄｅｃｏｒｉｎの含有量が多く、逆にＯｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ及びＭＭＰ１の含有量は少なかった。

【0121】

（酸化ストレス耐性の誘導）
（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社；ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社；及びＵｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＡＴＣＣ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、各社推奨培地にて馴化後、各社推奨培地又は処方培地に培地交換した（０．３〜１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行った細胞に対してＲｏｔｅｎｏｎｅを各濃度で処理した（０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ）。４８時間後にＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３５８で染色し、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓで核数を計測した。結果を図４に示す。

【0122】

図４に示す通り、ＵＣ−ＭＳＣはＲｏｔｅｎｏｎｅ処理濃度依存的に障害を受けて細胞数が減少するが、処方培地で培養することにより得られる特定マーカー発現間葉系幹細胞（実施例）は、Ｒｏｔｅｎｏｎｅ処理による障害に対する耐性ができ酸化ストレスを受けにくい状態となり、細胞数の減少が抑えられる可能性が示唆された。

【0123】

（培養上清のバリア機能亢進作用）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。それぞれの培地に変えてから８日間培養後に、培地を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、２ｍｌ／ｗｅｌｌに交換した。１日後に培養上清（Ｓｕｐ−１）を回収し、新しい培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ注ぎ、培養を継続した。さらに２４時間後に再び培養上清（Ｓｕｐ−２）を回収した。

【0124】

ヒト結腸癌由来細胞株Ｃａｃｏ−２を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で継代培養し、継代数３回目の細胞を本実験に用いた。Ｃａｃｏ−２を、トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ ＃３４６０）に５ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、翌日、細胞がトランスウェルに付着していることを確認し、培地を除去した。上記臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清（Ｓｕｐ−１）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０倍希釈したものをトランスウェルに添加した。翌日、培地を除去し、上記臍帯由来間葉系幹細胞の培養上清（Ｓｕｐ−２）を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で４倍希釈したものを添加した。さらに、ＩＬ−１βを１．５ｎｇ／ｍｌとなるよう添加し、さらに２０時間培養した後、ＴＥＲ（経上皮電気抵抗値）を測定した。同じ条件で培養したＣａｃｏ−２の細胞数（吸光度）を細胞増殖アッセイキット（ＷＳＴ−８、＃３４３−０７６２３、同仁化社）により測定し、得られたＴＥＲを細胞数で除した値をＴＥＲ値（ＴＥＲ Ｖａｌｕｅ）として図５に示した。

【0125】

図５に示すように、ＩＬ−１β処理によりＣａｃｏ−２細胞の細胞間バリア強度（ＴＥＲ値）の低下が起こる。それに対して、処方培地で培養して得られた特定マーカー高発現間葉系幹細胞の培養上清（実施例）を添加すると、推奨培地で培養した間葉系幹細胞（比較例）の培養上清を添加した場合と比較して、ＴＥＲ値がより回復した。この結果から、特定マーカー発現間葉系幹細胞の培養上清は、優れたバリア機能亢進効果を示すことがわかった。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、癌、前癌性症状等に対して有効である。

【0126】

（抗炎症効果）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。それぞれの培地に変えてから８日間培養後の細胞を以下の試験に用いた。

【0127】

染色試薬Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭの０．５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液を１０％ＦＣＳ ＤＭＥＭにて１，０００倍希釈したものを準備した。マウスマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ含有培地を添加し５％ＣＯ_２、３７℃にて３時間の前培養を行ったのち、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで４８ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。

【0128】

翌日、上記推奨培地又は処方培地で８日間培養したＵＣ−ＭＳＣを、５ｘ１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように添加し、ＵＣ−ＭＳＣとＲａｗ２６４．７との共培養を開始した。共培養開始から４時間後にＬＰＳを１００ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。１７−１８時間後、培養上清を回収した。培養上清中のＩＬ−６量をＥＬＩＳＡ（ｍＩＬ−６ＥＬＩＳＡ，Ｒ＆Ｄ Ｄｕｏｓｅｔ ＤＹ４０６−０５）により測定した。なお、培養上清回収後、予めＲａｗ２６４．７に取り込ませたＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭの蛍光値を測定し、割り戻すことでＩＬ−６量の細胞数補正を行った。結果を図６に示す。

【0129】

図６に示すように、ＵＣ−ＭＳＣとの共培養により、マクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７が産生する炎症性サイトカインであるＩＬ−６産生が抑制された。また、その抑制効果は、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣ（比較例）よりも、特定マーカー高発現ＵＣ−ＭＳＣ（実施例）の方が有意に高かった。したがって、本発明の間葉系幹細胞は、各種炎症性疾患に対して有効である。

【0130】

（骨分化能について）
臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ；Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｃｏｒｄ ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ（ＨＭＳＣ−ＷＪ）、ＦＣ−００２０、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地にて馴化後、ＬｉｆｅＬｉｎｅ社推奨培地又は処方培地に交換した（１Ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ；６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）。２〜３日おきに継代を行い、継代数８の細胞を準備した。継代数８の両ＭＳＣを各２枚のＣｅｌｌ ＢＩＮＤ Ｔ−７５ ｆｌａｓｋに７０００ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、両ＭＳＣ１枚は翌日に処方培地へ交換し、残り１枚は推奨培地のまま９０−１００％コンフルエントに達するまで培養を継続した。継代数９にて再度継代し、Ｔ−７５ ｆｌａｓｋ４枚ずつとなるようにまき直し、群分け後８日（継代数１０）の細胞を下記の分化試験に供した。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、骨細胞分化用培地（ヒト間葉系幹細胞用 骨細胞分化用培地：ＯｓｔｅｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３））を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （ｃｅｌｌｂｉｎｄ， ３３３７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。骨分化のための培養では、分化培養用播種から４８時間後に培地交換を行い、以後、２８日まで３−４日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、無水エタノールを添加し３０分間室温で置くことで細胞の固定を行った。無水エタノールを吸引し、クリーンベンチ内で約３０分間静置、乾燥させた。２％アリザリンレッド溶液を添加し、１５分間室温で静置した後、ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、乾燥させた。染色写真は顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）を用いて撮影した。 アリザリンレッド染色の結果を図７に示す。

【0131】

図７に示す通り、処方培地で培養して得られた特定マーカー発現間葉系幹細胞（実施例）は、推奨培地で培養した場合（比較例）と比較して、骨への分化能が高いことがわかった。

【0132】

（脂肪分化能について）
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は骨分化実験の際と同様の方法により行った。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地｛ヒト間葉系幹細胞用 脂肪細胞分化用培地：ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＬ−００５０） ｏｒ ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ ， ＬＬ−００５９）を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （ｃｅｌｌｂｉｎｄ， ３３３７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）、に播種した。脂肪分化のための培養では、分化培養用播種から４８時間後に培地交換を行い、以後、２８日まで３−４日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、４％ （ｖ／ｖ） パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で培地を少し残すようにしながら２回洗浄した。４％ （ｖ／ｖ） パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を再度添加し、２０分間室温で静置した。その後、培地を少し残すようにしながら、ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、１００％イソプロパノールで１回洗浄した。ＤＷ（蒸留水）で６０％に希釈したオイルレッドＯ染色原液を添加し、３０分間３７℃で静置後、完全に吸引した。その後６０％イソプロパノールを添加し、１０秒ほど待ち、ＤＷ（蒸留水）を加えた。ＤＷ（蒸留水）で２回洗浄後、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７０）で写真撮影した。なお、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−１のＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＢＭ （１００ｍｌ）を１５ｍｌと８５ｍｌに分け、１５ｍｌにはＤｉｆＦａｃｔｏｒ １ （１ｍｌ）を加えてＡＤ−ＭＳＣ用の分化開始培地とし、８５ｍｌにはＤｉｆＦａｃｔｏｒ ２ （５ｍｌ）を加えてＡＤ−ＭＳＣ用の分化維持培地とした。また、ＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＤｆＫｔ−２のＡｄｉｐｏＬｉｆｅ ＢＭ （１００ｍｌ） にＤｉｆＦａｃｔｏｒ ３ （１０ｍｌ）を加えてＵＣ−ＭＳＣ用の分化培地とした。 オイルレッドＯ染色の結果を図８に示す。

【0133】

図８に示す通り、処方培地で培養したＵＣ−ＭＳＣ（実施例）は、推奨培地で培養したＵＣ−ＭＳＣ（比較例）と比較して、脂肪細胞への分化能が高いことがわかった。一方、ＡＤ−ＭＳＣでは、推奨培地で培養したＡＤ−ＭＳＣの方が脂肪細胞への分化能がやや高いことがわかった。

【0134】

（軟骨分化能について）
分化実験に供する間葉系幹細胞の調製は骨分化実験の際と同様の方法により行った。
群分け後８日目に、各群ごとに細胞を回収し、クラボウ分化プロトコール推奨細胞密度にて、分化培地（ヒト間葉系幹細胞用 軟骨細胞分化用培地：ＣｈｏｎｄｒｏＬｉｆｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｌｉｆｅｌｉｎｅ， ＬＭ−００２３））を用いて、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３５２７， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。軟骨分化のための培養では、マイクロマス法で播種を行った。具体的には、回収した細胞を各維持培地で１．６ ｘ １０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに濃縮し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ （３５２６， Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５ｕｌずつ４ｄｒｏｐｓ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間３７℃， ５％ＣＯ２で静置した後、５００ｕｌ／ｗｅｌｌで軟骨分化培地を添加した。その後、２１日まで３日ごとに培地交換を行った。染色方法としては、播種後２１日目以降に、染色するｗｅｌｌをＰＢＳで１回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリン液を添加し、３０分間室温で置くことで細胞の固定を行った。その後、ＤＷ（蒸留水）で１回洗浄し、３％酢酸を添加し、１分間静置した。アルシアンブルー染色液を添加後２０分間室温で静置した後、染色液を吸引し、３％酢酸を添加して３分間待った。最後にＤＷ（蒸留水）で２回洗浄し、デジタルカメラで撮影した。

【0135】

上記試験の結果、処方培地で培養した細胞（実施例）と、推奨培地で培養した細胞（比較例）の、軟骨への分化能の差異は明確ではなかったものの、処方培地で培養した場合には、細胞が小さな塊を作ったのに対して、推奨培地で培養した場合には扁平なままプレートに張り付いている細胞が多かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】