特許 6959664 クプリアウィドゥス属細菌由来のナノ小胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6959664

(24)【登録日】2021年10月12日

(45)【発行日】2021年11月2日

(54)【発明の名称】クプリアウィドゥス属細菌由来のナノ小胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20211021BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20211021BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20211021BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20211021BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20211021BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALI20211021BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20211021BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20211021BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20211021BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20211021BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/06

   A61K35/74 BZNA

   A61P35/00

   A61P9/00

   A61P9/06

   A61P11/00

   A61P25/28

   A61P3/10

   A61P13/12

   A61P25/16

   A61P25/24

   A23L33/135

   C12Q1/689 Z

   C12N1/20 E

   C12N15/11 Z

   G01N33/50 P

   G01N33/53 M

【請求項の数】7

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2019-548319(P2019-548319)

(86)(22)【出願日】2019年2月20日

(65)【公表番号】特表2020-513799(P2020-513799A)

(43)【公表日】2020年5月21日

(86)【国際出願番号】KR2019002015

(87)【国際公開番号】WO2019164230

(87)【国際公開日】20190829

【審査請求日】2019年9月4日

(31)【優先権主張番号】10-2018-0020573

(32)【優先日】2018年2月21日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0018989

(32)【優先日】2019年2月19日

(33)【優先権主張国】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516348577

【氏名又は名称】エムディー ヘルスケア インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＤ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム、ユン−クン

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１８／００８８９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１８／０３０７３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１７−５１７５６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／００９６９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０２０−５０３０３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０２０−５０１５６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０２０−５０１５６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０２０−５０３０２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０２０−５０８０６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tumor Biology，2016年，Vol.37，p.15835-15845

【文献】 Journal of Microbiology and Biotechnology，2017年，Vol.27, No.4，p.791-807

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８９

Ａ６１Ｋ ３５／７４

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫及び炎症疾患からなる群より選択される１以上の疾病の予防又は治療用である、薬学的組成物。

【請求項2】

前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記小胞は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓから自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫及び炎症疾患からなる群より選択される１以上の疾病予防又は改善用食品組成物。

【請求項5】

前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであることを特徴とする、請求項４に記載の食品組成物。

【請求項6】

前記小胞は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓから自然的又は人工的に分泌されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の食品組成物。

【請求項7】

Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫及び炎症疾患からなる群より選択される１以上の疾病予防又は治療用である、吸入剤組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来のナノ小胞及びその使用に関し、より具体的には、クプリアウィドゥス属細菌に由来するナノ小胞を用いた癌、心血管疾患、肺疾患、代謝疾患及び神経−精神疾患などの診断方法、及び前記小胞を含む前記疾患の予防、改善又は治療用組成物などに関する。

【背景技術】

【0002】

２１世紀に入ってから、過去には伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が減る一方、ヒトとマイクロバイオームとの不調和により発生する免疫機能の異常を伴った慢性疾患が生活の質とヒトの寿命を決定する主要疾患となり疾病パターンが変わった。２１世紀の難治性慢性疾患として、癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患及び神経−精神疾患などが国民保健において大きい問題になっている。前記難治性慢性疾患は、原因因子による免疫機能の異常を伴った慢性炎症を特徴としている。

【0003】

人体に共生する微生物は１００兆に至り、ヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を越えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息地に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含んだ微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言う。

【0004】

人体に共生する細菌及び周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するためにナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子が通過できない物理的な防御膜を形成する。粘膜に共生する細菌の場合には粘膜を通過できないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートル以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過した後に人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来の小胞は、粘膜の上皮細胞あるいは皮膚角質細胞を通じて吸収されて局所炎症反応を誘導するだけでなく、人体に吸収されて各臓器に分布する。そして、吸収された臓器で免疫及び炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性菌に由来する小胞は、気道を通じて吸入されて肺気腫を誘発して慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）を誘導する。腸を通じて吸収された場合には、局所的に大腸炎を起こす。血管内では、血管内皮細胞炎症反応を通じて全身的な炎症反応及び血液凝固を促進させる。また、インシュリンが作用する筋肉細胞などに吸収されてインシュリン抵抗性と糖尿病を誘発する。一方、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能の異常を調節して疾病を調節することができる。

【0005】

細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下、ＩＬ）−１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応が発生する。これは、細菌由来の小胞に露出するとき、ＩＬ−６が分泌され、これがＴｈ１７免疫反応を誘導する。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程で大食細胞、好中球などのような炎症細胞から分泌される腫瘍怪死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ、以下、ＴＮＦ−α）が疾病の発生に重要な役目を担当する。

【0006】

クプリアウィドゥス属細菌（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐｐ．）は、好気性グラム陰性桿菌として土壌及び臨床検体から分離される。このうちクプリアウィドゥス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）は、毒性重金属に抵抗する特徴があり、酸素を通じたリン酸化を通じてエネルギーを生産し、一般的に、病原性がないことが知られている。また、クプリアウィドゥス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）、クプリアウィドゥス・タイワンエンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）などのクプリアウィドゥス種は、マメ科植物で窒素を固定する細菌として知られている。しかし、クプリアウィドゥス属の細菌が細菌外に小胞を分泌するという事実は報告されなかった。特に、癌、心血管疾患、肺疾患、代謝疾患及び神経−精神疾患などの難治性疾患の診断及び治療に応用した事例は報告されたことがない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、上記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、メタゲノム分析を通じて正常人に比べて胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫などの悪性疾患、心筋病症、心房細動、異形狭心症などの心臓疾患、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病、又は鬱病患者由来のサンプルからクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の含量が有意に減少していることを確認した。また、クプリアウィドゥス属細菌に属するクプリアウィドゥス・メタリデュランス（Ｃ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）菌から小胞を分離して大食細胞に処理したとき、病原性小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌を顕著に抑制すると同時にマウスモデルにおいて抗癌効果があることを確認し、これに基づいて本発明を完成した。

【0008】

そこで、本発明は、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、クプリアウィドゥス属由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防、改善又は治療用組成物を提供することを他の目的とする。

【0010】

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上記で言及した課題に制限されず、言及しなかったまた他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるべきである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記のステップを含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常人及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマー対を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常人に比べてクプリアウィドゥス属細菌由来の細胞外小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病に分類するステップ。

【0012】

また、本発明は、下記のステップを含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の診断方法を提供する：
（ａ）正常人及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマー対を用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常人に比べてクプリアウィドゥス属細菌由来の細胞外小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病に分類するステップ。

【0013】

本発明の一具現例で、前記ステップ（ａ）でのサンプルは、大便、血液、小便又は唾液であってもよい。

【0014】

本発明の他の具現例で、前記ステップ（ｂ）でのプライマー対は、配列番号１及び配列番号２のプライマーであってもよい。

【0015】

また、本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0016】

また、本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防又は改善用食品組成物を提供する。

【0017】

また、本発明は、クプリアウィドゥス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属細菌由来の小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防又は治療用吸入剤組成物を提供する。

【0018】

また、本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防又は治療方法を提供する。

【0019】

また、本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防又は治療のため使用を提供する。

【0020】

本発明の一具現例で、前記小胞は、平均直径が１０〜２００ｎｍであってもよい。

【0021】

本発明の他の具現例で、前記小胞は、クプリアウィドゥス属細菌から自然的又は人工的に分泌されるものであってもよい。

【0022】

本発明の他の具現例で、前記クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞であってもよい。

【発明の効果】

【0023】

本発明者らは、腸内細菌の場合には体内に吸収されないが、細菌由来の小胞の場合には上皮細胞を通じて体内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を通じて体外に排泄されることを確認し、患者の大便、血液、小便又は唾液などに存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を通じて胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病患者の大便、血液、小便又は唾液に存在するクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が正常人に比べて有意に減少していることを確認した。また、クプリアウィドゥス属細菌の一種であるクプリアウィドゥス・メタリデュランスを体外で培養して小胞を分離した後、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症媒介体の分泌を有意に抑制させることを確認したところ、本発明によるクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞は、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病に対する診断方法、及び前記疾患に対する予防、改善又は治療用組成物に有用に用いられ得ると期待される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１ａは、マウスに細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、血液、腎臓、肝臓その他の臓器を摘出して細菌と小胞の体内分布様相を評価した結果である。

【図2】図２〜図２ｃは、胃癌患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図２ａは大便、図２ｂは血液、図２ｃは小便を試料とした結果である。

【図3】図３ａ及び図３ｂは、大腸癌患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図３ａは、大便、図３ｂは、小便を試料とした結果である。

【図4】図４は、膵臓癌患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図5】図５は、胆管癌患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図6】図６ａ及び図６ｂは、乳癌患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図６ａは血液、図６ｂは小便を試料とした結果である。

【図7】図７ａ及び図７ｂは、卵巣癌患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図７ａは血液、図７ｂは小便を試料とした結果である。

【図8】図８ａ及び図８ｂは、膀胱癌患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図８ａは血液、図８ｂは小便を試料とした結果である。

【図9】図９は、前立腺癌患者及び正常人の小便に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図10】図１０は、頭頸部癌患者及び正常人の唾液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図11】図１１は、リンパ腫患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図12】図１２ａ〜図１２ｃは、心臓疾患患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図１２ａは心筋病症、図１２ｂは心房細動、図１２ｃは異形狭心症の場合を示す。

【図13】図１３は、脳卒中患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図14】図１４は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図15】図１５ａ〜図１５ｃは、糖尿病患者及び正常人に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果であって、図１５ａは血液、図１５ｂは小便、図１５ｃは唾液を試料とした結果である。

【図16】図１６は、腎不全患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図17】図１７は、認知症患者及び正常人の血液に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図18】図１８は、パーキンソン病患者及び正常人の小便に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図19】図１９は、鬱病患者及び正常人の小便に存在する細菌由来の小胞のメタゲノム分析を実施した後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。

【図20】図２０は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の細胞死滅効果を評価するために、前記小胞を大食細胞（Ｒａｗ２６４．７）に投与して細胞死滅程度を評価した結果である。

【図21】図２１は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗炎症及び免疫調節効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）処理前にクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症媒介体であるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌に及ぶ影響を評価した結果である。

【図22】図２２は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗癌効能を評価するために、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞をマウスに投与したプロトコルである。

【図23】図２３は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗癌効能を評価するために、クプリアウィドゥス・メタリデュランス小胞を腹腔（ＩＰ）又は経口（ＰＯ）で投与して、癌細胞による腫瘍発生に及ぶ影響を評価した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞及びその使用に関する。

【0026】

本発明者らは、メタゲノム分析を通じてクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が正常人に比べて癌、心血管疾患、肺疾患、代謝疾患及び神経−精神疾患患者の臨床サンプルで有意に減少していることを確認して、前記疾病を診断することができることを確認した。また、クプリアウィドゥス・メタリデュランス（Ｃ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）菌株から小胞を最初に分離して特性を分析した結果、前記菌株由来の小胞が病原性小胞による免疫機能の異常と炎症及び癌を調節することができることを確認した。

【0027】

さて、本発明は、下記のステップを含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常人及び被検者のサンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出するステップ；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて製作したプライマー対を用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を収得するステップ；及び
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常人に比べてクプリアウィドゥス属細菌由来の細胞外小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病に分類するステップ。

【0028】

本発明で用いられる用語「診断」とは、広い意味では患者の病気の実態を全ての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病状の詳細な様態、合併症の有無及び予後などである。本発明で「診断」は、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病及び／又は鬱病の発病有無及び疾患の程度などを判断することである。

【0029】

本発明において、前記サンプルは、大便、血液、小便又は唾液であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0030】

本発明で用いられる用語「メタゲノム」とは、「群遺伝体」とも言い、土壌、動物の腸など孤立した地域内の全てのウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝体の総合を意味するもので、主に培養されない微生物を分析するために配列分析器を用いて一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念として用いられる。特に、「メタゲノム」は、一種のゲノム、遺伝体を言うのではなく、一つの環境単位の全ての種の遺伝体として一種の混合遺伝体を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一つの種を定義するとき、機能的に既存の一種だけではなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から生じた用語である。技術的には、迅速配列分析法を用いて種に関係なく全てのＤＮＡ、ＲＮＡを分析し、一つの環境内での全ての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。

【0031】

本発明の他の様態として、本発明は、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病の予防、治療又は改善用組成物を提供する。前記組成物は、食品組成物、吸入剤組成物及び薬学的組成物を含み、本発明で食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。また、本発明の組成物は、口腔噴霧剤、鼻腔噴霧剤又は吸入剤の剤型であってもよい。

【0032】

本発明で用いられる用語「予防」とは、本発明による組成物の投与によって前記疾患を抑制するか発病を遅延させる全ての行為を意味する。

【0033】

本発明で用いられる用語「治療」とは、本発明による組成物の投与によって前記疾患に対する症状が好転するか利するように変更されるすべての行為を意味する。
本発明で用いられる用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。

【0034】

本発明で用いられる用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）」あるいは「小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜になった構造物を意味する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞、又は外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＯＭＶｓ）は、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけでなく、タンパク質、低分子化合物及び細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の小胞は、タンパク質、低分子化合物、核酸外にも細菌の細胞壁の構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）とリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、クプリアウィドゥス属細菌から自然的に分泌されるか又は人工的に生産するものであって、１０〜２００ｎｍの平均直径を有している。

【0035】

前記小胞は、クプリアウィドゥス属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルタによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動及び毛細管電気泳動からなる群より選択された一つ以上の方法を用いて分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮などの過程を追加で含むことができる。

【0036】

本発明の一実施例では、細菌及び細菌由来の小胞をマウスに経口投与して細菌及び小胞の体内吸収、分布及び排泄様相を観察した結果、細菌の場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに比べて、細菌由来の小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などを通じて排泄されることを確認した（実施例１参照）。

【0037】

本発明の他の実施例では、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病及び鬱病などの患者にと年齢と性別が対応した正常人の大便、血液、小便又は唾液から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した結果、正常人のサンプルに比べて胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病及び鬱病などの患者のサンプルでクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３〜実施例２０参照）。

【0038】

本発明のまた他の実施例では、前記実施例の結果を土台に、クプリアウィドゥス属細菌に属するクプリアウィドゥス・メタリデュランス種の細菌由来の小胞の特性を分析するために一層研究した結果、クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌株を培養してそれから分泌された小胞が抗炎症効果を示すかを評価し、多様な濃度のクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を大食細胞に処理した後、炎症疾患の原因因子である大腸菌由来の小胞を処理して炎症媒介体の分泌を評価した結果、大腸菌由来の小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌をクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例２２参照）。

【0039】

本発明のまた他の実施例では、クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌株を培養してそれから分泌された小胞が抗癌治療効果を示すかを評価した。そのために、癌細胞株をマウスの皮下に注射して癌モデルを作り、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を癌細胞株の処理４日前からマウスに経口又は腹腔で投与した後、２０日間癌組織のサイズを測定した結果、前記小胞を腹腔及び経口で投与した場合に、対照群に比べて癌組織のサイズが減少した。特に、経口投与した場合に顕著に減少していることを確認した（実施例２３参照）。

【0040】

本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リボソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤で製剤化することができる。適合な薬学的に許容される担体及び製剤化についてはレミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤型に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤又は経口摂取剤などに製剤化することができる。

【0041】

本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）でき、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。

【0042】

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効容量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の割合、治療期間、同時に用いられる薬物を含んだ要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤で投与するか他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次又は同時に投与され得、単一又は多重投与され得る。上記した要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。

【0043】

具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わることができ、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは、０．０１〜１００ｍｇを毎日又は隔日投与するか、１日１回〜３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減できるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

【0044】

本発明の吸入剤組成物は、有効成分を吸入剤にそのまま添加するか他の成分とともに用いてもよく、通常的な方法によって適切に用いてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防又は治療用）によって適切に決定され得る。

【0045】

本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加するか他の食品又は食品成分とともに用いてもよく、通常的な方法によって適切に用いてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防又は改善用）によって適切に決定され得る。一般的に、食品又は飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは、１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は前記範囲以下であってもよい。

【0046】

本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること以外に他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように多様な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロースなど；及びポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウディオサイドＡ、グリシルヒジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を好適に用いることができる。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決定され得る。

【0047】

上記外に、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立的に又は組み合わせて用いることができる。このような添加剤の割合も当業者により適切に選択され得る。

【0048】

以下、本発明の理解を助けるための好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

【実施例】

【0049】

（試験例１．腸内細菌及び細菌由来の小胞の体内吸収、分布及び排泄様相の分析）
腸内細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの容量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウスの全体イメージを観察した結果、図１ａに示したように、細菌の場合には全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞の場合には、投与５分後に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱で蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。

【0050】

また、腸内細菌と腸内細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、多くの臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を上記の方法のように投与した後、投与１２時間後に血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組職で蛍光を観察した結果、図１ｂに示したように、細菌由来の小胞が血液、心臓、肺、肝臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は吸収されないことが分かった。

【0051】

（試験例２．臨床サンプルで細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
血液、小便、大便又は唾液などの臨床サンプルを先に１０ｍｌチューブに入れ、遠心分離法（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めて上澄液のみを新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍのフィルタを用いて細菌及び異物を除去した後、遠心濾過機（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨てて１０ｍｌまで濃縮した。もう一度、０．２２μｍのフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）を用いてバクテリア及び異物を除去した後、Ｔｙｐｅ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を用いて上澄液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）でとかした。

【0052】

上記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして内部のＤＮＡを脂質の外から出るようにし、その後、氷に５分間冷やした。その後、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離して上澄液のみを集めた。そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来のＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）でＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。

【0053】

【表1】

【0054】

上記方法で抽出したＤＮＡを上記の１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを用いて増幅した後にシークエンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、その結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルに出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）分析のためには、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、網（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％のシーケンス類似度を基準にクラスタリングし、各ＯＴＵの門（ｐｈｙｌｕｍ）、網（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＲＮＡシーケンスデータベース（１０８，４５３シーケンス）を用いて属レベルで９７％以上のシーケンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。

【0055】

（試験例３．胃癌患者の大便、血液及び小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で胃癌患者６３人の大便と、性別と年齢をマッチングした正常対照群１２６人の大便を対象として、大便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の大便に比べて胃癌患者の大便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２及び図２ａ参照）。

【0056】

【表2】

【0057】

試験例２の方法で胃癌患者６７人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１９８人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて胃癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表３及び図２ｂ参照）。

【0058】

【表3】

また、試験例２の方法で胃癌患者６１人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群１２０人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて胃癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表４及び図２ｃ参照）。

【0059】

【表4】

【0060】

（試験例４．大腸癌患者の大便及び小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で大腸癌患者５２人の大便と、性別と年齢が対応した正常対照群８３人の大便を対象として、大便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の大便に比べて大腸癌患者の大便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表５及び図３ａ参照）。

【0061】

【表5】

【0062】

また、試験例２の方法で大腸癌患者３８人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群３８人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて大腸癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表６及び図３ｂ参照）。

【0063】

【表6】

【0064】

（試験例５．膵臓癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で膵臓癌患者２９１人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群２９１人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて膵臓癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表７及び図４参照）。

【0065】

【表7】

【0066】

（試験例６．胆管癌患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で胆管癌患者７９人の血液と、性別と年齢が対応したした正常対照群２５９人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて胆管癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表８及び図５参照）。

【0067】

【表8】

【0068】

（試験例７．乳癌患者の血液及び小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で乳癌患者９６人の血液と、性別と年齢が対応したした正常対照群１９２人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて乳癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表９及び図６ａ参照）。

【0069】

【表9】

【0070】

試験例２の方法で乳癌患者１２７人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群２２０人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて乳癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１０及び図６ｂ参照）。

【0071】

【表10】

【0072】

（試験例８．卵巣癌患者の血液及び小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で卵巣癌患者１３６人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１３６人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて卵巣癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１１及び図７ａ参照）。

【0073】

【表11】

【0074】

実施例２の方法で卵巣癌患者１３６人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群１３６人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて卵巣癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１２及び図７ｂ参照）。

【0075】

【表12】

【0076】

（試験例９．膀胱癌患者の血液及び小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で膀胱癌患者９６人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１８４人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて膀胱癌患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１３及び図８ａ参照）。

【0077】

【表13】

【0078】

また、試験例２の方法で膀胱癌患者９５人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群１５７人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて膀胱癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１４及び図８ｂ参照）。

【0079】

【表14】

【0080】

（試験例１０．前立腺癌患者の小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で前立腺癌患者５３人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群１５９人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて前立腺癌患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１５及び図９参照）。

【0081】

【表15】

【0082】

（試験例１１．頭頸部癌患者の唾液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で頭頸部癌患者５７人の唾液と、正常対照群２７７人の唾液を対象として、唾液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の唾液に比べて頭頸部癌患者の唾液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１６及び図１０参照）。

【0083】

【表16】

【0084】

（試験例１２．リンパ腫患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法でリンパ腫患者５７人の血液と、性別と年齢をマッチングした正常対照群１６３人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べてリンパ腫患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１７及び図１１参照）。

【0085】

【表17】

（試験例１３．心臓疾患患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で心筋病症患者７２人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１６３人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて心筋病症患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１８及び図１２ａ参照）。

【0086】

【表18】

【0087】

実施例２の方法で心房細動患者３４人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群６３人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて心房細動患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表１９及び図１２ｂ参照）。

【0088】

【表19】

【0089】

試験例２の方法で異形狭心症患者８０人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群８０人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて異形狭心症患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２０及び図１２ｃ参照）。

【0090】

【表20】

【0091】

（試験例１４．脳卒中患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で脳卒中患者１１５人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１０９人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて脳卒中患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２１及び図１３参照）。

【0092】

【表21】

【0093】

（試験例１５．慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法でＣＯＰＤ患者２０５人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群２３１人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べてＣＯＰＤ患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２２及び図１４参照）。

【0094】

【表22】

【0095】

（試験例１６．糖尿病患者の血液、小便及び唾液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で糖尿病患者６１人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群１２２人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて糖尿病患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２３及び図１５ａ参照）。

【0096】

【表23】

【0097】

実施例２の方法で糖尿病患者６０人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群１３４人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて糖尿病患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２４及び図１５ｂ参照）。

【0098】

【表24】

【0099】

実施例２の方法で糖尿病患者３７人の唾液と、年齢が対応した正常対照群２７７人の唾液を対象として、唾液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の唾液に比べて糖尿病患者の唾液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２５及び図１５ｃ参照）。

【0100】

【表25】

【0101】

（試験例１７．腎不全患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で腎不全患者３２人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群３２人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて腎不全患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２６及び図１６参照）。

【0102】

【表26】

【0103】

（試験例１８．認知症患者の血液細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で認知症患者６７人の血液と、性別と年齢が対応した正常対照群７０人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の血液に比べて認知症患者の血液でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２７及び図１７参照）。

【0104】

【表27】

【0105】

（試験例１９．パーキンソン病患者の小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法でパーキンソン病患者３９人の小便と、性別と年齢が対応した正常対照群７６人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べてパーキンソン病患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２８及び図１８参照）。

【0106】

【表28】

【0107】

（試験例２０．鬱病患者の小便細菌由来の小胞のメタゲノム分析）
試験例２の方法で鬱病患者２０人の小便と、性別と年齢をマッチングした正常対照群２１人の小便を対象として、小便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、クプリアウィドゥス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、正常人の小便に比べて鬱病患者の小便でクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（表２９及び図１９参照）。

【0108】

【表29】

【0109】

（試験例２１．クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌の培養及び小胞の分離）
クプリアウィドゥス・メタリデュランス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）菌株を培養した後、その小胞を分離して特性を分析した。クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌株を２８℃の好気性チャンバで吸光度（ＯＤ_６００）が１．０〜１．５になるまでＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）培地で培養した後、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ）培地に継代培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後、菌株が含まれている培地の上澄液を回収して１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した後、菌株を除去して０．２２μｍのフィルタで濾過した。濾過した上澄液を１００ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｃａｓｓｅｔｔｅのフィルタメンブレイン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ ｐｕｍｐｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、ＵＳ）を用いて限外濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通じて５０ｍｌの体積で濃縮した。濃縮した上澄液をもう一度０．２２μｍのフィルタで濾過した。その後、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）ａｓｓａｙを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を実施した。

【0110】

（試験例２２．クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗炎症効果）
炎症細胞でクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の細胞死滅に対する影響を確認するために、マウス大食細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞（Ｃ．ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ ＥＶ）を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞生存力測定（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ）を行った。より具体的に、４８−ｗｅｌｌの細胞培養プレート中に４×１０^４個ずつ分注したＲａｗ ２６４．７細胞に、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）無血清培地を入れた多様な濃度のクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を処理して１２時間の間培養した。その後、細胞にＥＺ−ＣＹＴＯＸ（Ｄｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）を４時間の間処理した後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、図２０に示したように、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を大食細胞株に処理したとき、細胞死滅が誘導されないことを確認した。

【0111】

上記結果を土台に、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗炎症効果を評価するために、多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を大食細胞株に１２時間前処理した後、病原性小胞である大腸菌由来の小胞１μｇ／ｍｌを処理し、１２時間後に炎症性サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡを行うために、キャプチャー（Ｃａｐｔｕｒｅ）抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）に希釈して９６ ｗｅｌｌのポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）プレートに作用濃度に合わせて５０μｌずつ分注した後、４℃で一晩の間反応させた。

【0112】

その後、ＰＢＳＴ（０．０５% ｔｗｅｅｎ−２０が入っているリン酸緩衝生理食塩水）溶液１００μｌで３回ずつ洗浄した後、ＲＤ（１％ ＢＳＡが入っているリン酸緩衝生理食塩水）溶液１００μｌを分注して常温で１時間の間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）し、サンプル及びスタンダード（ｓｔａｎｄａｒｄ）は、濃度に合わせて５０μｌず分注して常温で２時間の間反応させた。その後、ＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）抗体をＲＤに希釈して作用濃度に合わせて５０μｌずつ分注して常温で２時間の間反応させ、ＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）をＲＤに１／４０で希釈して５０μｌずつ分注して常温で２０分間反応させた。

【0113】

最後に、ＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＵＳＡ）５０μｌを分注して５分〜２０分後に発色が進行した時点で、１Ｍの硫酸溶液を５０μｌずつ分注して反応を止め、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0114】

その結果、図２１に示したように、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を前処理した場合、大腸菌由来の小胞によるＩＬ−６及びＴＮＦ−αの分泌が顕著に抑制されることを確認した。特に、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の前処理によるＴＮＦ−αの分泌抑制効果が有用微生物対照群であるラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の小胞の前処理によるＴＮＦ−αの分泌抑制効果より著しく大きいことを確認した。上記結果は、大腸菌由来の小胞のような病原性小胞により誘導される炎症反応をクプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞が効率的に抑制できることを意味する。

【0115】

（試験例２３．クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗癌効果）
前記試験例を土台に、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞の抗癌効果を確認した。それのために、図２２に示したように、クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌株（ＣＭＴ１０１）由来の小胞を６週齢のＣ５７ＢＬ／６の雄マウスに腹腔注射又は経口で投与し、投与４日目に癌細胞株（ＣＴ２６ ｃｅｌｌ）を皮下に注射して癌モデルを作った。癌細胞株を投与した後、クプリアウィドゥス・メタリデュランス菌株由来の小胞を腹腔注射又は経口で毎日投与して２４日目まで癌組織のサイズを測定した。その結果、図２３に示したように、癌組織のサイズは、対照群である生理食塩水経口投与群に比べて前記小胞を腹腔注射で投与したマウスと経口で投与したマウスで癌組織のサイズが減少した。特に、経口で投与した場合にサイズが一層減少した。上記結果は、クプリアウィドゥス・メタリデュランス由来の小胞を投与したとき、癌組織の成長を効率的に抑制することができることを意味する。

【0116】

上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。

【産業上の利用可能性】

【0117】

本発明によるクプリアウィドゥス属細菌由来の小胞は、胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、頭頸部癌、リンパ腫、心筋病症、心房細動、異形狭心症、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、糖尿病、腎不全、認知症、パーキンソン病又は鬱病に対する診断方法だけでなく、前記疾患に対する予防、改善又は治療用組成物でも用いられるので、関連医療及び食品産業分野に有用に用いられ得ると期待される。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図13】

【図14】

【図15a】

【図15b】

【図15c】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]