特許 6959251 ナノポアシステムに有用な部位特異的バイオコンジュゲーション方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6959251

(24)【登録日】2021年10月11日

(45)【発行日】2021年11月2日

(54)【発明の名称】ナノポアシステムに有用な部位特異的バイオコンジュゲーション方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/06 20060101AFI20211021BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20211021BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20211021BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20211021BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/06

   C12N9/00

   C12N9/12ZNA

   !C07K14/195

【請求項の数】16

【全頁数】52

(21)【出願番号】特願2018-549192(P2018-549192)

(86)(22)【出願日】2017年3月23日

(65)【公表番号】特表2019-512509(P2019-512509A)

(43)【公表日】2019年5月16日

(86)【国際出願番号】EP2017057002

(87)【国際公開番号】WO2017162828

(87)【国際公開日】20170928

【審査請求日】2020年3月6日

(31)【優先権主張番号】62/313,086

(32)【優先日】2016年3月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514318769

【氏名又は名称】ジェニア・テクノロジーズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(72)【発明者】

【氏名】グレミャチンスキー，ディミトリー

(72)【発明者】

【氏名】ツィツィロニス，クリストス

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１４８４０２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／０６

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ０７Ｋ １４／１９５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質および生体分子のコンジュゲートを調製する方法であって、
（ａ）適切な反応条件下で、チオール基を含むタンパク質を、式（Ｉ）

【化1】

（式中、
Ａは、チオール反応性基であり、
Ｌ_Ａは、リンカーであり、
Ｘは、クリック化学反応性基である）
の化合物と接触させ、それによって、式（ＩＩ）

【化2】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子である）
の修飾タンパク質を形成するステップ、
（ｂ）式（ＩＩ）の修飾タンパク質を、式（ＩＩＩ）

【化3】

（式中、
Ｂは、反応性基であり、
Ｌ_Ｂは、リンカーであり、
Ｙは、式（ＩＩ）の化合物の同族クリック化学反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基である）
の化合物と接触させ、それによって、構造式（ＩＶ）

【化4】

の修飾タンパク質を形成するステップ、および、
（ｃ）式（ＩＶ）の修飾タンパク質を、適切な条件下で、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能である反応性基Ｚを含む生体分子と接触させ、それによって、式（Ｖ）

【化5】

のコンジュゲートを形成するステップ、
を含み、
前記反応性基Ｂが、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むものであり、前記反応性基Ｚが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含むものである、前記方法。

【請求項2】

チオール反応性基Ａが、マレイミドまたはハロアセトアミドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＳｐｙＴａｇペプチドおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が各々、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのアミノ酸配列の断片を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

構造式（ＩＶａ）

【化6】

（式中、
Ｓは、細孔形成性タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、
Ａは、チオール反応性基であり、
Ｌ_Ａは、リンカーであり、
Ｘは、クリック化学反応性基であり、
Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、
Ｌ_Ｂは、リンカーであり、および、
Ｂは、反応性基であり、
前記反応性基Ｂが、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むものである）
の修飾細孔形成性タンパク質を含む組成物。

【請求項5】

チオール反応性基Ａが、マレイミドまたはハロアセトアミドであり、ハロゲン原子が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩから選択される、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

クリック化学反応性基ＸおよびＹが、クリック化学反応性基の下記対：アジドおよびアルキン、アジドおよびシクロオクチン、ならびにアジドおよびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択される対である、請求項４または５に記載の組成物。

【請求項7】

式（ＩＶａ）の修飾細孔形成性タンパク質が、式（ＩＶｂ）、式（ＩＶｃ）、式（ＩＶｄ）、式（ＩＶｅ）、式（ＩＶｆ）、および式（ＩＶｇ）：

【化7-1】

【化7-2】

の化合物から選択される化合物を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＳｐｙＴａｇペプチドが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのアミノ酸配列の断片を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

式（Ｖ）

【化8】

（式中、
Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、
Ａは、チオール反応性基であり、
Ｌ_Ａは、リンカーであり、
Ｘは、クリック化学反応性基であり、
Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、
Ｌ_Ｂは、リンカーであり、
Ｂは、反応性基であり、および、
Ｚは、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能な反応性基であり、
前記反応性基Ｂが、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むものであり、前記反応性基Ｚが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含むものである）
のタンパク質および生体分子のコンジュゲートを含む組成物。

【請求項10】

チオール反応性基Ａが、マレイミドである、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

クリック化学反応性基ＸおよびＹが、クリック化学反応性基の下記対：アジドおよびアルキン、アジドおよびシクロオクチン、ならびにアジドおよびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択される対である、請求項９または１０に記載の組成物。

【請求項12】

式（Ｖ）のコンジュゲートが、式（Ｖｂ）、式（Ｖｃ）、式（Ｖｄ）、式（Ｖｅ）、式（Ｖｆ）、および式（Ｖｇ）：

【化9-1】

【化9-2】

の化合物から選択される化合物を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

ＳｐｙＴａｇペプチドおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が各々、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのアミノ酸配列の断片を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

タンパク質が、任意選択で、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡからなる群から選択される細孔形成性タンパク質である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

タンパク質が、膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

生体分子が、任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＤＮＡリガーゼからなる群から選択される、ポリマーの合成を触媒することが可能な酵素である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本開示は、細孔形成性タンパク質であるα−溶血素などのタンパク質を、抗体、受容体、およびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素などの生体分子にコンジュゲートするための迅速で効率的な化学反応に関する。

【背景技術】

【0002】

[0002]ナノポアを使用する単一分子合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）技術が開発されている。例えば、米国特許公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号および同２０１３／０２６４２０７Ａ１号を参照のこと。ナノポアＳＢＳは、標的配列鋳型と相補的であるＤＮＡ鎖を合成するためのポリメラーゼの使用および各ヌクレオチドモノマーが成長する鎖に付加される場合に、各ヌクレオチドモノマーの同一性を決定し、それによって標的配列を決定することを含む。付加されるヌクレオチドモノマーは各々、ポリメラーゼ活性部位および成長する鎖に隣接して位置するナノポアを介して検出される。正確なシグナルを得ることにより、ポリメラーゼ活性部位をナノポアの付近に適切に位置付けることが必要とされる。適切に位置付けることは通常、ポリメラーゼを、ナノポアを構成する細孔タンパク質に共有結合することによって達成される。

【0003】

[0003]単量体細孔形成性タンパク質は、わずか５ｋＤａ〜８０ｋＤａの分子量範囲を有し、これらのモノマーは、１６０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、２００ｋＤａ、２２０ｋＤａまたはそれを上回る分子量を有する６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回るモノマーの大きな多量体複合体を形成する。適切な条件下で、これらの多量体複合体は、脂質二重膜を通る細孔を自発的に形成する。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の十分に研究された細孔形成性タンパク質であるα−溶血素（α−ＨＬ）は、モノマー分子量３３ｋＤａを有し、分子量２３１ｋＤａを有する七量体細孔複合体を自発的に形成する。ポリメラーゼは、約６０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量の範囲にある大きなタンパク質であり、場合によってはより一層大きな多量体複合体（例えば、およそ４００ｋＤａの多量体のＲＮＡポリメラーゼ）である。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片は、分子量６８ｋＤａを有する。

【0004】

[0004]したがって、ナノポアセンサーを提供するために、α−溶血素七量体のようなこれらの細孔形成性タンパク質を、ＤＮＡポリメラーゼのような大きな生体分子にコンジュゲートするための任意の反応の動態は、このような大きな巨大分子を用いた場合の達成可能な低濃度（および利用可能な比較的少量）によって極めて制限される。水溶液中のこのような大きなタンパク質の最大溶解度は通常、およそ０．１〜１０ｍｇ／ｍＬに制限される。したがって、コンジュゲーション反応に使用される溶液中の２つの巨大分子の濃度は、およそ１μＭ〜１０００μＭに制限される。例えば、α−溶血素タンパク質細孔は、総計約２３５，０００に及ぶ分子量の７つの同一サブユニットで構成される。したがって、１０ｍｇ／ｍｌの溶液は、約４２μＭの濃度を有する。この比較的低濃度範囲は実際上、実行可能なコンジュゲーション化学を、極めて迅速で不可逆的な反応速度を有するものに制限する。

【0005】

[0005]国際公開第２０１５／１４８４０２Ａ１号は、ナノポアシーケンシングに有用なタグ付きヌクレオチドについて記載し、またα−溶血素をポリメラーゼに結合する２つの方法について記載している。方法の１つは、ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ酵素コンジュゲーション反応を使用することを含む（例えば、ＺａｋｅｒｉおよびＨｏｗａｒｔｈ（２０１０）．ＪＡＣＳ １３２：４５２６〜７を参照のこと）。この方法では、ＳｐｙＴａｇペプチド断片は、組換え融合物として、α−ＨＬモノマーのＣ末端に結合され、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質断片は、組換え融合物として、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端に結合される。第２の方法は、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン基で修飾されたα−ＨＬと、６−メチル−テトラジン基で修飾されたポリメラーゼとの間の逆的電子要請型ディールズアルダー（ＩＥＤＤＡ）反応を使用することを含む。

【0006】

[0006]ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）は本来、天然ペプチド結合構造を維持しながら、ポリペプチド断片をライゲーションすることによって、合成ポリペプチドの伸長を可能にする合成方法として開発された。（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４、２６６、７７６〜７７９を参照のこと）。ＮＣＬの化学両論的効率および部位特異性が、それを、グリコペプチド合成および天然ペプチド結合を保持することが重要である他の合成方法に有用なものにしている。（例えば、Ｓｈｉｎら、「Ｆｍｏｃ−Ｂａｓｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ−α−Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９、１２１、１１６８４〜１１６８９を参照のこと）。

【0007】

[0007]ＳＢＳに関するナノポア検出システムを形成する際に通常使用される比較的低濃度の細孔タンパク質およびポリメラーゼに起因して、これらの２つの比較的大きなタンパク質複合体間の強力で選択的な共有結合的コンジュゲーションを可能にする非常に効率の良い部位特異的コンジュゲーション反応が開発されていることは重要である。また、コンジュゲーション反応が、的確な巨大分子配向性を要するナノポアシーケンシングなどの特定の使用のためのコンジュゲートされる分子の位置付けを最適化するために、結合部位選択における自由を可能にすることも重要である。したがって、ナノポアなどのタンパク質複合体を、酵素などの他の生体分子にコンジュゲートするためのより迅速でより効率的なプロセスが依然して必要とされる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

[0008]本開示は、細孔形成性タンパク質および生体分子の部位特異的コンジュゲーションに関する方法、ならびに修飾細孔形成性タンパク質、生体分子を含む組成物、ならびに調製方法の使用から生じるコンジュゲートを提供する。さらに、本開示は、コンジュゲートを含むナノポアシステムおよび組成物、ならびにナノポアシーケンシングにおける使用を含む関連使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

[0009]本明細書において開示するような、タンパク質の、生体分子への部位選択的コンジュゲーションに関する方法は概して、下記の通りにステップ（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）適切な反応条件下で、チオール基を含むタンパク質を、式（Ｉ）

【0010】

【化1】

【0011】

（式中、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基である）
の化合物と接触させ、それによって、式（ＩＩ）

【0012】

【化2】

【0013】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子である）
の修飾タンパク質を形成するステップと、
（ｂ）式（ｉｉ）の修飾タンパク質を、式（ｉｉｉ）

【0014】

【化3】

【0015】

（式中、Ｂは、反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｙは、式（ＩＩ）の化合物の同族クリック化学反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基である）
の化合物と接触させ、それによって、構造式（ＩＶ）

【0016】

【化4】

【0017】

の修飾タンパク質を形成するステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の修飾タンパク質を、適切な条件下で、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能である反応性基Ｚを含む生体分子と接触させ、それによって、式（Ｖ）

【0018】

【化5】

【0019】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基であり、Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｂは、反応性基であり、Ｚは、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能な反応性基である）
のタンパク質−生体分子コンジュゲートを形成するステップ。

【0020】

[0010]一部の実施形態においては、本開示はまた、構造式（ＩＶａ）

【0021】

【化6】

【0022】

（式中、Ｓは、細孔形成性タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基であり、Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｂは、反応性基である）
の修飾細孔形成性タンパク質を含む組成物を提供する。

【0023】

[0011]一部の実施形態においては、本開示はまた、式（Ｖ）

【0024】

【化7】

【0025】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基であり、Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｂは、反応性基であり、Ｚは、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能な反応性基である）
のタンパク質−生体分子コンジュゲートを含む組成物を提供する。

【0026】

[0012]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法および関連組成物の実施形態においては、反応性基Ｂは、ＳｐｙＴａｇペプチドを含み、反応性基Ｚは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む。一部の実施形態においては、ＳｐｙＴａｇペプチドは、ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号１）、ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫ（配列番号２）、ＡＨＩＶＭＶＤＡ（配列番号３）、およびａｈＡ−ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号４）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、反応性基Ｚを含む生体分子は、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質との融合物であり、任意選択で、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0027】

[0013]一部の実施形態においては、本開示はさらに、式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲートを含むナノポア組成物を提供し、ここで、タンパク質は、ナノポアの一部である細孔形成性タンパク質である。一部の実施形態においては、ナノポアは、膜中に埋め込まれており、任意選択で、膜は、固体基板に結合させることができ、および／またはそれが、固体基板中のウェルまたはくぼみまたは孔をつなげるように形成され、それは任意選択で、ポリマー、ガラス、シリコン、およびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態においては、固体基板は、ナノポアに隣接して、センサー、検出回路、または検出回路に連結された電極、任意選択で、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路をさらに含む。

【0028】

[0014]本開示はまた、構造式（ＩＶａ）の修飾細孔形成性タンパク質を含む中間体組成物を含む、タンパク質の、生体分子への部位選択的コンジュゲーションに関する方法において中間体として形成される化合物および組成物を提供する。

【0029】

[0015]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法および関連組成物の実施形態においては、タンパク質は、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡからなる群から選択される細孔形成性タンパク質である。一実施形態においては、細孔形成性タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素である。一実施形態においては、細孔形成性タンパク質は、α−溶血素Ｃ４６（「α−ＨＬ Ｃ４６」）であり、それは、Ｋ４６Ｃアミノ酸残基置換を伴う黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素を含む。一部の実施形態においては、細孔形成性タンパク質は、直径約０．５ナノメートル〜約２５ナノメートルのナノポアを形成することが可能である。

【0030】

[0016]式（Ｉ）のコンジュゲート組成物の調製方法の一部の実施形態においては、タンパク質および／または生体分子は、１０００μＭ、７５０μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、もしくは１μＭまたはそれ未満の濃度で反応溶液中に存在する。

【0031】

[0017]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション反応および関連組成物の実施形態においては、タンパク質は、少なくとも２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれを超える分子量を有する細孔形成性タンパク質である。その方法および組成物の一部の実施形態においては、生体分子は、少なくとも３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０Ｋｄａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、またはそれを超える分子量を有する。一部の実施形態においては、細孔形成性タンパク質は、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有し、生体分子は、少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する。

【0032】

[0018]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法および関連組成物の実施形態においては、タンパク質は、多量体複合体の一部である細孔形成性タンパク質であり、ここで、多量体は、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、またはより大きな多量体から選択される。一部の実施形態においては、タンパク質は、多量体複合体の一部である単一モノマーである細孔形成性タンパク質であり、ここで、複合体の他のモノマーは、式（Ｖ）のコンジュゲート組成物を含まない（即ち、多量体の単一モノマーのみが、生体分子にコンジュゲートされる）。

【0033】

[0019]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法および関連組成物の実施形態においては、タンパク質は、膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質である。一部の実施形態においては、タンパク質は、ナノポアの一部である細孔形成性タンパク質である。一部の実施形態においては、タンパク質は、固体基板に結合され、任意選択で、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコン、およびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。

【0034】

[0020]本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法および関連組成物の実施形態においては、生体分子は、ポリマーの合成を触媒することが可能な酵素である。一部の実施形態においては、生体分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＤＮＡリガーゼからなる群から選択される酵素である。一部の実施形態においては、生体分子は、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および強力な鎖置換活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する天然に存在するか、または天然に存在しない（例えば、操作された）酵素である。一部の実施形態においては、生体分子は、任意選択で、９°Ｎポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（エキソ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９Ｖ、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ２．０、およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼである。一部の実施形態においては、生体分子は、配列番号９のアミノ酸を含むＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ６である。一部の実施形態においては、反応性基Ｚを含む生体分子は、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ６およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質の融合物であり、任意選択で、融合物は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0035】

[0021]式（Ｉ）の化合物を含む組成物および調製方法の一部の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは、下記化学基：直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキル、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルケニル、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキニル、エステル、エーテル、アミン、アミド、イミド、ホスホジエステル、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数を含む２〜１００個の原子の共有結合鎖を含む。一部の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは、Ａおよび／もしくはＢ上のスルフヒドリル基へのチオエーテル結合により、またはＡおよび／もしくはＢの第一級アミン基へのペプチド結合により、ＡおよびＢに結合する。一部の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは、１〜５０個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のポリマーを含む。式（Ｉ）の化合物を含む組成物および調製方法の一部の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは独立に、式（ＶＩａ）〜式（ＶＩｅ）の構造からなる群から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】[0022]本開示の方法および組成物に従う、ＤＢＣＯ−アジドクリック化学およびネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）の組合せを介した、ポリメラーゼ（「ＰＯＬ」）の、ナノポア（「ＰＯＲＥ」）への部位選択的コンジュゲーションの例示的な方法における反応ステップおよび試薬の使用を模式的に（上部から下部へ）表す図である。図１に示す反応において有用な例示的な材料および方法は、α−ＨＬ七量体ナノポア複合体を、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼにコンジュゲートする特定の事例に関して、実施例１で詳述する。

【図2】[0023]本開示の方法および組成物に従う、クリック化学およびＳｐｙＴａｑ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ反応の組合せを介した、ポリメラーゼ（「ＰＯＬ」）の、ナノポア（「ＰＯＲＥ」）への部位選択的コンジュゲーションの例示的な方法における反応ステップおよび試薬の使用を模式的に（上部から下部へ）表す図である。図２に示す反応において有用な例示的な材料および方法は、α−ＨＬ七量体ナノポア複合体を、Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼにコンジュゲートする特定の事例に関して、実施例２で詳述する。

【発明を実施するための形態】

【0037】

[0024]本開示は、タンパク質（例えば、細孔形成性タンパク質、α−溶血素）の、他の生体分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼオリゴヌクレオチド、抗体および受容体）への部位選択的コンジュゲーションに関する方法、および式（Ｖ）

【0038】

【化8】

【0039】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基であり、Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｂは、反応性基であり、Ｚは、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能な反応性基である）
の得られたタンパク質−生体分子コンジュゲートに関する。

【0040】

[0025]本開示はまた、構造式（ＩＶａ）

【0041】

【化9】

【0042】

（式中、Ｓは、細孔形成性タンパク質のチオール基の硫黄原子であり、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基であり、Ｙは、反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｂは、反応性基である）
の修飾細孔形成性タンパク質を含む中間体組成物を含む、タンパク質の、生体分子への部位選択的コンジュゲーションの方法において中間体として形成される化合物および組成物を提供する。

【0043】

[0026]本明細書において開示するタンパク質の、生体分子への部位選択的コンジュゲーションに関する方法は概して、
（ａ）適切な反応条件下で、チオール基を含むタンパク質を、式（Ｉ）

【0044】

【化10】

【0045】

（式中、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基である）の化合物と接触させ、それによって、式（ＩＩ）

【0046】

【化11】

【0047】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子である）
の修飾タンパク質を形成するステップと、
（ｂ）式（ｉｉ）の修飾タンパク質を、式（ｉｉｉ）

【0048】

【化12】

【0049】

（式中、Ｂは、反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｙは、式（ＩＩ）の化合物の同族クリック化学反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基である）
の化合物と接触させ、それによって、構造式（ＩＶ）

【0050】

【化13】

【0051】

の修飾タンパク質を形成するステップと、
（ｃ）式（ＩＶ）の修飾タンパク質を、適切な条件下で、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能である反応性基Ｚを含む生体分子と接触させ、それによって、式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲートを形成するステップと
を含む。

【0052】

[0027]開示する方法および組成物は、比較的低濃度で、かつ一方の試薬が他方の試薬に対して大幅なモル過剰ではない場合に、タンパク質と他の生体分子との間の迅速で効率的なコンジュゲーションを可能にする。したがって、本明細書において開示するコンジュゲートの組成物およびそれらを調製する化学プロセスは、ＤＮＡポリメラーゼなどの生体分子に共有結合された膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質を含むナノポア組成物を調製する際の使用に特に適している。このようなナノポア組成物は、単一分子合成時解読を含むナノポア検出を要する用途において使用することができる。

【0053】

[0028]タンパク質の、生体分子への部位選択的コンジュゲーションの方法における使用のための組成物、方法、およびパラメーターのさらなる詳細を以下で本明細書において記載する。

【0054】

[0029]本明細書における説明および添付の特許請求の範囲について、単数形「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文脈が明確に別に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「１種のタンパク質」への言及は、２種以上のタンパク質を含み、「１種の化合物」への言及は、２種以上の化合物を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、互換可能であり、制限であるように意図されない。種々の実施形態の説明が、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合には、当業者ならば、一部の特別な場合においては、実施形態を、代替として、言語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を使用して説明することができるということは、さらに理解されるべきである。

【0055】

[0030]さまざまな値が提供される場合には、明確に別段の定めがない限り、その範囲の上限および下限の間の、値の介在する整数各々および明確に別段の定めがない限り、値の介在する整数各々の１０分の１ならびに任意のその他の示された値またはその示された範囲中の介在する値が、本発明内に包含されるということは理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立に、より小さい範囲中に含まれ得、また、本発明内に包含され、示された範囲中の任意の具体的に排除される限界の支配下にある。示された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界の（ｉ）いずれか、または（ｉｉ）両方を排除する範囲も、本発明中に含まれる。例えば、「１〜５０」は、「２〜２５」、「５〜２０」、「２５〜５０」、「１〜１０」などを含む。

【0056】

[0031]図面を含む前記の一般的な説明および以下の詳細な説明は、単に例示的なものであって、本開示を制限するものではないということは理解されるべきである。
[0032]定義
[0033]本明細書の説明において使用される技術用語および科学用語は、別段の定めがない限り、当業者に一般に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。

【0057】

[0034]「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において互換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合される少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを意味する。

【0058】

[0035]「細孔形成性タンパク質」または「細孔タンパク質」とは、本明細書において、脂質二重層または細胞膜などのバリア材料中に細孔またはチャネル構造を形成することが可能である天然のまたは天然に存在しないタンパク質を指す。この用語は、本明細書において、溶液中で細孔形成性のタンパク質および膜もしくはバリア材料中に埋め込まれた、または固体基板もしくは支持体上に固定化されている細孔形成性タンパク質の両方を含むものとする。この用語は、本明細書において、モノマーとしての細孔形成性タンパク質およびまたそれらが構築可能である任意の多量体形態を含むものとする。本開示の組成物および方法において使用できる例示的細孔形成性タンパク質として、α−溶血素（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の）、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒（例えば、ニューモリシン）、ロイコシジン、メリチンおよびポリンＡ（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のＭｓｐＡ）が挙げられる。

【0059】

[0036]「ポリメラーゼ」とは、本明細書において、任意の天然の、または天然に存在しない酵素またはヌクレオチドモノマーの核酸ポリマーを形成する重合などの重合反応を触媒可能である他の触媒を指す。本開示の組成物および方法において使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）、およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。

【0060】

[0037]「核酸」とは、本明細書において、核酸塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）のうち１種またはそのバリアントを含む１種または複数の核酸サブユニットの分子を指す。核酸は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる、ヌクレオチド（例えば、ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ）のポリマーを指すこともあり、一本鎖および二本鎖形態両方のＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む。

【0061】

[0038]「天然に存在する」または「野生型」とは、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型タンパク質は、天然に見られる供給源から単離することができる生物中に存在する、ヒトの操作によって意図的に改変されていない配列を有するタンパク質である。

【0062】

[0039]「操作された」、「組換え」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸、もしくはポリペプチドに関して使用される場合には、そうでなければ天然に存在しない方法で改変されている、または同一であるが、合成材料から、および／もしくは組換え技術を使用する操作によって製造される、もしくはそれに由来する材料を指す。

【0063】

[0040]「ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質」とは、本明細書において、Ｌｙｓ３１を含むが、Ａｓｐ１１７を排除する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｃｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質であるＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインのＮ末端断片を含むアミノ酸配列を指す。本開示の方法においてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質として有用なＣｎａＢ２ Ｎ末端配列断片として、Ｌｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７に開示されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が挙げられる。

【0064】

[0041]「ＳｐｙＴａｑペプチド」とは、本明細書において、Ａｓｐ１１７を含むが、Ｌｙｓ３１を排除する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｃｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質であるＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインのＣ末端断片を含むアミノ酸配列を指す。

【0065】

[0042]「ナノポア」とは、本明細書において、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有する膜または他のバリア材料中に形成される、または別に提供される細孔、チャネルまたは通路を指す。ナノポアは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素などの天然に存在する細孔形成性タンパク質またはα−ＨＬ−Ｃ４６などの天然に存在しない（即ち、操作された）または天然に存在するいずれかの、野生型細孔形成性タンパク質の変異体またはバリアントから作製することができる。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、天然に存在しないポリマー材料から作製された合成膜であってもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などのセンサー、検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。

【0066】

[0043]「リンカー」とは、本明細書において、２以上の分子、分子基および／または分子部分の間の幾分かの空間を有する結合取付けを提供する任意の分子部分を指す。本開示の組成物および方法において使用できる例示的リンカーとして、２〜１００個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のポリマー鎖を挙げることができ、それらのポリマー鎖は、アルキル、アルケン、アルキン、エステル、エーテル、アミド、イミド、および／またはホスホジエステルをさらに含むことができる。

【0067】

[0044]「固体基板」、または「固体支持体」とは、本明細書において、生体分子が結合され得る任意の固相材料を指す。本開示の組成物および方法とともに使用できる例示的固体基板として、ガラス、ポリマー、およびシリコンを含む種々の固相材料で作製されたビーズ、スライド、ウェル、チップが挙げられる。

【0068】

[0045]実施形態の詳細な説明
[0046]細孔形成性タンパク質、α−溶血素などのタンパク質と、ＤＮＡポリメラーゼなどの生体分子との間のコンジュゲートの調製に関する本明細書において開示する部位選択的コンジュゲーション方法は概して、リンカーおよびタンパク質または生体分子のいずれか上の基と反応する反応性基（または反応性部分）を含む試薬を要する。このコンジュゲーション方法は概して、下記ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）適切な反応条件下で、チオール基を含むタンパク質を、式（Ｉ）

【0069】

【化14】

【0070】

（式中、Ａは、チオール反応性基であり、Ｌ_Ａは、リンカーであり、Ｘは、クリック化学反応性基である）の化合物と接触させ、それによって、式（ＩＩ）

【0071】

【化15】

【0072】

（式中、Ｓは、タンパク質のチオール基の硫黄原子である）の修飾タンパク質を形成するステップ、
（ｂ）式（ＩＩ）の修飾タンパク質を、式（ＩＩＩ）

【0073】

【化16】

【0074】

（式中、Ｂは、反応性基であり、Ｌ_Ｂは、リンカーであり、Ｙは、式（ＩＩ）の化合物の同族クリック化学反応性基Ｘとクリック化学反応を起こすクリック化学反応性基である）の化合物と接触させ、それによって、構造式（ＩＶ）

【0075】

【化17】

【0076】

の修飾タンパク質を形成するステップ、および
（ｃ）式（ＩＶ）の修飾タンパク質を、適切な条件下で、反応性基Ｂと共有結合を形成することが可能である反応性基Ｚを含む生体分子と接触させ、それによって、式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲートを形成するステップ。

【0077】

[0047]上記に示すように、一般的な方法は、式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の試薬化合物を要し、式（ＩＩ）および式（ＩＶ）の２つの修飾タンパク質中間体を生じる。したがって、式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲートは、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各々での３つの共有結合形成反応によって生じる。

【0078】

【化18】

【0079】

[0048]ステップ（ａ）
[0049]ステップ（ａ）は、タンパク質上のチオール基と、式（Ｉ）のクリック化学反応性基を含むリンカーとの共有結合的修飾を含み、式（ＩＩ）の修飾タンパク質を生じる。このステップは、タンパク質が容易かつ効率的なクリック化学反応を介したさらなる修飾が可能であるように、タンパク質を本質的に修飾する。

【0080】

[0050]一部の実施形態においては、タンパク質は、式（ＩＩ）の修飾タンパク質が、単一アミノ酸残基位置で修飾されるように１個の反応性チオール基を有する。例えば、反応性チオール基は、タンパク質の表面、またはタンパク質が式（Ｉ）の化合物のチオール反応性基Ａと反応することができるように溶媒に露出される任意の他の領域上に位置するシステインアミノ酸残基のチオール基であり得る。一部の実施形態においては、タンパク質は、式（Ｉ）の化合物による修飾に利用可能なたった１個のシステイン残基を有するように、組換えＤＮＡ技術を介して操作されたバリアントである。

【0081】

[0051]一実施形態においては、タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の細孔形成性タンパク質α−溶血素（本明細書において「α−ＨＬ」とも呼ばれる）である。α−ＨＬは、細孔形成性タンパク質のクラスの最も研究されているメンバーの１つであり、部位特異的突然変異誘発および化学標識を含む幅広い技術を使用して、シーケンシングされ、クローニングされ、構造的におよび機能的に広く特性決定されてきた（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびそこで引用される参照文献を参照のこと）。特に、α−ＨＬは、多数の位置で挿入されるシステイン残基置換を有し、マレイミドリンカー化学によるタンパク質の共有結合的修飾を可能にした（上記）。一部の実施形態においては、本開示の方法において有用なα−溶血素は、天然に存在しない操作された細孔形成性タンパク質α−溶血素−Ｃ４６（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）であってもよく、それは、Ｋ４６Ｃアミノ酸残基置換を伴う黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のα−溶血素を含む。

【0082】

[0052]上記の構造描写によって示されるように、式（Ｉ）の化合物は概して、チオール反応性基Ａ、リンカーＬ_Ａ、およびクリック化学反応性基Ｘを含む。一般的に、式（Ｉ）の化合物は、比較的穏やかな水性条件下で、効率的かつ選択的に反応して、タンパク質上のチオール基と、クリック化学反応性基Ｘとの間に共有結合を形成するはずである。さらに、クリック化学反応性基Ｘは、Ｘがステップ（ｂ）でその同族クリック化学反応性基Ｙと反応を起こすのに利用可能でなくてはならないので、チオール反応性基Ａがタンパク質のチオール基と反応する条件下では、タンパク質と反応しないはずである。

【0083】

[0053]上述するように、クリック化学反応性基Ｘは、ステップ（ｂ）で使用されるその同族クリック化学反応性基Ｙと対形成するように選択されなくてはならない。上記方法において有用なクリック化学反応性基ＸおよびＹは、クリック化学反応性基の下記の対：アジドおよびアルキン、アジドおよびシクロオクチン、ならびにアジドおよびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択され得る。したがって、式（Ｉ）の化合物の一部の実施形態においては、クリック化学反応性基Ｘは、アルキン、シクロオクチン、およびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択される。あるいは、式（Ｉ）の化合物の一部の実施形態においては、クリック化学反応性基Ｘは、アジド基である。

【0084】

[0054]穏やかな条件下でタンパク質システイン基と選択的に反応する多くのチオール反応性基が、当該技術分野で公知である。上記クリック化学反応性基の対と適合性であることが公知の、したがってチオール反応性基Ａとして本開示の方法において特に有用なチオール反応性基Ａは、マレイミド基およびハロアセトアミド基である。したがって、式（Ｉ）の化合物の一部の実施形態においては、チオール反応性基Ａは、マレイミドおよびハロアセトアミドから選択される。

【0085】

[0055]一般的に、リンカーＬ_Ａは、タンパク質とクリック化学反応性基Ｘと、最終的には上記方法を介してコンジュゲートされる生体分子との間に適正な間隔を提供しながら共有結合的係留を提供すべきである。ステップ（ａ）〜（ｃ）の方法は、ステップ（ｂ）において使用される式（ＩＩＩ）の化合物における第２のリンカーＬ_Ｂを含むので、式（Ｖ）のコンジュゲートの一部である２つのリンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂの組合せによって提供される間隔も考慮することができる。

【0086】

[0056]したがって、本開示の一般的な実施形態においては、ステップ（ａ）〜（ｃ）を含む部位選択的コンジュゲーション方法を実行するために式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の化合物において有用なリンカー基Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、下記化学基：直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキル、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルケン、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキン、エステル、エーテル、アミン、アミド、イミド、ホスホジエステル、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数を含む２〜１００個の原子の共有結合鎖を含み得る。ＰＥＧリンカーは、生体分子をコンジュゲートする際における使用に周知である。したがって、本開示の組成物のある特定の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは、１〜５０個のＰＥＧ部分のポリマー、一部の実施形態においては、２〜２５個のＰＥＧ部分のポリマー、および一部の実施形態においては、２〜１５個のＰＥＧ部分のポリマーを含む。一部の実施形態においては、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは、異なる長さおよび／または構造を有する。また、一部の実施形態においては、Ｌ_ＡおよびＬ_Ｂは、同じであることが意図される。

【0087】

[0057]本開示の方法において有用な具体的なリンカー基は、タンパク質もしくは他の生体分子をコンジュゲートまたは架橋する際における使用に関して、周知であり、市販されている。（例えば、ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍにてＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡから、またはｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍにてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡから入手可能な「架橋試薬」のカタログを参照のこと）。

【0088】

[0058]式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態は、以下でより詳細に提供される。
[0059]一部の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、表１に示すような式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物から選択される化合物を含む。

【0089】

[0060]

【0090】

【表1】

【0091】

[0061]一部の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、表２に示すような式（Ｉｃ）、式（Ｉｄ）、式（Ｉｅ）、式（Ｉｆ）、式（Ｉｇ）および式（Ｉｈ）の化合物から選択される化合物を含む。

【0092】

[0062]

【0093】

【表2】

【0094】

[0063]一部の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、表３に示すような式（Ｉｉ）および式（Ｉｊ）の化合物から選択される化合物を含む。
[0064]

【0095】

【表3】

【0096】

[0065]一部の実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、表４に示すような式（Ｉｋ）および式（Ｉｍ）の化合物から選択される化合物を含む。
[0066]

【0097】

【表4】

【0098】

[0067]ステップ（ｂ）
[0068]ステップ（ｂ）は、式（ＩＩ）の修飾タンパク質上のＸ基、および式（ＩＩＩ）の試薬化合物上の同族クリック化学基Ｙのクリック化学反応を含む。このステップは、式（ＩＶ）および式（ＩＶａ）の中間体修飾タンパク質組成物を生じる（上記を参照のこと）。ステップ（ｃ）において生体分子と最終的な部位選択的反応を起こすのは、式（ＩＶ）のこの中間体化合物上の反応性基Ｂである。

【0099】

[0069]上記構造描写によって示されるように、ステップ（ｂ）において試薬として使用される式（ＩＩＩ）の化合物は、クリック化学反応性基Ｙ、リンカーＬ_Ｂ、および反応性基Ｂを含む。クリック化学反応性基Ｙは、ステップ（ａ）において使用されるその同族クリック化学反応性基Ｘと対形成するように選択されなくてはならない。上述するように、上記方法において有用なクリック化学反応性基ＸおよびＹは、クリック化学反応性基の下記の対：アジドおよびアルキン、アジドおよびシクロオクチン、ならびにアジドおよびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択され得る。式（ＩＩＩ）の化合物の一部の実施形態においては、クリック化学反応性基Ｙは、アジド基である。アジド基は、アルキン、シクロオクチン、およびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択される同族Ｘ基とのクリック化学反応を起こす。あるいは、式（ＩＩＩ）の化合物の一部の実施形態においては、クリック化学反応性基Ｙは、アルキン、シクロオクチン、およびジベンゾシクロオクチン−アミンから選択される。

【0100】

[0070]式（ＩＩＩ）の試薬化合物の同族クリック化学反応性基Ｙは、比較的穏やかな水性条件下で、効率的かつ選択的に反応して、式（ＩＩ）の修飾タンパク質のクリック化学反応性基Ｘと共有結合を形成する。生じた式（ＩＶ）のさらに修飾されたタンパク質は、ＸとＹとの間の単線として、本明細書において模式的に描写される共有結合（上記式（ＩＶ）の化合物を参照のこと）を含むが、この結合は、２つのクリック化学反応性基ＸおよびＹに依存する構造を有する複素環（例えば、トリアゾール）化学部分を含む。

【0101】

[0071]一般的に、リンカーＬ_Ｂは、タンパク質とクリック化学反応性基Ｙと、最終的には上記方法を介してコンジュゲートされる生体分子との間に適正な間隔を提供しながら共有結合的係留を提供するはずである。上述するように、ステップ（ａ）〜（ｃ）の方法は、２つのリンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂを含むので、組み合わせた２つのリンカーの組合せによって提供される間隔は、式（ＩＩＩ）の化合物においてリンカーＬ_Ｂを選択する際に考慮することができる。

【0102】

[0072]したがって、一部の実施形態においては、式（ＩＩＩ）の化合物において有用なリンカー基Ｌ_Ｂは、下記化学基：直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキル、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルケン、直鎖（Ｃ_１〜Ｃ_５）アルキン、エステル、エーテル、アミン、アミド、イミド、ホスホジエステル、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数を含む２〜１００個の原子の共有結合鎖を含み得る。

【0103】

[0073]リンカーＬ_Ｂの選択はまた、式（ＩＩＩ）の化合物に関して選択される反応性基Ｂにも依存する。以下でより詳細に論述するように、反応性基Ｂが、１３個のアミノ酸の鎖であるＳｐｙＴａｇペプチドである場合には、より短いリンカーＬ_Ｂ（例えば、２〜３個の炭素）を使用することができ、または反応性基Ｂがベンジルチオエステル基である場合には、より長いリンカーＬ_Ｂ（例えば、５〜５０個の炭素）を選択することができる。

【0104】

[0074]タンパク質が、（ＩＶａ）で見られるように細孔形成性タンパク質であり、反応性基Ｙおよび反応性基Ｘのクリック反応時に形成し得る種々の複素環式共有結合構造を示す式（ＩＶ）の修飾タンパク質の種々の実施形態を、以下で表５において式（ＩＶｂ）〜（ＩＶｉ）の化合物として示す。

【0105】

[0075]

【0106】

【表5-1】

【0107】

【表5-2】

【0108】

[0076]一般的に、式（ＩＩＩ）の化合物の反応性基Ｂの選択は、ステップ（ｃ）の反応における部位選択的コンジュゲーション用の生体分子の標的基である反応性基Ｚに依存する。

【0109】

[0077]一実施形態においては、生体分子の反応性基Ｚは、Ｎ末端システイン残基を含み、選択される反応性基Ｂは、チオエステルである。チオエステル反応性基Ｂは、ペプチド結合を含む共有結合を形成する「ネイティブケミカルライゲーション」反応（本明細書において、「ＮＣＬ反応」とも呼ばれる）を起こすことができる。（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４、２６６、７７６〜７７９を参照のこと）。生体分子の反応性基ＺがＮ末端システイン残基を含み、ＮＣＬ反応がコンジュゲーションに使用される、有用な式（ＩＩＩ）の化合物の実施形態を、以下でより詳細に提供する。

【0110】

[0078]反応性基ＺがＮ末端システイン残基を含む一部の実施形態においては、式（ＩＩＩ）の化合物は、表６に示すような式（ＩＩＩａ）または式（ＩＩＩｂ）の化合物を含む。

【0111】

[0079]

【0112】

【表6】

【0113】

[0080]生体分子の反応性基ＺがＮ末端システイン残基を含む特定の実施形態においては、反応性基Ｂは、ベンジルチオエステルである。
[0081]反応性基ＺがＮ末端システイン残基を含むさらに特定の実施形態においては、式（ＩＩＩ）の化合物は、表７に示すような式（ＩＩＩｃ）または式（ＩＩＩｄ）の化合物を含み得る。

【0114】

[0082]

【0115】

【表7】

【0116】

[0083]別の実施形態においては、生体分子の反応性基Ｚは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含み、選択される反応性基Ｂは、ＳｐｙＴａｇペプチドである。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質およびＳｐｙＴａｇペプチドは、タンパク質のリジン残基とペプチドのアスパラギン酸残基との間の、２つをコンジュゲートする共有結合をもたらす反応を起こす。（例えば、ＺａｋｅｒｉおよびＨｏｗａｒｔｈ（２０１０）．ＪＡＣＳ １３２：４５２６〜７、およびＬｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７を参照のこと）。生体分子の反応性基ＺがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含み、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ反応がコンジュゲーションに使用される、有用な式（ＩＩＩ）の化合物の実施形態を、以下でより詳細に提供する。

【0117】

[0084]一般的に、反応性基ＺがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質を含む本開示の方法において、式（ＩＩＩ）の化合物の反応性基Ｂは、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むはずである。したがって、特定の実施形態においては、式（ＩＩＩ）の化合物は、表８に示すような式（ＩＩＩｅ）または式（ＩＩＩｆ）の化合物を含み得る。

【0118】

[0085]

【0119】

【表8】

【0120】

[0086]さらに、式（ＩＶ）の修飾タンパク質は、ステップ（ｂ）の結果であるため、一部の実施形態においては、式（ＩＶ）の反応性基Ｂは、ＳｐｙＴａｇペプチドを含むことが意図される。したがって、特定の実施形態においては、式（ＩＶ）の修飾タンパク質化合物は、表９に示すような式（ＩＶｉ）または式（Ｖｋ）の化合物を含み得る。

【0121】

[0087]

【0122】

【表9】

【0123】

[0088]本明細書において別の場所に記載したように、ＳｐｙＴａｇペプチドおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は各々、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのアミノ酸配列の断片を含む。（例えば、Ｌｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７を参照のこと）。一般的に、ＳｐｙＴａｇペプチドは、より小さなＣ末端断片由来の反応性アスパラギン酸残基（例えば、８〜２０個のアミノ酸）を含み、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、より大きなＮ末端断片由来の反応性リジン残基（例えば、１００〜１４０個のアミノ酸）を含む。ＳｐｙＴａｇペプチドの反応性アスパラギン酸残基は、アスパラギン酸がリジンと反応して、２つの間に共有結合を形成するような最適なコンホメーションで、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に天然で結合する。

【0124】

[0089]本開示の方法および組成物においてＳｐｙＴａｇペプチドとして有用な例示的Ｃ末端ＣｎａＢ２ドメイン配列断片は、Ｌｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７からの下記の１３ａａのアミノ酸配列：ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号１）を含む。本開示の方法および組成物においてＳｐｙＴａｇペプチドとして有用な他のＣｎａＢ２ Ｃ末端配列断片は、ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫ（配列番号２）およびＡＨＩＶＭＶＤＡ（配列番号３）などの配列番号１のＳＰｙＴａｇペプチドより短い断片を含み得る。

【0125】

[0090]一部の実施形態においては、本開示の方法および組成物において有用なＳｐｙＴａｇペプチドは、ＳｐｙＴａｇがリンカーに共有結合されるのを可能にする修飾アミノ酸などのさらなるアミノ酸を含み得る。一部の実施形態においては、ＳｐｙＴａｇは、そのＮ末端で、４−アジド−Ｌ−ホモアラニン（「Ｌ−ａｈＡ」）などのアジド修飾アミノ酸を含み得ることが意図される。したがって、例示的ＳｐｙＴａｇペプチドは、下記アミノ酸配列：（Ｌ−ａｈＡ）ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号４）を含み得る。クリック化学および他の容易で高い効率の共有結合化学に有用なさまざまなアジド−、アルキン−および他の基で修飾されたアミノ酸は、当該技術分野で公知であり、市販されている（例えば、ｗｗｗ．ｊｅｎａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、ドイツを参照のこと）。

【0126】

[0091]ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、Ｌｙｓ３１を含むが、Ａｓｐ１１７を排除する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｃｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのＮ末端断片を含むさまざまなアミノ酸配列を含み得る。

【0127】

[0092]一部の実施形態においては、本開示の方法において有用なＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、配列番号２の１３８ａａのアミノ酸配列を含み得る。
[0093]本開示の方法においてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質として有用な化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｃｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢのＣｎａＢ２ドメインは、Ｌｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７からの下記の１４４ａａのアミノ酸配列を含み得る：
ＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩＶＭＶＤＡ（配列番号５）。

【0128】

[0094]本開示の方法においてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質として有用な例示的Ｎ末端ＣｎａＢ２ドメイン配列断片は、下記の１２９ａａのアミノ酸配列を含む：
ＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩ（配列番号６）。一部の実施形態においては、本開示の方法においてＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質として有用なＮ末端ＣｎａＢ２ドメイン配列断片は、Ｌｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜３１７からの下記の１３８ａａのアミノ酸配列を含む：
ＳＹＹＨＨＨＨＨＨＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩ（配列番号７）。

【0129】

[0095]本開示の方法およびコンジュゲート組成物において有用なＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、精製および生体分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）への融合を容易にするためにＮおよびＣ末端にさらなるアミノ酸リンカーを含み得ることが意図される。さらなるアミノ酸配列（例えば、Ｎ末端ＨｉｓタグおよびＣ末端ＧＧＳリンカー）を含む例示的ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質は、下記の１４３ａａの配列を有する：
ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＳＧＤＹＤＩＰＴＴＥＮＬＹＦＱＧＡＭＶＤＴＬＳＧＬＳＳＥＱＧＱＳＧＤＭＴＩＥＥＤＳＡＴＨＩＫＦＳＫＲＤＥＤＧＫＥＬＡＧＡＴＭＥＬＲＤＳＳＧＫＴＩＳＴＷＩＳＤＧＱＶＫＤＦＹＬＹＰＧＫＹＴＦＶＥＴＡＡＰＤＧＹＥＶＡＴＡＩＴＦＴＶＮＥＱＧＱＶＴＶＮＧＫＡＴＫＧＤＡＨＩＧＧＳ（配列番号８）。

【0130】

[0096]本開示の方法および組成物の一部の実施形態においては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質および生体分子の融合物を使用することができることが意図される。一部の実施形態においては、融合物は、そのＣ末端を介して生体分子ａａ配列のＮ末端に結合されるＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質配列を含み、ここで、融合物は、任意選択で、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と生体分子との間にポリペプチドリンカー配列を含む。

【0131】

[0097]同様に、ＳｐｙＴａｇペプチドは、Ａｓｐ１１７を含むが、Ｌｙｓ３１を排除する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｃｏｇｅｎｅｓ）フィブロネクチン結合タンパク質ＦｂａＢ由来のＣｎａＢ２ドメインのＣ末端断片を含むさまざまなアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態においては、本開示の方法および組成物において有用なＳｐｙＴａｇペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含み得る。一実施形態においては、ＳｐｙＴａｇペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0132】

[0098]ステップ（ｃ）
[0099]ステップ（ｃ）は、構造式（ＩＶ）の修飾タンパク質の反応性基Ｂと、生体分子の反応性基Ｚとの間の最終的な共有結合形成反応を含む。この反応は、式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲート組成物の形成をもたらす。上述するように、反応性基ＢおよびＺの選択は、ステップ（ｃ）に適した反応条件に影響する。ＮＣＬ反応条件およびＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ反応条件はともに、当該技術分野で周知であり、本開示のステップ（ｃ）反応において有用である。（例えば、Ｄａｗｓｏｎら、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６、７７６〜７７９、ＺａｋｅｒｉおよびＨｏｗａｒｔｈ（２０１０）ＪＡＣＳ １３２：４５２６〜７、およびＬｉら（２０１４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３；４２６（２）：３０９〜３１７を参照のこと）。

【0133】

[0100]ステップ（ｃ）反応の生成物である式（Ｖ）のタンパク質−生体分子コンジュゲート組成物の種々の実施形態は、式（Ｖｂ）〜（Ｖｍ）の化合物として、以下で表１０において示す。

【0134】

[0101]

【0135】

【表10-1】

【0136】

【表10-2】

【0137】

【表10-3】

【0138】

【表10-4】

【0139】

[0102]ステップ（ａ）〜（ｃ）を含む開示する部位選択的コンジュゲーション方法は、比較的低濃度で、かつ一方の試薬が他方の試薬に対して大幅なモル過剰ではない場合に、タンパク質と他の生体分子との間の迅速で効率的なコンジュゲーションを可能にする。したがって、本明細書において開示するコンジュゲートの組成物およびそれらを調製する化学プロセスは、ＤＮＡポリメラーゼなどの生体分子に共有結合された膜中に埋め込まれた細孔形成性タンパク質を含むナノポア組成物を調製する際の使用に特に適合している。このようなナノポア組成物は、単一分子合成時解読を含むナノポア検出を要する用途において使用することができる。

【0140】

[0103]本明細書において開示するステップ（ａ）〜（ｃ）を含む一般的な部位選択的コンジュゲーション方法は、タンパク質の天然に存在する形態および天然に存在しない（例えば、操作されたか、または組換え）形態の両方で、幅広い細孔形成性タンパク質とともに使用することができる。幅広い細孔形成性タンパク質が、当該技術分野で公知であり、本明細書において提供するコンジュゲーション試薬および方法は、それらの共通のアミノ酸高分子構造に起因して、それらに広く適用可能であるはずである。したがって、本開示の一部の実施形態においては、ステップ（ａ）〜（ｃ）を含む方法において使用される細孔形成性タンパク質は、α−溶血素、β−溶血素、γ−溶血素、アエロリジン、溶血毒、ロイコシジン、メリチン、ＭｓｐＡポリンおよびポリンＡからなる群から選択される。

【0141】

[0104]本明細書において開示するステップ（ａ）〜（ｃ）を含む部位選択的コンジュゲーション方法の驚くべき利点は、細孔形成性タンパク質および生体分子がともに、大きなタンパク質であり、したがって反応溶液中で比較的低濃度でのみ利用可能であるとしても、式（Ｖ）のコンジュゲート組成物が、迅速かつ効率的に形成されることである。例えば、式（Ｉ）のコンジュゲート組成物の調製方法の一部の実施形態においては、タンパク質および／または生体分子は、１０００μＭ、７５０μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１００μＭ、５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、もしくは１μＭまたはそれ未満の濃度で、反応溶液中に存在する。

【0142】

[0105]ステップ（ａ）〜（ｃ）を含む迅速かつ効率的な部位選択的コンジュゲーション方法は、このような低い反応物濃度を可能にするので、はるかに大きな分子量範囲のタンパク質および生体分子の組成物および調製方法。したがって、本明細書において開示する組成物および調製方法の一部の実施形態においては、タンパク質は、少なくとも２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、またはそれを超える分子量を有する。組成物の一部の実施形態において、生体分子は、少なくとも３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、またはそれを超える分子量を有する。一部の実施形態においては、タンパク質は、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有し、生体分子は、少なくとも５０ｋＤａの分子量を有する。

【0143】

[0106]さらに、ステップ（ａ）〜（ｃ）を含む部位選択的コンジュゲーション方法は、タンパク質が大きな多量体タンパク質複合体の一部である式（ＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）のコンジュゲートの形成を可能にする驚くべき利点を有する。したがって、本明細書において開示する組成物および調製方法の一部の実施形態においては、タンパク質は、多量体複合体の一部である細孔形成性タンパク質であり、ここで、多量体は、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、またより大きな多量体から選択される。一部の実施形態においては、細孔形成性タンパク質は、多量体複合体の一部である単一モノマーであり、複合体の他のモノマーは、ステップ（ａ）〜（ｃ）の方法において修飾されない（即ち、多量体の単一モノマーが、生体分子にコンジュゲートされる）。

【0144】

[0107]一般的に、本開示の実施形態において有用な細孔形成性タンパク質は、膜中でナノポアを自発的に自己集合させることが可能であり、ここで、ナノポアは、約０．５ナノメートル〜約２５ナノメートルの範囲の直径を有する。本明細書において開示する組成物および方法の一部の実施形態においては、タンパク質は、膜中に埋め込まれ、それにより膜（または他のバリア材料）を通ってナノポアを形成している細孔形成性タンパク質である。したがって、一部の実施形態においては、タンパク質は、ナノポアの一部である細孔形成性タンパク質であり、および／またはナノポアを形成する多量体タンパク質複合体もしくは集合体の一部である。

【0145】

[0108]細孔形成性タンパク質が、α−ＨＬである場合、α−ＨＬモノマーの七量体複合体は、脂質二重層中にナノポアを自発的に形成し得る。６：１の比の天然α−ＨＬ対変異体α−ＨＬを含むα−ＨＬの七量体がナノポアを形成し得ることが示されている（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）、およびそこで引用される参照文献を参照のこと）。したがって、一部の実施形態においては、本開示の組成物および方法は、ナノポアを含むことができ、ここで、ナノポアは、６：１の天然α−ＨＬ対α−ＨＬ−Ｃ４６を有する七量体α−ＨＬ複合体を含み、さらに、α−ＨＬ−Ｃ４６は、ステップ（ａ）〜（ｃ）を実行する際に生体分子にコンジュゲートされる。一部の実施形態においては、ナノポアにコンジュゲートされる生体分子は、ＤＮＡポリメラーゼである。

【0146】

[0109]さらに、タンパク質が、ナノポアを形成した多量体複合体の一部である細孔形成性タンパク質であるステップ（ａ）〜（ｃ）を含む部位選択的コンジュゲーション方法を実行することができることが意図される。したがって、一部の実施形態においては、コンジュゲートを形成する方法は、まず細孔形成性タンパク質を含むナノポアを形成すること、続いて細孔形成性タンパク質が多量体の一部である方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を実行することを含む。したがって、一部の実施形態においては、本開示は、七量体α−ＨＬナノポアを含む組成物を提供し、ここで、α−ＨＬモノマー単位の少なくとも１つが、式（ＩＩ）、式（ＩＶ）および式（Ｖ）の化合物で見られるように共有結合的に修飾される。一部の実施形態においては、七量体α−ＨＬナノポアは、６個の天然α−ＨＬモノマーおよび式（ＩＩ）の化合物で見られるようにクリック反応性基Ｘで共有結合的に修飾されたアミノ酸残基を含む１個のα−ＨＬ変異体モノマーを含む。一部の実施形態においては、１個のα−ＨＬ変異体モノマーは、単一システイン残基を含むα−ＨＬ−Ｃ４６である。

【0147】

[0110]一部の実施形態においては、タンパク質が溶液中に存在するナノポアの一部である細孔形成性タンパク質であるステップ（ａ）〜（ｃ）を含む部位選択的コンジュゲーションを実行することができることが意図される。しかしながら、同様に、細孔形成性タンパク質が、例えば共有結合または非共有結合により（直接的にまたは間接的に）固体支持体に固定化されたナノポアの一部であるステップ（ａ）〜（ｃ）のコンジュゲーション方法の一部の実施形態を実行することができることも意図される。

【0148】

[0111]本開示の式（Ｖ）の細孔形成性タンパク質コンジュゲート組成物を含むナノポアは、単一分子核酸シーケンシングなどの典型的なナノポア用途およびデバイスにおいて使用することができることが意図される。ナノポアデバイスならびにそれを作製および使用する方法は、例えば、米国特許第７，００５，２６４Ｂ２号、同７，８４６，７３８号、同６，６１７，１１３号、同６，７４６，５９４号、同６，６７３，６１５号、同６，６２７，０６７号、同６，４６４，８４２号、同６，３６２，００２号、同６，２６７，８７２号、同６，０１５，７１４号、同５，７９５，７８２号、および米国特許出願公開第２０１３／０２６４２０７号、同２０１３／０２４４３４０号、同２００４／０１２１５２５号、および同２００３／０１０４４２８号に開示され、それらは各々、参照によりそれらの全文が本明細書に組み込まれる。このようなナノポア実施形態においては、細孔形成性タンパク質は通常、固体基板に結合された膜中に埋め込まれる。通常、固体基板は、ポリマー、ガラス、シリコン、およびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む。さらに、固体基板は、ナノポアに隣接して、センサー、検出回路、または検出回路に連結された電極、任意選択で、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路をさらに含むことができる。

【0149】

[0112]一般的に、本開示の実施形態において有用な生体分子は、細孔形成性タンパク質とコンジュゲートして、それによりナノポアおよび付随するナノポア検出システムに隣接して配置することが望ましい可能性がある任意のタンパク質または核酸であり得る。一実施形態においては、本開示のコンジュゲート組成物は、ナノポアベースの核酸シーケンシングデバイスにおいて使用することができることが意図される。したがって、本明細書において開示する組成物および方法の一部の実施形態においては、生体分子は、ヌクレオチドポリマーの合成を触媒することが可能な酵素である。一部の実施形態においては、生体分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＤＮＡリガーゼからなる群から選択される酵素である。一部の実施形態においては、生体分子は、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および強力な鎖置換活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する天然に存在するか、または天然に存在しない（例えば、操作された）酵素である。

【0150】

[0113]幅広いポリメラーゼおよびリガーゼが、当該技術分野で公知であり、本明細書において提供するコンジュゲーション試薬および方法は、それらの共通のアミノ酸高分子構造に起因して、それらに広く適用可能であるはずである。本開示の組成物および方法において使用できる例示的ポリメラーゼとして、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．７の酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、クラスＥＣ２．７．７．６またはＥＣ２．７．７．４８の酵素）、逆転写酵素（例えば、クラスＥＣ２．７．７．４９の酵素）、およびＤＮＡリガーゼ（例えば、クラスＥＣ６．５．１．１の酵素）などの核酸ポリメラーゼが挙げられる。一部の実施形態においては、生体分子は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態においては、生体分子は、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼの大断片を含む。一実施形態においては、生体分子は、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔ２．０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡから市販されている）である。一部の実施形態においては、生体分子は、９°Ｎポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（エキソ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。

【0151】

[0114]一部の実施形態においては、本開示の方法およびコンジュゲート組成物において有用なＤＮＡポリメラーゼはＰｏｌ６であり、それは、下記の７２６ａａの配列を有する：

【0152】

【化19】

【0153】

[0115]本明細書において別の場所に記載したように、生体分子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質の融合ポリペプチドは、本開示の方法および組成物において使用することができる。したがって、一部の実施形態においては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質配列とＨｉｓタグおよび配列番号８のリンカーおよび配列番号９の７２６アミノ酸Ｐｏｌ６ポリメラーゼ配列との融合物。本開示の方法および組成物において有用なＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ６およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質のこのような例示的融合ポリペプチドの１つは、下記８７５アミノ酸配列を含む：

【0154】

【化20】

【0155】

[0116]配列番号１０の例示的８７５ａａＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６融合ポリペプチド配列が、幅広い縮重ヌクレオチド（ｎｔ）コード配列のいずれかによってコードされ得ることは、当業者に理解されよう。一実施形態においては、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６融合配列は、２６１０ｎｔ配列によってコードされる：

【0156】

【化21】

【0157】

[0117]特定の実施形態においては、本開示は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、および式（Ｖ）の化合物を含むステップ（ａ）〜（ｃ）の方法および関連組成物を提供し、ここで、リンカーＬ_ＡおよびＬ_Ｂは独立に、以下で表１１において示す式（ＶＩａ）〜式（ＶＩｅ）の構造からなる群から選択される。

【0158】

[0118]

【0159】

【表11】

【実施例】

【0160】

実施例１
クリック化学およびネイティブケミカルライゲーションを使用した細孔形成性タンパク質の、ポリメラーゼへの部位選択的コンジュゲーション
[0119]この実施例は、本明細書において開示するステップ（ａ）〜（ｃ）の部位選択的コンジュゲーション方法の使用について説明し、ここで、ＢおよびＺ反応性基は、ステップ（ｃ）においてネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）を起こす。この実施例は、図１において模式的に描写するように、七量体ナノポア複合体の一部であるα−ＨＬ−Ｃ４６細孔形成性タンパク質のシステイン側鎖がＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）のＮ末端にコンジュゲートされる式（Ｖ）の組成物の調製を実証する。

【0161】

[0120]材料および方法
[0121]Ａ．細孔形成性タンパク質（例えば、α−ＨＬ）精製：使用する細孔形成性タンパク質モノマーは、ともに精製用の６−Ｈｉｓタグとともにコードされる天然α−ＨＬおよび操作されたα−ＨＬ−Ｃ４６である。６−Ｈｉｓタグを有する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）α−ＨＬモノマーのＫ４６Ｃ（システインで置換された４６位のリジン）変異体（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）は、標準的なタンパク質工学技術を使用して調製される（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびＰａｌｍｅｒら（１９９３）を参照のこと）。天然α−ＨＬおよびα−ＨＬ−Ｃ４６モノマーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換え的に発現されて、標準的な技術を使用して、アフィニティー精製される。簡潔に述べると、野生型α−ＨＬおよびα−ＨＬ−Ｃ４６は、「ＰｒｅｐＥａｓｅ」Ｈｉｓタグ付きタンパク質精製キット（ＵＳＢ−Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）に関するプロトコールに記載されるように精製し、１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ｐＨ７．２の１ｍＭトリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）を有する１×ＰＢＳに交換する。α−ＨＬ精製ステップは全て、還元剤（ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）の存在下で実施される。

【0162】

[0122]Ｂ．６：１の七量体ナノポア形成：精製したα−ＨＬ−Ｃ４６を、下記の通りに、脂質の存在下で野生型α−ＨＬと混合して、七量体を形成する。天然α−ＨＬモノマー対α−ＨＬ−Ｃ４６変異体モノマーの最適な６：１の比を有する七量体細孔複合体を得るために、オリゴマー化には１１：１の比を使用する。脂質（１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、粉末、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を、ｐＨ８．０の、５０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ中で５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、４０℃にて３０分間添加する。透明化することによって評価する場合、５％オクチル−ベータ−グルコシド（β−ＯＧ）をｐｏｐ小胞に添加して、タンパク質を可溶化させる。次に、１００Ｋ ＭＷＣＯフィルターを使用して、試料を濃縮して、２４０００ＲＰＭで３０分間回転させて、沈殿したタンパク質をペレット化する。サイズ排除カラムをｐＨ７．５の３０ｍＭ βＯＧ、７５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳで平衡化した後、濃縮した試料５００μＬを低圧でロードして、七量体６：１α−ＨＬ細孔複合体をモノマーと分離させる。２つの連続したサイズ排除カラムにおいて５ｍＬに濃縮した後、試料をＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）上にロードする。さらに、ＦＰＬＣを使用して、６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６細孔を、異なるサブユニット量論（例えば、７：０、５：２）を有するものと分離する。ＦＰＬＣ移動相は、Ａ、ランニングバッファー：ｐＨ５の２０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｂ、溶出バッファー：ｐＨ５の２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で構成される。精製は、２１分間にわたる均一濃度の１００％Ａ、続いて２０分間の０〜１００％Ｂの線形勾配、次にさらに２分間にわたる均一濃度の１００％Ｂで実施する。流速は、１ｍｌ／分である。純粋な天然７：０のα−ＨＬ七量体細孔複合体がまず溶出し、６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６七量体細孔複合体は、保持時間約２４．５分から約２５．５分で溶出した。

【0163】

[0123]Ｃ．ステップ（ａ）のＤＢＣＯ−マレイミド試薬反応および式（ＩＩ）のＤＢＣＯ修飾細孔形成性タンパク質の単離：還元剤ＴＣＥＰまたはＤＴＴを、バッファー交換によって、精製した６：１の七量体α−ＨＬナノポア複合体から除去して、コンジュゲーションバッファーのｐＨを、ｐＨ７に調節する。ＤＢＣＯマレイミド試薬（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、Ａ１０８Ｐ−１００）を、無水ＤＭＦ中で１００ｍＭ濃度になるように溶解する。マレイミド試薬を、タンパク質よりも１０倍過剰で添加して、混合物を４℃で一晩インキュベートする。過剰なマレイミド試薬を、次の反応ステップ前にバッファー交換によってＤＭＣＯ修飾ナノポア反応混合物と分離する。

【0164】

[0124]Ｄ．式（ＩＩＩ）のアジド修飾ベンジルチオエステル同族クリック試薬の調製：アジドチオエステル同族クリック試薬の合成は、以下に示す一般的な反応スキームを使用して実行する。

【0165】

【化22】

【0166】

[0125]簡潔に述べると、ＤＭＦ（２ｍＭ）中のアジド−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ（０．１ｇ、０．０００２６ｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＦ（３ｍＬ）中のベンジルメルカプタン（３６μＬ、０．０００３１ｍｏｌ、１．２当量）およびトリエチルアミン（１０８μＬ、０．０００７７ｍｏｌ、３当量））の溶液に室温で滴下する。得られた反応混合物を、室温（ＲＴ）で攪拌して、反応の進行を、ＴＬＣによってモニタリングする。完了時に、この反応混合物をジクロロメタン中に希釈して、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液で洗浄して、水２×１００ｍＬで洗浄して、続いて乾燥させる（Ｎａ_２ＳＯ_４）。得られた油状物質を、フラッシュクロマトグラフ（ヘキサン：ＥＡ混合物１０：１中のＳｉＯ_２）上で分離させて、生成物０．０６ｇを生成する（収率およそ５８％）。得られたアジド修飾ベンジルチオエステルの質量スペクトルは、３９９（Ｍ＋１）に主要イオンを有する。アジド修飾ベンジルチオエステル化合物を、１４７ｍＭの濃度になるようにＤＭＦ中に溶解する。

【0167】

[0126]Ｅ．式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物のステップ（ｂ）におけるクリック反応ならびに式（ＩＶ）のベンジルチオエステル修飾細孔タンパク質の単離／精製：この実施例のステップＤで調製される式（ＩＩＩ）のアジド修飾ベンジルチオエステル化合物を、この実施例のステップＣで調製されるＤＢＣＯ−マレイミド修飾細孔タンパク質ナノポア複合体に１０倍過剰で添加する。得られた混合物を４℃で一晩反応させる。１８時間後、式（ＩＶ）のベンジルチオエステル修飾細孔タンパク質を、バッファー交換によって過剰の未反応化合物と分離させる（脱塩）。

【0168】

[0127]Ｆ．式（Ｖ）の部位特異的α−ＨＬ−ポリメラーゼコンジュゲートを生じるネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）反応：Ｎ末端システインで操作したＰｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、およびステップＥで調製される式（ＩＶ）のベンジルチオエステル修飾細孔タンパク質（６：１のナノポア複合体として）を、ネイティブケミカルライゲーション触媒である４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）とともに、それぞれ１０：１：１００の相対比で、４℃にて１８時間インキュベートする。予想されるα−ＨＬ−ポリメラーゼコンジュゲートは、ゲル電気泳動によって、および本明細書において別の場所に記載したように、ナノポアシーケンシング実験を実施することによって特性決定される。

【0169】

実施例２
クリック化学およびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇ反応を使用した細孔形成性タンパク質の、ポリメラーゼへの部位選択的コンジュゲーション
[0128]この実施例は、ステップ（ｃ）においてＳｐｙＴａｇペプチドの、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質への反応を提供するＢおよびＺ反応性基を用いた本明細書において開示するステップ（ａ）〜（ｃ）の部位選択的コンジュゲーション方法の使用について説明する。この実施例は、図２において模式的に示すように、七量体ナノポア複合体の一部であるα−ＨＬ−Ｃ４６細孔形成性タンパク質のＳｐｙＴａｇ修飾Ｃ４６残基がＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６ ＤＮＡポリメラーゼ融合物に部位特異的にコンジュゲートされる式（Ｖ）の組成物の調製を実証する。

【0170】

[0129]材料および方法
[0130]Ａ．細孔形成性タンパク質（例えば、α−ＨＬ）精製：使用する細孔形成性タンパク質モノマーは、ともに精製用の６−Ｈｉｓタグとともにコードされる天然α−ＨＬおよび操作されたα−ＨＬ−Ｃ４６である。６−Ｈｉｓタグを有する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）α−ＨＬモノマーのＫ４６Ｃ（システインで置換された４６位のリジン）変異体（「α−ＨＬ−Ｃ４６」）は、標準的なタンパク質工学技術を使用して調製される（例えば、Ｖａｌｅｖａら（２００１）およびＰａｌｍｅｒら（１９９３）を参照のこと）。天然α−ＨＬおよびα−ＨＬ−Ｃ４６モノマーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換え的に発現されて、標準的な技術を使用して、アフィニティー精製される。簡潔に述べると、野生型α−ＨＬおよびα−ＨＬ−Ｃ４６は、「ＰｒｅｐＥａｓｅ」Ｈｉｓタグ付きタンパク質精製キット（ＵＳＢ−Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）に関するプロトコールに記載されるように精製し、１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ｐＨ７．２の１ｍＭトリス−カルボキシエチル−ホスフィン（ＴＣＥＰ）を有する１×ＰＢＳに交換する。α−ＨＬ精製ステップは全て、還元剤（ＴＣＥＰまたはＤＴＴ）の存在下で実施される。

【0171】

[0131]Ｂ．６：１の七量体ナノポア形成：精製したα−ＨＬ−Ｃ４６を、下記の通りに、脂質の存在下で野生型α−ＨＬと混合して、七量体を形成する。天然α−ＨＬモノマー対α−ＨＬ−Ｃ４６変異体モノマーの最適な６：１の比を有する七量体細孔複合体を得るために、重合には１１：１の比を使用する。脂質（１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、粉末、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ中で５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、４０℃にて３０分間添加する。透明化することによって評価する場合、５％オクチル−ベータ−グルコシド（β−ＯＧ）をｐｏｐ小胞に添加して、タンパク質を可溶化させる。次に、１００Ｋ ＭＷＣＯフィルターを使用して、試料を濃縮して、２４０００ＲＰＭで３０分間回転させて、沈殿したタンパク質をペレット化する。サイズ排除カラムをｐＨ７．５の３０ｍＭ βＯＧ、７５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳで平衡化した後、濃縮した試料５００μＬを低圧でロードして、七量体６：１α−ＨＬ細孔複合体をモノマーと分離させる。２つの連続したサイズ排除カラムにおいて５ｍＬに濃縮した後、試料をＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）上にロードする。さらに、ＦＰＬＣを使用して、６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６細孔を、異なるサブユニット量論（例えば、７：０、５：２）を有するものと分離する。ＦＰＬＣ移動相は、Ａ、ランニングバッファー：ｐＨ５の２０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｂ、溶出バッファー：ｐＨ５の２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で構成される。精製は、２１分間にわたる均一濃度の１００％Ａ、続いて２０分間の０〜１００％Ｂの線形勾配、次にさらに２分間にわたる均一濃度の１００％Ｂで実施する。流速は、１ｍｌ／分である。純粋な天然７：０のα−ＨＬ七量体細孔複合体がまず溶出し、６：１のα−ＨＬ：α−ＨＬ−Ｃ４６七量体細孔複合体は、保持時間約２４．５分から約２５．５分で溶出した。

【0172】

[0132]Ｃ．ステップ（ａ）のＤＢＣＯ−マレイミド試薬反応および式（ＩＩ）のＤＢＣＯ修飾細孔形成性タンパク質の単離：還元剤ＴＣＥＰまたはＤＴＴを、バッファー交換によって、精製した６：１の七量体α−ＨＬナノポア複合体から除去して、コンジュゲーションバッファーのｐＨを、ｐＨ７に調節する。ＤＢＣＯマレイミド試薬（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、Ａ１０８Ｐ−１００）を、無水ＤＭＦ中で１００ｍＭ濃度になるように溶解する。マレイミド試薬を、タンパク質よりも１０倍過剰で添加して、混合物を４℃で一晩インキュベートする。過剰なマレイミド試薬を、次の反応ステップ前にバッファー交換によってＤＭＣＯ修飾ナノポア反応混合物と分離する。

【0173】

[0133]Ｄ．式（ＩＩＩ）のアジド修飾ＳｐｙＴａｇ同族クリック試薬の調製：Ｎ末端Ｌ−アジド−ホモアラニン（「ａｈＡ」）残基を有するＳｐｙＴａｇペプチドアミノ酸配列ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号１）を合成し、標準的な自動ペプチド合成方法を使用して精製する。式（ＩＩＩ）の得られたＮ−アジド−修飾ＳｐｙＴａｇ同族クリック試薬は、配列ａｈＡ−ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号４）を有する。このＳｐｙＴａｇ同族クリック反応は、次のステップにおける使用のために、ｐＨ７．０の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（「コンジュゲーションバッファー」）中に溶解する。

【0174】

[0134]Ｅ．ステップ（ｂ）における式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の化合物のクリック反応に関する条件ならびに式（ＩＶ）のＳｐｙＴａｇ修飾細孔タンパク質の任意の中間体単離または精製：１０倍過剰のＳｐｙＴａｇ同族クリック試薬（ステップＤで調製される）を、ＤＢＣＯ修飾細孔形成性タンパク質（ステップＣで調製される）に添加する。得られたクリック反応混合物を４℃で一晩反応させる。１８時間後、式（ＩＶ）の得られたＳｐｙＴａｇ修飾細孔タンパク質を、バッファー交換によって任意の過剰の未反応同族クリック試薬と分離させる（脱塩）。

【0175】

[0135]Ｆ．ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６ポリメラーゼ融合タンパク質の調製：配列番号９のＰｏｌ６ポリメラーゼをコードする配列は、配列番号８のＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質配列をコードする配列がポリメラーゼのＮ末端から伸長するように組換え的に修飾する。得られたＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６融合物は、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、それは、アフィニティー精製用のＮ末端ＨｉｓタグおよびＰｏｌ６と、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒとの間のＧＧＳペプチドリンカーを含む。融合物構築物は、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされる。

【0176】

[0136]Ｇ．ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＳｐｙＴａｇコンジュゲーション反応および式（Ｖ）のα−ＨＬ−ポリメラーゼの最終生成物コンジュゲートの単離：ＳｐｙＴａｇ修飾α−ＨＬ細孔タンパク質を含むナノポア複合体（ステップＥで調製される）を、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−Ｐｏｌ６融合物（ステップＦで調製される）とともに、１：４のモル比で、４℃にて一晩インキュベートする。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質およびＳｐｙＴａｑペプチドは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質のリジン残基と、ＳｐｙＴａｇペプチドのアスパラギン酸残基との間で自発的な共有結合形成反応を起こす。この共有結合形成は、Ｐｏｌポリメラーゼを、式（Ｖｍ）によって本明細書において一般的に示される七量体ナノポア複合体のα−ＨＬ−Ｃ４６にコンジュゲートする特異的な結合をもたらす。部位特異的コンジュゲートの形成は、ゲル電気泳動により、および実施例３に記載するように、ナノポアシーケンシングのためのコンジュゲートの使用により特性決定される。

【0177】

実施例３
ナノポアアレイにおける実施例２で調製するようなα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ ＳｐｙＴａｇ−ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒコンジュゲートを使用したナノポアシーケンシング
[0137]この実施例は、核酸をシーケンシングするためのナノポアアレイにおける、実施例２で見られるように調製されるα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアコンジュゲートの使用について説明する。α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアコンジュゲートは、個々にアドレス可能な集積回路チップのアレイ上に形成される膜中に埋め込まれている。このα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポアアレイは、ＪＡＭ１Ａ自己プライミングＤＮＡ鋳型および４つのヌクレオチドｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴに相当する４つの異なる５’にタグ付けされたヌクレオチド基質の組に曝露される。ＤＮＡ鋳型に相補的である特異的な５’−タグ付きヌクレオチドは、Ｐｏｌ６ポリメラーゼ活性部位に捕捉および結合されるため、タグ部分の「尾部」は、すぐ近くにコンジュゲートされるα−ＨＬナノポアの中に配置されるようになる。ＡＣ電位の印加の下で、細孔におけるタグの存在は、開放細孔電流（即ち、ナノポアにおいてタグを有さない場合の電流）と比較して特有の阻止電流を引き起こす。Ｐｏｌ６が鋳型に相補的な鎖を合成する場合に測定される阻止電流の配列により、ＤＮＡ鋳型の配列が同定される。

【0178】

[0138]ナノポア検出システム：ナノポア阻止電流測定は、浅いウェル内に１２８，０００個の銀電極のアレイを有するＣＭＯＳマイクロチップを含むナノポアアレイマイクロチップを使用して実施される（チップは、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡで製造される）。このようなナノポアアレイマイクロチップを製造および使用する方法はまた、米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０Ａ１号、同２０１３／０２６４２０７Ａ１号、および同２０１４／０１３４６１６Ａ１号に見出すことができ、それらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。アレイ中のウェルは各々、生物学的試薬および伝導性塩との不断の接触を可能にする表面修飾を有する標準的なＣＭＯＳプロセスを使用して製造される。ウェルは各々、ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートが埋め込まれたリン脂質二重膜を支持することができる。各ウェルでの電極は、コンピューターインターフェースによって個々にアドレス可能である。使用する試薬は全て、コンピューター制御されたシリンジポンプを使用して、アレイマイクロチップ上の簡素なフローセルに導入される。チップは、アナログからデジタルへの変換を支持し、独立に１秒当たり１０００ポイントを上回る速度で、全ての電極からの電気測定を報告する。ナノポア阻止電流測定は、１ミリ秒（ｍｓｅｃ）毎に少なくとも１回、アレイにおける１２８Ｋアドレス可能ナノポア含有膜各々で非同期的に行われて、インターフェースコンピューター上に記録され得る。

【0179】

[0139]チップ上の脂質二重層の形成：チップ上のリン脂質二重膜は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して調製される。脂質粉末を、１５ｍＭでデカン中に溶解して、続いてチップ上のウェルを横切る層において塗布する。次に、空気を、アレイウェルのｃｉｓ側を通してポンピングすることによって、薄化プロセスが開始され、したがって、多重層脂質膜を、単一二重層に低減させる。二重層形成は、０〜１０００ｍＶのランピング電圧を使用して検査する。典型的な単一二重層が、３００〜５００ｍＶの印加電圧で一時的に開放する。

【0180】

[0140]膜中のナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート挿入：脂質二重層がアレイチップのウェル上に形成した後、３μＭの５’タグ付きヌクレオチド、０．１μＭの６：１のα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲート、０．４μＭの所望の「ＪＡＭ１Ａ」ＤＮＡ鋳型（全てが、ｐＨ８の３ｍＭ ＣａＣｌ_２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、および５００ｍＭグルタミン酸カリウム、中のバッファー溶液中）を、２０℃でチップのシス側に添加する。混合物中のナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートは、脂質二重層へ自発的に挿入する。Ｃａ^２＋金属イオンみのみが存在し、Ｍｇ^２＋イオンは存在しないため、三元複合体は、Ｐｏｌ６活性部位で形成することが可能であるが、タグ付きヌクレオチドは組み込まれず、５’−リン酸連結タグは放出されない。

【0181】

[0141]「ＪＡＭ１Ａ」ＤＮＡ鋳型は、配列５’−ＴＴＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１２）を有する９９マーの自己プライミング一本鎖である。このＤＮＡ鋳型は、相補的ｄＴヌクレオチドとの結合のための、鋳型上の第１の利用可能な位置を有する。

【0182】

[0142]本実施例において、混合物中のポリメラーゼ基質として使用される４つのタグ付きヌクレオチドは、ｄＡ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ４−（ｉｄＳｐ−Ｔ）４−Ｔ１８−Ｃ３（配列番号１３）、ｄＣ６Ｐ−Ｃｙ３−Ｔ３０−Ｃ３（配列番号１４）、ｄＴ６Ｐ−Ｃｙ３−ｄＴ４（Ｎ３−ＣＥ−ｄＴ）３−ｄＴ２３−Ｃ３（配列番号１５）、ｄＧ６Ｐ−Ｔ６−Ｔｍｐ６−Ｔ１９−Ｃ３（配列番号１６）であった。しかしながら、２０１４年３月２４日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔａｇｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」とう表題の米国仮出願第６１／９６９，６２８号に記載されるものなどの、ナノポアデバイスに有用な幅広い５’−タグ付きヌクレオチドが利用可能であり、それは、全ての目的で、参照により本明細書に組み込まれる。

【0183】

[0143]ナノポア阻止電流測定：ナノポア電流遮断測定用の電解質溶液として使用するバッファー溶液は、２０℃の５００ｍＭ グルタミン酸カリウム、ｐＨ８、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＴＣＥＰである。Ｐｔ／Ａｇ／ＡｇＣｌ電極設定を使用して、−１０ｍＶ〜２００ｍＶ矩形波のＡＣ電流を印加する。ＡＣ電流は、それが、タグをナノポアへと反復的に誘導させて、続いてナノポアから排出させるのを可能にして、それにより検出に対してより多くの機会を提供するため、ナノポア検出に関してある特定の利点を有し得る。ＡＣ電流はまた、経時的に、より安定な電流シグナルおよび電極のより少ない分解のために、より定常的な電位を提供し得る。

【0184】

[0144]４つの別個の電流遮断事象を表すシグナルは、それらがＪＡＭ１Ａ ＤＮＡ鋳型でプライミングされたα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートによって捕捉されるため、４つの異なる５’タグ付きヌクレオチドから観察された。阻止電流事象の記録されたプロットを分析した。１０ｍ秒よりも長く持続し、０．８から０．２まで開放チャネル電流を低減する事象は、α−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートによる生産的ヌクレオチド捕捉を示すようであった。３つの異なる実験において、ＪＡＭ１Ａ ＤＮＡ配列は、非常に低いミスマッチコールを伴うが、不正確な挿入コールの幾つかの領域を伴って、４５％、４８％、および７３％の割合で正確にコールされた。これらの結果により、本開示の方法は、ナノポアデバイスを使用して、特異的なＤＮＡを検出および／またはシーケンシングすることが可能なα−ＨＬ−Ｐｏｌ６ナノポア−ポリメラーゼコンジュゲートを提供することができることが示される。さらに、アレイ条件のさらなる最適化は、より高度な正確な配列コールの割合をもたらすことができる。

【0185】

[0145]この出願で引用する刊行物、特許、特許出願および他の文書は全て、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が独立に、まるで全ての目的で、参照により組み込まれると示されたのと同程度にまで、全ての目的で参照によりそれらの全文が本明細書に組み込まれる。

【0186】

[0146]種々の特定の実施形態を説明および記載してきたが、本発明（複数可）の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変更が成され得ることが理解されよう。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]