特許 6957039 融合タンパク質、構造体、捕集剤、捕集する方法、ＤＮＡ、及びベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6957039

(24)【登録日】2021年10月8日

(45)【発行日】2021年11月2日

(54)【発明の名称】融合タンパク質、構造体、捕集剤、捕集する方法、ＤＮＡ、及びベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20211021BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20211021BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20211021BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20211021BHJP

   C07K 17/06 20060101ALI20211021BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20211021BHJP

   B01J 20/24 20060101ALI20211021BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20211021BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20211021BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20211021BHJP

   C07K 14/46 20060101ALN20211021BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N15/63 Z

   C07K1/22

   C07K19/00

   C07K17/06

   C12N9/00 101

   B01J20/24 C

   !C12N15/31

   !C12N15/12

   !C07K14/195

   !C07K14/46

【請求項の数】10

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2018-538438(P2018-538438)

(86)(22)【出願日】2017年9月6日

(86)【国際出願番号】JP2017032092

(87)【国際公開番号】WO2018047856

(87)【国際公開日】20180315

【審査請求日】2020年8月26日

(31)【優先権主張番号】特願2016-174087(P2016-174087)

(32)【優先日】2016年9月6日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】川上 了史

(72)【発明者】

【氏名】宮本 憲二

(72)【発明者】

【氏名】近藤 宏紀

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０１９７２５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１１／１６２４９２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１３２３６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０３７３１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５０４４０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PROTEINS，2008年12月23日，Vol.75，p.296-307

【文献】 PNAS，2012年10月23日，Vol.109, No.43，p.17388-17393

【文献】 生体触媒化学シンポジウム講演要旨集，2016年12月21日，Vol.18th，p.11, OP-05

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ０７Ｋ １／２２

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ０７Ｋ １７／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ホモ５量体を形成可能なタンパク質又はホモ６量体を形成可能なタンパク質と、逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質とを有する、融合タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の融合タンパク質の分子同士が互いに結合して形成された構造体。

【請求項3】

請求項２に記載の構造体に対して親和性を有する対象物質の捕集剤であって、
前記構造体を含有する捕集剤。

【請求項4】

前記対象物質は金属又はタンパク質である、請求項３に記載の捕集剤。

【請求項5】

前記対象物質は酵素である、請求項３に記載の捕集剤。

【請求項6】

請求項２に記載の構造体に対して親和性を有する物質を捕集する方法であって、
前記構造体を対象物質に接触させる工程を有する方法。

【請求項7】

前記対象物質は金属又はタンパク質である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記対象物質は酵素である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項10】

請求項９に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、融合タンパク質、構造体、捕集剤、捕集する方法、ＤＮＡ、及びベクターに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、巨大なタンパク質を設計・構築されており、このような巨大なタンパク質を産業的に利用することが期待されている。

【0003】

例えば、特許文献１には、３量体を形成するタンパク質と２量体を形成するタンパク質との融合タンパク質により、かご型（ケージ型）の巨大な融合タンパク質の構造体を作製できることが記載されている。該文献には、このようなかご型の構造体のような空洞のある構造体は、薬物や遺伝子の送達に利用できることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第６７５６０３９号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１のように、３量体と２量体とからタンパク質の構造体を作製した場合、幾何学的に異なる構造の構造体が必ず製造されるため、所望の構造を有する構造体のみを得ることができなかった。そのため、製造される構造体のバリエーションを減少させた、構造の均一性の高い構造体を作製することが求められていた。

【0006】

また、２種類の多量体、例えば、５量体と６量体とからフラーレン様の球状の構造体を設計しようとした場合、５量体同士の結合と６量体同士の結合様式が異なるため、２種類の異なる結合様式を組み込んだ設計を実現するのは困難である。このように、実際に所望の構造体を設計して作製することは容易ではないため、より簡便に所望の構造体を作製できることが必要である。

【0007】

本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、構造の均一性の高いタンパク質の構造体の作製を簡便に行うことができる融合タンパク質、及びこのような融合タンパク質により形成された構造体を提供すること目的とする。また、本発明は、該構造体を用いた捕集剤、捕集する方法、ＤＮＡ、及びベクターを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ホモ５量体質又はホモ６量体を形成可能なタンパク質と逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質とを融合させることで、構造の均一性の高いタンパク質の構造体の作製を簡便に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

【0009】

（１） ホモ５量体を形成可能なタンパク質又はホモ６量体を形成可能なタンパク質と、逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質とを有する、融合タンパク質。

【0010】

（２） （１）に記載の融合タンパク質の分子同士が互いに結合して形成された構造体。

【0011】

（３） （２）に記載の構造体に対して親和性を有する対象物質の捕集剤であって、
前記構造体を含有する捕集剤。

【0012】

（４） 前記対象物質は金属又はタンパク質である、（３）に記載の捕集剤。

【0013】

（５） 前記対象物質は酵素である、（３）に記載の捕集剤。

【0014】

（６） （２）に記載の構造体に対して親和性を有する物質を捕集する方法であって、
前記構造体を対象物質に接触させる工程を有する方法。

【0015】

（７） 前記対象物質は金属又はタンパク質である、（６）に記載の方法。

【0016】

（８） 前記対象物質は酵素である、（６）に記載の方法。

【0017】

（９） （１）に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。

【0018】

（１０） （９）に記載のＤＮＡが組み込まれたベクター。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、構造の均一性の高いタンパク質の構造体の作製を簡便に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ホモ５量体モノマー１１と逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２とから形成される、本発明の融合タンパク質の一実施形態の模式図である。

【図2】ホモ５量体モノマー１１と逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２とから構造体が形成される流れを示す図である。

【図3】図２の（ｃ）のフラーレン構造について、サッカーボールに見立てて説明している図である。

【図4】（Ａ）ホモ５量体モノマー１１と逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２とからフラーレン構造が形成される流れを示す図である。（Ｂ）ホモ６量体モノマー１６と逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２とからグラフェン構造が形成される流れを示す図である。

【図5】実施例に係る融合タンパク質（ホモ５量体モノマーと逆平行型コイルドコイル構造モノマーとを含む融合タンパク質）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図6】実施例に係る融合タンパク質（ホモ５量体モノマーと逆平行型コイルドコイル構造モノマーとを含む融合タンパク質）同士が結合することにより形成された、フラーレン構造を有する構造体のタンパク質についてのＢｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図7】実施例に係る構造体（フラーレン構造を有する構造体）のタンパク質についての３０℃〜９０℃で熱処理した後のタンパク質の残存率を示すグラフを示す図である。

【図8】実施例に係る構造体（フラーレン構造を有する構造体）のタンパク質についての動的光散乱法（ＤＬＳ）による測定結果を示すグラフである。

【図9】実施例に係る構造体（フラーレン構造を有する構造体）により作製した担体が、Ｎｉ^２＋イオンに結合することを示す、吸光度のグラフである。

【図10】実施例に係る構造体（フラーレン構造を有する構造体）により作製した担体に対して、Ｎｉ^２＋イオンに繰り返し結合させることでＮｉ^２＋イオンを濃縮できることを示す、吸光度のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。

【0022】

＜融合タンパク質＞
本発明の融合タンパク質は、ホモ５量体を形成可能なタンパク質又はホモ６量体を形成可能なタンパク質と、逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質とを有する。

【0023】

本明細書において、ホモ５量体を形成可能なタンパク質又はホモ６量体を形成可能なタンパク質は、相互作用によりホモ５量体又はホモ６量体を構成するサブユニット（モノマー）である。逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質とは、逆平行型コイルドコイル構造を構成する２量体のサブユニット（モノマー）である。以下、本明細書において、ホモ５量体を形成可能なタンパク質、ホモ６量体を形成可能なタンパク質、逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なタンパク質を、それぞれ「ホモ５量体モノマー」、「ホモ６量体モノマー」、「逆平行型コイルドコイル構造モノマー」と略称する場合がある。

【0024】

以下、本発明の融合タンパク質の一例、及び本発明の融合タンパク質により形成された構造体について模式図を用いて、説明する。

【0025】

図１は、本発明の融合タンパク質の模式図の一例である。図１に示す実施形態における融合タンパク質は、ホモ５量体モノマー１１と逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２と、リンカー１３とを有する。

【0026】

図１における融合タンパク質により構造体が形成される流れを図２に示す。図２の（ａ）に示すように、ホモ５量体モノマー１１が相互作用により５量体を形成して、図２の（ａ）に示すように中心の５量体の部分が五角形の構造（１４）となる。このように、図２（ａ）における逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２が２量体を形成することで、図２の（ｂ）で示すように逆平行型コイルドコイル構造モノマー１２を手として結合し、五角形の構造同士の間に６角形の空洞（１５）が形成され、最終的に図２の（ｃ）で示すように、フラーレン構造を形成することができる。逆平行型コイルドコイル構造でなく、平行型コイルドコイル構造を用いると、このような構造を形成することができない。同様の原理により、ホモ５量体モノマーの代わりにホモ６量体モノマーを用いた場合、グラフェン構造を作製することができる。本発明の融合タンパク質は、これによって５量体又は６量体の種類によらず、同様の原理により構造体を設計できるので、構造体の作製が簡便にできる。

【0027】

図４の（Ａ）に、ホモ５量体モノマーと逆平行型コイルドコイル構造モノマーとからフラーレン構造が形成される流れを示し、図４の（Ｂ）にホモ６量体モノマーと逆平行型コイルドコイル構造モノマーとからグラフェン構造が形成される流れを示す。図４の（Ａ）、（Ｂ）において、（ａ）は、ホモ５量体モノマー１１が相互作用により５量体を形成したもの又はホモ６量体モノマー１６が相互作用により６量体を形成したものである。図４の（Ａ）、（Ｂ）における（ｂ）は、（ａ）の模式図をより具体的なイメージとしたものである。また、図４の（Ａ）、（Ｂ）において、（ｃ）は、各融合タンパク質が結合することにより得られる構造体の模式図を示す。図４の（Ａ）の（ｃ）は、５量体を用いた場合のフラーレン構造を示し、（ｄ）は一般的なフラーレン構造の立体構造である。図４の（Ｂ）の（ｃ）は、６量体を用いた場合のグラフェン構造を示し、（ｄ）は一般的なグラフェン構造の立体構造である。なお、本明細書において、フラーレン構造、グラフェン構造とは、炭素原子のみにより形成されるフラーレン又はグラフェンと立体的に同じ又は類似の構造を有する構造を指し、フラーレン又はグラフェンそのもの（炭素からなる構造体）とは異なるものである。

【0028】

本発明のホモ５量体モノマーは、ホモ５量体を形成可能なアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されず、目的（例えば、後述する捕集剤として用いた場合における対象物質の親和性等）に応じて適宜設定することができる。具体的には、配列番号１〜４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。または、配列番号１〜４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に代えて、これらのタンパク質をコードするＤＮＡの変異体やホモログがコードするタンパク質を用いてもよい。そのようなタンパク質としては、以下の（１）〜（３）のいずれに記載のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（１）配列番号１〜４２のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（２）配列番号１〜４２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつホモ５量体を形成可能なＤＮＡ
（３）配列番号１〜４２のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつホモ５量体を形成可能なＤＮＡ

【0029】

本発明のホモ５量体モノマーは、捕集剤の用途としても利用を考えた場合、例えば、金属又は核酸の回収に適している点では、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はこのタンパク質をコードするＤＮＡの変異体もしくはホモログがコードするタンパク質が好ましい。

【0030】

本発明のホモ６量体モノマーは、ホモ６量体を形成可能なアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されず、目的（例えば、後述する捕集剤として用いた場合における対象物質の親和性等）に応じて適宜設定することができる。具体的には、配列番号４３〜４８又は配列番号５８〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質等が挙げられる。または、配列番号４３〜４８又は配列番号５８〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に代えて、これらのタンパク質をコードするＤＮＡの変異体やホモログがコードするタンパク質を用いてもよい。そのようなタンパク質としては、以下の（４）〜（６）のいずれに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（４）配列番号４３〜４８又は配列番号５８〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（５）配列番号４３〜４８又は配列番号５８〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、ホモ６量体を形成可能なＤＮＡ
（６）配列番号４３〜４８又は配列番号５８〜７２のいずれかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつホモ６量体を形成可能なＤＮＡ

【0031】

本発明のホモ６量体モノマーとしては、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又は該タンパク質をコードするＤＮＡの変異体もしくはホモログがコードするタンパク質が好適である。

【0032】

本発明のホモ５量体モノマー又はホモ６量体を形成可能なアミノ酸配列は、相互作用するためのアミノ酸配列が含まれており、例えば、ホモ５量体モノマーの場合、配列番号５０と配列番号５１のような配列を組み合わせて有することにより、ホモ５量体を形成する。また、配列番号５０と配列番号５１のアミノ酸配列の組み合わせのほか、配列番号５０と配列番号５１のアミノ酸配列に代えて、これらのアミノ酸をコードするＤＮＡの変異体やホモログがコードするアミノ酸配列を用いてもよい。配列番号５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの変異体やホモログとしては、以下の（７）〜（９）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列が挙げられる。また、配列番号５１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの変異体やホモログとしては、以下の（１０）〜（１２）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列が挙げられる。
（７）配列番号５０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（８）配列番号５０に記載のアミノ酸配列において１、２又は３のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（９）配列番号５０に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
（１０）配列番号５１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（１１）配列番号５１に記載のアミノ酸配列において１又は２のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ
（１２）配列番号５１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ

【0033】

本発明の逆平行型コイルドコイル構造モノマーは、逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されず、従来の公知の逆平行型コイルドコイル構造を有するタンパク質を用いることができ、目的（例えば、後述する捕集剤として用いた場合における対象物質の親和性等）に応じて適宜設定することができる。具体的には、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。または、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に代えて、これらのタンパク質をコードするＤＮＡの変異体やホモログがコードするタンパク質を用いてもよい。そのようなタンパク質としては、以下の（１３）〜（１５）のいずれに記載のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（１３）配列番号４９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するＤＮＡ
（１４）配列番号４９に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なＤＮＡ
（１５）配列番号４９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなり、かつ逆平行型コイルドコイル構造を形成可能なＤＮＡ

【0034】

本発明の逆平行型コイルドコイル構造モノマーとしては、特に限定されないが、ロイシンジッパー構造を有するものが好ましい。より具体的には、６〜８個のアミノ酸残基、好ましくは７個のアミノ酸残基からなり、かつ、配列の真ん中付近に疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン等）を含むユニット配列を２〜９含むものが好ましい。例えば、配列番号４９は、ＭＥＮＫＱＶＥＥ「ＩＬＲＬＥＫＥ」「ＩＥＤＬＱＲＭ」ＫＥＱＱＥ「ＬＳＬＴＥＡＳ」「ＬＱＫＬＱＥＲ」ＲＤＱＥ「ＬＲＲＬＥＥＥ」と示されるように、上記ユニット配列を５つ含む構造を有する。

【0035】

なお、本明細書において、「ホモ５量体を形成可能」、「ホモ６量体を形成可能」、「逆平行型コイルドコイル構造を形成可能」とは、塩基配列がコードするポリペプチドがホモ５量体形成能、ホモ６量体形成能又は逆平行型コイルドコイル構造形成能を有することを意味する。本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中、４０〜７０℃（好ましくは、５０〜６７℃、より好ましくは、６０〜６５℃）で反応を行い、塩濃度１５〜３００ｍＭ（好ましくは、１５〜１５０ｍＭ、より好ましくは１５〜６０ｍＭ、さらに好ましくは、３０〜５０ｍＭ）の洗浄液中で洗浄を行う条件が挙げられる。

【0036】

本発明におけるホモ５量体モノマー、ホモ６量体モノマー、又は逆平行型コイルドコイル構造モノマーのアミノ酸配列をコードするＤＮＡには、かかる配列番号１〜４９のいずれか記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡも含まれる。ここで配列番号１〜４９のいずれかにおいて、「１もしくは複数」とは、通常、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。融合タンパク質のホモ５量体形成能、ホモ６量体形成能又は逆平行型コイルドコイル構造形性能を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。なお、あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することは公知である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。

【0037】

配列番号１〜４９のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡの変異体やホモログには、配列番号１〜４９のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。このようなＤＮＡは、好ましくは、配列番号１〜４９のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有する。アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。

【0038】

本発明の融合タンパク質は、図１に示す実施形態のように、ホモ５量体モノマー又はホモ６量体モノマーと、逆平行型コイルドコイル構造モノマーとの間にリンカーを有してもよく、有さなくてもよい。かかるリンカーより、ホモ５量体により構成される５角形又はホモ６量体により６角形と逆平行型コイルドコイル構造モノマーとの角度を調整し、構造体を形成しやすくすることができる。ここで、上記「角度」とは、図２の（ｃ）を例として説明すると、５量体の中心を通る辺１４２と、逆平行型コイルドコイル構造モノマーに沿った辺１５２とのなす角度「ｒ」に相当する。また、図３に図２の（ｃ）のフラーレン構造を、サッカーボール（真ん中、右側の図）に見立てて説明したものを示す。図３に示すように、フラーレン構造はサッカーボールに見立てて説明できるが、上述のｒは、右側のサッカーボールにおいて（連続する５角形と６角形を一部切り取ったもの）において示されるとおりのものである。このｒは、ホモ５量体モノマーの場合（構造体がフラーレン構造を形成する場合）は、０°超１８０°未満の範囲内（より好ましくは、１３０°以上１６０°以下の範囲内）であることが、構造体を形成しやすくなる点で好ましい。また、図２では、ホモ５量体モノマーの場合について説明したが、ホモ６量体モノマーの場合（構造体がグラフェン構造を形成する場合）は、９０°以上１８０°以下の範囲内（より好ましくは、１８０°）であることが、構造体を形成しやすくなる点で好ましい。角度の調整は、例えば、そのリンカーにより、該リンカーの両末端に付された要素がなす角度をどの程度変更又は調整できるかが既知であるリンカーを用いることで調整できる。例えば、このようなリンカーの数を調整することで、角度を変更することができる。

【0039】

本発明の融合タンパク質において、ホモ５量体モノマー又はホモ６量体モノマーと逆平行型コイルドコイル構造モノマーの位置は、いずれがＮ末端側に位置してもよく、いずれがＣ末端側に位置してもよい。例えば、融合タンパク質中、逆平行型コイルドコイル構造モノマーがＮ末端側に位置し、ホモ５量体モノマー又はホモ６量体モノマーがＣ末端側に位置してもよく、あるいは、ホモ５量体モノマー又はホモ６量体モノマーがＮ末端側に位置し、逆平行型コイルドコイル構造モノマーがＣ末端側に位置してもよい。

【0040】

本発明の融合タンパク質は、本発明における効果を損なわない程度に、必要に応じて、上述したアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有してもよく、有さなくてもよい。例えば、融合タンパク質の精製のために、タグとなるアミノ酸配列を加えてもよい。

【0041】

本発明における「ＤＮＡ」は、センス鎖又はアンチセンス鎖（例えば、プローブとして使用できる）のいずれでもよく、その形状は一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。また、ゲノムＤＮＡであっても、ｃＤＮＡであってもよく、あるいは合成されたＤＮＡであってもよい。

【0042】

本発明のＤＮＡを取得する方法としては、特に限定されないが、ｍＲＮＡから逆転写することでｃＤＮＡを得る方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法）、ゲノムＤＮＡから調整する方法、化学合成により合成する方法、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから単離する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。

【0043】

本発明の融合タンパク質は、公知のキメラタンパクの調製方法によって製造できる。キメラタンパク質の調製は、例えば、前述のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターが導入された形質転換体を使用することで行うことができる。例えば、まず、この形質転換体を適宜の条件で培養し、このＤＮＡがコードするキメラタンパク質を合成させる。そして、合成されたタンパク質を形質転換体又は培養液から回収することにより、キメラタンパク質（本発明の融合タンパク質）を得ることができる。

【0044】

より具体的に説明すると、適当な発現ベクターに上述のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを挿入することにより、作製できる。「適当なベクター」とは、原核生物及び／又は真核生物の各種の宿主内で複製保持又は自己増殖できるものであればよく、使用の目的に応じて適宜選択できるものである。例えば、ＤＮＡを大量に取得したい場合には高コピーベクターを選択でき、ポリペプチド（融合タンパク質）を取得したい場合には発現ベクターを選択できる。その具体例としては、特に限定されず、例えば、特開平１１−２９５９９号公報に記載された公知のベクターが挙げられる。

【0045】

ベクターの導入方法は、ベクターや宿主の種類等に応じて適宜選択できる。その具体例としては、特に限定されないが、例えば、細菌を宿主とした場合、プロトプラスト法、コンピテント法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。

【0046】

発現ベクターを導入する宿主は、発現ベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、特に限定されないが、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、公知の天然細胞もしくは人工的に樹立された細胞（特開平１１−２９５９９号公報参照）、あるいは、ヒト、マウス等の動物が挙げられる。形質転換体の培養は、キメラタンパク質が大量にかつ容易に取得できるように、形質転換体の種類等に応じて、公知の栄養培地から適宜選択し、温度、栄養培地のｐＨ、培養時間等を適宜調整して行うことができる（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）。

【0047】

融合タンパク質の単離方法及び精製方法としては、特に限定されず、溶解度を利用する方法、分子量の差を利用する方法、荷電を利用する方法等の公知の方法（例えば、特開平１１−２９５９９号公報参照）が挙げられる。

【0048】

＜構造体＞
本発明の構造体は、上述の本発明の融合タンパク質の分子同士が互いに結合して形成されたものである。

【0049】

構造体としては、例えば、ホモ５量体モノマーを用いた場合、図２の（ｃ）、図４の（Ａ）の（ｃ）で示すようなフラーレン構造を形成することができる。このフラーレン構造は、本発明の上述の融合タンパク質６０分子により、１つのフラーレン構造を形成することができる。また、ホモ６量体モノマーを用いた場合、図４の（Ｂ）の（ｃ）で示すようなグラフェン構造を形成することができる。グラフェン構造の場合、１つの構造体あたりの本発明の上述の融合タンパク質の分子の数は、特に限定されない。

【0050】

本発明の構造体は、構造体１分子同士を結合させて、大きい構造体としてもよい。構造体同士の結合は、例えば、タンパク質の架橋に用いられる従来の架橋剤（グルタルアルデヒド等）により行うことができる。また、構造体を含む溶液のｐＨを等電点付近（等電点±１．５）に調整することによって構造体同士が集合体を形成し得る。このような集合体は、ｐＨを中性近辺（例えば、ｐＨ７．０±１．０）にすると、構造体に解離する。構造体を含有させる溶液の溶媒としては、タンパク質を変性させるものではない限り任意のものが使用でき、例えば、メタノール、エタノール等が挙げられる。

【0051】

本発明の構造体は、後述の捕集剤として用いるのに適している。

【0052】

＜捕集剤＞
本発明の捕集剤は、上記の本発明の構造体に対して親和性を有する対象物質の捕集剤であって、該構造体を含有するものである。なお、本明細書において、「捕集」とは、結果的に捕集されるものであればどのような作用機序に基づくものであってもよく、例えば、親和性を有するものをフラーレン構造の内部に閉じ込めるようなものであってもよく、あるいは、同じようなサイズの物質同士で相互作用して凝集するようなものであってもよい。

【0053】

本発明の捕集剤は、捕集する対象物質に親和性を有する、適宜構造体を設計してもよい。例えば、金属等の正電荷を帯びている物質を対象物質とする場合、構造体は、正電荷を帯びている物質に親和性を有する性質、つまり、負電荷を有するものにすればよい。上述の本発明のホモ５量体モノマーが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質や、このタンパク質をコードするＤＮＡの変異体やホモログがコードするタンパク質である場合、金属、タンパク質（リゾチーム等の酵素等）又は核酸の捕集に適している。また、本発明の捕集剤は、光学活性な化合物の分離や該化合物の選択的捕集にも適している。

【0054】

本発明の捕集剤は、対象物質を捕集すると、対象物質とともに集合体を形成し得る。集合体は、捕集剤と対象物質との凝集体や、捕集体の空間内部に対象物質が内包された形態であり得る。かかる場合、得られた集合体に、塩（ＮａＣｌ等）等の添加や、ｐＨの調整によって、捕集剤と対象物質とに解離させることができる。したがって、本発明の捕集剤によれば、対象物質を自在に捕集及び放出できる。

【0055】

捕集剤は、種々の目的で使用してよく、例えば、カラムの担体として使用することで、分析又は分取に用いてもよく、また、フィルターとして用いて目的物質の単離（例えば、環境汚染物質の集団から目的の成分のみ単離すること）に用いてもよい。

【0056】

＜捕集する方法＞
本発明の方法は、上記の本発明の構造体に対して親和性を有する物質を捕集する方法であって、該構造体を対象物質に接触させる工程を有する方法である。

【0057】

本発明の方法において、構造体、対象物質は上記の本発明の捕集剤と同様のものを用いることができる。

【0058】

構造体と対象物質との接触させる方法は、構造体の使用方法（カラムの担体としての使用方法、フィルターとしての使用方法等）に応じて適宜設定してよい。

【0059】

＜ＤＮＡ＞
本発明は、上述の本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを包含してもよい。

【0060】

＜ベクター＞
本発明は、上述の本発明のＤＮＡが組み込まれたベクターを含んでもよい。ベクターは、発現ベクターであってもよく、それ以外のベクターであってもよい。

【実施例】

【0061】

＜融合タンパク質の作製−１＞
（フラーレン構造を有する構造体の設計）
フラーレン構造の切頂二十面体は、５角形１２枚と６角形２０枚で構成されるいわゆるサッカーボール型の多面体である。この構造を単一分子で構築するため、切頂二十面体の５角形面にホモ５量体モノマーを配置し、空いている６角形の辺に相当する部分に、２量体ペプチドである逆平行型コイルドコイル構造モノマー（２回対称）を配置する分子設計を行った。逆平行型コイルドコイル構造を形成する２量体とホモ５量体のプロトマーを遺伝子上で融合させれば、大腸菌を用いた発現系のみで切頂二十面体構造が自発的に形成される。ホモ５量体モノマーには、海洋微生物由来のＳＭ／ＬＳＭ−ｌｉｋｅ ＲＮＡ結合タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ＝３ＢＹ７、配列番号１）を、２量体には、ヒト由来のＭｙｏ Ｘの逆平行コイルドコイル領域（ＰＤＢ ＩＤ＝２ＬＷ９、配列番号４９）を用いた。

【0062】

（遺伝子設計）
５量体と２量体の単量体分子を遺伝子上で融合させた人工タンパク質は大腸菌での発現のためにコドンの最適化を行い、その遺伝子配列を設計した（配列番号５２）。このとき、Ｎ末端にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｔａｇを付与することができるｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターに組換えることができるように、Ｎ末端にはＢａｍＨ Ｉ、Ｃ末端にはＨｉｎｄ ＩＩＩの制限酵素認識配列を付与した。なお、配列番号５２を以下に示す。

【0063】

【0064】

（発現用ベクターへの組換え）
上記の遺伝子配列はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄにヒートショック法により形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ培地で培養を行い、プラスミド抽出（ＶＩＯＧＥＮＥ）した。この増幅したプラスミドとｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターをＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限酵素処理した。アガロースゲル電気泳動を行い、目的の挿入配列と切断したｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターをそれぞれゲルから切り取り、精製（ＶＩＯＧＥＮＥ）した。それぞれの配列をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いてＬｉｇａｔｉｏｎを行った。作成したプラスミドは同様に形質転換し、培養、プラスミド抽出した。

【0065】

（リンカーの付加）
五量体を形成する面同士の二面角を調整するために、リンカーの付加を行った。配列は、ＮＮＫ（縮重）コドンを用いたランダム変異導入により取得した。リンカー配列の長さは１〜３のアミノ酸残基となるようにした。

【0066】

（変異導入）
５量体と２量体を繋ぐリンカーを変異ＰＣＲによって挿入した。このとき、プライマーはリンカー領域に縮重コドンが含まれるよう設計し（表１）、上述の発現用ベクターを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は、鋳型プラスミドを除去するため、１０×Ｔ Ｂｕｆｆｅｒ ５．６μＬ、Ｄｐｎ Ｉ １．０μＬ加え、１時間、３７℃でインキュベートした。Ｄｐｎ Ｉ処理を行ったＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動を行い、増幅していることを確認した後、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄにヒートショック法により形質転換した。ＬＢ＋Ａｍｐ寒天培地で１６時間、３７℃で培養して得た全てのコロニーは２ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地で懸濁し、プラスミド抽出した後、発現株であるＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ （ＤＥ３）にヒートショック法により形質転換し、リンカー配列を含む融合タンパク質（以下、「実施例に係る融合タンパク質」と呼称する場合がある。）を有する変異体を得た。なお、リンカー配列はＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（ＲＶＬ）（配列番号５３）であった。以下、本明細書において、かかるリンカー配列を含む融合タンパク質を有する変異体（以下、「ｉｎｓ ＲＶＬ変異体」と呼称する。）について、後述の複合化評価を行った。

【0067】

【表1】

【0068】

（複合化評価）
ｉｎｓ ＲＶＬ変異体について、培養・発現、及び融合タンパク質の精製を行った。まず、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体をＬＢ＋Ａｍｐ寒天培地で１６時間、３７℃で培養し、コロニーを得た。このコロニーを３ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に植菌し、８時間、３７℃で前培養を行った。前培養を行った液体培地２ｍＬを２００ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に移し、２時間、３７℃で本培養を行った後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるよう加え、Ｏ／Ｎ発現誘導を行った。

【0069】

発現誘導後の培養液を、遠心分離（１００００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）して菌体を回収し、−３０℃で一時保存した。培養液１００ｍＬ分に相当する菌体に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）を１０ ｍＬ加え、超音波破砕（Ｏｕｔｐｕｔ３，Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ ３０，２０ｍｉｎ）した。破砕後上清を遠心分離（１００００×ｇ， １０ ｍｉｎ， ４℃）して上清を回収した。この上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に流し、発現した融合タンパク質を結合させた後、２０ ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）で１０ ＣＶ以上洗浄した。その後、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を３ｍＬ加え、１時間インキュベートした後、溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出画分に予定していた融合タンパク質由来のアミノ酸配列（配列番号５４）に相当する分子量（１７．８ｋＤａ）のバンドを確認した（図５）。なお、図５中、「ＦＴ」が、精製前の菌体の抽出液のレーンであり、Ｗａｓｈが、精製過程で洗浄した画分のレーンであり、Ｅｌｕｔｉｏｎが、精製後の溶出した融合タンパク質のレーンである。精製したタンパク質は限外濾過を行い、タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮を行った後、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ったところ、予定していた融合タンパク質により形成されたフラーレン構造の分子量（約１０００ｋＤａ）のほぼ単一なバンドを確認できた（図６）。図６の左側のレーンがマーカーであり、右側のレーンがタンパク質複合体のレーンである。この結果より、融合タンパク質によりフラーレン構造を有する構造体（以下、「実施例に係る構造体」と呼称する場合がある。）が作製できたことがわかった。

【0070】

＜複合体の熱安定性の試験＞
タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮を行ったｉｎｓ ＲＶＬ変異体における実施例に係る構造体の熱安定性を検討するため、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃で１時間インキュベートした後、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行った。その結果を図７に示す。図７に示すように、６０℃〜８０℃では約１０００ｋＤａのバンド強度は変化しておらず、フラーレン構造を有する実施例に係る構造体が高い熱安定性を有することがわかった。

【0071】

＜粒子サイズ測定＞
フラーレン構造を有する実施例に係る構造体の粒子サイズの測定を行う前に、まず、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体を精製後、塩等の小分子化合物を除去するためＭＷＣＯ ３５００の透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４℃で透析を行った。外液は、タンパク質溶液量に対して１００倍量の２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８）を用いて、２時間おきに２回交換し、２回目の交換後はＯ／Ｎインキュベートした。

【0072】

透析したｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質を、タンパク質濃度が０．１０ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって粒子サイズを測定し、キュムラント法解析を行った。その結果を、図８に示す。図８に示すとおり、Ｚ平均粒子径が１１．７５ｎｍ（半径、直径は２３．４ｎｍ）、分子量が１０７０ｋＤａであったことが示され、予定どおりの６０量体を形成していることがさらに確認された。

【0073】

＜フラーレン構造の切頂二十面体の拡大＞
上記ｉｎｓ ＲＶＬ変異体における実施例に係る構造体において、切頂二十面体の径を拡張するため、該構造体を形成する実施例に係る融合タンパク質のリンカー配列は変化させずに、２量体のＮ末端がαへリックスであることを利用して、これを伸長させた。挿入する配列はＰＤＢｓｕｍにより、２量体のＮ末端を内部配列に含み、かつその領域が結晶構造解析によってαへリックスであることが既知のタンパク質を選別し、その結果、２量体のＮ末端４残基と共通した内部配列をもつｃｏｒｔｅｘｉｌｌｉｎ Ｉ／ＧＣＮ４ハイブリッドペプチド（ＰＤＢ ＩＤ＝１Ｐ９Ｉ）を用いた。また、末端のαへリックスが伸びる向きをｉｎｓ ＲＶＬ変異体と揃えるため、αへリックスが３．６残基／１ターンであることから、ハイブリッドペプチドのうち、７残基（配列番号５５）の挿入を行った。

【0074】

ｉｎｓ ＲＶＬ変異体に形質転換された上記融合タンパク質において、リンカーと２量体の間に、アミノ酸７残基分（配列番号５５）をコードする塩基配列を変異ＰＣＲによって挿入した。鋳型のプラスミドをｉｎｓ ＲＶＬ変異体に形質添加された発現ベクターとして７残基挿入を行った。ＰＣＲ産物についてＤｐｎ Ｉ処理を行い、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅していることを確認した後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄに対してヒートショック法により形質転換した。ＬＢ＋Ａｍｐ寒天培地で１６時間、３７℃で培養して得たコロニーを２ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に植菌し、１６時間、３７℃で培養してプラスミド抽出して、サンガーシーケンシングを行い、配列を確認した後、発現株であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ （ＤＥ３）にヒートショック法により形質転換した。以下、得られた変異体を、「ｉｎｓ ＬＬＡＳＬＥＡＲＶＬ変異体」と呼称する。

【0075】

ｉｎｓ ＬＬＡＳＬＥＡＲＶＬ変異体を、上述のｉｎｓ ＲＶＬ変異体と同様の方法で培養・発現、及びタンパク質の精製を行った。精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出画分に融合タンパク質由来のアミノ酸配列に相当する分子量（１８．５ｋＤａ）の単一のバンドを確認できた。精製したタンパク質について限外濾過を行い、タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮を行った後、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ったところ、ｉｎｓ ＬＬＡＳＬＥＡＲＶＬ変異体においては、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体よりも高分子側に挿入したアミノ酸の数に相当する超分子の分子量増加が観察された。この結果から、リンカーの長さを調整することで、フラーレン構造の粒径等を調整できることがわかった。

【0076】

＜金属結合能の試験＞
報告されたタンパク質の結晶構造を元に、ｐｙｍｏｌを用いた表面電荷の観察により、５量体タンパク質の五角形平面部分の両面が負に帯電していることから、上記のフラーレン構造を有する構造体の電荷も負に帯電していることが推測された。そこで、金属イオン等の陽イオンに結合できるかを確認した。

【0077】

（二価の金属イオンとの結合試験）
上述した透析したｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質を、タンパク質濃度が１０ ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した後、二価の陽イオンであるＭｎＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２を１００ ｍＭの濃度で１ ｍＬ調整した溶液に加えたところ、全てにおいて凝集を確認した。この結果より、このフラーレン構造を有する実施例に係る構造体のタンパク質は、金属結合能を有することが示された。

【0078】

（Ｎｉ２＋イオンとの結合量測定）
切頂二十面体１分子にＮｉ^２＋イオンが結合する量を調べるため、タンパク質濃度が０．７０ ｍｇ／ｍＬの透析したｉｎｓ ＲＶＬ変異体由来の実施例に係る構造体のタンパク質溶液１ｍＬに、７ｍＭ ＮｉＣｌ_２を１μＬ（切頂二十面体１分子に対してＮｉ^２＋イオン１０分子）ずつ加え、凝集量の指標として赤外分光光度計でベースラインの上昇を測定した。その結果、ＮｉＣｌ_２を６μＬ加えたとき、ベースラインの上昇が収束したことから、切頂二十面体１分子に対してＮｉ^２＋イオンが６０分子結合することが示唆された。このｉｎｓ ＲＶＬ変異体とＮｉＣｌ_２の混合液に７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１μＬずつ加えたところ、凝集が再可溶化し、ベースラインが低下した。

【0079】

＜金属結合担体としての利用法検討＞
ｉｎｓ ＲＶＬ変異体における融合タンパク質は、金属イオンと結合することで凝集し、ＥＤＴＡにより金属イオンがキレートされることで再可溶化することから、水中の金属イオンを除去する担体としての利用応用法を検討した。また、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体の精製スケールの拡大を行った。また、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体における実施例に係る構造体が再利用できるよう、金属イオンと結合させて凝集させる際にグルタルアルデヒドによって架橋を行い、ＥＤＴＡにより金属イオンを除去しても再可溶化しない担体の作製を行った。

【0080】

（タンパク質の大量精製）
まず、目的のタンパク質（実施例に係る構造体のタンパク質）を大量に精製するため、培養液１Ｌ分に相当する菌体に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を４０ｍＬ加え、超音波破砕（Ｏｕｔｐｕｔ ３， Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ ３０，３０ｍｉｎ）した。破砕後上清を遠心分離（１００００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）して上清を回収した。この上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）に流速１．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、発現したタンパク質を結合させた後、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で１０ＣＶ以上洗浄した。その後、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を５ＣＶ流し、溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出画分に同様のバンドを確認した。さらに、タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮を行った後、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ったところ、同様のバンドを確認した。

【0081】

（金属結合担体の作製）
タンパク質濃度が０．４０ｍｇ／ｍＬの精製したｉｎｓ ＲＶＬ変異体における実施例に係る構造体のタンパク質溶液４０ｍＬに、１Ｍ ＮｉＣｌ２を５ｍＬと２５％グルタルアルデヒドを５ｍＬ（２．５％ ｆｉｎａｌ）加えて転倒混和することで担体を作製した。その後、遠心分離（１００００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）して担体を回収した。担体はＮｉ^２＋イオンを除去するため、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を２０ｍＬ加え、遠心分離（１００００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）して上清を除去した。その後、ＥＤＴＡを除去するため、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を２０ｍＬ加え、遠心分離（１００００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）して上清を除去した。洗浄した担体は４℃で保存した。

【0082】

（担体の金属結合量測定）
作製・洗浄した担体は６０℃のインキュベーターで乾燥させた後、１０ｍＭ ＮｉＣｌ_２を１ｍＬ加えて混和した。担体と結合していないＮｉ^２＋イオンを除去するため、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を除去した。この上清を紫外−可視分光光度計でＮｉ^２＋イオンの最大吸収波長における吸光度（図９における［２］）を測定したところ、担体を含まないコントロールの１０ｍＭ ＮｉＣｌ_２の吸光度（図９における［１］）比較して３０％以上の減少が見られた。また、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を１ｍＬ加え、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を除去することで洗浄を行った。その後、担体に結合した金属イオンを回収するため、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１ｍＬ加え混和した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を回収した。この上清をＮｉ^２＋イオンの最大吸収波長における吸光度を測定したところ、担体とＮｉ^２＋イオンとの結合によって減少した吸光度に対応する吸収（図９における［３］）が見られた。

【0083】

（担体の金属濃縮）
作製・洗浄した担体は６０℃のインキュベーターで乾燥させた後、１ｍＭ ＮｉＣｌ_２を１ｍＬ加えて混和した。担体と結合していないＮｉ^２＋イオンを除去するため、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を除去した。この担体に再度ＮｉＣｌ_２を加えて上清を除去し、洗浄するという作業を計３サイクル行った。洗浄は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を１ｍＬ加え、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を除去することにより行った。上記作業を３サイクル行った後、担体に結合した金属イオンを回収するため、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１ｍＬ加え混和した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４ｍｉｎ，４℃）して上清を回収した。この上清を赤外分光光度計でＮｉ^２＋イオンの最大吸収波長における吸光度を測定した。その結果を図１０に示す。図１０中、［１］は上記のサイクルを３回行ったときのＥＤＴＡ処理後の上清の吸光度を、［２］は担体を添加していない１ｍＭ ＮｉＣｌ_２（コントロール）の吸光度をそれぞれ示す。この結果から、１ｍＭ ＮｉＣｌ_２と比較して約２．５倍に濃縮されたことが確認された。

【0084】

＜酵素結合能の試験＞
上記＜金属結合担体としての利用法検討＞に示されるとおり、上記のフラーレン構造を有する構造体は、陽イオンである金属イオンに結合できたことから、負に帯電していることが確認された。そこで、金属イオン同様に正に荷電している酵素に結合できるかを確認した。酵素としては、リゾチームを用いた。

【0085】

（リゾチームとの結合試験）
上述の透析したｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質を０．０５ｍｇ／ｍＬ以上用いて、該タンパク質１分子あたり、リゾチーム４分子以上となる割合でリゾチームを添加した。リゾチームを添加後、タンパク質の凝集を確認した。この結果より、フラーレン構造を有する構造体の上記タンパク質は、リゾチーム結合能を有することが示された。特に、上記タンパク質１分子あたり、リゾチーム６〜８分子となる割合でリゾチームを添加すると、平均径が１５０ｎｍ程度の均質性の高い凝集体が形成される傾向にあった。なお、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質の平均径は約２２ｎｍだった。

【0086】

また、リゾチームを添加後に得られた凝集体に１００ｍＭのＮａＣｌを添加すると、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質とリゾチームとに解離した。したがって、ｉｎｓ ＲＶＬ変異体のタンパク質とリゾチームとの結合は制御でき、リゾチームを自在に捕集及び放出できることがわかった。

【0087】

＜融合タンパク質の作製−２＞
（グラフェン構造を有する構造体の設計）
フラーレンとともに炭素材料としてよく知られるグラフェンは、６角形で構成されるいわゆるハニカム構造を有する。フラーレン構造の設計においては、上記のとおり、海洋微生物由来のＳＭ／ＬＳＭ−ｌｉｋｅ ＲＮＡ結合タンパク質を用いたが、ＬＳＭタンパク質ファミリーにはホモ６量体（６角形）を形成するものが多い。そこで、グラフェン構造を有する構造体を得るべく、６量体を形成するＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ Ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のＬＳＭ−ｌｉｋｅ ＲＮＡ結合タンパク質（ＰＤＢ ＩＤ＝１ＬＪＯ、配列番号４３）と、Ｍｙｏ Ｘの逆平行コイルドコイル領域（ＰＤＢ ＩＤ＝２ＬＷ９、配列番号４９）との融合タンパク質を設計した。

【0088】

（遺伝子設計）
６量体と２量体の単量体分子を遺伝子上で融合させた人工タンパク質は、大腸菌での発現のためにコドンの最適化を行い、その遺伝子配列を設計した（配列番号５６）。このとき、Ｎ末端にＨｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｔａｇを付与することができるｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターに組換えることができるように、Ｎ末端にはＢａｍＨ Ｉ、Ｃ末端にはＨｉｎｄ ＩＩＩの制限酵素認識配列を付与した。なお、配列番号５６を以下に示す。

【0089】

【0090】

（発現用ベクターへの組換え）
上記の遺伝子配列はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１０−Ｇｏｌｄにヒートショック法により形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ培地で培養を行い、プラスミド抽出（ＶＩＯＧＥＮＥ）した。この増幅したプラスミドとｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターをＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限酵素処理した。アガロースゲル電気泳動を行い、目的の挿入配列と切断したｐＥＴ−Ｄｕｅｔ １ベクターをそれぞれゲルから切り取り、精製（ＶＩＯＧＥＮＥ）した。それぞれの配列をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを用いてＬｉｇａｔｉｏｎを行った。作成したプラスミドは同様に形質転換し、培養、プラスミド抽出した後、発現株であるＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｓｔａｒ （ＤＥ３）にヒートショック法により形質転換した。

【0091】

（培養及び発現）
上記で形質転換された発現株を、ＬＢ＋Ａｍｐ寒天培地で１６時間、３７℃で培養し、コロニーを得た。このコロニーを３ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に植菌し、８時間、３７℃で前培養を行った。前培養を行った液体培地２ｍＬを２００ｍＬ ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に移し、２時間、３７℃で本培養を行った後、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭになるよう加え、Ｏ／Ｎ発現誘導を行った。

【0092】

（精製）
上記発現誘導後の培養液を、遠心分離（１００００×ｇ，１０分間，４℃）して菌体を回収し、−３０℃で一時保存した。培養液１００ｍＬ分に相当する菌体に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）を１０ｍＬ加え、超音波破砕（Ｏｕｔｐｕｔ ３，Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ ３０，２０分間）した。破砕後上清を遠心分離（１００００×ｇ，１０分間，４℃）して上清を回収した。この上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に流し、発現したタンパク質を結合させた後、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）で１０ＣＶ以上洗浄した。その後、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８）を３ｍＬ加え、１時間インキュベートした後、溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出画分に人工タンパク質由来のアミノ酸配列（配列番号５７）に相当する分子量（１６．３ ｋＤａ）のバンドを確認した。なお、配列番号５７を以下に示す。

【0093】

【0094】

（複合化評価）
精製したタンパク質を電気泳動により可視化するため、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３Ｋ （Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）で限外濾過を行い、タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮を行った。タンパク質複合体は、非変性条件下で泳動することが可能であるＢｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行うことで評価した。その結果、設計したタンパク質が多量化したもの（グラフェン構造を有する構造体）とみられるバンドを確認した。

【符号の説明】

【0095】

１０ 融合タンパク質
１１ ホモ５量体モノマー
１２ 逆平行型コイルドコイル構造モノマー
１３ リンカー
１４ 五角形
１４１ 五角形の辺
１４２ ５量体の中心を通る辺
１５ 六角形
１５１ 六角形の辺
１５２ 逆平行型コイルドコイル構造モノマーに沿った辺
１６ ホモ６量体モノマー

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]