特許 6959912 抗ＶＥＧＦ抗体の最適化変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6959912

(24)【登録日】2021年10月12日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦ抗体の最適化変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20211025BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20211025BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211025BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20211025BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20211025BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211025BHJP

   C40B 40/08 20060101ALN20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/22

   C12N15/62 Z

   C12N15/63 Z

   C12P21/08

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/46

   C07K19/00

   A61K39/395 D

   A61K39/395 T

   A61K39/395 N

   A61P27/02

   A61P3/10

   A61P9/10

   A61P27/06

   A61P19/10

   A61P35/00

   !C40B40/08

【請求項の数】105

【全頁数】183

(21)【出願番号】特願2018-515130(P2018-515130)

(86)(22)【出願日】2016年9月23日

(65)【公表番号】特表2018-531005(P2018-531005A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】US2016053454

(87)【国際公開番号】WO2017053807

(87)【国際公開日】20170330

【審査請求日】2019年9月24日

(31)【優先権主張番号】62/271,913

(32)【優先日】2015年12月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/222,698

(32)【優先日】2015年9月23日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ケーニグ， パトリック

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジンウェイ ヴィヴィアン

(72)【発明者】

【氏名】ラジャゴパル， カルシカン

(72)【発明者】

【氏名】ファミリ， エイミン

(72)【発明者】

【氏名】フー， ジャーメイン

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２６７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０１０１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１７３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０８３０８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ０７Ｋ １６／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の６つの超可変領域（ＨＶＲ）：
（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；、
（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する単離抗体。

【請求項2】

以下の重鎖可変（ＶＨ）ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：
（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２；
（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４
をさらに含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項3】

以下の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＦＲ：
（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１；
（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２；
（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３；及び
（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４
をさらに含む、請求項１または２に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１に記載の抗体。

【請求項5】

（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体。

【請求項6】

（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖及び（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体。

【請求項7】

（ａ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖及び（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体。

【請求項8】

ＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体への結合を阻害することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体であって、
任意選択的に、ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）またはＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）であり、
任意選択的に、約２ｎＭ以下のＫｄでヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）に結合し、
任意選択的に、約７５ｐＭ〜約２ｎＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合し、
任意選択的に、約７５ｐＭ〜約６００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合し、
任意選択的に、約７５ｐＭ〜約５００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合し、かつ
任意選択的に、約６０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する、
抗体。

【請求項9】

約８３．５℃超の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体であって、
任意選択的に、約８５℃〜約９１℃のＴｍを有し、かつ
任意選択的に、約８９℃のＴｍを有する、
抗体。

【請求項10】

モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体であって、
任意選択的に、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントであり、
任意選択的に、抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択され、
任意選択的に、抗体フラグメントが、Ｆａｂであり、
任意選択的に、単一特異性抗体または多重特異性抗体であり、
任意選択的に、多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、
任意選択的に、二重特異性抗体が、ＶＥＧＦと、ＩＬ−１β；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）；インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびに加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子とに結合し、
任意選択的に、ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合型ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、若しくは可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ）であり、または
任意選択的に、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される、
抗体。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項14】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞を培養すること及び抗体を回収することを含む、方法。

【請求項15】

宿主細胞が、原核性であり、任意選択的にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、または
宿主細胞が、真核性であり、任意選択的に２９３細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、または植物細胞である、
請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。

【請求項17】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための医薬であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。

【請求項18】

病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害または細胞増殖性障害である、請求項１６または１７に記載の医薬。

【請求項19】

病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害である、請求項１８に記載の医薬。

【請求項20】

眼の障害が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、黄斑変性症、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬。

【請求項21】

眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである、請求項２０に記載の医薬。

【請求項22】

眼の障害が、ＡＭＤである、請求項２１に記載の医薬。

【請求項23】

眼の障害が、滲出性ＡＭＤである、請求項２２に記載の医薬。

【請求項24】

病理学的血管形成に関連付けられる障害が、細胞増殖性障害である、請求項１８に記載の医薬。

【請求項25】

細胞増殖性障害が、がんである、請求項２４に記載の医薬。

【請求項26】

がんが、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、又は多発性骨髄腫である、請求項２５に記載の医薬。

【請求項27】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害するための医薬であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。

【請求項28】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するための医薬であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬。

【請求項29】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害が、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、及び循環器疾患に関連付けられる透過性からなる群から選択される、請求項２７または２８に記載の医薬。

【請求項30】

（ｉ）医薬が、第２の薬剤と共に投与されるものであり、第２の薬剤が、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、前駆薬物、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、がんワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉ）抗血管形成剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストであり、
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、
任意選択的に、（ｉｖ）抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体であり、任意選択的に、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体が、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体であり、かつ任意選択的に、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体が、ＲＧ−７７１６であり、または、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質が、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））であり、または、アプタマーが、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））であり、または、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）が、アビシパルペゴールであり、または、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される、
請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項31】

第２の生体分子が、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される、請求項３０に記載の医薬であって、
任意選択的に、ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲであるか、または、
任意選択的に、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される、
医薬。

【請求項32】

第２の生体分子に結合する化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項３０または３１に記載の医薬であって、任意選択的に、抗原結合抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される、
医薬。

【請求項33】

（ｉ）硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与されるものであり、
任意選択的に、（ｉｉ）硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与されるものであり、
任意選択的に、（ｉｉｉ）注入により硝子体内にまたは目薬または軟膏により局所的に投与されるものである、
請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項34】

ポート送達デバイスにより投与されるものである、請求項３３に記載の医薬。

【請求項35】

対象が、ヒトである、請求項１６〜３４のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項36】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、薬学的組成物。

【請求項37】

ポリマーをさらに含み、任意選択的に、ポリマーが、生分解性ポリマーである；または、
薬学的組成物が、ポリマー溶媒デポ、ポリマーインプラント、またはポリマーミセルとして製剤化される、
請求項３６に記載の薬学的組成物。

【請求項38】

ポリマーが、ポリ乳酸ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）コポリマーであり、
任意選択的に、薬学的組成物が、ＰＬＧＡロッドとして製剤化される、
請求項３７に記載の薬学的組成物。

【請求項39】

哺乳動物における病理学的血管形成に関連付けられる障害または望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するための医薬であって、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を含む、医薬。

【請求項40】

（ｉ）病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害または細胞増殖性障害であり；
任意選択的に、（ｉｉ）病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害であり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）眼の障害が、ＡＭＤ、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、ＤＲ（ＰＤＲ、ＮＰＤＲ、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、ＲＶＯ（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ＲＰ、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、ＣＭＥ、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択され；かつ
任意選択的に、（ｉｖ）眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである、
請求項３９に記載の医薬。

【請求項41】

眼の障害が、ＡＭＤであり；任意選択的に、ＡＭＤが、滲出性ＡＭＤである、請求項４０に記載の医薬。

【請求項42】

病理学的血管形成に関連付けられる障害が、細胞増殖性障害であり；
任意選択的に、細胞増殖性障害が、がんであり；かつ
任意選択的に、がんが、乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎がん、前立腺がん、肝臓がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、
請求項４０に記載の医薬。

【請求項43】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害が、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、及び循環器疾患に関連付けられる透過性からなる群から選択される、請求項３９に記載の医薬。

【請求項44】

（ｉ）第２の薬剤をさらに含み、第２の薬剤が、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、前駆薬物、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉ）抗血管形成剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、任意選択的に、抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体であり、任意選択的に、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体が、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体であり、かつ任意選択的に、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体が、ＲＧ−７７１６であり、または、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質が、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））であり、または、アプタマーが、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））であり、または、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）が、アビシパルペゴールであり、または、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される、
請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項45】

第２の生体分子が、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択され、
任意選択的に、ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである、または、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される、
請求項４４に記載の薬学的組成物。

【請求項46】

第２の生体分子に結合する化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
任意選択的に、抗原結合抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される、
請求項４４または４５に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

（ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体と、（ｉｉ）抗体に共有結合される親水性ポリマーと、を含む、抗体複合体。

【請求項48】

（ｉ）親水性ポリマーが、ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり；
任意選択的に、（ｉｉ）親水性ポリマーが、ＨＡポリマーであり；かつ
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＨＡポリマーが、約１メガダルトン（ＭＤａ）以下の分子量を有する、
請求項４７に記載の抗体複合体。

【請求項49】

（ｉ）ＨＡポリマーが、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有し；
任意選択的に、（ｉｉ）ＨＡポリマーが、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有し、かつ
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＨＡポリマーが、約２００ｋＤａの分子量を有する、
る、請求項４８に記載の抗体複合体。

【請求項50】

（ｉ）ＨＡポリマーが、架橋されていない；
任意選択的に、（ｉｉ）抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｖ）抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、またはＦａｂ’であり；
任意選択的に、（ｖ）抗体複合体が、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍの流体力学半径を有し；
任意選択的に、（ｖｉ）抗体複合体が、約２５ｎｍ〜約３５ｎｍの流体力学半径を有し；
任意選択的に、（ｖｉｉ）流体力学半径が、約２８ｎｍであり；かつ
任意選択的に、（ｖｉｉｉ）抗体複合体が、親水性ポリマーに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有し；
任意選択的に、（ｉｘ）眼半減期が、参照抗体に対して少なくとも約２倍増加され：かつ
任意選択的に、（ｘ）眼半減期が、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される、
請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の抗体複合体。

【請求項51】

眼半減期が、硝子体半減期である、請求項５０に記載の抗体複合体であって、
任意選択的に、参照抗体が、抗体複合体の抗体と同一である、
抗体複合体。

【請求項52】

（ｉ）抗体が、可逆的前駆薬物リンカーによりポリマーに共有結合され；
任意選択的に、（ｉｉ）ポリマーが、ヒドロゲルであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）ヒドロゲルが、ＰＥＧ系ヒドロゲルである、
請求項４７に記載の抗体複合体。

【請求項53】

ヒドロゲルが、微粒子ビーズの形状である、請求５２に記載の抗体複合体。

【請求項54】

ＨＡ結合ドメインに共有結合される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、融合タンパク質。

【請求項55】

（ｉ）ＨＡ結合ドメインが、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合され；
任意選択的に、（ｉｉ）ＨＡ結合ドメインが、重鎖のＣ末端または軽鎖のＣ末端に共有結合され；
任意選択的に、（ｉｉｉ）融合タンパク質が、リンカーをさらに含み、リンカーが、抗体とＨＡ結合ドメインとの間に位置付けられており；
任意選択的に、（ｉｖ）リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含み；
任意選択的に、（ｖ）リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列からなり；
任意選択的に、（ｖｉ）抗体が、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントであり；
任意選択的に、（ｖｉｉ）抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択され；
任意選択的に、（ｖiｉｉ）抗体フラグメントが、Ｆａｂであり；
任意選択的に、（ｉｘ）ＨＡ結合ドメインが、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端またはＦａｂのＣＬドメインに共有結合され；
任意選択的に、（ｘ）ＨＡ結合ドメインが、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドからなる群から選択され；
任意選択的に、（ｘｉ）ＨＡ結合ドメインが、リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｘｉｉ）リンクモジュールが、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ６）、ＣＤ４４、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ−１）、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質（ＨＡＰＬＮ）１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、ブレビカン、ニューロカン、ホスファカン、バーシカン、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡ０５２７、スタビリン−１、ならびにスタビリン−２リンクモジュールからなる群から選択され；
任意選択的に、（ｘｉｉｉ）リンクモジュールが、ＴＳＧ６リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｘｉｖ）ＴＳＧ６リンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールまたはウサギＴＳＧ６リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｘｖ）ＴＳＧリンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｘｖｉ）ヒトＴＳＧ６リンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６のアミノ酸残基３６〜１２８を含み；
任意選択的に、（ｘｖｉｉ）融合タンパク質が、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインをさらに含み；
任意選択的に、（ｘｖｉｉｉ）少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインが、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合される、
請求項５４に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

（ｉ）少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質が、リンカーにより抗体に連鎖され；
任意選択的に、（ｉｉ）リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含み；
任意選択的に、（ｉｉｉ）リンカーが、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列からなり、
任意選択的に、（ｉｖ）第１のＨＡ結合ドメインが、重鎖に共有結合され、第２のＨＡ結合ドメインが、軽鎖に共有結合され；
任意選択的に、（ｖ）第１のＨＡ結合ドメインが、重鎖のＣ末端に連鎖され、第２のＨＡ結合ドメインが、軽鎖のＣ末端に連鎖され；
任意選択的に、（ｖｉ）少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質が、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドからなる群から選択され；
任意選択的に、（ｖｉｉ）少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質が、リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｖｉｉｉ）リンクモジュールが、ＴＳＧ６リンクモジュールであり、
任意選択的に、（ｉｘ）ＴＳＧ６リンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールまたはウサギＴＳＧ６リンクモジュールであり；
任意選択的に、（ｘ）ＴＳＧ６リンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールである、
請求項５５に記載の融合タンパク質。

【請求項57】

ヒトＴＳＧ６リンクモジュールが、ヒトＴＳＧ６のアミノ酸残基３６〜１２８を含む、請求項５６に記載の融合タンパク質。

【請求項58】

（ｉ）融合タンパク質が、ＶＥＧＦ及びＨＡに特異的に結合し；
任意選択的に、（ｉｉ）融合タンパク質が、約２μＭ以下のＫｄでＨＡに結合し；
任意選択的に、（ｉｉｉ）融合タンパク質が、約１ｎＭ〜約５００ｎＭのＫｄでＨＡに結合し；
任意選択的に、（ｉｖ）融合タンパク質が、約１ｎＭ〜約５０ｎＭのＫｄでＨＡに結合し；
任意選択的に、（ｖ）融合タンパク質が、約１０ｎＭのＫｄでＨＡに結合し；
任意選択的に、（ｖｉ）融合タンパク質が、ＨＡ結合ドメインに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有し、
任意選択的に、（ｖｉｉ）眼半減期が、参照抗体に対して少なくとも約２倍増加され；
任意選択的に、（ｖｉｉｉ）眼半減期が、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される、
請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項59】

眼半減期が、硝子体半減期であり、任意選択的に、参照抗体が、融合タンパク質の抗体と同一である、請求項５８に記載の融合タンパク質。

【請求項60】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬であって、有効量の請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む、医薬。

【請求項61】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための医薬であって、有効量の請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む、医薬。

【請求項62】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬であって、有効量の請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、医薬。

【請求項63】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための医薬であって、有効量の請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、医薬。

【請求項64】

（ｉ）病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害であり；
任意選択的に、（ｉｉ）眼の障害が、ＡＭＤ、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、ＤＲ（ＰＤＲ、ＮＰＤＲ、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、ＲＶＯ（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ＲＰ、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、ＣＭＥ、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉｉ）眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯであり；
任意選択的に、（ｉｖ）眼の障害が、ＡＭＤである、
請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項65】

ＡＭＤが、滲出性ＡＭＤである、請求項６４のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項66】

（ｉ）医薬が、第２の薬剤と共に投与されるものであり、第２の薬剤が、別の抗体、抗血管形成剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉ）抗血管形成剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり；
任意選択的に、（ｉｖ）抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体であり；かつ
任意選択的に、（ｖ）二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体が、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体であり、任意選択的に、（ｖｉ）抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体が、ＲＧ−７７１６である、
請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項67】

可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質が、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である；または
アプタマーが、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である；または
抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）が、アビシパルペゴールである；または
ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される、
請求項６６に記載の医薬。

【請求項68】

第２の生体分子が、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択され、
任意選択的にＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである、または、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される、
請求項６６に記載の医薬。

【請求項69】

第２の生体分子に結合する化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項６６または６８に記載の医薬であって、
任意選択的に、抗原結合抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される、
医薬。

【請求項70】

（ｉ）医薬が、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与されるものであり；
任意選択的に、（ｉｉ）医薬が、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与されるものであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）医薬が、注入により硝子体内に、または、目薬または軟膏により局所的に投与されるものである、
請求項６０、６１、及び６４〜６９の何れか一項に記載の医薬。

【請求項71】

ポート送達デバイスにより投与されるものである、請求項７０に記載の医薬。

【請求項72】

（ｉ）硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与されるものであり、
任意選択的に、（ｉｉ）硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与されるものであり；かつ
任意選択的に、（ｉｉｉ）注入により硝子体内に、または、目薬または軟膏により局所的に投与されるものである、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項73】

ポート送達デバイスにより投与されるものである、請求項７２に記載の医薬。

【請求項74】

対象が、ヒトである、請求項６０〜７３のいずれか一項に記載の医薬。

【請求項75】

請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む、薬学的組成物。

【請求項76】

請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。

【請求項77】

請求項７５または７６に記載の薬学的組成物を含む、哺乳動物における病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための医薬。

【請求項78】

（ｉ）病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害であり；
任意選択的に、（ｉｉ）眼の障害が、ＡＭＤ、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、ＤＲ（ＰＤＲ、ＮＰＤＲ、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、ＲＶＯ（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ＲＰ、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、ＣＭＥ、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択され；かつ
任意選択的に、（ｉｉｉ）眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである、
請求項７７に記載の医薬。

【請求項79】

眼の障害が、ＡＭＤである、請求項７８に記載の医薬。

【請求項80】

ＡＭＤが、滲出性ＡＭＤである、請求項７９に記載の医薬。

【請求項81】

第２の薬剤をさらに含み、（ｉ）第２の薬剤が、別の抗体、抗血管形成剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉ）抗血管形成剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり；
任意選択的に、（ｉｖ）抗ＶＥＧＦ抗体が、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体であり；
任意選択的に、（ｖ）二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体が、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体であり；
任意選択的に、（ｖｉ）抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体が、ＲＧ−７７１６である、
請求項７５または７６に記載の薬学的組成物。

【請求項82】

可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質が、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である、または、アプタマーが、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である、または、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）が、アビシパルペゴールである、または、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される、請求項８１に記載の薬学的組成物。

【請求項83】

（ｉ）第２の生体分子が、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択され；
任意選択的に、（ｉｉ）ＶＥＧＦ受容体が、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲであり；
任意選択的に、（ｉｉｉ）ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される、
請求項８１に記載の薬学的組成物。

【請求項84】

第２の生体分子に結合する化合物が、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、任意選択的に、抗原結合抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される、請求項８１または８３に記載の薬学的組成物。

【請求項85】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。

【請求項86】

病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。

【請求項87】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。

【請求項88】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項89】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項90】

望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害する方法で使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物。

【請求項91】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬の製造における、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体の使用。

【請求項92】

病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための医薬の製造における、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体の使用。

【請求項93】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む組成物。

【請求項94】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む組成物。

【請求項95】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための医薬の製造における、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項96】

病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための医薬の製造における、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項97】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物。

【請求項98】

病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む組成物。

【請求項99】

（ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーとを含む、抗体複合体であって、ＨＡポリマーが、約２００ｋＤａの分子量を有し、かつ架橋されておらず、抗体が、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインと含む、抗体複合体。

【請求項100】

（ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーとを含む、抗体複合体であって、ＨＡポリマーが、約２００ｋＤａの分子量を有し、かつ架橋されておらず、抗体が、（ａ）配列番号４８または配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖と（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、抗体複合体。

【請求項101】

（ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体及び（ｉｉ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーであって、ＨＡポリマーが、約１００ｋＤａの分子量を有し、かつ架橋されておらず、抗体が、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列とを含むＶＬドメインと含む、抗体及びＨＡポリマー；
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体及び（ｉｖ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーであって、ＨＡポリマーが、約１５０ｋＤａの分子量を有し、かつ架橋されておらず、抗体が、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列とを含むＶＬドメインとを含む、抗体及びＨＡポリマー；または
（ｖ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体及び（ｖｉ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーであって、ＨＡポリマーが、約２５０ｋＤａの分子量を有し、かつ架橋されておらず、抗体が、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、抗体及びＨＡポリマー
を含む、抗体複合体。

【請求項102】

請求項９９〜１０１のいずれか一項に記載の抗体複合体を含む、薬学的組成物。

【請求項103】

請求項１０２に記載の薬学的組成物を含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための医薬。

【請求項104】

病理学的血管形成に関連付けられる障害が、眼の障害または細胞増殖性障害である、請求項１０３に記載の医薬。

【請求項105】

眼の障害が、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、及びＲＶＯからなる群から選択される、請求項１０４に記載の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年９月２１日に作製された該ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７４−１１０ＷＯ３＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿９＿２１＿１６＿ＳＴ２５という名称であり、４１，７６４バイトのサイズである。

【0002】

本発明は概して、研究、療法、及び診断目的にとって有益な特性を有する抗ＶＥＧＦ抗体、ならびに抗ＶＥＧＦ抗体を含む組成物（例えば、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）に関する。本発明は、改善された特性、例えば、増強された結合親和性、安定性、及び／または発現を有する抗体変異体を特定する方法にも関する。

【背景技術】

【0003】

血管形成は、新しい血管が既存の血管から形成する厳密に制御されたプロセスである。血管形成は、十分な血液循環を確実にするために発育段階では重要であるが、眼の障害（例えば、加齢黄斑変性症、ＡＭＤ）及び細胞増殖性障害（例えば、癌）などの多くの障害が病理学的血管形成に関連付けられる。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が、臨床的に確証された血管形成の主動体であり、例えば、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するために、抗ＶＥＧＦ遮断抗体を使用したＶＥＧＦの中和が使用され得る。

【0004】

例えば、病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療で使用するための、増強された結合親和性、安定性、薬物動態、及び／または発現を有する抗ＶＥＧＦ抗体などの抗体がなおも必要とされている。特に、眼の障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、及び網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ））の治療のための長時間作用性送達を目的とした抗体組成物が必要とされている。加えて、未だ対処されていないが、改善された特性（例えば、増強された結合親和性、安定性、薬物動態、及び／または発現）を有するかかる抗体を特定する改善された方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、例えば、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、眼の障害及び細胞増殖性障害）の治療のための抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体を含む組成物（例えば、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）、及びそれらの使用方法を提供する。本発明は、改善された特性、例えば、増強された結合親和性、安定性、薬物動態、及び／または発現を有する抗体変異体を特定する方法も提供する。

【0006】

一態様において、本発明は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、本抗体は、以下の６つの超可変領域（ＨＶＲ）：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＸ_１ＴＰＸ_２ＧＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＹＸ_６ＤＳＶＸ_７Ｘ_８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２であって、式中Ｘ_１がＩｌｅまたはＨｉｓであり、Ｘ_２がＡｌａまたはＡｒｇであり、Ｘ_３がＴｙｒまたはＬｙｓであり、Ｘ_４がＴｈｒまたはＧｌｕであり、Ｘ_５がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕであり、Ｘ_６がＡｌａまたはＧｌｕであり、Ｘ_７がＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ_８がＧｌｙまたはＧｌｕである、ＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＸ_１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１であって、式中、Ｘ_１がＡｓｐまたはＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）Ｘ_１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２であって、式中、Ｘ_１がＳｅｒまたはＭｅｔである、ＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）Ｘ_１ＱＧＹＧＸ_２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３であって、式中、Ｘ_１がＧｌｎ、Ａｓｎ、またはＴｈｒであり、Ｘ_２がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、またはＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）またはＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。

【0007】

上記の態様のいくつかの実施形態において、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下の重鎖可変（ＶＨ）ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４と、をさらに含む。

【0008】

上記の態様のいくつかの実施形態において、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下のＶＬドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４と、をさらに含む。

【0009】

上記の態様のいくつかの実施形態において、本抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下のＶＬドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）またはＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下のＶＨドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）またはＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４と、をさらに含む。

【0010】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号１１、４０、もしくは４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２、４１、もしくは４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、以下のＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）またはＷＶＲＱＥＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、以下のＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＤＣ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（配列番号４４）、またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）またはＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0011】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0012】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0013】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0014】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0015】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３もしくは５１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２、３４、３５、３６、３７、もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下のＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）またはＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本抗体は、以下のＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）またはＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）、またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４と、をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＬドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。

【0016】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0017】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0018】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0019】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0020】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0021】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0022】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0023】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0024】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0025】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0026】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖と、（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

【0027】

別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する単離抗体を特徴とし、ここで、抗体は、（ａ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖と、（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

【0028】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合することを阻害することができる。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）である。

【0029】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、約２ｎＭ以下のＫｄでヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）に結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約２ｎＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約６００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約５００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約８０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約６０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。

【0030】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、約８３．５℃超の融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約８５℃〜約９１℃のＴｍを有する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約８９℃のＴｍを有する。

【0031】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、８未満の等電点（ｐＩ）を有する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約５〜約７のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、本抗体は、約５〜約６のｐＩを有する。

【0032】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラである。

【0033】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。

【0034】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、単一特異性抗体である。前述の態様のいずれかの他の実施形態において、本抗体は、多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦと、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）；インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびに加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子とに結合する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合型ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、または可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ）である。いくつかの実施形態において、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質は、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される。

【0035】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチド（例えば、単離ポリヌクレオチド）を特徴とする。別の態様において、本発明は、抗体を発現させるためのポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）を特徴とする。別の態様において、本発明は、前述のポリヌクレオチド及び／またはベクターを含む宿主細胞を特徴とする。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、または植物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核細胞は、Ｅ．Ｃｏｌｉである。

【0036】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかを産生する方法を特徴とし、本方法は、前述のベクター（例えば、発現ベクター）のうちのいずれかを含む宿主細胞を培養培地で培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞または培養培地から抗体を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、酵母細胞、または植物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核細胞は、Ｅ．Ｃｏｌｉである。

【0037】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法を特徴とし、対象に有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含み、それにより対象における血管形成を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑変性症、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。

【0038】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための方法を特徴とし、本方法は、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑変性症、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。

【0039】

別の態様において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害する方法を特徴とし、本方法は、対象に有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含み、それにより対象における血管透過性を阻害する。

【0040】

別の態様において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療する方法を特徴とし、本方法は、有効量の前述の抗体のうちのいずれか１つを、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。

【0041】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、及び循環器疾患に関連付けられる透過性からなる群から選択される。

【0042】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、対象に有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、ここで、第２の薬剤は、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、前駆薬物、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体は、ＲＧ−７７１６である。いくつかの実施形態において、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、アビシパルペゴールである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ））−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質は、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子に結合する化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。

【0043】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与される。いくつかの実施形態において、本抗体は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本抗体は、注入により硝子体内投与される。いくつかの実施形態において、本抗体は、目薬または軟膏により局所的に投与される。いくつかの実施形態において、本抗体は、ポート送達デバイスにより投与される。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。

【0044】

別の態様において、本発明は、前述の抗体のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物を特徴とする。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、ポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリマーは、生分解性ポリマーである。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ポリマー溶媒デポ、ポリマーインプラント、またはポリマーミセルとして製剤化される。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリ乳酸ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）コポリマーである。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、ＰＬＧＡロッドとして製剤化される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、哺乳動物における病理学的血管形成に関連付けられる障害または望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害または細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑変性症、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、細胞増殖性障害である。いくつかの実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、及び循環器疾患に関連付けられる透過性からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、第２の薬剤をさらに含み、ここで、第２の薬剤は、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、前駆薬物、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体は、ＲＧ−７７１６である。いくつかの実施形態において、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、アビシパルペゴールである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ））−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質は、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子に結合する化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。

【0045】

別の態様において、本発明は、（ｉ）前述の抗体のうちのいずれか１つと、（ｉｉ）抗体に共有結合される親水性ポリマーとを含む抗体複合体を特徴とする。いくつかの実施形態において、親水性ポリマーは、ヒアルロン酸（ＨＡ）ポリマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。いくつかの実施形態において、親水性ポリマーは、ＨＡポリマーである。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約１メガダルトン（ＭＤａ）以下の分子量を有する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約２００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、架橋されていない。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、またはＦａｂ’である。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍの流体力学半径を有する。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、約２５ｎｍ〜約３５ｎｍの流体力学半径を有する。いくつかの実施形態において、流体力学半径は、約２８ｎｍである。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、親水性ポリマーに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有する。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約２倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの実施形態において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一である。

【0046】

別の態様において、本発明は、（ｉ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）抗体に共有結合されるＨＡポリマーとを含む抗体複合体を特徴とし、ここで、ＨＡポリマーは、１ＭＤａ以下の分子量を有する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、約２００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＨＡポリマーは、架橋されていない。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、またはＦａｂ’である。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍの流体力学半径を有する。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、約２５ｎｍ〜約３５ｎｍの流体力学半径を有する。いくつかの実施形態において、流体力学半径は、約２８ｎｍである。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、親水性ポリマーに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有する。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約２倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの実施形態において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一である。

【0047】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、可逆的前駆薬物リンカーによりポリマーに共有結合される。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ヒドロゲルである。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、ＰＥＧ系ヒドロゲルである。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、微粒子ビーズの形状である。

【0048】

別の態様において、本発明は、ＨＡ結合ドメインに共有結合される前述の抗体のうちのいずれか１つを含む融合タンパク質を特徴とする。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端または軽鎖のＣ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、軽鎖のＣ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、リンカーをさらに含み、リンカーは、抗体とＨＡ結合ドメインとの間に位置付けられている。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合タンパク質は、ＦａｂのＣＬドメインのＣ末端に共有結合される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＨＡ結合ドメインは、リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、リンクモジュールは、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ６）、ＣＤ４４、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ−１）、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質（ＨＡＰＬＮ）１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、ブレビカン、ニューロカン、ホスファカン、バーシカン、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡ０５２７、スタビリン−１、ならびにスタビリン−２リンクモジュールからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リンクモジュールは、ＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ６リンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールまたはウサギＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ＴＳＧリンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６のアミノ酸残基３６〜１２８を含む。

【0049】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンカーにより抗体に連鎖される。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、第１のＨＡ結合ドメインは、重鎖に共有結合され、第２のＨＡ結合ドメインは、軽鎖に共有結合される。いくつかの実施形態において、第１のＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端に連鎖され、第２のＨＡ結合ドメインは、軽鎖のＣ末端に連鎖される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、リンクモジュールは、ＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ６リンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールまたはウサギＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ６リンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの実施形態において、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６のアミノ酸残基３６〜１２８を含む。

【0050】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパクは、ＶＥＧＦ及びＨＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約２μＭ以下のＫｄでＨＡに結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約１ｎＭ〜約５００ｎＭのＫｄでＨＡに結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約１ｎＭ〜約５０ｎＭのＫｄでＨＡに結合する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、約１０ｎＭのＫｄでＨＡに結合する。

【0051】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＨＡ結合ドメインに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有する。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約２倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの実施形態において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの実施形態において、参照抗体は、融合タンパク質の抗体と同一である。

【0052】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法を特徴とし、対象に有効量の前述の抗体複合体のうちのいずれか１つを投与することを含み、それにより対象における血管形成を低減または阻害する。

【0053】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための方法を特徴とし、本方法は、有効量の前述の抗体複合体のうちのいずれか１つを、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。

【0054】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法を特徴とし、対象に有効量の前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つを投与することを含み、それにより対象における血管形成を低減または阻害する。

【0055】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための方法を特徴とし、本方法は、有効量の前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つを、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。

【0056】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、ＤＲ（ＰＤＲ、ＮＰＤＲ、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、ＲＶＯ（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ＲＰ、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、ＣＭＥ、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤである。

【0057】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、対象に有効量の第２の薬剤を投与することをさらに含み、ここで、第２の薬剤は、別の抗体、抗血管形成剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体は、ＲＧ−７７１６である。いくつかの実施形態において、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、アビシパルペゴールである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ））−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質は、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子に結合する化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。

【0058】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、抗体複合体は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与される。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与される。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、注入により硝子体内投与される。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、目薬または軟膏により局所的に投与される。いくつかの実施形態において、抗体複合体は、ポート送達デバイスにより投与される。

【0059】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、局所的に、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、目薬により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、硝子体内に、経眼的に、眼内に、強膜近傍に、テノン嚢下に、脈絡膜上に、または局所的に投与される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、注入により硝子体内投与される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、目薬または軟膏により局所的に投与される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ポート送達デバイスにより投与される。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。

【0060】

別の態様において、本発明は、前述の抗体複合体のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物を特徴とする。

【0061】

別の態様において、本発明は、前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物を特徴とする。

【0062】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、薬学的組成物は、哺乳動物における病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するために使用される。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害である。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与ＤＭＥを含む）、網膜症、ＤＲ（ＰＤＲ、ＮＰＤＲ、及び高地ＤＲを含む）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、ＲＶＯ（ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯ形態を含む）、ＣＮＶ（近視性ＣＮＶを含む）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ＲＰ、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、ＣＭＥ、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎を含む）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、及びシェーグレン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯである。いくつかの実施形態において、眼の障害は、ＡＭＤである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤは、滲出性ＡＭＤである。

【0063】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、薬学的組成物は、第２の薬剤をさらに含み、ここで、第２の薬剤は、別の抗体、抗血管形成剤、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、コルチコステロイド、鎮痛剤、及び第２の生体分子に結合する化合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質、アプタマー、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）、またはＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、ＲＴＨ−２５８、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２抗体は、ＲＧ−７７１６である。いくつかの実施形態において、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ペガプタニブ（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、アビシパルペゴールである。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤は、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ））−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；ならびにＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ受容体は、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲである。いくつかの実施形態において、ＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質は、補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第２の生体分子に結合する化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗原結合抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。

【0064】

別の態様において、本発明は、抗体の標的分子への増強された結合を付与するアミノ酸残基改変を特定する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）候補抗体変異体をコードする核酸を含むディスプレイライブラリーであって、各候補抗体変異体が、参照抗体と比較してＶＨまたはＶＬ内にアミノ酸残基改変を含み、ＶＨまたはＶＬの全ての位置のアミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリー中に存在する、ディスプレイライブラリーを提供することと、（ｂ）候補抗体変異体の標的分子への結合に基づいてディスプレイライブラリーを分類して、参照抗体と比較して標的分子への増強された結合を有する候補抗体変異体を含む分類されたライブラリーを形成することと、（ｃ）超並列配列決定法により決定される、各アミノ酸残基改変がディスプレイライブラリー中に存在する頻度と分類されたライブラリー中に存在する頻度とを比較し、それにより各アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されているかどうかを決定することと、を含み、それにより、アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されている場合、標的分子への増強された結合を付与するものとして特定される。

【0065】

別の態様において、本発明は、増強された安定性を抗体に付与するアミノ酸残基改変を特定する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）候補抗体変異体をコードする核酸を含むディスプレイライブラリーであって、各候補抗体変異体が、参照抗体と比較してＶＨまたはＶＬ内にアミノ酸残基改変を含み、ＶＨまたはＶＬの全ての位置のアミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリー中に存在する、ディスプレイライブラリーを提供することと、（ｂ）候補抗体変異体の標的分子への結合に基づいてディスプレイライブラリーを分類して、参照抗体と比較して増強された安定性を有する候補抗体変異体を含む分類されたライブラリーを形成することと、（ｃ）超並列配列決定法により決定される、各アミノ酸残基改変がディスプレイライブラリー中に存在する頻度と分類されたライブラリー中に存在する頻度とを比較し、それにより各アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されているかどうかを決定することと、を含み、それにより、アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されている場合、増強された安定性を抗体に付与するものとして特定される。

【0066】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、ステップ（ｂ）後、超並列配列決定法により、各アミノ酸改変が、ディスプレイライブラリー及び分類されたライブラリー中に存在する頻度を決定することをさらに含む。

【0067】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、アミノ酸残基改変は、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で少なくとも２倍濃縮される。

【0068】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、哺乳動物ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、及びｍＲＮＡディスプレイライブラリーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。

【0069】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、アミノ酸残基改変は、縮重コドンセットによりコードされる。いくつかの実施形態において、縮重コドンセットは、ＮＮＫまたはＮＮＳコドンセットであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、Ｋは、ＧまたはＴであり、Ｓは、ＣまたはＧである。いくつかの実施形態において、縮重コドンセットは、ＮＮＫコドンセットである。

【0070】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の分類することは、ディスプレイライブラリーを固定化標的分子またはエピトープと接触させることを含む。

【0071】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ステップ（ｂ）の分類することは、ディスプレイライブラリーを可溶性標的分子またはエピトープと接触させることを含む。

【0072】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、少なくとも１×１０^６個の候補抗体変異体を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、少なくとも１×１０^８個の抗体変異体を含む。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、少なくとも１×１０^９個の抗体変異体を含む。

【0073】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、超並列配列決定法は、ディープ配列決定法、超ディープ配列決定法、及び／または次世代配列決定法を含む。

【0074】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体である。

【0075】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、ＩｇＧ抗体である。

【0076】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本抗体は、抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びダイアボディからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。

【0077】

前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は、本方法のステップにより特定されたアミノ酸残基改変を含む抗体を生成することをさらに含む。

【0078】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための薬品の製造で使用され得る。

【0079】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための薬品の製造で使用され得る。

【0080】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害するための薬品の製造で使用され得る。

【0081】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用され得る。

【0082】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象において行うために使用され得る。

【0083】

いくつかの態様において、前述の抗体のうちのいずれか１つは、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害する方法で使用され得る。

【0084】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための前述の抗体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0085】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する前述の抗体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0086】

別の態様において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を患う対象における血管透過性を阻害する方法で使用するための前述の抗体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0087】

いくつかの態様において、前述の抗体複合体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するため薬品の製造で使用され得る。

【0088】

いくつかの態様において、前述の抗体複合体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための薬品の製造で使用され得る。

【0089】

いくつかの態様において、前述の抗体複合体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用され得る。

【0090】

いくつかの態様において、前述の抗体複合体のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象において行うために使用され得る。

【0091】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための前述の抗体複合体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0092】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する前述の抗体複合体のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0093】

いくつかの態様において、前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害するための薬品の製造で使用され得る。

【0094】

いくつかの態様において、前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療を、かかる治療を必要とする対象において行うための薬品の製造で使用され得る。

【0095】

いくつかの態様において、前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用され得る。

【0096】

いくつかの態様において、前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つは、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象において行うために使用され得る。

【0097】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0098】

別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法を、かかる治療を必要とする対象で行うために使用する前述の融合タンパク質のうちのいずれか１つを含む組成物を特徴とする。

【0099】

治療方法に関して（例えば、抗体特性、追加の療法剤、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯなどの眼の障害）、投与経路（例えば、硝子体内注入）などに関して）上述される実施形態のいずれも、上述される薬品、使用、及び組成物の文脈において使用され得ることを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0100】

図１Ａ〜１Ｆは、抗ｇＤタグ抗体（抗ｇＤ）、タンパク質Ｌ、またはタンパク質Ａに対して、ＮＮＫウォークＶＨ（図１Ａ〜１Ｃ）及びＶＬ（図１Ｄ〜１Ｆ）ライブラリーから得られたパニングにおける全ての突然変異の濃縮比のｌｏｇ２（ｌｏｇ２濃縮比とも称される）を示すヒートマップである。位置２から始まる野生型Ｇ６．３１ＶＨ（図１Ａ〜１Ｃ）またはＶＬ（図１Ｄ〜１Ｆ）のアミノ酸配列は、以下の各ヒートマップに示される。

【図1A】抗ｇＤに対してＮＮＫウォークＶＨライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図1B】タンパク質Ｌに対してＮＮＫウォークＶＨライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図1C】タンパク質Ａに対してＮＮＫウォークＶＨライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図1D】抗ｇＤに対してＮＮＫウォークＶＬライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図1E】タンパク質Ｌに対してＮＮＫウォークＶＬライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図1F】タンパク質Ａに対してＮＮＫウォークＶＬライブラリーをパニングすることにより得られた結果を示す。

【図2A】抗ｇＤタグ抗体（「ｇＤ」）、タンパク質Ａ（「タンパク質Ａ（ｐｒｏｔＡ）」）、及びタンパク質Ｌ（「タンパク質Ｌ（ｐｒｏｔＬ）」）に対して、ＶＨ（図２Ａ）及びＶＬ（図２Ｂ）のパニングによるｌｏｇ２濃縮比間の相関性を示す一連のグラフ及び表である。この表は、（ｉ）ｇＤとｐｒｏｔＡ、（ｉｉ）ｇＤとｐｒｏｔＬ、及び（ｉｉｉ）ｐｒｏｔＡとｐｒｏｔＬとの間の比較のためのピアソン相関係数（ｒ^２、「Ｃｏｒ」）を示す。疎水性コア（「コア」）、延長疎水性コア（「延長コア」）、ＶＨ／ＶＬ界面（「界面」）に属すると分類される位置、もしくは重要水素結合、塩橋を形成する位置か、または他の目的（「他」）である位置における突然変異の濃縮比の相関性も決定した。これらの図は、抗ｇＤ抗体、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｌを使用して、ファージにおけるＦａｂ分子の折り畳みを検出することにより、類似の結果がもたらされることを示す。異なるパニングにおいて濃縮比が著しく異なった突然変異のみが、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌ結合部位内に直接配置されたものである。それらの残基は、それぞれ「タンパク質Ａ」、「タンパク質Ｌ１」、及び「タンパク質Ｌ２」（タンパク質Ｌのための２つの結合部位が存在する）と標識される。タンパク質Ｌのための結合部位は、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ９（８）：６７９−６８７，２００１に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質Ｇのための結合部位は、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１０）：５３９９−５４０４，２０００に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図2B】抗ｇＤタグ抗体（「ｇＤ」）、タンパク質Ａ（「タンパク質Ａ（ｐｒｏｔＡ）」）、及びタンパク質Ｌ（「タンパク質Ｌ（ｐｒｏｔＬ）」）に対して、ＶＨ（図２Ａ）及びＶＬ（図２Ｂ）のパニングによるｌｏｇ２濃縮比間の相関性を示す一連のグラフ及び表である。この表は、（ｉ）ｇＤとｐｒｏｔＡ、（ｉｉ）ｇＤとｐｒｏｔＬ、及び（ｉｉｉ）ｐｒｏｔＡとｐｒｏｔＬとの間の比較のためのピアソン相関係数（ｒ^２、「Ｃｏｒ」）を示す。疎水性コア（「コア」）、延長疎水性コア（「延長コア」）、ＶＨ／ＶＬ界面（「界面」）に属すると分類される位置、もしくは重要水素結合、塩橋を形成する位置か、または他の目的（「他」）である位置における突然変異の濃縮比の相関性も決定した。これらの図は、抗ｇＤ抗体、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｌを使用して、ファージにおけるＦａｂ分子の折り畳みを検出することにより、類似の結果がもたらされることを示す。異なるパニングにおいて濃縮比が著しく異なった突然変異のみが、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌ結合部位内に直接配置されたものである。それらの残基は、それぞれ「タンパク質Ａ」、「タンパク質Ｌ１」、及び「タンパク質Ｌ２」（タンパク質Ｌのための２つの結合部位が存在する）と標識される。タンパク質Ｌのための結合部位は、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ９（８）：６７９−６８７，２００１に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質Ｇのための結合部位は、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１０）：５３９９−５４０４，２０００に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図3A】ＶＨ（図３Ａ）及びＶＬ（図３Ｂ）内の所与の位置における全ての突然変異のｌｏｇ２濃縮比を示すグラフである。疎水性コア（濃い灰色）、延長疎水性コア（中間の灰色）、またはＶＨ／ＶＬ界面（淡い灰色）内に配置されているかどうかに従って、位置に陰影をつける。保存され、突然変異に耐容性を示さない位置（ｌｏｇ２濃縮比Ｚスコア＜−０．５）が標識される。

【図3B】ＶＨ（図３Ａ）及びＶＬ（図３Ｂ）内の所与の位置における全ての突然変異のｌｏｇ２濃縮比を示すグラフである。疎水性コア（濃い灰色）、延長疎水性コア（中間の灰色）、またはＶＨ／ＶＬ界面（淡い灰色）内に配置されているかどうかに従って、位置に陰影をつける。保存され、突然変異に耐容性を示さない位置（ｌｏｇ２濃縮比Ｚスコア＜−０．５）が標識される。

【図3C】それぞれ、ＶＨ（図３Ｃ）及びＶＬ（図３Ｄ）の構造内の保存位置の配置を示す抗原遊離Ｇ６Ｆａｂ（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）コード：２ＦＪＦ）の結晶構造のレンダリングである。陰影スキームは、図３Ａ〜３Ｂと同じである。加えて、重要水素結合、塩橋を形成するか、または他の重要である保存位置が示される。

【図3D】それぞれ、ＶＨ（図３Ｃ）及びＶＬ（図３Ｄ）の構造内の保存位置の配置を示す抗原遊離Ｇ６Ｆａｂ（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）コード：２ＦＪＦ）の結晶構造のレンダリングである。陰影スキームは、図３Ａ〜３Ｂと同じである。加えて、重要水素結合、塩橋を形成するか、または他の重要である保存位置が示される。

【図4A】ＶＥＧＦに対してＮＮＫウォークＶＨ（図４Ａ）及びＶＬ（図４Ｂ）ライブラリーをパニングすることにより得られた全ての単一のアミノ酸置換のｌｏｇ２濃縮比を示すヒートマップである。

【図4B】ＶＥＧＦに対してＮＮＫウォークＶＨ（図４Ａ）及びＶＬ（図４Ｂ）ライブラリーをパニングすることにより得られた全ての単一のアミノ酸置換のｌｏｇ２濃縮比を示すヒートマップである。

【図5A】ＶＨ（図５Ａ）及びＶＬ（図５Ｂ）ライブラリーのＶＥＧＦパニングから得られたｌｏｇ２濃縮比が、双峰分布を有することを示すグラフである。特定の実験に関して、検出限度を超えて減損された突然変異を最大観察減損に設定した。ｇＤパニングを使用して特定されるような保存フレームワーク、またはフレームワークの残りにおいて、突然変異をＨＶＲ内の配置に従って色付けする。

【図5B】ＶＨ（図５Ａ）及びＶＬ（図５Ｂ）ライブラリーのＶＥＧＦパニングから得られたｌｏｇ２濃縮比が、双峰分布を有することを示すグラフである。特定の実験に関して、検出限度を超えて減損された突然変異を最大観察減損に設定した。ｇＤパニングを使用して特定されるような保存フレームワーク、またはフレームワークの残りにおいて、突然変異をＨＶＲ内の配置に従って色付けする。

【図5C】選択された突然変異のＶＥＧＦパニングによるｌｏｇ２濃縮比と、親抗体Ｇ６．３１に対するＫｄの変化（図５Ｃ）またはＧ６．３１に対する融解温度（Ｔ_ｍ）の変化（図５Ｄ）との比較を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｂと同じ陰影スキームが使用される。

【図5D】選択された突然変異のＶＥＧＦパニングによるｌｏｇ２濃縮比と、親抗体Ｇ６．３１に対するＫｄの変化（図５Ｃ）またはＧ６．３１に対する融解温度（Ｔ_ｍ）の変化（図５Ｄ）との比較を示すグラフである。図５Ａ〜５Ｂと同じ陰影スキームが使用される。

【図5E】球形として選択された突然変異の配置を示す、Ｇ６Ｆａｂ（ＰＤＢコード、２ＦＪＧ）のＶＨ（図５Ｅ）及びＶＬ（図５Ｆ）のＶＥＧＦ結合形態の結晶構造のレンダリングである。ＶＥＧＦの表面は、表面表現として示される。図５Ａ〜５Ｅと同じ陰影スキームが使用される。標識は、Ｇ６．３１と比較したＴ_ｍ（℃）の変化及び結合親和性（Ｋｄ）の倍率変化を示す。

【図5F】球形として選択された突然変異の配置を示す、Ｇ６Ｆａｂ（ＰＤＢコード、２ＦＪＧ）のＶＨ（図５Ｅ）及びＶＬ（図５Ｆ）のＶＥＧＦ結合形態の結晶構造のレンダリングである。ＶＥＧＦの表面は、表面表現として示される。図５Ａ〜５Ｅと同じ陰影スキームが使用される。標識は、Ｇ６．３１と比較したＴ_ｍ（℃）の変化及び結合親和性（Ｋｄ）の倍率変化を示す。

【図6A】分子により示される異なるＦａｂのＬ字型角度を示す、抗原遊離Ｇ６Ｆａｂ（ＰＤＢ、２ＦＪＦ）の結晶構造中に存在する分子の重畳レンダリングの視覚化である。

【図6B】それぞれ、小さなＦａｂのＬ字型角度（図６Ｂ、濃い灰色）を有する分子内及び大きなＦａｂのＬ字型角度（図６Ｃ、淡い灰色）を有する分子を有するＶＬ−ＶＨ界面、ならびにＬＣ−８３Ｆ及びＬＣ−１０６Ｉの側鎖立体配座の詳細図を示すレンダリングである。βストランドＥ、ヘリックスα−１、及び両方の要素を接合するループは、明確にするために取り除かれている。

【図6C】それぞれ、小さなＦａｂのＬ字型角度（図６Ｂ、濃い灰色）を有する分子内及び大きなＦａｂのＬ字型角度（図６Ｃ、淡い灰色）を有する分子を有するＶＬ−ＶＨ界面、ならびにＬＣ−８３Ｆ及びＬＣ−１０６Ｉの側鎖立体配座の詳細図を示すレンダリングである。βストランドＥ、ヘリックスα−１、及び両方の要素を接合するループは、明確にするために取り除かれている。

【図7A】ＰＤＢの３１９個のヒト抗体構造からの位置ＬＣ−Ｆ８３のｃｈｉ１（Ｘ^１）角度を示すグラフである（右のパネル）。レンダリング（左のパネル）は、「内」及び「外」立体配座内のＬＣ−Ｆ８３の位置を示す。

【図7B】位置１０５におけるｐｓｉ（Ψ）角度及び位置１０６におけるｐｈｉ（Φ）角度のＬ字型角度主鎖立体配座を示すグラフである（右のパネル）。図７Ａに示されるｃｈｉ１角度に従って、構造に陰影をつける。レンダリング（左のパネル）は、「内」及び「外」立体配座内の軽鎖（ＬＣ）位置１０３〜１０８を示す。

【図7C】「内」立体配座及び「外」立体配座内にＬＣ−Ｆ８３を有する抗体構造のＬ字型角度（右上）及びＶＬ／ＣＬ界面域（右下）を示す一連のグラフである。結果を、ＬＣ−Ｆ８３を担うＰＤＢからの３１９個のヒトＦａｂ構造及びＬＣ−８３Ａを担う２２個のヒト構造のＦａｂのＬ字型角度及びＶＬ／ＣＬ界面サイズと比較する。左のパネルは、大きなＬ字型角度及び小さなＬ字型角度を有するＧ６分子の重畳レンダリングを示す。ＶＬ／ＣＬ界面域は、円により示される。

【図8A】大きなＬ字型角度を有するＧ６Ｆａｂ結晶構造（Ｇ６鎖ＶＵ、Ｇ６−ＶＵ）及び小さなＬ字型角度を有する結晶構造（Ｇ６鎖ＢＡ、Ｇ６−ＢＡ）に関するＬＣ−Ｆ８３のｃｈｉ１角度を示すグラフである。

【図8B】示される分子に関する分子動力学シミュレーションの結果を示すグラフである。Ｌ字型角度は、時間の関数としてプロットされる。

【図8C】ＶＨ／ＶＬ回旋角度（「ＨＬ角度」）の関数としてＦａｂのＬ字型角度をプロットする分子動力学シミュレーションの結果を示すグラフである。散乱／輪郭形成プロットは、ＶＵ．Ｆ８３（濃い灰色）及びＶＵ．Ｆ８３Ａ（淡い灰色）が分子動力学シミュレーション中に取るＶＨ／ＶＬ回旋角度及びＬ字型角度を示す。２つの異なる集合体が、２つの分子に関して可視である。

【図9A】１００ｎｓの分子動力学シミュレーションの最後の７５ｎｓの間に得られた分子ＢＡ−Ｆ８３（「外」立体配座内のＬＣ−Ｆ８３）、ＢＡ−Ｆ８３Ａ、ＶＵ−Ｆ９３（「内」立体配座内のＬＣ−Ｆ８３）、及びＶＵ−Ｆ８３ＡのＦａｂのＬ字型角度分布を示すグラフである。分散分析（ＡＮＯＶＡ）／テューキー真正有意差（ＨＳＤ）試験により決定すると、ＢＡ−Ｆ８３及びＢＡ−Ｆ８３Ａを除いて全ての試料は著しく異なった（ｐ＜０．００１）。

【図9B】「外」立体配座（黒）内にＬＣ−Ｆ８３を有するＧ６_非結合の５つの分子及び「内」立体配座（濃い灰色）内にＬＣ−Ｆ８３を有するＧ６_非結合を有する５つの分子のＶＨ／ＶＬ回旋、ならびにＶＥＧＦ結合Ｇ６構造（「ＡＧ結合」、淡い灰色）のＶＨ／ＶＬ回旋角度を示すグラフである。

【図9C】同じ１００ｎｓの分子動力学シミュレーション中の図９Ａと同じ分子のＶＨ／ＶＬ回旋角度分布を示すグラフである。ＡＮＯＶＡ／テューキーＨＳＤ試験により決定すると、ＢＡ−Ｆ８３Ａ及びＶＵ−Ｆ８３Ａを除いて全ての試料は著しく異なった（ｐ＜０．００１）。

【図9D】Ｇ６．３１とＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}との間に異なる水素−重水素交換パターンを有する領域を示す非結合Ｇ６の結晶構造のレンダリングである。濃い灰色に陰影をつけた領域は、Ｇ６．３１と比較してＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}においてよりゆっくりとした交換を有したが、中間の灰色に陰影をつけた領域は、Ｇ６．３１と比較してＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}においてより速い交換を有した。Ｆ８３Ａの突然変異及びＤＥループの位置は、線により示される。

【図10A】ＩＧＫＶ１生殖細胞系から発生する抗体配列の示されるＶＬ位置に関して体細胞突然変異の分布を示すグラフである。ジェンバンク、タンパク質データベース（ＰＤＢ）、Ｋａｂａｔデータベース、Ａｂｙｓｉｓデータベース、及びＩＭＧＴデータベース（「公開データセット」）から公的に入手可能なヒト抗体配列を使用して、上のパネル内の突然変異分布を得た。１０００を超える個別のヒトリンパ系組織から得られたｃＤＮＡの単一分子リアルタイム配列決定法（ＳＭＲＴ）を使用して、下のパネル内の突然変異分布を得た。公的に入手可能な配列のＮ末端における高い突然変異率は、クローニング人工物であることに因る可能性が高い。

【図10B】図１０Ａ及び実施例８（Ｓａｎｇｅｒ）に記載されている公開データセット、またはＳＭＲＴデータセット（ＰａｃＢｉｏ）からのＩＧＫＶ１．３９配列の位置ＬＣ−８３における最も一般的な突然変異を示すグラフである。ＩＧＫＶ１．３９は、位置ＬＣ−８３でフェニルアラニンを担う。それぞれのアミノ酸サイズにより点を色付けする。大きなアミノ酸を黄色で色付け、小さなアミノ酸を暗赤色で色付けする。

【図10C】公開データセット（Ｓａｎｇｅｒ）またはＳＭＲＴデータセット（ＰａｃＢｉｏ）で見られる全てのＩＧＫＪ配列の位置ＬＣ−１０６における最も一般的な突然変異を示すグラフである。それぞれのアミノ酸サイズにより点に陰影をつける。大きなアミノ酸を淡い灰色で色付け、小さなアミノ酸を濃い灰色で色付けする。

【図10D】ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴により測定したときのＧ６．３１の選択された突然変異体の親和性（Ｋｄ）（左のパネル）、及び示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定したときの選択されたＧ６．３１突然変異体の融解温度Ｔ_ｍ（右のパネル）を示す一連のグラフである。左のパネル内の円は、誤差棒により示されるそれぞれの標準偏差を有する３つの複製物からの平均を表す。右のパネル内の円は、３つの複製物からの平均及び誤差棒により示されるそれぞれの標準偏差を表す。

【図11A】実施例１１に記載されるように、ウサギの目の中のそれぞれのＦａｂの硝子体内（ＩＶＴ）投与後のＧ６．３１ＡＡＥＥ、Ｇ６．３１ＷＴ、及びＧ６．３１ＡＡＲＲの各々の水性及び硝子体薬物動態を示すグラフである。

【図11B】実施例１１に記載されるように、ウサギの目の中のそれぞれのＦａｂの硝子体内投与後のＧ６．３１ＡＡＥＥ、Ｇ６．３１ＷＴ、及びＧ６．３１ＡＡＲＲの各々の血清からのクリアランスを示すグラフである。

【図12】示される抗体クローンに関するキャピラリー電気泳動‐ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）によるフラグメンテーション分析を示す表である。フラグメンテーションは、ＰＢＳ中、３７℃での４週、１２週、及び２４週間後の低分子量構成要素（ＬＭＷ％）のパーセンテージにより表される。フラグメンテーションは、野生型Ｇ６．３１と比較して全てのＮ９４Ａ変異体において一貫して低減される。高分子量構成要素（ＨＭＷ％）は、不純物または集合体を示す。このアッセイにおける主なピークサイズは、フラグメンテーションの程度と直接相互関連しないが、フラグメントサイズ及び色素標識の程度に応じる。抗ＶＥＧＦ Ｆａｂラニビズマブは、対照の機能を果たした。

【図13】実施例１２に記載されるように、多様なＦａｂ濃度で親Ｇ６．３１と比較した、Ｇ６．３１変異体ＬＣ−Ｎ９４ＡによるＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ移動の阻害のプロットを示すグラフである。

【図14】ＨＡ４０Ｋ−ｒａｂＦａｂ、ＨＡ２００Ｋ−ｒａｂＦａｂ、及びＨＡ６００Ｋ−ｒａｂＦａｂのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び屈折率（ＲＩ）多角度光散乱（ＭＡＬＳ）（ＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ）分析を示し、重量平均分子質量（Ｍｗ）が重ねて示されるグラフである。

【図15】ＨＹＡＬ−２でインキュベートしたＨＡ及びＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂのＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析により査定した場合、ｒａｂＦａｂに複合体化されたヒアルロン酸（ＨＡ）が、ヒアルロニダーゼ−２（ＨＹＡＬ２）による消化に対する酵素感受性を保持することを示すグラフである。ＨＡ−ｒａｂＦａｂ試料に関して、右のＭｗ軸は、単に複合体のＨＡ構成成分であるＭｗとして表される。

【図16】硝子体内注入後のウサギ硝子体からのラニビズマブ、ｒａｂＦａｂ、及びＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ（「線状ＨＡ−ｒａｂＦａｂ」）のクリアランスを示すグラフである。ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂは、ｒａｂＦａｂのおよそ２．５日と比較して、およそ１１．９日の半減期を提示した。

【図17】ウサギ硝子体内において、硝子体滞留時間が、流体力学半径（Ｒｈ；グラフ内で「Ｒ_Ｈ」として示される）と直線的に相互関連することを示すグラフである。ｒａｂＦａｂ、ｒａｂＦａｂ−２０ｋＤａ ＰＥＧ、ｒａｂＦａｂ−４０ｋＤａ ＰＥＧ、及びＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂの履歴データ（塗り潰された円）は、測定されたＲｈ値に基づいて、ＨＡ１００Ｋ−Ｇ６．３１ＡＡＲＲ（塗り潰しなしの円）、ＨＡ２００Ｋ−Ｇ６．３１ＡＡＲＲ（塗り潰しなしの四角）、及びＨＡ３００Ｋ−Ｇ６．３１（塗り潰しなしの三角）の半減期を予測するために使用され得る。

【発明を実施するための形態】

【0101】

Ｉ．定義
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。

【0102】

本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはそれは、アミノ酸配列変化を含有し得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークの配列は、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

【0103】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、「結合親和性」は、本明細書で使用される場合、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は概して、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当該技術分野において既知の一般的な方法により測定され得る。結合親和性を測定するための具体的な例証的かつ例示的な実施形態が、以下に記載される。

【0104】

「親和性成熟」抗体とは、改変を保有しない親抗体と比較して、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）及び／またはフレームワーク領域（ＦＲ）に１つ以上の改変を有し、かかる改変により抗体の抗原に対する親和性が改善される抗体を指す。

【0105】

「血管内皮成長因子」または「ＶＥＧＦ」という用語は、配列番号４７（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５６９２、Ｇｅｎｅ ＩＤ（ＮＣＢＩ）：７４２２も参照されたい）により例示されるような、血管内皮成長因子タンパク質Ａを指す。「ＶＥＧＦ」という用語は、配列番号４７のアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびにその相同体及びアイソフォームを包含する。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、既知のアイソフォーム、例えば、ＶＥＧＦのスプライスアイソフォーム、例えば、ＶＥＧＦ_１１１、ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８９、及びＶＥＧＦ_２０６を、それらの天然のアレル形態及びプロセシング形態と共に包含し、これには、Ｆｅｒｒａｒａ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２１：６８７（２０１０），Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６（１９８９）、及びＨｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）に記載されているようなＶＥＧＦ_１６５のプラスミン切断により生成された１１０個のアミノ酸の血管内皮細胞成長因子が含まれる。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、マウス、ラット、または霊長類などの非ヒト種に由来するＶＥＧＦを指す。特定の種に由来するＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦではｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦではｍＶＥＧＦなどの用語により示される。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、１６５個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含む、ポリペプチドの切断形態を指して使用されることもある。ＶＥＧＦの任意のかかる形態への言及は、本出願において、例えば、「ＶＥＧＦ_１０９」、「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」、または「ＶＥＧＦ_１６５」により特定され得る。「切断型」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位は、天然ＶＥＧＦ配列に示されるように番号付けされる。例えば、切断型天然ＶＥＧＦでのアミノ酸１７位（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦでも１７位（メチオニン）である。切断型天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対して、天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。「ＶＥＧＦ変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、天然ＶＥＧＦ配列に１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。任意に、この１つ以上のアミノ酸突然変異には、アミノ酸置換（複数可）が含まれる。本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体を簡潔に表記する目的で、数字は、推定上の天然ＶＥＧＦ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＨｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に提供される）のアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指すことが留意される。別途示されない限り、「ＶＥＧＦ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦ−Ａを示す。

【0106】

「抗ＶＥＧＦ抗体」、「ＶＥＧＦに結合する抗体」、及び「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体が診断剤及び／または療法剤としてＶＥＧＦを標的とするのに有用となるような十分な親和性でＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体が無関係の非ＶＥＧＦタンパク質に結合する程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定した場合に、抗体がＶＥＧＦに結合する約１０％未満である。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、異なる種からのＶＥＧＦ間で保存されているＶＥＧＦのエピトープに結合する。

【0107】

「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

【0108】

「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの事例において、抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0109】

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、及び容易に結晶化する能力を反映して表記される残留「Ｆｃ」フラグメントが産生される。Ｆａｂフラグメントは、重（Ｈ）鎖（ＶＨ）の可変領域ドメインと共に全軽（Ｌ）鎖と、１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ（ａｂ’）_２フラグメントが産出され、これは概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連鎖Ｆａｂフラグメントに対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加の残基を数個しか有さない点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ−Ｃ分子は、配列が、第１のヒンジシステインで切断され、発現に際し直接的に遊離システインを有するＦａｂをもたらすように発現されるＦａｂ分子である（例えば、Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１６；ＰｕｂＭｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＰＭＩＤ）２７２４４４７４を参照されたい）。例えば、Ｆａｂ−Ｃ分子は、重鎖の位置Ｃｙｓ２２７で遊離システインを有し得る。他の事例において、Ｆａｂ−Ｃ分子は、重鎖の位置Ｃｙｓ２２９で遊離システインを有し得る。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として産生されたものであった。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた既知である。

【0110】

本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で別途示されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているように、ＥＵ指標とも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。

【0111】

「Ｆｖ」は、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変領域ドメインが緊密な非共有結合で結合した二量体からなる。２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に与える、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各々３つのループ）が生じる。しかし、しばしば全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

【0112】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接合されているＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む、抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーにより、ｓＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することが可能となっている。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。

【0113】

「ダイアボディ」という用語は、鎖内ではなく鎖間のＶドメイン対合が達成され、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を用いてｓＦｖフラグメント（前述の段落を参照されたい）を構築することにより調製された小さな抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在している、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）でより完全に記載されている。

【0114】

「遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。

【0115】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体がその抗原へ結合することを５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体がその抗原へ結合することを５０％以上遮断する参照抗体を指す。例示的な競合アッセイが本明細書に提供される。

【0116】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。

【0117】

抗体の「クラス」は、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0118】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が含まれる。

【0119】

「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは概して、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。

【0120】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、または本明細書に定義されるようなＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指して、本明細書において互換的に使用される。

【0121】

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0122】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。概して、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位群である。一実施形態において、ＶＬに関して、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記）にあるような下位群カッパＩである。一実施形態において、ＶＨに関して、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記）にあるような下位群ＩＩＩである。

【0123】

非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の配列を最小限に含んだキメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び機能性を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基により置き換えられる。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものが含まれるであろう。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。

【0124】

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが、抗体間の配列において大幅に異なるという事実を指す。可変または「Ｖ」ドメインは、抗原結合を媒介し、かつ特定の抗体の特定の抗原に対する特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインに均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、各々９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域により分離される１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は概して、例えば、ＶＬでは大体残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨで大体残基２６〜３５（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）（一実施形態において、Ｈ１は、大体残基３１〜３５である）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））からのアミノ酸残基、さらに／または「超可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬでは残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨでは２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を含む。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にベータシート構成を取る４つのＦＲを含み、３つの超可変領域により接合され、それによりベータシート構造を接合するループ、及びいくつかの場合において、その一部を形成するループが形成される。各鎖における超可変領域は、ＦＲにより他方の鎖の超可変領域と近位して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照されたい）。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は概して、ＶＨ（またはＶＬ）にＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の順序で現れる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を示す。

【0125】

「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、「標準の」Ｋａｂａｔにより番号付けされた配列との抗体の配列の相同領域での整列により決定され得る。

【0126】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムは概して、可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）内の残基に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は概して、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記）で報告されるＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。本明細書に別途示されない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書に別途示されない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによる残基番号付けを意味する（例えば、米国仮出願第６０／６４０，３２３号、ＥＵ番号付けに関する図を参照されたい）。

【0127】

別途示されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔら（上記）に従って本明細書で番号付けされる。

【0128】

「免疫複合体」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない１つ以上の異種分子（複数可）に複合体化される抗体である。

【0129】

「単離抗体」という用語は、本明細書に開示される様々な抗体を記載するために使用されるとき、抗体が発現された細胞または細胞培養物から特定され、分離及び／または回収されている、抗体を意味する。その天然環境の混入成分は典型的には、ポリペプチドの診断上または療法用途を妨げる材料であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態において、本抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体純度を査定するための方法の概説に関しては、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。好ましい実施形態において、本抗体は、（１）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して非還元もしくは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製されるであろう。単離抗体には、組み換え細胞内でインサイツの抗体が含まれるが、これは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、通常は、単離ポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。

【0130】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団をなす個別の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に生じる突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異体抗体を除き、かかる変異体は概して、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、多様な技法により作製されてもよく、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。

【0131】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、特に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体を網羅し、ここで、このＶＨ−ＶＬ単位は、多重エピトープ特異性（すなわち、１つの生体分子上の２つの異なるエピトープまたは異なる生体分子上の各エピトープに結合することができる）を有する。かかる多重特異性抗体には、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’。Ｆａｂ−Ｃ。Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ及びトリアボディ、共有連鎖または非共有連鎖されている抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」は、同じかまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「二特異性」または「二重特異性」は、同じかまたは異なる標的（複数可）上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる能力を指す。しかし、二重特異性抗体とは対照的に、二特異性抗体は、アミノ酸配列が同一である２つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームにより２つの抗原を認識することができる。二重特異性は、抗体が、高い親和性で単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として２つの異なる抗原と相互作用することを可能にする。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態の多重特異性抗体は、５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭ、または０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合する。「単一特異性」は、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。

【0132】

「天然抗体」は、多様な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。

【0133】

抗体の標的分子への結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的な結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、非特異的相互作用とはある程度異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を、対照分子の結合と比較して決定することにより測定され得る。例えば、特異的な結合は、標的に類似している対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合により決定され得る。この場合、特異的な結合は、標識標的のプローブへの結合が、過剰な非標識標的により競合的に阻害された場合に示される。特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的な結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、標的に対して、１０^−４Ｍ以下、あるいは１０^−５Ｍ以下、あるいは１０^−６Ｍ以下、あるいは１０^−７Ｍ以下、あるいは１０^−８Ｍ以下、あるいは１０^−９Ｍ以下、あるいは１０^−１０Ｍ以下、あるいは１０^−１１Ｍ以下、あるいは１０^−１２Ｍ以下のＫｄ、または１０^−４Ｍ〜１０^−６Ｍ、もしくは１０^−６Ｍ〜１０^−１０Ｍ、もしくは１０^−７Ｍ〜１０^−９Ｍの範囲のＫｄを有する分子により示すことができる。当業者には理解されるように、親和性及びＫｄの値は、逆相関している。抗原の高い親和性は、低いＫｄ値により測定される。一実施形態において、「特異的な結合」という用語は、ある分子が、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープに実質的に結合することなく結合する、結合を指す。

【0134】

「抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（またはそれらのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクターまたは別々のベクター内のかかる核酸分子（複数可）を含み、かかる核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。

【0135】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが結合している別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連鎖している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。

【0136】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含有し得る。元々形質転換された細胞に関してスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が、本明細書に含まれる。

【0137】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が開発したものであり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。

【0138】

アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ａとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ａへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算され：１００×分数Ｘ／Ｙ、式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によりそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致とスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％が、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解される。別途具体的に明記されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0139】

本明細書で使用される場合、「投与する」は、ある投与量の化合物（例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、本発明の抗体複合体、本発明の融合タンパク質、本発明の高分子製剤、または本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸）または組成物（例えば、薬学的組成物、例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、本発明の抗体複合体、本発明の融合タンパク質、または本発明の高分子製剤を含む薬学的組成物）を、対象に供与する方法を意味する。本明細書に記載される方法で利用される組成物は、例えば、硝子体内に（例えば、硝子体内注入により）、目薬により、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼内に、眼窩内に、口腔内に、局所的に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与され得る。本明細書に記載される方法で利用される組成物は、全身または局所的にも投与され得る。投与方法は、様々な要因（例えば、投与される化合物または組成物、及び治療される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて異なり得る。

【0140】

「血管形成」は、新しい血管が既存の血管から形成するプロセスである。血管形成は、中胚葉細胞前駆体からの内皮細胞のデノボ形成である脈管形成とは異なる。病理学的血管形成に関連付けられる障害は、本発明の組成物及び方法により治療することができる。これらの障害には、非腫瘍性障害及び細胞増殖性障害の両方が含まれる。細胞増殖性障害には、以下に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。非腫瘍性障害には、眼の状態（非限定的な眼の状態には、例えば、増殖性糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、網膜静脈閉塞症（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、ならびに高血圧性網膜症を含む網膜症が含まれる）、自己免疫疾患（例えば、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬、強直性脊椎炎、及び炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎））、所望されないまたは異常な肥大、関節炎、乾癬性関節炎、乾癬プラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性プラーク、動脈性動脈硬化症、血管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜及び他の組織移植、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性肺水貯留、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷に関連付けられる）、滑膜炎症、ＲＡ内のパンヌス形成、骨化性筋炎、超回帰線骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、難治性腹水、多嚢胞卵巣疾患、子宮内膜症、細胞外液喪失疾患（３ｒｄ ｓｐａｃｉｎｇ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｄｉｓｅａｓｅ）（膵臓炎、コンパートメント症候群、火傷、腸疾患）、慢性喘息、子宮筋腫、早期分娩、ＩＢＤなどの慢性炎症（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、炎症性腎疾患（糸球体腎炎、特に、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性尿毒症候群、糖尿病性腎症、及び高血圧性腎硬化症を含む）、移植後に生じる疾患、腎同種移植片拒絶反応、炎症性疾患、ネフローゼ症候群、所望されないまたは異常な組織塊成長（非癌）、血友病性関節、肥厚性瘢痕、毛髪成長の阻害、オースラ−ウェバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖、強皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎、妊娠高血圧腎症、腹水、心膜液貯留（心膜炎に関連付けられるものなど）、ならびに胸水貯留が含まれるが、これらに限定されない。追加の眼の障害は、以下に記載される。

【0141】

病理学的血管形成に関連付けられ得る他の障害には、偽関節性骨折（治癒しない骨折）、化膿性肉芽腫、トラコーマ、血友病性関節、血管接着及び肥厚性瘢痕、移植片拒絶反応、繊維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）組織、酒さ性ざ瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞症、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット病、頸動脈閉塞症、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ過度装用症、角膜移植片拒絶反応、角膜移植血管新生、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純疱疹感染症、帯状疱疹感染症、過粘着性症候群、カポジ肉腫、白血病、脂肪変性症、ライム病、辺縁表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染症、近視、乳頭小窩ピット、骨関節炎、ページェット病、扁平部睫状体炎、類天疱瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、多発性動脈炎、レーザー後合併症、原虫感染症、弾力繊維性仮性黄色腫、乾燥翼状片角膜炎（ｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ ｓｉｃｃａ）、放射状角膜切開、後水晶体線維形成、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球症、シェーグレン症候群、シュタルガルト病、スティーブンス・ジョンソン病、上位辺縁系角膜炎、梅毒、全身紅はん性、テリエン周辺角膜変性症、トキソプラズマ病、外傷、静脈閉塞症、ビタミンＡ欠損症及びヴェーゲナーサルコイドーシス、糖尿病に関連付けられる所望されない血管形成、寄生虫性疾患、異常創傷治癒、術後肥大、損傷または外傷、毛髪成長の阻害、排卵及び黄体形成の阻害、子宮内での着床の阻害及び胚発生の阻害が含まれる。

【0142】

「眼の障害」という用語は、本明細書で使用される場合、病理学的血管形成に関連付けられる任意の眼の障害（本明細書において互換的に「眼の状態」とも称される）を含む。眼の障害は、新しい血管の改変もしくは制御されていない増殖、及び／または網膜もしくは角膜などの眼の組織構造への侵入を特徴とし得る。非限定的な眼の障害には、例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、及び地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥ及びびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障（レーバー先天性黒内障またはＬＣＡとしても既知である）、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、シェーグレン病、ならびに疾患または障害が眼内血管新生（ｏｃｕｌａｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、血管漏出、及び／または網膜浮腫に関連付けられる他の眼の疾患が含まれる。追加の例示的な眼の障害には、全ての形態の増殖性硝子体網膜症を含む、皮膚潮紅（隅角血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｇｌｅ）に関連付けられる疾患、及び繊維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）または繊維組織の異常増殖により引き起こされる疾患が含まれる。

【0143】

角膜血管新生に関連付けられる例示的な疾患には、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠損症、コンタクトレンズ過度装用症、アトピー性角膜炎、上位辺縁系角膜炎、乾燥翼状片角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂肪変性症、化学的熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純疱疹感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁角膜変性症、辺縁表皮剥離、リウマチ性関節炎、全身紅はん性、多発性動脈炎、外傷、ウェジナーサルコイド症、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、ペリフィゴイド放射状角膜切開、及び角膜移植片拒絶反応が含まれるが、これらに限定されない。

【0144】

網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる例示的な疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球症、サルコイド、梅毒、弾力繊維性仮性黄色腫、ページェット病、静脈閉塞症、動脈閉塞症、頸動脈閉塞症、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜色素変性症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）を引き起こす感染症、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病（卵黄様黄斑変性症）、近視、乳頭小窩ピット、シュタルガルト病、扁平部睫状体炎、網膜剥離（例えば、慢性網膜剥離）、過粘着性症候群、トキソプラズマ病、外傷、及びレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。

【0145】

「望ましくない血管透過性に関連付けられる障害」には、本明細書で使用される場合、例えば、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、循環器疾患に関連付けられる透過性、例えば、心筋梗塞及び脳卒中後の状態などが含まれる。

【0146】

上述される分類は、相互排他的ではなく、障害は、複数のカテゴリーに入ってもよいことを理解されたい。

【0147】

「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連付けられる障害を指す。一実施形態において、細胞増殖性障害は、癌である。

【0148】

「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的ではない。

【0149】

「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、悪性または良性に関わらず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。

【0150】

「血管形成因子または薬剤」は、血管の発生を刺激する、例えば、血管形成、内皮細胞成長、血管の安定化、及び／または脈管形成などを促進する成長因子である。例えば、血管形成因子には、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、繊維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、Ｄｅｌ−１、繊維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）及び塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子、特に、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦＲ−ベータ、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−アルファ）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）などが含まれるが、これらに限定されない。それには、成長ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの、創傷治癒を促進する因子も含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）、Ｓｔｒｅｉｔ ａｎｄ Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）、Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）、Ｔｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、既知の血管形成因子を列挙する表１）、及びＳａｔｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照されたい。

【0151】

「抗血管形成薬剤」または「血管形成阻害剤」は、血管形成、脈管形成、または望ましくない血管透過性を直接的または間接的に阻害する小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離タンパク質、組み換えタンパク質、抗体、またはそれらの複合体もしくは融合タンパク質を指す。抗血管形成薬剤には、血管形成因子またはその受容体の血管形成活性を結合及び遮断する薬剤が含まれることを理解されたい。例えば、抗血管形成薬剤は、上記で定義されるような、血管形成薬剤に対する抗体または他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ａ受容体（例えば、ＫＤＲ受容体またはＦｌｔ−１受容体）に対する抗体）、ＰＤＧＦアンタゴニスト（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（メシル酸イマチニブ）などの抗ＰＤＧＦＲ阻害剤）である。抗血管形成薬剤には、天然血管形成阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンなども含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）、Ｓｔｒｅｉｔ ａｎｄ Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）（例えば、悪性黒色腫における抗血管形成療法を列挙する表３）、Ｆｅｒｒａｒａ＆Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）、Ｔｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、既知の抗血管形成因子を列挙する表２）、及びＳａｔｏ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）（例えば、表１は臨床治験で使用される抗血管形成剤を列挙する）。

【0152】

「ＶＥＧＦアンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦに結合すること、ＶＥＧＦ発現レベルを低減させること、または１つ以上のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合、ＶＥＧＦのシグナル伝達、ならびにＶＥＧＦに媒介される血管形成及び内皮細胞生存もしくは増殖を含むがこれらに限定されないＶＥＧＦの生物学的活性を中和する、遮断する、阻害する、抑止する、低減させる、もしくはそれに干渉することが可能な分子を指す。例えば、ＶＥＧＦの生物学的活性を中和する、遮断する、阻害する、抑止する、低減させる、またはそれに干渉することができる分子は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合型ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、または可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））に結合することによりその効果を発揮することができる。ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合フラグメント、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより１つ以上の受容体への結合を封鎖する受容体分子及び誘導体、融合体タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）及びＶＥＧＦ_１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ））が、本発明の方法において有用なＶＥＧＦアンタゴニストとして含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つのフラグメントに相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つのフラグメントに相補的な低分子ＲＮＡ、ＶＥＧＦを標的とするリボザイム、ＶＥＧＦに対するペプチボディ、及びＶＥＧＦアプタマーも含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦＲに結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦＲ抗体、及びそれらの抗原結合フラグメント、ならびにＶＥＧＦＲに結合し、それによりＶＥＧＦの生物学的活性（例えば、ＶＥＧＦのシグナル伝達）を遮断する、阻害する、抑止する、低減させる、もしくはそれに干渉する誘導体、または融合体タンパク質も含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに結合し、ＶＥＧＦの生物学的活性を遮断する、阻害する、抑止する、低減させる、またはそれに干渉することができる、非ペプチド小分子も含まれる。したがって、「ＶＥＧＦ活性」という用語は、ＶＥＧＦに媒介される、ＶＥＧＦの生物学的活性を具体的に含む。ある特定の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベルまたは生物学的活性を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストにより阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ（８〜１０９）、ＶＥＧＦ（１〜１０９）、またはＶＥＧＦ_１６５である。

【0153】

本明細書で使用される場合、ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦＲ２抗体及び関連分子（例えば、ラムシルマブ、タニビルマブ、アフリベルセプト）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、イクルクマブ、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ、ＥＹＬＥＡ（登録商標））、及びジブ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）））、二重特異性ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＭＰ−０２５０、バヌシズマブ（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）、及びＵＳ２００１／０２３６３８８に開示されている二重特異性抗体）、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ＶＥＧＦＲ２アームのうちの２つの組み合わせを含む二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、セバシズマブ、及びラニビズマブ）、ならびに非ペプチド小分子ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、スチバーガ、カボザンチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、テラチニブ、ドビチニグ（ｄｏｖｉｔｉｎｉｇ）、セジラニブ、モテサニブ、スルファチニブ、アパチニブ、フォレチニブ、ファミチニブ、及びチボザニブ）が含まれ得るが、これらに限定されない。追加のＶＥＧＦアンタゴニストは、以下に記載される。

【0154】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、必要な投与量で必要な期間にわたって所望の療法または予防結果を達成するのに有効な量を指す。

【0155】

「固体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。「対象」は、「患者」であり得る。

【0156】

「癌」及び「癌性」という用語は、制御されていない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。かかる癌のより特定された例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、及び種々の頭頸部癌が含まれる。治療目的のための「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物及び家畜、非ヒト霊長類、ならびに動物園、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を指す。

【0157】

「障害」は、抗体を用いた治療により利益を得るであろう任意の状態である。例えば、異常血管形成（過剰な、不適切な、または制御できない血管形成）または血管透過性を患うかまたはそれに対する予防を必要とする哺乳動物。これには、哺乳動物を問題の障害に罹りやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性障害または疾患が含まれる。本明細書において治療されるべき障害の非限定的な例には、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、眼の障害及び細胞増殖性障害）及び望ましくない血管透過性に関連付けられる障害が含まれる。

【0158】

「抗腫瘍性組成物」という用語は、少なくとも１つの活性療法剤、例えば、「抗癌剤」を含む、癌を治療するのに有用な組成物を指す。療法剤（抗癌療法剤）の例には、例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法で使用される薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、ならびに癌を治療するための他の薬剤、例えば、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、またはＶＥＧＦ受容体（複数可）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、他の生理活性及び有機化学薬剤などのうちの１つ以上に結合する抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、アンタゴニスト（例えば、中和抗体）が含まれるが、これらに限定される。これらの組み合わせも、本発明に含まれる。

【0159】

「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤もしくは化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそれらのフラグメント；抗生物質；細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素（それらのフラグメント及び／または変異体を含む）などの毒素；ならびに以下に記載される様々な抗腫瘍または抗癌薬剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0160】

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロスレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１Ｉ及びカリケアミシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４を参照されたい））；ジネマイシンＡを含むジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモホア及び関連クロモタンパク質エンジイン抗オビオティック（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）クロモホア）、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピュロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニシン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシン及びアンサミトシンなどマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類錯体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリデンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル、（Ｂｒｉｓｔｏｌ− Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモホール−フリー、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ− Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イダンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ，ＣＰＴ−１１）（５−ＦＵとロイコボリンを用いたイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）））、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。

【0161】

また、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍におけるホルモン作用を制御または阻害する上で作用する抗ホルモン剤；副腎におけるエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタイン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、具体的には、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓなど；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；ワクチン、例えば、遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体もこの定義に含まれる。

【0162】

「前駆薬物」という用語は、本明細書で使用される場合、親薬物と比較すると腫瘍細胞に対して細胞傷害性が低く、酵素によってより活性な親形態へと活性化または変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明の前駆薬物にはリン酸塩含有前駆薬物、チオリン酸塩含有前駆薬物、硫酸塩含有前駆薬物、ペプチド含有前駆薬物、Ｄアミノ酸修飾前駆薬物、グリコシル化前駆薬物、β−ラクタム含有前駆薬物、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有前駆薬物または任意に置換されたフェニルアセトアミド含有前駆薬物、５−フルオロシトシン、及び他の５−フルオロウリジン前駆薬物が含まれるがこれらに限定されず、これらは、より活性な細胞傷害性遊離薬物へと変換され得る。本発明で使用するための前駆薬物形態に誘導体化され得る細胞傷害性薬物の例には、上述される化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0163】

「添付文書」という用語は、かかる療法剤製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含む、療法剤製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。

【0164】

「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性の、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0165】

「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤）の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。

【0166】

本明細書で使用される場合、「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などのその文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変更することを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理過程中に実施され得る。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状の回復または寛解、及び緩解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体または本発明の抗体を含む他の組成物（例えば、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤）が、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。

【0167】

「単離」核酸分子は、それが通常、核酸の天然源で関連している、少なくとも１つの汚染核酸分子から特定及び分離される核酸分子である。単離核酸分子は、自然に見られる形態または状況以外の状態にある。したがって、単離核酸分子は、天然細胞内に存在するような核酸分子と区別される。しかし、単離核酸分子は、抗体を通常発現させる細胞内に含有される核酸分子を含み、ここで、例えば、核酸分子は天然細胞の核酸分子とは異なる染色体配置にある。

【0168】

「制御配列」という表現は、特定の宿主生物における、操作可能に連鎖されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが既知である。

【0169】

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係性に置かれているとき、「操作可能に連鎖」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡと操作可能に連鎖しており、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に操作可能に連鎖しているか、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連鎖されている。概して、「操作可能に連鎖」されるは、連鎖しているＤＮＡ配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合においては連続的であり、かつリーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続的でなくてもよい。連鎖は、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。かかる部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来的な慣例に従って使用される。

【0170】

本明細書で使用される場合、発現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、かかる全ての表記は、子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞及び転換の数に関わらずそれを由来とする培養物を含む。全ての子孫が、意図的な突然変異または不慮の突然変異に起因して、ＤＮＡ含有量が精密に同一でなくてもよいことも理解される。元々形質転換された細胞に関してスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が含まれる。異なる表記が意図される場合、文脈から明確になるであろう。

【0171】

本明細書で使用される場合、「ライブラリー」は、複数の抗体もしくは抗体フラグメント配列（例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体）、またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、本発明の方法に従ってこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組み合わせにおいて異なる。

【0172】

「突然変異」は、野生型配列などの参照ヌクレオチド配列に対する、ヌクレオチド（複数可）の欠失、挿入、または置換である。

【0173】

本明細書で使用される場合、「コドンセット」は、所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチド三連配列のセットを指す。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、コドンセットにより提供されるヌクレオチド三連配列の可能性のある全ての組み合わせを表し、所望のアミノ酸群をコードするであろう配列を含む固相合成法により合成され得る。コドン表記の標準形態は、ＩＵＢコードの標準形態であり、これは、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される。コドンセットは典型的には、例えば、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどの斜字体で３つの大文字により表される。例えば、ＴＲＩＭ法（Ｋｎａｐｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（１９９９））、Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ１２８：１０３（１９９３））などのある特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮退」を有するオリゴヌクレオチドとの合成は、当該技術分野において周知されている。ある特定のコドンセットを有するかかるオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能である）を使用して合成され得るか、または市販されているものから得ることができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは典型的には、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、この差異は、全体的な配列内のコドンセットにより確立される。本発明に従って使用されるようなオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸テンプレートに対するハイブリダイゼーションを可能にし、必須ではないが、例えば、クローニングの目的に有用な制限酵素部位も含み得る配列を有する。

【0174】

「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドがファージ、例えば、糸状ファージ粒子の表面上にコートタンパク質の少なくとも一部分への融合タンパク質としてディスプレイされる技法である。ファージディスプレイの有用性は、ランダムなタンパク質変異体の大きなライブラリーが、標的抗原に高い親和性で結合する配列に関して高速かつ効率的に分類され得るという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーのファージへのディスプレイは、特異的な結合特性を有するものに関して、何百万ものポリペプチドをスクリーニングするのに使用されている。多価ファージディスプレイ法は、小さなランダムペプチド及び小さなタンパク質を、糸状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合を通じてディスプレイするために使用されている。Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２（１９９２）、及びそこに引用されている参考文献。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質またはペプチドライブラリーは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部分に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１つのコピーをディスプレイするか、または融合タンパク質をディスプレイしないように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルに発現される。結合活性効果が多価ファージと比べて低減しているため、分類は本質的なリガンド親和性に基づき、ファージミドベクターが使用され、これによりＤＮＡ操作が単純なものになる。Ｌｏｗｍａｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６（１９９１）。

【0175】

「ファージミド」は、細菌複製起点、例えば、Ｃｏ１Ｅ１と、バクテリオファージの遺伝子間領域のコピーとを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージを含む任意の既知のバクテリオファージに使用することができる。プラスミドは概して、抗生物質耐性の選択的マーカーも含むであろう。これらのベクターにクローニングしたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして伝播され得る。これらのベクターを持つ細胞に、ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝子を提供すると、プラスミドの複製様式がローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの一本鎖のコピー及びパッケージファージ粒子が生成される。ファージミドは、感染性または非感染性ファージ粒子を形成し得る。この用語には、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面にディスプレイされるように、遺伝子融合として異種ポリペプチド遺伝子に連鎖したファージコートタンパク質遺伝子またはそのフラグメントを含む、ファージミドが含まれる。

【0176】

「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含み、複製することができるバクテリオファージの二本鎖複製形態を意味する。ファージベクターは、ファージ複製及びファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージなどの糸状バクテリオファージもしくはそれらの誘導体、またはラムダ２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４などのラムドイドファージもしくはそれらの誘導体などである。

【0177】

開始または参照ポリペプチド（例えば、参照抗体またはその可変ドメイン（複数可）／ＨＶＲ（複数可））の「変異体」または「突然変異体」は、（１）開始または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、（２）天然突然変異生成または人工的（人造的）突然変異生成のいずれかによる開始または参照ポリペプチドに由来したポリペプチドである。本明細書において「アミノ酸残基改変」と称される、かかる変異体には、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。したがって、変異体ＨＶＲは、開始または参照ポリペプチド配列に関して変異体配列を含むＨＶＲを指す（抗体源または抗原結合フラグメントのＨＶＲなど）。この文脈において、アミノ酸残基改変は、開始または参照ポリペプチド配列内の対応する位置におけるアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す（参照抗体またはそのフラグメントのアミノ酸など）。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせにより、最終変異体または突然変異体構築物に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の機能的特徴を保有することを条件とする。アミノ酸変化は、ポリペプチドの翻訳後処理も改変し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化することができる。

【0178】

「野生型（ＷＴ）」もしくは「参照」配列、または「野生型」もしくは「参照」タンパク質／ポリペプチドの配列、例えば、参照抗体のＨＶＲまたは可変ドメインは、変異体ポリペプチドが突然変異の導入を通じて誘導された参照配列であり得る。概して、所与のタンパク質に関する「野生型」配列は、自然界で最も一般的である配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も一般的に見られる、その遺伝子に対する配列である。突然変異は、自然過程で、または人工的な誘導手段のいずれかを通じて「野生型」遺伝子に導入され得る（したがって、それがコードするタンパク質）。かかる過程の産生物は、元の「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」形態である。

【0179】

「参照抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体またはそのフラグメントを指し、その抗原結合配列は、本明細書に記載される基準に従って多様化が実施されるとテンプレート配列としての機能を果たす。抗原結合配列は概して、好ましくはフレームワーク領域を含む抗体可変領域を好ましくは少なくとも１つ含む。

【0180】

当該技術分野において「次世代配列決定法」または「第二世代配列決定法」としても既知の「超並列配列決定法（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」または「超並列配列決定法（ｍａｓｓｉｖｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、任意の高処理核酸配列決定法を意味する。これらの手法は典型的には、大量の（例えば、何千、何百万、または何十億の）空間分離されたクローン増幅ＤＮＡテンプレートまたは単一のＤＮＡ分子の並行配列決定法を伴う。例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：３１−３６，２０１０を参照されたい。

【0181】

「濃縮された」は、本明細書で使用される場合、構成要素（例えば、アミノ酸残基改変）が、対応する参照ライブラリー（例えば、未分類のライブラリー、または異なるかもしくは無関係の抗原に関して分類されたライブラリー）と比較して、分類されたライブラリー中でより高い頻度で存在することを意味する。対照的に「減損された」は、構成要素（例えば、アミノ酸残基改変）が、対応する参照ライブラリー（例えば、未分類のライブラリー、または異なるかもしくは無関係の抗原に関して分類されたライブラリー）と比較して、分類されたライブラリー中でより低い頻度で存在することを意味する。「中和」という用語は、アミノ酸残基変異体を特定する方法に関して使用されるとき、構成要素が、濃縮も減損もされておらず、言い換えると、それが、対応する参照ライブラリー（例えば、未分類のライブラリー、または異なるかもしくは無関係の抗原に関して分類されたライブラリー）と比較して、分類されたライブラリー中でおよそ同じ頻度で存在することを意味する。

【0182】

「等電点（ｐＩ）」は、分子（例えば、抗体などのタンパク質）が、当該技術分野において「ｐＨ（Ｉ）」または「ＩＥＰ」とも称される正味電荷を担わないｐＨを意味する。

【0183】

本明細書で使用される場合、「抗体複合体」は、１つ以上のポリマーに共有結合される抗体である。例えば、親水性ポリマー（例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））または疎水性ポリマー（例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））などの任意の好適なポリマーは、抗体に複合体化され得る。

【0184】

本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、線状、円状、分岐状、架橋された状態、もしくは樹枝状、またはそれらの組み合わせで化学結合により接合された繰り返し構造単位（すなわち、モノマー）を含む分子を意味する。ポリマーは、合成もしくは天然に生じる、またはそれらの組み合わせであり得る。「ポリマー」という用語は、２つ以上の異なるモノマーを含むポリマーであるコポリマーを包含することを理解されたい。ポリマーは、たった一種類のモノマーを含むポリマーであるホモポリマーでもあり得る。

【0185】

本明細書において互換的に使用される「ヒアルロン酸」、「ヒアルラノン（ｈｙａｌｕｒａｎｏｎ）」、及び「ＨＡ」という用語は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸の繰り返し二糖類単位を含有するポリマーグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を指す。ＨＡは、例えば、細胞外マトリックス（例えば、目の硝子体内）、接合組織、上皮、及び神経組織で見ることができる陰イオン性非硫酸化ＧＡＧである。

【0186】

「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、本明細書で使用される場合、分子量に応じて、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても既知であるポリエーテル化合物を指す。ＰＥＧは、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−ＯＨの構造を有し得、式中、ｎは、任意の好適な整数である。ＰＥＧは、分岐状ＰＥＧ、星状ＰＥＧ、または櫛状ＰＥＧであり得る。ＰＥＧは、例えば、ＰＥＧ四量体、ＰＥＧ六量体、またはＰＥＧ八量体であり得る。

【0187】

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、第１のペプチド、タンパク質、またはポリペプチド、例えば、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ））が、第２のペプチド、タンパク質、またはポリペプチド、例えば、眼の結合ドメイン（例えば、ＨＡ結合ドメイン）に直接的または間接的に連鎖されるタンパク質を指す。一例において、第１のペプチド、タンパク質、またはポリペプチド（例えば、抗体）は、リンカーにより第２のペプチド、タンパク質、またはポリペプチド（例えば、眼の結合ドメイン（例えば、ＨＡ結合ドメイン））に連鎖され得る。融合タンパク質の文脈において、「連鎖する」及び「連鎖される」という用語、ならびにそれらの文法上の変形は、「共有結合される」という用語と互換的に使用され、融合タンパク質の２つの部分間の直接的または間接的な共有結合（例えば、ペプチド結合）を指す。概して、本発明の融合タンパク質は、抗体融合タンパク質である。本抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ−Ｃであり得る。いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。

【0188】

「眼の結合ドメイン」という用語は、目の中に見られる生体物質（例えば、角膜、硝子体、網膜、網膜色素上皮、または脈絡膜）に結合するペプチド、タンパク質、ポリペプチド、またはそれらのフラグメントを指す。一例として、いくつかの事例において、目の中に見られる生体物質は、細胞外マトリックス構成成分、例えば、炭水化物（例えば、荷電炭水化物（例えば、グリコサミノグリカン））、糖タンパク質（例えば、フィブリリン及びオプティシン）、もしくはタンパク質（例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲン種Ｉ〜ＸＸＶＩＩ、特にコラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＸＩ、及びそれらのヘテロタイプのコラーゲン原線維）、または例えば、Ｌｅ Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｙｅ ２２：１２１４−１２２２，２００８に記載されている他の細胞外マトリックス構成成分である。いくつかの事例において、細胞外マトリックス構成成分は、グリコサミノグリカン、例えば、ＨＡまたはプロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸塩またはヘパリン硫酸塩）である。一例において、眼の結合ドメインは、ヒアルロン酸結合ドメインである。

【0189】

本明細書で使用される場合、「ヒアルロン酸結合ドメイン」または「ＨＡ結合ドメイン」という用語は、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、またはＨＡに結合するそれらのフラグメントを指す。ＨＡ結合ドメインは、例えば、腫瘍壊死因子刺激遺伝子６（ＴＳＧ６）、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ−１）、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質（ＨＡＰＬＮ）１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、ブレビカン、ニューロカン、ホスファカン、バーシカン、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡ０５２７、スタビリン−１、スタビリン−２、ＲＨＡＭＭ、細菌性ＨＡシンターゼ、ならびにコラーゲンＶＩを含むＨＡ結合タンパク質（当該技術分野において「ヒアルアドヘリン」とも称される）に由来する場合がある。他のＨＡ結合タンパク質は、当該技術分野において既知である。例示的なＨＡ結合ドメインには、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドが含まれる。

【0190】

「リンクモジュール」（当該技術分野において「リンクドメイン」とも称される）は、ＨＡに結合する、およそ１００個のアミノ酸の構造ドメインである（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．，１３（２）：２８６−２９６、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２５）：２２７６４−２２７７１，２００１、及びＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４９）：４９２６１−４９２７０，２００３を参照されたい）。例示的で非限定的なリンクモジュールには、ＴＳＧ６、ＣＤ４４、ＬＹＶＥ−１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、ブレビカン、ニューロカン、ホスファカン、バーシカン、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡ０５２７、スタビリン−１、及びスタビリン−２リンクモジュール、またはそれらの変異体からのものが含まれる。一例として、ＨＡ結合タンパク質ＴＳＧ６のリンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９８０６６）のアミノ酸残基３６〜１２８を含み得る。変異体リンクモジュールは、ＨＡに結合し、例えば、野生型または参照リンクモジュールに対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有し得、野生型または参照リンクモジュールアミノ酸配列に対して挿入、欠失、及び置換（例えば、保存的アミノ酸置換）などの配列多様性を含み得る。

【0191】

融合タンパク質の文脈において、「リンカー」は、第１の部分（例えば、抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）））を、第２の部分（例えば、眼の結合ドメイン（例えば、ＨＡ結合ドメイン））に連鎖させる（例えば、共有連鎖させる）ペプチドまたはポリペプチドであり得る。リンカーは、任意の好適な長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの事例において、リンカーは、約３、約４、約５、約６、約７、または約８個の残基を含む。いくつかの事例において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む。

【0192】

「ヒドロゲル」は、本明細書で使用される場合、共有化学架橋の存在に起因して非可溶性である、ホモポリマーまたはコポリマーからなる親水性または両親媒性ポリマーネットワークを指す。架橋は、ネットワーク構造及び物理的一体性を提供し得る。ヒドロゲルは、それらが水性媒体中で膨張することを可能にする水との熱力学的相溶性を示し得る。

【0193】

本明細書で使用される場合、「可逆的前駆薬物リンカー」という用語は、可逆的連鎖により一端上で生物学的に活性な部分（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体などの薬物）に結合され、永久結合により他方の端上で担体（例えば、ヒドロゲル）に結合され、それにより生物学的に活性な部分を担体に連鎖する部分を意味する。かかる可逆的前駆薬物リンカーは、生理学的状態（例えば、ｐＨ７．４、３７℃の水性緩衝液）下で非酵素的加水分解的に分解性、すなわち、切断可能であり、例えば、１時間〜１２ヶ月の範囲の半減期を有する。可逆的連鎖には、例えば、アコニチル、アセタール、アミド、カルボン酸無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレイン酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カルバメート、及びそれらの組み合わせが含まれる。対照的に、永久連鎖は、生理学的状態（ｐＨ７．４、３７℃の水性緩衝液）下で非酵素的加水分解的に分解性であり、１２ヶ月超の半減期を有する。例示的な可逆的前駆薬物リンカーは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０５６９２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0194】

「クリアランス」という用語は、本明細書で使用される場合、単位時間当たり、コンパートメント（例えば、目（例えば、硝子体））から除去された物質（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質（例えば、Ｆａｂ融合タンパク質）、または高分子製剤）の体積を指す。

【0195】

「半減期」という用語は、インビボ（例えば、目（例えば、硝子体）の中）またはインビトロで、物質（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質（例えば、Ｆａｂ融合タンパク質）、または高分子製剤）を濃縮して、半分に減らすために必要とされる時間を指す。

【0196】

ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、例えば、診断及び療法用途のための、ＶＥＧＦに結合する新規の抗体、ならびにそれらの作製方法及び使用方法を提供する。本発明は、例えば、診断及び療法用途のための抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤を含む、抗ＶＥＧＦ抗体を含む（本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体を含む）組成物、ならびにそれらの作製方法及び使用方法を提供する。本発明は、改善された特性、例えば、増強された結合親和性、安定性、及び／または発現を有する抗体変異体を特定する方法も提供する。

【0197】

Ａ．例示的な抗ＶＥＧＦ抗体
一態様において、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体に部分的に基づく。例えば、本発明の抗体は血管形成を低減し、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、眼の障害または細胞増殖性障害）を治療するかまたはその進行を遅延させるのに有用である。例えば、本発明の抗体は血管透過性を阻害し、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するのにも有用である。

【0198】

いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＸ_１ＴＰＸ_２ＧＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＹＸ_６ＤＳＶＸ_７Ｘ_８（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２であって、式中、Ｘ_１がＩｌｅもしくはＨｉｓであり、Ｘ_２がＡｌａもしくはＡｒｇであり、Ｘ_３がＴｙｒもしくはＬｙｓであり、Ｘ_４がＴｈｒもしくはＧｌｕであり、Ｘ_５がＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、もしくはＧｌｕであり、Ｘ_６がＡｌａもしくはＧｌｕであり、Ｘ_７がＬｙｓもしくはＧｌｕであり、Ｘ_８がＧｌｙもしくはＧｌｕである、ＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＸ_１ＶＳＴＡＶＡ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１であって、式中、Ｘ_１がＡｓｐもしくはＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）Ｘ_１ＡＳＦＬＹＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２であって、式中、Ｘ_１がＳｅｒもしくはＭｅｔである、ＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）Ｘ_１ＱＧＹＧＸ_２ＰＦＴ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３であって、式中、Ｘ_１がＧｌｎ、Ａｓｎ、もしくはＴｈｒであり、Ｘ_２がＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、もしくはＡｒｇである、ＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１〜６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせから選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含み得る。

【0199】

例えば、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）、ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２１）、もしくはＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）もしくはＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１、３、７〜１０、もしくは２１〜２３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせから選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含み得る。

【0200】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１、３、もしくは７〜１０のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせから選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含み得る。いくつかの事例の特定の例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。

【0201】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0202】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0203】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0204】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１、３、８、９、２２、もしくは２３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせから選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含み得る。いくつかの事例の特定の例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。

【0205】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）またはＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0206】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0207】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0208】

いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＮＰＦＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0209】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号１、３、８〜１０、もしくは２２のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせから選択された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＨＶＲを含み得る。いくつかの事例の特定の例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。

【0210】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）またはＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0211】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）またはＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0212】

例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0213】

例えば、他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0214】

例えば、他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0215】

例えば、さらに他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）とのアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0216】

例えば、さらに別の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0217】

他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0218】

例えば、他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0219】

他の事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の６つのＨＶＲ：（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＥＹＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの重鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。さらなる事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の４つの軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0220】

いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号：１１、４０、もしくは４２のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはそれらの配列を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、（ｂ）配列番号：１２、４１、もしくは４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはそれらの配列を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例において、本抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0221】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）またはＷＶＲＱＥＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0222】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＤＣ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣ（配列番号４４）、またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）またはＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0223】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0224】

いくつかの実例において、本抗体は配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン。

【0225】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0226】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0227】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0228】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0229】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0230】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0231】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0232】

いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＹＧＡＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１に対する少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはその配列を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１１に対する少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはその配列を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）ＤＹＷＩＨ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＧＩＴＰＡＧＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＦＶＦＦＬＰＹＡＭＤＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、（ｆ）ＱＱＧＹＧＡＰＦＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含み得る。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の重鎖フレームワーク領域：（ａ）ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１と、（ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２と、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＲＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の軽鎖フレームワーク領域：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１と、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２と、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３と、（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４とを含む。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインと含む結合ドメインとを含む。いくつかの事例において、例示的な抗ＶＥＧＦは、Ｎ９４Ａ．Ｆ８３Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｙ５８Ｒである。

【0233】

いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号３３もしくは５１に対する少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはそれらの配列を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号１２、３４、３５、３６、３７、もしくは３８のうちのいずれか１つに対する少なくとも９０％の配列（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはそれらの配列を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。いくつかの事例において、本抗体は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む。

【0234】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の重鎖可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）：ＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＥＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号２９）またはＥＥＱＬＶＥＥＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＥＩＳ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＶＲＱＥＰＧＥＧＬＥＷＶＡ（配列番号３０）またはＷＶＲＱＥＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ２、（ｃ）ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＥＮＴＡＹＬＱＭＮＥＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ３、及び（ｄ）ＷＧＱＧＥＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｈ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0235】

いくつかの事例において、前述の抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、以下の軽鎖可変ドメインＦＲ：（ａ）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＥＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２５）、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＥＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ１、（ｂ）ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１８）またはＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ２、（ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号１９）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号２４）、またはＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＥＳＬＱＰＥＤＡＡＴＹＹＣ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ３、及び（ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むＦＲ−Ｌ４のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み得る。

【0236】

いくつかの事例において、本発明は、（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本抗体は、Ｆａｂ形式で発現されるＧ６．３１ＡＡＲＲである。

【0237】

いくつかの事例において、本発明は、（ａ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本抗体は、抗ヒトＩｇＧに対する反応性を欠くＧ６．３１ＡＡＲＲの変異体バージョンである。

【0238】

さらなる態様において、上記の実施形態のいずれかに記載の抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の１〜８項に記載されるような特徴のいずれかを、単独または組み合わせて組み込み得る。

【0239】

１．抗体親和性
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、いくつかの事例において、本明細書に提供される抗体は、約１０ｎＭ以下のＫｄでヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）に結合する。いくつかの事例において、本明細書に提供される抗体は、約５ｎＭ以下のＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本明細書に提供される抗体は、約２ｎＭ以下のＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。例えば、いくつかの事例において、本抗体は、約２５ｐＭ〜約２ｎＭ（例えば、約２５ｐＭ、約５０ｐＭ、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ、約６２５ｐＭ、約６５０ｐＭ、約６７５ｐＭ、約７００ｐＭ、約７２５ｐＭ、約７５０ｐＭ、約７７５ｐＭ、約８００ｐＭ、約８２５ｐＭ、約８５０ｐＭ、約８７５ｐＭ、約９００ｐＭ、約９２５ｐＭ、約９５０ｐＭ、約９７５ｐＭ、約１ｎＭ、約１．１ｎＭ、約１．２ｎＭ、約１．３ｎＭ、約１．４ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１．６ｎＭ、約１．７ｎＭ、約１．８ｎＭ、約１．９ｎＭ、または約２ｎＭ）のＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約６００ｐＭ（例えば、約７５ｐＭ、約１００ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約２００ｐＭ、約２２５ｐＭ、約２５０ｐＭ、約２７５ｐＭ、約３００ｐＭ、約３２５ｐＭ、約３５０ｐＭ、約３７５ｐＭ、約４００ｐＭ、約４２５ｐＭ、約４５０ｐＭ、約４７５ｐＭ、約５００ｐＭ、約５２５ｐＭ、約５５０ｐＭ、約５７５ｐＭ、約６００ｐＭ）のＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約５００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約４００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約３００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約２００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１５０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１２５ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約７５ｐＭ〜約１００ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約８０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約６０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。いくつかの事例において、本抗体は、約４０ｐＭのＫｄでｈＶＥＧＦに結合する。

【0240】

一実施形態において、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。一実施形態において、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の一連の滴定の存在下で、Ｆａｂを最小濃度の（^１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで結合した抗原を捕捉することにより測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２〜５時間にわたって室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［^１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の査定と一貫する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））を用いてプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上でプレートを１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を競合結合アッセイでの使用に選択する。

【0241】

別の実施形態によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイは、約１０の応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施形態において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後に、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０の応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。反応速度測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、２５℃の０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中におよそ２５μＬ／分の流量で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることにより計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオンレートが１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、オンレートは、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される場合に、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍの帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用することにより決定することができる。

【0242】

２．抗体安定性
本発明は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１と比較して増強された安定性を有する抗体を提供する（例えば、米国特許第７，７５８，８５９号及び国際出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号を参照されたく、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。抗体の安定性は、当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、固有のタンパク質蛍光、示差走査熱量測定、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）を使用して決定され得る。この抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、増強された融解温度（Ｔ_ｍ）、凝集温度（Ｔ_ａｇｇ）、または抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１と比較して安定した他のメトリクスを有し得る。

【0243】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、約８０℃以上（例えば、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、または約９３℃）であるＴ_ｍを有する。例えば、いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８３．５℃以上（例えば、約８３．５℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、または約９３℃）であるＴ_ｍを有する。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８２℃〜約９２℃（例えば、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、または約９２℃）のＴ_ｍを有する。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８２℃のＴ_ｍを有する。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体の前述のＴ_ｍ値のうちのいずれも、ＤＳＦを使用して決定される。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体のＴ_ｍ値は、本明細書において、例えば、実施例１に記載されるように決定される。

【0244】

３．抗体フラグメント
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、ならびに以下に記載される他のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントの概説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの概説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0245】

ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。

【0246】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。

【0247】

抗体フラグメントは、本明細書に記載されるような、インタクトな抗体のタンパク分解消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉまたはファージ）の産生が含まれるが、これらに限定されない様々な技法により作製され得る。

【0248】

４．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変ドメイン）及びヒト定常ドメインを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。

【0249】

ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるためにヒト化される。概して、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含むことになる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来となる抗体）からの対応する残基で置換される。

【0250】

ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載している）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載している）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載している）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」手法を記載している）にさらに記載されている。

【0251】

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「最良適合」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

【0252】

５．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。

【0253】

ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製され得る。かかる動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに合体されるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は概して、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説に関しては、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号、ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している）米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。かかる動物により生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに修飾され得る。

【0254】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体も、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されている物が含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。

【0255】

ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法が以下に記載される。

【0256】

６．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体に関してかかるライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が当該技術分野において既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）にさらに記載されている。

【0257】

ある特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーでランダムに組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように抗原結合ファージに関してスクリーニングされ得る。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして抗体フラグメントをディスプレイする。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫源に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）により記載されているように、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴うことなく、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する単一抗体源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することによっても合成的に作製されて、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を達成し得る。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が含まれる。

【0258】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なされる。

【0259】

７．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性のうちの１つは、ＶＥＧＦに対し、その他は、任意の他の抗原（例えば、第２の生体分子、例えば、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）；インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）；インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）；ＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合型ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、または可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａなどの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質に対する。したがって、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ及びＩＬ−１β、ＶＥＧＦ及びＩＬ−６、ＶＥＧＦ及びＩＬ−６Ｒ、ＶＥＧＦ及びＩＬ−１３、ＶＥＧＦ及びＩＬ−１３Ｒ、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２、ＶＥＧＦ及びＴｉｅ２、ＶＥＧＦ及びＳ１Ｐ、ＶＥＧＦ及びインテグリンαｖβ３、ＶＥＧＦ及びインテグリンαｖβ５、ＶＥＧＦ及びインテグリンα５β１、ＶＥＧＦ及びベータセルリン、ＶＥＧＦ及びアペリン／ＡＰＪ、ＶＥＧＦ及びエリスロポエチン、ＶＥＧＦ及び補体Ｄ因子、ＶＥＧＦ及びＴＮＦα、ＶＥＧＦ及びＨｔｒＡ１、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲ）、ＶＥＧＦ及びＳＴ−２受容体、ＶＥＧＦ及びＣ２、ＶＥＧＦ及びＢ因子、ＶＥＧＦ及びＨ因子、ＶＥＧＦ及びＣＦＨＲ３、ＶＥＧＦ及びＣ３ｂ、ＶＥＧＦ及びＣ５、ＶＥＧＦ及びＣ５ａ、ＶＥＧＦ及びＣ３ａ、ＶＥＧＦ及びＡＲＭＳ２、ＶＥＧＦ及びＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦ及びＨＬＡ、ＶＥＧＦ及びＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＣＸ３ＣＲ１、ＶＥＧＦ及びＴＬＲ３、ＶＥＧＦ及びＴＬＲ４、ＶＥＧＦ及びＣＥＴＰ、ＶＥＧＦ及びＬＩＰＣ、ＶＥＧＦ及びＣＯＬ１０Ａ１、またはＶＥＧＦ及びＴＮＦＲＳＦ１０Ａに対する結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、ＶＥＧＦを発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化するためにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ−Ｃフラグメント）として調製され得る。

【0260】

いくつかの事例において、二重特異性抗体は、米国特許出願第２０１４／００１７２４４号に開示されている二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエイチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｉｎ）２（Ａｎｇ２）抗体であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメイン（本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかなど）と、（ａ）ＧＹＹＭＨ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（ｃ）ＳＰＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹＹＹＰＧＡＦＤＩ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）ＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｅ）ＤＤＳＤＲＰＳ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｆ）ＱＶＷＤＳＳＳＤＨＷＶ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または上記のＨＶＲのうちの１つ以上と、配列番号６２〜６７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）を有するそれらの１つ以上の変異体との組み合わせを含むＡｎｇ２に結合する第２の結合ドメインとを含み得る。

【0261】

いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメイン（本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかなど）と、Ａｎｇ２に結合し、（ａ）配列番号６８に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはその配列を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、（ｂ）配列番号６９に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）、もしくはその配列を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、または（ｃ）（ａ）にあるようなＶＨドメイン及び（ｂ）にあるようなＶＬドメインを含む第２の結合ドメインとを含み得る。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメイン（本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかなど）と、Ａｎｇ２に特異的に結合する第２の結合ドメインとを含み得、ここで、第２の結合ドメインは、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０６９５３２号に記載されている任意の抗体結合ドメイン、またはその変異体である。

【0262】

他の事例において、抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０７３１５７号に記載されている任意の抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体である。

【0263】

いくつかの事例において、二重特異性抗体は、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６抗体である。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメイン（本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかなど）と、ＩＬ−６に結合する第２の結合ドメインとを含み得る。第２の結合ドメインは、当該技術分野において既知の任意の抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ（ｇｅｒｉｌｉｍｚｕｍａｂ）、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体の結合ドメインであり得る。

【0264】

いくつかの事例において、二重特異性抗体は、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６Ｒ抗体である。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ−６Ｒ二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメイン（本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれかなど）と、ＩＬ−６Ｒに結合する第２の結合ドメインとを含み得る。第２の結合ドメインは、当該技術分野において既知の結合ドメイン任意の抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体であり得る。

【0265】

多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、静電的ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、及び、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているような三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

【0266】

「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。

【0267】

本明細書における抗体またはフラグメントは、ＶＥＧＦ、ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。

【0268】

８．抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体（例えば、１つ以上のアミノ酸残基改変を含む抗体変異体）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。アミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによるか、またはペプチド合成により調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するように、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせることができるが、但し、その最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合性を保有することを条件とする。

【0269】

ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異生成の目的の部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化が、「例示的の置換」という見出しで表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的の抗体中に導入され、その産生物が、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣに関して、スクリーニングされてもよい。
表１

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

【0270】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

【0271】

一種の置換型変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基及び／またはＦＲ残基の置換を伴う。概して、さらなる研究のために選択されて得られた変異体（複数可）は、親抗体に対して、ある特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、増加した安定性、増加した発現、改変されたｐＩ、及び／または低減した免疫原性）における変更（例えば、改善）を有し、かつ／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、変異体抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。

【0272】

改変（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するためにＨＶＲ内で行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を経るコドンによりコードされた残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／または抗原に接触する残基内で行われ得、得られた変異体ＶＨまたはＶＬは、結合親和性に関して試験される。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和成熟のいくつかの実施形態において、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異生成）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異体が特定される。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６つの残基）がランダム化されるＨＶＲ指向手法を伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。

【0273】

ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）がＨＶＲ内で行われ得る。かかる改変は、例えば、ＨＶＲ内の抗原接触残基の外側であってもよい。上記で提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。

【0274】

ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＦＲ内で生じ得る。例えば、かかる改変は、抗体親和性及び／または安定性（例えば、増加した融解温度により査定される場合）を改善し得る。

【0275】

突然変異生成のために標的とされ得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されている「アラニンスキャニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法において、標的残基の残基または基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に荷電されたアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けたかどうかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸配置に導入され得る。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体錯体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異体はスクリーニングされて、それらが所望の特性を含むかを決定することができる。

【0276】

アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端の融合が含まれ、これは抗体の血清半減期を増加させる。

【0277】

ｂ）グリコシル化変異体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成され得る。

【0278】

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞により産生された天然抗体は典型的には、Ｎ連鎖によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に概して結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、ある特定の特性の改善を有する抗体変異体を作製するために行われ得る。

【0279】

一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、錯体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に配置されるアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体中のわずかな配列の多様性に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する公報の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が含まれる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に実施例１１）、ならびにアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が含まれる。

【0280】

例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。かかる抗体変異体は、低減したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８、米国特許第６，６０２，６８４号、及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。かかる抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0281】

ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。ある特定の実施形態において、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を保有することにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補となる抗体変異体を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／減損を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）のページ４６４の表３に要約されている。

【0282】

目的の分子のＡＤＣＣ活性を査定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号に記載されている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９−７０６３（１９８６）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、ならびにＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）。あるいは、非放射性アッセイ方法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣＹＴＯＴＯＸ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて査定され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を査定するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定も、当該技術分野において既知の方法を使用して実施され得る（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。

【0283】

低減したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上で置換を有するＦｃ突然変異が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0284】

ＦｃＲｓへの改善または減損された結合を有するある特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。

【0285】

ある特定の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。

【0286】

いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、改変された（すなわち、改善または減損された）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす改変は、Ｆｃ領域内で行われる。

【0287】

母体ＩｇＧの胎児への移入に関与する、増加した半減期、及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

【0288】

ｄ）システイン操作された抗体変異体
ある特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性のチオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体を複合体化して、本明細書にさらに記載されるように、免疫複合体を作製することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基のうちのいずれか１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されているように生成され得る。

【0289】

ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野において既知であり、かつ容易に入手可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合するポリマーの数は異なり得、１つ以上のポリマーが結合する場合、それらは同じかまたは異なる分子であり得る。概して、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が療法において規定の条件下で使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。追加の抗体複合体は、本明細書において、例えば、以下のＫの項及び実施例１３に記載される。

【0290】

別の実施形態において、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態において、非タンパク質性部分は、炭素ナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近位の細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むがこれらに限定されない。

【0291】

ｆ）等電点変異体
本発明は、改変された等電点を有する抗体変異体を提供する。例えば、本発明は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１と比較して低減した等電点（ｐＩ）を有する抗体変異体を提供する。いくつかの事例において、表面荷電は、生理学的ｐＨにおいて低減される。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約８以下（例えば、約８、約７、約６、約５、または約４）のｐＩを有する。いくつかの事例において、本抗体は、約４〜約８（例えば、約４、約５、約６、約７、または約８）のｐＩを有する。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約５〜約７（例えば、約５、約６、または約７）のｐＩを有する。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、約５〜約６（例えば、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、または約６）のｐＩを有する。

【0292】

本発明の抗体は、低減したｐＩを有するように、例えば、より低いｐＩを有するアミノ酸で所与の位置における野生型アミノ酸残基を置換することにより操作され得る。アミノ酸のｐＩは、アミン（−ＮＨ_２）、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、及びアミノ酸の側鎖のｐＫａ値に基づいて決定され得、これは、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、表面が曝露されたアミノ酸残基は、抗体のｐＩを低減するために置換され得る。一実施形態において、表面が曝露されたアミノ酸残基は、グルタミン酸塩（Ｅ）で置換され得る。一実施形態において、表面が曝露されたアミノ酸残基は、アスパラギン酸塩（Ｄ）で置換され得る。

【0293】

Ｂ．組み換え方法及び組成物
本明細書に記載される抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれも、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。一実施形態において、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態において、かかる核酸を含む宿主細胞が提供される。かかる一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は、真核性、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の作製方法が提供され、本方法は、上記で提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。

【0294】

抗ＶＥＧＦ抗体の組み換え産生に関して、例えば、上述されるような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクターに挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され、配列決定され得る。

【0295】

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、本抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされないときに細菌中で産生され得る。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。Ｅ．Ｃｏｌｉにおける抗体フラグメントの発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、本抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。

【0296】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。

【0297】

グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。

【0298】

植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物における抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。

【0299】

脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されているようなＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説に関しては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。

【0300】

Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体、ならびに抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤などの抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に提供される任意の抗ＶＥＧＦ抗体）を含む組成物は、当該技術分野において既知の様々なアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性に関して特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。

【0301】

１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法などの既知の方法によりその抗原結合活性に関して試験される。

【0302】

別の態様において、競合アッセイは、ＶＥＧＦに結合することに関して、本明細書に記載されるような抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤と競合する抗体を特定するために使用され得る。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、本明細書に記載されるような抗体により結合される、同じエピトープ（例えば、線状または立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細で例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。

【0303】

例示的な競合アッセイにおいて、固定化ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦに結合する第１の標識抗体と、ＶＥＧＦへの結合に関して第１の抗体と競合する能力に関して試験されている第２の未標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化ＶＥＧＦは、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体がＶＥＧＦへ結合することを許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化ＶＥＧＦに関連付けられる標識の量が測定される。固定化ＶＥＧＦに関連付けられる標識の量が、対照試料に対して試験試料中で実質的に低減している場合、それは、第２の抗体がＶＥＧＦへの結合に関して第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。

【0304】

２．活性アッセイ
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有する抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤を特定するために提供される。生物学的活性には、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、血流中ＶＥＧＦ）またはそのペプチドフラグメントに、インビボ、インビトロ、またはエキソビボのいずれかで結合することが含まれ得る。ある特定の実施形態において、生物学的活性には、ＶＥＧＦの遮断もしくは中和、またはＶＥＧＦがリガンド、例えば、ＫＤＲもしくはＦｌｔ−１などの受容体に結合することを防止することが含まれ得る。インビボ及び／またはインビトロにかかる生物学的活性を有する抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤も提供される。ある特定の実施形態において、本発明の抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、かかる生物学的活性に関して試験される。

【0305】

３．安定性アッセイ
一態様において、アッセイは、抗ＶＥＧＦ抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤の安定性（例えば、熱安定性）を決定するために提供される。例えば、本抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤の安定性は、当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）、固有のタンパク質蛍光、示差走査熱量測定、分光法、光散乱（例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）及び静的光散乱（ＳＬＳ）、自己相互作用クロマトグラフィー（ＳＩＣ）を使用して決定され得る。例えば、アッセイの安定性は、本明細書に記載されるように、例えば、実施例１及び２に記載されるようなＤＳＦを使用して決定され得る。

【0306】

Ｄ．免疫複合体
本発明は、化学療法剤もしくは化学療法薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、もしくはそれらのフラグメント）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性薬剤に複合体化された本明細書における抗ＶＥＧＦ抗体を含む、免疫複合体も提供する。

【0307】

一実施形態において、免疫複合体は、抗体が１つ以上の薬物に複合体化された抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）であり、これには、マイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照されたい）；モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦなどのオーリスタチン（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）、ならびにＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８−３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９−８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９−１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン；トリコテシン；ならびにＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されない。

【0308】

別の実施形態において、免疫複合体には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれるが、これらに限定されない酵素活性毒素またはその断片に複合体化された本明細書に記載される抗体を含む。

【0309】

別の実施形態において、免疫複合体は、放射性原子に複合体化されて放射性複合体を形成する本明細書に記載されるような抗体を含む。放射性複合体の産生には、多様な放射性同位体が入手可能である。例には、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性複合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ｍｒｉ）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含み得る。

【0310】

抗体及び細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製され得る。炭素−１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への複合体化のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。

【0311】

本明細書における免疫複合体またはＡＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）を含むが、これらに限定されない架橋剤試薬で調製されるかかる複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。

【0312】

Ｅ．親和性精製、診断、及び検出のための方法及び組成物
本発明の抗体は、親和性精製薬剤として使用され得る。このプロセスにおいて、本抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して、かかるＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）樹脂または濾紙などの固相に固定化される。固定化抗体は、精製すべき抗原を含有する試料と接触され、その後、支持体を好適な溶媒で洗浄することにより、固定化抗体に結合している精製すべき抗原を除き、試料中の実質的に全ての材料が除去される。最後に、支持体を、ｐＨ５．０のグリシン緩衝液などの別の好適な溶媒で洗浄し、抗体から抗原が放出される。

【0313】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体のうちのいずれも、生体試料中のＶＥＧＦの存在を検出するのに有用である。「検出すること」という用語は、本明細書で使用される場合、定量的または定性的検出を包含する。ある特定の実施形態において、生体試料は、血液（例えば、全血液、血漿、及び／または血清）、組織試料（例えば、腫瘍試料）などの細胞または組織を含む。

【0314】

一実施形態において、診断または検出方法で使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＶＥＧＦの存在の検出方法が提供される。ある特定の実施形態において、本方法は、抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦに結合することを許容する条件下で生体試料を本明細書に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体と接触させることと、錯体が抗ＶＥＧＦ抗体とＶＥＧＦとの間に形成されるかどうかを検出することとを含む。かかる方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、ＶＥＧＦが患者の選択のための生物マーカーである場合、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた療法に適した対象を選択するために使用される。

【0315】

本発明の抗体を使用して診断され得る例示的な障害には、病理学的血管形成に関連付けられる障害（例えば、眼の障害及び細胞増殖性障害）及び／または望ましくない血管透過性に関連付けられる障害（例えば、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、及び循環器疾患に関連付けられる透過性）が含まれる。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、または地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥまたはびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、または高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障（レーバー先天性黒内障またはＬＣＡとしても既知である）、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、またはシェーグレン病である。いくつかの事例において、眼の障害は、増殖性糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、網膜静脈閉塞症（網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態を含む）、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、家族性滲出性硝子体網膜症（ＦＥＶＲ）、コーツ病、ノリエ病、骨粗鬆症−偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）、結膜下出血、または高血圧性網膜症を含む網膜症である。いくつかの事例において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの事例において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、または多発性骨髄腫である。

【0316】

ある特定の実施形態において、標識抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。標識には、直接的に検出される標識または部分（蛍光標識、発色団標識、電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用により間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、希土類キレートもしくはフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロホア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化させる酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングされた、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離ラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0317】

本発明の別の実施形態において、本抗体は、標識される必要はなく、その存在は、本抗体に結合する標識抗体を使用して検出され得る。

【0318】

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの任意の既知のアッセイ方法で用いられ得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。

【0319】

競合結合アッセイは、限定された量の抗体と結合することに関して、標識標準物が、試験試料分析物と競合する能力に依存する。試験試料中の抗原の量は、抗体と結合した標準物の量に反比例する。結合した標準物の量の決定を容易にするために、本抗体は概して、抗体に結合している標準物及び分析物が結合していないままである標準物及び分析物から好都合に分離され得るように競合前または競合後に不溶化にされる。

【0320】

サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用を伴い、各々は、検出されるタンパク質の異なる免疫原生部分、またはエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイにおいて、試験試料分析物は、堅い支持体に固定化されている第１の抗体により結合され、したがって、第２の抗体が分析物に結合して、非可溶性の３部の錯体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第２の抗体は、検出可能部分でそれ自身が標識され得る（直接サンドイッチアッセイ）か、または検出可能部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、一種のサンドイッチアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能部分は、酵素である。

【0321】

免疫組織化学に関して、腫瘍試料は、加工されていないかもしくは凍結されていてもよいか、またはパラフィンで包埋されていても、例えば、ホルマリンなどの防腐剤で固定されていてもよい。

【0322】

本抗体は、インビボ診断アッセイのためにも使用され得る。概して、本抗体は、腫瘍が免疫シンチオグラフィーを使用して局在化され得るように、放射性核種（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐ、または^３５Ｓなど）または色素で標識される。

【0323】

Ｆ．診断キット
便宜上、本発明の抗体は、キットで、すなわち、パッケージにされた所定の量の試薬と診断アッセイの実施に関する指示書との組み合わせで提供され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素により必要とされる基材及び共同因子（例えば、検出可能なクロモホアまたはフルオロホアを提供する基材前駆体）を含むであろう。加えて、他の添加剤には、安定剤、緩衝液（例えば、遮断緩衝液または溶解緩衝液）などが含まれ得る。様々な試薬の相対量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように幅広く異なり得る。特に、溶解すると適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む試薬は、乾燥粉末、通常凍結乾燥された状態で提供され得る。

【0324】

Ｇ．薬学的製剤
本明細書に記載されるような抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤の薬学的製剤は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、所望の純度を有するかかる抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することにより調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。薬学的に許容される担体は概して、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの介在性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及びその使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

【0325】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。

【0326】

本明細書における製剤は、治療されている特定の適応症に対する必要に応じて、１つを超える活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有し得る。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい場合がある。かかる分子は好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わされて存在する。

【0327】

活性成分は、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0328】

インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜に通した濾過により、容易に達成され得る。

【0329】

ある特定の実施形態において、薬学的製剤は、１つ以上の追加の化合物を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａなどの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0330】

例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体である。

【0331】

いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。

【0332】

いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0333】

Ｈ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体（例えば、ＨＡ複合体、ＰＥＧ複合体、及び前駆薬物抗体複合体）、融合タンパク質、及び高分子製剤のうちのいずれかが治療方法で使用され得る。

【0334】

一態様において、薬品として使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。別の態様において、薬品として使用するための抗体複合体が提供される。さらに別の態様において、薬品として使用するための融合タンパク質が提供される。さらに別の態様において、薬品として使用するための高分子製剤が提供される。さらなる態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。別の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するのに使用するための抗体複合体を提供する。さらに他の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するのに使用するための融合タンパク質を提供する。他の態様において、本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するのに使用するための高分子製剤を提供する。いくつかの実施形態において、病理学的血管形成に関連付けられる障害は、眼の障害または細胞増殖性障害である。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、または地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥまたはびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、または高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、またはシェーグレン病である。いくつかの事例において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの事例において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、または多発性骨髄腫である。別の態様において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。いくつかの事例において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、または循環器疾患に関連付けられる透過性である。

【0335】

別の態様において、治療方法で使用するための抗ＶＥＧＦ抗体が提供される。別の態様において、治療方法で使用するための抗体複合体が提供される。さらに別の態様において、治療方法で使用するための融合タンパク質が提供される。さらに別の態様において、治療方法で使用するための高分子製剤が提供される。ある特定の事例において、本発明は、個体に有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象を治療する方法で使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。本発明は、個体に有効量の抗体複合体を投与することを含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象を治療する方法で使用するための抗体複合体も提供する。本発明は、個体に有効量の融合タンパク質を投与することを含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象を治療する方法で使用するための融合タンパク質も提供する。本発明は、個体に有効量の高分子製剤を投与することを含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象を治療する方法で使用するための高分子製剤も提供する。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、または地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥまたはびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、または高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、またはシェーグレン病である。いくつかの事例において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの事例において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、または多発性骨髄腫である。

【0336】

他の事例において、本発明は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を有する個体を治療する方法で使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。いくつかの事例において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、または循環器疾患に関連付けられる透過性である。前述の使用のうちのいずれも、例えば、以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を個体に投与することをさらに含み得る。

【0337】

いくつかの事例において、本発明は、対象における血管形成を低減または阻害するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。別の態様において、対象における血管形成を低減または阻害するのに使用するための抗体複合体が提供される。さらに別の態様において、対象における血管形成を低減または阻害するのに使用するための融合タンパク質が提供される。さらに別の態様において、対象における血管形成を低減または阻害するのに使用するための高分子製剤が提供される。ある特定の実施形態において、本発明は、個体に有効の抗ＶＥＧＦ抗体を投与して血管形成を低減または阻害することを含む、対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。本発明は、個体に有効量の抗体複合体を投与することを含む、対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための抗体複合体も提供する。本発明は、個体に有効量の融合タンパク質を投与することを含む、対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための融合タンパク質も提供する。本発明は、個体に有効量の高分子製剤を投与することを含む、対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するための高分子製剤も提供する。他の事例において、本発明は、対象における血管透過性を低減または阻害するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、個体に有効の抗ＶＥＧＦ抗体を投与して血管透過性を低減または阻害することを含む、対象における血管透過性を低減または阻害するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。上記の使用のうちのいずれかに記載の「対象」は、ヒトであり得る。

【0338】

いくつかの事例において、本発明は、対象における自己免疫疾患を治療するのに使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。いくつかの事例において、自己免疫障害は、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、及びクローン病である。前述の使用のうちのいずれも、例えば、以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を個体に投与することをさらに含み得る。

【0339】

本発明は、薬品の製造または調製において抗ＶＥＧＦ抗体の使用を提供する。本発明は、薬品の製造または調製において抗体複合体の使用も提供する。さらに、本発明は、薬品の製造または調製において融合タンパク質の使用を提供する。本発明は、薬品の製造または調製において高分子製剤の使用も提供する。例えば、一事例において、薬品は、病理学的血管形成に関連付けられる障害の治療のためのものである。さらなる事例において、薬品は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する対象に有効量の薬品を投与することを含む、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療する方法で使用するためのものである。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、または地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥまたはびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、または高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、またはシェーグレン病である。いくつかの事例において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの事例において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、または多発性骨髄腫である。さらなる事例において、薬品は、対象における血管形成を低減または阻害するためのものである。さらなる事例において、薬品は、対象に薬品の有効な量を投与して血管形成を低減または阻害することを含む、対象における血管形成を低減または阻害する方法で使用するためのものである。薬品の前述の使用のうちのいずれにおいても、本方法は、例えば、以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を個体に投与することを含み得る。

【0340】

別の事例において、薬品は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害の治療のためのものである。いくつかの事例において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、または循環器疾患に関連付けられる透過性である。さらなる事例において、薬品は、望ましくない血管透過性に関連付けられる有する対象に有効量の薬品を投与することを含む、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療する方法で使用するためのものである。別の事例において、薬品は、対象における血管透過性を低減または阻害するためのものである。さらなる事例において、薬品は、対象に薬品の有効な量を投与して血管形成を低減または阻害することを含む、対象における血管透過性を低減または阻害する方法で使用するためのものである。薬品の前述の使用のうちのいずれにおいても、本方法は、例えば、以下に記載されるような有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を対象に投与することを含み得る。上記の使用のうちのいずれかに記載の「対象」は、ヒトであり得る。

【0341】

別の事例において、薬品は、自己免疫障害の治療のためのものである。いくつかの事例において、自己免疫障害は、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、及びクローン病である。さらなる事例において、薬品は、自己免疫障害を有する対象に有効量の薬品を投与することを含む、自己免疫障害を治療する方法で使用するためのものである。上記の使用のうちのいずれかに記載の「対象」は、ヒトであり得る。

【0342】

本発明は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する個体に有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。別の例において、本方法は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する個体に有効量の抗体複合体を投与することを含む。さらに別の例において、本方法は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する個体に有効量の融合タンパク質を投与することを含む。さらに別の例において、本方法は、病理学的血管形成に関連付けられる障害を有する個体に有効量の高分子製剤を投与することを含む。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ、乾燥ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、または地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性症、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、局所非中心部ＤＭＥまたはびまん性中心部関与関連ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、または高地ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例えば、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜分枝静脈閉塞症（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連付けられる疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連付けられる疾患、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノリエ病、ＯＰＰＧ、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑部毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性症、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、網膜炎、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、目の乾燥、外傷性目の損傷、またはシェーグレン病である。いくつかの事例において、細胞増殖性障害は、癌である。いくつかの事例において、癌は、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、腎癌、前立腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、または多発性骨髄腫である。さらなる事例において、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を個体に投与することをさらに含む。上記の方法のうちのいずれかに記載の「対象」は、ヒトであり得る。

【0343】

本発明は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本方法は、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害を有する個体に有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。いくつかの事例において、望ましくない血管透過性に関連付けられる障害は、脳腫瘍に関連付けられる浮腫、悪性病変に関連付けられる腹水、メーグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心膜液貯留、胸水貯留、または循環器疾患に関連付けられる透過性である。さらなる事例において、本方法は、以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の療法剤を個体に投与することをさらに含む。上記の方法のうちのいずれかに記載の「対象」は、ヒトであり得る。

【0344】

本発明の抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、哺乳動物を治療するために使用され得ることが企図される。一実施形態において、本抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、例えば、前臨床データを得る目的のために非ヒト哺乳動物に投与される。治療される例示的な非ヒト哺乳動物には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）、及び前臨床研究が実施される他の哺乳動物が含まれる。かかる哺乳動物は、本抗体を用いて治療される疾患に関して確立された動物モデルであり得るか、または目的の抗体の毒性もしくは薬物動態を研究するために使用され得る。これらの実施形態の各々において、用量漸増研究は、哺乳動物で実施され得る。本抗体は、例えば、固形腫瘍モデルで宿主齧歯類に投与され得る。本抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、例えば、硝子体内投与（例えば、硝子体内注入）によるか、またはポート送達デバイスを使用して、眼の薬物動態研究のために宿主（例えば、齧歯類、例えば、ウサギ）に投与され得る。

【0345】

さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の治療方法のうちのいずれかで使用するための本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び／または高分子製剤のうちのいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び／または高分子製剤のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態において、薬学的製剤は、本明細書に提供される抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び／または高分子製剤のうちのいずれかと、例えば、以下に記載されるような少なくとも１つの追加の療法剤とを含む。ある特定の実施形態において、薬学的製剤は、１つ以上の追加の化合物を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａなどの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0346】

本発明の抗体、またはその抗体複合体、融合タンパク質、もしくは高分子製剤は、治療において単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、少なくとも１つの追加の療法剤と共に同時投与され得る。ある特定の実施形態において、追加の療法剤は、別の抗体、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、前駆薬物、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞傷害性放射線療法、コルチコステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤、成長阻害剤、またはそれらの組み合わせである。

【0347】

例えば、ある特定の実施形態において、前述の方法のうちのいずれも、１つ以上の追加の化合物を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤は、追加の化合物（複数可）と共に同時に投与される。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤は、追加の化合物（複数可）の前または後に投与される。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１３；ＩＬ−１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０ＡなどのＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。上記の実施形態のいずれかに記載の（またはそれらに適用されるような）ある特定の実施形態において、眼の障害は、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病及び他の虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病理学的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、目のヒストプラズマ症、ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群から選択される眼内血管新生疾患である。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0348】

いくつかの事例において、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害、例えば、本明細書に記載される眼の障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための少なくとも１つの追加の療法剤と組み合わせて投与され得る。眼の障害の治療を目的とした併用療法のための例示的な追加の療法剤には、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ））、可溶性受容体融合タンパク質（例えば、組み換え可溶性受容体融合タンパク質ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｅｙｅとしても既知である、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ））、アプタマー（例えば、抗ＶＥＧＦペグ化アプタマーＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム、ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６、ＳＵＧＥＮ）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）、スクアラミン；ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）（デポ懸濁液のための酢酸アネコルタブ、Ａｌｃｏｎ，Ｉｎｃ．）、コンブレタスタチンＡ４前駆薬物（ＣＡ４Ｐ）、ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストーン−ｒｕ４８６）、テノン嚢下トリアムシノロンアセトニド、硝子体内結晶性トリアムシノロンアセトニド、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、プリノマスタット（ＡＧ３３４０、Ｐｆｉｚｅｒ））、フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内インプラントを含む、Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ／Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、リノミド、インテグリンβ３機能の阻害剤、アンジオスタチン、ならびにそれらの組み合わせなどの抗血管形成剤が限定されることなく含まれる。本発明の抗体と組み合わせて投与され得るこれらの療法剤及び他の療法剤は、例えば、米国特許出願第２０１４／００１７２４４号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0349】

眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤と組み合わせて使用され得る追加の療法剤のさらなる例には、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン、典型的には非熱レーザーを用いた光線力学療法と併用して使用される光により活性化される薬物）、ＰＫＣ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮＳ ３７２８、ＮｅｕｒｏＳｅａｒｃｈ Ａ／Ｓ）、神経栄養因子（例えば、グリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ））、ジアタゼム、ドルゾラミド、ＰＨＯＴＯＴＲＯＰ（登録商標）、９−シス−レチナール、目薬（例えば、ホスホリンアイオダイド、エコチオパート、または炭酸脱水酵素阻害剤）、ヴェオバスタット（ｖｅｏｖａｓｔａｔ）（ＡＥ−９４１、ＡＥｔｅｒｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｓｉｒｎａ−０２７（ＡＧＦ−７４５、Ｓｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ニューロトロフィン（例としてのみ、ＮＴ−４／５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈを含む）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ−３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリンアンタゴニスト（Ｊｅｒｉｎｉ ＡＧ及びＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのものを含む）、ＥＧ−３３０６（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＢＤＭ−Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ Ｌｔｄ．）、サリドマイド（例えば、ＥｎｔｒｅＭｅｄ，Ｉｎｃ．により使用されるような）、カルジオトロフィン−１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、２−メトキシエストラジオール（Ａｌｌｅｒｇａｎ／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ−８２３４（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＮＴＣ−２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデン酸塩（ミシガン大学）、ＬＹＮ−００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、微細藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ，Ｍｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ−９１２０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ）、ＡＴＸ−Ｓ１０（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）、ＴＧＦ−ベータ２（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、Ａｌｌｅｒｇａｎ、ＳＵＧＥＮ、またはＰｆｉｚｅｒからのもの）、ＮＸ−２７８−Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＯＰＴ−２４（ＯＰＴＩＳ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）、網膜細胞神経節神経保護剤（Ｃｏｇｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ−ニトロピラゾール誘導体（Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＫＰ−１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、光線力学療法で使用される療法剤であるシクロスポリンＡ、（例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）；受容体を標的とするＰＤＴ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｃｏ．；ＰＤＴを用いた注入用のポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、ＱＬＴ Ｉｎｃ．；ＰＤＴを伴うロスタポルフィン、Ｍｉｒａｖｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＰＤＴを伴うタラポルフィンナトリウム、Ｎｉｐｐｏｎ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ；モテキサフィンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Ｎｏｖａｇａｌｉ Ｐｈａｒｍａ ＳＡにより試験された産生物及びＩＳＩＳ−１３６５０、Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを含む）、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0350】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、例えば、レーザー光凝固（例えば、汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドルーゼンレーザー加工、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、インプラント可能ミニチュアテレスコープ、ファイモーション血管造影（また、マイクロレーザー療法及びフィーダーベッセル治療としても既知である）、陽子線治療、微小刺激治療、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔的温熱療法、光化学系Ｉ治療、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレシス（膜差濾過及びレオセラピー（ｒｈｅｏｔｈｅｒａｐｙ）としても既知である）、マイクロチップインプラント、幹細胞治療、遺伝子交換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答要素用の遺伝子療法を含む、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、ＧＥＮＥＴＩＸ；及びＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃ）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞、Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．；網膜細胞移植、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．を含む）、ならびに鍼、ならびにそれらの組み合わせを含む眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための療法または外科手技と組み合わせて投与され得る。

【0351】

いくつかの事例において、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための抗血管形成剤と組み合わせて投与され得る。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０７：２４９−２５７，２０００により列挙されているものが含まれるが、これらに限定されない任意の好適な抗血管形成剤が、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態において、抗血管形成剤は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ−２５８（前ＥＳＢＡ−１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体フラグメント；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、または二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエイチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｉｎ）２二重特異性抗体、例えば、ＲＧ−７７１６；Ｒｏｃｈｅ））、可溶性組み換え受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦＲフラグメント、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー（例えば、ペガプタニブ）、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパルペゴール）、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲの発現を阻害する小さな干渉ＲＮＡ、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ）−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサミニブ（ｓｅｍａｘａｍｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）、及びＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（スニチニブ））、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されないＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの事例において、二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ）；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ｍｂＶＥＧＦＲ、またはｓＶＥＧＦＲ）；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａなどの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質が含まれるが、これらに限定されない第２の生体分子に結合する。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。

【0352】

眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤と組み合わせて投与され得る他の好適な抗血管形成剤には、コルチコステロイド、血管形成抑制ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンジオスタチン、エンドスタチン、チロシンキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、インシュリン様成長因子−結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、間質由来因子（ＳＤＦ−１）アンタゴニスト（例えば、抗ＳＤＦ−１抗体）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ガンマ−セクレターゼ、デルタ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αアンタゴニスト、タンパク質キナーゼＣＫ２アンタゴニスト、血管新生部位に対する幹細胞（例えば、内皮前駆細胞）ホーミングを阻害する薬剤（例えば、抗血管内皮カドヘリン（ＣＤ−１４４）抗体及び／または抗ＳＤＦ−１抗体）、及びそれらの組み合わせが含まれる。

【0353】

いくつかの事例のさらなる例において、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための、抗炎症性薬物、哺乳動物標的のラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）（エベロリムス）、及びＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）（テムシロリムス））、シクロスポリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦα抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セトリズマブペゴール、及びゴリムマブ）、または可溶性受容体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト））、抗補体薬剤、非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）、またはそれらの組み合わせなどの血管新生に対する活性を有する薬剤と組み合わせて投与され得る。

【0354】

いくつかの事例のさらに別の例において、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、神経保護性であり、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（ブランド名：ＰＲＡＳＴＥＲＡ（商標）及びＦＩＤＥＬＩＮ（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、及びプレグネノロン硫酸塩などの薬物を含む、「神経ステロイド」と呼ばれる薬物クラスなどの、乾燥ＡＭＤから滲出性ＡＭＤへの進行を低減する可能性があり得る薬剤と組み合わせて投与され得る。

【0355】

ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ−２５８（前ＥＳＢＡ−１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体フラグメント；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、もしくは二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエイチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｉｎ）２二重特異性抗体、例えば、ＲＧ−７７１６；Ｒｏｃｈｅ））、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパルペゴール；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、または抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体（例えば、ＲＥＧＮ２１７６−３）、抗ＰＤＧＦ−ＢＢペグ化アプタマー（例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、可溶性ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質、または二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＤＥ−１２０（Ｓａｎｔｅｎ）またはＸ−８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））または二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体））；光線力学療法と組み合わされるＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン）；抗酸化剤；補体システムアンタゴニスト、例えば、補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＡＲＣ−１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ）もしくは抗Ｃ５抗体（例えば、ＬＦＧ−３１６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、プロパージンアンタゴニスト（例えば、抗プロパージン抗体、例えば、ＣＬＧ−５６１；Ａｌｃｏｎ）、または補体Ｄ因子アンタゴニスト（例えば、抗補体Ｄ因子抗体、例えば、ランパリズマブ；Ｒｏｃｈｅ））；視覚サイクル調節剤（例えば、エミクススタト塩酸塩）；スクアラミン（例えば、ＯＨＲ−１０２；Ｏｈｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミン及びミネラル補給剤（例えば、加齢性眼疾患研究１に記載されているもの（ＡＲＥＤＳ１；亜鉛及び／または抗酸化剤）及び研究２に記載されているもの（ＡＲＥＤＳ２；亜鉛、抗酸化剤、ルテイン、ゼアキサンチン、及び／またはオメガ−３脂肪酸））；細胞療法、例えば、ＮＴ−５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ−０５２０６３８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ｈｕＣＮＳ−ＳＣ細胞移植（幹細胞）、ＣＮＴＯ−２４７６（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＯｐＲｅｇｅｎ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＭＡ０９−ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；組織因子アンタゴニスト（例えば、ｈＩ−ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；アルファ−アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、ブリモニジン酒石酸塩）；ペプチドワクチン（例えば、Ｓ−６４６２４０；Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）；アミロイドベータアンタゴニスト（例えば、抗ベータアミロイドモノクローナル抗体、例えば、ＧＳＫ−９３３７７６）；Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体、例えば、ｉＳＯＮＥＰ（商標）；Ｌｐａｔｈ Ｉｎｃ）；ＲＯＢＯ４アンタゴニスト（例えば、抗ＲＯＢＯ４抗体、例えば、ＤＳ−７０８０ａ；Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）；エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現させるレンチウイルスベクター（例えば、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）；ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない任意の好適なＡＭＤ療法剤が、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤と組み合わせて追加の療法剤として投与され得る。いくつかの事例において、ＡＭＤ療法剤（前述のＡＭＤ療法剤のうちのいずれかを含む）は、同時に製剤化され得る。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ２１７６−３は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））と同時に製剤化され得る。いくつかの事例において、かかる同時製剤は、本発明の抗体と組み合わせて投与され得る。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0356】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与され得る。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）は、例えば、硝子体内注入により０．３ｍｇ／目または０．５ｍｇ／目で、例えば、毎月投与され得る。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0357】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）は、例えば、硝子体内注入により２ｍｇ／目で、例えば、４週間毎に（Ｑ４Ｗ）投与され得るか、または最初の３か月間はＱ４Ｗで投与され得、その後は、維持のために２ヶ月に１回注入される。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0358】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）と組み合わせて投与され得る。ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）は、例えば、６週間毎に硝子体内注入により０．３ｍｇ／目で投与され得る。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0359】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための光線力学療法と組み合わせてＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ベルテポルフィン）と組み合わせて投与され得る。ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）は、例えば、任意の好適な用量（例えば、体表面積の６ｍｇ／ｍ^２）で静脈点滴により投与され、３ヶ月に１回送達され得る（例えば、１０分を超える点滴）。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0360】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのＰＤＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。本発明の抗体と組み合わせて使用され得る例示的なＰＤＧＦアンタゴニストには、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、小分子阻害剤（例えば、スクアラミン）、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）（Ｅ１００３０；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などの抗ＰＤＧＦ−Ｂペグ化アプタマー、または二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＤＥ−１２０（Ｓａｎｔｅｎ）もしくはＸ−８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））、または二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体）が含まれる。例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）は、本発明の抗体の補助療法剤として投与され得る。ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）は、任意の好適な用量、例えば、０．１ｍｇ／目〜２．５ｍｇ／目、例えば、０．３ｍｇ／目または１．５ｍｇ／目で、例えば、硝子体内注入により、例えば、４週間毎に（Ｑ４Ｗ）投与され得る。ＯＨＲ−１０２（乳酸スクアラミン点眼液、０．２％）は、目薬により、例えば、１日２回投与され得る。ＯＨＲ−１０２は、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）またはＥＹＬＥＡ（登録商標）などのＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＯＨＲ−１０２、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）、及び／またはＥＹＬＥＡ（登録商標）と組み合わせて投与され得る。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0361】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのＲＴＨ−２５８と組み合わせて投与され得る。ＲＴＨ−２５８は、例えば、硝子体内注入または目の点滴により投与され得る。硝子体内注入に関して、ＲＴＨ−２５８は、任意の好適な用量（例えば、３ｍｇ／目または６ｍｇ／目）で、例えば、最初の３か月間は４週間に１回（Ｑ４Ｗ）ローディングとして投与され得、その後は、維持のために１２週毎（Ｑ１２Ｗ）または８週毎に（Ｑ８Ｗ）注入される。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0362】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のためのアビシパルペゴールと組み合わせて投与され得る。アビシパルペゴールは、例えば、硝子体内注入により投与され得る。アビシパルペゴールは、任意の好適な用量（例えば、１ｍｇ／目、２ｍｇ／目、３ｍｇ／目、４ｍｇ／目、または４．２ｍｇ／目）で、例えば、最初の３か月間は４週間に１回（Ｑ４Ｗ）ローディングとして投与され得、その後は、維持のために１２週毎（Ｑ１２Ｗ）または８週毎に（Ｑ８Ｗ）注入される。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0363】

ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）またはＥＹＬＥＡ（登録商標））、コルチコステロイド（例えば、コルチコステロイドインプラント（例えば、ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）またはＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（フルオシノロンアセトニド硝子体内インプラント））、または硝子体内注入による投与のために製剤化されたコルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド））、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、任意の好適なＤＭＥ及び／またはＤＲ療法剤が、眼の障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤と組み合わせて投与され得る。いくつかの事例において、眼の障害は、ＤＭＥ及び／またはＤＲである。

【0364】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、ＤＭＥ及び／またはＤＲ（例えば、ＮＰＤＲまたはＰＤＲ）の治療のためのＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与され得る。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）は、例えば、硝子体内注入により０．３ｍｇ／目または０．５ｍｇ／目、例えば、４週間毎に（Ｑ４Ｗ）で投与され得る。

【0365】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、ＤＭＥ及び／またはＤＲ（例えば、ＮＰＤＲまたはＰＤＲ）の治療のためのＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）は、例えば、硝子体内注入により２ｍｇ／目で、例えば、４週間毎に（Ｑ４Ｗ）投与され得るか、または最初の５か月間はＱ４Ｗで投与され得、その後は、維持のために８週間に１回（Ｑ８Ｗ）注入される。

【0366】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、ＤＭＥ及び／またはＤＲの治療のためのＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与され得る。ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）は、０．７ｍｇのデキサメタゾン硝子体内インプラントとして投与され得、これは、最大６ヶ月毎に投与され得る。

【0367】

本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤は、ＤＭＥ及び／またはＤＲの治療のためのＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与され得る。ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）は、０．１９ｍｇのフルオシノロンアセトニド硝子体内インプラントとして投与され得、これは、０．２５μｇ／日の速度で溶出され得、最大約３６ヶ月継続され得る。

【0368】

いくつかの場合において、ＴＡＯ／ＰＲＮ治療レジメンまたはＴＡＥ治療レジメンは、本発明の抗体、またはそれらの抗体複合体、融合タンパク質、及び／もしくは高分子製剤と組み合わせて、ＡＭＤ療法剤（例えば、ラニビズマブまたはアフリベルセプト）を投与するために使用され得る。ＴＡＯ／ＰＲＮレジメンに関して、４週間毎（Ｑ４Ｗ）（典型的には約３ヶ月間）の最初の硝子体内注入の後、対象は、毎月または隔月（または、より長い間隔をもって）監視され、疾患活動性（例えば、視力の減退または光干渉断層撮影画像（ＯＣＴ）上の流体）の徴候があると注入が施される。ＴＡＥレジメンに関して、対象は、４週間毎に（Ｑ４Ｗ）治療され得、その後は、後の往診の各々に関して、決められた週の数（例えば、＋２週）だけ最大の間隔（例えば、６週間毎、８週間毎、１０週間毎、または１２週間毎）まで治療の間隔を伸ばす。目（複数可）は、疾患活動性の徴候が無くても各往診において観察及び治療され得る。網膜黄斑が、滲出しているように見えた場合（例えば、ＯＣＴにより）、注入の間隔は、網膜黄斑が再び乾燥しているように見えるまで、短縮され得る（例えば、−２週）。いくつかの事例において、眼の障害は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）である。

【0369】

上述されるかかる併用療法は、併用投与（同じかまたは別々の製剤中に２つ以上の療法剤が含まれる場合）及び別々の投与を包含し、別々の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加の療法剤（複数可）の投与前、投与と同時に、かつ／または投与後に行われ得る。一実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤の投与及び追加の療法剤の投与は、互いに、約１、２、３、４、もしくは５ヶ月以内、または約１、２、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に生じる。本発明の抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤は、放射線療法と組み合わせても使用され得る。

【0370】

眼の疾患または状態の予防または治療のための本発明の抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤（及び、任意の追加の療法剤）は、例えば、経眼的、眼内、及び／もしくは硝子体内注入、及び／もしくは強膜近傍注入、及び／もしくはテノン嚢下注入、及び／もしくは超脈絡膜注入、ならびに／または目薬及び／もしくは軟膏の形態での局所的な投与が含まれるが、これらに限定されない任意の好適な手段により投与され得る。本発明のかかる抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤は、多様な方法、例えば、Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）などの参照文献に記載されているものを含む、化合物が硝子体にゆっくりと放出されるのを可能にするデバイス及び／またはデポにより硝子体内に送達され得る。一例において、デバイスは、長時間にわたって化合物を放出するミニポンプ及び／またはマトリックス及び／または受動拡散系及び／または封入細胞の形態であり得る（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊａｆｆｅ，Ｊａｆｆｅ，Ａｓｈｔｏｎ，ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ｍａｒｃｈ ２００６）。使用され得る追加の手法は、以下のＫの項に記載される。

【0371】

経眼的、眼内、または硝子体内投与のための製剤は、当該技術分野における既知の方法及び賦形剤を使用することにより調製され得る。有効な治療の重要な特徴は、目を通過する適切な浸透である。目の前方の疾患とは違い、薬物が局所的に送達され得る場合、網膜疾患は典型的には、より部位に特異的な手法から利益を得る。目薬及び軟膏は、目の後方にめったに浸透することはなく、血液眼バリアが、全身に投与された薬物が眼の組織中に浸透するのを妨げる。したがって、ＡＭＤ及びＣＮＶなどの網膜疾患を治療するための薬物送達の選択方法は典型的には、硝子体内直接注入である。硝子体内注入の間隔は通常、患者の状態、ならびに送達される薬物の特性及び半減期に応じて繰り返される。使用され得る追加の手法は、以下のＫの項に記載される。

【0372】

特定の眼の障害または状態の治療に有効になるであろう抗体、その抗体変異体、その抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技法により決定され得る。可能な場合、最初にインビトロで、次いで、有用な動物モデル系で用量応答曲線及び本発明の薬学的組成物を決定し、その後ヒトで試験することが望ましい。

【0373】

追加の好適な投与手段には、非経口的、肺内、及び鼻腔内、ならびに局所的治療が所望される場合は、病巣内投与が含まれる。非経口点滴には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内または皮下注入などの注入によるものであり得る。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス点滴を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。いくつかの事例において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤は、静脈内に、筋肉内に、皮内に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、くも膜下腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹腔内に、腹膜内に、脳室内に、皮下に、結膜下に、肺胞内に、粘膜内に、心膜内に、臍帯内に（ｉｎｔｒａｕｍｂｉｌｉｃａｌｌｙ）、眼窩内に、口腔内に、局所的に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）、吸入により、注入により、インプラントにより、点滴により、連続点滴により、標的細胞に直接的に流す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリームで、または脂質組成物で投与され得る。

【0374】

疾患の予防または治療に関して、本発明の抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤の適切な投与量（単独で、または１つ以上の他の追加の療法剤と組み合わせて使用されるとき）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的または療法目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴、及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に応じる。抗体、抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤は好適には、１回で、または一連の治療にわたって患者に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるかまたは連続点滴によるかどうかに関わらず、患者への投与のための最初の候補投与量になり得る。いくつかの実施形態において、使用される抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。１つの典型的な１日投与量は、上述される要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲になり得る。状態に応じて数日間以上にわたって繰り返される投与に関して、治療は概して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。

【0375】

いくつかの実施形態において、本方法は、追加の療法をさらに含み得る。追加の療法は、放射線療法、手術、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウィルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述のものの組み合わせであり得る。追加の療法は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。いくつかの実施形態において、追加の療法は、小分子酵素阻害剤または抗点転移薬剤の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、副作用制限薬剤（例えば、治療の副作用の発生及び／または重症度を軽減するよう意図された薬剤、例えば、制嘔吐剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、手術である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施形態において、追加の療法は、上述される療法剤のうちの１回以上の別々の投与であり得る。

【0376】

上記の製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の免疫複合体を使用して行われ得ることが理解される。

【0377】

上記の製剤または治療方法のうちのいずれも、抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明（例えば、本明細書に記載されるいずれにおいても、例えば、以下のＫの項）の抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤を使用して行われ得ることが理解される。

【0378】

Ｉ．製造物品
本発明の別の態様において、上述される障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上または容器に関連付けられるラベルもしくは添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体によるか、または別の組成物と組み合わせて、状態の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグまたは皮下注入針により貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物をその中に収容した第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤、さもなければ療法剤を含む組成物をその中に収容した第２の容器を含み得る。本発明のこの実施形態における製造物品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製造物品は、注入用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または、第３）の容器をさらに備え得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【0379】

上記の製造物品のうちのいずれも、抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の免疫複合体を含み得ることが理解される。

【0380】

上記の製造物品のうちのいずれも、抗ＶＥＧＦ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の抗体複合体、融合タンパク質、または高分子製剤を含み得ることが理解される。

【0381】

Ｊ．抗体変異体を特定する方法及び抗体を改善する方法
本発明は、抗体を改善する方法及び抗体変異体を特定する方法を提供する。いくつかの事例において、本方法は、抗体の標的分子への増強された結合を付与する１つ以上のアミノ酸残基改変を特定することを伴う。いくつかの事例において、本方法は、抗体の増強された安定性（例えば、熱安定性）、機能発現、及び／またはタンパク質折り畳みを付与する１つ以上のアミノ酸残基改変を特定することを伴う。いくつかの事例において、本発明は、抗体の標的分子への結合親和性を改善する方法を提供する。いくつかの事例において、本発明は、抗体の安定性（例えば、熱安定性）、機能発現、及び／またはタンパク質折り畳みを改善する方法を提供する。いくつかの事例において、本発明は、抗体の標的分子への結合親和性を改善する方法及び抗体の安定性（例えば、熱安定性）を改善する方法を提供する。

【0382】

例えば、本発明は、以下のステップ：（ａ）候補抗体変異体をコードする核酸を含むディスプレイライブラリーであって、各候補抗体変異体が、参照抗体と比較してＶＨまたはＶＬ内にアミノ酸残基改変を含み、ＶＨまたはＶＬの全ての位置のアミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリー中に存在する、ディスプレイライブラリーを提供すること、（ｂ）候補抗体変異体の標的分子への結合に基づいてディスプレイライブラリーを分類して、参照抗体と比較して標的分子への増強された結合を有する候補抗体変異体を含む分類されたライブラリーを形成すること、及び（ｃ）超並列配列決定法により決定される、各アミノ酸残基改変がディスプレイライブラリー中に存在する頻度と分類されたライブラリー中に存在する頻度とを比較し、それにより各アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されているかどうかを決定することにより、アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されている場合、標的分子への増強された結合を付与するものとして特定されること、のうちの１つ以上（例えば、１、２、または３）を伴う、抗体の標的分子への増強された結合を付与するアミノ酸残基改変を特定する方法を提供する。いくつかの事例において、本方法は、例えば、以下に記載されるように、抗体に増強された安定性を付与するアミノ酸残基を特定することをさらに含む。

【0383】

別の例において、本発明は、以下のステップ：（ａ）候補抗体変異体をコードする核酸を含むディスプレイライブラリーであって、各候補抗体変異体が、参照抗体と比較してＶＨまたはＶＬ内にアミノ酸残基改変を含み、ＶＨまたはＶＬの全ての位置のアミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリー中に存在する、ディスプレイライブラリーを提供すること、（ｂ）候補抗体変異体の標的分子への結合に基づいてディスプレイライブラリーを分類して、参照抗体と比較して増強された安定性有する候補抗体変異体を含む分類されたライブラリーを形成すること、及び（ｃ）超並列配列決定法により決定される、各アミノ酸残基改変がディスプレイライブラリー中に存在する頻度と分類されたライブラリー中に存在する頻度とを比較し、それにより各アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されているかどうかを決定することにより、アミノ酸残基改変が、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で濃縮されている場合、抗体に増強された安定性を付与するものとして特定されること、のうちの１つ以上（例えば、１、２、または３）を伴う、抗体に増強された安定性を付与するアミノ酸残基改変を特定する方法を提供する。いくつかの事例において、本方法は、例えば、上述されるように、抗体の標的分子への増強された結合を付与するアミノ酸残基を特定することをさらに含む。

【0384】

前述の方法のうちのいずれも、ステップ（ｂ）後、超並列配列決定法により、各アミノ酸改変が、ディスプレイライブラリー及び分類されたライブラリー中に存在する頻度を決定することをさらに含み得る。

【0385】

いくつかの事例において、アミノ酸残基改変は、ディスプレイライブラリーと比較して分類されたライブラリー中で少なくとも２倍濃縮され得る。例えば、アミノ酸残基改変は、ディスプレイライブラリーと比較して、分類されたライブラリー中で１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１４倍、１６倍以上濃縮され得る。

【0386】

ディスプレイライブラリーは、任意の好適な数の抗体変異体、例えば、約１×１０^３〜約１×１０^１２個以上（例えば、約１×１０^３、約１×１０^４、約１×１０^５、約１×１０^６、約１×１０^７、約１．５×１０^７、約２．５×１０^７、約１×１０^８、約５×１０^８、約１×１０^９、約５×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２個以上）の抗体変異体を含み得る。いくつかの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、約３×１０^９個の抗体変異体を含み得る。他の実施形態において、ディスプレイライブラリーは、約８×１０^８個の抗体変異体を含み得る。

【0387】

前述の方法のうちのいずれにおいても、アミノ酸残基改変は、任意の好適なコドンセットによりコードされ得る。例えば、いくつかの事例において、アミノ酸残基改変は、縮重コドンセットによりコードされる。選択のアミノ酸をテンプレート核酸に置換する方法は、当該技術分野においてしっかりと確立されており、そのいくつかは本明細書に記載される。米国特許第７，９８５，８４０号も参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、上述されるようなまたは以下の実施例の項に記載されるようなライブラリーは、クンケル法を使用して変異体アミノ酸でのアミノ酸置換により作製され得る。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２，１９８７を参照されたい。

【0388】

アミノ酸残基改変は、任意の好適なコドンセットによりコードされ得る。コドンセットは、所望の変異体アミノ酸をコードするために使用される異なるヌクレオチド三連配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従って、以下に示されるように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を表記するための記号を使用して表わされ得る。
ＩＵＢコード
Ｇ グアニン
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｃ シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）

【0389】

例証的な例として、コドンセットＤＶＫにおいて、Ｄは、ヌクレオチドＡまたはＧまたはＴであり得、Ｖは、ＡまたはＧまたはＣであり得、Ｋは、ＧまたはＴであり得る。このコドンセットは、１８個の異なるコドンを呈示し得、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードし得る。

【0390】

オリゴヌクレオチドまたはプライマーセットは、標準的な方法を使用して合成され得る。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、コドンセットにより提供されるヌクレオチド三連配列の可能性のある全ての組み合わせを表し、所望のアミノ酸群をコードするであろう配列を含む固相合成法により合成され得る。ある特定の位置において選択されたヌクレオチド「縮退」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において周知されている。ある特定のコドンセットを有するかかるヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆから入手可能である）を使用して合成され得るか、または市販されているものから得ることができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは典型的には、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、この差異は、全体的な配列内のコドンセットにより確立される。本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸テンプレートに対するハイブリダイゼーションを可能にし、クローニングの目的のための制限酵素部位も含み得る配列を有する。

【0391】

前述の方法のうちのいずれにおいても、縮重コドンセットは、アミノ酸残基改変をコードするために使用され得る。いくつかの事例において、縮重コドンセットは、ＮＮＫまたはＮＮＳコドンセットであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、Ｋが、ＧまたはＴであり、Ｓが、ＣまたはＧである。特定の事例において、縮重コドンセットは、ＮＮＫコドンセットである。

【0392】

当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される任意の好適なディスプレイ手法は、前述の方法のうちのいずれかと併用して使用され得ることを理解されたい。例えば、この方法は、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び／またはｍＲＮＡディスプレイを伴い得る。前述の方法のうちのいずれにおいても、任意の好適なディスプレイライブラリーが使用され得る。例えば、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、細菌ディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、哺乳動物ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイライブラリー、及びｍＲＮＡディスプレイライブラリーからなる群から選択され得る。特定の実施形態において、ディスプレイライブラリーは、ファージディスプレイライブラリーである。

【0393】

抗体可変ドメインの融合ポリペプチドは、多様な形式の細胞、ウィルス、ファージミド、または他の粒子の表面上にディスプレイされ得る。これらの形式は、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びこれらのフラグメントの多価形態を含む。多価形態は、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦａｂ’の二量体であり得、本明細書において、それぞれ（ＳｃＦｖ）_２、Ｆａｂ_２、及びＦ（ａｂ’）_２と称される。例えば、特許公開第ＷＯ９２／０１０４７号及び本明細書に記載されるような、抗体フラグメントを含む融合ポリペプチドを、バクテリオファージの表面上にディスプレイするための方法が、当該技術分野において周知されている。他の特許公報、例えば、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、及びＷＯ９３／１９１７２は、関連方法を記載している。他の公報は、ファージの表面上にディスプレイされた多様な抗原に対して人工的に再配列されているＶ遺伝子レパートリーを有する抗体の特定を示している（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８，１９９２を参照されたく、かつＷＯ９３／０６２１３及びＷＯ９３／１１２３６に開示されているようなもの）。

【0394】

前述の方法のうちのいずれにおいても、ディスプレイライブラリーは、分類（選択）及び／またはスクリーニングされて、例えば、抗原への高親和性結合体が特定され得る。分類することは、本明細書に記載されるように、または当該技術分野において既知の他の手法により実施され得る。例えば、米国特許第７，９８５，８４０号を参照されたい。いくつかの実施形態において、分類することは、ディスプレイライブラリーを固定化抗原（例えば、標的分子またはそれらのエピトープ）と接触させることを伴い得る。他の実施形態において、分類することは、ディスプレイライブラリーを可溶性抗原と接触させることを伴い得る。選択された抗体変異体は、さらにスクリーニングされて、抗体変異体を結合親和性（例えば、ＳＰＲにより）、安定性、折り畳み、構造（例えば、Ｘ線結晶学により）、または他の特質の観点で特徴付けられ得る。

【0395】

前述の方法のうちのいずれも、例えば、未分類のライブラリー中にアミノ酸残基改変が現れる頻度と比較して、分類後のライブラリー（分類されたライブラリーと称される）中にアミノ酸残基改変が現れる頻度を決定するために超並列配列決定法を伴い得る。超並列配列決定法のための幅広い多様な手法が当該技術分野において既知であり、任意の好適な手法が本発明の方法で使用され得る。例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１１：３１−３６，２０１０を参照されたく、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。例示的な手法には、超並列署名配列決定法（ＭＰＳＳ）、ポロニー配列決定法、パイロ配列決定法（４５４／Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、イオン半導体配列決定法、単一分子リアルタイム配列決定法、合成配列決定法、ライゲーション配列決定法が含まれる。市販されている超並列配列決定法基盤は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ及び他の会社から入手可能である。配列決定法は、ディープ配列決定法、超ディープ配列決定法、及び／または次世代配列決定法であり得る。

【0396】

前述の方法のうちのいずれにおいても、この方法は、少なくとも約１００，０００リード以上（例えば、１００，０００リード、２００，０００リード、３００，０００リード、４００，０００リード、５００，０００リード、６００，０００リード、７００，０００リード、８００，０００リード、９００，０００リード、１，０００，０００リード、２×１０^６個のリード、３×１０^６個のリード、４×１０^６個のリード、５×１０^６個のリード、６×１０^６個のリード、７×１０^６個のリード、８×１０^６個のリード、９×１０^６個のリード、１０^７個のリード、１０^８個のリード、１０^９個のリード、または１０^１０個以上のリード）の配列を決定することを伴い得る。この方法は、任意の好適な深さで配列決定法を伴い得る。

【0397】

前述の方法のうちのいずれにおいても、本抗体は、モノクローナル抗体であり得る。前述の方法のうちのいずれにおいても、本抗体は、ＩｇＧ抗体であり得る。前述の方法のうちのいずれにおいても、本抗体は、抗体フラグメントであり得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びダイアボディからなる群から選択され得る。特定の事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。

【0398】

前述の方法のうちのいずれにおいても、二特異性抗体は、モノクローナル抗体であり得る。前述の方法のうちのいずれにおいても、二特異性抗体は、ＩｇＧ抗体であり得る。前述の方法のうちのいずれにおいても、二特異性抗体は、抗体フラグメントであり得る。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びダイアボディからなる群から選択され得る。特定の事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂである。

【0399】

前述の方法のうちのいずれも、本方法のステップにより特定された抗体を生成することをさらに伴い得る。上述される方法は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれかと共に使用され得る。

【0400】

Ｋ．抗ＶＥＧＦ抗体の経眼的長時間作用性送達手法
本発明は、目への抗ＶＥＧＦ抗体（本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体を含む、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）の長時間作用性送達のために使用され得る、眼の障害の治療のための組成物を提供する。例えば、本発明は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗体複合体（例えば、ＦａｂまたはＦａｂ−Ｃ抗体複合体）を提供する。本発明は、融合タンパク質（例えば、Ｆａｂ融合タンパク質）も提供する。他の態様において、本発明は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体を含む製剤（例えば、高分子製剤）を提供する。本発明は、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体の経眼的投与のために使用され得るデバイスも提供する。本発明は、本明細書に記載される抗体複合体、融合タンパク質、及び／または製剤（例えば、高分子製剤）を含む薬学的組成物をさらに提供する。これらの組成物は、本明細書に記載される治療方法、例えば、眼の障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ（例えば、ＮＰＤＲまたはＰＤＲ）、またはＲＶＯ（例えば、ＣＲＶＯまたはＢＲＶＯ））を治療する方法のうちのいずれかで使用され得る。

【0401】

１．抗体複合体
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体及び本抗体に共有結合されるポリマーを含む抗体複合体を提供する。抗ＶＥＧＦ抗体は、不可逆的な様式または可逆的な様式でポリマーに共有結合され得る。本明細書に記載されるものまたは当該技術分野において既知の他のものを含む任意の好適なポリマーが使用され得る。ポリマーは、親水性ポリマーまたは疎水性ポリマーであり得る。親水性ポリマーが水溶性ポリマーであり得ることを理解されたい。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０６６４１７号及び／またはＰｅｌｅｇｒｉ−Ｏ’Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６：１４３２３−１４３３２，２０１４に記載されている親水性ポリマーなどの任意の好適な親水性ポリマーが使用され得る。使用され得る例示的で非限定的な親水性ポリマーには、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）としても既知である）（例えば、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、櫛状ＰＥＧ、及び樹状ＰＥＧ）、ポリ［エチレンオキシド）−コ−（メチレンエチレンオキシド）］、ポリ（ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ｐＰＥＧＭＡ）、アガロース、アルギン酸塩、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、セルロース誘導体、キトサン、コンドロイチン硫酸塩、コラーゲン、デルマタン硫酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸塩、フィブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、フコイダン、ゼラチン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、グリコポリマー、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、高度分岐状多糖類（例えば、ガラクトースデンドリマー）、ケラタン硫酸塩、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）、ペクチン、ペクチン誘導体、ペントサンポリ硫酸塩、デンプン、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、スチレン、ビトロネクチン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、多価電解質、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリ（グリセロール）（ＰＧ）（例えば、線状、中官能性、超分岐状、または線状超分岐状ＰＧ）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリスチレン、ポリスチレン誘導体（例えば、荷電ポリスチレン誘導体）、ポリ（スチレンスルホン酸塩−コ−ＰＥＧＭＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ｐＮＡｃＭ）、及びそれらのコポリマーが含まれる。いくつかの事例において、ポリマーは、疎水性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、及びポリグリコリド（ＰＧＡ）である。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。

【0402】

例として、ポリマーは、例えば、２〜約１×１０^４個（例えば、約１０、約５０、１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、または約１ｘ１０^４個）以上のモノマーの任意の好適な数のモノマーを含み得る。例えば、ポリマーは、約５０〜約２５０個のモノマー、約５０及び約５００個のモノマー、約５０〜約１０００個のモノマー、約５０〜約２０００個のモノマー、約５０〜約３０００個のモノマー、約５０〜約４０００個のモノマー、約５０〜約５０００個のモノマー、約５０〜約６０００個のモノマー、約５０〜約７０００個のモノマー、約５０〜約８０００個のモノマー、約５０〜約９０００個のモノマー、約５０〜約１００００個のモノマー、約１００〜約２５０個のモノマー、約１００及び約５００個のモノマー、約１００〜約１０００個のモノマー、約１００〜約２０００個のモノマー、約１００〜約３０００個のモノマー、約１００〜約４０００個のモノマー、約１００〜約５０００個のモノマー、約１００〜約６０００個のモノマー、約１００〜約７０００個のモノマー、約１００〜約８０００個のモノマー、約１００〜約９０００個のモノマー、約１００〜約１００００個のモノマー、約２５０〜約５００個のモノマー、約２５０〜約１０００個のモノマー、約２５０〜約２０００個のモノマー、約２５０〜約３０００個のモノマー、約２５０〜約４０００個のモノマー、約２５０〜約５０００個のモノマー、約２５０〜約６０００個のモノマー、約２５０〜約７０００個のモノマー、約２５０〜約８０００個のモノマー、約２５０〜約９０００個のモノマー、約２５０〜約１００００個のモノマー。約５００〜約１０００個のモノマー、約５００〜約２０００個のモノマー、約５００〜約３０００個のモノマー、約５００〜約４０００個のモノマー、約５００〜約５０００個のモノマー、約５００〜約６０００個のモノマー、約５００〜約７０００個のモノマー、約５００〜約８０００個のモノマー、約５００〜約９０００個のモノマー、または約５００〜約１００００個のモノマーを含み得る。いくつかの事例において、ポリマーは、約５００個のモノマーを含み得る。

【0403】

本発明は、ＨＡポリマーに共有結合される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）を含む抗体複合体を提供する。かかる抗体複合体は、本明細書において「ＨＡ複合体」と称される場合がある。いくつかの事例において、ＨＡポリマーは、約２．５メガダルトン（ＭＤａ）以下（例えば、約２．５ＭＤａ以下、約２．４ＭＤａ以下、約２．３ＭＤａ以下、約２．２ＭＤａ以下、約２．１ＭＤａ以下、約２．０ＭＤａ以下、約１．９ＭＤａ以下、約１．８ＭＤａ以下、約１．７ＭＤａ以下、約１．６ＭＤａ以下、約１．５ＭＤａ以下、約１．４ＭＤａ以下、約１．３ＭＤａ以下、約１．２ＭＤａ以下、約１．１ＭＤａ以下、約１．０ＭＤａ以下、約９００ｋＤａ以下、約８００ｋＤａ以下、約７００ｋＤａ以下、約６００ｋＤａ以下、約５００ｋＤａ以下、約４００ｋＤａ以下、約３００ｋＤａ以下、約２００ｋＤａ以下、または約１００ｋＤａ以下）の分子量を有する。いくつかの事例において、ＨＡポリマーは、約１ＭＤａ以下（例えば、約１．０ＭＤａ以下、約９００ｋＤａ以下、約８００ｋＤａ以下、約７００ｋＤａ以下、約６００ｋＤａ以下、約５００ｋＤａ以下、約４００ｋＤａ以下、約３００ｋＤａ以下、約２００ｋＤａ以下、または約１００ｋＤａ以下）の分子量を有する。いくつかの事例において、ＨＡポリマーは、約２５ｋＤａ〜約２．５ＭＤａ（例えば、約２５ｋＤａ〜約２．５ｍＤａ、約２５ｋＤａ〜約２ＭＤａ、約２５ｋＤａ〜約１．５ＭＤａ、約２５ｋＤａ〜約１ＭＤａ、約２５ｋＤａ〜約９００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約８００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約２．５ＭＤａ、約１００ｋＤａ〜約２ＭＤａ、約１００ｋＤａ〜約１．５ＭＤａ、約１００ｋＤａ〜約１ＭＤａ、約１００ｋＤａ〜約９００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約８００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約２．５ＭＤａ、約２５０ｋＤａ〜約２ＭＤａ、約２５０ｋＤａ〜約１．５ＭＤａ、約２５０ｋＤａ〜約１ＭＤａ、約２５０ｋＤａ〜約９００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約８００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、約２５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜約２．５ＭＤａ、約５００ｋＤａ〜約２ＭＤａ、約５００ｋＤａ〜約１．５ＭＤａ、約５００ｋＤａ〜約１ＭＤａ、約５００ｋＤａ〜約９００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜約８００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜約７００ｋＤａ、約５００ｋＤａ〜約６００ｋＤａ、約１ＭＤａ〜約２．５ＭＤａ、約１ＭＤａ〜約２ＭＤａ、約１ＭＤａ〜約１．５ＭＤａ、約１ＭＤａ〜約１．２５ＭＤａ、約１．２５ＭＤａ〜約２．５ＭＤａ、約１．２５ＭＤａ〜約２ＭＤａ、約１．２５ＭＤａ〜約１．５ＭＤａ、約１．５ＭＤａ〜約２．５ＭＤａ、約１．５ＭＤａ〜約２ＭＤａ、約１．５ＭＤａ〜約１．７５ＭＤａ、または１．７５ＭＤａ〜約２．５ＭＤａ）の分子量を有する。

【0404】

いくつかの事例において、ＨＡポリマーは、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ（例えば、約２５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１００ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、１７５ ２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１７５ｋＤａ〜約２２５ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、または約２００ｋＤａ〜２２５ｋＤａ）の分子量を有する。

【0405】

いくつかの事例において、ＨＡポリマーは、約１００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ（例えば、約１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２１０ｋＤａ、約２２０ｋＤａ、約２３０ｋＤａ、約２４０ｋＤａ、または約２５０ｋＤａ）の分子量を有する。特定の事例において、ＨＡポリマーは、約２００ｋＤａの分子量を有する。

【0406】

前述の分子量のうちのいずれも、重量平均分子量（重量平均分子質量としても既知である）であり得る。

【0407】

いくつかの事例において、前述のＨＡポリマーのうちのいずれも、線状であり、すなわち、架橋されていない。

【0408】

他の事例において、本発明は、ＰＥＧポリマーに共有結合される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体）を含む抗体複合体を提供する。かかる抗体複合体は、本明細書において「ＰＥＧ複合体」と称される場合がある。任意の好適なＰＥＧポリマーが使用され得る。ＰＥＧは、分岐状ＰＥＧ、星状ＰＥＧ、または櫛状ＰＥＧであり得る。ＰＥＧポリマーは、例えば、ＰＥＧ四量体、ＰＥＧ六量体、またはＰＥＧ八量体であり得る。いくつかの事例において、抗体複合体は、ＰＥＧデンドリマーに共有結合される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）を含む。ＰＥＧポリマーは、例えば、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及び他の業者から市販されている。

【0409】

いくつかの事例において、ＰＥＧポリマーは、約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａ〜約７５ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約４５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約４００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約３００ｋＤａ、５０ ２００ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ、または約５０ｋＤａ〜約２２５ｋＤａ）の分子量を有する。

【0410】

いくつかの事例において、ＰＥＧポリマーは、約５ｋＤａ〜約２５０ｋＤａ（例えば、約１ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、約８０ｋＤａ、約９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、約１１０ｋＤａ、約１２０ｋＤａ、約１３０ｋＤａ、約１４０ｋＤａ、約１５０ｋＤａ、約１６０ｋＤａ、約１７０ｋＤａ、約１８０ｋＤａ、約１９０ｋＤａ、約２００ｋＤａ、約２１０ｋＤａ、約２２０ｋＤａ、約２３０ｋＤａ、約２４０ｋＤａ、または約２５０ｋＤａ）の分子量を有する。特定の事例において、ＰＥＧポリマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する。他の事例において、ＰＥＧポリマーは、約４０ｋＤａの分子量を有する。

【0411】

前述の分子量のうちのいずれも、重量平均分子量（重量平均分子質量としても既知である）であり得る。

【0412】

いくつかの事例において、ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ四量体である。例えば、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ−４００ＭＡ、ＰＴＥ−２００ＭＡ、ＰＴＥ−１００ＭＡ、及びＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ ４アームＰＥＧマレイミド（Ｃａｔ．Ｎｏ．４ＡＲＭ−ＭＡＬ）などのＰＥＧ四量体が市販されている。いくつかの事例において、ＰＥＧ四量体は、ペンタエリスリトールコアを有する。例えば、いくつかの事例において、ＰＥＧ四量体は、式（Ｉ）の構造を含み、式中、ｎは独立して、任意の好適な整数である。
式Ｉ：

【0413】

いくつかの事例の別の例において、ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ六量体である。例えば、ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ ６アームＰＥＧアミン（Ｃａｔ．Ｎｏ．６ＡＲＭ（ＤＰ）−ＮＨ２ＨＣｌ）などのＰＥＧ六量体、またはＱｕａｎｔａ ＢｉｏＤｅｓｉｇｎからのＰＥＧ六量体が市販されている。いくつかの事例において、ＰＥＧ六量体は、ジペンタイルエリスリトール（ｄｉｐｅｎｔｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）コアを含む。

【0414】

いくつかの事例において、ＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ八量体である。例えば、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＨＧＥＯシリーズまたはＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ ８アームＰＥＧマレイミド（Ｃａｔ．Ｎｏ．８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＭＡＬ）などのＰＥＧ八量体が市販されている。いくつかの事例において、ＰＥＧ八量体は、トリペンタエリスリトール（ｔｒｉｐｅｎｔａｅｒｉｔｈｒｉｔｏｌ）コアを含み得る。例えば、いくつかの事例において、ＰＥＧ八量体は、式（ＩＩ）の構造を含み、式中、ｎは独立して、任意の好適な整数である。
式ＩＩ：

【0415】

いくつかの事例のさらに別の例において、ＰＥＧ八量体は、トリペンタエリスリトールコアを含む。

【0416】

本明細書に記載されるもの及び当該技術分野において既知の他のものを含む任意の好適な複合体化手法が、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体をポリマーに複合体化するために使用され得ることを理解されたい。例えば、ポリマーは、一級アミン基、カルボキシル基、スルフヒドリルフロウプ、またはカルボニル基を含む任意の好適なタンパク質官能基に複合体化され得る。任意の好適な化学反応性基は、タンパク質官能基、例えば、カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）、ＮＨＳエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィン、マレイミド、ハロアセチル（例えば、ブロモアセチルまたはヨードアセチル）、ピリジルジスルフィド、チオスルホン酸塩、ビニルスルホン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ジアジリン、アリールアジド、イソシアン酸塩、または当該技術分野において既知の他のものを標的とするために使用され得る。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２０１３を参照されたい。

【0417】

前述の抗体複合体のうちのいずれも、約５ｎｍ〜約２００ｎｍ（例えば、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１９０ｎｍ、または約２００ｎｍ）の流体力学半径を有し得る。いくつかの事例において、抗体複合体は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（例えば、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、または約１５０ｎｍ）の流体力学半径を有する。いくつかの事例において、抗体複合体は、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ（例えば、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、または約１００ｎｍ）の流体力学半径を有する。いくつかの事例において、抗体複合体は、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ（例えば、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、または約６０ｎｍ）の流体力学半径を有する。いくつかの事例において、抗体複合体は、約２５ｎｍ〜約３５ｎｍ（例えば、約２５ｎｍ、約２６ｎｍ、約２７ｎｍ、約２８ｎｍ、約２９ｎｍ、約３０ｎｍ、約３１ｎｍ、約３２ｎｍ、約３３ｎｍ、約３４ｎｍ、または約３５ｎｍ）の流体力学半径を有する。いくつかの事例において、流体力学半径は、約２８ｎｍである。

【0418】

いくつかの事例において、抗体複合体は、約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約６０ｎｍ〜約８０ｎｍの流体力学半径を有する。

【0419】

いくつかの事例において、抗体複合体は、前駆薬物抗体複合体（担体連鎖前駆薬物とも称される）であり、ここで、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）は、例えば、リンカー（例えば、可逆的前駆薬物リンカー）を介して、担体（例えば、ヒドロゲル）に可逆的に複合体化される。この手法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／００３０１４号、同第ＷＯ２００９／０９５４７９号、同第ＷＯ２０１１／０１２７１５号、同第ＷＯ２０１３／０５３８５６号、及び同第ＷＯ２０１４／０５６９２３号にさらに記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。かかる前駆薬物抗体複合体は、Ａｓｃｅｎｄｉｓ Ｐｈａｒｍａ（例えば、ＴｒａｎｓＣｏｎ技術基盤）から市販されている。リンカーは、目（例えば、硝子体）の中で抗ＶＥＧＦ抗体の時間制御された放出をもたらす、本来の自己切断特性を有し得る（例えば、リンカーは、目に投与されると非酵素的に加水分解され得る）。

【0420】

例えば、いくつかの事例において、本発明は、リンカーにより担体に共有結合される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）を含む前駆薬物抗体複合体を提供する。特定の事例において、リンカーは、可逆的前駆薬物リンカーである。いくつかの事例において、担体は、ポリマー、例えば、ＰＥＧを含む。ＰＥＧは、例えば、線状、分岐状、マルチアーム、または樹状ＰＥＧであり得る。いくつかの事例において、担体は、生分解性ヒドロゲルを含むヒドロゲルである。例えば、ＰＥＧ系ヒドロゲルなどの任意の好適なヒドロゲルが使用され得る。ＰＥＧ系ヒドロゲルは、例えば、少なくとも１０％のＰＥＧ、少なくとも２０％のＰＥＧ、少なくとも３０％以上のＰＥＧを含み得る。ヒドロゲルは、微粒子ビーズの形状であり得る。かかる微粒子ビーズは、約１μｍ〜約１０００μｍ、例えば、約５μｍ〜約５００μｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、または約２０μｍ〜約８０μｍの直径を有し得る。ビーズ直径は、微粒子ビーズが等張性水性緩衝液中で懸濁されるときに測定され得る。いくつかの事例において、ヒドロゲルは、ＷＯ２００６／００３０１４またはＷＯ２０１１／０１２７１５に開示されている任意のヒドロゲルであり得る。

【0421】

前述の抗体複合体のうちのいずれにおいても、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメント、例えば、ＶＥＧＦに結合する本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ抗体の抗体フラグメントであり得る。いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。特定の事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ−Ｃである。いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ−Ｃである。

【0422】

前述の抗体複合体のうちのいずれも、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）に共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有し得る。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの事例において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一ではない。

【0423】

前述の抗体複合体のうちのいずれも、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）に共有結合されない参照抗体に対して減少される眼クリアランスを有し得る。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して少なくとも約４倍減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、硝子体からのクリアランスである。いくつかの事例において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、抗体複合体の抗体と同一ではない。

【0424】

いくつかの事例において、前述の抗体複合体（例えば、ＨＡ複合体、ＰＥＧ複合体、及び前駆薬物抗体複合体）のうちのいずれか２つの眼内投与間の期間（例えば、硝子体内注入による）は、少なくとも１ヶ月、例えば、少なくとも１ヶ月、少なくとも５週、少なくとも６週、少なくとも７週、少なくとも８週、少なくとも９週、少なくとも１０週、少なくとも１１週、少なくとも１２週、少なくとも１３週、少なくとも１４週、少なくとも１５週、少なくとも１６週、少なくとも２０週、少なくとも２４週、少なくとも２８週、少なくとも３２週、少なくとも３６週、少なくとも４０週、少なくとも４４週、少なくとも４８週、少なくとも５２週以上である。次いで、いくつかの場合において、２つの眼内投与間の最大期間は、４年以下、例えば、３年以下、２年以下、または１年以下である。抗体複合体は、例えば、２〜１２ヶ月毎、例えば、４〜１０ヶ月毎に投与され得る。いくつかの事例において、抗体複合体は、６ヶ月毎に投与される。

【0425】

本発明は、上述される抗体複合体（例えば、ＨＡ複合体、ＰＥＧ複合体、及び前駆薬物抗体複合体）のうちのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、１つ以上の追加の化合物を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン−８（ＩＬ−８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０Ａなどの加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）リスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0426】

本発明は、上述される抗体複合体（例えば、ＨＡ複合体、ＰＥＧ複合体、及び前駆薬物抗体複合体）のうちのいずれかと、追加のＶＥＧＦアンタゴニストとを含む組成物（例えば、薬学的組成物）をさらに提供する。

【0427】

２．融合タンパク質
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）と、眼の結合ドメインとを含む融合タンパク質を提供する。眼の結合ドメインは、例えば、目の中で見られる生体物質（例えば、角膜、硝子体、網膜、網膜色素上皮、または脈絡膜）に結合し得、それは、抗体の眼（例えば、硝子体）内滞留時間を（例えば、半減期を増加及び／またはクリアランスを減少することにより）増加し得る。眼の結合ドメインは、例えば、細胞外マトリックス構成成分を含む任意の好適な生体物質に結合し得る。例えば、目（例えば、硝子体）の中の好適な生体物質には、細胞外マトリックス構成成分、例えば、炭水化物（例えば、荷電炭水化物（例えば、グリコサミノグリカン））、糖タンパク質（例えば、フィブリリン及びオプティシン）、及びタンパク質（例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲン種Ｉ〜ＸＸＶＩＩ、特にコラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＸＩ、及びそれらのヘテロタイプのコラーゲン原線維）、または例えば、Ｌｅ Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｙｅ ２２：１２１４−１２２２，２００８に記載されている他の細胞外マトリックス構成成分が含まれ得る。いくつかの事例において、細胞外マトリックス構成成分は、グリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはプロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸塩またはヘパリン硫酸塩）である。特定の事例において、グリコサミノグリカンは、ＨＡである。ＨＡ結合ドメイン、ならびにＨＡ結合ドメインを含む融合タンパク質は、例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６（３）：８０１−８１２，２００９；米国特許第５，９８６，０５２号、同第７，１８３，３７７号、同第７，７２３，４７２号、及び同第８，８４６，０３４号；米国特許出願公開第２００４／００５２７７号；ならびに国際特許出願第ＷＯ１９９８／０５２５９０号、同第ＷＯ２０１０／０４５５０６号、同第ＷＯ２０１４／０９９９９７号、同第ＷＯ２０１５／１９８２４３号、同第ＷＯ２０１５／１１０８０９号に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。眼の結合ドメインは、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体に組み換え融合されることにより、抗体に共有結合され得る。他の事例において、眼の結合ドメインは、（例えば、ビオチン−ストレパビジン（ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ））連鎖）により、抗ＶＥＧＦ抗体に共有複合体化または非共有複合体化され得る。

【0428】

例えば、本発明は、ＨＡ結合ドメインに共有結合される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの事例において、ＨＡ結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合される。例えば、ＨＡ結合ドメインは、重鎖に共有結合される。別の例において、ＨＡ結合ドメインは、軽鎖に共有結合される。ＨＡ結合ドメインは、任意の好適な部位、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部部位（例えば、挿入）で抗ＶＥＧＦ抗体に共有結合され得る。ＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端または軽鎖のＣ末端に共有結合され得る。例えば、いくつかの事例において、ＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端に共有結合される。他の事例において、ＨＡ結合ドメインは、軽鎖のＣ末端に共有結合される。

【0429】

前述の融合タンパク質のうちのいずれにおいても、融合タンパク質は、リンカーをさらに含み得、リンカーは、抗体とＨＡ結合ドメインとの間に位置付けられている。例えば、（Ｇｌｙ_ｎ−Ｓｅｒ_ｎ）_ｎまたは（Ｓｅｒ_ｎ−Ｇｌｙ_ｎ）_ｎリンカーなどの任意の好適なリンカーが使用され得、式中、ｎは独立して、１以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３以上）の整数である。ＷＯ２０１４／０９９９９７は、いくつかのリンカーを記載しており、そのうちのいずれかが本発明の融合タンパク質中で使用され得る。いくつかの事例において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの事例において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列から構成され得る。他の好適なリンカーには、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_４、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３などが含まれる。いくつかの事例において、セリンは、アラニン（例えば、（Ｇｌｙ_４Ａｌａ）または（Ｇｌｙ_３Ａｌａ））で置き換えられ得る。

【0430】

前述の融合タンパク質のうちのいずれにおいても、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントであり得る。いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。例えば、いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ−Ｃである。いくつかの事例において、ＨＡ結合ドメインは、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端に共有結合される。他の事例において、ＨＡ結合タンパク質は、ＦａｂのＣＬドメインのＣ末端に共有結合される。

【0431】

前述の融合タンパク質のうちのいずれにおいても、ＨＡ結合ドメインは、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、リジンに富んだオリゴペプチド、及び当該技術分野において既知の他のＨＡ結合ドメインからなる群から選択され得る。例えば、ＨＡ結合ドメインは、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６（３）：８０１−８１２，２００９；米国特許第５，９８６，０５２号、同第７，１８３，３７７号、同第７，７２３，４７２号、及び同第８，８４６，０３４号；米国特許出願公開第２００４／００５２７７号；ならびに／または国際特許出願第ＷＯ１９９８／０５２５９０号、同第ＷＯ２０１０／０４５５０６号、同第ＷＯ２０１４／０９９９９７号、同第ＷＯ２０１５／１９８２４３号、同第ＷＯ２０１５／１１０８０９号に記載されている任意のＨＡ結合ドメインであり得る。例えば、ＷＯ２０１４／０９９９９７に記載されているように、ＨＡ結合ドメインは、ＨＡ１０、ＨＡ１０．１、ＨＡ１０．２、ＨＡ１１、またはＨＡ１１．１であり得る。

【0432】

いくつかの事例において、ＨＡ結合ドメインは、リンクモジュールである。任意の好適なリンクモジュールが使用され得る。例えば、いくつかの事例において、リンクモジュールは、ＴＳＧ６、ＣＤ４４、リンパ管内皮ヒアルロナン受容体１（ＬＹＶＥ−１）、ヒアルロナン及びプロテオグリカンリンクタンパク質（ＨＡＰＬＮ）１、ＨＡＰＬＮ２、ＨＡＰＬＮ３、ＨＡＰＬＮ４、アグリカン、ブレビカン、ニューロカン、ホスファカン、バーシカン、ＣＡＢ６１３５８、ＫＩＡ０５２７、スタビリン−１、ならびにスタビリン−２リンクモジュール、またはそれらの変異体からなる群から選択される。いくつかの事例において、リンクモジュールは、ＴＳＧ６リンクモジュール、例えば、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの事例において、ＨＡ結合タンパク質ＴＳＧ６のリンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９８０６６）のアミノ酸残基３６〜１２８を含み得る。

【0433】

前述の融合タンパク質のうちのいずれも、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインをさらに含み得る。例えば、融合タンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加のＨＡ結合ドメイン（複数可）をさらに含み得る。いくつかの事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインは、抗体の重鎖または軽鎖に共有結合される。例えば、いくつかの事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインは、抗体の重鎖に共有結合される。他の事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインは、抗体の軽鎖に共有結合される。いくつかの事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンカーにより抗体に連鎖される。上述されるリンカーなどの任意の好適なリンカーが使用され得る。いくつかの事例において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む。いくつかの事例において、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列からなる。いくつかの事例において、第１のＨＡ結合ドメインは、重鎖に共有結合され、第２のＨＡ結合ドメインは、軽鎖に共有結合される。少なくとも１つの追加のＨＡ結合ドメインは、任意の好適な部位、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部部位（例えば、挿入）で抗ＶＥＧＦ抗体に共有結合され得る。抗体が抗体中に１つ超の追加のＨＡ結合ドメインを含む事例において、挿入は、抗体中の単一の部位にあるか、または抗体中の複数の異なる部位にある場合がある。例えば、いくつかの事例において、第１のＨＡ結合ドメインは、重鎖のＣ末端に連鎖され、第２のＨＡ結合ドメインは、軽鎖のＣ末端に連鎖される。いくつかの事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンクモジュール、Ｇ１ドメイン、及びリジンに富んだオリゴペプチドからなる群から選択される。例えば、いくつかの事例において、少なくとも１つの追加のＨＡ結合タンパク質は、リンクモジュールである。リンクモジュールは、本明細書に記載されるか、または当該技術分野において既知の任意のリンクモジュールであり得る。いくつかの事例において、リンクモジュールは、ＴＳＧ６リンクモジュール、例えば、ヒトＴＳＧ６リンクモジュールである。いくつかの事例において、ＨＡ結合タンパク質ＴＳＧ６のリンクモジュールは、ヒトＴＳＧ６（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９８０６６）のアミノ酸残基３６〜１２８を含み得る。

【0434】

前述の融合タンパク質のうちのいずれも、ＶＥＧＦ及びＨＡに特異的に結合し得る。いくつかの事例において、融合タンパク質は、約１０μＭ以下のＫｄでＨＡに結合する。例えば、いくつかの事例において、融合タンパク質は、約１０μＭ以下、８μＭ以下、６μＭ以下、４μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、７５０ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎｍ以下、または１ｎｍ以下のＫｄでＨＡに結合する。いくつかの事例において、融合タンパク質は、約２ｎＭ以下のＫｄでＨＡに結合する。いくつかの事例において、融合タンパク質は、約１ｎＭ〜約２μＭ、例えば、約１ｎＭ〜約１．８μＭ、約１ｎＭ〜約１．６μＭ、約１ｎＭ〜約１．４μＭ、約１ｎＭ〜約１．２μＭ、約１ｎＭ〜約１．０μＭ、約１ｎＭ〜約９００ｎＭ、約１ｎＭ〜約８００ｎＭ、約１ｎＭ〜約７００ｎＭ、約１ｎＭ〜約６００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４００ｎＭ、約１ｎＭ〜約３００ｎＭ、約１ｎＭ〜約２００ｎＭ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１ｎＭ〜約４０ｎＭ、約１ｎＭ〜約３０ｎＭ、約１ｎＭ〜約２０ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１００ｎＭ、約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５ｎＭ〜約２５ｎＭ、約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、または約５ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでＨＡに結合する。いくつかの事例において、融合タンパク質は、約１０ｎＭのＫｄでＨＡに結合する。

【0435】

前述の融合タンパク質のうちのいずれも、ＨＡ結合ドメインに共有結合されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有し得る。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの事例において、参照抗体は、融合タンパク質の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、融合タンパク質の抗体と同一ではない。

【0436】

前述の融合タンパク質のうちのいずれも、ＨＡ結合ドメインに共有結合されない参照抗体に対して減少された眼クリアランスを有し得る。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して少なくとも約４倍減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、硝子体からのクリアランスである。いくつかの事例において、参照抗体は、融合タンパク質の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、融合タンパク質の抗体と同一ではない。

【0437】

いくつかの事例において、前述の融合タンパク質のうちのいずれか２つの眼内投与間の期間（例えば、硝子体内注入による）は、少なくとも１ヶ月、例えば、少なくとも１ヶ月、少なくとも５週、少なくとも６週、少なくとも７週、少なくとも８週、少なくとも９週、少なくとも１０週、少なくとも１１週、少なくとも１２週、少なくとも１３週、少なくとも１４週、少なくとも１５週、少なくとも１６週、少なくとも２０週、少なくとも２４週、少なくとも２８週、少なくとも３２週、少なくとも３６週、少なくとも４０週、少なくとも４４週、少なくとも４８週、少なくとも５２週以上である。次いで、いくつかの場合において、２つの眼内投与間の最大期間は、４年以下、例えば、３年以下、２年以下、または１年以下である。融合タンパク質は、例えば、２〜１２ヶ月毎、例えば、４〜１０ヶ月毎に投与され得る。いくつかの事例において、融合タンパク質は、６ヶ月毎に投与される。

【0438】

本発明は、上述される融合タンパク質のうちのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、１つ以上の追加の化合物を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０ＡなどのＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0439】

本発明は、上述される融合タンパク質のうちのいずれかと、追加のＶＥＧＦアンタゴニストとを含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。

【0440】

３．高分子製剤
本発明は、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体と、ポリマーとを含む製剤を提供する。高分子製剤は、例えば、マイクロスフェア、インプラント、ヒドロゲル、オルガノゲル、ナノ集合体、ミセル、インサイツ成型デポ、または当該技術分野において既知の別の種類の高分子製剤であり得る。任意の好適なポリマーが、本発明の高分子製剤で使用され得る。例えば、ポリマーは、親水性ポリマーまたは疎水性ポリマーであり得る。親水性ポリマーが水溶性ポリマーであり得ることを理解されたい。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０６６４１７号またはＰｅｌｅｇｒｉ−Ｏ’Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６：１４３２３−１４３３２，２０１４に記載されている親水性ポリマーなどの任意の好適な親水性ポリマーが使用され得る。他の事例において、例えば、疎水性ポリマーが使用され得る。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。

【0441】

使用され得る例示的で非限定的な親水性ポリマーには、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）としても既知である）（例えば、直鎖ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、櫛状ＰＥＧ、及び樹状ＰＥＧ）、ポリ［エチレンオキシド）−コ−（メチレンエチレンオキシド）］、ポリ（ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート）（ｐＰＥＧＭＡ）、アガロース、アルギン酸塩、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、セルロース、セルロース誘導体、キトサン、コンドロイチン硫酸塩、コラーゲン、デルマタン硫酸塩、デキストラン、デキストラン硫酸塩、フィブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、フコイダン、ゼラチン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、グリコポリマー、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、高度分岐状多糖類（例えば、ガラクトースデンドリマー）、ケラタン硫酸塩、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）、ペクチン、ペクチン誘導体、ペントサンポリ硫酸塩、デンプン、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、スチレン、ビトロネクチン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アミン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（カルボキシベタイン）（ＰＣＢ）、多価電解質、ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリ（グリセロール）（ＰＧ）（例えば、線状、中官能性、超分岐状、または線状超分岐状ＰＧ）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＺ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリスチレン、ポリスチレン誘導体（例えば、荷電ポリスチレン誘導体）、ポリ（スチレンスルホン酸塩−コ−ＰＥＧＭＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）（ｐＮＡｃＭ）、及びそれらのコポリマーが含まれる。他の事例において、例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、及びポリグリコリド（ＰＧＡ）を含む任意の好適な疎水性ポリマーが使用され得る。

【0442】

本発明は、ポリマー溶媒デポ（インサイツ成型インプラントとしても既知である）として製剤化される抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。例えば、ポリマー溶媒デポは、ポリマー（例えば、本明細書に記載されるポリマーのうちのいずれか、例えば、ＰＬＧＡなどの疎水性ポリマー）と、溶媒（例えば、有機溶媒）と、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体）とを含み得る。この溶媒は、低い水混和性を有し得る。使用され得る例示的な有機溶媒には、トリアセチン（酢酸グリセロール）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ポリ（エチレングリコール）ジメチルエーテル、及びエチル安息香酸塩が含まれる。一実施例において、ポリマー溶媒デポは、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）の噴霧乾燥粉末を、ＰＬＧＡトリアセチン溶液内に分散することにより調製され得る（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４（１０）：３４０４−１７，２０１５を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＰＬＧＡは、例えば、約１０ｋＤａ、約４１ｋＤａ、または約５６ｋＤａの分子量を有し得る。例えば、ＲＧ７５２Ｓ、ＲＧ７５５Ｓ、及びＲＧ７５６Ｓ（Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などのＰＬＧＡポリマーが市販されている。ＰＬＧＡ濃度は、約７．５％、約１０％、約１２．５％、約１５％、約２０％以上（重量％）であり得る。抗体濃度は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％（重量％）以上であり得る。いくつかの事例において、抗体濃度は、約１．５％（重量％）である。ポリマー溶媒デポ製剤のうちのいずれも、例えば、２７ゲージ（２７Ｇ）針により注入可能であり得る。投与（例えば、注入（例えば、硝子体内注入）により）されると、かかるポリマー溶媒デポ製剤は、目の中でゲルまたは固形デポに形質転換し得る。ゲルまたは固形デポは、水性及び非水性相を脱混合した結果として形成し得る。水性相への溶媒転換速度に部分的に応じて、注入されたデポは、ポリマー沈降に起因して固形またはゲル材料に遷移し得、抗ＶＥＧＦ抗体（及び、任意の追加の療法剤または化合物）を物理的に封入し得る。他の事例において、インサイツ架橋またはインサイツ固形化オルガノゲルは、例えば、ゲルまたは固形デポを形成するために使用され得る。ポリマー溶媒デポは、例えば、約３０日以上、例えば、約３０日、約４０日、約５０日、約６０日、約７０日、約８０日、約９０日、約１００日、約１１０日、約１２０日、約１３０日以上にわたる長期間送達を可能にし得る。いくつかの場合において、ポリマー溶媒デポは、目の中で約８０日間の長期間送達を可能にし得る。

【0443】

本発明は、ポリマーミセルとして製剤化される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体）も提供する。ポリマーミセルは、例えば、ポリマー（例えば、両親媒性ブロック（例えば、ジブロックまたはマルチブロック）コポリマー）の、疎水性コア及び親水性外皮を有するナノ粒子への自己集合により形成され得る。ポリマーミセルは、任意の好適な直径（例えば、平均直径）、例えば、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ（例えば、約１ｎｍ、約１０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１０００ｎｍ）以上の直径を有し得る。いくつかの事例において、ポリマーミセルは、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ（例えば、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ｎｍ）の直径（例えば、平均直径）を有し得る。例えば、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸塩）、及びポロクサマー（例えば、ポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（プロピレンオキシド）−ブロック−ポリ（エチレンオキシド）コポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などの両親媒性ブロックコポリマーを含む任意の好適なポリマーが使用され得る。他の両親媒性ブロックコポリマーが当該技術分野において既知である。いくつかの事例において、抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、ポリマーへの共有結合によりポリマーミセルの親水性外皮に結合され得る。したがって、いくつかの事例において、上述される抗体複合体は、抗ＶＥＧＦ抗体を含むポリマーミセルを調製するために使用され得る。

【0444】

本発明は、ポリマーインプラントとして製剤化される抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）も提供する。ポリマーインプラントは、固形薬物製剤（例えば、抗体）が疎水性ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ）内で均等に分布されている剛性物体である。ポリマーインプラントは典型的には、ミリメートルにサイズ決めされる（例えば、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．３ｍｍ、１．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１．６ｍｍ、１．７ｍｍ、１．８ｍｍ、１．９ｍｍ、２ｍｍ、２．１ｍｍ、２．２ｍｍ、２．３ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍ、１１ｍｍ、１２ｍｍ、１３ｍｍ、１４ｍｍ、１５ｍｍ、１６ｍｍ、１７ｍｍ、１８ｍｍ、１９ｍｍ、２０ｍｍ以上）。ポリマーインプラントは、例えば、外科手技（例えば、顕微鏡手術）によるか、または好適なデバイスを使用する注入（例えば、硝子体内注入による）により目に投与され得る。ポリマー系インプラントは、目の中の任意の好適な部位、例えば、硝子体、目の前部もしくは後部チャンバ、または目の網膜内、網膜下、脈絡膜内、脈絡膜上、強膜上、結膜下、角膜内、もしくは角膜外部位への投与のために製剤化され得る。特定の事例において、ポリマー系インプラントは、硝子体への投与のために製剤化される。

【0445】

抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）を含むポリマーインプラントは、加熱性溶融押出成形（ＨＭＥ）プロセスを使用して調製され得る。熱が適用されて、ポリマーを融解（流動化）し、次いで、機械的せん断が加えられ、流体ポリマー相内で固形薬物製剤をブレンド及びマイクロ調合し得る。次いで、薬物−ポリマー混合物は、ミリメートルにサイズ決めされたダイ（例えば、円状ダイ）を通して押出成形され得る。押出成形物が冷却可能であるとき（例えば、室温に）、それは、任意の所望の長さに切断され得るロッド（例えば、円筒形ロッド）を形成する。いくつかの事例において、ポリマーインプラントは、抗ＶＥＧＦ抗体と、ＰＬＧＡとを含むＰＬＧＡロッドであり得る。本発明の文脈において使用され得るポリマーインプラントは、例えば、Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０２（８）：２６５５−２６６６，２０１３及び国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０９３７５８号に記載されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0446】

一実施例において、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、本明細書に記載される任意の抗ＶＥＧＦ抗体）は、高温で安定させるためのトレハロース及びヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液を含み得る噴霧乾燥製剤として調製され得、これは、次いで、ＰＬＧＡなどの疎水性ポリマーに添加され得、ＨＭＥを経てポリマー系インプラントを形成し得る（例えば、Ｒａｊａｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。例えば、噴霧乾燥製剤は、任意の好適な濃度（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ）の抗体、任意の好適な濃度（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、３．３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのトレハロース、及び／または緩衝液（例えば、１０ｍＭのヒスチジンＨＣｌ）を含み得る。噴霧乾燥製剤は、任意の好適なｐＨ、例えば、約５〜約８（例えば、約５、約６、約７、または約８）のｐＨを有し得る。いくつかの事例において、噴霧乾燥製剤は、約６または約６．２のｐＨを有し得る。特定の事例において、噴霧乾燥製剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、３．３ｍｇ／ｍＬのトレハロース、及び１０ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．２を含む。ポリマー系インプラントは、ＰＬＧＡなどの疎水性ポリマーを有する噴霧乾燥製剤のＨＭＥにより調製され得る。例えば、固形ＰＬＧＡペレット及び噴霧乾燥製剤は、室温で予備混合され得、円錐形の逆回転二軸押出機中に供給され得る。この組み合わせは、マイクロ調合され得、続いて、１００℃で０．５ｍｍの円状ダイを通して押出成形される。いくつかの事例において、噴霧乾燥製剤は、３０分未満の間１００℃に曝露される。

【0447】

ポリマーインプラントは、例えば、約１％〜約９０重量％の抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０重量％）を含有し得る。いくつかの事例において、ポリマーインプラントは、約１０重量％の抗ＶＥＧＦ抗体を含む。ポリマー系インプラントは、任意の好適な寸法を有し得、例えば、いくつかの事例において、インプラントは、約０．１〜約１ｍｍ（例えば、約０．５ｍｍ）の直径及び約１〜約３０ｍｍ（例えば、約１４ｍｍ）の長さを有する。ＰＬＧＡインプラント（例えば、ＰＬＧＡロッド）に関して、ＰＬＧＡコポリマー中のポリ乳酸のパーセンテージは、０〜１００％、例えば、約１５〜８５％、約３５〜６５％、または５０％であり得る。いくつかの事例において、ＰＬＧＡインプラント（例えば、ＰＬＧＡロッド）は、１つ以上の追加のポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）をさらに含み得る。

【0448】

前述の高分子製剤（例えば、ポリマー溶媒デポ、ポリマーミセル、及びポリマーインプラント）のうちのいずれにおいても、本抗体は、ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントであり得る。いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ−Ｃ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）_２フラグメントからなる群から選択される。例えば、いくつかの事例において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦａｂ−Ｃである。

【0449】

前述の高分子製剤（例えば、ポリマー溶媒デポ、ポリマーミセル、及びポリマーインプラント）のうちのいずれも、高分子製剤として製剤化されない参照抗体に対して増加された眼半減期を有し得る。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、参照抗体に対して少なくとも約４倍増加される。いくつかの事例において、眼半減期は、硝子体半減期である。いくつかの事例において、参照抗体は、高分子製剤の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、高分子製剤の抗体と同一ではない。

【0450】

前述の高分子製剤（例えば、ポリマー溶媒デポ、ポリマーミセル、及びポリマーインプラント）のうちのいずれも、高分子製剤として製剤化されない参照抗体に対して減少された眼クリアランスを有し得る。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して、少なくとも約２倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍以上）減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、参照抗体に対して少なくとも約４倍減少される。いくつかの事例において、クリアランスは、硝子体からのクリアランスである。いくつかの事例において、参照抗体は、高分子製剤の抗体と同一である。他の場合において、参照抗体は、高分子製剤の抗体と同一ではない。

【0451】

いくつかの事例において、前述の高分子製剤のうちのいずれか２つの眼内投与間の期間（例えば、硝子体内注入による）は、少なくとも１ヶ月、例えば、少なくとも１ヶ月、少なくとも５週、少なくとも６週、少なくとも７週、少なくとも８週、少なくとも９週、少なくとも１０週、少なくとも１１週、少なくとも１２週、少なくとも１３週、少なくとも１４週、少なくとも１５週、少なくとも１６週、少なくとも２０週、少なくとも２４週、少なくとも２８週、少なくとも３２週、少なくとも３６週、少なくとも４０週、少なくとも４４週、少なくとも４８週、少なくとも５２週以上である。次いで、いくつかの場合において、２つの眼内投与間の最大期間は、４年以下、例えば、３年以下、２年以下、または１年以下である。高分子製剤は、例えば、２〜１２ヶ月毎、例えば、４〜１０ヶ月毎に投与され得る。いくつかの事例において、高分子製剤は、６ヶ月毎に投与される。

【0452】

本発明は、上述される高分子製剤（例えば、ポリマー溶媒デポ、ポリマーミセル、及びポリマーインプラント）のうちのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。ある特定の実施形態において、本組成物は、１つ以上の追加の化合物を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０ＡなどのＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0453】

本発明は、上述される高分子製剤（例えば、ポリマー溶媒デポ、ポリマーミセル、及びポリマーインプラント）のうちのいずれかと、追加のＶＥＧＦアンタゴニストとを含む組成物（例えば、薬学的組成物）も提供する。

【0454】

４．デバイス
本明細書に記載される組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）のうちのいずれも、ポート送達デバイスを使用して目に投与され得る。ポート送達デバイスは、何ヶ月もの期間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月以上）にわたって療法剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体）を放出し得るインプラント可能な詰め替え可能デバイスである。使用され得る例示的なポート送達デバイスには、ＦｏｒＳｉｇｈｔ Ｌａｂｓ，ＬＬＣ及び／またはＦｏｒＳｉｇｈｔ ＶＩＳＩＯＮ４からのもの、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０８８５４８号、同第ＷＯ２０１５／０８５２３４号、同第ＷＯ２０１３／１１６０６１号、同第ＷＯ２０１２／０１９１７６号、同第ＷＯ２０１３／０４０２４７号、同第ＷＯ２０１２／０１９０４７号に記載されているようなものが含まれ、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0455】

例えば、本発明は、本明細書に記載される組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）のうちのいずれかを収容する貯留槽を含むポート送達デバイスを提供する。ポート送達デバイスは、近接領域と、貯留槽と流体連通している近位領域にカップリングされた筒体と、貯留槽と流体連通しており、かつ組成物を目の中に放出するように構成されている１つ以上の出口とをさらに含み得る。筒体は、約０．５ｍｍ以下の目の中の切り口または開口部を通って挿入されるように構成されている外径を有し得る。デバイスは、約１ｍｍ〜約１５ｍｍの長さ（例えば、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約９ｍｍ、約１１ｍｍ、約１３ｍｍ、または約１５ｍｍの長さ）であり得る。貯留槽は、任意の好適な容積を有し得る。いくつかの事例において、貯留槽は、約１μｌ〜約１００μｌ（例えば、約１μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約７５μｌ、または約１００μｌ）の容積を有する。デバイスまたはその構成部は、任意の好適な材料、例えば、ポリイミドでできている場合がある。

【0456】

いくつかの事例において、ポート送達デバイスは、本明細書に記載される組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）のうちのいずれか及び１つ以上の追加の化合物を収容する貯留槽を含む。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、ＩＬ−１β；ＩＬ−６；ＩＬ−６Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；アンジオポエチン２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体Ｄ因子；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ−２受容体；さらに補体経路構成成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；ＩＬ−８；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ；ＣＯＬ１０Ａ１；ならびにＴＮＦＲＳＦ１０ＡなどのＡＭＤリスクと遺伝的に関係付けられるタンパク質からなる群から選択される第２の生体分子に結合する。ある特定の実施形態において、追加の化合物は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、いくつかの事例において、追加の化合物は、二重特異性抗体（例えば、ＲＧ−７７１６などの抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはＷＯ２０１０／０６９５３２もしくはＷＯ２０１６／０７３１５７に開示されている任意の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗Ａｎｇ２二重特異性抗体、またはそれらの変異体である。いくつかの事例の別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＥＢＩ−０３１（Ｅｌｅｖｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、例えば、ＷＯ２０１６／０７３８９０を参照されたい）、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、オロキズマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、エルシリモマブ、ジェリリムズマブ、ＯＰＲ−００３、ＭＥＤＩ−５１１７、ＰＦ−０４２３６９２１、またはそれらの変異体である。いくつかの事例のさらに別の例において、追加の化合物は、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））（例えば、ＷＯ１９９２／０１９５７９を参照されたい）、サリルマブ、ボバリリズマブ（ＡＬＸ−００６１）、ＳＡ−２３７、またはそれらの変異体である。

【0457】

いくつかの事例において、ポート送達デバイスは、本明細書に記載される組成物（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、抗体複合体、融合タンパク質、及び高分子製剤）のうちのいずれか及び追加のＶＥＧＦアンタゴニストを含む。

【0458】

ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上記で提供される概要を得ると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。

【0459】

実施例１：Ｇ６．３１のディープスキャニング突然変異生成法は、安定型集合体Ｆａｂの集合にとって重要な位置を特定する。
Ｇ６．３１は、高い親和性の抗ＶＥＧＦ抗体である（Ｆｕｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６６２５−６６３１（２００６）、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２）：９５１−９６１（２００６）。重鎖及び軽鎖可変ドメインがそれぞれ、頻繁に使用されるヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ３−２３及びＩＧＫＶ１−３９起源であるため、Ｇ６．３１は、ヒト抗体の代表と見なされる。

【0460】

Ｇ６．３１のＶＨ及びＶＬドメイン内の単一の突然変異の効果を体系的に査定するために、各可変ドメイン（Ｋａｂａｔ番号付けスキームによるＶＬ位置２−１０７及びＶＨ位置２−１１３）の飽和単一部位突然変異生成ライブラリーを生成した。これらのライブラリーはそれぞれ、ＶＨ及びＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーと称される。ディープ突然変異スキャニング実験でこれらのライブラリーを使用することにより、選択中の２つのライブラリー内の各突然変異の濃縮比（ＥＲ）の計算が可能になり、分子の適合に対する突然変異の影響の査定の機能を果たす。特定の突然変異のＥＲは、機能発現に対する突然変異の影響、折り畳みの安定性に対する突然変異の影響、及び選択タンパク質（例えば、抗ｇＤ（軽鎖のＣ末端に融合されるペプチドタグ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、またはＶＥＧＦ）への結合に対する突然変異の影響を含む多様な作用を集める。

【0461】

Ｆａｂの機能発現及び折り畳み安定性に対する各突然変異の影響を査定するために、ＶＨ及びＶＬライブラリーを、抗ｇＤ、タンパク質Ａ、またはタンパク質Ｌに対して別々にパニングした。これらのパニング戦略は、Ｆａｂ分子がファージ上にディスプレイされているかどうか、かつある程度、それが適切に折り畳まれ、集合しているかどうかを検出する。重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリーの所与の位置における、２３３１及び２２２６アミノ酸置換（停止を含む）、ならびにそれぞれの野生型アミノ酸のＥＲをそれぞれ、３つのパニングの各々に関して決定した（図１Ａ〜１Ｆ）。３つの重鎖パニング戦略または３つの軽鎖パニング戦略の比較は、非常に類似の結果が得られたことを示す（図２Ａ〜２Ｂ）。例えば、ＥＲは、抗ｇＤパニングとタンパク質Ｌパニングとの間の良好な線状関係（ｒ^２＝０．９８）を示す（図２Ａ）。タンパク質Ａパニングデータセットとタンパク質Ｌパニングデータセットとの間の比較は、より低い線状相関性（ｒ^２＝０．６１１）を示し、これは、タンパク質Ａ結合、したがって、２つの選択肢における示差的濃縮に対する直接的な影響を有する突然変異のサブセットを起因とし得る。軽鎖に関して類似のパターンが観察された（図２Ｂ）。

【0462】

Ｆａｂの機能発現及び安定性に影響を及ぼす位置を特定するための一手法において、保存され、選択中に突然変異に耐容性を示さない位置を決定した。代表的なスキャンとして抗ｇＤパニングから得られたデータセットを使用して、所与の位置における全ての突然変異の平均濃縮比（ＥＲ_ｐｏｓ）を、保存の指標として各位置に関して計算した（図３Ａ〜３Ｂ）。ＶＨ及びＶＬドメインの両方において、βストランドＢとＦとの間のシステイン対（ＨＣ−Ｃ２２、ＨＣ−Ｃ９３；ＬＣ−Ｃ２３、ＬＣ−８８）、ならびに隣接したトリプトファン残基（ＨＣ−Ｗ３６、ＬＣ−Ｗ３５）からなる中心コア残基を高度に保存した（図３Ａ〜３Ｄ）。免疫グロブリン折り畳みの疎水性コアは、例えば、Ｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１２（７）：５６３−５７１，１９９９に記載されている。延長疎水性コアの部分である、分子の下半分内に配置される数個の疎水性残基が中心コアに隣接している（ＨＶＲが上向くようにＦａｂが配向されているとき）。それらは保存されたが、中心コア残基より小さなＥＲ_ｐｏｓ値を示した。これらの残基のなかでもとりわけ、Ｉｇ折り畳みの安定性にとって重要であると以前から示されているのがチロシン（ＨＣ−Ｙ９０、ＨＣ−８６）である（例えば、Ｈａｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５（３）：６４１−６４９（２０００）を参照されたい。保存残基の第３の基をＶＨ／ＶＬ界面内に配置した（ＨＣ−Ｌ４５、ＨＣ−Ｙ９１、ＨＣ−Ｗ１０３、ＬＣ−Ｐ４４、ＬＣ−Ｙ３６、ＬＣ−Ｙ９６）。ＶＨ／ＶＬ界面残基は、間接的な選択（例えば、タンパク質ＬパニングからのＶＨデータ）だけでなく、直接的な選択（例えば、タンパク質ＡパニングからのＶＨデータ）によってもパニング内に保存され、記載された界面位置での突然変異が、低減した安定性を有する集合体Ｆａｂをもたらしたことを示す。保存残基の第４の基（ＨＣ−Ｅ４６、ＨＣ−Ｒ３８、ＨＣ−Ｄ８６、ＬＣ−Ｒ６１、ＬＣ−Ｄ８２）は、安定性にとって重要であるＦａｂの下半分の水素結合ネットワーク内に残基を含む。特に、α１−ヘリックス内のアスパラギン酸塩残基は、データセット内の最も高い保存のうちの１つを示した位置に属する。位置ＬＣ−Ｒ６１及びＬＣ−Ｄ８２での突然変異が、軽鎖内の原線維形成を誘導し、凝集を誘導すると以前から示されている（Ｈｅｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５７（１）：７７−８６（１９９６）を参照されたい）。最後に、高度に保存されているＨＶＲ−Ｈ３内の４つの位置、ＨＣ−Ａ９３、ＨＣ−Ｒ９４、ＨＣ−Ｐ１００、ＨＣ−Ｄ１０１を特定した。これらのパニング戦略は抗原結合のために選択されていないため、これらの結果は、ＨＶＲ３ループ立体配座がＦａｂの安定性に関与することを示した。

【0463】

要約すると、高度に保存されている可変ドメインの数個の位置を除いて、多くの位置は、これらの選択においてＦａｂ分子の全体的な安定性及び発現に影響を及ぼすことなく突然変異に耐容性を示し得る。さらに、小さなＥＲ_ｐｏｓを有するいくつかの位置さえも、保存アミノ酸置換に耐容性を示し得る。例えば、突然変異生成データは、より低いコアの疎水性残基が、Ｆａｂの安定性に影響を及ぼすことなく類似の疎水性残基で置換され得ることを呈示した（図１Ａ〜１Ｆ）。単一置換に対するＶＨ／ＶＬ安定性の耐性は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのディープ突然変異生成スキャンから得られた結果に対照的であり、ここで、過半数の残基は、いずれの突然変異にも耐容性を示さなかった（Ｔｒａｘｙｌｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２３（３）：３９７−４１２（２０１２）を参照されたい）。

【0464】

材料及び方法
Ａ．完全可変ドメインＮＮＫウォークライブラリーの設計及び生成。
Ｇ６．３１の完全ＶＨ（残基２〜１１３）及びＶＬ（残基２〜１０７）を、ランダム化にかけた。サブライブラリーにつき１０〜１２個の後の残基をランダム化した。サブライブラリー内で、ＴＡＡコドンをクンケル突然変異生成により各ランダム化した位置で導入した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（２）：４８８−４９２（１９８５））。１０個のＶＬサブライブラリー及び１２個のＶＨサブライブラリー停止テンプレートを生成した。ライブラリー設計に関して、各位置をＮＮＫコドンを有するオリゴヌクレオチド指向突然変異生成によりランダム化し、ここで、Ｎは、４つの天然ヌクレオチドのうちのいずれかであり、Ｋは、５０％のＴ（チミン）及び５０％のＧ（グアニン）である。ＮＮＫコドンは、２０個の天然アミノ酸のうちのいずれかをコードし得る。軽鎖及び重鎖のサブライブラリーを別々に作製し、次いで、各鎖のそれぞれのライブラリーを組み合わせて、ＶＬライブラリー及びＶＨライブラリーを形成した。組み合わされたライブラリーは、ＶＨまたはＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーとも称される。ライブラリーをファージＦａｂフラグメントディスプレイベクター中に作製した。ＶＨ ＮＮＫウォークライブラリーは、３×１０^９個のメンバーのサイズを有したが、ＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーは、８×１０^８個のメンバーのサイズを有した。

【0465】

Ｂ．抗ｇＤ、タンパク質Ｌ、またはタンパク質Ａのファージパニング選択
結合クローンを、継続的な選択ラウンドにおいて５、０．５、０．１ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦでＶＨまたはＶＬ ＮＮＫウォークファージディスプレイライブラリーをインキュベートすることにより選択し、次いで、室温または３７℃で１００ｎＭの非ビオチン化ＶＥＧＦと競合させて、より低い親和性クローンがＶＥＧＦに結合することを低減した。結合したクローンをニュートラアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで捕捉し、洗浄し、室温で２０分間、１００ｍＭのＨＣｌ中に溶出した。溶出したファージをｐＨ８．０の１Ｍの１／１０体積のトリスで中和し、次の選択ラウンドの増幅を目的としてＥ．Ｃｏｌｉに感染させるために使用した。

【0466】

抗ｇＤ、タンパク質Ｌ、またはタンパク質Ａによる選択に関して、結合クローンを、抗ｇＤ、タンパク質Ｌ、またはタンパク質ＡでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上でＶＨまたはＶＬ ＮＮＫウォークファージディスプレイライブラリーをインキュベートすることにより選択し、洗浄し、室温で２０分間、１００ｍＭのＨＣｌ中に溶出した。溶出したファージをｐＨ８．０の１Ｍの１／１０体積のトリスで中和し、次の選択ラウンドの増幅を目的としてＥ．Ｃｏｌｉに感染させるために使用した。

【0467】

Ｃ．Ｇ６．３１ディープ突然変異スキャニングライブラリーのイルミナ配列決定法
ディープ配列決定法に関して、ファージミドＤＮＡを、非選択または選択されたＶＨまたはＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーのいずれかからのファージミドベクターを担うＥ．ＣｏｌｉＸＬ１細胞から単離した。精製したＤＮＡを、ＶＬ及びＶＨ領域の限定サイクルＰＣＲに基づく増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル抽出及び清浄（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製した。溶出した増幅産物ＤＮＡを、ＴＲＵＳＥＱ（商標）ＤＮＡ試料調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用する標準的なイルミナライブラリー調製方法を用いたディープ配列決定法ライブラリー調製のための基準として使用した。アダプター連鎖ライブラリーを、ＰＣＲの単一サイクルにかけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱ（登録商標）、ペアードエンド３００ｂｐで配列決定して、増幅産物の全体の長さを網羅した。

【0468】

Ｄ．ディープスキャニング突然変異生成データ分析
ＦＬＡＳｈを使用して、配列決定したペアードエンドリードを合わせた（Ｍａｇｏｃ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７（２１）：２９５７−２９６３（２０１１））。統計的プログラミングラングエッジＲ（Ｔｅａｍ ＲＣ“Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ”Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（２０１４））及びＳｈｏｒｔＲｅａｄ（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１９）：２６０７−２６０８（２００９））パッケージを使用して、さらなる配列決定法データ分析を実施した。品質管理の第１のステップは、それぞれのＨＣ及びＬＣバーコードを担った配列に関して濾過することであった。第２のステップにおいて、隣接領域のＶＨ及びＶＬドメインを、合わせたリードの各々に関して特定し、正確な長さを確認して、挿入または欠失突然変異（挿入欠失）を有する大多数のリードを除去した。配列決定法の誤差をさらに訂正するために、非ＮＮＫ突然変異を野生型塩基に変換して、２つ超のＮＮＫ突然変異を含有したリードを濾過した。位置重量マトリックスを、全てのランダム化した位置の全ての突然変異の頻度を計算することにより生成した。先述されるように、分類された試料中の所与の位置における所与の突然変異の頻度を、未分類の試料中の全く同じ突然変異の頻度で除算することにより、全ての突然変異の濃縮比を計算した（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ７（９）：７４１２−７４６（２０１０））。

【0469】

実施例２：Ｇ６．３１のディープスキャニング突然変異生成法スクリーンは、増強された安定性及び／またはＶＥＧＦへの改善された結合親和性を有するアミノ酸残基変異体を特定する。
抗原結合に対するＧ６．３１の単一置換の影響の総合的概論を得るために、実施例１に記載されるＶＨ及びＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーをＶＥＧＦに対してパニングした（図４Ａ〜４Ｂ）。得られた濃縮比（ＥＲ）値は、二峰性分布を示した（図５Ａ〜５Ｂ）。突然変異のサブセットは、結合機能に対して強いマイナスの効果を有したが、過半数の突然変異は中立的であり、数個の突然変異は、適合に対して強いプラスの効果を有した。結合に対してマイナスの影響を有した突然変異は、ループがＧ６．３１の結合機能のほとんどを提供すると見なされるＨＣ−ＨＶＲか、または抗ｇＤパニングで特定されるようなフレームワークの保存残基内に配置されるほとんどの部分に関する（実施例１を参照されたい）。強力に濃縮された突然変異を、フレームワーク領域及びＨＣ−ＨＶＲの低度に保存された区域に主に配置した。これらの結果は、可変ドメインが強く、Ｆａｂの抗原結合機能に実質的に影響を及ぼすことなく多くの単一の突然変異に耐容性を示し得る、上述されるｇＤパニングによる観察（実施例１を参照されたい）を確認する。

【0470】

ディープ突然変異生成スキャニングから得られた結果を確認するために、選択された突然変異を発現させ、精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してそれらのＶＥＧＦへの親和性を測定し、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用してそれらの熱安定性（融解温度、Ｔ_ｍにより査定される）を測定した。抗原結合及び折り畳みに対する選択された強力に濃縮された突然変異の効果を評価した。さらに、高く濃縮された突然変異を、Ａｂｙｓｉｓデータベースに従って、ヒト抗体中の所与の位置におけるそれらの存在に基づいて選択した。加えて、強く減損したいくつかの突然変異もマイナスの対象として試験した。示されるＧ６．３１変異体のＫｄ及びＴ_ｍは、表２に示される。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００デバイスを使用する単一サイクル反応速度分析を使用して、表２に列挙されるＫｄ値を測定した。
表２：ディープスキャニング突然変異生成により特定されたＧ６．３１変異体の特徴付け

【0471】

３４個の突然変異（ＶＨにおいて１６個及びＶＬにおいて１８個）からのデータを使用すると、濃縮比と、親和性または安定性において得られた増加との間に非線状な関係が観察された（図５Ｃ〜５Ｄ）。理論に束縛されるものではないが、これは、ＥＲが、Ｅ．Ｃｏｌｉ内の機能発現、ファージ粒子上でのＦａｂの安定性、ならびに選択タンパク質への結合を含む、多様な要因により影響を受けるという事実を反映する場合があり得る。これが、軽鎖の疎水性コアの部分である突然変異ＬＣ−Ｌ７３Ｇであることを例証する一例。この位置で疎水性ロイシンを、グリシンと置き換えることにより、コア内の充填が減少し、安定性に欠ける軽鎖がもたらされる可能性が高い。ＬＣ−Ｌ７３Ｇ突然変異体のＴ_ｍは、その野生型Ｇ６．３１ＦａｂのＴ_ｍより１４．４℃低い。ＬＣ−Ｌ７３Ｇ突然変異は、ＶＥＧＦパニング実験で減損したが、それは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲにより測定すると、抗原結合親和性に対する明らかな影響を有しなかった（親和性が野生型Ｇ６．３１と比較しておよそ１．６倍増加する（すなわち、より低いＫ_ｄ））。Ｇ６．３１ＬＣ_Ｌ７３Ｇの減損が、ファージ上の突然変異の低減したディスプレイの効果である可能性が高く、この効果が、実際の抗原選択よりもこの突然変異体の選択を支配した。さらに、その反対も正である：ディスプレイを増加する突然変異（例えば、発現及び／または安定性を増強することにより）は、濃縮され得る可能性があるが、実際の抗原結合機能は、（偽陽性を生成する）野生型と比較して減退または変化しない。したがって、濃縮により特定された変異体は、結合親和性、安定性、発現、及び／または他の特性のいずれかに関して改善され得る。

【0472】

ディープスキャニング突然変異生成手法により特定されたＨＶＲ−Ｈ２における２つの突然変異、ＨＣ−Ｔ５７Ｅ及びＨＣ−Ｙ５８Ｒは、野生型Ｇ６．３１と比較して最も高く増加した親和性（８〜９倍）を有した（図５Ｅ）。フレームワーク領域の突然変異、ＨＣ−Ｎ８２ａＲは、野生型Ｇ６．３１と比較して、およそ６．６倍の親和性の増加をもたらした（図５Ｅ）。いくつかの他のフレームワーク領域の突然変異は、野生型Ｇ６．３１と比較して２〜４倍増加した親和性を示した（図５Ｅ〜５Ｆ）。熱安定性の最も高い増加は、軽鎖の突然変異ＬＣ−Ｆ８３Ａで得られた（＋５．４℃）（図５Ｆ）。融解温度の増加に加えて、ＬＣ−Ｆ８３Ａは、Ｇ６．３１のＶＥＧＦへの親和性を３倍増加した。驚くべきことに、親和性の増加をもたらした多くの突然変異は、抗原結合部位に対して遠位に配置されていた（図５Ｅ〜５Ｆ）。これらの中でもとりわけ、ＨＣ−Ｎ８２ａＲは、ヘリックスα１とストランドβ Ｅとの間のループ内に抗原結合部位から２２Åを超えて離れて配置され、ＬＣ−Ｆ８３Ａは、ＶＬと軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）との間の界面にＨＶＲから２５Åを超えて離れて配置される。

【0473】

要約すると、ＶＨ及びＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーを使用するＧ６．３１のディープスキャニング突然変異生成法ならびに次世代配列決定法は、ＦａｂのＶＥＧＦへの結合親和性及び／または安定性を増加させたアミノ酸残基改変を特定した。

【0474】

材料及び方法
Ａ．ＶＥＧＦのファージパニング選択
結合クローンを、継続的な選択ラウンドにおいて５、０．５、０．１ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦでＶＨまたはＶＬ ＮＮＫウォークファージディスプレイライブラリー（実施例１に記載される）をインキュベートすることにより選択し、次いで、室温または３７℃で１００ｎＭの非ビオチン化ＶＥＧＦと競合させて、より低い親和性クローンがＶＥＧＦに結合することを低減した。結合したクローンをニュートラアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで捕捉し、洗浄し、室温で２０分間、１００ｍＭのＨＣｌ中に溶出した。溶出したファージをｐＨ８．０の１Ｍの１／１０体積のトリスで中和し、次の選択ラウンドの増幅を目的としてＥ．Ｃｏｌｉに感染させるために使用した。

【0475】

Ｂ．Ｇ６．３１ディープ突然変異スキャニングライブラリーのイルミナ配列決定法及びデータ分析
ディープ配列決定法に関して、ファージミドＤＮＡを、非選択または選択された、ＶＥＧＦに対してパニングしたＶＨ及びＶＬ ＮＮＫウォークライブラリーのいずれかからのファージミドベクターを担うＥ．ＣｏｌｉＸＬ１細胞から単離した。精製したＤＮＡを、ＶＬ及びＶＨ領域の限定サイクルＰＣＲに基づく増幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル抽出及び清浄（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）により精製した。溶出した増幅産物ＤＮＡを、ＴＲＵＳＥＱ（商標）ＤＮＡ試料調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用する標準イルミナライブラリー調製方法を用いたディープ配列決定法ライブラリー調製のための基準として使用した。アダプター連鎖ライブラリーを、ＰＣＲの単一サイクルにかけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭＩＳＥＱ（登録商標）、ペアードエンド３００ｂｐで配列決定して、増幅産物の全体の長さを網羅した。データ分析を実施例１のように実施して、位置重量マトリックス及び濃縮比を計算した。

【0476】

Ｃ．抗体発現
選択された変異体のＶＨ及びＶＬ配列を、発現のために哺乳動物Ｆａｂベクターにクローンニングした。重鎖及び軽鎖の両方のプラスミドを、３０ｍｌの２９３Ｔ細胞に、７日間トランスフェクトした（１５μｇ）。上清を収穫して、タンパク質Ｇカラムにより精製した。

【0477】

Ｄ．ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲによる抗体親和性決定
選択されたＦａｂ変異体の結合親和性を決定するために、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器を用いたＳＰＲ測定を使用した。簡潔には、シリーズＳセンサチップＣＭ５を、供給者の指示書に従って、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）試薬を用いて活性化し、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）をカップリングして、５０〜８０の応答単位（ＲＵ）を達成し、次いで、１Ｍのエタノールアミンで未反応基を遮断した。

【0478】

ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）中のＦａｂの低（０．０２ｎＭ）から高（５０ｎＭ）の３倍段階希釈液を注入した（流量：３０μｌ／分）。ｈＶＥＧＦにおける結合応答を、空のフローセルからＲＵを控除することにより訂正した。センサグラムを記録し、参照及び緩衝液控除にかけて、その後、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２．０）により評価した。単純な１対１ラングミュア結合モデルを使用して、会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算した。

【0479】

Ｅ．示差走査型蛍光定量法による融解温度（Ｔ_ｍ）の決定
示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）は、蛍光色素の存在下でのタンパク質の熱変性を監視し、典型的には、リアルタイムＰＣＲ機器（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ）を使用することにより実施される。ＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．番号 Ｓ６６５０）をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：２０に希釈した。１μｌの希釈色素を、１ウェルにつき２４μｌのＦａｂタンパク質（およそ１００μｇ／ｍｌ）中に添加した。リアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ）を使用して温度を２０℃から１００℃に増加し、蛍光強度をプロットし、ボルツマン方程式などの方程式を使用して遷移曲線（Ｔ_ｍ）の変曲点を計算した（例えば、Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２（９）：２２１２−２２２１（２００７）を参照されたい）。

【0480】

実施例３：ＬＣ−Ｆ８３の立体配座変化は、Ｇ６構造におけるＦａｂのＬ字型立体配座と相互関連する。
抗原結合部位から空間遠隔にある突然変異がどのようにして抗原結合及び安定性に対してかかる強力な影響を有し得る可能性があるのかを理解するために、ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異の構造効果をより詳細に調べた。Ｇ６．３１の親抗体であるＧ６は、ＶＥＧＦ結合及びＶＥＧＦ遊離形態で先に結晶化されている（Ｆｕｈ ｅｔ ａｌ．（上記））。Ｇ６．３１は、Ｇ６と比較して、ＨＶＲ−Ｌ３においてわずか４つの置換を担う。したがって、Ｇ６の結晶構造をＧ６．３１のモデルとして使用した。Ｇ６のＶＥＧＦ遊離形態の結晶構造は、非対称な単位の中に１２個のＦａｂ分子を含有する。Ｆａｂ構造は、定常ドメインの可変ドメイン（Ｖ−Ｃ界面）への配向に基づいて２つの異なる基にクラスター形成され得（図６Ａ）、これは、ＦａｂのＬ字型領域内の異なる立体配座の結果であり、ＦａｂのＬ字型角度を測定することにより定量化され得る（例えば、Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５７（５）：１５６６−１５７４（２００６）を参照されたい）。

【0481】

ＦａｂのＬ字型角度の柔軟性は、重鎖内の球状ソケットジョイントにより影響を受け（例えば、Ｌｅｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５（６１８６）：１８８−１９０（１９８８）を参照されたい）るだけでなく、軽鎖クラスによっても支配され得、これが、恐らくより重要である。典型的には、カッパ軽鎖抗体はＬ字型角度に制限され、それらは、めったに１８０°を超えないおよそ１４０°及びおよそ１７５°の二峰性分布ピーキングに適合し、かつそれらを示し得るが、ラムダ軽鎖抗体は、幅広い範囲の角度を取り得る（例えば、Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。結晶構造内の６つのＧ６分子は、小さなＬ字型角度（１４３〜１５５°）及びＶＬのα１に対してＣＬドメインのＤＥ−ループの密充填を有するが、他の６つの分子は、緩く充填されたＶＬ−ＣＬ界面と共に大きなＬ字型角度（１７０〜１８７°）を有する（図６Ｂ〜６Ｃ）。緩く充填または密充填されたＶＬ−ＣＬ界面を有する異なるＦａｂ分子の界面域分布は、図７Ｃに示される。密充填された界面域は、平均で、およそ６００Åであるが、緩く充填された界面域は、およそ４５０Åである。さらに詳細なかつより詳細な分析は、６つのＧ６_遊離分子が、密充填されたＶＬ−ＣＬ界面（ＶＬのα１に対して充填されたＣＬドメインのＤＥ−ループを含む；３０４±４８Å^２）に関連付けられる小さなＬ字型角度（１４３〜１５５°）を有する一方で、他の６つの分子は、より低度に密充填されたＶＬ−ＣＬ界面（２３４±２９Å^２界面域）と共に大きなＬ字型角度（１７０〜１８７°）を有することを明らかにした。したがって、Ｇ６結晶構造は、Ｇ６が、１８０°未満のＬ字型角度を有する典型的なヒトカッパ軽鎖抗体のように挙動することを明らかにする（図６Ａ〜６Ｃ）。

【0482】

ＬＣ−Ｆ８３の側鎖立体配座は、ＦａｂのＬ字型角度の変化と相互関連した。大きなＬ字型角度構造において、ＬＣ−Ｆ８３は、ＶＬドメインの遠位キャッピング領域内で疎水性ポケットと密に結合する（「内」立体配座と称される）（図６Ｃ）。小さなＬ字型構造において、ＬＣ−Ｆ８３は、疎水性ポケットから弾き出され（「外」立体配座と称される）、部分的に溶媒に曝露される（図６Ｂ）。ＬＣ−Ｆ８３は、ＦａｂのＬ字型領域に空間近接して配置されるが、Ｌ字型の部分ではない。しかし、ＬＣ−Ｆ８３’の立体配座変化は、Ｌ字型残基ＬＣ−Ｉ１０６の側鎖位置の変化により反映される。ＬＣ−Ｆ８３が「外」立体配座である構造において、ＬＣ−Ｆ１０６Ｉの側鎖は、「上方」に移動し、疎水性ポケットを占める。対照的に、ＬＣ−Ｆ８３が「内」立体配座である構造において、ＬＣ−Ｉ１０６の側鎖は、「下方」に移動する（「上方」及び「下方」配向は、「上方」にあるＨＶＲ及び「下方」にある定常ドメインに関して記載されることに留意されたい）。ＬＣ−Ｆ８３と対照的に、ＬＣ−Ｉ１０６の移動は、側鎖に限定されず、タンパク質主鎖においても立体配座変化をもたらし（ＬＣ−１０５Φ角度、ＬＣ−１０６ψ角度）、結果として、異なるＬ字型角度が観察される可能性が高い。要約すると、Ｇ６の結晶構造は、Ｇ６におけるＬ字型角度の変化が、位置ＬＣ−Ｉ１０６及びＬＣ−Ｆ８３での立体配座変化を必要とすることを呈示した。

【0483】

実施例４：ＬＣ−８３Ｆの立体配座とＬＣ−１０６Ｉの立体配座とのカップリングは、ヒト抗体構造における一般的な特徴である。
Ｇ６／Ｇ６．３１は、ファージライブラリーから発生した、重鎖及び軽鎖の一般的なフレームワーク領域上に作成される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４））。軽鎖の最も近接した生殖細胞系遺伝子は、ＩＧＫＶ１−３９及びＩＧＫＪ１である。ＩＭＧＴデータベースによる、最も一般的に使用されるヒトＩＧＫＶ下位群（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（１）：４５−６０（２００５））である、ＩＧＫＶ１及びＩＧＫＶ３は、位置ＬＣ−８３でフェニルアラニンを担うが、その他の頻繁にはあまり使用されない生殖細胞系は典型的には、位置８３でバリン（ＩＧＫＶ２及びＩＧＫＶ４）またはアラニン（ＩＧＫＶ５及びＩＧＫＶ６）を担う。位置ＬＣ−１０６でのイソロイシンは、全ての５つのヒトＩＧＫＪ生殖細胞系遺伝子内に保存される。

【0484】

位置Ｆ８３の側鎖立体配座とＦａｂのＬ字型立体配座とのカップリングがヒト抗体における一般的な特徴であるかどうかを決定するために、ＬＣ−Ｆ８３の立体配座を、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの３１９個のヒトＦａｂ結晶構造において決定した。構造を、「内」立体配座（−５０°〜−１００°の二面角ｃｈｉ１）のＬＣ−Ｆ８３を有する構造及び「外」立体配座の構造（主に５０°〜１８０°のｃｈｉ１角度）として群分けした（図７Ａ）。ＬＣ−Ｆ８３立体配座は、大多数の構造において、位置ＬＣ−１０６でのＦａｂのＬ字型領域の変化と相互関連した（図７Ｂ）。さらに、２つの群は、Ｌ字型角度における著しい差異（図７Ｃ）、ならびにＶ−Ｃ界面域における著しい差異を示し、これは、大きなＬ字型角度を有する構造が、より小さく、かつより低度に充填されたＶ−Ｃ界面を有し、大きなＬ字型角度を有する構造が大きなＶ−Ｃ界面を有することを示した（図７Ｃ）。

【0485】

ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異がより高い熱安定性、及び抗原へのより高い親和性をもたらしたため、ＬＣ−８３Ａ及びＬＣ−１０６Ｉを担うＰＤＢにおいて入手可能な２０個のヒトＦａｂ構造のＬ字型角度を決定した。これらの構造は、ＬＣ−８３Ｆの「外」確認構造の特性を反映した：それらは、小さなＬ字型角度及び大きなＶ−Ｃ界面を示した（図７Ｃ）。

【0486】

要約すると、これらの結果は、以前に観察されたようなヒトカッパ軽鎖抗体のＦａｂのＬ字型角度における二峰性分布（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（上記））が主に、位置ＬＣ−８３でのフェニルアラニン側鎖の異なる立体配座の結果であることを示した。データは、位置ＬＣ−８３に存在するアミノ酸の種類が、ＦａｂのＬ字型角度に対して大きな影響を有することをさらに示した。

【0487】

材料及び方法
ヒト抗体構造を構造抗体データベースから得た（ＳＡｂＤａｂ，Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：Ｄ１１４０−１１４６（２０１４））。Ｂｉｏ３Ｄを使用して、追加の構造濾過及び構造ハンドリング（アミノ酸の再番号付け、二面角の決定、構造整列）を実施した（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２（２１）：２６９５−２６９６（２００６））。ＣＣＰ４−Ｐｉｓａの局所的事例を使用して、定常ドメインと可変ドメインとの間の界面域を計算した（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２（３）：７７４−７９７（２００７））。ＡＢａｎｇｌｅ（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６（１０）：６１１−６２０（２０１３））を、ＶＨ−ＶＬ相互作用を特徴付けるために使用した。Ｐｙｍｏｌ及び公的に入手可能なスクリプトを、Ｌ字型角度を計算するために使用した。

【0488】

実施例５：分子動力学シミュレーションは、位置ＬＣ−８３が大きなＦａｂのＬ字型立体配座と小さなＦａｂのＬ字型立体配座との間を遷移するスイッチのように作用することを確認する。
分子動力学を、実施例４に記載される構造メタ分析で特定されるＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異の作用のさらなる見識を得るために使用した。ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異の効果を２つの異なる構造的背景でシミュレーションした。大きなＬ字型角度を有するＧ６Ｆａｂの結晶構造（Ｇ６鎖ＶＵ、「ＶＵ．Ｆ８３」）及び小さなＬ字型角度を有する結晶構造（Ｇ６鎖ＢＡ、「ＢＡ．Ｆ８３」）を使用した。突然変異型構造（ＶＵ．Ｆ８３Ａ及びＢＡ．Ｆ８３Ａ）に加えて両方の構造を水中で１００ｎｓ間、シミュレーションした。シミュレーションの時間の間、Ｆ８３の立体配座における変化は観察されなかった：ＶＵ．Ｆ８３の場合、ＬＣ−Ｆ８３は「内」立体配座内に留まり、ＢＡ．Ｆ８３の場合、残基は「外」立体配座内に留まった（図８Ａ）。シミュレーションの間の時間の経過におけるＬ字型角度の変化の比較は、全ての４つの分子のＬ字型角度は、約２５ｎｓの最初の平衡化相の後、シミュレーションの間ほぼ安定したままであったことを明らかにした（図８Ｂ）。ＢＡ．Ｆ８３及びＢＡ．Ｆ８３ＡのＬ字型角度分布において統計的に著しい差異は観察されなかった。両方の分子に関して、Ｌ字型角度は、大体１３５°で変動した。しかし、シミュレーションの間、ＶＵ．Ｆ８３のＬ字型角度とＶＵ．Ｆ８３ＡのＬ字型角度との間に著しい差異が存在した。シミュレーションの最初の２５ｎｓの間、ＶＵ．Ｆ８３ＡのＬ字型角度が落ち込み、大体１４０°に変動したが、ＶＵ．Ｆ８３のＬ字型角度は、１６１°の大きな角度で安定したままであった（図９Ａ）。

【0489】

上記で表示された結果は、大きなＦａｂのＬ字型角度を安定させるためにＬＣ−Ｆ８３の「内」立体配座が重要であることを示す。ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異は、分子動力学シミュレーションにおいて、小さなＬ字型角度への迅速な遷移及びより大きなＶＬ−ＣＬ界面をもたらした。ＬＣ−Ｆ８３側鎖の「内」から「外」立体配座への遷移及びその逆の遷移が観察され得る可能性がないため、これらの結果は、ＬＣ−Ｆ８３が分子のＬ字型角度の変化において著しいエネルギーバリアを課すことを呈示する。

【0490】

これらを踏まえると、Ｇ６．３１と比較した場合のＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}の熱安定性の増加は、Ｖ−Ｃ界面の相互作用域が増加し、したがって、Ｆａｂの４つのドメインの折り畳みがさらに安定することにより説明することができる。さらに、Ｖ−Ｃ界面のより密な充填は、ＬＣ−Ｉ１０６のように疎水性残基の溶媒曝露を低減する。

【0491】

材料及び方法
ａｍｂｅｒ１２を使用して、分子動力学シミュレーションを実施した（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２６（１６）：１６６８−１６８８（２００５））。記載されていない場合、定常圧力及び３００Ｋで、１００ｎｓをシミュレーションした。シミュレーションの前に、ＰＤＢのエントリー４ｈｈ９を使用して、電子密度の欠如に起因して分解されなかったＧ６構造の定常ドメイン内の区域を補足した。ＶＭＤ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ １４（１）：３３−３８，２７−３８（１９９６））、Ｂｉｏ３ｄ、ＣＣＰ４−Ｐｉｓａ、Ｐｙｍｏｌ、及びＡＢａｎｇｌｅを使用して、得られたシミュレーション構造を分析した。

【0492】

実施例６：Ｇ６ＦａｂのＬ字型角度動態は、ＶＨ−ＶＬ回旋角度を調節することにより抗原結合界面に影響を与える。
ＦａｂのＬ字型角度の変化により、ＬＣ−Ｆ８３Ａ変異体における融解温度の増加の説明がついたが、ＦａｂのＬ字型動態の変化によっては、抗原結合に対するこの突然変異の効果の直接的な説明がつかなかった。理論に束縛されるものではないが、ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異は、ＬＣ−Ｆ８３ＡがＶＨ−ＶＬ界面に近接してあり、かつＶＨ及びＶＬドメインの互いに対する配向に影響を及ぼし得る可能性があるため、ＦａｂのＬ字型角度の変化を介して抗原結合に間接的に影響を与え得る可能性があるか、または抗原結合に直接的に影響を与え得る可能性がある。ＶＨ−ＶＬ界面は、抗原と直接接触していないが、抗原結合親和性に強力な影響を有し得る（例えば、Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊ．２７３（１０）：２１８４−２１９４（２００６）、Ｋｈａｌｉｆａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １３（３）：１２７−１３９（２０００）を参照されたい）。さらに、抗原遊離の状態において、ＦａｂのＶＨ−ＶＬ界面は典型的には柔軟性であるが、抗原結合は剛性の増加をもたらす（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６（１０）：６１１−６２０（２０１３））。加えて、ＶＨ−ＶＬ配向は、リガンド遊離と抗原結合形態との間で実質的に異なり得る（例えば、Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１（２）：８３−９３（１９９３）を参照されたい）。

【0493】

確かに、Ｇ６の結晶構造は、柔軟性、及び異なるＧ６抗原遊離構造（Ｇ６_非結合）と、ＶＥＧＦ結合構造（Ｇ６_結合）との間にあるＶＨ／ＶＬ回旋角度（ＨＬ回旋角度）において著しい差異を示した。大きなＬ字型角度を有する６つのＧ６_遊離分子の平均ＶＨ／ＶＬ回旋角度（ＨＬ回旋角度）は、およそ６０°であるが、小さなＬ字型を有する６つの分子に関して、それはおよそ５８°である。これは、したがって、−５５°であるＧ６_ＶＥＧＦの平均ＨＬ回旋角度に実質的により近接している（図９Ｂ）。

【0494】

回旋角度におけるこれらの変化が結晶化の人為的結果である可能性を除外するために、分子動力学シミュレーションを使用した。ＶＵ．Ｆ８３のＨＬ回旋角度の中央値は、およそ６２°であるが、それはＢＡ．Ｆ８３に関してはおよそ５９°であり、Ｇ６_非結合結晶構造で見られた結果と一致する。さらに、２つの突然変異体Ｆａｂ（ＢＡ．Ｆ８３Ａ及びＶＵ．Ｆ８３Ａ）は、さらにより小さな回旋角度（それぞれ、およそ５７°及びおよそ５７°）を示し、それは、Ｇ６_結合構造で観察された回旋角度にさらにより近接している（図９Ｃ）。さらに、ＬＣ−Ｆ８３Ａでの突然変異は、ＢＡ．Ｆ８３ＡのＨＬ角度がＢＡ．Ｆ８３のＨＬ角度より著しく小さい（ｐ＜０．０００１）場合、ＶＨ−ＶＬ界面に対する突然変異の追加の効果を呈示した。

【0495】

これらの結果は、ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異が、ＨＬ回旋角度、次いで、２つの異なる機序による抗原結合に影響を与えることを示した。第１に、ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異は、ＦａｂのＬ字型角度を変化させることによりこれを間接的に媒介する。構造データ及び分子動力学シミュレーションは、Ｌ字型角度とＨＬ角度との間に相関性があることを示した（図８Ａ〜８Ｃ及び９Ａ〜９Ｄ）。第２に、ＬＣ−８３は、ＶＨ−ＶＬ界面に直接的に影響を与える。ＬＣ−Ｆ８３Ａが導入されたときに、ＨＬ回旋角度の追加の著しい増加が存在した（図９Ａ〜９Ｄ、分子ＢＡ．Ｆ８３及びＢＡ．Ｆ８３Ａの比較）。結果は、Ｇ６_ＶＥＧＦの構造で観察されたものにより近接しているＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}の抗原遊離形態における抗原結合部位構成である。理論に束縛されるものではないが、Ｇ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}の再配列された抗原結合界面が、ＶＥＧＦ結合に対するより低いエネルギーコストをもたらし、したがって、観察されたＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}の親和性の増加（減少したＫｄ）をもたらし得る可能性がある。さらに、おそらくＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}におけるＶＨ−ＶＬ界面のより良好な充填により、代替的または追加の折り畳み安定化機序が提供され（例えば、Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４７（４）：７７３−７８９（２００５）を参照されたい）、観察されたＴ_ｍの増加の説明をつけることができる可能性がある。

【0496】

材料及び方法
構造分析及び分子動力学シミュレーションを実施例３〜５に記載されるように実施した。

【0497】

実施例７：水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）により、Ｇ６．３１と比較してＧ６．３１_Ｆ８３Ａにおける定常可変界面、ならびに抗原結合領域の立体配座変化を確認する。
実施例３〜６に記載されるＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異に起因するＦａｂ分子のドメイン間動態の変化が溶液中で観察され得ることを示すために、ＨＤＸ−ＭＳを使用した。ＨＤＸ−ＭＳは、主鎖アミド水素原子と重水素との交換速度を測定する。主鎖アミド水素原子は典型的には、それらが溶媒曝露され、かつ水素結合の形成を伴わない場合、それらが埋没され、かつ／または水素結合の形成を伴うときと比較してより速く交換する。いくつかの領域は、Ｇ６．３１の水素−重水素交換パターンがＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}と比較されるとき差異を示す（図９Ｄ）。ＶＬ−ＣＬ界面を形成し、ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異に近位するＣＬドメインのＤＥ−ループは、Ｇ６．３１と比較してＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}においてよりゆっくりと交換した。ＨＶＲループ及び隣接領域の交換速度の変化も観察された。ＨＶＲループＨ１及びＬ２は、Ｇ６．３１と比較してＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}においてよりゆっくりと交換したが、ＶＨ−ＶＬ界面にあるＨＶＲ−Ｈ３ループの隣接領域は、より速く交換した。ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｈ３ループは、ＶＨ−ＶＬ界面の部分である（例えば、Ｖａｒｇａｓ−Ｍａｄｒａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １６（３）：１１３−１２０（２００３）、Ａｂｕｒａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２（５）：７７５−７８２（２００２）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：１６９−２１７（１９９４）を参照されたい）。したがって、Ｇ６．３１とＧ６．３１_{ＬＣ−Ｆ８３Ａ}との間のＨＤＸ−ＭＳにおけるＨＶＲ及びＶＬ−ＣＬ界面で観察された交換パターンの変化は独立して、構造分析及び分子動力学シミュレーションから得られた結果を確認した。

【0498】

材料及び方法
Ｇ６．３１ＷＴ及びＦ８３Ａの突然変異体試料（４５μＭ）を１５倍に希釈して、ｐＤ７．０の２０ｍＭの酢酸ヒスチジン緩衝液及び＞９０％のＤ_２Ｏ含有量を有する５０ｍＭのＮａＣｌ中に入れて、２０℃で標識反応を開始した。３０秒〜１０００分の期間の６つの対数的に離間した間隔時間で、ｐＨ低減（ｐＨ２．５）、ならびに２Ｍの塩化グアニジウム（ＧｄｍＣｌ）及び０．２５Ｍのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の添加により標識反応を停止し、その後、冷却オンラインシステムに注入した（例えば、Ｍａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２２（１１）：１８９８−１９０５，２０１１を参照されたい）。

【0499】

簡潔には、停止した試料をまず、タンパク質分解のために固定化ペプシンカラム（２．１×３０ｍｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に０℃で通過させ、次いで、脱塩のためにトラップカラムに結合させ（ＡＣＱＵＩＴＹ ＶＡＮＧＵＡＲＤ（商標）Ｃ８）、その後、逆相クロマトグラフィーにより分離し（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍの粒子サイズ、１．０×５０ｍｍ）、重水素含有量の測定のために質量分光計に導入した（Ｔｈｅｒｍｏ ＯＲＢＩＴＲＡＰ ＥＬＩＴＥ（商標）、ｍ／ｚ４００での１２０ｋのＨｚ分解）。クロマトグラフ移動相を、先述されるように２．２５のｐＨで調製して（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２３（１２）：２１３２−２１３９，２０１２）、重水素回収を最大化したが、これは、完全に重水素化された対照物の測定により平均すると８２％であった。突然変異体及び野生型実験を組み合わせ、ランダム化した時点を三連で収集し、全体の工程をＬＥＡＰｖ１ロボット工学プラットホーム（Ｌｅａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｒｂｏｒｏ，ＮＣ）により自動化し、全ての試料ハンドリングステップを実施した。この工程は、大体９５％の配列網羅を提供する、野生型及び突然変異体試料の両方に関してＥｘＭＳプログラムにより一貫して特定された１５２個の固有のペプチドをもたらした（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２２（１１）：１９０６−１９１５，２０１１）。重水素含有量の分析は、先述されるカスタムパイソンスクリプトの使用を伴い（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．（上記）；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（４７）：１８８９８−１８９０３，２０１３、及びＨｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（１９）：７６８４−７６８９，２０１３）、野生型と突然変異体との間の重水素取り込みレベルにおける著しい差異を、ＨＤＸ−ＭＳ実験に関して先述される、ｐ−値＜０．０５を有するようなスチューデントのｔ−試験により特定した（Ｌｅｕｒｓ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８６（２３）：１１７３４−１１７４１，２０１４）。

【0500】

実施例８：ヒト抗体における体細胞超突然変異は、ＬＣ−８３及びＬＣ−１０６を標的とする。
位置ＬＣ−８３は、ＩＧＫＶ１−３９生殖細胞系軽鎖遺伝子内のＡＩＤホットスポットモチーフ（ＲＧＹＷ、式中、Ｒがプリンであり、Ｙがピリミジンであり、ＷがＡまたはＴである）に近接して配置される。ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異により引き起こされた熱安定性の増加は、Ｇ６．３１と同じ生殖細胞系から発生する他の抗体に伝達可能であった。したがって、ヒト抗体中の位置ＬＣ−８３での体細胞突然変異の頻度を評価した。加えて、ＬＣ−１０６もこの分析に含めた。

【0501】

ＩＧＫＶ１生殖細胞系から発生する軽鎖配列内の体細胞超突然変異（ＳＨＭ）の分布を調べるために、２つの手法を使用した。まず、いくつかの公的に入手可能なデータベースで入手可能な４６２３個の固有のヒトＩＧＫＶ１軽鎖配列の体細胞突然変異を照合した（図１０Ａ、上のパネル）。第２に、１０００を超える個別のヒトリンパ系組織から発生するＲＮＡからのＩＧＫＶ１配列を増幅し、続いて、高性能の再現性がある単一分子リアルタイム配列決定法（ＳＭＲＴ）及びＳＨＭ照合を行った。２つのデータセットの異なる起源に関わらす、体細胞突然変異の非常に類似した分布が観察された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＬＣ−８３は、ＶＬセグメント内で最も頻繁に突然変異される位置のうちの１つであり、全てのＩＧＫＶ１配列のうちのそれぞれ７％及び１９％が２つのデータセット内のＬＣ−８３で突然変異を担う。興味深いことに、位置ＬＣ−１０６も、ＩＧＫＶ１配列において頻繁に突然変異し（それぞれ９％及び２０％）、最も一般的な突然変異は、バリンである。Ｇ６ＶＬの最も近接した生殖細胞系遺伝子セグメントは、ＩＧＫＶ１−３９及びＩＧＪ１である。したがって、ＩＧＫＶ１．３９の生殖細胞系源の抗体を調べると、ＬＣ−Ｆ８３での体細胞突然変異が主に、より小さな側鎖（セリン、バリン、及びロイシンを含む）をもたらすことが明らかになった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＩＧＫＶ１．３９の抗体中のアラニン置換は観察されなかったが、これは、アラニン突然変異が、ＬＣ−Ｆ８３でのコドンにおいて２つの塩基置換を必要とすることに因る可能性が高いが、これはめったに生じない。

【0502】

次に、位置ＬＣ−８３及びＬＣ−１０６の最も頻繁な体細胞突然変異を担うＧ６．３１Ｆａｂ変異体を生成し、抗原結合及び熱安定性に対するそれらの効果を決定した（図１０Ｄ）。全ての単一の突然変異体は、おそらく、ＦａｂのＬ字型角度を減少し、ＶＬ−ＣＬ界面域を増加することによりＴ_ｍを４．８℃〜６℃増加させた。一貫して、二重突然変異ＬＣ−Ｆ８３Ａ／ＬＣ−Ｉ１０６Ｖは、Ｔ_ｍの著しい増加をもたらさなかった。理論に束縛されるものではないが、両方の側鎖のサイズを同時に低減することにより、典型的にはＬＣ−Ｆ８３またはＬＣ−Ｉ１０６が占める疎水性空洞に空隙が残り、ＶＬがＣＬに対して安定した充填を行う能力が低減されるであろう。ＶＥＧＦ親和性に対するＬＣ−８３の突然変異の効果は混合している。ＬＣ−Ｆ８３Ｖは、ＬＣ−Ｆ８３Ａと類似して３倍増加した親和性をもたらす一方で、突然変異ＬＣ−Ｆ８３Ｓ及びＬＣ−Ｉ１０６Ｖは、親和性の増加をほとんど示さなかった。抗原親和性に対するＬＣ−８３の突然変異の効果は、状況に依存し得る。ＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異をＧ６．３１と同じ生殖細胞系から発生した別の抗体に導入すると、熱安定性及び親和性において類似の増加が観察された。さらに、ＬＣ−Ｆ８３Ｓの突然変異が、抗エストラジオール抗体の親和性を増加させることが報告されている。

【0503】

要約すると、ＬＣ−８３及びＬＣ−１０６は、ヒト抗体中で頻繁に突然変異される。親和性及び安定性に対するこれらの２つの位置の影響を考慮すると、全体的なＦａｂドメイン動態の最適化は、インビボでの抗体親和性成熟中でよく利用され得る分子機序である。

【0504】

材料及び方法
ヒト軽鎖配列を、様々な公的に入手可能な源から得た：Ａｂｙｓｉｓ（ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓのウェブサイトで入手可能である）、Ｋａｂａｔデータベース（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２５（１）：１３０−１３３（１９９６））、ＩＭＧＴデータベース（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４０（１）：１０１−１１１（２００８））、ジェンバンク（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：Ｄ３０−３５（２０１５））、及びタンパク質データバンク（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（１）：２３５−２４２（２０００））。二重の配列を除去し、ＩＧＢｌａｓｔ（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１：Ｗ３４−４０（２０１３））を使用して、最も近接した生殖細胞系遺伝子をそれぞれのＶ−セグメントに関して割り当てた。マウスまたはラット生殖細胞系が割り当てられた配列をデータセットから除去した。配列をＫａｂａｔ番号付けし（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−２５０（１９７０）を参照されたい）、Ｖ−セグメントのフレームワーク内の体細胞突然変異を特定した。この分析において、ＨＶＲ領域内の突然変異（Ｋａｂａｔ番号付けスキーマにより定義されるような）を考慮しなかった。

【0505】

ヒト抗体配列の第２の源は、１０８８の個体から発生したヒト脾臓、扁桃、骨髄、及び末梢血液リンパ球からの、市販されているＲＮＡからのものである（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ ａｎｄ Ａｍｓｂｉｏ）。まず、ＳＭＡＲＴＥＲ（登録商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ＩＧＫＶ特異性ＤＮＡに対しては、ＩＧＫＣ領域の５’の領域をアニールするカスタムプライマー（５’−ＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号５６））を有する５’ＲＡＣＥ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して増幅したが、ＩＧＫＶ１セグメントに対しては、プライマーを使用する第２のＰＣＲステップで濃縮した：フォワード：５’−ＧＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号５７）及びリバース：５’−ＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ−３’（配列番号５８）。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＲＳＩＩ（ＥＡ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して、ＰＣＲ産生物をゲル精製し、配列決定した。全部で９９４．８Ｍｂｐが得られた。Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ ＳＭＲＴ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．３ソフトウェアパッケージを使用して、各リードのコンセンサス配列を作製した。ＶＤＪＦａｓｔａを使用して、コンセンサス配列の生殖細胞系アノテーションを実施した（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６（４８）：２０２１６−２０２２１）。配列をＫａｂａｔ番号付けし、Ｖ−セグメントのフレームワーク内の体細胞突然変異を特定した。全体として、１９０３４個の配列がＩＧＫＶ１としてアノテートされ、そのうちの３７９６個が少なくとも３つのフレームワーク領域及び２つのＨＶＲを含有し、ＳＨＭ分布を生成するように含まれた。

【0506】

実施例９：Ｇ６．３１の表面荷電変異体の特定
Ｇ６．３１のｐＩを低下させるために使用され得る可能性がある突然変異を単離するために、Ｇ６結晶構造からの構造情報を使用して、表面が曝露された位置を可変ドメイン内で特定した。グルタミン酸塩への置換がＮＮＫウォークＶＨ及びＶＬライブラリーのＶＥＧＦパニングに基づいて１以上の濃縮比を示した位置を選択して（実施例２）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００システムを使用する単一サイクル反応速度分析によるＶＥＧＦ結合親和性、及び熱安定性（ＤＳＦ）に対するそれらの影響を試験した（表３Ａ）。上述されるように、グルタミン酸塩への置換、ならびに他の荷電残基（例えば、アルギニン、リジン）を含有する突然変異体を生成し、発現させ、精製した（実施例２、材料及び方法を参照されたい）。いくつかの事例において、いくつかの変異体に関して表３Ａに列挙される全体的なＫｄは、単一サイクル反応速度分析（表３Ａ）と複数のサイクル反応速度分析（表４）との間にある適合差異に起因して、表４の結果と比較するとより弱いことを留意されたい。表３Ｂは、示される変異体に関する収率、モノマーパーセント（モノマー％）、及び溶出時間を示す。
表３Ａ：表面が曝露された荷電変異体の特徴付け

表３Ｂ：表面が曝露された荷電変異体に関する精製パラメータ

【0507】

表３Ａに示されるように、Ｇ６．３１と比較して匹敵するかまたはＶＥＧＦへの改善された結合親和性を有した、いくつかの表面が曝露された荷電変異体が特定された。

【0508】

実施例１０：ＶＥＧＦへの改善された結合親和性及び改善された安定性を有する組み合わせ変異体の生成及び特徴付け
Ａ．ＶＥＧＦへの改善された結合親和性及び改善された安定性を有する変異体の生成
Ｇ６．３１は、ＨＶＲ−Ｌ３（Ｎ９４−Ｐ９５）内に自己切断部位を含有し、それは、その安定性に影響を及ぼし得る可能性がある。実施例２に記載される単一変異体の組み合わせ（例えば、表２を参照されたい）を、増加した結合親和性及び増加した安定性を有するクローンを特定するために組み合わせた。特に４つの突然変異：ＬＣ−Ｆ８３Ａ（改善された熱安定性及び親和性を提供する）、ＬＣ−Ｎ９４Ａ（自己切断部位を除去する）、ＨＣ−Ｙ５８Ｒ（親和性を改善する）、及びＨＣ−Ｎ８２ａＲ（親和性を改善する）に焦点をあてた。自己切断部位を除去することを意図する位置ＬＣ−Ｎ９４でのいくつかの他の置換も、複数のサイクル反応速度測定によりＶＥＧＦへの結合親和性、ならびにＤＳＦにより安定性に対するそれらの効果に関して試験した（表４）。自己切断部位の除去は、非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）を使用して決定した低分子量構成要素のパーセンテージにより査定すると、フラグメンテーションを一貫して低減させていた（図１２）。
表４：自己切断部位変異体の親和性及び熱安定性

【0509】

ＬＣ−Ｆ８３Ａ、ＬＣ−Ｎ９４Ａ、ＨＣ−Ｙ５８Ｒ、及びＨＣ−Ｎ８２ａＲ変異体を組み合わせて単一のクローン（「Ｙ５８Ｒ．Ｎ９４Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｆ８３Ａ」、「Ｇ６．３１ＡＡＲＲ」とも称される）にすることにより、ＶＥＧＦへの明らかに増加した結合親和性がもたらされ（Ｋｄ＝８０ｐＭ）、Ｇ６．３１と比較すると６．６倍改善された。Ｙ５８Ｒ．Ｎ９４Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｆ８３Ａは、明らかに改善された熱安定性も有し、Ｇ６．３１と比較するとＴ_ｍが４．８℃増加した。（表５）。Ｙ５８Ｒ．Ｎ９４Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｆ８３ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１で示され、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１２で示される。
表５：組み合わせ変異体Ｙ５８Ｒ．Ｎ９４Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｆ８３Ａは、Ｇ６．３１と比較してＶＥＧＦへの改善された結合親和性及び改善された安定性を有する。

【0510】

Ｂ．改変されたｐＩを有する表面が曝露された荷電変異体の生成
より低いｐＩを有する変異体を生成するために、いくつかのグルタミン酸塩置換をＧ６．３１の配列に導入した。単一の表面が曝露された荷電変異体の突然変異データ（表３Ａ〜３Ｂ）に基づいて、ＶＥＧＦ結合に対して大きなマイナスの影響を有さなかった変異体をさらなる操作のために選択した。発現レベル（収率により査定される場合）及び低減した凝集（高モノマー％により査定される場合）も、突然変異の選択において考慮した。ＡＰＢＳを使用して、Ｇ６．３１の等静電表面を計算した（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８（１８）：１００３７−１００４１（２００１））。選択されたグルタミン酸塩突然変異を、静電表面上にマッピングし、（ｉ）空間近接して配置された突然変異を回避し、（ｉｉ）強力な、正に荷電されたパッチ内に配置された突然変異を有利としたグルタミン酸塩突然変異の組み合わせを選択した。２つの重鎖の組み合わせ変異体（Ｒ１９Ｅを有するもの、及び有しないもの）及び５つの軽鎖の組み合わせ変異体をさらなる特徴付けのために生成した（表６）。全ての軽鎖の組み合わせ変異体は、自己切断部位を除去するためのＬＣ−Ｎ９４Ａの突然変異及び抗体の熱安定性を改善するためのＬＣ−Ｆ８３Ａの突然変異を含有した。いくつかの変異体は、ＶＥＧＦへの改善された親和性を示した（表６、表７、及び表９）を参照されたい。例えば、ＨＣＬＣ２及びＨＣＬＣ５は、Ｇ６．３１と比較して改善された親和性及び明らかに低減したｐＩ（Ｇ６．３１のｐＩ８．９と比較して、それぞれｐＩ５．３及び５．６）を示した（表７及び表９を参照されたい）。
表６：表面が曝露された荷電変異体の組み合わせ

表７：表面が曝露された荷電変異体結合の組み合わせのＶＥＧＦに対する反応速度

【0511】

加えて、選択された表面が曝露されたグルタミン酸塩置換と、親和性及び／または安定性を改善した単一変異体とを含むいくつかの他の組み合わせ変異体を生成した（表８）。
表８：追加の組み合わせ変異体の結合反応速度

【0512】

表９は、選択された組み合わせ変異体の結合親和性、安定性、及びｐＩデータの要約を示す。インハウスプログラムを使用して、かつ標準的なｐＩ対照を用いて等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを実行することにより、抗体ｐＩを計算した。表１０は、これらの抗体の対応するＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表１１は、これらの抗体のＶＬ ＨＶＲアミノ酸配列を示す。表１２は、これらの抗体のＶＨ ＨＶＲアミノ酸配列を示す。
表９：選択された組み合わせ変異体の要約

表１０：表９の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列

表１１：表９の抗体のＶＬ ＨＶＲ配列

表１２：表９の抗体のＶＨ ＨＶＲ配列

【0513】

上記に列挙される抗体のうちのいずれか、例えば、Ｇ６．３１ＡＡＲＲのＦａｂ重鎖の上ヒンジ領域は突然変異されて、文献に報告されている抗ＩｇＧ１ヒンジ自己抗体に対する反応性が除去され得る。例えば、Ｂｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：３１８３−３１９２，２００８及びＢｒｅｚｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ２：３，２１２−２２０，２０１０を参照されたい。したがって、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ重鎖のＣ末端アミノ酸は、Ｔ（野生型（ＷＴ）バージョン）またはＬ（抗ヒトＩｇＧＦａｂに対する反応性を欠く変異体バージョン）のいずれかであり得る。野生型Ｇ６．３１ＡＡＲＲの完全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４８である。抗ヒトＩｇＧのＦａｂに対する反応性を欠く変異体バージョンの完全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４９である。Ｇ６．３１ＡＡＲＲ、及び抗ヒトＩｇＧのＦａｂに対する反応性を欠く変異体バージョンの両方の完全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５０である。

【0514】

要約すると、ディープスキャニング突然変異生成法により特定された変異体の組み合わせは、改善された特性を有する抗体をもたらした。いくつかの事例において、それらの抗体は、Ｇ６．３１と比較してＶＥＧＦへの改善された結合親和性、ならびに改善された安定性（明らかに増加したＴ_ｍにより判断した場合）を有した。いくつかの変異体（例えば、抗体ＨＣｃｏｍｂｏ、ＨＣＬＣ１、ＨＣＬＣ２、ＨＣＬＣ３、ＨＣＬＣ４、及びＨＣＬＣ５）は、ＶＥＧＦへの改善された結合親和性及び明らかに低減したｐＩの両方を有した。低減したｐＩを有する変異体に関して、重鎖後方のＲ１９Ｅの突然変異を、位置１９で元のアルギニン（例えば、Ｒ１９ＨＣｃｏｍｂｏ、Ｒ１９ＨＣＬＣ２、Ｒ１９ＨＣＬＣ４、及びＲ１９ＨＣＬＣ５にあるような）に回復させることにより、さらなる親和性の改善及び増加したＴ_ｍ（約２．２〜２．８℃の分）を有する変異体がもたらされた。

【0515】

実施例１１：ウサギにおける硝子体内投与後のＧ６．３１変異体の眼の薬物動態及び全身性薬物動態
インビボでのＧ６．３１変異体の薬物動態（ＰＫ）特性を査定するために、ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギを使用して以下の実験を実施した。２つの異なるＧ６．３１変異体である、Ｇ６．３１ＡＡＥＥ（ＬＣ−Ｎ９４Ａ．ＬＣ−Ｆ８３Ａ．ＨＣ−Ａ４０Ｅ．ＨＣ−Ｔ５７Ｅ）及びＧ６．３１ＡＡＲＲ（Ｙ５８Ｒ．Ｎ９４Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｆ８３Ａ）、ならびに親Ｇ６．３１ＷＴの眼半減期を決定した。各場合において、それらの抗体の各々のＦａｂを、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中にて製剤化した。５０μＬ（０．５ｍｇ）を、麻酔をかけたウサギに硝子体内注入した。ウサギ（１０個の群）に、１回／目で投薬した。群１にはＧ６．３１ＡＡＥＥを投薬し、群２にはＧ６．３１ＷＴを投薬し、群３にはＧ６．３１ＡＡＲＲを投薬した。投薬前、投薬２時間後、６時間後、１日後、２日後、４日後、８日後、１５日後、及び２１日後に組織（硝子体液、水様液、及び血清）を収集した。以下に記載される合計のＦａｂ ＥＬＩＳＡを使用して、試料を抗ＶＥＧＥのレベルに関してアッセイした。

【0516】

硝子体液及び水様液の各々における各変異体及びＷＴの薬物動態分析の結果は、図１１Ａに表示される。結果は、Ｇ６．３１ＡＡＥＥのＰＫ及びＧ６．３１ＡＡＲＲのＰＫは、硝子体液及び水様液の両方においてＷＴＧ６．３１のＰＫと本質的に同じであることを示す。硝子体半減期及び水様半減期を計算し、それらの結果を以下の表１３に表示する。変異体Ｇ６．３１Ｆａｂの半減期は、ＷＴに類似しており、文献に報告されているＦａｂの眼半減期とも一貫していた。
表１３：Ｇ６．３１変異体及びＧ６．３１ＷＴの半減期

【0517】

硝子体内注入後のＦａｂへの全身性曝露を、血清中の抗ＶＥＧＦのレベルを測定することにより査定した。血清試料を抗ＶＥＧＦに関してアッセイした。結果は、図１１Ｂに示される。クリアランス（ｍｌ／ｋｇ／日）を計算し、それらの結果を以下の表１４に示す。血清を抗治療用抗体（ＡＴＡ）に関してもアッセイした。ＡＴＡは、１４日目から全ての動物中に存在した。
表１４．Ｇ６．３１変異体及びＧ６．３１ＷＴのクリアランス

【0518】

表１４に示される結果により示されるように、全ての３つのＦａｂが同じ生物学的利用能を有する場合、Ｇ６．３１ＡＡＲＲは、Ｇ６．３１ＷＴ及びＧ６．３１ＡＡＥＥと比較してより低い全身性曝露を示す最速クリアランスを有した。かかるより低い全身性曝露は、Ｇ６．３１ＷＴ及びＧＧ６．３１ＡＡＥＥと比較してＧ６．３１ＡＡＲＲのより良好で安全なプロファイルをもたらし得る。

【0519】

材料及び方法
Ａ．合計のＦａｂ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを３回洗浄し、その後、遮断緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、及び１５ｐｐｍのＰＲＯＣＬＩＮ（商標））でインキュベートした。３回洗浄した後、ＷＴＧ６．３１、Ｇ６．３１ＡＡＲＲ、またはＧ６．３１ＡＡＥＥを投薬したＮＺＷウサギから収集した水性試料及び硝子体試料を穏やかに混合しながら、プレート内で室温にて２時間インキュベートした。次いで、コーティング抗体に結合したＧ６．３１分子を、Ｆ（ａｂ’）_２ペルオキシダーゼ複合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて室温で１時間検出した。３回洗浄した後、ＴＭＢＥ−１０００基材溶液を３０分間プレートに添加し、１ＭのＨ_３ＰＯ_４を使用して反応を停止した。シグナルを４５０／６２０ｎｍで記録した。

【0520】

標準的な曲線を使用して、Ｇ６．３１分子の濃度を決定した。

【0521】

実施例１２：ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ移動アッセイ
Ｇ６．３１変異体を、ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ移動を阻害する能力に関して試験した。Ｆａｌｃｏｎ２４マルチウェル挿入システムを使用して、表１５に示される変異体のＨＵＶＥＣ移動アッセイを実施した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ．３５１１８４）。挿入を、８ｍｇ／ｍｌのマウスラミニン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２３０１７−０１５）で、一晩事前にコーティングした。ＨＵＶＥＣを一晩欠乏させ、収穫し、アッセイ培地（ＥＢＭ−２、０．１％のＢＳＡ）中で再懸濁した。細胞（５×１０^４個）を上方チャンバに添加し、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを下方チャンバに添加して、様々な用量レベルの遮断抗体の存在下または不在下で１６時間、移動を刺激した。固定し、上方表膜から擦り取った後、下方表面上の細胞をメタノールで固定し、ＳＹＴＯＸ（登録商標）の緑色（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ７０２０）で染色した。倒立型蛍光顕微鏡を使用して画像を取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して細胞数を分析した。

【0522】

図１３は、多様なＦａｂ濃度で親Ｇ６．３１と比較した、Ｇ６．３１ ＬＣ−Ｎ９４ＡによるＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ移動の阻害のプロットを示す。図１３から見ることができるように、単一のＬＣ−Ｎ９４Ａの突然変異は、ＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ移動アッセイにおいて、親ＷＴ Ｇ６．３１と比較して約５倍、著しく効能が低い。表１５に示されるように、二重突然変異体であるＬＣ−Ｎ９４Ａ．ＬＣ−Ｆ８３Ａも、このアッセイにおいて、親ＷＴ Ｇ６．３１と比較して約５倍効能が低い。四重突然変異体であるＬＣ−Ｎ９４Ａ．ＬＣ−Ｆ８３Ａ．ＨＣ−Ａ４０Ｅ．ＨＣ−Ｔ５７Ｅ（Ｇ６．３１ＡＡＥＥ）は回復し、効能はわずかに改善した（表１５）。驚くべきことに、四重突然変異体であるＮ９４Ａ．Ｆ８３Ａ．Ｎ８２ａＲ．Ｙ５８Ｒ（Ｇ６．３１ＡＡＲＲ）は、親ＷＴ Ｇ６．３１と比較して効能を約２倍、著しく改善した（表１５）。
表１５．ＨＵＶＥＣ移動アッセイにおいてＩＣ５０により決定したＧ６．３１変異体の細胞効能

【0523】

実施例１３：Ｇ６．３１ＡＡＲＲ及び他の抗体へのヒアルロン酸（ＨＡ）の複合体化
病理学的血管形成に関連付けられる眼の障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、またはＲＶＯ）の治療のための現在の手法は典型的には、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂラニビズマブ）の硝子体内注入を伴う。抗ＶＥＧＦ Ｆａｂの作用の部位が網膜において目の後方にあるため、かつＦａｂが目の中で比較的短い滞留時間を有し得るため、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂから患者が得られる最大の利益は典型的には、硝子体内注入による比較的頻繁な投薬（例えば、Ｑ４Ｗ）により得られる。眼の障害に対する抗ＶＥＧＦ抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）の長時間作用性送達が、投薬頻度を少なくとも部分的に減少する上で所望され、これにより、改善された患者の利便性及び適応性がもたらされる。この実施例において、線状未架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）をＧ６．３１変異体のＧ６．３１ＡＡＲＲに複合体化する効果を評価した。複合体の分子特性、薬物動態パラメータ（例えば、硝子体半減期及びクリアランス）、熱力学的安定性、及びＶＥＧＦの阻害効能を分析した。

【0524】

モデルのウサギＦａｂ（ｒａｂＦａｂ、Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１６；ＰｕｂＭｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＰＭＩＤ）２７２４４４７４）を、この分析の一部として使用した。タンパク質療法剤のための送達技術の開発は典型的には、インビボの有用性を示すために関連動物モデルにおいて試験することを伴う。眼の薬物動態の初期研究では、一般的にウサギモデルを用いる。残念ながら、ほとんどのヒト及びヒト化抗体は、ウサギにおいて免疫原生であり、これは、長時間作用性送達技術を使用した重要な薬物動態パラメータの予測を妨げる。この問題に対処するために、ウサギモデルにおける送達技術を評価するのに有用である、種が合致したウサギＦａｂ（「ｒａｂＦａｂ」）である代用化合物を開発した。本明細書に記載されるｒａｂＦａｂは、ヒトホスホｃ−Ｍｅｔに結合するウサギモノクローナル抗体に由来していた。ウサギモノクローナル抗体を含むウサギ抗体の作製方法は、当該技術分野において周知されている。例えば、米国特許第５，６７５，０６３号及び／または同第７，４２９，４８７号を参照されたい。ヒトホスホｃ−Ｍｅｔに結合する例示的なウサギモノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から製品番号ａｂ６８１４１で市販されている。

【0525】

現在の実験において、Ｇ６．３１ＡＡＲＲまたはｒａｂＦａｂ Ｆａｂ−Ｃ分子を、４０ｋＤａ（ＨＡ４０Ｋ−）、１００ｋＤａ（ＨＡ１００Ｋ−）、２００ｋＤａ（ＨＡ２００Ｋ−）、及び６００ｋＤａ（ＨＡ６００Ｋ−）を含む、様々な重量平均分子質量（Ｍｗ）の線状未架橋ＨＡに複合体化した。Ｆａｂ−Ｃ分子は、配列が、第１のヒンジシステインで切断され、発現から直接的に遊離システインを有するＦａｂをもたらすように発現されるＦａｂ分子である。完全長モノクローナル抗体の消化により生成された遊離システインを有するＦａｂ’分子も使用され得る。この実施例に記載されるＨＡ複合体に関して、Ｆａｂ−Ｃ分子を、ＨＡのグルクロン酸糖単位上でカルボン酸基に共有結合した。合成の第１のステップにおいて、ＨＡ上のこれらの酸基のある特定のパーセンテージをマレイミドに変換した（典型的には２〜１０％の酸基を変換した）。次いで、Ｆａｂ−Ｃ分子を、Ｆａｂ−Ｃ分子上の遊離システインを通じてマレイミド基に複合体化した。しかし、複合体化化学に対するわずかな修飾が、Ｆａｂ分子または他の抗体形式をＨＡに複合体化するために使用され得る。

【0526】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、屈折率（ＲＩ）多角度光散乱（ＭＡＬＳ）、及び準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）（ＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ−ＱＥＬＳとも称される）の組み合わせを、選択されたＨＡ−Ｆａｂ複合体のＨＡ Ｍｗ、複合体Ｍｗ、Ｆａｂ充填パーセンテージ（共有結合されたＦａｂ分子が占めるＨＡカルボン酸基のパーセンテージとして定義される）、流体力学半径（Ｒｈ）、遊離Ｆａｂ（溶液中で遊離し、ＨＡ分子に共有結合されないＦａｂ分子のパーセンテージとして定義される）、及びタンパク質質量分率（タンパク質質量／（タンパク質質量＋ＨＡ質量）を査定するために使用した（表１６）。図１４は、ＨＡ４０Ｋ−ｒａｂＦａｂ、ＨＡ２００Ｋ−ｒａｂＦａｂ、及びＨＡ６００Ｋ−ｒａｂＦａｂの重量平均分子質量（Ｍｗ）を査定するためのＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ−ＱＥＬＳの例示的な結果を示す（ＱＥＬＳデータは、図１４に示されていないことを留意されたい）。
表１６．ＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ−ＱＥＬＳにより査定した選択ＨＡ−Ｆａｂ複合体の特性

^＊およそのＲｈ値
^＊＊ウサギＰＫ研究で調査した試料（例えば、図１６及び以下を参照されたい）

【0527】

ＡＭＤなどの眼の障害の治療に関して、眼半減期は長いが全身性半減期が短いことが、例えば、全身性抗ＶＥＧＦ曝露を最小限に抑える上で所望され得る。全身性循環からのＨＡクリアランスは、ヒアルロニダーゼ保持肝細胞により媒介される。以前の報告は、天然ＨＡ上のヒアルロニダーゼ活性がグルクロン酸カルボン酸基による認識を伴うことを示す。これらのカルボン酸基が修飾されて、Ｆａｂ−Ｃ分子に結合したため、複合体化ＨＡがヒアルロニダーゼにより酵素消化される能力を査定した。ＨＡ複合体化ｒａｂＦａｂは、ＨＹＡＬ２でインキュベートしたＨＡ及びＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂのＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析により査定すると、ヒアルロニダーゼ−２（ＨＹＡＬ２）による消化に対する酵素感受性を保持した（図１５）。

【0528】

硝子体内投与後のウサギ硝子体内の眼の薬物動態パラメータ（例えば、半減期及びクリアランス）に対するＦａｂフラグメントのＨＡ複合体化の効果を決定した。ＨＡ１００Ｋ（ＨＡ１００Ｋ−Ｉ^１２５−ｒａｂＦａｂ）へのｒａｂＦａｂの複合体化は、非複合体化ｒａｂＦａｂまたはラニビズマブと比較して、クリアランスの著しい減少及び硝子体半減期の著しい増加をもたらした（図１６及び表１７）。ＨＡ１００Ｋ複合体化ｒａｂＦａｂは、履歴データから、非複合体化ｒａｂＦａｂと比較しておよそ４倍増加した硝子体半減期（ｔ_１／２）を有した（それぞれ、１１．９日対３．２日）（図１６及び表１７）。表１７は、ｒａｂＦａｂ及びＨＡ１００Ｋ−Ｉ^１２５−ｒａｂＦａｂのＲｈも示す。これらのデータは、ＨＡ複合体化がＦａｂの流体力学半径を増加させ、結果的に、硝子体クリアランスを減速させ、硝子体半減期を増加させたことを示す。
表１７．硝子体内投与後のウサギ硝子体からのｒａｂＦａｂ及びＨＡ１００Ｋ−^１２５Ｉ−ｒａｂＦａｂのクリアランス

【0529】

ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂに関して上述されるデータと連結した、流体力学サイズ（例えば、流体力学半径の観点における）と硝子体滞留時間（例えば、半減期の観点における）との間の線状相関性は、ｒａｂＦａｂ、２０ＫＤのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に複合体化されたｒａｂＦａｂ（ｒａｂＦａｂ−２０ｋＤａ ＰＥＧ）、及び４０ｋＤａのＰＥＧに複合体化されたｒａｂＦａｂ（ｒａｂＦａｂ−４０ｋＤａ ＰＥＧ）（Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．（上記））の履歴データと併せて、ＨＡ１００ＫまたはＨＡ２００Ｋに複合体化されたＧ６．３１及びＨＡ３００Ｋに複合体化されたＧ６．３１の硝子体半減期の予測を可能にした（図１７）。ＨＡ１００Ｋ−Ｇ６．３１は、およそ１１日の予測硝子体半減期を有するが、ＨＡ２００Ｋ−Ｇ６．３１は、およそ１７日のさらに大きな予測硝子体半減期を有する（図１７）。ＨＡ３００Ｋ−Ｇ６．３１は、およそ１９日の予測硝子体半減期を有する（図１７）。これらの結果は、線状未架橋ＨＡへの、本明細書に記載されるＧ６．３１ＡＡＲＲまたは他のＧ６．３１変異体の複合体化が、硝子体内注入後の増加した眼の滞留時間（例えば、半減期）及び減少したクリアランスをもたらすというさらなる証拠を提供する。

【0530】

Ｆａｂの熱力学的安定性に対するＨＡ複合体化の効果も評価した（表１８）。３つの異なるモル質量のＨＡへのｒａｂＦａｂの共有結合は、親Ｆａｂと比較して類似の複合体のＴｍ開始及びピークＴｍにより示されるように、Ｆａｂの熱力学的安定性を改変しなかった（表１８）。
表１８．ＨＡへのＦａｂの複合体化は、Ｆａｂの熱力学的安定性を著しく改変しない。

【0531】

最後に、Ｇ６．３１ＡＡＲＲのＶＥＧＦ阻害効能に対するＨＡ複合体化の効果を査定した。驚くべきことに、線状未架橋ＨＡへのＧ６．３１ＡＡＲＲの複合体化は、ＶＥＧＦ阻害に関するｐＫＤＲアッセイにおいて比較したとき、親Ｆａｂを超える著しく改善された効能をもたらした（表１９）。表１９のｑＡＣ５０値は、活性アッセイ形式で５０％の応答を誘発するために必要とされる濃度を示す。ｑＡＣ５０値は、ＩＣ５０値と同等である。ＨＡ複合体化Ｇ６．３１ＡＡＲＲは、非複合体化親Ｆａｂと比較しておよそ７倍増加した効能を有した（表１９）。したがって、本明細書に記載されるＧ６．３１ＡＡＲＲ及び他のＧ６．３１変異体の複合体化は、両方とも、硝子体薬物動態パラメータ（半減期及びクリアランスを含む）、ならびにＶＥＧＦ阻害効能を改善するのに有用であり得る。
表１９．ＨＡへのＧ６．３１ＡＡＲＲの複合体化は、改善されたＶＥＧＦ阻害効能をもたらす。

【0532】

前述の実験データに基づいて、ＨＡ複合体化Ｇ６．３１ＡＡＲＲ分子は、ＡＭＤ（例えば、滲出性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、及びＲＶＯを含む眼の障害の治療にとって著しく改善された特徴を有する。これらの改善された特徴には、増強された硝子体滞留時間に起因する増加した効能及び投薬頻度の低下の機会が含まれる。

【0533】

材料及び方法
Ａ．マレイミド官能化ＨＡ（ＨＡ−ｍａｌ）の合成
様々なモル質量の線状未架橋ＨＡポリマーを、Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから得た。カップリング試薬である４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）及びリンカーであるＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ）との水性反応を使用して、ＨＡをマレイミド基で修飾した。ＨＡを、２．５ｍｇ／ｍＬでｐＨ５．５の１００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸中に溶解し、この溶液に、１．５モル過剰のＤＭＴＭＭ及び３．７５モル過剰のＡＥＭを攪拌しながら添加した（モル過剰は、ＨＡ中のカルボン酸のモルに基づいて計算した）。溶液を２時間、７０℃に加熱した。

【0534】

過剰ＡＥＭ及びＤＭＴＭＭを、脱塩手順を介して反応から除去した。ＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムを、ＡＫＴＡ（商標）精製システムに備え付け、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０の１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。反応をカラム上にニート注入し、ＨＡ−ｍａｌピークを３０２ｎｍでの吸収度に従って収集し、遠心限外濾過デバイスを使用して５ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。ＵＶ可視分光光度計を使用して、３０２ｎｍでの吸収度によりＨＡ−ｍａｌ保存溶液中のマレイミド濃度を測定し、多角度光散乱と合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）により、ＨＡ鎖あたりのマレイミド基のモル比を査定した。

【0535】

Ｂ．ＨＡ−ｍａｌへのＦａｂ−Ｃの複合体化
ｐＨ６．５の１Ｍのリン酸塩を使用して、Ｆａｂ−Ｃの溶液を６．５にｐＨ調整し、５０ｍＭの最終リン酸塩濃度にした。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をその溶液中にスパイクして、２．５ｍＭの最終濃度にした。Ｆａｂ−Ｃ溶液を攪拌し、それに、反応緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．５））中に希釈したＨＡ−ｍａｌを添加した。化学量論を最終反応において１モルのマレイミドあたり１．２モルのＦａｂ−Ｃに設定し、体積を１ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度をもたらすように設定した。複合体化反応を、攪拌しながら室温で行った。３時間の時点で、メルカプトエタノールを１モルのマレイミドあたり２モルで添加して、未反応のマレイミド基をキャップした。メルカプトエタノール添加の３０分後、反応を、精製のために１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．５）で５０ｍＭ未満のＮａＣｌに希釈した。

【0536】

陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製を行い、複合体から遊離Ｆａｂ−Ｃ及びＦａｂ二量体を分離した。ＨｉＴｒａｐ（商標）Ｑ ＦＦの５ｍＬカラムをＡＫＴＡ（商標）精製システムに備え付け、１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）を平衡化した。希釈反応をカラムに流して、ＨＡ−Ｆａｂ複合体を捕捉し、同時に遊離Ｆａｂ−Ｃ及び二量体を溶出した。１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）、１００ｍＭのＮａＣｌで洗浄した後、複合体を段階勾配により１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）、５００ｍＭのＮａＣｌに溶出した。溶出した複合体を貯め、１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）で希釈して、１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌの最終組成物にした。製剤化した複合体を遠心限外濾過により濃縮した。

【0537】

Ｃ．ＨＡ−Ｆａｂ複合体の分析
Ｗｙａｔｔ Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ−ｒＥＸ ＲＩ検出装置及びＷｙａｔｔ ＨＥＬＥＯＳ−ＩＩ ＭＡＬＳ検出装置を並んで有するＡｇｉｌｅｎｔ１２００高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで、屈折率（ＲＩ）多角度光散乱（ＭＡＬＳ）と合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）との組み合わせ（ＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ−ＱＥＬＳとも称される）により、残留遊離Ｆａｂ含有量、全複合体モル質量、及びタンパク質質量分率を査定した。実行緩衝液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた分析のためにＴｏｓｏｈ Ｇ６０００ ＰＷｘｌカラムを使用した。ＭＡＬＳ検出装置を正規化し、検出装置間のバンド広がりを訂正するためにＢＳＡ制御を使用した。Ｆａｂ及びＨＡ−Ｆａｂ複合体と対応するＵＶ Ａ_２８０ピークを合体させることにより、遊離Ｆａｂ含有量を測定した。複合体モル質量を、複合体ピークの重量平均分子量（Ｍｗ）（重量平均分子質量とも称される）として取った。示差的ＲＩ（ｄＲＩ）及びＵＶ Ａ_２８０シグナルを使用するタンパク質複合体分析を使用してタンパク質質量分率を計算した。

【0538】

Ｄ．ＨＡ−ｒａｂＦａｂ複合体の動的走査熱量測定（ＤＳＣ）研究
ｒａｂＦａｂ、３９ｋＤａの重量平均分子質量（Ｍｗ）を有するＨＡに複合体化したｒａｂＦａｂ（ＨＡ３９Ｋ−ｒａｂＦａｂ）、１００ｋＤａのＭｗを有するＨＡに複合体化したｒａｂＦａｂ（ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ）、及び３００ｋＤａのＭｗを有するＨＡに複合体化したｒａｂＦａｂ（ＨＡ３００Ｋ−ｒａｂＦａｂ）の溶液を、１０ｍＭのＨｉｓＨＣｌ（ｐＨ５．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で０．５ｍｇ／ｍＬ（タンパク質に基づいた所与の濃度）で調製した。ＤＳＣ研究をＶＰ−ＤＳＣミコ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｉｎｃ．）で、１℃／分のランプ速度を用いて１５〜１０５℃で行った。緩衝液のみの参照スキャンを各試料スキャンから控除した。付随するＯＲＩＧＩＮソフトウェアスイートを使用して、融解温度（Ｔｍ）及びＴｍ開始を評価した。

【0539】

Ｅ．リン酸化ＫＤＲ（ｐＫＤＲ）受容体活性化アッセイ
ＫＤＲを過剰発現させるために操作されたＣＨＯ細胞（ＫＤＲ−ＣＨＯ細胞；Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９（７）：１５２５−１５３３，２０００及びＢｅｎｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ＢＢＡ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ １４６６：７１−７８，２０００を参照されたく、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を、平底の９６ウェル組織培養物プレート中、８０μｌの細胞播種培地（５０：５０の高グルコースＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ−１２、０．２％のＢＳＡ、０．２５％の透析濾過したウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭのＬ−グルタマックス）内に１×１０^４個の細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。同時に、ＰＢＳ中で希釈した２５μｌの抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）でＮＵＮＣ（登録商標）ＭＡＸＩＳＯＲＢ（登録商標）３８４ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号４３９４５４）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。

【0540】

翌日、細胞刺激の２時間前、組織培養プレートを軽く押し固め、培養培地を、４０μｌの血清−遊離細胞刺激培地（５０：５０の高グルコースＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ−１２、０．５％のＢＳＡ、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）に変化させ、３７℃で２時間インキュベートした。Ｇ６．３１ＡＡＲＲまたはＨＡ１００Ｋ−Ｇ６．３１ＡＡＲＲの３倍の段階希釈液を細胞刺激培地内に作製した。ヒトＶＥＧＦ_１６５（１００ｎｇ／ｍｌ）の希釈液も細胞刺激培地内で調製した。ディープウェルブロックプレートを使用して、Ｇ６．３１ＡＡＲＲまたはＨＡ１００Ｋ−Ｇ６．３１ＡＡＲＲの段階希釈液からの試料を、希釈したＶＥＧＦ試料と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。４０μＬの得られた混合物を細胞の各ウェルに、合計の培養物体積が８０μＬになるように添加した。ＶＥＧＦのみを有するウェルまたはＶＥＧＦが添加されていないウェルも対照として調製した。細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。培養培地を軽く押し固め、２５μＬの氷のように冷たい細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、１ｘＨＡＬＴ（登録商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号７８４４４、１００倍保存から使用の直前に添加した）、５ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した。細胞を、ＥＬＩＳＡで進める前に１５分間氷上で溶解した。

【0541】

抗ｇＤコーティングＥＬＩＳＡプレートのウェルを洗浄緩衝液（ｐＨ７．４の０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ウェルを８０μｌの遮断緩衝液（０．５％のＢＳＡを有するＰＢＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号＃ＤＹ９９５））を用いて室温で１時間遮断した。次いで、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、１つのウェルあたり２５μｌの細胞可溶化液を各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液でウェルを４回洗浄した。２５μｌの１：２０００で希釈した抗リン酸化チロシン（クローン４Ｇ１０）ビオチン複合体化抗体（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号１６−１０３）をアッセイ緩衝液（０．５％のＢＳＡを有するＰＢＳ、遮断緩衝液と同じ）に入れて各ウェルに添加し、得られた混合物を室温で２時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で３回洗浄した。２５μｌの１：１０，０００で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレパビジン（Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ ＵＫ、カタログ番号ＲＰＮ４４ＯＩＶ）をアッセイ緩衝液に入れて各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で３回追加で洗浄した。次いで、２５μｌのＴＭＢを各ウェルに添加し、２０分間発色させて、その後、２５のＨ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止させた。最後に、ウェルの光学密度を４５０／６２０ｎｍのプレートリーダーで読み取った。

【0542】

Ｆ．ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂのヒアルロニダーゼ消化
最大１０％のＦａｂ複合体化（ＨＡ上の入手可能な酸基に基づいて発現されるパーセント）がＨＡ−Ｆａｂ複合体のヒアルロニダーゼ感受性を改変しなかったことを確認するために、１００ｋＤａのＭｗを有するＨＡ（ＨＡ１００Ｋ）及びＨＡ１００Ｋに複合体化したｒａｂＦａｂ（ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ）を、ｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中の４μｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ−２を用いて、２００μｇ／ｍＬのＨＡ（ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ濃度をＨＡ主鎖に対して２００μｇ／ｍＬの濃度を達成するように調整した）でインキュベートした。試料を３７℃でインキュベートし、上述されるように、Ｍｗ分析のために３０分間隔でＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＳ上にすぐに注入した。

【0543】

Ｇ．ウサギ硝子体からのＨＡ−Ｆａｂクリアランスの速度を査定するためのＰＫ研究
ウサギ硝子体内のＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂの眼の薬物動態プロファイルを以下に記載されるようにｒａｂＦａｂの履歴データと比較した。

【0544】

ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂをその日に^１２５Ｉを用いて標識し、その後投薬した。投薬製剤を調製するために、適切な量のＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）３０Ｋ遠心濾過管を使用して、トリスヨウ素化緩衝液（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、０．４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）と交換した。Ｐｉｅｒｃｅ社の事前にコーティングしたヨウ素化管をトリスヨウ素化緩衝液で湿潤させ、デカントした。適切な体積のトリスヨウ素化緩衝液を管の底に添加し、続いて、適切な量のＮａ^１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加した。ヨウ素を３０秒毎に回転させながら１５分間活性化した。適切な体積の試験試料であるトリスヨウ素化緩衝液、及び活性化したヨウ素をＮＵＮＣ（登録商標）微小遠心管に添加し、穏やかに振動させることによりおよそ１〜５分間混合した。スカベンジング緩衝液（チロシン、２ｍｇ／ｍＬのトリス緩衝液）を添加することによりヨウ素化反応を停止させ、製剤を混合し、１分及び４分の時点で軽く混合しながら５分間インキュベートした。タンパク質精製に関して、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）３０Ｋ遠心濾過管を、ＰＢＳを用いて、６，０００ＲＰＭで１５分間の遠心分離により調製した。ＮＵＮＣ（登録商標）管の含有物を、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）３０Ｋ遠心濾過管に添加し、ＰＢＳ中で最大４回洗浄して、およそ４００μＬの最終放射性標識試験物質体積を達成した。各試験物質の放射能、タンパク質濃度、及び放射化学純度を決定した。ピペットを使用して、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）管の含有物をＮＵＮＣ（登録商標）管に移し、製剤の最終濃度をおよそ１０ｍｇ／ｍＬにした。

【0545】

ＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ−^１２５Ｉをニュージーランドホワイトウサギの目の中に硝子体内注入した（５００μｇ／目）（Ｎ＝２４個の目）。硝子体内注入のために、ウサギをイソフルランで効果が出るように鎮静させ／麻酔をかけ、横向きに置いた。トロピカミド点眼液（２滴）及び２．５％のフェニルエフリンＨＣｌ（１滴）を両方の目に適用した。局所的プロパラカインを調製及び投薬の直前に各眼に適用した。結膜円蓋を１：５０希釈のベタジン溶液で流し、眼瞼辺縁を無希釈の５％のベタジン溶液でぬぐった。上耳側の眼球結膜を無希釈ベタジン溶液でぬぐった。Ｊａｍｅｓｏｎ社のカリパスを上耳側の眼球結膜上の縁郭の１．５〜２．０ｍｍ後部の箇所に印をつけるために使用した。印をつけた箇所において強膜を通して５ｍｍ先の硝子体液に注入シリンジに固着した針を右手で挿入しながら、左手で眼球位置を固定するために結膜鑷子を使用した。注入針を眼球の後部軸に対面するように位置付け、シリンジプランジャーをゆっくりと押し下げることにより含有物を硝子体の真ん中に送達した。注入シリンジに固着した針を引き抜き、強膜上組織を結膜鑷子で捉えた挿入の部位に３０秒間接近させて、注入材料の還流を低下した。投薬部位の残留放射能をぬぐった。調製及び用量投与を第２の目に対して同じ方法で繰り返した。手順の間、適切な試験物質を濡れ氷上に置いておき、片方の目につき５０μＬの用量体積で１回投与した。注入後に間接的な検眼鏡検査を実施して、レンズまたは網膜接触が生じていないかを確認した。各注入部位のふき取った投薬を収集し、室温で保持して、液体シンチレーション計数（ＬＳＣ）により分析して、残留放射能を決定した。回収した放射能を投与量から控除して、実際に投与した放射性用量を出した。

【0546】

投薬前、投薬６時間後、ならびに投薬１、２、４、７、１１、１４、２１、及び２８日後に血液試料を動物の頸静脈から収集して、室温で抗凝固薬を含まない管に入れた。全血液の分割量（およそ０．１ｍＬ）を収集し、放射分析のために処理した。残りの血液を周囲温度で遠心分離にかけて血清を得、放射分析のために処理した。

【0547】

各時点、２匹の動物を安楽死溶液の静脈注射により安楽死させ、続いて、聴診した。終末時点は、投薬６時間後、ならびに投薬２、７、１４、２１、及び２８日後であった。水様液、レンズ、硝子体液、網膜／脈絡膜、及び強膜を指定の動物から収集した。目を取り出し、任意の異常組織を眼球の外側から切り落とした。ツベルクリン針を有するシリンジを介して水様液を除去し、事前に計量したガンマ管に収集して入れた。残りの目を液体窒素内でおよそ３０秒間凍結させた。冷却した切断表面において、角膜、虹彩、及びレンズを取り出した。レンズを少量のＰＢＳですすぎ、リンス液をガンマ管に収集して入れた。レンズを吸い取り乾燥させ、事前に計量したガンマ管内に置いた。必要に応じて、目を液体窒素内で再凍結させた。強膜を切断し、硝子体液から後方に剥いだ。硝子体液を取り出して、事前に計量した容器内に可溶化のために置いた。結合する網膜／脈絡膜を有する強膜を、前述のリンス液と共に貯めたＰＢＳの１ｍｌのリンス液中に浸漬し、組織を丁寧に吸い取り乾燥させた。網膜／脈絡膜を強膜から除去し、別々の事前に計量したガンマ管内に置いた。適切な表面及び器具を濡れガーゼでふき取り、計数のためにガンマ管に収集して入れた。全ての組織、リンス液、及びふき取り物をプラスチック容器に収集して入れ、放射分析のために処理した。

【0548】

選択動物からの各時点につき１つの目（投薬２、１４、及び２８日後時点の動物を含む）を、硝子体液の放射クロマトグラフプロファイリングのために処理した。右目を取り出し、異常組織を眼球の外側から切り落とした。ツベルクリン針を有するシリンジを介して水様液を除去し、事前に計量したガンマ管内に置いた。１８ゲージの針を有する１０ｍｌのシリンジを使用して、最大量の硝子体液を収集した。含有物をＨＰＬＣ−Ｇａｍｍａ−ＲＡＭ（商標）による分析のために事前に計量した容器に移した。硝子体液試料を放射クロマトグラフプロファイリングのために冷蔵したままか、または濡れ氷上で保存した。残りの右目組織を可溶化のために事前に計量した容器内に置き、放射分析のために処理した。

【0549】

投薬製剤、血清、及び全血液の単一または複製分割量をよく混合し、ガンマ計数による放射能の直接分析のために試料採取した。眼の組織を直接計数して、ＰＢＳ中で希釈するか、または３ＮのＫＯＨ／メタノール／ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００の溶液中に、およそ５０℃に設定したインキュベートオーブン内で可溶化し、ガンマ計数による放射能分析のために三連で試料採取した。収集した全ての放射性試料を二連または三連の許容範囲の試料サイズで少なくとも５分間または１００，０００カウントの間計数した。２００ｄｐｍ超の放射能を有した全ての試料結果（ｄｐｍ／ｇの試料で計算した）は、中央値の１５％以内であった。

【0550】

放射クロマトグラフプロファイリングを、投薬２、１４、及び２８時間後の１匹の動物からの右目硝子体液試料で実施した。試料をＨＰＬＣ−Ｇａｍｍａ−ＲＡＭ（商標）による適格な方法に従って分析した。ピーク域及び保持時間を、時間経過における試験物質の一体性を査定するために比較した。試料を調製するために、ＰＲＥＣＥＬＬＹＳ（登録商標）２４ホモジナイザーを、冷却窒素流を用いて−１０〜０℃に事前に冷却した。ジルコニアビーズを適切な管に添加した。ポジティブ配置用ピペットを用いて、ジルコニアビーズを含む管に硝子体液の試料を添加した。試料を事前に冷却したＰＲＥＣＥＬＬＹＳ（登録商標）２４ホモジナイザー内に置き、６，５００ＲＰＭで６０秒のサイクルを６回で均質にした。管を１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離にかけ、その後、分析した。

【0551】

ＰＨＯＥＮＩＸ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．２．１（Ｃｅｒｔａｒａ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を使用して、薬物動態パラメータを予測した。投与の硝子体内経路と一貫している非コンパートメント手法をパラメータ予測のために使用した。ウサギ硝子体内のＨＡ１００Ｋ−ｒａｂＦａｂ−^１２５Ｉの半減期の値は、履歴データからのｒａｂＦａｂの３．２日と比較して１１．９日であった（Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１６；ＰｕｂＭｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＰＭＩＤ）２７２４４４７４）。

【0552】

前述の発明は明確な理解のために例証及び例により多少詳しく説明されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]