特許 6960950 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6960950

(24)【登録日】2021年10月14日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20211025BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20211025BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20211025BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 110

   C12N15/86 ZZNA

   C12N15/861 Z

   C12N15/864 100

   C12N15/867 Z

   C12N15/869 Z

   A01H1/00 A

   A01K67/027

【請求項の数】20

【外国語出願】

【全頁数】111

(21)【出願番号】特願2019-39723(P2019-39723)

(22)【出願日】2019年3月5日

(62)【分割の表示】特願2015-547573(P2015-547573)の分割

【原出願日】2013年12月12日

(65)【公開番号】特開2019-103510(P2019-103510A)

(43)【公開日】2019年6月27日

【審査請求日】2019年4月3日

(31)【優先権主張番号】61/814,263

(32)【優先日】2013年4月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/828,130

(32)【優先日】2013年5月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/736,527

(32)【優先日】2012年12月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/835,931

(32)【優先日】2013年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/791,409

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/802,174

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/836,127

(32)【優先日】2013年6月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/758,468

(32)【優先日】2013年1月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/748,427

(32)【優先日】2013年1月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/769,046

(32)【優先日】2013年2月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/806,375

(32)【優先日】2013年3月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/819,803

(32)【優先日】2013年5月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515236259

【氏名又は名称】ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】507324290

【氏名又は名称】マサチューセッツ・インスティトュート・オブ・テクノロジー

(73)【特許権者】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】フェン・ジャン

(72)【発明者】

【氏名】レ・コン

(72)【発明者】

【氏名】パトリック・シュウ

(72)【発明者】

【氏名】フェイ・ラン

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１６−５０２８４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０２１７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１４６１２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５１０８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０６４７３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Science, Aug 2012, Vol.337, p.816-821, Supplementary Materials

【文献】 Nucleic Acids research, 2011, Vol.39, p.9275-9282

【文献】 Biology Direct, 2011, Vol.6, 38

【文献】 Gene Therapy, 2008, Vol.15, p.1463-1468

【文献】 Methods, 2011, Vol.53, p.339-346

【文献】 Nature Biotechnology, 2011, Vol.29, p.143-148

【文献】 Nucleic Acids Research, 2011, Vol.39, e82

【文献】 Biochimica et Biophysica Acta, 2006, Vol.1758, p.355-363

【文献】 The Journal of Cell Biology, 1988, Vol.107, p.1279-1287

【文献】 PNAS, 2011, Vol.108, p.E351-E358

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エンジニアリングされた、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系であって、
ａ）１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント、
ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントであって、前記キメラＲＮＡが、真核細胞の核に存在する標的配列にハイブリダイズすることができ、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を指向することができるガイド配列、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズできるｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含み、ここで、前記ｔｒａｃｒ配列は、３０以上の長さのヌクレオチドである、第２の調節エレメント、ならびに
ｃ）標的化された遺伝子挿入のための外因性ポリヌクレオチド
を含む１つ以上のベクターを含み、
成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、前記系の同じまたは異なるベクター上に位置する、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクター系。

【請求項2】

前記成分（ａ）および（ｂ）が、同じベクター上に位置する、請求項１に記載の系。

【請求項3】

前記成分（ａ）および（ｂ）が、異なるベクター上に位置する、請求項１に記載の系。

【請求項4】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。

【請求項5】

前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴または単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項４に記載の系。

【請求項6】

エンジニアリングされた、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、
ａ）１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９タンパク質、又は前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
ｂ）真核細胞の核に存在する標的配列にハイブリダイズすることができ、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の配列特異的結合を指向することができるガイド配列、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズできるｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含み、ここで、前記ｔｒａｃｒ配列は、３０以上の長さのヌクレオチドである、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ、
ｃ）標的化された遺伝子挿入のための外因性ポリヌクレオチド
を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。

【請求項7】

前記ｔｒａｃｒ配列が、少なくとも４０の長さのヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。

【請求項8】

前記ｔｒａｃｒ配列が、少なくとも５０の長さのヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の系。

【請求項9】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、対応する野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して変異しており、変異タンパク質が、標的ポリヌクレオチドの一方の鎖を開裂する能力が欠如したニッカーゼである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の系。

【請求項10】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩまたはＲｕｖＣＩＩＩ触媒ドメインにおける１つ以上の変異を含む、請求項９に記載の系。

【請求項11】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質の付番位置を参照したＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａからなる群から選択される変異を含む、請求項１０に記載の系。

【請求項12】

成分（ｃ）が、前記成分（ａ）および（ｂ）とは別個のベクターに含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の系。

【請求項13】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、２つ以上のＮＬＳを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の系。

【請求項14】

少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９タンパク質のアミノ末端に、もしくは、その付近に存在し、および／または、少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９タンパク質のカルボキシ末端に、もしくは、その付近に存在する、請求項１３に記載の系。

【請求項15】

少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９タンパク質のアミノ末端に、もしくは、その付近に存在し、および、少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９タンパク質のカルボキシ末端に、もしくは、その付近に存在する、請求項１４に記載の系。

【請求項16】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系。

【請求項17】

前記真核細胞が、哺乳動物の細胞またはヒト細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の系。

【請求項18】

前記Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の系。

【請求項19】

ゲノムエンジニアリングのための請求項１〜１８のいずれか一項に記載の系の使用であって、人間の生殖系列の遺伝的同一性を改変するためのプロセスを含まず、人体における病気の治療または予防のための方法ではなく、人体へ前記系を投与する工程を含まない、使用。

【請求項20】

非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の系の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願および参照による組み込み
本出願は、２０１３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／８３６，１２７号明細書、標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮの優先権を主張する。本出願は、米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；同第６１／７６９，０４６号明細書；同第６１／８０２，１７４号明細書；同第６１／８０６，３７５号明細書；同第６１／８１４，２６３号明細書；同第６１／８１９，８０３号明細書および同第６１／８２８，１３０号明細書の優先権も主張し、それぞれ標題ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮであり、それぞれ２０１３年１月３０日；２０１３年２月２５日；２０１３年３月１５日；２０１３年３月２８日；２０１３年４月２０日；２０１３年５月６日および２０１３年５月２８日に出願されたものである。それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願された両方とも標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮの米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書の優先権も主張される。それぞれ２０１３年３月１５日および２０１３年６月１７日に出願された両方とも標題ＢＩ−２０１１／００８／４４７９０．０２．２００３およびＢＩ−２０１１／００８／４４７９０．０３．２００３の米国仮特許出願第６１／７９１，４０９号明細書および同第６１／８３５，９３１号明細書の優先権も主張される。
２０１３年６月１７日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３６，１２３号明細書および同第６１／８３５，９７３号明細書も参照される。

【0002】

上記の出願、ならびにそれらの出願においてまたはそれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）およびその出願引用文献において引用または参照される全ての文献、ならびに本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書においてまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文献において挙げられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれの個々の文献が個別具体的に参照により組み込まれることが示されるような程度で参照により組み込まれる。

【0003】

本発明は、一般に、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）およびその成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティング、例えば、ゲノム摂動または遺伝子編集を含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法および組成物に関する。

【0004】

連邦政府により資金提供された研究に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、ＮＩＨパイオニアアワードＤＰ１ＭＨ１００７０６により助成された政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0005】

ゲノムシーケンシング技術および分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノムターゲティング技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより因果的遺伝子変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、ならびに合成生物学、バイオテクノロジーおよび医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼがターゲティングされるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数位置をターゲティングしやすい新たなゲノムエンジニアリング技術が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第４，８７３，３１６号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

多彩な用途の配列ターゲティングのための代替的で堅牢な系および技術が差し迫って必要とされている。本発明は、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（両方の用語は、本出願全体にわたり互換的に使用される）は特異的配列をターゲティングするためにカスタム化タンパク質の生成を要求しないが、単一Ｃａｓ酵素を短鎖ＲＮＡ分子によりプログラミングして特異的ＤＮＡ標的を認識させることができ、換言すると、Ｃａｓ酵素は、前記短鎖ＲＮＡ分子を使用して特異的ＤＮＡ標的にリクルートすることができる。ゲノムシーケンシング技術および分析法のレパートリーへのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の付加により方法論が顕著に簡易化され、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝因子を分類およびマッピングする技能が加速される。有害効果を有さずにゲノム編集にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有効に利用するため、特許請求される本発明の態様であるそれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリングおよび最適化の態様を理解することが重要である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、細胞中、例えば真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み；成分（ａ）および（ｂ）は、系の同一または異なるベクター上にある。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でｔｒａｃｒ配列を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。理論により拘束されるものではないが、核局在化配列は、真核生物中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要でないが、そのような配列を含めることにより、特に核中の核酸分子のターゲティングに関して系の活性が向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一般に、および本明細書全体で、用語「ベクター」は、それが結合した別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由末端を含み、自由末端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および当技術分野において公知の他の種々のポリヌクレオチドが挙げられる。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、付加ＤＮＡセグメントを例えば標準分子クローニング技術により挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、それにおいてウイルス由来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する。ウイルスベクターとしては、宿主細胞中への形質移入のためにウイルスにより担持されるポリヌクレオチドも挙げられる。あるベクターは、それが導入された宿主細胞中で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入時に宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それが作動的に結合している遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。

【0009】

組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得、そのことは、組換え発現ベクターが、発現に使用すべき宿主細胞に基づき選択することができ、発現させるべき核酸配列に作動的に結合している１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクターのうち、「作動可能に結合している」は、目的ヌクレオチド配列が調節エレメントに、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系またはベクターが宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞中で）を可能とするように結合していることを意味するものとする。

【0010】

用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節エレメントとしては、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよびある宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的組織、例えば、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特異的臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球）中で発現を指向し得る。調節エレメントは、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的または発生段階依存的様式の発現も指向し得、それは、組織または細胞タイプ特異的であってもなくてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多いｐｏｌＩプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌＩＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、Ｕ６およびＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌＩＩプロモーターの例としては、限定されるものではないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」により、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者により認識される。ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされる転写物、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体、それらの融合タンパク質など）を産生することができる。

【0011】

有利なベクターとしては、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられ、そのようなベクターのタイプは、特定のタイプの細胞のターゲティングのために選択することもできる。

【0012】

一態様において、本発明は、１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、前記調節エレメントは真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ酵素の転写を、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が真核細胞の核中で検出可能な量で蓄積するようにドライブする。一部の実施形態において、調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。

【0013】

一態様において、本発明は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素を提供する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、それが結合する標的配列の１つ以上の鎖を開裂する能力を欠く。

【0014】

一態様において、本発明は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む真核宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）および（ｂ）は、宿主真核細胞のゲノム中に安定的にインテグレートされている。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、真核宿主細胞は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。一態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む非ヒト真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載の実施形態のいずれかによる真核宿主細胞を含む真核生物；好ましくは、多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物；例えば、哺乳動物であり得る。また、生物は、節足動物、例えば、昆虫であり得る。生物は、植物でもあり得る。さらに、生物は、真菌であり得る。

【0015】

一態様において、本発明は、本明細書に記載の成分の１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列および１つ以上のガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。一部の実施形態において、キットは、系の同一または異なるベクター上にある成分（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントの制御下でｔｒａｃｒメイト配列の下流のｔｒａｃｒ配列をさらに含む。一部の実施形態において、成分（ａ）は、第１の調節エレメントに作動可能に結合している２つ以上のガイド配列をさらに含み、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、発現された場合、真核細胞中の異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、系は、前記ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメント、例えば、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合にｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列相補性を示す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞の核中の検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９酵素は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９であり、それらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含み得る。酵素は、Ｃａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における１つまたは２つの鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖開裂活性を欠く。一部の実施形態において、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、ガイド配列は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１０〜３０、もしくは１５〜２５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド長である。

【0016】

一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、前記ベクターを対象中の真核細胞中に送達する。一部の実施形態において、前記改変を、細胞培養物中の前記真核細胞中で行う。一部の実施形態において、方法は、前記改変前に前記真核細胞を対象から単離することをさらに含む。一部の実施形態において、方法は、前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む。

【0017】

一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。一部の実施形態において、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする。

【0018】

一態様において、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現をドライブする）および（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の局在における１つまたは２つの鎖を開裂することを含む。一部の実施形態において、前記開裂は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。一部の実施形態において、方法は、外因性テンプレートポリヌクレオチドとの相同組換えにより前記開裂標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態において、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。

【0019】

一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナリングイベントをモジュレートする生物活性剤を開発する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患遺伝子は、疾患を有し、または発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態において、方法は、（ａ）試験化合物を、記載の実施形態のいずれか１つのモデル細胞と接触させること；および（ｂ）前記疾患遺伝子中の前記突然変異に関連する細胞シグナリングイベントの低減または増大を示すリードアウトの変化を検出し、それにより、前記疾患遺伝子に関連する前記細胞シグナリングイベントをモジュレートする前記生物活性剤を開発することを含む。

【0020】

一態様において、本発明は、ｔｒａｃｒメイト配列の上流のガイド配列を含む組換えポリヌクレオチドであって、ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中に存在する対応する標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する組換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞中に存在するウイルス配列である。一部の実施形態において、標的配列は、原癌遺伝子または癌遺伝子である。

【0021】

一態様において、本発明は、１つ以上の原核細胞中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を導入することにより１つ以上の原核細胞を選択する方法であって、１つ以上のベクターを原核細胞中に導入すること（１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、および編集テンプレートの１つ以上の発現をドライブし；編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素開裂を停止させる１つ以上の突然変異を含む）；編集テンプレートと、選択すべき細胞中の標的ポリヌクレオチドとを相同組換えさせること；ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導する）、それにより、１つ以上の突然変異が導入された１つ以上の原核細胞の選択を可能とすることを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９である。本発明の別の態様において、選択すべき細胞は、真核細胞であり得る。本発明の態様により、選択マーカーもカウンターセレクション系を含み得る２ステッププロセスも要求しない規定の細胞の選択が可能となる。

【0022】

一部の態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列は、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列ｖｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物
または
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ポリヌクレオチド配列は、（ａ）真核細胞中の１つ以上の標的配列にハイブリダイズし得る１つ以上のガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒメイト配列、および（ｃ）１つ以上のｔｒａｃｒ配列を含む）、およびＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’配向で配置されており、成分ＩおよびＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む１つ以上のベクターを含むベクター系によりコードされるＣＲＩＳＰＲ酵素系、またはＩ．（ａ）細胞中の標的配列にハイブリダイズし得る１つ以上のガイド配列、および（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメント、ならびにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に作動可能に結合している第３の調節エレメントを含み、成分Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、系の同一または異なるベクター上にあり、転写されるとｔｒａｃｒメイト配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、多重化系において、複数のガイド配列および単一のｔｒａｃｒ配列が使用される１つ以上のベクターを含むベクター系によりコードされる多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系（ガイド、ｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト配列の１つ以上は、安定性を改善するように改変されている）を提供する。

【0023】

本発明の態様において、改変は、エンジニアリングされた二次構造を含む。例えば、改変は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との間のハイブリダイゼーションの領域の低減を含み得る。例えば、改変は、人工ループを通すｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の融合も含み得る。改変は、４０〜１２０ｂｐの長さを有するｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、４０ｂｐから全長のｔｒａｃｒである。ある実施形態において、ｔｒａｃＲＮＡの長さは、野生型ｔｒａｃＲＮＡの少なくともヌクレオチド１〜６７を含み、一部の実施形態において、少なくともヌクレオチド１〜８５を含む。一部の実施形態において、少なくとも野生型化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｔｒａｃＲＮＡのヌクレオチド１〜６７または１〜８５に対応するヌクレオチドを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ系がＣａｓ９以外、またはＳｐＣａｓ９以外の酵素を使用する場合、関連野生型ｔｒａｃＲＮＡ中の対応するヌクレオチドが存在し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃＲＮＡの長さは、野生型ｔｒａｃＲＮＡのヌクレオチド１〜６７または１〜８５以下を含む。改変は、配列最適化を含み得る。ある態様において、配列最適化は、ｔｒａｃｒおよび／またはｔｒａｃｒメイト配列中のポリＴ配列の出現率の低減を含み得る。配列最適化は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列との間のハイブリダイゼーションの領域の低減；例えば、ｔｒａｃｒ配列の長さの低減と組み合わせることができる。

【0024】

一態様において、本発明は、改変が、ｔｒａｃｒおよび／またはｔｒａｃｒメイト配列中のポリＴ配列の低減を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。本発明の一部の態様において、関連野生型配列のポリＴ配列中に存在する１つ以上のＴ（すなわち、３、４、５、６つ、またはそれよりも多い数を超える連続Ｔ塩基のストレッチ；一部の実施形態において、１０、９、８、７、６つ以下の連続Ｔ塩基のストレッチ）を、非Ｔヌクレオチド、例えば、Ａにより置換することができ、したがって、ストリングがＴのより小さいストレッチに分解され、それぞれのストレッチは、４つ、または４つ未満（例えば、３または２つ）の連続Ｔを有する。Ａ以外の塩基、例えば、ＣもしくはＧ、または天然に存在しないヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドを置換に使用することができる。Ｔのストリングがヘアピン（またはステムループ）の形成に関与する場合、非Ｔ塩基についての相補的塩基を非Ｔヌクレオチドの相補鎖に変えることが有利である。例えば、非Ｔ塩基がＡである場合、その相補鎖をＴに変え、例えば、二次構造を保存し、またはその保存を支援することができる。例えば、５’−ＴＴＴＴＴを５’−ＴＴＴＡＴになるように変更し、相補的な５’−ＡＡＡＡＡを５’−ＡＴＡＡＡに変えることができる。

【0025】

一態様において、本発明は、改変が、ポリＴターミネーター配列を付加することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ｔｒａｃｒおよび／またはｔｒａｃｒメイト配列中のポリＴターミネーター配列を付加することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ガイド配列中のポリＴターミネーター配列を付加することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。ポリＴターミネーター配列は、５つの連続Ｔ塩基、または５つを超える連続Ｔ塩基を含み得る。

【0026】

一態様において、本発明は、改変が、ループおよび／またはヘアピンを変更することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ガイド配列中の最少の２つのヘアピンを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ｔｒａｃｒとｔｒａｃｒメイト（ダイレクトリピート）配列との間の相補性により形成されるヘアピンを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の３’末端における、またはそれに向かう１つ以上のさらなるヘアピンを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。例えば、ヘアピンは、ヘアピンが自己フォールディング時に形成されるように、ループにより結合しているｔｒａｃＲＮＡ配列内の自己相補的配列を提供することにより形成することができる。一態様において、本発明は、改変が、ガイド配列の３’に付加される追加のヘアピンを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ガイド配列の５’末端を伸長させることを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、ガイド配列の５’末端中の１つ以上のヘアピンを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、配列（５’−ＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＡＡ）をガイド配列の５’末端に追加することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。ヘアピンの形成に好適な他の配列は、当業者に公知であり、本発明のある態様において使用することができる。本発明の一部の態様において、少なくとも２、３、４、５つ、またはそれよりも多い追加のヘアピンが提供される。本発明の一部の態様において、１０、９、８、７、６つ以下の追加のヘアピンが提供される。一態様において、本発明は、改変が、２つのヘアピンを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、３つのヘアピンを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、改変が、多くとも５つのヘアピンを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0027】

一態様において、本発明は、改変が、架橋を提供すること、またはポリヌクレオチド配列中の１つ以上の修飾ヌクレオチドを提供することを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。修飾ヌクレオチドおよび／または架橋は、ｔｒａｃｒ、ｔｒａｃｒメイト、および／もしくはガイド配列のいずれかもしくは全てにおいて、ならびに／または酵素コード配列において、ならびに／またはベクター配列において提供することができる。改変は、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、またはそれらのアナログの包含を含み得る。修飾ヌクレオチドは、リボース、ホスフェート、および／または塩基部分において修飾されていてよい。修飾ヌクレオチドとしては、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、または２’−フルオロアナログを挙げることができる。核酸骨格を修飾することができ、例えば、ホスホロチオエート骨格を使用することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）の使用も可能であり得る。修飾塩基のさらなる例としては、限定されるものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。

【0028】

上記の改変のいずれかまたは全てを、単独で、または組合せで所与のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系において提供することができることが理解される。このような系は、前記改変の１、２、３、４、５つ、またはそれよりも多い数を含み得る。

【0029】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、例えば、Ｃａｓ９酵素であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が１０００未満のアミノ酸、または４０００未満のアミノ酸を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、Ｃａｓ９酵素がＳｔＣａｓ９もしくはＳｔｌＣａｓ９であり、またはＣａｓ９酵素が、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ニトラティフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パービバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アゾスピリラム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、スフェロケタ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはコリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）の属からなる群から選択される生物からのＣａｓ９酵素であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列の局在における両方の鎖の開裂を指向するヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0030】

一態様において、本発明は、第１の調節エレメントがポリメラーゼＩＩＩプロモーターであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。一態様において、本発明は、第２の調節エレメントがポリメラーゼＩＩプロモーターであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0031】

一態様において、本発明は、ガイド配列が少なくとも１５ヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0032】

一態様において、本発明は、改変が、最適化ｔｒａｃｒ配列ならびに／または最適化ガイド配列ＲＮＡならびに／またはｔｒａｃｒ配列および／もしくはｔｒａｃｒメイト配列の同時フォールド（ｃｏ−ｆｏｌｄ）構造ならびに／またはｔｒａｃｒ配列の安定化二次構造ならびに／または塩基対形成の低減した領域を有するｔｒａｃｒ配列ならびに／またはｔｒａｃｒ配列融合ＲＮＡエレメントを含み；および／または多重化系において、ｔｒａｃｅｒを含み、複数のガイドを含む２つのＲＮＡまたは複数のキメラを含む１つのＲＮＡが存在するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0033】

本発明の態様において、キメラＲＮＡアーキテクチャーは、突然変異導入試験の結果に従ってさらに最適化される。２つ以上のヘアピンを有するキメラＲＮＡにおいて、ヘアピンを安定化するための近位ダイレクトリピート中の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性の停止をもたらし得る。ヘアピンを短縮または安定化するための遠位ダイレクトリピート中の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性に対する影響を有さないことがある。近位リピートと遠位リピートとの間のバルジ領域中の配列ランダム化は、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性を顕著に低減させ得る。ヘアピン間のリンカー領域中の単一の塩基対変化または配列ランダム化は、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性の完全な損失をもたらし得る。ガイド配列後の第１のヘアピンに続く遠位ヘアピンのヘアピン安定化は、ＣＲＩＳＰＲ複合体活性の維持または改善をもたらし得る。したがって、本発明の好ましい実施形態において、キメラＲＮＡアーキテクチャーは、治療送達の任意選択および他の使用に有益であり得るより小さいキメラＲＮＡを生成することによりさらに最適化することができ、このことは、ヘアピンを短縮または安定化するように遠位ダイレクトリピートを変更することにより達成することができる。本発明のさらに好ましい実施形態において、キメラＲＮＡアーキテクチャーは、遠位ヘアピンの１つ以上を安定化することによりさらに最適化することができる。ヘアピンの安定化は、ヘアピンの形成に好適な配列の改変を含み得る。本発明の一部の態様において、少なくとも２、３、４、５つ、またはそれよりも多い追加のヘアピンが提供される。本発明の一部の態様において、１０、９、８、７、６つ以下の追加のヘアピンが提供される。本発明の一部の態様において、安定化は、架橋および他の改変であり得る。改変は、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、またはそれらのアナログの包含を含み得る。修飾ヌクレオチドは、リボース、ホスフェート、および／または塩基部分において修飾されていてよい。修飾ヌクレオチドとしては、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、または２’−フルオロアナログを挙げることができる。核酸骨格を修飾することができ、例えば、ホスホロチオエート骨格を使用することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）の使用も可能であり得る。修飾塩基のさらなる例としては、限定されるものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。

【0034】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が真核細胞中の発現のためにコドン最適化されているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ酵素系を提供する。

【0035】

したがって、本発明の一部の態様において、本発明の構築物、例えば、キメラ構築物において要求されるｔｒａｃＲＮＡの長さは、必ずしも固定する必要はなく、本発明の一部の態様において、それは４０〜１２０ｂｐであり得、本発明の一部の態様において、最大で全長のｔｒａｃｒであり、例えば、本発明の一部の態様において、細菌ゲノム中の転写終結シグナルにより中断されるｔｒａｃｒの３’末端までである。ある実施形態において、ｔｒａｃＲＮＡの長さは、野生型ｔｒａｃＲＮＡの少なくともヌクレオチド１〜６７を含み、一部の実施形態において、少なくともヌクレオチド１〜８５を含む。一部の実施形態において、少なくとも野生型化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ｔｒａｃＲＮＡのヌクレオチド１〜６７または１〜８５に対応するヌクレオチドを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ系がＣａｓ９以外、またはＳｐＣａｓ９以外の酵素を使用する場合、関連野生型ｔｒａｃＲＮＡ中の対応するヌクレオチドが存在し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃＲＮＡの長さは、野生型ｔｒａｃＲＮＡのヌクレオチド１〜６７または１〜８５以下を含む。配列最適化（例えば、ポリＴ配列の低減）に関して、例えば、ｔｒａｃｒメイト（ダイレクトリピート）またはｔｒａｃｒＲＮＡ内部のＴのストリングに関して、本発明の一部の態様において、関連野生型配列のポリＴ配列中に存在する１つ以上のＴ（すなわち、３、４、５、６つ、またはそれよりも多い数を超える連続Ｔ塩基のストレッチ；一部の実施形態において、１０、９、８、７、６つ以下の連続Ｔ塩基のストレッチ）を、非Ｔヌクレオチド、例えば、Ａにより置換することができ、したがって、ストリングがＴのより小さいストレッチに分解され、それぞれのストレッチは、４つ、または４つ未満（例えば、３または２つ）の連続Ｔを有する。Ｔのストリングがヘアピン（またはステムループ）の形成に関与する場合、非Ｔ塩基についての相補的塩基を非Ｔヌクレオチドの相補鎖に変えることが有利である。例えば、非Ｔ塩基がＡである場合、その相補鎖をＴに変え、例えば、二次構造を保存し、またはその保存を支援することができる。例えば、５’−ＴＴＴＴＴを５’−ＴＴＴＡＴになるように変更し、相補的な５’−ＡＡＡＡＡを５’−ＡＴＡＡＡに変えることができる。ｔｒａｃｒ＋ｔｒａｃｒメイト転写物中のポリＴターミネーター配列、例えば、ポリＴターミネーター（ＴＴＴＴＴまたはそれより多い数のＴ）の存在に関して、本発明の一部の態様において、２つのＲＮＡ（ｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト）であろうと単一ガイドＲＮＡ形態であろうと、このようなものを転写物の末端に付加することが有利である。ｔｒａｃｒおよびｔｒａｃｒメイト転写物中のループおよびヘアピンに関して、本発明の一部の態様において、最少の２つのヘアピンがキメラガイドＲＮＡ中に存在することが有利である。第１のヘアピンは、ｔｒａｃｒとｔｒａｃｒメイト（ダイレクトリピート）配列との間の相補性により形成されるヘアピンであり得る。第２のヘアピンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の３’末端におけるものであり得、これは、Ｃａｓ９との相互作用のための二次構造を提供し得る。追加のヘアピンは、ガイドＲＮＡの３’に付加し、例えば、本発明の一部の態様において、ガイドＲＮＡの安定性を増加させることができる。さらに、ガイドＲＮＡの５’末端は、本発明の一部の態様において、伸長させることができる。本発明の一部の態様において、５’末端中の２０ｂｐをガイド配列とみなすことができる。５’部分は伸長させることができる。１つ以上のヘアピンは、５’部分中で提供することができ、例えば、本発明の一部の態様において、これは、ガイドＲＮＡの安定性も改善し得る。本発明の一部の態様において、規定のヘアピンは、配列（５’−ＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＡＡ）をガイド配列の５’末端に追加することにより提供することができ、本発明の一部の態様において、これは、安定性の改善に役立ち得る。ヘアピンの形成に好適な他の配列は、当業者に公知であり、本発明のある態様において使用することができる。本発明の一部の態様において、少なくとも２、３、４、５つ、またはそれよりも多い追加のヘアピンが提供される。本発明の一部の態様において、１０、９、８、７、６つ以下の追加のヘアピンが提供される。上記のものは、ガイド配列中の二次構造を含む本発明の態様も提供する。本発明の一部の態様において、例えば、安定性を改善するための架橋および他の改変が存在し得る。改変は、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、またはそれらのアナログの包含を含み得る。修飾ヌクレオチドは、リボース、ホスフェート、および／または塩基部分において修飾されていてよい。修飾ヌクレオチドとしては、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、または２’−フルオロアナログを挙げることができる。核酸骨格を修飾することができ、例えば、ホスホロチオエート骨格を使用することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）の使用も可能であり得る。修飾塩基のさらなる例としては、限定されるものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。このような改変または架橋は、ガイド配列またはガイド配列に隣接する他の配列中に存在し得る。

【0036】

したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に公知の生成物、作製方法、または使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（欧州特許条約第８３条）の記載要件および実施可能要件を満たさない任意の生成物、方法、または生成物の作製または生成物の使用方法を、本発明の範囲に包含しないものとし、したがって、本出願人らは、その権利を保有し、任意の既に記載の生成物、その生成物の作製方法、またはその生成物の使用方法の放棄を本明細書に開示することがさらに留意される。

【0037】

本開示および特に特許請求の範囲および／または段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得；「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法に帰属する意味を有し、例えば、それらは、明示的に記述されない構成要素を許容するが、先行技術に見出され、または本発明の基本もしくは新規特徴に影響する構成要素を排除することが留意される。これらのおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示され、またはそれから明らかであり、それにより包含される。

【0038】

本発明の新規特徴を、特に添付の特許請求の範囲を用いて記載する。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される説明的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより得られる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】ＣＲＩＳＰＲ系の模式的モデルを示す。化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）を、２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によりゲノムＤＮＡにターゲティングする。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、およびＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流の二本鎖切断（ＤＳＢ）（赤色三角）を媒介する。

【図2A】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2B】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2C】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2D】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2E】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図2F】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、考えられる作用機序、真核細胞中の発現の例示的適応、ならびに核局在化およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。

【図3】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的発現カセット、例示的ガイド配列の予測構造、ならびに真核および原核細胞中で計測されたＣＲＩＳＰＲ系活性を示す。

【図4A】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図4B】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図4C】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図4D】例示的標的についてのＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。

【図5A】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5B】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5C】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5D】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5E】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5F】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図5G】例示的ベクター系および真核細胞中の相同組換えの指向におけるその使用についての結果を示す。

【図6A】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を説明する。

【図6B】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を説明する。

【図6C】Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについての異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を説明する。

【図7A】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を説明する。

【図7B】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を説明する。

【図7C】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を説明する。

【図7D】例示的ＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞中の発現のための例示的適応、およびＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を説明する。

【図8】哺乳動物細胞中のゲノム遺伝子座をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的操作を説明する。

【図9】哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングのノザンブロット分析の結果を説明する。

【図10A】キメラＲＮＡの模式的表示および真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を説明する。

【図10B】キメラＲＮＡの模式的表示および真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を説明する。

【図10C】キメラＲＮＡの模式的表示および真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を説明する。

【図11】真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を説明する。

【図12】ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む例示的キメラＲＮＡについての予測二次構造を説明する。

【図13A】Ｃａｓ遺伝子の系統発生樹である。

【図13B】Ｃａｓ遺伝子の系統発生樹である。

【図13C】Ｃａｓ遺伝子の系統発生樹である。

【図13D】Ｃａｓ遺伝子の系統発生樹である。

【図14A】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図14B】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図14C】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図14D】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図14E】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図14F】大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群および小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーを明らかにする系統発生分析を示す。

【図15】異なる最適化ガイドＲＮＡの機能を示すグラフを示す。

【図16】異なるガイドキメラＲＮＡの配列および構造を示す。

【図17】ｔｒａｃｒＲＮＡおよびダイレクトリピートの同時フォールド構造を示す。

【図18A】インビトロでのＳｔ１Ｃａｓ９キメラガイドＲＮＡ最適化からのデータを示す。

【図18B】インビトロでのＳｔ１Ｃａｓ９キメラガイドＲＮＡ最適化からのデータを示す。

【図19】ＳｐＣａｓ９細胞溶解物による非メチル化またはメチル化標的のいずれかの開裂を示す。

【図20】ＳｐＣａｓ９媒介哺乳動物ゲノム編集のためのガイドＲＮＡアーキテクチャーの最適化を示す。（ａ）全ての後続の実験において使用されたＵ６プロモーターによりドライブされる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣＢｈプロモーターによりドライブされるヒトコドン最適化化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｈＳｐＣａｓ９）のためのバイシストロニック発現ベクター（ＰＸ３３０）の模式図。ｓｇＲＮＡは、示される種々の位置においてトランケートされた２０ｎｔガイド配列（青色）および足場（赤色）からなる。（ｂ）ヒトＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す（ｎ＝３）。（ｃ）ローディング対照としてＵ１を用いる４つのｓｇＲＮＡトランケーションアーキテクチャーについてのノザンブロット分析。（ｄ）ＳｐＣａｓ９の野生型（ｗｔ）またはニッカーゼ突然変異体（Ｄ１０Ａ）の両方が、ヒトＥＭＸ１遺伝子中へのＨｉｎｄＩＩＩ部位の挿入を促進した。一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を、ゲノム配列に対してセンスまたはアンチセンス方向のいずれかで配向させ、相同組換えテンプレートとして使用した。（ｅ）ヒトＳＥＲＰＩＮＢ５遺伝子座の模式図。ｓｇＲＮＡおよびＰＡＭを配列上部の色付きバーにより示し；メチルシトシン（Ｍｅ）を強調し（桃色）、転写開始部位（ＴＳＳ、＋１）に対してナンバリングする。（ｆ）１６個のクローンのバイサルファイトシーケンシングによりアッセイされたＳＥＲＰＩＮＢ５のメチル化状態。黒色丸、メチル化ＣｐＧ；白色丸、非メチル化ＣｐＧ。（ｇ）ディープシーケンシングによりアッセイされたＳＥＲＰＩＮＢ５のメチル化領域をターゲティングする３つのｓｇＲＮＡによる改変効率（ｎ＝２）。エラーバーは、Ｗｉｌｓｏｎ区間（オンライン法）を示す。

【図21】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｇＲＮＡアーキテクチャーのさらなる最適化を示す。（ａ）４つの追加のｓｇＲＮＡアーキテクチャーＩ〜ＩＶの模式図。それぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡ（赤色）にハイブリダイズするダイレクトリピート（ＤＲ、灰色）に結合している２０ｎｔガイド配列（青色）からなる。ＤＲ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、示されるとおり＋１２または＋２２においてトランケートされており、人工ＧＡＡＡステムループを有する。ｔｒａｃｒＲＮＡトランケーション位置を、既に報告されているｔｒａｃｒＲＮＡについての転写開始部位に従ってナンバリングする。ｓｇＲＮＡアーキテクチャーＩＩおよびＩＶは、早期転写ターミネーターとして機能し得るそれらのポリＵトラクト内の突然変異を担持する。（ｂ）標的部位１〜３についてのヒトＥＭＸ１遺伝子座におけるＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す（ｎ＝３）。

【図22】ヒトゲノム中の一部の標的部位の可視化を説明する。

【図23】（Ａ）ｓｇＲＮＡの模式図および（Ｂ）最大開裂効率を有する最適なトランケートアーキテクチャーについてのＳａＣａｓ９についての５つのｓｇＲＮＡバリアントのＳＵＲＶＥＹＯＲ分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本明細書における図面は、説明目的のためのものにすぎず、必ずしも一定の縮尺で描画されるものではない。

【0041】

用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を遂行し得る。以下のものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から定義される遺伝子座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の改変は、存在する場合、ポリマーの集合前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合後に例えば標識成分とのコンジュゲーションによりさらに改変することができる。

【0042】

本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」は、標的部位を規定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐ配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用することができる。用語「ｔｒａｃｒメイト配列」も、用語「ダイレクトリピート」と互換的に使用することができる。

【0043】

本明細書において使用される用語「野生型」は、当業者により理解される当技術分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から区別される天然状態で生じるままの生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。

【0044】

本明細書において使用される用語「バリアント」は、天然状態で生じるものから逸脱するパターンを有する品質の提示を意味すると解釈すべきである。

【0045】

用語「天然に存在しない」または「エンジニアリングされた」は、互換的に使用され、人工の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然状態で天然に会合し、または天然状態で見出される少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

【0046】

「相補性」は、古典的ワトソン−クリック塩基対形成または他の非古典的タイプのいずれかによる別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列との水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成し得る核酸分子中の残基の割合を示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の全ての連続残基が第２の核酸配列中の同一数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれよりも多いヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指し、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

【0047】

本明細書において使用されるハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対する相補性を有する核酸が、標的配列と優位にハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長ければ、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度が高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。

【0048】

「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの開裂におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補鎖」と称される。

【0049】

ＣＲＩＳＰＲ系の成分に関して本明細書において使用される「安定化」または「安定性を増加させること」は、分子の構造を確保または定常化することに関する。このことは、単一または複数の塩基対変化、ヘアピン数の増加、架橋、ヌクレオチドの特定のストレッチの破壊および他の改変を含む１つまたは突然変異の導入により達成することができる。改変は、少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、またはそれらのアナログの包含を含み得る。修飾ヌクレオチドは、リボース、ホスフェート、および／または塩基部分において修飾されていてよい。修飾ヌクレオチドとしては、２’−Ｏ−メチルアナログ、２’−デオキシアナログ、または２’−フルオロアナログを挙げることができる。核酸骨格を修飾することができ、例えば、ホスホロチオエート骨格を使用することができる。ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）の使用も可能であり得る。修飾塩基のさらなる例としては、限定されるものではないが、２−アミノプリン、５−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン、イノシン、７−メチルグアノシンが挙げられる。これらの改変は、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分に当てはまり得る。好ましい実施形態において、これらの改変は、ＲＮＡ成分、例えば、ガイドＲＮＡまたはキメラポリヌクレオチド配列になされる。

【0050】

本明細書において使用される「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称することができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中のｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0051】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、改変、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションを受けたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣体を含む。

【0052】

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを指すために互換的に使用される。哺乳動物としては、限定されるものではないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。インビボで得られ、またはインビトロで培養される生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。一部の実施形態において、対象は、無脊椎動物、例えば、昆虫または線形動物であり得；他方、対象は、植物または真菌であり得る。

【0053】

用語「治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」、「治療可能薬剤」または「治療剤（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）」は、互換的に使用され、対象への投与時にいくつかの利益効果を付与する分子または化合物を指す。利益効果としては、診断測定の使用可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の改善；疾患、症状、障害または病態の軽減またはその発症の予防；および一般には疾患、症状、障害または病的状態の中和が挙げられる。

【0054】

本明細書において使用される「治療」もしくは「治療する」または「緩和する」または「改善する」は、互換的に使用される。これらの用語は、利益または所望の結果、例として、限定されるものではないが、治療利益および／または予防利益を得るためのアプローチを指す。治療利益は、治療中の１つ以上の疾患、病態、または症状の任意の治療関連改善またはそれらに対する効果を意味する。予防利益については、疾患も、病態も、症状もこれまで顕在化し得なかった場合であっても、組成物を特定の疾患、病態、もしくは症状の発症リスクのある対象に、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象に投与することができる。

【0055】

用語「有効量」または「治療有効量」は、利益または所望の結果を生じさせるために十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与様式などの１つ以上に応じて変動し得、それらは当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも当てはまる。規定の用量は、選択される特定の薬剤、遵守すべき投与レジメン、他の化合物との組合せで投与するか否か、投与のタイミング、イメージングすべき組織、およびそれが担持される物理的送達系の１つ以上に応じて変動し得る。

【0056】

本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの慣用の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。

【0057】

本発明のいくつかの態様は、１つ以上のベクターを含むベクター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターをインビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写および翻訳させることができる。

【0058】

ベクターは、原核細胞中に導入し、その中で増殖させることができる。一部の実施形態において、原核生物を使用して真核細胞中に導入すべきベクターのコピーを増幅し、または真核細胞中に導入すべきベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅）。一部の実施形態において、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の資源を提供する。原核生物中のタンパク質の発現は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中で、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれにコードされるタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現の増加；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度の増加；および（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の支援を果たし得る。融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解開裂部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とすることが多い。このような酵素、およびそのコグネート認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。例示的融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する。

【0059】

好適な誘導的非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。

【0060】

一部の実施形態において、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母の出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中の発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。

【0061】

一部の実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中のタンパク質発現をドライブする。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中のタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。

【0062】

一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現をドライブし得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクター制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示の他のものおよび当技術分野において公知のものに由来する。原核および真核細胞の両方のために他の好適な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照。

【0063】

一部の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中の核酸の発現を優先的に指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生制御プロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトタンパク質プロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。

【0064】

一部の実施形態において、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブするようにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；およびＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］参照）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には他のＳＳＲとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、前掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物中で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；およびＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］参照）、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロバス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーケオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポーフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザーカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミクソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびサーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）である。

【0065】

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現またはその活性の指向に関与する転写物および他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「ダイレクトリピート」およびｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分ダイレクトリピートを包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物を指す。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全相補性は必ずしも要求されず、但し、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性が存在することを条件とする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質中に局在している。一部の実施形態において、標的配列は、真核細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたはクロロプラスト内に存在し得る。標的配列を含むターゲティングされる遺伝子座中への組換えに使用することができる配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドを編集テンプレートと称することができる。本発明の一態様において、組換えは、相同組換えである。

【0066】

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体形成しているガイド配列を含む）は、標的配列中または付近（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれよりも多い塩基対内）の一方または両方の鎖の開裂をもたらす。理論により拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全部または一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約または約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）を含み得、またはそれからなっていてよく、例えば、ガイド配列に作動可能に結合しているｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部とのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿うハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するためにｔｒａｃｒメイト配列に対する十分な相補性を有する。標的配列と同様に、完全相補性は必要とされず、但し、機能的であるために十分な相補性が存在することを条件とすることが考えられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、最適にアラインされた場合、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現をドライブする１つ以上のベクターを宿主細胞中に導入し、その結果、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指向する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に結合しているガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に結合させることができる。あるいは、同一または異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上を単一ベクター中で合わせることができ、ＣＲＩＳＰＲ系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターは第１のベクター中に含まれない。単一ベクター中で合わせるＣＲＩＳＰＲ系エレメントは、任意の好適な配向で配置することができ、例えば、あるエレメントを第２のエレメントに対して５’側（の上流）にまたは３’側（の下流）に局在化することができる。あるエレメントのコード配列は、第２のエレメントのコード配列の同一または逆鎖上で局在化し、同一または逆向きで配向させることができる。一部の実施形態において、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、ならびに１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれているガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（場合により、ガイド配列に作動可能に結合している）、およびｔｒａｃｒ配列（例えば、それぞれが異なるイントロン中に、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中に、または全部が単一のイントロン中に存在する）の１つ以上の発現をドライブする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同一のプロモーターに作動可能に結合しており、それから発現される。

【0067】

一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも称される）を含む。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超える挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に局在している。一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列の上流、および場合によりｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に結合している調節エレメントの下流の挿入部位を含み、その結果、挿入部位中へのガイド配列の挿入後および発現時にガイド配列が真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、それぞれの挿入部位は、それぞれの部位におけるガイド配列の挿入を可能とするために２つのｔｒａｃｒメイト配列間に局在している。このような配置において、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはそれらの組合せを含み得る。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一発現構築物を使用して細胞内の複数の異なる対応する標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ活性をターゲティングすることができる。例えば、単一ベクターは、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれよりも多い数を超えるガイド配列を含み得る。一部の実施形態において、約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるそのようなガイド配列含有ベクターを提供し、場合により細胞に送達することができる。

【0068】

一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中にアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２のもと見出すことができる。一部の実施形態において、非改変ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ開裂活性を有し、例えば、Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのＣａｓ９であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の局在における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドからの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多い塩基対内の一方または両方の鎖の開裂を指向する。一部の実施形態において、ベクターは、対応する野生型酵素に対して突然変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を開裂する能力を欠く。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を開裂するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を開裂する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変える突然変異の他の例としては、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれターゲティングする２つのガイド配列との組合せで使用することができる。この組合せにより、両方の鎖をニック形成し、それを使用してＮＨＥＪを誘導することが可能となる。本出願人らは、突然変異原性ＮＨＥＪの誘導における２つのニッカーゼ標的（すなわち、同一局在であるがＤＮＡの異なる鎖にターゲティングされるｓｇＲＮＡ）の効力を実証した（データ示さず）。単一ニッカーゼ（単一ｓｇＲＮＡを有するＣａｓ９−Ｄ１０Ａ）は、ＮＨＥＪを誘導し、インデルを創成し得ないが、本出願人らは、二重ニッカーゼ（同一局在における異なる鎖にターゲティングされるＣａｓ９−Ｄ１０Ａおよび２つのｓｇＲＮＡ）がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）中でそれを行い得ることを示した。効率は、ｈＥＳＣ中でヌクレアーゼ（すなわち、Ｄ１０突然変異を有さない通常のＣａｓ９）の約５０％である。

【0069】

さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を産生することができる。一部の実施形態において、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を産生する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ開裂活性がその非突然変異形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、またはそれよりも小さい数未満である場合、全てのＤＮＡ開裂活性を実質的に欠くとみなす。他の突然変異は有用であり得；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）以外の種からのものである場合、対応するアミノ酸の突然変異は、類似効果を達成するように作製することができる。

【0070】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類のものまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い数を超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度または最も高頻度のコドンにより置き換える一方、天然アミノ酸配列を維持することにより目的宿主細胞中の発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、このことは、次いで、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。特定の宿主細胞中の発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれよりも多い、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

【0071】

一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約また約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、カルボキシ末端またはその付近における約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるＮＬＳ、またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよびカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一のＮＬＳが２つ以上のコピーで存在し得るように他のものから独立して、および／または１つ以上のコピーで存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、多くとも６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最近傍アミノ酸が、ＮまたはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも多いアミノ酸内である場合、ＮまたはＣ末端付近に存在するとみなす。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正荷電リジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。

【0072】

一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核中の検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積をドライブするために十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、またはそれらの因子の組合せに由来し得る。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技術により実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、その結果、細胞内の局在を、例えば、核の局在を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。検出可能なマーカーの例としては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはＧＦＰ；ＲＦＰ；ＣＦＰ）、およびエピトープタグ（ＨＡタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＮＡＰタグ）が挙げられる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織学的分析、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイにより分析することができる。核中の蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡ開裂もしくは突然変異についてのアッセイ、またはＣＲＩＳＰＲ複合体形成および／もしくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性により影響される遺伝子発現活性の変化についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されず、または１つ以上のＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露される対照と比較して間接的に測定することもできる。

【0073】

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。

【0074】

ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、ＡまたはＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。

【0075】

一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムにより決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出をベースとする。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されている。別の例示的フォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにより開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えばＡ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；およびＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。さらなるアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号ＴＢＡ（Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ２０１２／０８４ ４４７９０．１１．２０２２）に見出すことができる。

【0076】

一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒメイト配列およびｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれよりも大きい数を超える。ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列との間の最適なアラインメントの例示的説明を図１２Ｂおよび１３Ｂに提供する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。ヘアピン構造において使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、代替配列であり得るようにより長いまたは短いループ配列を使用することができる。配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、および追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態において、転写物または転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。一部の実施形態において、単一転写物は、転写終結配列をさらに含み；好ましくは、これはポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドである。このようなヘアピン構造の例示的説明を、図１３Ｂの下方位置に提供し、最後の「Ｎ」およびループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒメイト配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：

【化1】

一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列を含む転写物と別個の転写物である（例えば、図１３Ｂの上図に説明されるもの）。

【0077】

一部の実施形態において、組換えテンプレートも提供される。組換えテンプレートは、本明細書に記載の別のベクターの成分であり、別個のベクター中で含有させ、または別個のポリヌクレオチドとして提供することができる。一部の実施形態において、組換えテンプレートは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によりニック形成または開裂される標的配列内またはその付近での相同組換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば、約または約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約または約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド）と重複し得る。一部の実施形態において、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれよりも多いヌクレオチド内に存在する。

【0078】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素の他の約または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多い数を超えるドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。

【0079】

一部の態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、および／またはそれから転写された１つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された生物（例えば、動物、植物、または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（および場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。

【0080】

核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；および同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオンおよび中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、インビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。

【0081】

脂質：核酸複合体、例として、ターゲティングされるリポソーム、例えば、免疫脂質複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、および同第４，９４６，７８７号明細書参照）。

【0082】

核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらを使用してインビトロで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（エクスビボ）。慣用のウイルスベース系としては、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中のインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法について考えられ、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において観察されている。

【0083】

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的には、高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用長鎖末端リピートを含む。最小シス作用ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでそれを使用して治療遺伝子を標的細胞中にインテグレートして恒久的なトランス遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書参照）。

【0084】

一過的発現が好ましい用途においては、アデノウイルスベース系を使用することができる。アデノウイルスベースベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示し得、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価および発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。

【0085】

典型的には、パッケージング細胞を使用して宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成する。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することにより生成する。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび後続の宿主中へのインテグレーションに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージングおよびインテグレーションに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系中にパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書参照。

【0086】

一部の実施形態において、宿主細胞を、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入する。一部の実施形態において、細胞を、それが対象中で天然に生じるままで形質移入する。一部の実施形態において、形質移入される細胞を対象から採取する。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞系に由来する。組織培養のための広範な細胞系は、当技術分野において公知である。細胞系の例としては、限定されるものではないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞系は、当業者に公知の種々の資源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより形質移入された細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の成分により一過的に形質移入され（例えば、１つ以上のベクターの一過的形質移入、またはＲＮＡによる形質移入により）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的にまたは非一過的に形質移入された細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。

【0087】

一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、またはウサギである。ある実施形態において、生物または対象は、植物である。ある実施形態において、生物または対象または植物は、藻類である。トランスジェニック植物および動物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞形質移入の方法から出発する。トランスジェニック植物、特に作物および藻類と同様にトランスジェニック動物も提供される。トランスジェニック動物または植物は、疾患モデルの提供を除く用途において有用であり得る。これらとしては、例えば、野生型において通常見られるよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養素またはビタミンレベルの発現を通しての食物または飼料生産を挙げることができる。これに関して、トランスジェニック植物、特に豆類および塊茎、ならびに動物、特に哺乳動物、例えば家畜（ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタ）、さらには家禽および食用昆虫が好ましい。

【0088】

トランスジェニック藻類または他の植物、例えば、セイヨウアブラナは、例えば、植物油またはバイオ燃料、例えば、アルコール（特にメタノールおよびエタノール）の生産において特に有用であり得る。これらは、油またはバイオ燃料産業において使用される高レベルの油またはアルコールを発現または過剰発現するようにエンジニアリングすることができる。

【0089】

一態様において、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドの開裂を生じさせ、それにより、標的ポリヌクレオチドを改変することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0090】

一態様において、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させ、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増加または減少をもたらすことを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0091】

作物ゲノミクスの近年の進歩とともに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的でコスト効率の良い遺伝子編集および操作を実施する技能により、産生の改善および形質の向上のためにそのようなゲノムを形質転換するための単一および多重化遺伝子操作の迅速な選択および比較が可能となる。これに関して、米国特許および刊行物：米国特許第６，６０３，０６１号明細書−Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；米国特許第７，８６８，１４９号明細書−Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆおよび米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号明細書−Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｔｒａｉｔｓが参照され、これらのそれぞれの全ての内容および開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容および開示も参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の有利な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して微細藻類をエンジニアリングする（実施例１４）。したがって、本明細書における動物細胞への言及は、必要な変更を加え、特に明らかでない限り植物細胞にも当てはまり得る。

【0092】

一態様において、本発明は、インビボ、エクスビボまたはインビトロであり得る真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態において、方法は、ヒトまたは非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞の集団をサンプリングし、１つまたは複数の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階においてエクスビボで行うことができる。１つまたは複数の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）中に再導入することもできる。

【0093】

一態様において、本発明は、上記方法および組成物に開示のエレメントのいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、ベクター系およびキットの使用指示書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列およびガイド配列をｔｒａｃｒメイト配列の上流に挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に結合している第１の調節エレメント（ガイド配列は、発現された場合、真核細胞中の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指向し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、および（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む）；ならびに／または（ｂ）核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第２の調節エレメントを含む。エレメントは、個々にまたは組合せで提供することができ、任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブ中で提供することができる。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語の、例えば、２つ以上の言語の指示書を含む。

【0094】

一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載のエレメントの１つ以上を利用するプロセスにおいて使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の好適な容器中で提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応または貯蔵緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能な形態で、または使用前に１つ以上の他の成分の添加を要求する形態（例えば、濃縮物または凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、任意の緩衝液、例として、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せであり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は、約７から約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に結合させるためのベクター中への挿入のためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを含む。

【0095】

一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を有する。したがって、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、次いでｔｒａｃｔ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に結合している。

【0096】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核中に残留するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論により拘束されるものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と会合するはずであることが考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの条件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対配列である。ＰＡＭ配列の例を以下の実施例セクションに挙げ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素について使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。

【0097】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、それぞれＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１およびＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２を有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日および２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを挙げることができる。

【0098】

標的ポリヌクレオチドの例としては、シグナリング生化学経路に関連する配列、例えば、シグナリング生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織または細胞と比較して患部組織に由来する細胞中で異常なレベルにおいてまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じさせている任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得；これは、異常に低いレベルにおいて発現されるようになる遺伝子であり得、発現の変化は、疾患の発生および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の病因を直接担い、または疾患の病因を担う遺伝子と連鎖不平衡をなす突然変異または遺伝子変異を有する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、既知または未知のものであり得、正常または異常レベルにおけるものであり得る。

【0099】

疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。

【0100】

疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表ＡおよびＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。シグナリング生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。

【0101】

これらの遺伝子および経路中の突然変異は、不適切なタンパク質の産生または機能に影響する不適切な量のタンパク質をもたらし得る。遺伝子、疾患およびタンパク質のさらなる例は、米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書および同第６１／７４８，４２７号明細書から参照により本明細書に組み込まれる。このような遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。

【0102】

【表1】

【0103】

【表2】

【0104】

【表3】

【0105】

【表4】

【0106】

【表5】

【0107】

【表6】

【0108】

【表7】

【0109】

【表8】

【0110】

【表9】

【0111】

【表10】

【0112】

【表11】

【0113】

【表12】

【0114】

【表13】

【0115】

【表14】

【0116】

【表15】

【0117】

【表16】

【0118】

本発明の実施形態は、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅ならびにＤＮＡリピート不安定性および神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関連する方法および組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。規定の態様のタンデムリピート配列が２０を超えるヒト疾患を担うことが見出されている（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの異常を補正することができる。

【0119】

本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２ＡおよびＥＭＰ２Ｂ遺伝子の異常の補正のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期において癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、および最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりターゲティングすることもでき、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓにより編集，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。

【0120】

本発明のさらに別の態様において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉにより編集，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されているいくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の異常を補正することができる。

【0121】

本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にトピックサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する異常の補正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーが挙げられる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所のウェブサイト上にサブセクションＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓのもとでさらに記載されている。

【0122】

一部の実施形態において、病態は、新形成である。病態が新形成であり得る一部の実施形態において、ターゲティングすべき遺伝子は、表Ａに列記のもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は、加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、脆弱性Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は、薬物嗜好であり得る。一部の実施形態において、病態は、自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は、炎症であり得る。一部の実施形態において、病態は、パーキンソン病であり得る。

【0123】

パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、およびＮＵＲＲ１が挙げられる。

【0124】

嗜好関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。

【0125】

炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。

【0126】

心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。

【0127】

アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。

【0128】

自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。

【0129】

黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。

【0130】

統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せを挙げることができる。

【0131】

腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、またはＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。

【0132】

セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１）を挙げることができる。

【0133】

筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。

【0134】

プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、およびそれらの任意の組合せを挙げることができる。

【0135】

プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。

【0136】

免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。

【0137】

トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。

【0138】

神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。

【0139】

神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、またはＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。

【0140】

本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例は、以下のものから選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩおよびＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症および（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。

【0141】

タンパク質治療剤の慢性投与は、特異的タンパク質に対する許容され得ない免疫応答を誘発し得る。タンパク質薬物の免疫原性は、数個の免疫優勢ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープに起因し得る。これらのタンパク質内に含有されるこれらのＨＴＬエピトープのＭＨＣ結合親和性の低減は、より低い免疫原性を有する薬物を生成し得る（Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６）。本発明において、ＣＲＩＳＰＲ酵素の免疫原性は、特に、エリスロポエチンに関してＴａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌに最初に記載され、続いて開発されたアプローチに従って低減させることができる。したがって、指向進化または合理的設計を使用して宿主種（ヒトまたは他の種）中のＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、Ｃａｓ９）の免疫原性を低減させることができる。

【0142】

植物において、病原体は宿主特異的であることが多い。例えば、トマト萎凋病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）は、トマト萎凋病を引き起こすが、トマトのみを攻撃し、カーネーション萎凋病菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｄｉａｎｔｈｉｉ）コムギ黒さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）はコムギのみを攻撃する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗するための既存および誘導的防御を有する。植物世代にわたる突然変異および組換えイベントは、特に病原体が植物よりも高頻度で繁殖する場合に感受性を生じさせる遺伝子変異をもたらす。植物において、非宿主耐性が存在し得、例えば、宿主および病原体は不適合性である。水平耐性、例えば、典型的には、多くの遺伝子により制御される病原体の全ての種に対する部分耐性および垂直耐性、例えば、典型的には、少数の遺伝子により制御される病原体の一部の種に対するが他の種に対するものでない完全耐性も存在し得る。遺伝子対遺伝子レベルにおいて、植物および病原体は、一緒に進化し、あるものの遺伝子変化は他の変化と均衡を保つ。したがって、自然変動を使用して、育種者は、収穫高、品質、均一性、耐寒性、耐性に最も有用な遺伝子を組み合わせる。耐性遺伝子の資源としては、天然または外来種、在来種、野生植物類縁種、および誘導突然変異、例えば、植物材料を突然変異誘発剤により処理することが挙げられる。本発明を使用して、植物育種者に、突然変異を誘導するための新たなツールを提供する。したがって、当業者は、耐性遺伝子の資源のゲノムを分析し、所望の特徴または形質を有する品種において本発明を用いて耐性遺伝子の出現を従来の突然変異誘発剤よりも正確に誘導し、したがって、植物育種プログラムを加速および改善することができる。

【0143】

明らかなとおり、本発明の系を使用して任意の目的ポリヌクレオチド配列をターゲティングすることができることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療することができる病態または疾患の一部の例を上記表に含め、それらの病態に現在関連する遺伝子の例もその表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。

【実施例】

【0144】

以下の実施例を、本発明の種々の実施形態を説明する目的のために挙げ、それらは本発明をいかなる様式にも限定することを意味しない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、目下好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の趣旨に包含されるその変更および他の使用は、当業者が行う。

【0145】

実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、およびＣｓｎ１のクラスター、ならびに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡおよび非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（ダイレクトリピート）を含有する化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に指向する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの開裂を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。

【0146】

哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ成分の発現を改善するため、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））ＳＦ３７０遺伝子座１からの２つの遺伝子Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）をコドン最適化した。核局在化を促進するため、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩの両方のアミノ（Ｎ）またはカルボキシル（Ｃ）末端に含めた（図２Ｂ）。タンパク質発現の可視化を促進するため、蛍光タンパク質マーカーも両方のタンパク質のＮまたはＣ末端に含めた（図２Ｂ）。ＮおよびＣ末端の両方に付着しているＮＬＳを有するＳｐＣａｓ９のバージョン（２×ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９）も生成した。ＮＬＳ融合ＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩを含有する構築物を２９３ＦＴヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞中に形質移入し、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩに対するＮＬＳの相対的位置決めが、それらの核局在化効率に影響することが見出された。Ｃ末端ＮＬＳは標的ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを核にターゲティングするために十分であった一方、ＳｐＣａｓ９のＮまたはＣ末端のいずれかへのこれらの特定のＮＬＳの単一コピーの付着は、この系中の適切な核局在化を達成し得なかった。この例において、Ｃ末端ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのもの（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）であり、Ｃ末端ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原のもの（ＰＫＫＫＲＫＶ）であった。試験されたＳｐＣａｓ９のバージョンのうち、２×ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９のみが核局在化を示した（図２Ｂ）。

【0147】

化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの転写開始部位を有し、８９ヌクレオチド（ｎｔ）および１７１ｎｔの２つの転写物を生じさせ、それは続いて同一の７５ｎｔ成熟ｔｒａｃｒＲＮＡにプロセシングされる。より短い８９ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡを哺乳動物細胞中の発現のために選択した（図６に説明される発現構築物、図６Ｂに示されるＳｕｒｖｅｒｙｏｒアッセイの結果により決定された機能性を有する）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーターおよびノザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノザンブロットにより確認した。図７Ｃは、長鎖または短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、ならびにＳｐＣａｓ９およびＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析の結果を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物の形質移入は、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノザンブロット上で検出される。

【0148】

正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現をドライブした（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つのダイレクトリピート（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒメイト配列」にも包含される；図２Ｃ）によりフランキングされている単一スペーサーからなるプレｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。

【0149】

哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびプレｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の開裂を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ成分の組合せにより形質移入した。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な開裂活性を検出した（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入は、プロトスペーサーの最大５．０％の開裂を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮアーゼＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ成分の同時形質移入も、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮアーゼ、例えば、関連ＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆した。残り３つの成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム開裂活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのサンガーシーケンシングにより開裂活性を確認し；４３個のシーケンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図４〜８、１０、および１１参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。

【0150】

開裂効率を最適化するため、本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが開裂効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の開裂を媒介し得ることを見出した。図９は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノザンブロット分析を提供する。図９Ａは、２つのダイレクトリピートによりフランキングされている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサーおよびダイレクトリピート配列を、図９Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノザンブロットプローブを生成する領域を示す。図９Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物により形質移入された２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノザンブロット分析を示す。左および右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮアーゼＩＩＩを用いず、または用いて形質移入された２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮアーゼＩＩＩの存在に依存的でなかった。形質移入２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの開裂を促進することができることを実証する。

【0151】

図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１およびこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ開裂の提案される機序を示す模式図を説明する。ダイレクトリピート−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に指向する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）およびＲＮアーゼＩＩＩ（ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターによりドライブされるＳｐＣａｓ９およびＳｐＲＮアーゼＩＩＩならびに正確な転写開始および終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６によりドライブされるｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、プレｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介少数挿入および欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮアーゼＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＥＭＸ１標的スペーサーを担持するプレｃｒＲＮＡアレイを用いてまたは用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、ならびにＳｐＣａｓ９開裂部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入および欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシーケンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、またはミスマッチの塩基は挿入または突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。

【0152】

３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させた（図３Ａ）。

【0153】

ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。センスおよびアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方および下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢおよびマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％および０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した。開裂はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるプレｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で開裂された（図４および５）。

【0154】

図５は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図５Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図５Ｂは、プレｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのダイレクトリピート領域間のハイブリダイゼーションを示すプレｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）および２０ｂｐのガイド配列、ならびにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分ダイレクトリピートおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒメイトおよびｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介開裂の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図５Ｃに説明する。プロセシングされたプレｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）またはキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。

【0155】

ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギーおよびボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用して本出願人らのゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（図３Ｂ）（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。したがって、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。

【0156】

図３は、例示的発現ベクターを説明する。図３Ａは、合成ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ（キメラＲＮＡ）およびＳｐＣａｓ９の発現をドライブするためのバイシストロニックベクターの模式図を提供する。キメラガイドＲＮＡは、ゲノム標的部位中のプロトスペーサーに対応する２０ｂｐのガイド配列を含有する。図３Ｂは、ヒトＥＭＸ１、ＰＶＡＬＢ、およびマウスＴｈ遺伝子座をターゲティングするガイド配列、ならびにそれらの予測二次構造を示す模式図を提供する。それぞれの標的部位における改変効率をＲＮＡ二次構造図の下方に示す（ＥＭＸ１、ｎ＝２１６アンプリコンシーケンシングリード；ＰＶＡＬＢ、ｎ＝２２４リード；Ｔｈ、ｎ＝２６５リード）。フォールディングアルゴリズムは、図３Ｂにグレースケールで再現されるレインボースケールにより示されるとおり、それぞれの塩基が予測二次構造を仮定するその確率に従って着色されたアウトプットを生じさせた。ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計が図３Ａに示され、ガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、およびＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターが含まれる。

【0157】

ＣＲＩＳＰＲが天然に作動する原核細胞中で二次構造を含有するスペーサーが機能し得るか否かを試験するため、プロトスペーサー担持プラスミドの形質転換干渉を、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１を異種発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で試験した（図３Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を低コピー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター中にクローニングし、ｃｒＲＮＡアレイをＤＲのペアによりフランキングされている単一スペーサーにより置き換えた（ｐＣＲＩＳＰＲ）。異なるｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、対応するプロトスペーサーおよびＰＡＭ配列を含有するチャレンジプラスミドにより形質転換した（図３Ｃ）。細菌アッセイにおいて、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図３Ｃ）。これらの結果は、哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響する追加の因子が存在し得ることを示唆する。

【0158】

ＣＲＩＳＰＲ媒介開裂の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー開裂に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図４Ａ）。図４Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の開裂効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム開裂を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図４Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム開裂を媒介し得る。図４Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図４Ｄは、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。

【0159】

エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高フィデリティ遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪおよびＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図５Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓａｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニック形成されたゲノムＤＮＡが高フィデリティ相同性組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図５Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシーケンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９またはｈＳｐＣａｓ９ｎ、およびプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲテンプレートにより同時形質移入することによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図５Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在およびプライマーアニーリング配列（矢印）とともに提供する。ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲテンプレートのインテグレーションを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図５Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する開裂産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人らは、ゲノムアンプリコンのサンガーシーケンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図５Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐおよびＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。

【0160】

アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な開裂が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計および開裂の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域のターゲティングされる欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図５Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。

【0161】

実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系改変および代替例
配列特異的ＤＮＡ開裂をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ^２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとでターゲティング能を制限する。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。それぞれの標的部位における改変効率をＲＮＡ二次構造の下方に示す。この構造を生成するアルゴリズムは、それぞれの塩基を予測二次構造を仮定するその確率に従って着色する。ＲＮＡガイドスペーサー１および２は、それぞれ１４％および６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計的分析も図７に提供する。

【0162】

実施例３：試料標的配列選択アルゴリズム
規定のＣＲＩＳＰＲ酵素についての所望のガイド配列長およびＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づきインプットＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧＮＧ−３’を探索することにより同定することができる。Ｎ_ｘ中の値「ｘ」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、２０である。

【0163】

ＤＮＡ標的部位のゲノム中の複数の発生は、非特異的ゲノム編集をもたらし得るため、全ての潜在的な部位を同定した後、プログラムは配列が関連参照ゲノム中で出現する回数に基づき配列をフィルタリング除去する。配列特異性が「シード」配列、例えば、ＰＡＭ配列自体を含め、ＰＡＭ配列から５’側の１１〜１２ｂｐにより決定されるそれらのＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップはシード配列に基づき得る。したがって、追加のゲノム遺伝子座における編集を回避するため、結果を関連ゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数に基づきフィルタリングする。使用者に、シード配列の長さを選択させることができる。使用者に、フィルタ通過の目的のためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を規定させることもできる。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルトレーションレベルは、シード配列の長さおよびゲノム中の配列の発生数の両方を変えることにより変更する。プログラムは、さらにまたは代替的に、同定された標的配列の逆相補鎖を提供することにより、報告された標的配列に相補的なガイド配列の配列を提供し得る。

【0164】

配列選択を最適化する方法およびアルゴリズムのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願番号ＴＢＡ（Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１２／０８４ ４４７９０．１１．２０２２）に見出すことができる。

【0165】

実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込むｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記載する。図１８ａは、キメラＲＮＡおよびＣａｓ９のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターによりドライブされ、キメラＲＮＡはＵ６プロモーターによりドライブされる。キメラガイドＲＮＡは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイドおよびｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡと、それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を、それぞれ図１８ｂおよび１８ｃに説明する。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す。ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し、ｃｒＲＮＡは、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図１１ａおよび１１ｂにヒストグラムにより示し、それぞれ図１０ｂおよび１０ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」は、インデルが検出されなかったことを示す）。プロトスペーサーＩＤおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、ＰＡＭ配列、および鎖局在を表Ｄに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラＲＮＡの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。

【0166】

【表17】

【0167】

細胞培養および形質移入
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ_２インキュベーションで維持した。２９３ＦＴ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に、形質移入２４時間前に１ウェル当たり１５０，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞を形質移入した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計５００ｎｇのプラスミドを使用した。

【0168】

ゲノム改変についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ
２９３ＦＴ細胞を上記プラスミドＤＮＡにより形質移入した。細胞を３７℃において形質移入後７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、ペレット化細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間および９８℃において１０分間インキュベートした。それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位をフランキングするゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し（表Ｅに列記のプライマー）、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、および２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼおよびＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、相対バンド強度に基づくものであった。

【0169】

【表18】

【0170】

ユニークＣＲＩＳＰＲ標的部位のコンピュータによる同定
ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ミバエ、および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノム中の化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）酵素についてのユニーク標的部位を同定するため、本出願人らは、ＤＮＡ配列の両方の鎖をスキャンし、考えられる全てのＳｐＣａｓ９標的部位を同定するためのソフトウェアパッケージを開発した。この実施例について、それぞれのＳｐＣａｓ９標的部位を２０ｂｐ配列と、それに続くＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列として操作上定義し、本出願人らは、全ての染色体上のこの５’−Ｎ_２０−ＮＧＧ−３’定義を満たす全ての配列を同定した。非特異的ゲノム編集を防止するため、全ての潜在的な部位を同定した後、全ての標的部位をそれらが関連参照ゲノム中で出現する回数に基づきフィルタリングした。例えば、ＰＡＭ配列から５’側の約１１〜１２ｂｐ配列であり得る「シード」配列により付与されるＣａｓ９活性の配列特異性を利用するため、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＮＧＧ−３’配列を関連ゲノム中でユニークであると選択した。全てのゲノム配列をＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードした（ヒトゲノムｈｇ１９、マウスゲノムｍｍ９、ラットゲノムｒｎ５、ゼブラフィッシュゲノムｄａｎＲｅｒ７、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲノムｄｍ４および線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ゲノムｃｅ１０）。全探索結果は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ情報を使用して閲覧利用可能である。ヒトゲノム中の一部の標的部位の例示的可視化を図２２に提供する。

【0171】

最初に、ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つの部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路によるその後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれることを示し、ｎについては４８、５４、６７、および８５の値が使用される。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は、３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ開裂を媒介し、特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、ガイドおよびｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ開裂を実証した（図１０ｂおよび１０ａ）。ハイブリッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列およびｔｒａｃｒ配列）を検出可能な開裂を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も、ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）およびｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な開裂を媒介し得た（図１０ｃおよび１０ｂ）。

【0172】

ＥＭＸ１およびＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について、ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される二次構造は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。本実施例において使用されるキメラＲＮＡのそれぞれについての予測二次構造の説明を、図２１に提供する。二次構造は、最小自由エネルギーおよび分配関数アルゴリズムを使用するＲＮＡｆｏｌｄ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用して予測した。それぞれの塩基についての疑似カラー（グレースケールで再現）は、対形成の確率を示す。より長いｔｒａｃｒ配列を有するｃｈｉＲＮＡは、天然ＣＲＩＳＰＲｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドにより開裂されない標的を開裂し得たため、キメラＲＮＡをＣａｓ９上にその天然ハイブリッド相当物よりも効率的にロードすることができることが考えられる。真核細胞および生物中の部位特異的ゲノム編集のためのＣａｓ９の適用を促進するため、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について予測される全てのユニーク標的部位をヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ゲノムにおいてコンピュータにより同定した。キメラＲＮＡは、他の微生物からのＣａｓ９酵素について設計してＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼの標的スペースを拡大することができる。

【0173】

図１１および２１は、最大＋８５ヌクレオチドの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および核局在化配列を有するＳｐＣａｓ９を含むキメラＲＮＡの発現のための例示的なバイシストロニック発現ベクターを説明する。ＳｐＣａｓ９は、ＣＢｈプロモーターから発現され、ｂＧＨポリＡシグナル（ｂＧＨｐＡ）により終結される。模式図の直下に説明される拡大配列は、ガイド配列挿入部位を包囲する領域に対応し、５’から３’でＵ６プロモーターの３’部分（最初の陰影領域）、ＢｂｓＩ開裂部位（矢印）、部分ダイレクトリピート（ｔｒａｃｒメイト配列ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ、下線付き）、ループ配列ＧＡＡＡ、および＋８５ｔｒａｃｒ配列（ループ配列後の下線付き配列）を含む。例示的なガイド配列インサートを、ガイド配列挿入部位の下方に説明し、選択される標的についてのガイド配列のヌクレオチドを「Ｎ」により表す。

【0174】

上記実施例に記載の配列は、以下のとおりである（ポリヌクレオチド配列は、５’から３’である）。

【0175】

Ｕ６−短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ（化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：

【化2】

【0176】

Ｕ６−長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：

【化3】

【0177】

Ｕ６−ＤＲ−ＢｂｓＩ骨格−ＤＲ（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）：

【化4】

【0178】

Ｕ６−キメラＲＮＡ−ＢｂｓＩ骨格（化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化5】

【0179】

ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ：

【化6】

【0180】

ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ：

【化7】

【0181】

ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ：

【化8】

【0182】

ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ：

【化9】

【0183】

ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＳｐＲＮアーゼ３：

【化10】

【0184】

ＳｐＲＮアーゼ３−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮＬＳ：

【化11】

【0185】

ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９ｎ−ＮＬＳ（Ｄ１０Ａニッカーゼ突然変異は小文字である）：

【化12】

【0186】

ｈＥＭＸ１−ＨＲテンプレート−ＨｉｎｄＩＩ−ＮｈｅＩ：

【化13】

【化14】

【0187】

ＮＬＳ−ＳｔＣｓｎ１−ＮＬＳ：

【化15】

【0188】

Ｕ６−Ｓｔ＿ｔｒａｃｒＲＮＡ（７〜９７）：

【化16】

【0189】

Ｕ６−ＤＲ−スペーサー−ＤＲ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化17】

【0190】

＋４８ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化18】

【0191】

＋５４ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化19】

【0192】

＋６７ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化20】

【0193】

＋８５ｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラＲＮＡ（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０）

【化21】

【0194】

ＣＢｈ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ

【化22】

【化23】

【化24】

【化25】

【0195】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化26】

【0196】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化27】

【0197】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化28】

【0198】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化29】

【0199】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化30】

【0200】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化31】

【0201】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化32】

【0202】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化33】

【0203】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＮＡＧＡＡＷのＰＡＭの場合）

【化34】

【0204】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ３Ｃａｓ９のための例示的キメラＲＮＡ（ＮＧＧＮＧのＰＡＭの場合）

【化35】

【0205】

Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座からのＣａｓ９のコドン最適化バージョン（５’および３’末端の両方においてＮＬＳを有する）

【化36】

【化37】

【化38】

【化39】

【0206】

実施例５：化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９と称される）についてのガイドＲＮＡの最適化
本出願人らは、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびダイレクトリピート配列を突然変異させ、またはキメラガイドＲＮＡを突然変異させて細胞中のＲＮＡを向上させた。

【0207】

最適化は、ｐｏｌ３プロモーターによる早期転写終結をもたらし得るｔｒａｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡ中にチミンのストレッチ（Ｔ）が存在した観察に基づく。したがって、本出願人らは、以下の最適化配列を生成した。最適化ｔｒａｃｒＲＮＡおよび対応する最適化ダイレクトリピートをペアで表す。

【0208】

最適化ｔｒａｃｒＲＮＡ１（下線は突然変異）：

【化40】

【0209】

最適化ダイレクトリピート１（下線は突然変異）：

【化41】

【0210】

最適化ｔｒａｃｒＲＮＡ２（下線は突然変異）：

【化42】

【0211】

最適化ダイレクトリピート２（下線は突然変異）：

【化43】

【0212】

本出願人らは、真核細胞中の最適な活性のためにキメラガイドＲＮＡも最適化した。

【0213】

元のガイドＲＮＡ：

【化44】

【0214】

最適化キメラガイドＲＮＡ配列１：

【化45】

【0215】

最適化キメラガイドＲＮＡ配列２：

【化46】

【0216】

最適化キメラガイドＲＮＡ配列３：

【化47】

【0217】

本出願人らは、最適化キメラガイドＲＮＡが図３に示されるとおり、より良好に機能することを示した。本実験は、２９３ＦＴ細胞をＣａｓ９およびＵ６ガイドＲＮＡ ＤＮＡカセットにより同時形質移入して上記４つのＲＮＡ形態の１つを発現させることにより実施した。ガイドＲＮＡの標的は、ヒトＥｍｘ１遺伝子座：「ＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＧＧＧ」中の同一標的部位である。

【0218】

実施例６：ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９と称される）の最適化
本出願人らは、図１２に示されるガイドキメラＲＮＡを設計した。

【0219】

Ｓｔ１Ｃａｓ９ガイドＲＮＡは、ポリチミンのストレッチ（Ｔ）を分解することによりＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡに関して同一タイプの最適化を受け得る。

【0220】

実施例７：インビボ用途のためのＣａｓ９系の改善
本出願人らは、小分子量を有するＣａｓ９についてメタゲノム検索を実施した。ほとんどのＣａｓ９ホモログはかなり大きい。例えば、ＳｐＣａｓ９は、約１３６８ａａ長であり、送達のためのウイルスベクター中に容易にパッケージングされるには大きすぎる。配列の一部は誤ってアノテートされており、したがって、それぞれの長さについての正確な頻度は、必ずしも的確であるとは限らない。それにもかかわらず、これは、Ｃａｓ９タンパク質の分布における徴候を提供し、より短いＣａｓ９ホモログが存在することを示唆する。

【0221】

計算分析を通して、本出願人らは、細菌株カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）において、１０００未満のアミノ酸を有する２つのＣａｓ９タンパク質が存在することを見出した。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）からの１つのＣａｓ９についての配列を以下に提示する。この長さにおいて、ＣｊＣａｓ９をＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、および初代細胞中へのおよび動物モデルにおけるインビボでの堅牢な送達のための他のウイルスベクター中に容易にパッケージングすることができる。

【0222】

＞カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）

【化48】

【0223】

このＣｊＣａｓ９のための推定ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは、以下である：

【化49】

【0224】

ダイレクトリピート配列は、以下である：

【化50】

【0225】

ｔｒａｃｒＲＮＡおよびダイレクトリピートの同時フォールド構造を図６に提供する。

【0226】

ＣｊＣａｓ９のためのキメラガイドＲＮＡの一例は、以下である：

【化51】

【0227】

本出願人らはまた、インビトロ法を使用してＣａｓ９ガイドＲＮＡを最適化した。図１８は、インビトロでのＳｔ１Ｃａｓ９キメラガイドＲＮＡ最適化からのデータを示す。

【0228】

本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることを理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、それらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物は、特許請求の範囲により包含されるものとする。

【0229】

実施例８：Ｓａ ｓｇＲＮＡ最適化
本出願人らは、最大開裂効率を有する最適なトランケートアーキテクチャーのためのＳａＣａｓ９のための５つのｓｇＲＮＡバリアントを設計した。さらに、天然ダイレクトリピート：ｔｒａｃｒ二本鎖系をｓｇＲＮＡと並行して試験した。示される長さを有するガイドをＳａＣａｓ９と同時形質移入し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中で活性について試験した。合計１００ｎｇのｓｇＲＮＡ Ｕ６−ＰＣＲアンプリコン（または５０ｎｇのダイレクトリピートおよび５０ｎｇのｔｒａｃｒＲＮＡ）および４００ｎｇのＳａＣａｓ９プラスミドを２００，０００個のＨｅｐａ１−６マウス肝細胞中に同時形質移入し、ＳＵＲＶＥＹＯＲ分析のために形質移入から７２時間後にＤＮＡを回収した。結果を図２３に示す。

【0230】

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３９．Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒ６．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７０９−５７１７（２００１）．
４０．Ｈａｖａｒｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｓ．，Ｃｏｏｍａｒａｓｗａｍｙ，Ｇ．＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ａｎ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｐｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２，１１１４０−１１１４４（１９９５）．
４１．Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．＆Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，Ｂ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｐ ｏｆ ｐＣ１９４，ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０，８１５−８２５（１９８２）．
４２．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ：ＳＯＥｉｎｇ Ｔｏｇｅｔｈｅｒ Ｔａｉｌｏｒ−Ｍａｄｅ Ｇｅｎｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，２５１−２６１（１９９３）．
４３．Ｐｏｄｂｉｅｌｓｋｉ，Ａ．，Ｓｐｅｌｌｅｒｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｗｏｉｓｃｈｎｉｋ，Ｍ．，Ｐｏｈｌ，Ｂ．＆Ｌｕｔｔｉｃｋｅｎ，Ｒ．Ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＧＡＳ）．Ｇｅｎｅ １７７，１３７−１４７（１９９６）．
４４．Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ｋ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｇ．＆Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｐ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３，３４５−３４８（１９９５）．
４５．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３−３４５（２００９）．
４６．Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６．

【0231】

本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し、記載したが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。当業者は目下、多数のバリエーション、変更、および置換を本発明から逸脱せずに行う。本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替例を本発明の実施において用いることができることが理解されるべきである。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]